Informatie

Low-tech of goedkope techniek voor kwantitatieve schatting in enzymologie


Als een nauwkeurige meting van enzymologische hoeveelheden nodig is, dan is het volgen van gevestigde methoden in het veld noodzakelijk.

Soms is het echter van groot nut om een ​​waarde te bepalen voordat u zich ertoe verbindt de nodige tijd te nemen voor eiwitzuivering of de benodigde apparatuur/reagentia te kopen. Voor een dergelijk doel kan een kleine "hack" een lange weg gaan. Dit houdt vaak in dat een beschikbare apparatuur wordt gebruikt om een ​​andere te vervangen (misschien heb ik bijvoorbeeld een FACS direct beschikbaar, maar geen HPLC).

Ik ben op zoek naar voorbeelden van "onconventioneel" gebruik van laboratoriumtechniek die kan worden gebruikt om enzymologische hoeveelheden te bepalen ($K_d$, $V_{max}$, $K_i$…) als een eerste schatting -- of je hebt deelgenomen aan dergelijke ketterijen, of ze alleen hebt zien gebruiken, mogelijk zelfs in een niet-formele/doe-het-zelf-omgeving.


Als er een manier is om:

  • Maak de replicatie van een gemeenschappelijk cultuurorganisme (bijv. E coli) afhankelijk van de remmer of het substraat van belang, mogelijk met een beperkend medium.
  • Express het enzym van belang op een relatief gecontroleerde manier in een dergelijk organisme (bijvoorbeeld goed gekarakteriseerde promotor in plasmide met goed gekarakteriseerd aantal kopieën),

Dan kun je goede kilometers halen uit enkele seriële verdunningen en een OD600-meter. Nog beter met een plaatlezer.

Het exacte protocol zal afhangen van de hoeveelheid die wordt overwogen, maar zal meestal neerkomen op het vervangen van de enzymkinetiekvergelijkingen totdat de hoeveelheid van belang een functie is van de concentratie, en een schema bedenken om de andere onbekende hoeveelheden op te heffen (vaak substraatconcentratiehelling). + start OD helling + curve fitting)


Chemiluminescente Western Blotting

Chemiluminescentiedetectie voor western blotting is populair omdat het verschillende voordelen biedt ten opzichte van andere detectiemethoden. Door chemiluminescentie te gebruiken, kunnen meerdere belichtingen worden gemaakt, wat optimalisatie van signaal naar ruis mogelijk maakt. De detectiereagentia kunnen worden verwijderd en de gehele blot kan opnieuw worden onderzocht om een ​​ander eiwit zichtbaar te maken of om de detectie van het eerste eiwit te optimaliseren. Een groot lineair responsbereik maakt detectie en kwantificering van een groot aantal eiwitconcentraties mogelijk. Het belangrijkste is dat chemiluminescentie de grootste potentiële gevoeligheid oplevert van alle beschikbare detectiemethoden voor western blotting. Door deze voordelen is chemiluminescentie in de meeste eiwitlaboratoria de favoriete detectiemethode geworden.

Pagina-inhoud


Invoering

Western blotting is een krachtige techniek die indirecte detectie mogelijk maakt van eiwitmonsters die zijn geïmmobiliseerd op membranen van nitrocellulose of polyvinylideenfluoride (PVDF). In een conventionele western-blot worden eiwitmonsters eerst gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en vervolgens elektroforetisch overgebracht naar het membraan. Na een blokkeerstap wordt het membraan gesondeerd met een primair antilichaam dat is opgewekt tegen het betreffende antigeen. Na een daaropvolgende wasstap wordt het membraan geïncubeerd met een geconjugeerd secundair antilichaam dat reactief is ten opzichte van het primaire antilichaam. De twee meest voorkomende enzymen die aan secundaire antilichamen worden geconjugeerd, zijn mierikswortelperoxidase (HRP) en alkalische fosfatase (AP). Deze enzymen katalyseren de chemische reactie voor het genereren van een registreerbaar signaal in de vorm van licht.

Chemiluminescente western blot-detectie.

Chemiluminescente substraten voor HRP en AP verschillen van andere substraten doordat het gedetecteerde licht een tijdelijk product van de reactie is dat alleen aanwezig is terwijl de enzym-substraatreactie plaatsvindt. Dit in tegenstelling tot chromogene substraten die een stabiel, gekleurd product produceren. Deze gekleurde precipitaten blijven op het membraan achter nadat de enzym-substraatreactie is beëindigd. Op een chemiluminescente western-blot is het substraat het beperkende reagens in de reactie, aangezien het substraat uitgeput raakt, de lichtproductie afneemt en uiteindelijk stopt. Een goed geoptimaliseerde procedure met behulp van de juiste antilichaamverdunningen zal gedurende enkele uren een stabiele lichtopbrengst produceren, waardoor consistente en gevoelige detectie van eiwitten mogelijk is.


Chemiluminescente western blot-detectiemethoden

De keuze van het substraat voor chemiluminescente western blotting wordt bepaald door het gekozen reporterenzym. Specifiek zijn op luminol en acridan gebaseerde reagentia chemiluminescente HRP-substraten. Voor chemiluminescente detectie van AP zijn substraten op basis van acridan en 1,2-dioxetaan beschikbaar.

Chemiluminescente reactie van HRP-substraat-luminol. Chemiluminescentie is een eigenschap van chemische reacties die licht uitstralen als bijproduct. Luminol is een van de meest gebruikte chemiluminescente reagentia. De oxidatie van luminol door peroxide resulteert in de vorming van een product in aangeslagen toestand dat 3-aminoftalaat wordt genoemd. Dit product vervalt naar een lagere energietoestand door fotonen van licht vrij te geven.

Chemiluminescente reactie van AP-substraat-CDP-Star.CDP-Star wordt gedefosforyleerd door AP om een ​​metastabiel dioxetaanfenolaat-aniontussenproduct op te leveren dat ontleedt en licht uitzendt met een maximale intensiteit bij een golflengte van 475 nm. Lichtemissie vindt alleen plaats tijdens de enzym-substraatreactie.

Mierikswortelperoxidase (HRP) katalyseert de oxidatie van substraten door waterstofperoxide, wat resulteert in een gekleurd of fluorescerend product en het vrijkomen van licht als bijproduct van de reactie. HRP functioneert optimaal bij een bijna neutrale pH en kan worden geremd door cyaniden, sulfiden en aziden. Antilichaam-HRP-conjugaten zijn superieur aan antilichaam-AP-conjugaten met betrekking tot de specifieke activiteiten van zowel het enzym als het antilichaam. Bovendien maakt de hoge omloopsnelheid, goede stabiliteit, lage kosten en brede beschikbaarheid van substraten HRP het enzym bij uitstek voor de meeste toepassingen. Vanwege de relatief kleine omvang van het HRP-enzym kan een verdere toename van de gevoeligheid worden bereikt door gebruik te maken van aan poly-HRP geconjugeerde secundaire antilichamen en kan het voor sommige onderzoekers de noodzaak voor het gebruik van amplificatiesystemen van het ABC-type elimineren. Alkalische fosfatase (AP) katalyseert de hydrolyse van fosfaatgroepen uit een substraatmolecuul, wat resulteert in een gekleurd of fluorescerend product en het vrijkomen van licht als bijproduct van de reactie. AP heeft optimale enzymatische activiteit bij een basische pH (pH 8-10) en kan worden geremd door cyaniden, arsenaat, anorganisch fosfaat en divalente kationchelatoren, zoals EDTA. Als label voor Western blotting biedt AP een duidelijk voordeel ten opzichte van andere enzymen. Omdat de reactiesnelheid lineair blijft, kan de detectiegevoeligheid worden verbeterd door simpelweg een reactie langer te laten duren.

Aangezien HRP het meest populaire enzym is dat wordt gebruikt bij western blotting, zal het in dit artikel als ons voorbeeld worden besproken. Er zijn verschillende varianten van Thermo Scientific Pierce ECL en SuperSignal chemiluminescente HRP-substraten beschikbaar die verschillende niveaus van gevoeligheid bieden voor chemiluminescentie western blotting. Raadpleeg tabel 1 om het meest geschikte chemiluminescerende HRP-substraat te identificeren op basis van de overvloed aan uw doeleiwit van belang, het aantal monsters dat het doeleiwit bevat en het niveau van gevoeligheid en het type instrumentatie dat beschikbaar is voor detectie. De tabel schetst ook kenmerken van veelgebruikte verbeterde chemiluminescente (ECL) en SuperSignal chemiluminescente substraten.

Chemiluminescente substraten voor HRP zijn meestal tweecomponentensystemen bestaande uit een stabiele peroxideoplossing en een verbeterde substraatoplossing, vaak op luminolbasis. Om een ​​werkende oplossing te maken, worden in de meeste gevallen gelijke volumes van de twee componenten met elkaar gemengd. Wanneer geïncubeerd met een blot waarop HRP-geconjugeerde antilichamen (of andere sondes) zijn gebonden, zendt een chemische reactie licht uit bij 425 nm dat kan worden vastgelegd met röntgenfilm en CCD-camerabeeldapparatuur die chemiluminescentie detecteren. Hoewel röntgenfilm kwalitatieve en semi-kwantitatieve gegevens levert en nuttig is om de aanwezigheid van doeleiwitten te bevestigen, bieden op gekoelde CCD-camera gebaseerde imagers de voordelen van kwantitatieve analyse, snelle gegevensverzameling, hogere gevoeligheid, grotere resolutie en een groter dynamisch bereik dan film.

Tabel 1. Thermo Scientific chemiluminescente HRP-substraten.

Doorboren ECL-substraatPierce ECL Plus-substraatSuperSignal West Pico PLUS substraatSuperSignal West Dura-substraatSuperSignal West Femto substraatSuperSignal West Atto-substraat
DetectieniveauLaag tot middenpicogramLaag-picogramLaag picogram naar hoog femtogramMid-femtogramLaag tot midfemtogramLaag femtogram - hoog attogram
Signaalduur0,5–2 uur5 uur6–24 uur24 uur8 uur6 uur
Detectiemethoden:Röntgenfilm, CCD-imagerRöntgenfilm, CCD-imager, fluorescentie-imagerRöntgenfilm, CCD-imagerRöntgenfilm, CCD-imagerRöntgenfilm, CCD-imagerRöntgenfilm, CCD-imager
Aanbevolen primaire antilichaamverdunning*1:1,0001:1,0001:1,0001:5,0001:5,0001:5,000
Aanbevolen secundaire antilichaamverdunning*1:25,000 - 1:200,0001:1,000 - 1:15,0001:20,000 - 1:100,0001:50,000 - 1:250,0001:100,000 - 1:500,0001:100,000 - 1:250,000
Selecteer wanneer .. doel en monster zijn er in overvloed. doelwit is minder overvloedig, monster is beperkt en je hebt chemifluorescentiedetectie nodig. doelwit is minder overvloedig, monster is beperkt en u hebt meer gevoeligheid nodig dan een ECL-substraat op instapniveau biedt. doel is minder overvloedig, monster is beperkt en u gebruikt CCD-beeldopname. doelwit is het minst overvloedig, monster is kostbaar en je hebt maximale gevoeligheid nodig. doelwit is het minst overvloedig, monster is precisie en je hebt maximale gevoeligheid nodig
Waarde voor jouLage kosten Eenvoudig over te schakelen van andere ECL-substraten op instapniveauBeste detectieflexibiliteit met chemifluorescentiedetectieoptieBeste waarde werkt voor de meeste western blotsBeste signaalduurGoede gevoeligheid met geoptimaliseerde omstandighedenMeeste gevoeligheid met minder optimalisatie vereist
*Gebaseerd op een antilichaamconcentratie van 1 mg/ml

De lichtopbrengst die wordt gegenereerd tijdens een chemiluminescente luminolreactie is relatief kortstondig, daarom zijn verbeterde chemiluminescente (ECL) substraten ontwikkeld. Het gebruik van een versterker met luminol verhoogt bijvoorbeeld de signaalgevoeligheid, intensiteit en duur van de enzym-substraatreactie. Pierce ECL-substraat is geschikt voor western blot-toepassingen waarin overvloedige eiwitten worden onderzocht of waar het experiment is geoptimaliseerd. Er zijn echter substraten ontwikkeld die zeer gevoelige eiwitdetectie bieden. SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate maakt bijvoorbeeld eiwitdetectie op picogram- tot hoog femtogramniveau mogelijk door middel van western-blot-analyse.


Diagnose van SARS-CoV-2 op basis van CRISPR/Cas12

Broughton et al. 16 ontwikkelde een op CRISPR/Cas12a gebaseerde precisietechniek, genaamd SARS-CoV-2 DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR), die een eenvoudige en snelle diagnose mogelijk maakt van SARS-CoV-2-RNA dat is geëxtraheerd uit monsters van uitstrijkjes van de luchtwegen van patiënten in minder dan 40 min. De ontwikkelde methode is eigenlijk het product van het combineren van het CRISPR/Cas12a DETECTR-systeem met isotherme amplificatie die tegelijkertijd reverse transcriptie en isotherme amplificatie uitvoert door lus-gemedieerde replicatie (RT-LAMP) voor gezuiverd RNA uit nasofaryngeale of orofaryngeale uitstrijkjes. Cas12a detecteert vervolgens vooraf bepaalde virale sequenties, waarna de splitsing van het reportermolecuul de aanwezigheid van een virus bevestigt. Het elimineren van de noodzaak voor thermocycling en isothermische signaalversterking biedt aanzienlijke voordelen in vergelijking met qRT-PCR, zoals snelle doorlooptijd, doelspecificiteit voor afzonderlijke nucleotiden, integratie met bruikbare en gebruiksvriendelijke rapportageformaten zoals laterale flowstrips, en geen vereiste voor geavanceerd laboratorium systemen. Het gevestigde systeem werd gevalideerd met referentiemonsters en ook Amerikaanse patiëntmonsters, waaronder 36 patiënten met COVID-19 en 42 patiënten met andere respiratoire virale infecties. Dit systeem is een snel en visueel alternatief voor rRT-PCR voor het detecteren van SARS-CoV-2 met respectievelijk 95% en 100% overeenstemming voor positieve en negatieve voorspelling. 16

Het all-in-one dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) systeem is ontwikkeld door Ding et al. 75 voor snellere, zeer gevoelige, zeer specifieke en optisch gebaseerde nucleïnezuurdetectie. Deze methode maakt gebruik van dubbele crRNA's om de doelgenoomsequentie efficiënt te detecteren. Het AIOD-CRISPR-systeem integreert alle componenten die nodig zijn voor doelnucleïnezuuramplificatie en CRISPR-systeemgebaseerde detectie in een enkele reactie die resulteerde in de schrapping van de behoefte aan afzonderlijke amplificatie en overdracht van geamplificeerd product. Het AIOD-CRISPR-systeem is ontworpen om te worden gebruikt voor de detectie van SARS-CoV-2 en HIV-1. Aangezien beide virale agentia retrovirussen zijn, werd het vermogen van het AIOD-CRISPR-systeem om elk van hun nucleïnezuurtoestanden (DNA en RNA) te detecteren, beoordeeld en werden hun nucleïnezuren met succes gedetecteerd. 75

Van de verschillende klassen van CRISPR-systemen veroorzaakt het CRISPR/Cas12-systeem, een RNA-geleide DNase, enkelstrengs DNA-splitsing na identificatie van het doelgebied. Het CRISPR/Cas12-vermogen om collaterale splitsing in enkelstrengs DNA te creëren, kan worden gebruikt om enkelstrengs reportermoleculen te vernietigen die fluorescente signalen genereren. 65 Zo kunnen CRISPR-Cas12-gerelateerde benaderingen in realtime worden gebruikt als een in situ diagnostisch hulpmiddel voor het diagnosticeren van SARS-CoV-2-infectie. Het CRISPR/Cas12a-systeem werd geïmplementeerd in een andere poging om de synthetische SARS-CoV-2-nucleïnezuursequenties betrouwbaar, gevoelig en snel te identificeren. 88 Synthetische sequenties van de RdRp-, ORF1b- en ORF1ab-genen werden in dit werk als referenties beschouwd. Het ontbreken van werkelijke monsters van SARS-CoV-2-gevallen in dit onderzoek kan worden bekritiseerd, maar in dit onderzoek werden geen echte monsters gebruikt vanwege het ontbreken van rapporten van patiënten die leden aan de ziekte SARS-CoV-2 in het studiegebied (Zuid Amerika). Om echte monsters na te bootsen, werden synthetische SARS-CoV-2-nucleïnezuursequenties toegevoegd aan het speekselmonster van een gezond persoon. Het gebruik van speeksel om SARS-CoV-2 te diagnosticeren is een redelijke benadering omdat het volledig niet-invasief is en het nemen van monsters snel en eenvoudig is. Er werd vastgesteld dat het CRISPR-diagnosesysteem dat in dit onderzoek is gebruikt, niet wordt geïnactiveerd in speeksel, dus het is een veelbelovend hulpmiddel voor nauwkeurige en snelle identificatie van echte SARS-CoV-2-monsters. 76

Wang et al. 77 heeft een snel en nauwkeurig op CRISPR/Cas12a gebaseerd systeem ontwikkeld waarmee met het blote oog kan worden gelezen (CRISPR/Cas12a-NER) om de detectie van het SARS-COV-2-genoom te stimuleren en te versnellen. 77 CRISPR/Cas12a-NER kan snel, betrouwbaar en gevoelig ten minste 10 kopieën van een viraal gen detecteren in 40 minuten zonder dat er gespecialiseerde instrumenten nodig zijn. Het ontworpen systeem bestaat uit Cas12-eiwit, SARS-COV-2-specifieke crRNA's en een enkelstrengs DNA-molecuul als reporter (gelabeld met een groen fluorescerend off-molecuul). Waar het genoom van SARS-COV-2 in het monster aanwezig is en wordt gedetecteerd door het ontworpen diagnostische systeem, wordt het reportermolecuul gesplitst door het Cas12-eiwit, wat resulteert in groen fluorescerend licht dat zichtbaar is voor het blote oog bij 458 nm. 77

Er zijn goedkope, zeer gevoelige, nauwkeurige, high-throughput en zeer effectieve methoden nodig om de ziekte onder controle te houden en zelfs asymptomatische patiënten in elke regio te herkennen. Studies hebben aangetoond dat, hoewel SARS-COV-2-patiënten geen tekenen of presymptomen hebben, ze sterk besmettelijk zijn en vele anderen kunnen infecteren. Daarom moedigen deze omstandigheden onderzoekers aan om snelle, nauwkeurige en zeer gevoelige methoden voor SARS-COV-2-detectie op grote schaal vast te stellen. In een poging om aan deze eisen te voldoen, is door Huang et al. een diagnostisch systeem ontwikkeld op basis van CRISPR. 78 De methode bestaat uit een CRISPR/Cas12a-systeem en een fluorescerende sonde voor de diagnose van RT-PCR- of RPA-versterkte amplicons, waardoor gevoelige en nauwkeurige detectie mogelijk is in gebieden die geen realtime PCR-systeem hebben. Er werd waargenomen dat het ontwikkelde systeem in staat was om positieve SARS-COV-2-monsters in ongeveer 50 minuten te detecteren, met de beperking om twee kopieën van de doel-RNA-sequenties voor elk monster te detecteren. In monsters met minder dan vijf kopieën van het geamplificeerde doel-DNA kon de qPCR-test echter geen detecteerbaar signaal produceren. Het gebruik van CRISPR bij detectie is heel gewoon geworden vanwege het vermogen van Cas13 om te binden aan het doel-RNA-molecuul en Cas12 om te binden aan het doel-DNA-molecuul door de gRNA-sequentie om een ​​splitsing in de sonde te maken om het detectiesignaal te produceren. 60,67 De meeste op CRISPR gebaseerde diagnostische methoden gebruiken papieren strips om het uitgangssignaal te detecteren. Het gebruik van papieren strips om afzonderlijke monsters te herkennen is een redelijke strategie, aangezien de tests geen speciale apparatuur vereisen, maar de verkregen detectielimiet (LoD) is erg laag in vergelijking met op fluorescentie gebaseerde benaderingen. De CRISPR-FDS-methode ontwikkeld door Huang et al. 78 zou gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd op microtiterplaten met 96 putjes die met precisie en gemak in de meeste goed uitgeruste laboratoria kunnen worden gebruikt met behulp van fluorescerende plaatlezers. 78 Over het algemeen waren de resultaten van dit onderzoek vergelijkbaar met de resultaten van de RT-qPCR-test uitgevoerd in openbare laboratoria, maar de CRISPR-FDS-methode leverde betrouwbaardere resultaten op dan die gerapporteerd in een klinische setting wanneer dezelfde RT-qPCR-test werd gebruikt . Opgemerkt moet worden dat de CRISPR-FDS-methode positieve resultaten heeft opgeleverd voor bepaalde monsters die negatieve resultaten hebben verkregen met de RT-qPCR-test, hoewel het niet mogelijk is om te beslissen of deze resultaten vals-positieven zijn voor CRISPR-FDS of vals-negatieven voor RT-qPCR vanwege een tekort aan geldige vervolggegevens. Daarom kan de CRISPR-FDS-methode worden beschouwd als een gevoelige en krachtige methode voor het produceren van resultaten met behulp van hulpmiddelen en beschikbare apparatuur voor gebruik in klinische laboratoria en zorginstellingen met geschikte apparatuur. Het CRISPR/FDS-systeem is zo ontworpen dat het duidelijke negatieve of positieve resultaten oplevert en virustiters zoals RT-qPCR niet kan kwantificeren, wat een nadeel is voor het CRISPR/FDS-systeem. Aangezien het hoofddoel echter is om een ​​snel, nauwkeurig en betrouwbaar COVID-19-detectiesysteem te ontwikkelen, kan deze tekortkoming niet als een belangrijke tekortkoming worden beschouwd. 78

Een diagnostische methode die bestaat uit een combinatie van CRISPR/Cas12a en RT-LAMP, het in vitro specifieke CRISPR-gebaseerde assay voor nucleïnezuurdiagnose (iSCAN)-systeem, werd geïntroduceerd in een poging van Ali et al. 89 om de tekortkomingen van SARS-CoV-2-detectie te verhelpen.89 De potentiële voordelen van het iSCAN-systeem zijn onder meer: ​​(i) hoge snelheid, (ii) precisie (vanwege de diagnose die afhankelijk is van SARS-CoV-2-nucleïnezuursequenties die worden gedetecteerd en geknipt door Cas12), (iii) inzetbaarheid in het veld ( omdat het alleen de basisinstrumenten nodig heeft), en (iv) eenvoudige bediening (omdat het gemakkelijke toegang tot testresultaten biedt door een colorimetrische reactie met laterale immunochromatografiestroom op te nemen). Het iSCAN-systeem is zeer geschikt voor vroege identificatie van COVID-19-dragers, zodat ze vroegtijdig kunnen worden geïdentificeerd en in quarantaine worden geplaatst, waardoor wordt voorkomen dat het virus zich wijd verspreidt. 89 Een ander diagnostisch hulpmiddel op basis van CRISPR, Cas12b-gemedieerde DNA-detectie (CDetection) genaamd, werd opgericht voor de detectie van SARS-CoV-2 in een poging van Guo et al. 82 Door behandelingsprotocollen voor monsters en nucleïnezuuramplificatiestrategieën op te nemen in CDetection, hebben ze een geïntegreerd viraal nucleïnezuurdetectiesysteem 'x02014CASdetect' (CRISPR-ondersteunde detectie) opgezet. De detectielimiet van het CASdetect-systeem was 1 - 104 kopieën/ml voor de identificatie van het SARS-CoV-2-pseudovirus, zonder kruisreactiviteit met andere menselijke endemische coronavirussen. 82

Op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde moleculaire detectie is momenteel de meest betrouwbare, snelle en goedkope benadering voor de diagnose van SARS-CoV-2-ziekte. Een flink aantal bedrijven en laboratoria hebben rRT-PCR-kits ontwikkeld. 90 De rRT-PCR-prestaties voor SARS-CoV-2-detectie vormen een aantal urgente uitdagingen, met name met onzekere negatieve of positieve resultaten die verband houden met de vaak voorkomende 'grijze zone' die wordt aangeduid met een hoge Ct-waarde. 91� Naast gebruikersfouten zoals onnauwkeurige bemonstering, reagentia van slechte kwaliteit en niet-gekalibreerde instrumenten, zijn ineffectieve RT-reactie en PCR-proliferatie van patiëntspecimens met zeer slechte virustiters waarschijnlijk de belangrijkste oorzaken van onnauwkeurige rRT-PCR-uitlezingen en onduidelijke diagnose. Hoewel de diagnose kan worden geverifieerd door herhaalde bemonstering en controle, is het oplossen van problemen tijdrovend en worden monsters met een lage virale belasting niet gedetecteerd bij milde of asymptomatische patiënten of in gevorderde gevallen, daarom leidt dit tot een vals-negatief resultaat dat kan zorgen over de bestrijding van de ziekte. 96 De identificatie van niet-specifieke trans-splitsingsactiviteiten in verschillende Cas-eiwitten, waaronder Cas12, Cas13 en Cas14, droeg bij aan de opkomst van de CRISPR-Diagnostics-strategie (CRISPR-Dx). 60,66,67,97� Het werkingsmechanisme van de CRISPR-Dx-techniek is gebaseerd, zoals aangetoond door het op Cas12a gebaseerde HOLMES-systeem,103 op de efficiënte trans-splitsingsactiviteit van Cas12a (na detectie van doelwit-DNA) tegen enkelstrengs DNA gelabeld met een fluorofoor quencher (FQ), waarvan het fluorescentiesignaal binnen enkele minuten exponentieel toeneemt. Op basis van dit mechanisme hebben Huang et al. 96 ontwikkelde een specifieke versterker voor de identificatie van nucleïnezuren geamplificeerd door PCR (SENA) om de nauwkeurigheid en efficiëntie van het detecteren van voorversterkte nucleïnezuursequenties van SARS-CoV-2 te verbeteren. Samenvattend analyseerden ze eerst SARS-CoV-2-monsters met behulp van rRT-PCR en vervolgens gevalideerde amplicons met onduidelijke uitlezingen door SENA. 96 Het SENA-diagnosesysteem was zeer gevoelig en specifiek en kon valse positieven en negatieven detecteren met een detectielimiet van twee kopieën per reactie lager dan de overeenkomstige rRT-PCR-test. Aanvankelijk werden de ampliconsequenties bepaald uit verschillende rRT-PCR-kits om geschikte cRNA's voor de SENA te ontwerpen, en vervolgens werd voor elk amplicon een specifiek crRNA ontworpen. Vervolgens werden kandidaat-crRNA's gescreend op de SENA bestaande uit Cas12a-, crRNA-, FQ-reporter- en rRT-PCR-producten, en de beste crRNA's werden geselecteerd voor verdere SENA-tests.

Vanwege de steekproevenverdeling van Poisson zijn replicavariaties erg belangrijk wanneer kopieën van sjablonen zijn ontworpen om klein te zijn (minder dan 3𠄴 kopieën/Rx), dicht bij de LoD voor rRT-PCR en erg laag (gelijk aan en kleiner dan 1 exemplaar/Rx). 104,105 Om het probleem van de bemonstering aan te pakken, werden negen replica's uitgevoerd voor groepen RNA-templates met een halve en één kopie/Rx, terwijl zes replica's werden uitgevoerd in elk van de andere concentratieniveaus. Na de rRT-PCR-reactie werden alle amplicons ingevoerd in drie verschillende SENA-reacties met crRNA's gerelateerd aan O- en N-genen en beide (N-SENA, O-SENA en mix-SENA). Door RNA-templates te verminderen tot minder dan drie kopieën per reactie, werd gevonden dat Ct-waarden hoger waren dan 38 (grenswaarde voor positief) in sommige replica's, voornamelijk gerelateerd aan het N-gen, maar wanneer het onder de 40 daalt, wordt aangenomen dat het de grijze zone binnengaat . Naarmate de concentratie van RNA-templates afneemt, nemen de Ct-waarden gestaag toe, waarbij de meeste replica's aangeven dat een of beide Ct-waarden de grijze zone binnenkomen en uiteindelijk worden ze allemaal negatief. Door Ct = 38 als grenswaarde voor positieve detectie te nemen, werd de detectielimiet voor O- en N-genen met een 95%-betrouwbaarheidsinterval (BI) van deze set van rRT-PCR geschat op 3,3 ≤ 4,0 ≤ 6,1 en 4,0 ≤ 4.1 ≤ 4.4, respectievelijk. De rRT-PCR-amplicons werden vervolgens onderzocht met het SENA-systeem om de fluorescentiesignalen voor elke replica te meten en na vergelijking van de toename in fluorescentie versus de snelheid van fluorescentieverandering tussen monsters op een bepaald moment ten opzichte van de negatieve controle (FC), de FC-parameter werd gedefinieerd als de verhouding van FC-waarden gemeten op de 10e en vijfde minuut na het begin van de fluorescentiemeting. Er is ook gevonden dat de effectiviteit van rRT-PCR voor zowel O- als N-genen verschilt van die van het SENA-systeem met afnemende templateconcentratie. De amplicons van de RNA-template werden onderzocht via NGS en er werd vastgesteld dat de bevindingen consistent waren met O-SENA- en mix-SENA-resultaten. Naast het vermijden van fout-positieve en fout-negatieve diagnoses, kan het zeer gevoelige SENA-systeem nuttig zijn om aan te tonen dat het virus is verwijderd uit herstelde gevallen. Aangezien het qPCR-systeem nog steeds het meest populaire moleculaire detectiesysteem is en het SENA-systeem opmerkelijk is door zijn operationele eenvoud, kan het SENA-systeem op grote schaal worden gebruikt om onduidelijkheidsproblemen van qPCR en andere moleculaire detectiesystemen op basis van amplificatie van nucleïnezuren op te lossen. 96

Recente trends in effectieve op CRISPR gebaseerde diagnostische systemen tonen aan dat het DTECTR-diagnosesysteem kan worden toegepast als een gemakkelijke, goedkope en snelle vervanging voor qRT-PCR, waarbij het verlies van gevoeligheid en specificiteit voor moleculaire detectie wordt vermeden. Een vergelijking van het DETECTR-systeem met qRT-PCR voor SARS-CoV-2-diagnose bij 378 patiënten onthulde een consensus van 95% in een poging van Brandsma et al. 106 Klinische monsterverdunningsbeoordelingen lieten een hogere analytische gevoeligheid van DETECTR zien in vergelijking met qRT-PCR, maar dit werd niet geverifieerd bij een meerderheid van de patiënten. Uit de bevindingen bleek dat zowel DETECTR- als qRT-PCR-technieken even gevoelig waren voor de SARS-CoV-2-diagnose. In het DETECTR-systeem kunnen verschillende gRNA's tegelijkertijd worden gebruikt om negatieve resultaten als gevolg van N-genmutaties te voorkomen. Het DETECTR-systeem was 100% specifiek voor het detecteren van nucleïnezuursequenties van SARS-CoV-2 en kon daarom geen andere menselijke coronavirussen herkennen. Bovendien, aangezien het DETECTR-systeem voor SARS-CoV-2-diagnose geen gespecialiseerde apparatuur vereist en kan worden gebruikt als een onafhankelijke qRT-PCR-methode in diagnostische laboratoria, kunnen PCR-systemen in het laboratorium worden gebruikt voor andere diagnostische werkzaamheden. 106

Op CRISPR gebaseerde diagnostische systemen worden momenteel beschouwd als in het veld inzetbare oplossingen. Het CRISPR-Cas12/gRNA-complex is een basisvorm van dergelijke systemen. Cas12/gRNA wordt geactiveerd wanneer het specifiek via gRNA bindt aan de doel-DNA-sequentie en vervolgens niet-specifiek de fluorofoor-quencher-paar-gelabelde enkelstrengs DNA-reportersonde splitst. Onlangs is aangetoond dat elektrische veldgradiënten kunnen worden gebruikt om dit op CRISPR gebaseerde diagnostische systeem te beheersen en te versnellen door het Cas12 / gRNA-complex, de reporter en het doelwit te cofocussen. 88 Een geschikte elektrische veldgradiënt kon worden verkregen met behulp van isotachoforese, een speciale ionische focusseringstechniek, toegepast op een microfluïdische chip. Over het algemeen werden on-chip elektrische veldcontrole en microfluïdica gecombineerd om twee zeer belangrijke stappen uit te voeren: (1) automatische extractie van nucleïnezuur uit primaire biologische monsters (hier werden nasofaryngeale monsters van patiënten met COVID-19 en gezonde controles gebruikt) en ( 2) toepassing van een elektrisch veld om de snelle enzymatische activiteit van het CRISPR/Cas12-complex te volgen en te beïnvloeden zodra de doelnucleïnezuursequentie wordt gedetecteerd. Dit maakt een gelijktijdige combinatie van enzymatische reacties, preconcentratie en snelheid mogelijk. Dit ontwikkelde microfluïdische systeem heeft niet alleen een klein volume aan reagentia nodig, maar staat ook open voor automatisering. Het werd beoordeeld voor het detecteren van SARS-CoV-2-nucleïnezuur in COVID-19-positieve en gezonde monsters. Uiteindelijk, als een opmerkelijk verschil met de huidige COVID-19-testprocedures, duurt dit proces slechts 30 minuten vanaf het voltooide onbewerkte monster. 107


Voorbeelden

Genetische circuits beoordelen

Het evalueren van de prestaties van genetische circuits in microplaatlezers is een gangbare praktijk, aangezien de momenteel beschikbare lezers worden geleverd met meetmogelijkheden voor OD, fluorescentie en luminescentie, en als methoden die omgaan met autofluorescentie van de plaat en de media, evenals van de cellen zijn ontwikkeld (Boyer et al., 2010 Lichten et al., 2014 Mihalcescu et al., 2015). In combinatie met robotische vloeistofbehandeling is de bereikte doorvoer voldoende hoog om de activiteit van de promotor op genomische schaal van een volledige bibliotheek van fluorescerende reporterstammen te kunnen meten (Zaslaver et al., 2006, 2009). In de handel verkrijgbare plaatlezers met (aangepaste) gerobotiseerde vloeistofverwerkingscapaciteiten zijn echter duur, en doe-het-zelf-oplossingen bieden een goedkoop en flexibel alternatief. (Takahashi et al., 2014) gebruikten bijvoorbeeld een 3D-geprinte houder van het kweekvat en een spuitpomp van ABS-kunststof om een ​​goedkope “turbidostat” te ontwerpen (Figuur 1a). Het apparaat heeft in-line OD- en fluorescentiedetectiemogelijkheden, geïmplementeerd via een eenvoudige laserdiode, lichtemitterende diode (LED) en een fotodetector.

Adaptieve laboratoriumevolutie-experimenten

In laboratoriumevolutie-experimenten (ALE) worden microbiële cellen gedurende langere tijd gekweekt onder een gekozen evolutionaire druk, door ofwel de kweek serieel te verdunnen of in een chemostaatmodus, figuren 3A,B (Lenski et al., 1991). Terwijl dergelijke experimenten al 30 jaar in laboratoria worden uitgevoerd, worden deze recentelijk gebruikt voor systeem- en synthetische biologie en biotechnologie (Buckling et al., 2009 Dragosits en Mattanovich, 2013). Veelvoorkomende evolutionaire druk omvat subletale antibioticaconcentraties en groei terwijl onnodige eiwitten of verbindingen worden geproduceerd onder een bepaald expressiesysteem (Dekel en Alon, 2005).

FIGUUR 3. Adaptief laboratorium evolutie-experiment. (EEN) Seriële verdunningspassage in schudkolven wordt vaak handmatig uitgevoerd (Dragosits en Mattanovich, 2013). De groeiparameters, zoals celdichtheid, pH en zuurstofniveaus, kunnen tijdens elke groeicyclus fluctueren. Biomed Centraal. Met toestemming overgenomen. (B) Chemostaatoperatie (Dragosits en Mattanovich, 2013). Het evolutie-experiment kan ook worden uitgevoerd met een continue toevoer van media en verdunning van bacteriële celdichtheid. De celdichtheid en andere omgevingscondities, zoals temperatuur, pH en zuurstofniveaus, worden constant gehouden. Biomed Centraal. Met toestemming overgenomen. (C) Een feedbackalgoritme op basis van de gemeten optische dichtheid wordt geïmplementeerd voor dynamische aanpassing van de geneesmiddelconcentratie in de morbidostaat (Toprak et al., 2012). Het apparaat werkt vergelijkbaar met de chemostaat, bij een bepaalde OD-waarde verdunt het de kweek door extra media te pompen, behalve hier dat het extra medium bij elke cyclus een hogere geneesmiddelconcentratie bevat. Natuur Publishing Group. Met toestemming overgenomen. (NS) Representatieve resultaten van de morbidostat (Toprak et al., 2012). de IC50, gedefinieerd als de antibiotische remmerconcentratie waarbij de groeisnelheid 50% is van de maximale groei bij nul-remmerconcentratie, wordt weergegeven voor het geneesmiddel trimethoprim in de loop van 20 dagen. De legende toont de kleurcodes voor vijf parallelle evolutie-experimenten. De stapsgewijze toename is duidelijk te zien. Natuur Publishing Group. Met toestemming overgenomen.

De lengte van ALE-experimenten en de behoefte aan constante kweekverdunning, evenals het bereik van verschillende selectiedrukken die zijn gekozen, maken ze goede kandidaten voor automatisering en doe-het-zelfontwerp (Gresham en Dunham, 2014). De “morbidostatâ” is bijvoorbeeld een aangepaste kweekoplossing die een feedbacklus gebruikt om de concentratie van antibiotica geleidelijk te verhogen bij een bepaalde gemeten OD, en zo de medicijnresistente mutant constant op de proef stelt (Toprak et al., 2012, 2013 ). Met behulp van de “morbidostatâ” en trimethoprim als testantibioticum, zijn stapsgewijze verhogingen van de resistentie tegen antibiotica (tot �-voudig gedurende � dagen) waargenomen en overeenkomstige mutaties in het doelwit van het medicijn geïdentificeerd, figuur 3D. Arias Castro JC rapporteert het ontwerp van 𠇎voBot,”, een robot gemaakt van LEGO ® MINDSTORMS ® NXT 2.0 voor geautomatiseerde verdunning tijdens ALE-experimenten (Arias-Castro, 2017). EvoBot is gemaakt van LEGO-stenen en wordt bestuurd met RWTH Mindstorms NXT Toolbox voor MATLAB (MathWorks). De kweek wordt rij voor rij in een plaat met 96 putjes geroerd, waar de robot elke volgende rij inoculeert en zo de noodzaak voor menselijk ingrijpen vermindert van eenmaal per dag tot ongeveer eenmaal per week.

Optogenetische interventie-bioreactoren

Onlangs is een reeks monochromatische optogenetische systemen ontwikkeld (Levskaya et al., 2005 Ohlendorf et al., 2012 Ryu en Gomelsky, 2014 Schmidl et al., 2014 Ramakrishnan en Tabor, 2016). Bovendien is tweekleurencontrole bereikt (Tabor et al., 2011) en recentelijk is driekleuren RGB-visie aangetoond in E coli (Fernandez-Rodriguez et al., 2017).

Light is een contactloze en veelzijdige oplossing voor bioprocescontrole en is als zodanig geïmplementeerd in verschillende aangepaste kweekapparatuur en als een add-on-optie voor in de handel verkrijgbare plaatlezers. (Davidson et al., 2013) ontwikkelden bijvoorbeeld een reeks LED's die op de bodem van een microplaat kunnen worden gemonteerd voor optogenetische controle, en Tabor en collega's construeerden een Light Tube Array en Light Plate Apparatus om licht te leveren aan individuele wells op een plaat met meerdere putjes (Olson et al., 2014 Gerhardt et al., 2016). De veelzijdigheid die kan worden bereikt (Davidson et al., 2013) laat zien dat een specifiek tweecomponentensysteem van cyanobacteriën fungeert als een laagdoorlaatfilter wanneer uitgedrukt in E coli en (Gerhardt et al., 2016) met succes specifieke genexpressieprofielen geprogrammeerd. Evenzo hebben verschillende groepen op maat ontworpen lichtgestuurde bioreactoren gerapporteerd, met behulp van platen met meerdere putjes (Lee et al., 2013) of vaten met een groter volume (Milias-Argeitis et al., 2011 Ruess et al., 2015 Wang en Yang, 2017), die schakelbare controle van genexpressie in micro-organismen demonstreert.

Add-on oplossingen voor het bereiken van optogenetische controle zijn ook gemeld. Moglich en collega's hebben bijvoorbeeld een bestaande Tecan-microplaatlezer aangepast en optische vezels toegevoegd voor lichte verlichting (Richter et al., 2015 figuur 2a). Het systeem is gebruikt voor: in vitro studie van Arabidopsis thaliana fytochroom B fotoactivatie, maar kan in principe gebruikt worden voor optogenetische controle.

Fotobioreactor voor fotosynthetische microalgen

Microalgen zijn een belangrijke grondstof voor de productie van nuttige verbindingen, zoals biobrandstoffen en hoogwaardige chemicaliën (Chisti, 2007 Angermayr et al., 2015). Bovendien is hun vermogen om CO . af te2 terwijl de productie van biomassa, die op zijn beurt een bron van energie en bioproducten is, steeds meer aandacht heeft gekregen (Katiyar et al., 2017). Microalgen zijn echter zeer divers met naar schatting 200.000 tot 20131.000.000 bestaande soorten (Guiry, 2012), waarbij elke soort verschillende lichtintensiteit, temperatuur en koolstofniveaus nodig heeft. Het optimaliseren van kweekomstandigheden voor het screenen van potentieel bruikbare algen is dus een onderzoeksuitdaging die kan profiteren van de flexibiliteit en lage kosten van doe-het-zelf-oplossingen. Chen en collega's assembleerden bijvoorbeeld optische microplaten, met behulp van LED's om licht te leveren aan individuele putjes en om de lipideconversie-efficiëntie van Dunaliella tertiolecta. Evenzo integreert de recent ontwikkelde “Photobiobox” een plaat met 96 putjes met LED's voor verlichting, in combinatie met lichtgradiëntfilters en waterblokken om lichtintensiteit en temperatuurgradiënten te bereiken (Heo et al., 2015), figuur 2c. Het apparaat werd gebruikt om 12 microalgenstammen uit zoet water te screenen op hun groei- en lipidenproductiepotentieel. Add-on-oplossingen zijn ook voorgesteld, Morschett en collega's hebben een commerciële microplaatlezer aangepast voor 48-voudige parallelle algenkweek door een 'fotomodule' op te nemen voor individuele putverlichting (Morschett et al., 2017).

Anaërobe teelt

Anaërobe kweek van micro-organismen is van toenemend belang in industriële biotechnologie, bijvoorbeeld bacterie Clostridium dat biochemisch oplosmiddelen synthetiseert (Green, 2011). Meestal wordt anaërobe kweken bereikt met behulp van gespecialiseerde anaërobe kasten (Leach et al., 1971). Hoewel agarplaatgroei kan worden uitgevoerd in anaërobe potten (Brewer en Brown, 1938 Brewer, 1942) en gasverpakkingen, en in de handel verkrijgbare buizen met rubberen stoppen kunnen worden gebruikt voor de groei van vloeibare culturen (Anderson en Fung, 1983), waarbij deze worden gebruikt zonder de anaërobe kasten maken het moeilijk om de groei van de cultuur te volgen (bijvoorbeeld OD meten). Wij stellen ons voor dat doe-het-zelf kweektechnologie de anaërobe teelt kan vereenvoudigen en goedkope en innovatieve oplossingen mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, onlangs gerapporteerd Moorella thermoacetica die zichzelf kan fotosynthetiseren via synthetisch geïntroduceerde cadiumzwavel (CdS) nanodeeltjes, is strikt anaëroob (Drake en Daniel, 2004 Sakimoto et al., 2016). De gerapporteerde fotosynthese vereist dus teelt onder anaërobe omstandigheden in aanwezigheid van licht.DIY-oplossingen kunnen worden ontworpen om aan het doel te voldoen, bioreactoren kunnen bijvoorbeeld worden voorzien van LED-licht en een specifieke gasbron. Elektronische componenten met een laag vermogen, zoals LED's en halfgeleiderfotodetectoren, kunnen op batterijvoeding werken, en de overdracht van verzamelde gegevens kan worden bereikt met draadloze communicatie, wat de mogelijkheid biedt om oplossingen te ontwerpen die ook in gespecialiseerde omgevingen kunnen worden geplaatst. Wij zijn daarom van mening dat een doe-het-zelf-oplossing voor anaërobe groei de mate en het gemak waarmee dergelijke micro-organismen worden gekweekt, kan vergroten.


Tecan tijdschriftartikelen

Toegang tot menselijke pluripotente embryonale stamcellen stelt Genea Biocells in staat om nieuwe therapieën te ontwikkelen voor de behandeling van een aantal neuromusculaire ziekten. Voortbouwend op bijna 30 jaar onderzoekserfgoed, gebruikt het bedrijf zijn expertise om spinale spieratrofie en facioscapulohumerale spierdystrofie te modelleren om mogelijke therapieën te identificeren.

De Monash Antibody Technologies Facility (MATF) in Victoria, Australië, heeft een nieuwe dimensie toegevoegd aan haar high-throughput-service en biedt screening op antilichaamfunctionaliteit. Deze tijdrovende fase is cruciaal voor veel projecten en kan nu worden uitbesteed aan MATF, waar uitgebreide en flexibele automatisering het testen in een fractie van de tijd voltooit.

De nieuwe Spark 20M multimode microplaatlezer biedt op maat gemaakte oplossingen voor vrijwel elke medicijnontdekking of geavanceerde biowetenschappelijke onderzoekstoepassing. Dit vrij configureerbare systeem geeft onderzoekers toegang tot nieuwe technieken en functies die bedoeld zijn om biochemische en celgebaseerde workflows te verbeteren en te stroomlijnen.

Het Karlsruhe Institute of Technology heeft geautomatiseerde protocollen voor scheiding van cellen met hoge doorvoer voor therapeutische toepassingen op een Freedom EVO® 200 vloeistofverwerkingsplatform. Het proces handhaaft de levensvatbaarheid van de cellen en is sneller en reproduceerbaarder dan handmatige methoden, waardoor 96 monsters in vier uur kunnen worden verwerkt.

Wetenschappers van de ADME Screening, Enzymology and Automation Group in Roche, Zwitserland, hebben met succes een mug® nanoliter vloeistofbehandelingsinstrument geïntegreerd met een Freedom EVO®-platform, waardoor nauwkeurig en nauwkeurig pipetteren bij zeer lage volumes mogelijk is.

Wetenschappers die werkzaam zijn in de Screening Unit van het Institute for Molecular Pharmacology in Duitsland, vinden het pipetteren van kleine volumes van de MultiChannel Arm™ 384 gunstig voor het onderzoek naar siRNA's en het screenen van kleine moleculen.

Tecan en pION Inc. hebben pION's PAMPA Explorer Test System™ gecombineerd met Tecan's microplaatlezers voor het screenen van geneesmiddelenpermeabiliteit met behulp van de Double-Sink™ parallelle kunstmatige membraanpermeabiliteitstest (PAMPA™).

Het Duitse leger heeft de bepaling van AChE-activiteit in volbloed geautomatiseerd. De bepaling van de cholinesterasestatus is in de eerste plaats bedoeld voor het analyseren van met organofosfaten vergiftigde patiënten (accidentele of suïcidale vergiftiging), maar kan ook worden toegepast na het gebruik van zenuwgas bij militaire conflicten of terroristische aanslagen, evenals in het kader van arbeidsgeneeskundige onderzoeken .


NS. Hoffmann, P. Begovatz, A.M. Nagel, R. Umathum, K. Schommer, P. Bachert, M. Bock, Een meetopstelling voor directe 17O MRI bij 7 T. Magn. Reson. Med. 66(4), 1109–1115 (2011)

W. Cui, X.-H. Zhu, M.L. Vollmers, E.T. Colonna, G. Adriany, B. Tramm, JM Dubinsky, G. Öz, Niet-invasieve meting van het cerebrale zuurstofmetabolisme in de muizenhersenen door ultrahoge veld 17O MR-spectroscopie. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 33(12), 1846–1849 (2013)

X.-H. Zhu, Y. Zhang, N. Zhang, K. Ugurbil, W. Chen, Niet-invasieve en driedimensionale beeldvorming van CMRO2 bij ratten bij 9,4 T: reproduceerbaarheidstest en normothermie / hypothermie-vergelijkingsstudie. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 27(6), 1225–1234 (2007)

A. Selzer, R.B. Sudrann, Betrouwbaarheid van de bepaling van het hartminuutvolume bij de mens door middel van het Fick-principe. Circa. Onderzoek 6(4), 485-490 (1958). https://doi.org/10.1161/01.res.6.4.485

SS Kety, C.F. Schmidt, De lachgasmethode voor de kwantitatieve bepaling van de cerebrale bloedstroom bij de mens: theorie, procedure en normale waarden. J. Clin. Investeren. 27(4), 476-483 (1948). https://doi.org/10.1172/JCI101994

Pittman, RN (2011) De bloedsomloop en zuurstoftransport, in Regulering van weefseloxygenatie. Morgan & Claypool Life Sciences.

SS Kety, C.F. Schmidt, De bepaling van de cerebrale doorbloeding bij de mens door het gebruik van lachgas in lage concentraties. Ben. J. Fysiologie-been. Inhoud 143(1), 53–66 (1945)

SL Peng, P. Su, F.N. Wang, Y. Cao, R. Zhang, H. Lu, P. Liu, Optimalisatie van fasecontrast-MRI voor de kwantificering van de cerebrale bloedstroom in de hele hersenen. J. Magn. Reson. In beeld brengen 42(4), 1126-1133 (2015). https://doi.org/10.1002/jmri.24866

DS Williams, J.A. Detre, J.S. Leigh, AP Koretsky, magnetische resonantie beeldvorming van perfusie met behulp van spin-inversie van arterieel water. Proc. nat. Acad. Wetenschap. 89(1), 212–216 (1992)

KR Thulborn, JC Waterton, P.M. Matthews, G.K. Radda, Oxygenatie-afhankelijkheid van de transversale relaxatietijd van waterprotonen in volbloed bij hoog veld. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Algemene vakken 714(2), 265–270 (1982)

DP Bulte, M. Kelly, M. Germuska, J. Xie, MA Chappell, T.W. Okell, M.G. Bright, P. Jezzard, kwantitatieve meting van cerebrale fysiologie met behulp van respiratoire gekalibreerde MRI. Neurobeeld 60(1), 582-591 (2012). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2011.12.017

CJ Gauthier, RD Hoge, magnetische resonantie beeldvorming van rustende OEF en CMRO (2) met behulp van een algemeen kalibratiemodel voor hypercapnie en hyperoxie. Neurobeeld 60(2), 1212-1225 (2012). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2011.12.056

RG Wise, A.D. Harris, A.J. Stone, K. Murphy, Meting van OEF en absolute CMRO2: op MRI gebaseerde methoden met behulp van interleaved en gecombineerde hypercapnie en hyperoxie. Neurobeeld 83, 135-147 (2013). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2013.06.008

X. Hij, D.A. Yablonskiy, Quantitative BOLD: mapping van het menselijke cerebrale gedeoxygeneerde bloedvolume en zuurstofextractiefractie: standaardstatus. Magn. Reson. Med. 57(1), 115-126 (2007). https://doi.org/10.1002/mrm.21108

S. Hubertus, S. Thomas, J. Cho, S. Zhang, Y. Wang, L.R. Schad, Vergelijking van gradiëntecho en gradiëntecho-bemonstering van spinecho-sequentie voor de kwantificering van de zuurstofextractiefractie van een gecombineerde kwantitatieve susceptibiliteitsmapping en kwantitatieve BOLD (QSM + qBOLD) benadering. Magn. Reson. Med. 82(4), 1491-1503 (2019). https://doi.org/10.1002/mrm.27804

DS Bolar, BR Rosen, A. Sorensen, E. Adalsteinsson, kwantitatieve beeldvorming van extractie van zuurstof en weefselconsumptie (QUIXOTIC) met behulp van venulair-gerichte snelheidsselectieve spin-labeling. Magn. Reson. Med. 66(6), 1550–1562 (2011)

H. Lu, F. Xu, K. Grgac, P. Liu, Q. Qin, P. van Zijl, Kalibratie en validatie van TRUST MRI voor de schatting van cerebrale bloedoxygenatie. Magn. Reson. Med. 67(1), 42-49 (2012). https://doi.org/10.1002/mrm.22970

LC Krishnamurthy, P. Liu, Y. Ge, H. Lu, Vaatspecifieke kwantificering van bloedoxygenatie met T2-relaxatie-onder-fase-contrast MRI. Magn. Reson. Med. 71(3), 978-989 (2014). https://doi.org/10.1002/mrm.24750

J. Guo, EC Wong, Veneuze oxygenatie in kaart brengen met behulp van snelheidsselectieve excitatie en arteriële nulling. Magn. Reson. Med. 68(5), 1458-1471 (2012). https://doi.org/10.1002/mrm.24145

AP Fan, T. Benner, DS Bolar, B.R. Rosen, E. Adalsteinsson, op fasen gebaseerd regionaal zuurstofmetabolisme (PROM) met behulp van MRI. Magn. Reson. Med. 67(3), 669-678 (2012). https://doi.org/10.1002/mrm.23050

EM Haacke, S. Lai, JR Reichenbach, K. Kuppusamy, F.G. Hoogenraad, H. Takeichi, W. Lin, In vivo meting van bloedzuurstofverzadiging met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming: een directe validatie van het bloedzuurstofniveau-afhankelijke concept in functionele hersenbeeldvorming. Brommen. Hersenen kaart. 5(5), 341–346 (1997)

EM Haacke, S. Liu, S. Buch, W. Zheng, D. Wu, Y. Ye, Quantitative susceptibility mapping: huidige status en toekomstige richtingen. Magn. Reson. In beeld brengen 33(1), 1-25 (2015). https://doi.org/10.1016/j.mri.2014.09.004

JF Dunn, Y. Zaim-Wadghiri, BW Pogue, I. Kida, BOLD MRI vs. NIR-spectrofotometrie Zal de beste techniek naar voren komen? Adv. Exp. Med. Biol. 454, 103–113 (1998)

T. Nagaoka, F. Zhao, P. Wang, N. Harel, R.P. Kennan, S. Ogawa, S.-G. Kim, Verhoging van het zuurstofverbruik zonder verandering van het cerebrale bloedvolume tijdens visuele stimulatie onder hypotensie. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 26(8), 1043–1051 (2006)

K. Nakamura, Y. Shiroto, Y. Tamura, K. Koyama, K. Takeuchi, M. Amanuma, T. Nagasawa, S. Ozawa, Een toename van de gedeoxygeneerde hemoglobineconcentratie veroorzaakt door een werkgeheugentaak tijdens de refractaire periode in de hemodynamische respons in de menselijke hersenschors. neurosci. Let. 714, 134531 (2020). https://doi.org/10.1016/j.neulet.2019.134531

S. Ogawa, R.S. Menon, DW Tank, S.G. Kim, H. Merkle, J.M. Ellermann, K. Ugurbil, Functionele hersenmapping door bloedoxygenatieniveau-afhankelijke contrast magnetische resonantie beeldvorming. Een vergelijking van signaalkarakteristieken met een biofysisch model. Biofysica. J. 64(3), 803-812 (1993). https://doi.org/10.1016/S0006-3495(93)81441-3

JL Boxerman, L.M. Hamberg, B.R. Rosen, R. M. Weisskoff, MR-contrast vanwege intravasculaire magnetische gevoeligheidsverstoringen. Magn. Reson. Med. 34(4), 555–566 (1995)

RB Buxton, L.R. Frank, Een model voor de koppeling tussen cerebrale bloedstroom en zuurstofmetabolisme tijdens neurale stimulatie. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 17(1), 64–72 (1997)

RD Hoge, J. Atkinson, B. Gill, GR. Crelier, S. Marrett, GB. Pike, Lineaire koppeling tussen cerebrale bloedstroom en zuurstofverbruik in geactiveerde menselijke cortex. Proc. nat. Acad. Wetenschap. 96(16), 9403–9408 (1999)

TL Davis, KK Kwong, R.M. Weisskoff, BR Rosen, Gekalibreerde functionele MRI: de dynamiek van het oxidatieve metabolisme in kaart brengen. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 95(4), 1834-1839 (1998). https://doi.org/10.1073/pnas.95.4.1834

RL Grubb Jr., M.E. Raichle, J.O. Eichling, M. M. Ter-Pogossian, De effecten van veranderingen in PaCO2 cerebrale bloedvolume, bloedstroom en vasculaire gemiddelde transittijd. Hartinfarct 5(5), 630–639 (1974)

E. Rostrup, G.M. Knudsen, I. Law, S. Holm, H.B. Larsson, O.B. Paulson, De relatie tussen cerebrale doorbloeding en volume bij mensen. Neurobeeld 24(1), 1–11 (2005)

VADER. Ciris, M. Qiu, R.T. Constable, niet-invasieve MRI-meting van de absolute cerebrale bloedvolume-cerebrale bloedstroomrelatie tijdens visuele stimulatie bij gezonde mensen. Magn. Reson. Med. 72(3), 864-875 (2014). https://doi.org/10.1002/mrm.24984

RD Hoge, J. Atkinson, B. Gill, GR. Crelier, S. Marrett, GB. Pike, onderzoek naar de afhankelijkheid van het BOLD-signaal van de cerebrale bloedstroom en zuurstofverbruik: het deoxyhemoglobine-verdunningsmodel. Magn. Reson. Med. 42(5), 849-863 (1999). https://doi.org/10.1002/(sici)1522-2594(199911)42:5%3c849::aid-mrm4%3e3.0.co2-z

V.E. Griffeth, RB Buxton, een theoretisch raamwerk voor het schatten van veranderingen in het cerebrale zuurstofmetabolisme met behulp van de gekalibreerde BOLD-methode: modellering van de effecten van bloedvolumeverdeling, hematocriet, zuurstofextractiefractie en weefselsignaaleigenschappen op het BOLD-signaal. Neurobeeld 58(1), 198–212 (2011)

DP Bulte, K. Drescher, P. Jezzard, Vergelijking van op hypercapnie gebaseerde kalibratietechnieken voor het meten van het cerebrale zuurstofmetabolisme met MRI. Magn. Reson. Med. 61(2), 391-398 (2009). https://doi.org/10.1002/mrm.21862

VADER. Chiarelli, DP Bulte, R. Wise, D. Gallichan, P. Jezzard, een kalibratiemethode voor kwantitatieve BOLD fMRI op basis van hyperoxie. Neurobeeld 37(3), 808-820 (2007). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2007.05.033

CJ Gauthier, L. Desjardins-Crepeau, C. Madjar, L. Bherer, RD Hoge, Absolute kwantificering van het zuurstofmetabolisme in rust en metabole reactiviteit tijdens functionele activering met behulp van QUO2 MRI. Neurobeeld 63(3), 1353-1363 (2012). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2012.07.065

DA Yablonskiy, Kwantificering van intrinsieke magnetische gevoeligheidsgerelateerde effecten in een weefselmatrix. Phantom studie. Magn. Reson. Med. 39(3), 417-428 (1998). https://doi.org/10.1002/mrm.1910390312

X. Hij, M. Zhu, D.A. Yablonskiy, Validatie van zuurstofextractiefractiemeting door qBOLD-techniek. Magn. Reson. Med. 60(4), 882-888 (2008). https://doi.org/10.1002/mrm.21719

DA Carpenter, RL Grubb Jr., L.W. Tempel, WJ Powers, Cerebrale zuurstofmetabolisme na aneurysmale subarachnoïdale bloeding. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 11(5), 837-844 (1991). https://doi.org/10.1038/jcbfm.1991.143

H. Yamauchi, H. Fukuyama, Y. Nagahama, H. Nabatame, M. Ueno, S. Nishizawa, J. Konishi, H. Shio, Betekenis van verhoogde zuurstofextractiefractie in de prognose van vijf jaar van ernstige cerebrale arteriële occlusieve ziekten. J. Nucl. Med. 40(12), 1992–1998 (1999)

MN Diringer, K. Yundt, T.O. Videen, R.E. Adams, AR. Zazulia, E. Deibert, V. Aiyagari, R.G. Dacey, RL Grubb, WJ Powers, Geen vermindering van het cerebrale metabolisme als gevolg van vroege matige hyperventilatie na ernstig traumatisch hersenletsel. J. Neurochirurg. 92(1), 7–13 (2000)

H. Lu, Y. Ge, Kwantitatieve evaluatie van oxygenatie in veneuze bloedvaten met behulp van T2-Relaxation-Under-Spin-Tagging MRI. Magn. Reson. Med. 60(2), 357-363 (2008). https://doi.org/10.1002/mrm.21627

RM Botnar, M. Stuber, P.G. Danias, K.V. Kissinger, WJ Manning, Verbeterde definitie van de kransslagader met T2-gewogen, vrij ademende, driedimensionale coronaire MRA. Circulatie 99(24), 3139-3148 (1999). https://doi.org/10.1161/01.cir.99.24.3139

GA Wright, BS Hu, A. Macovski, Het schatten van zuurstofverzadiging van bloed in vivo met MR-beeldvorming bij 1,5 T. J. Magn. Reson. In beeld brengen 1(3), 275–283 (1991)

MJ Silvennoinen, C.S. Clingman, X. Golay, R.A. Kauppinen, PC van Zijl, Vergelijking van de afhankelijkheid van bloed R2 en R2* van zuurstofverzadiging bij 1,5 en 4,7 Tesla. Magn. Reson. Med. 49(1), 47-60 (2003). https://doi.org/10.1002/mrm.10355

JM Zhao, CS Clingman, MJ Narvainen, RA Kauppinen, PC van Zijl, Oxygenatie en hematocrietafhankelijkheid van transversale relaxatiesnelheden van bloed bij 3T. Magn. Reson. Med. 58(3), 592-597 (2007). https://doi.org/10.1002/mrm.21342

F. Xu, Y. Ge, H. Lu, Niet-invasieve kwantificering van het hersenmetabolisme van de hele hersenen (CMRO2) door MRI. Magn. Reson. Med. 62(1), 141-148 (2009). https://doi.org/10.1002/mrm.21994

P. Liu, I. Dimitrov, T. Andrews, D.E. Crane, J.K. Dariotis, J. Desmond, J. Dumas, G. Gilbert, A. Kumar, BJ Maclntosh, Multisite-evaluaties van een T 2-relaxation-under-spin-tagging (TRUST) MRI-techniek om hersenoxygenatie te meten. Magn. Reson. Med. 75(2), 680–687 (2016)

P. Liu, F. Xu, H. Lu, Test-hertest reproduceerbaarheid van een snelle methode om het zuurstofmetabolisme in de hersenen te meten. Magn. Reson. Med. 69(3), 675-681 (2013). https://doi.org/10.1002/mrm.24295

F. Xu, J. Uh, M.R. Brier, J. Hart Jr., U.S. Yezhuvath, H. Gu, Y. Yang, H. Lu, De invloed van koolstofdioxide op hersenactiviteit en metabolisme bij bewuste mensen. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 31(1), 58-67 (2011). https://doi.org/10.1038/jcbfm.2010.153

F. Xu, P. Liu, JM Pascual, G. Xiao, H. Lu, Effect van hypoxie en hyperoxie op de cerebrale bloedstroom, bloedoxygenatie en oxidatief metabolisme. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 32(10), 1909-1918 (2012). https://doi.org/10.1038/jcbfm.2012.93

F. Xu, P. Liu, J.J. Pekar, H. Lu, verandert acute inname van cafeïne het hersenmetabolisme bij jonge volwassenen? Neurobeeld 110, 39–47 (2015)

P. Liu, H. Huang, N. Rollins, LF Chalak, T. Jeon, C. Halovanic, H. Lu, Kwantitatieve beoordeling van de globale cerebrale stofwisseling van zuurstof (CMRO2) bij pasgeborenen met behulp van MRI. NMR Biomed. 27(3), 332–340 (2014)

SL Peng, J.A. Dumas, DC Park, P. Liu, F.M. Filbey, CJ McAdams, A.E. Pinkham, B. Adinoff, R. Zhang, H. Lu, Leeftijdsgerelateerde toename van de ruststofwisseling in het menselijk brein. Neurobeeld 98, 176-183 (2014). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2014.04.078

Y. Ge, Z. Zhang, H. Lu, L. Tang, H. Jaggi, J. Herbert, J.S. Babb, H. Rusinek, R.I. Grossman, Karakterisering van het zuurstofmetabolisme in de hersenen bij patiënten met multiple sclerose met T2-relaxatie-onder-spin-tagging MRI. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 32(3), 403-412 (2012). https://doi.org/10.1038/jcbfm.2011.191

BP Thomas, M. Sheng, B.Y. Tseng, T. Tarumi, K. Martin-Cook, K.B. Womack, MC Cullum, BD Levine, R. Zhang, H. Lu, Verminderd globaal hersenmetabolisme maar handhaafde vasculaire functie bij amnestische milde cognitieve stoornissen. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 37(4), 1508-1516 (2017). https://doi.org/10.1177/0271678X16658662

Z. Wei, J. Xu, P. Liu, L. Chen, W. Li, P. van Zijl, H. Lu, Kwantitatieve beoordeling van cerebraal veneus bloed T2 in muis bij 11,7 T: implementatie, optimalisatie en leeftijdseffect. Magn. Reson. Med. 80(2), 521–528 (2018)

MA Bernstein, K.F. Koning, XJ Zhou, Handboek van MRI-pulssequenties (Elsevier, 2004).

JA Polzin, M.T. Alley, FR Korosec, TM. Grist, Y. Wang, CA Mistretta, een fasecontrasttechniek met complexe differentiatie voor het meten van volumestroomsnelheden. J. Magn. Reson. In beeld brengen 5(2), 129-137 (1995). https://doi.org/10.1002/jmri.1880050202

MA Bernstein, Y. Ikezaki, vergelijking van faseverschil en complexe verschilverwerking in fasecontrast MR-angiografie. J. Magn. Reson. In beeld brengen 1(6), 725-729 (1991). https://doi.org/10.1002/jmri.1880010620

J.S. Perlmutter, WJ Powers, P. Herscovitch, P.T. Fox, ME Raichle, regionale asymmetrieën van cerebrale bloedstroom, bloedvolume en zuurstofgebruik en extractie bij normale proefpersonen. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 7(1), 64-67 (1987). https://doi.org/10.1038/jcbfm.1987.9

M. Ibaraki, S. Miura, E. Shimosegawa, S. Sugawara, T. Mizuta, A. Ishikawa, M. Amano, Kwantificering van cerebrale doorbloeding en zuurstofmetabolisme met 3-dimensionale PET en 15O: validatie door vergelijking met 2- dimensionale PET. J. Nucl. Med. 49(1), 50-59 (2008). https://doi.org/10.2967/jnumed.107.044008

LC Krishnamurthy, D. Mao, K.S. King, H. Lu, Correctie en optimalisatie van een T2-gebaseerde benadering om bloedoxygenatie in kleine hersenaders in kaart te brengen. Magn. Reson. Med. 75(3), 1100-1109 (2016). https://doi.org/10.1002/mrm.25686

E.Y. Liu, J. Guo, A.B. Simon, F. Haist, D.J. Dubowitz, R.B. Buxton, het potentieel voor gasvrije metingen van het absolute zuurstofmetabolisme tijdens zowel baseline- als activeringstoestanden in het menselijk brein. Neurobeeld 207, 116342 (2020). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2019.116342

K. Ishii, M. Sasaki, H. Kitagaki, S. Sakamoto, S. Yamaji, K. Maeda, Regionaal verschil in cerebrale doorbloeding en oxidatief metabolisme in de menselijke cortex. J. Nucl. Med. 37(7), 1086–1088 (1996)

MA Fernandez-Seara, A. Techawiboonwong, J.A. Detre, FW Wehrli, MR susceptometrie voor het meten van globale zuurstofextractie in de hersenen. Magn. Reson. Med. 55(5), 967-973 (2006). https://doi.org/10.1002/mrm.20892

M. Cerdonio, S. Morante, S. Vitale, [21] Magnetische gevoeligheid van hemoglobines, in Methoden in Enzymologie. (Elsevier, 1981), blz. 354-371

RM Weisskoff, S. Kiihne, MRI-susceptometrie: beeldgebaseerde meting van absolute gevoeligheid van MR-contrastmiddelen en menselijk bloed. Magn. Reson. Med. 24(2), 375-383 (1992). https://doi.org/10.1002/mrm.1910240219

JF Schenck, De rol van magnetische gevoeligheid bij beeldvorming door magnetische resonantie: MRI magnetische compatibiliteit van de eerste en tweede soort. Med. Fys. 23(6), 815-850 (1996). https://doi.org/10.1118/1.597854

C. Li, MC Langham, C.L. Epstein, JF Magland, J. Wu, J. Gee, FW Wehrli, Nauwkeurigheid van de cilinderbenadering voor susceptometrische meting van intravasculaire zuurstofsaturatie. Magn. Reson. Med. 67(3), 808-813 (2012). https://doi.org/10.1002/mrm.23034

ZB Rodgers, J.A. Detre, FW Wehrli, MRI-gebaseerde methoden voor het kwantificeren van de cerebrale stofwisseling van zuurstof. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 36(7), 1165-1185 (2016). https://doi.org/10.1177/0271678X16643090

V. Jain, MC Langham, FW Wehrli, MRI-schatting van het wereldwijde zuurstofverbruik van de hersenen. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 30(9), 1598-1607 (2010). https://doi.org/10.1038/jcbfm.2010.49

X. Feng, A. Deistung, JR Reichenbach, Quantitative Susceptibility Mapping (QSM) en R2 * in het menselijk brein bij 3 T: evaluatie van herhaalbaarheid binnen de scanner. Z. Med. Fys. 28(1), 36–48 (2018)

Y. Wang, T. Liu, Quantitative Susceptibility Mapping (QSM): het decoderen van MRI-gegevens voor een weefselmagnetische biomarker. Magn. Reson. Med. 73(1), 82-101 (2015). https://doi.org/10.1002/mrm.25358

J. Liu, T. Liu, L. de Rochefort, J. Ledoux, I. Khalidov, W. Chen, A.J. Tsiouris, C. Wisnieff, P. Spincemaille, MR Prince, Morfologie maakten dipoolinversie mogelijk voor kwantitatieve gevoeligheidskartering met behulp van structurele consistentie tussen het magnitudebeeld en de gevoeligheidskaart. Neurobeeld 59(3), 2560–2568 (2012)

JR Reichenbach, F. Schweser, B. Serres, A. Deistung, Quantitative susceptibility mapping: concepten en toepassingen. clin. neuroradiaal. 25(S2), 225-230 (2015). https://doi.org/10.1007/s00062-015-0432-9

V. Jain, O. Abdulmalik, K.J. Propert, FW Wehrli, Onderzoek naar de magnetische gevoeligheidseigenschappen van vers menselijk bloed voor niet-invasieve kwantificering van zuurstofverzadiging. Magn. Reson. Med. 68(3), 863-867 (2012). https://doi.org/10.1002/mrm.23282

WM Spees, DA Yablonskiy, MC Oswood, J.J. Ackerman, Waterproton MR-eigenschappen van menselijk bloed bij 1,5 Tesla: magnetische gevoeligheid, T1, T2, T en niet-Lorentzisch signaalgedrag. Magn. Reso. Med. Uit. J. Int. soc. Mag. Reson. Med. 45(4), 533–542 (2001)

K. Kudo, T. Liu, T. Murakami, J. Goodwin, I. Uwano, F. Yamashita, S. Higuchi, Y. Wang, K. Ogasawara, A. Ogawa, M. Sasaki, Zuurstofextractiefractiemeting met behulp van kwantitatieve gevoeligheidsmapping: vergelijking met positronemissietomografie. J. Cereb. Bloedstroom. Metab. 36(8), 1424-1433 (2016). https://doi.org/10.1177/0271678X15606713

J. Zhang, T. Liu, A. Gupta, P. Spincemaille, TD Nguyen, Y. Wang, Kwantitatieve mapping van cerebrale metabolische snelheid van zuurstof (CMRO2) met behulp van kwantitatieve susceptibility mapping (QSM). Magn. Reson. Med. 74(4), 945-952 (2015). https://doi.org/10.1002/mrm.25463

J. Zhang, D. Zhou, TD Nguyen, P. Spincemaille, A. Gupta, Y. Wang, Cerebrale metabolische snelheid van zuurstof (CMRO2) mapping met hyperventilatie-uitdaging met behulp van kwantitatieve susceptibility mapping (QSM). Magn. Reson. Med. 77(5), 1762-1773 (2017). https://doi.org/10.1002/mrm.26253

J. Zhang, J. Cho, D. Zhou, TD Nguyen, P. Spincemaille, A. Gupta, Y. Wang, Kwantitatieve gevoeligheidsmapping-gebaseerde cerebrale metabolische snelheid van zuurstofkartering met minimale lokale variantie. Magn. Reson. Med. 79(1), 172-179 (2018). https://doi.org/10.1002/mrm.26657

KL Leenders, D. Perani, A.A. Lammertsma, JD Heather, P. Buckingham, MJ Healy, JM Gibbs, RJ Wise, J. Hatazawa, S. Herold et al., Cerebrale bloedstroom, bloedvolume en zuurstofgebruik. Normale waarden en effect van leeftijd. Brein 113(Pt 1), 27-47 (1990). https://doi.org/10.1093/brain/113.1.27

J. Cho, Y. Kee, P. Spincemaille, TD Nguyen, J. Zhang, A. Gupta, S. Zhang, Y. Wang, Cerebrale metabolische snelheid van zuurstof (CMRO2) mapping door kwantitatieve susceptibility mapping (QSM) en kwantitatieve bloedoxygenatieniveau-afhankelijke beeldvorming (qBOLD). Magn. Reson. Med. 80(4), 1595-1604 (2018). https://doi.org/10.1002/mrm.27135

FF Jobsis, niet-invasieve, infrarood monitoring van cerebrale en myocardiale zuurstoftoereikendheid en circulatieparameters. Wetenschap 198(4323), 1264-1267 (1977). https://doi.org/10.1126/science.929199

PL Madsen, N.H. Secher, Near-infrared oximetry of the brain. prog. neurobiol. 58(6), 541-560 (1999). https://doi.org/10.1016/s0301-0082(98)00093-8

CE Elwell, JR Henty, T.S. Leung, T. Austin, J.H. Meek, DT Delpy, J.S. Wyatt, Meting van CMRO 2 bij pasgeborenen die intensieve zorg ondergaan met behulp van nabij-infraroodspectroscopie, in Zuurstoftransport naar weefsel XXVI. (Springer, 2005), blz. 263-268

L. Skov, O. Pryds, G. Greisen, H. Lou, Schatting van cerebrale veneuze verzadiging bij pasgeboren baby's door nabij-infraroodspectroscopie. Kinderarts Onderzoek 33(1), 52-55 (1993). https://doi.org/10.1203/00006450-199301000-00011

CW Yoxall, AM Weindling, Meting van het cerebrale zuurstofverbruik bij de menselijke pasgeborene met behulp van nabij-infraroodspectroscopie: het cerebrale zuurstofverbruik neemt toe met de voortschrijdende zwangerschapsduur. Kinderarts Onderzoek 44(3), 283–290 (1998)

SJ Matcher, M. Cope, D.T. Delpy, gebruik van het waterabsorptiespectrum om veranderingen in de weefselchromofoorconcentratie in nabij-infraroodspectroscopie te kwantificeren. Fys. Med. Biol. 39(1), 177-196 (1994). https://doi.org/10.1088/0031-9155/39/1/011

S. Matcher, C. Cooper, Absolute kwantificering van deoxyhemoglobineconcentratie in weefsel nabij-infraroodspectroscopie. Fys. Med. Biol. 39(8), 1295 (1994). https://doi.org/10.1088/0031-9155/39/8/008

A. Rinnan, F. Van Den Berg, S.B. Engelsen, Overzicht van de meest voorkomende voorbewerkingstechnieken voor nabij-infraroodspectra. TrAC Trends anaal. Chem. 28(10), 1201–1222 (2009)

H. Dehghani, F. Leblond, B.W. Pogue, F. Chauchard, Toepassing van spectrale afgeleide gegevens in zichtbare en nabij-infraroodspectroscopie. Fys. Med. Biol. 55(12), 3381 (2010). https://doi.org/10.1088/0031-9155/55/12/008

S. Wray, M. Cope, D.T. Delpy, J.S. Wyatt, E.O. Reynolds, Karakterisering van de nabij-infraroodabsorptiespectra van cytochroom aa3 en hemoglobine voor de niet-invasieve monitoring van cerebrale oxygenatie. Biochim Biophys Acta 933(1), 184-192 (1988). https://doi.org/10.1016/0005-2728(88)90069-2

RF Reinoso, BA Telfer, M. Rowland, Weefselwatergehalte bij ratten gemeten door uitdroging. J. Pharmacol. Toxicol. Methoden: 38(2), 87-92 (1997). https://doi.org/10.1016/s1056-8719(97)00053-1

KM Tichauer, J.T. Elliott, J.A. Hadway, DS Lee, T.-Y. Lee, K. St, Lawrence, Gebruik van nabij-infraroodspectroscopie om de cerebrale metabolische snelheid van zuurstof te meten onder meerdere niveaus van arteriële oxygenatie bij biggen. J. Appl. Fysiol. 109(3), 878–885 (2010)

R. Springett, J. Newman, M. Cope, D.T. Delpy, Zuurstofafhankelijkheid en precisie van cytochroomoxidasesignaal van volledige spectrale NIRS van de biggenhersenen. Ben. J. Fysiol. Hart Circ. Fysiol. 279(5), H2202-H2209 (2000). https://doi.org/10.1152/ajpheart.2000.279.5.H2202

Q. Zhang, S. Srinivasan, Y. Wu, S. Natah, JF Dunn, Een bijna-infraroodkalibratiemethode die geschikt is voor het kwantificeren van breedbandgegevens bij mensen. J. Neurosci. Methoden: 188(2), 181-186 (2010). https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.200.01.037

M. Hashem, Q. Zhang, Y. Wu, T.W. Johnson, JF Dunn, Een multimodale nabij-infraroodspectroscopie en MRI gebruiken om de metabolische snelheid van grijze stof voor zuurstof te kwantificeren: een hypothermie-validatieonderzoek. Neurobeeld 206, 116315 (2020). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2019.116315

JF Dunn, Q. Zhang, Y. Wu, S. Srinivasan, MR Smith, R.A. Shaw, Monitoring van angiogenese niet-invasief met nabij-infraroodspectroscopie. J. Biomed. opt. 13(6), 064043 (2008). https://doi.org/10.1117/1.3000431

CE Cooper, D.T. Delpy, EM Nemoto, De relatie van zuurstofafgifte tot absolute hemoglobine-oxygenatie en mitochondriale cytochroomoxidase-redoxtoestand in de volwassen hersenen: een onderzoek met bijna-infraroodspectroscopie. Biochem. J. 332(3), 627-632 (1998). https://doi.org/10.1042/bj3320627

R. Yang, Q. Zhang, Y. Wu, JF Dunn, Monitoring van angiogenese met behulp van een voor mensen geschikte kalibratie voor breedband nabij-infraroodspectroscopie. J. Biomed. opt. 18(1), 016011 (2013)

MJT Van De Ven, W.N.J.M. Colier, MC Van Der Sluijs, D. Walraven, B. Oeseburg, H. Folgering, Kan het cerebrale bloedvolume reproduceerbaar worden gemeten met een verbeterd nabij-infraroodspectroscopiesysteem? J. Cereb. Bloedstroom Metab. 21(2), 110-113 (2001). https://doi.org/10.1097/00004647-200102000-00002

J.S. Wyatt, D.T. Delpy, M. Cope, S. Wray, E.O.R. Reynolds, Kwantificering van cerebrale oxygenatie en hemodynamiek bij zieke pasgeboren baby's door nabij-infraroodspectrofotometrie. Lancet 328(8515), 1063-1066 (1986). https://doi.org/10.1016/s0140-6736(86)90467-8

T. Wolf, U. Lindauer, U. Reuter, T. Back, A. Villringer, K. Einhäupl, U. Dirnagl, Niet-invasieve nabij-infraroodspectroscopie monitoring van regionale cerebrale bloedoxygenatieveranderingen tijdens peri-infarctdepolarisaties bij focale cerebrale ischemie in de Rat. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 17(9), 950-954 (1997). https://doi.org/10.1097/00004647-199709000-00004

C. Elwell, M. Cope, A. Edwards, J. Wyatt, D. Delpy, E. Reynolds, Kwantificering van cerebrale hemodynamica bij volwassenen door nabij-infraroodspectroscopie. J. Appl. Fysiol. 77(6), 2753–2760 (1994)

KM Tichauer, J.A. Hadway, T.Y. Lee, K. St Lawrence, Meting van cerebraal oxidatief metabolisme met nabij-infraroodspectroscopie: een validatiestudie. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 26(5), 722-730 (2006). https://doi.org/10.1038/sj.jcbfm.9600230

DW Brown, J. Hadway, T.-Y. Lee, Near-infrared spectroscopie meting van zuurstofextractiefractie en cerebrale stofwisseling van zuurstof bij pasgeboren biggen. Kinderarts Onderzoek 54(6), 861-867 (2003). https://doi.org/10.1203/01.pdr.0000090928.93045.be

LM Hamberg, G.J. Hunter, D. Kierstead, E.H. Lo, R. Gilberto Gonzalez, GL Wolf, Meting van het cerebrale bloedvolume met driedimensionale functionele CT-aftrekking. AJNR Am. J. Neuroradiol. 17(10), 1861–1869 (1996)

U. Sabatini, P. Celsis, G. Viallard, A. Rascol, J.P. Marc-Vergnes, Kwantitatieve beoordeling van het cerebrale bloedvolume door single-photon emissie computertomografie. Hartinfarct 22(3), 324-330 (1991). https://doi.org/10.1161/01.str.22.3.324

DW Brown, PA Picot, J.G. Naeini, R. Springett, D.T. Delpy, T.-Y. Lee, Kwantitatieve nabij-infraroodspectroscopiemeting van cerebrale hemodynamica bij pasgeboren biggen. Kinderarts Onderzoek 51(5), 564–570 (2002)

D. Bereczki, L. Wei, T. Otsuka, V. Acuff, K. Pettigrew, C. Patlak, J. Fenstermacher, Hypoxia verhoogt de snelheid van de bloedstroom door parenchymale microvasculaire systemen in rattenhersenen. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 13(3), 475–486 (1993)

M. Phelps, S. Huang, E. Hoffman, D. Kuhl, Validatie van tomografische meting van het cerebrale bloedvolume met C-11-gelabeld carboxyhemoglobine. J. Nucl. Med. 20(4), 328–334 (1979)

HM Watzman, CD Kurth, LM Montenegro, J. Rome, JM Steven, SC Nicolson, arteriële en veneuze bijdragen aan nabij-infrarood cerebrale oximetrie. anesthesiologie 93(4), 947-953 (2000). https://doi.org/10.1097/00000542-200010000-00012

NC Brun, A. Moen, K. Borch, O.D. Saugstad, G. Greisen, Near-infrared monitoring van de zuurstofsaturatie van het hersenweefsel en het bloedvolume bij pasgeboren biggen. Ben. J. Fysiol. 273(2 punt 2), H682-H686 (1997). https://doi.org/10.1152/ajpheart.1997.273.2.H682

S. Ijichi, T. Kusaka, K. Isobe, F. Islam, K. Okubo, H. Okada, M. Namba, K. Kawada, T. Imai, S. Itoh, Kwantificering van cerebrale hemoglobine als functie van oxygenatie met bijna-infrarood tijdsopgeloste spectroscopie in een biggenmodel van hypoxie. J. Biomed. opt. 10(2), 024026 (2005)

Matcher, SJ, PJ Kirkpatrick, K. Nahid, M. Cope en DT Delpy. Absolute kwantificatiemethoden in nabij-infraroodspectroscopie van weefsel. in Optische tomografie, fotonmigratie en spectroscopie van weefsel en modelmedia: theorie, menselijke studies en instrumentatie. 1995. Internationale Vereniging voor Optica en Fotonica.

Suzuki, S., S. Takasaki, T. Ozaki en Y. Kobayashi. Weefseloxygenatiemonitor met NIR-ruimtelijk opgeloste spectroscopie. in Optische tomografie en spectroscopie van weefsel III. 1999. Internationale Vereniging voor Optica en Fotonica.

MEVROUW. Patterson, B. Chance, BC Wilson, Tijdsopgeloste reflectie en transmissie voor de niet-invasieve meting van optische eigenschappen van weefsel. toepassing opt. 28(12), 2331–2336 (1989)

E. Sevick, B. Chance, J. Leigh, S. Nioka, M. Maris, Kwantificering van tijd- en frequentie-opgeloste optische spectra voor de bepaling van weefseloxygenatie. Anaal. Biochem. 195(2), 330–351 (1991)

Yamashita, Y., M. Oda, E. Olimae en M. Tamura. Continue meting van oxy- en deoxyhemoglobine van biggenhersenen door tijdsopgeloste spectroscopie. in Biomedische optische spectroscopie en diagnostiek. 1998. Optical Society of America.

Oda, M., Y. Yamashita, T. Nakano, A. Suzuki, K. Shimizu, I. Hirano, F. Shimomura, E. Ohmae, T. Suzuki en Y. Tsuchiya. Near-infrared time-resolved spectroscopiesysteem voor weefseloxygenatiemonitor. in Optische tomografie en spectroscopie van weefsel III. 1999. Internationale Vereniging voor Optica en Fotonica.

K. Verdecchia, M. Diop, T.Y. Lee, K. St. Lawrence, Kwantificering van de cerebrale stofwisseling van zuurstof door diffuse correlatiespectroscopie en in de tijd opgeloste nabij-infraroodspectroscopie te combineren. J. Biomed. Opt 18(2), 27007 (2013). https://doi.org/10.1117/1.JBO.18.2.027007

A. Liebert, H. Wabnitz, J. Steinbrink, H. Obrig, M. Möller, R. Macdonald, A. Villringer, H. Rinneberg, Time-resolved multidistance near-infrared spectroscopie van het volwassen hoofd: intracerebrale en extracerebrale absorptieveranderingen van distributiemomenten van vluchttijden van fotonen. toepassing opt. 43(15), 3037–3047 (2004)

JT Elliott, M. Diop, K.M. Tichauer, T.-Y. Lee, KS Lawrence, Kwantitatieve meting van de cerebrale bloedstroom in een juveniel varkensmodel door diepte-opgeloste nabij-infraroodspectroscopie. J. Biomed. opt. 15(3), 037014 (2010)

E. Gratton, Nabij-infrarood optische spectroscopie van weefsel met behulp van een LED-frequentiedomeinspectrometer. Adv. opt. Beeldvorming Foton Migr. Tech. Verteren 1994, 212–215 (1994)

Ma, H.Y., Q. Xu, J. Bellesteros, V. Ntziachristos, Q. Zhang en B. Chance. Kwantitatieve studie van hypoxie-stress in biggenhersenen door IQ-fasemodulatie-oximetrie. in Optische tomografie en spectroscopie van weefsel III. 1999. Internationale Vereniging voor Optica en Fotonica.

MA Franceschini, DA Boas, A. Zourabian, S.G. Diamond, S. Nadgir, D.W. Lin, JB Moore, S. Fantini, Near-infrared spiroximetry: niet-invasieve metingen van veneuze verzadiging bij biggen en mensen. J. Appl. Fysiol. 92(1), 372–384 (2002)

Du, C., Andersen, C., en Chance, B. Kwantitatieve detectie van hemoglobineverzadiging op biggenhersenen door nabij-infrarood frequentiedomeinspectroscopie. in Fotonvoortplanting in weefsels III, vol. 3194. (International Society for Optics and Photonics, 1998), blz. 55-62. https://doi.org/10.1117/12.301089

SR Arridge, M. Cope, D. Delpy, De theoretische basis voor de bepaling van optische padlengtes in weefsel: temporele en frequentieanalyse. Fys. Med. Biol. 37(7), 1531 (1992)

D. Delpy, M. Cope, kwantificering in nabij-infraroodspectroscopie van weefsel. Filosofische transacties van de Royal Society of London. ser. B Biol. Wetenschap. 352(1354), 649–659 (1997)

M. Dehaes, A. Aggarwal, P.-Y. Lin, C. Rosa Fortuno, A. Fenoglio, N. Roche-Labarbe, J.S. Soul, MA Franceschini, P.E. Grant, Cerebrale zuurstofmetabolisme bij neonatale hypoxische ischemische encefalopathie tijdens en na therapeutische hypothermie. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 34(1), 87–94 (2014)

N. Roche-Labarbe, S.A. Carp, A. Surova, M. Patel, D.A. Boas, P.E. Grant, M.A. Franceschini, Niet-invasieve optische metingen van CBV, StO2, CBF-index en rCMRO2 in de hersenen van menselijke premature pasgeborenen in de eerste zes weken van hun leven. Brommen. Hersenen kaart. 31(3), 341–352 (2010)

A. Edwards, C. Richardson, M. Cope, J. Wyatt, D. Delpy, E. Reynolds, Cotside-meting van de cerebrale bloedstroom bij zieke pasgeboren baby's door nabij-infraroodspectroscopie. Lancet 332(8614), 770–771 (1988)

JH Meek, L. Tyszczuk, C.E. Elwell, J. Wyatt, Cerebrale bloedstroom neemt tijdens de eerste drie dagen van het leven toe bij extreem premature pasgeborenen. Boog. Dis. Kind. Foetale pasgeborenen. Ed. 78(1), F33-F37 (1998)

M. Noone, M. Sellwood, J. Meek, J. Wyatt, Postnatale aanpassing van de cerebrale bloedstroom met behulp van nabij-infraroodspectroscopie bij extreem premature baby's die hoogfrequente oscillerende ventilatie ondergaan. Acta Pediatr. 92(9), 1079–1084 (2003)

J. Patel, K. Marks, I. Roberts, D. Azzopardi, A.D. Edwards, Meting van de cerebrale bloedstroom bij pasgeboren baby's met behulp van nabij-infraroodspectroscopie met indocyaninegroen. Kinderarts Onderzoek 43(1), 34–39 (1998)

KM Tichauer, D.W. Brown, J. Hadway, T.Y. Lee, K. St. Lawrence, Nabij-infraroodspectroscopiemetingen van cerebrale bloedstroom en zuurstofverbruik na hypoxie-ischemie bij pasgeboren biggen. J. Appl. Fysiol. 100(3), 850-857 (2006). https://doi.org/10.1152/japplphysiol.00830.2005

R. Springett, Y. Sakata, D.T. Delpy, Nauwkeurige meting van de cerebrale bloedstroom bij pasgeboren biggen uit de boluspassage van indocyaninegroen. Phys Med Biol 46(8), 2209-2225 (2001). https://doi.org/10.1088/0031-9155/46/8/312

EH Niggemann, T. Patrick, K.P. Sunnergren, MD Winniford, LD. Hillis, Detectie van intracardiale links-naar-rechts rangeren bij volwassenen: een prospectieve analyse van de variabiliteit van de standaard indocyanine groen techniek bij patiënten zonder rangeren. Ben. J. Cardiol. 60(4), 355–357 (1987)

VADER. Anderson, K. W. Bowyer, RH Jones, Effecten van leeftijd op radionuclide angiografische detectie en kwantificering van links-naar-rechts shunts. Ben. J. Cardiool. 53(7), 879–883 (1984)

HU Bucher, A.D. Edwards, A.E. Lipp, G. Duc, Vergelijking tussen nabij-infraroodspectroscopie en 133xenonklaring voor schatting van de cerebrale bloedstroom bij ernstig zieke premature baby's. Kinderarts Onderzoek 33(1), 56-60 (1993). https://doi.org/10.1203/00006450-199301000-00012

V. Jain, EM Buckley, D.J. Licht, JM Lynch, PJ Schwab, M.Y. Naim, NA Lavin, SC Nicolson, LM Montenegro, AG Yodh, FW Wehrli, Cerebrale zuurstofmetabolisme bij pasgeborenen met een aangeboren hartaandoening gekwantificeerd door MRI en optica. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 34(3), 380-388 (2014). https://doi.org/10.1038/jcbfm.2013.214

M. Diop, J. Kishimoto, V. Toronov, D.S. Lee, K. St Lawrence, Ontwikkeling van een gecombineerd breedband nabij-infrarood en diffusiecorrelatiesysteem voor het bewaken van de cerebrale bloedstroom en oxidatief metabolisme bij premature baby's. biomed. opt. uitdrukken 6(10), 3907-3918 (2015). https://doi.org/10.1364/BOE.6.003907

C. Cheung, J.P. Culver, K. Takahashi, J.H. Greenberg, A.G. Yodh, In vivo cerebrovasculaire meting die diffuse nabij-infraroodabsorptie- en correlatiespectroscopieën combineert. Fys. Med.Biol. 46(8), 2053-2065 (2001). https://doi.org/10.1088/0031-9155/46/8/302

D. Boas, A. Yodh, Ruimtelijk variërende dynamische eigenschappen van troebele media onderzocht met diffunderende tijdelijke lichtcorrelatie. J. Opt. soc. Ben. Een opt. Afbeelding Wetenschap. Zicht. 14, 192–215 (1997)

M. Schweiger, S. Arridge, optische tomografische reconstructie in een complex hoofdmodel met behulp van a priori regiogrensinformatie. Fys. Med. Biol. 44(11), 2703 (1999)

BA Brooksby, H. Dehghani, B.W. Pogue, KD Paulsen, Nabij-infrarood (NIR) tomografie borstbeeldreconstructie met a priori structurele informatie van MRI: algoritmeontwikkeling voor het reconstrueren van heterogeniteiten. IEEE J. Sel. Bovenkant. Kwantum Elektron. 9(2), 199–209 (2003)

V. Ntziachristos, X. Ma, B. Chance, Tijd-gecorreleerde enkele foton-tellende imager voor gelijktijdige magnetische resonantie en nabij-infrarood mammografie. ds. Sci. Instrument. 69(12), 4221–4233 (1998)

H. Xu, R. Springett, H. Dehghani, B.W. Pogue, KD Paulsen, JF Dunn, Magnetisch-resonantie-beeldvorming-gekoppeld breedband nabij-infrarood tomografiesysteem voor hersenonderzoek bij kleine dieren. toepassing opt. 44(11), 2177-2188 (2005). https://doi.org/10.1364/ao.44.002177

Q. Zhu, N. Chen, S.H. Kurtzman, Imaging tumor angiogenese door gebruik te maken van gecombineerd nabij-infrarood diffuus licht en ultrageluid. opt. Let. 28(5), 337–339 (2003)

A. Li, E.L. Miller, ME Kilmer, T.J. Brukilacchio, T. Chaves, J. Stott, Q. Zhang, T. Wu, M. Chorlton, R.H. Moore, Tomografische optische borstbeeldvorming geleid door driedimensionale mammografie. toepassing opt. 42(25), 5181–5190 (2003)

J.F. Dunn, N. Nathoo, R. Yang, Een verhaal van twee methoden: het combineren van nabij-infraroodspectroscopie met MRI voor studies van hersenoxygenatie en metabolisme, in Zuurstoftransport naar weefsel XXXVI. (Springer, 2014), blz. 65-71

L. Gagnon, M.A. Yücel, M. Dehaes, R.J. Cooper, KL Perdue, J. Selb, T.J. Huppert, RD Hoge, DA Boas, Kwantificering van de corticale bijdrage aan het NIRS-signaal over de motorische cortex met behulp van gelijktijdige NIRS-fMRI-metingen. Neurobeeld 59(4), 3933-3940 (2012). https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2011.10.054

H. Xu, B.W. Pogue, H. Dehghani, R. Springett, K.D. Paulsen, JF Dunn, Haalbaarheid van NIR-tomografische reconstructie met multispectrale continue golfgegevens door in kaart te brengen in frequentiedomeingegevens. In optische tomografie en spectroscopie van weefsel V. Int. soc. opt. Fotonica 4955, 103 (2003)

A. Kleinschmidt, H. Obrig, M. Requardt, K.-D. Merboldt, U. Dirnagl, A. Villringer, J. Frahm, Gelijktijdige opname van cerebrale bloedoxygenatieveranderingen tijdens activering van de menselijke hersenen door magnetische resonantiebeeldvorming en nabij-infraroodspectroscopie. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 16(5), 817–826 (1996)

T. Temma, M. Yamazaki, J. Miyanohara, H. Shirakawa, N. Kondo, K. Koshino, S. Kaneko, H. Iida, Sequentiële PET-schatting van het cerebrale zuurstofmetabolisme met spontane ademhaling van 15O-gas bij muizen met bilaterale gemeenschappelijke halsslagader stenose. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 37(10), 3334–3343 (2017)

NS. Yee, K. Lee, PA Jerabek, PT Fox, Kwantitatieve meting van het zuurstofmetabolisme in de hersenen van ratten met behulp van microPET-beeldvorming van kort ingeademd 15O-gelabeld zuurstofgas. nucl. Med. gemeenschappelijk 27(7), 573–581 (2006)

X.-H. Zhu, JM Chen, T.-W. Tu, W. Chen, S.-K. Lied, gelijktijdige en niet-invasieve beeldvorming van cerebrale zuurstofmetabolisme, bloedstroom en zuurstofextractiefractie bij muizen met een beroerte. Neurobeeld 64, 437–447 (2013)

S. Lou, V.C. Lepak, L.E. Eberly, B. Roth, W. Cui, X.-H. Zhu, G. Öz, JM Dubinsky, Zuurstofconsumptietekort in de hersenen van muizen met de ziekte van Huntington onder metabole stress. Brommen. Mol. Genet. 25(13), 2813–2826 (2016)

D. Fiat, S. Kang, Bepaling van de snelheid van cerebrale zuurstofconsumptie en regionale cerebrale bloedstroom door niet-invasieve 17O in vivo NMR-spectroscopie en magnetische resonantiebeeldvorming: deel 2. Bepaling van CMRO2, voor de rat door 17O NMR, en CMRO2, rCBF en de partitiecoëfficiënt voor de kat door 17O MRI. neurol. Onderzoek 15(1), 7–22 (1993)

F. Hyder, R.P. Kennan, I. Kida, G.F. Mason, KL Behar, D. Rothman, Afhankelijkheid van zuurstofafgifte op de bloedstroom in rattenhersenen: een onderzoek naar nucleaire magnetische resonantie van 7 tesla. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 20(3), 485–498 (2000)

C. Peeters-Scholte, E. Van Den Tweel, F. Groenendaal, F. Van Bel, Redox-toestand van nabij-infraroodspectroscopie gemeten cytochroom aa3 correleert met vertraagd cerebraal energiefalen na perinatale hypoxie-ischemie bij het pasgeboren varken. Exp. Hersenonderzoek. 156(1), 20-26 (2004). https://doi.org/10.1007/s00221-003-1761-5

M. Tsuji, H. Naruse, J. Volpe, D. Holtzman, Reductie van cytochroom aa 3 gemeten door nabij-infraroodspectroscopie voorspelt cerebrale energieverlies bij hypoxische biggen. Kinderarts Onderzoek 37(3), 253–259 (1995)

T. Shinoka, G. Nollert, D. Shum-Tim, A. du Plessis, R.A. Jonas, nut van nabij-infrarood spectroscopische metingen tijdens diepe hypothermische circulatiestilstand. Ann. Thorac. Surg. 69(2), 578–583 (2000)

JD Winter, KM Tichauer, N. Gelman, R.T. Thompson, T.-Y. Lee, K. St, Lawrence, veranderingen in cerebrale zuurstofconsumptie en hoogenergetische fosfaten tijdens vroeg herstel bij hypoxisch-ischemische biggen: een gecombineerd onderzoek naar nabij-infrarood- en magnetische resonantiespectroscopie. Kinderarts Onderzoek 65(2), 181-187 (2009). https://doi.org/10.1203/pdr.0b013e31818f06fb

EL Rolett, A. Azzawi, K.J. Liu, MN Yongbi, H.M. Swartz, JF Dunn, Kritische zuurstofspanning in rattenhersenen: een gecombineerd 31P-NMR- en EPR-oximetrieonderzoek. Ben. J. Fysiologie-Regulat. Integreren. Samenstelling Fysiol. 279(1), R9-R16 (2000). https://doi.org/10.1152/ajpregu.2000.279.1.r9

M. D'Esposito, L.Y. Deouell, A. Gazzaley, Wijzigingen in het BOLD fMRI-signaal met veroudering en ziekte: een uitdaging voor neuroimaging. nat. Rev. Neurosci. 4(11), 863-872 (2003). https://doi.org/10.1038/nrn1246

W. Lin, WJ Powers, zuurstofmetabolisme bij acute ischemische beroerte. J. Cereb. Bloedstroom Metab. 38(9), 1481-1499 (2018). https://doi.org/10.1177/0271678X17722095

NR Sims, H. Muyderman, mitochondriën, oxidatief metabolisme en celdood bij een beroerte. Biochimica en Biophysica Acta (BBA)- Mol. Basis Dis. 1802(1), 80–91 (2010)

ML Diaz-Hung, M.E. Gonzalez Fraguela, Oxidatieve stress bij neurologische aandoeningen: oorzaak of gevolg? neurologie 29(8), 451-452 (2014). https://doi.org/10.1016/j.nrl.2013.06.022

S. Nikam, P. Nikam, S.K. Ahaley, AV Sontakker, oxidatieve stress bij de ziekte van Parkinson. Indiaan J. Clin. Biochem. 24(1), 98-101 (2009). https://doi.org/10.1007/s12291-009-0017-y

C. Zhou, Y. Huang, S. Przedborski, Oxidatieve stress bij de ziekte van Parkinson: een mechanisme van pathogene en therapeutische betekenis. Ann. NY Acad. Wetenschap. 1147, 93-104 (2008). https://doi.org/10.1196/annals.1427.023

WJ Powers, TO Videen, J. Markham, K.J. Black, N. Golchin, J.S. Perlmutter, Cerebrale mitochondriale stofwisseling bij de vroege ziekte van Parkinson. J. Cereb. Bloed. Stroom Metab. 28(10), 1754-1760 (2008). https://doi.org/10.1038/jcbfm.2008.63

H. Braak, K. Del Tredici, U. Rub, R.A. de Vos, EN Jansen Steur, E. Braak, Staging van hersenpathologie gerelateerd aan de sporadische ziekte van Parkinson. neurobiol. Veroudering 24(2), 197-211 (2003). https://doi.org/10.1016/s0197-4580(02)00065-9

MA Lovell, WR Markesbery, oxidatieve DNA-schade bij milde cognitieve stoornissen en de ziekte van Alzheimer in een laat stadium. Nucleïnezuren Res. 35(22), 7497-7504 (2007). https://doi.org/10.1093/nar/gkm821

RL Buckner, AZ Snyder, BJ Shannon, G. LaRossa, R. Sachs, A.F. Fotenos, Y.I. Sheline, W.E. Klunk, CA Mathis, JC Morris, Moleculaire, structurele en functionele karakterisering van de ziekte van Alzheimer: bewijs voor een verband tussen standaardactiviteit, amyloïde en geheugen. J. Neurosci. 25(34), 7709–7717 (2005)

IK P. Barcelos, R. M. Troxell, J.S. Graves, mitochondriale disfunctie en multiple sclerose. Biologie (Bazel) 8(2), 37 (2019). https://doi.org/10.3390/biology8020037

LP Rowland, NA Shneider, Amyotrofische laterale sclerose. N. Engl. J. Med. 344(22), 1688–1700 (2001)

BG Jenkins, W.J. Koroshetz, M.F. Beal, BR Rosen, Bewijs voor irnnairment van energiemetabolisme in vivo bij de ziekte van Huntington met behulp van gelokaliseerde 1H NMR-spectroscopie. Neurologie 43(12), 2689–2689 (1993)

WJ Koroshetz, B.G. Jenkins, BR Rosen, M.F. Beal, Energiemetabolismedefecten bij de ziekte van Huntington en effecten van co-enzym Q10. Ann. neurol. 41(2), 160-165 (1997). https://doi.org/10.1002/ana.410410206

MC Hsieh, L.W. Kuo, Y.A. Huang, J.H. Chen, Onderzoek naar hyperoxische effecten in de hersenen van ratten met behulp van kwantitatieve gevoeligheidsmapping op basis van MRI-fase. Magn. Reson. Med. 77(2), 592-602 (2017). https://doi.org/10.1002/mrm.26139


De toekomst van DNA-fingerprinting

De komst van massaal parallelle high-throughput genomische sequencing ongeveer 10 jaar geleden was een adembenemende stap voorwaarts in de nog korte geschiedenis van moleculaire genetica en genomica (zie bijvoorbeeld de recensies van Mardis [294], Metzker [295] , en Rothberg en Leamon [296]). De immense snelheid waarmee DNA-sequenties kunnen worden gelezen door 454 pyrosequencing, SOLID, Illumina en andere machines had ook een aanzienlijke en tweevoudige impact op de ontwikkeling en het gebruik van moleculaire markers in het algemeen, en op DNA-fingerprinting in het bijzonder. Aan de ene kant kunnen conventionele markers zoals microsatellieten en SNP's nu worden ontdekt met lagere kosten en moeite en met ongekende snelheden. Aan de andere kant worden DNA-markertechnologieën momenteel achtereenvolgens aangevuld of zelfs vervangen door het sequencingproces zelf, zoals wordt uitgedrukt door de term “genotyping-by-sequencing” [87.297.298] (zie ook de Special Issue of Moleculaire ecologie 22(11), 2013).

Ontdekking van nucleaire microsatellieten door high-throughput DNA-sequencing

Het is duidelijk dat willekeurige high-throughput-sequencing van genomisch DNA zichzelf biedt als een nuttige strategie om allerlei soorten repetitief DNA in een genoom te identificeren, inclusief microsatellieten. Toch duurde het enkele jaren voordat dit potentieel werd gerealiseerd. In een van de eerste rapporten over het gebruik van de volgende generatie DNA-sequencing voor de ontwikkeling van microsatellietmarkers, gebruikten Abdelkrim en collega's [299] een 454-platform om 17.215 metingen van niet-geselecteerd, gefragmenteerd genomisch DNA van de blauwe eend te produceren (Hymenolaimos malacorhynchos), een watervogelsoort die endemisch is in Nieuw-Zeeland. Elke read had een gemiddelde grootte van 243਋p, wat neerkomt op een totaal van ongeveer 4,1 Mb. Met behulp van geschikte bioinformatica-tools werden microsatellieten gedetecteerd in 231 metingen. Het aantal geschikte markerloci werd echter teruggebracht tot 24 door de noodzaak om primers aan weerszijden van de microsatelliet te ontwerpen. Dertien van de primerparen vertoonden polymorfisme en 13 markers werden dus gegenereerd in een enkele sequencing-run.

Santana en collega's [300] gebruikten ook 454-technologie om microsatellietmarkers te maken van een schimmel (de pijnboompathogeen Fusarium circinatum), een insect (de wesp Sirex noctilio) en een nematode (Deladenus siridicola). Twee methoden, ISSR-PCR en snelle isolatie door AFLP van sequenties die herhalingen bevatten (FIASCO), werden gebruikt om het matrijs-DNA voor microsatellieten te verrijken voorafgaand aan sequencing. In totaal werd 1,2 tot 1,7 Mb DNA gesequenced en werden 873 potentieel amplificeerbare microsatellieten geïdentificeerd met voldoende flankerende sequentie beschikbaar voor primerontwerp. Er is een set van 28 SSR-flankerende primerparen ontwikkeld voor Fusarium circinatum. Hiervan leverden 19 enkele fragmenten op in het verwachte groottebereik en 13 produceerden polymorfe amplicons van een reeks schimmelisolaten. De auteurs genereerden ook een traditionele bibliotheek van F. circinatum DNA verrijkt voor microsatellieten door de ISSR-methode. Sanger-sequencing van 100 klonen uit deze bibliotheek leverde slechts acht potentieel amplificeerbare microsatellieten op.

Opnieuw met behulp van een 454-platform zochten Allentoft en collega's [301] naar microsatellieten in een oude DNA-bron, een botfragment van een uitgestorven Nieuw-Zeelandse moa-soort (een loopvogel). Er werden in totaal 79.796 sequenties verkregen met een gemiddelde lengte van 112਋p. Van de 195 di-, tri- en tetranucleotide-herhalingen die aanwezig zijn in de dataset, kon uiteindelijk slechts één polymorfe microsatellietmarker worden gegenereerd. Deze lage opbrengst kan worden verklaard door de oude bron en daarom de gedegradeerde staat van het DNA en dus korte leeslengtes.

De bovenstaande drie artikelen zijn gepubliceerd in hetzelfde nummer van BioTechnieken en gaf voor het eerst aan dat high-throughput sequencing een sterk potentieel heeft om SSR-markers te isoleren van niet-modelorganismen waar geen genomische informatie bestaat. De nieuwe methoden besparen veel tijd en zijn ook kostenefficiënt in vergelijking met traditioneel verrijkingsklonen. Csencsics en collega's [302] hebben bijvoorbeeld ongeveer US $ 5.000 uitgegeven om microsatellietmarkers voor de plantensoort te ontwikkelen Typha minima binnen 6  weken. In hun onderzoek werden 307 di-, tri- en tetranucleotide-herhalingen gevonden in een totaal van 76.692 sequentielezingen. Honderd loci werden geselecteerd voor primerontwerp, 30 primerparen werden getest en leverden 17 polymorfe markers op.

De relatief lange leeslengtes die door 454 sequencing worden verschaft, vergemakkelijken de identificatie van voldoende flankerende sequentie aan weerszijden van de SSR voor het ontwerp van PCR-primers. 454-technologie had daarom aanvankelijk de voorkeur boven andere sequencing-benaderingen van de volgende generatie voor het genereren van SSR-markers. In planten werd 454 sequencing voor het eerst toegepast op microsatellietisolatie in Typha minima[302], Amaranthus tuberculatus[303] en Vigna radiata[304]. Er volgden nog veel meer onderzoeken en genomische shotgun-sequencing verving al snel de traditionele verrijkingsstrategieën als de voorkeursmethode voor het genereren van sets van microsatellietmarkers in elk organisme (zie de recensie door Zalapa en collega's [305]). Meer recentelijk is SSR-identificatie van genomische sequencing met gepaarde uiteinden met behulp van de meer economische Illumina-platforms bepleit door verschillende werkgroepen [306.307], vooral omdat de gemiddelde lengte van Illumina-lezingen in de loop der jaren aanzienlijk is toegenomen. Castoe en collega's [306] toonden bijvoorbeeld in één slang en twee vogelsoorten dat 454 en Illumina vergelijkbare aantallen potentieel amplificeerbare SSR's detecteren op een read-by-read-basis, maar de veel lagere kosten per nucleotide waarvan de sequentie is bepaald, zijn duidelijk in het voordeel van Illumina.

Aangezien de sequencing-methodologie zich nog steeds in hoog tempo ontwikkelt, mag een verdere daling van de kosten worden verwacht. De grote hoeveelheid sequentiegegevens die zelfs in een kleinschalig experiment worden verkregen, maakt een top-down selectie van de meest veelbelovende kandidaten mogelijk (bijvoorbeeld alleen trinucleotide-herhalingen of alleen perfecte herhalingen). Verrijking van microsatellietmotieven voorafgaand aan sequencing wordt soms bepleit [307,308], maar is in de meeste gevallen waarschijnlijk niet nodig [306]. Het gebruik van (bar)coded adapters en primers voor de amplificatiestap maakt de parallelle sequencing van meerdere templates tegelijk mogelijk [307.309], wat verder bijdraagt ​​aan de efficiëntie van de methode. Met behulp van barcode-adapters (ook bekend als multiplex identifier-adapters), waren Takayama en collega's [310] dus in staat om een ​​groot aantal microsatellieten te isoleren van slechts 10.000 tot 20.000 genomische 454 reads van elk van zes niet-verwante plantensoorten tegen lage kosten.

Wat betreft de leeslengte van high-throughput sequencingplatforms, is onlangs een grote doorbraak bereikt door Pacific Bioscience, wiens SMRT-cellen leeslengtes tot 15 kb produceren. De kwaliteit van de sequentie is echter relatief laag. Daarom werd gesuggereerd om bovendien reads te produceren met een ander sequencing-platform (bijvoorbeeld Illumina) om de lange PacBio-reads te corrigeren in een hybride sequencing-benadering [311]. Een ander alternatief is gebaseerd op de circularisatie van templatemoleculen voorafgaand aan single-molecuul sequencing, en multipass-sequencing van dezelfde circulaire templates werd gerapporteerd om zeer nauwkeurige consensussequenties te genereren [312]. Meest recent toonden Grohme en collega's [313] voor het eerst het succesvolle gebruik van circulaire consensus-sequencing met één molecuul op een PacBio RS-platform voor het ontdekken van SSR-markers in het genoom van een gans, Anser albifrons. Welke technologie ook wordt gebruikt voor sequencing, het is essentieel dat er geschikte bio-informatica-instrumenten en hardware beschikbaar zijn om de enorme aantallen sequenties die moeten worden gescreend het hoofd te bieden.

Een bijkomend voordeel van het gebruik van next-generation sequencing voor de ontwikkeling van SSR-markers is de grote hoeveelheid willekeurige nucleaire en organellaire sequentiegegevens die worden gegenereerd als een 𠇋y-catchâx0201d van microsatellietidentificatie. Er werden bijvoorbeeld 382 SSR's bemonsterd in de loop van 454 sequencing van Amaranthus tuberculatus samen met een contig die een bijna compleet chloroplast-genoom vertegenwoordigt, mitochondriale DNA-fragmenten, transponeerbare elementen en talrijke nucleaire genen van belang [303]. Krapp en collega's [314] verzamelden ongeveer 84% van de Dyckia marnier-lapostollei (Bromeliaceae) chloroplast-genoom van slechts 59.624 pyrosequencing-lezingen. In totaal werden ook 34 chloroplastmicrosatellieten (cpSSR's) met een minimum aantal van 10 A´s of T´s gevonden, en flankerende primers werden geconstrueerd die zeer polymorfe amplificatieproducten produceerden in verschillende Dyckia soort.

High-throughput genotypering-door-sequencing

De radicaal verhoogde doorvoer in sequencingcapaciteit met 50 tot 100.000 keer lagere kosten per base in vergelijking met traditionele Sanger-sequencing had ook een grote impact op de DNA-fingerprinttechnologie zelf. High-throughput sequencing opende volledig nieuwe en ongekend snelle wegen voor genotypering (tot de hoogst mogelijke resolutie) van de resequencing van de volledige genomen van populaties van planten (WGS, bijvoorbeeld [315,316]). Terwijl de lijst van plantengenomen waarvan de sequentie volledig is vastgesteld voortdurend groeit (voor gewassen, zie Bevan en Uauy [317]), zijn de meeste plantengenomen niettemin te groot, te complex en te rijk aan repetitief DNA om goede kandidaten voor WGS te zijn. Dit is de reden waarom in wezen alle benaderingen van genotype-door-sequencing gericht zijn op het verminderen van de complexiteit van genomen tot een kleinere subset (“reduced representation sequencing” bijvoorbeeld, zie [298.318-324]). Door de geanalyseerde genoomruimte te verkleinen tot een beheersbare grootte, kan een voldoende hoge sequentiedekking worden bereikt die de detectie van polymorfismen (meestal SNP's) met het nodige vertrouwen mogelijk maakt, zelfs in planten met zeer grote genomen.

Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld die gericht zijn op het verrijken van bepaalde delen van het genoom voorafgaand aan sequencing. Een voor de hand liggende benadering is om alleen het transcriptoom te sequensen dat beschikbaar is in EST's of cDNA-bibliotheken (voor details zie "Transcriptoomsequencing: RNAseq en verwante benaderingen" hieronder). Andere technieken zijn gebaseerd op de voorafgaande amplificatie van bepaalde genomische subsets met behulp van PCR met geselecteerde primers (bijvoorbeeld met SRAP-primers [321]), of verrijken bepaalde delen van het genoom door hybridisatie met een pre-cast set van oligonucleotiden (zie bijvoorbeeld [322]). In de momenteel meest gebruikte techniek wordt genomisch DNA eerst verteerd met een restrictie-enzym, en alleen de regio's op beide flankerende plaatsen van de enzymherkenningsplaatsen worden gesequenced (voor details zie "Restriction Enzyme Anchored Sequencing: RADseq en verwante benaderingen" hieronder ).Dit principe werd voor het eerst gepresenteerd door Altshuler en collega's [325] die het beschreven als 'creduced representation shotgun sequencing', waarbij nog steeds gebruik wordt gemaakt van de Sanger-methodologie. Een andere versie van deze benadering, die al high-throughput sequencing omvat, werd geïntroduceerd door van Orsouw en collega's [323] die hun techniek CRoPS (Complexity Reduction of Polymorphic Sequences) noemden. De meest gebruikte term voor het concept, inclusief de vele varianten, werd echter gesuggereerd door Baird en collega's [319] die hun benadering “Restriction Site Associated DNA Sequencing” (RADseq) bedachten. Aangezien al deze technieken gericht zijn op het sequencen van restrictieplaats-geassocieerd DNA, zullen we hier de meer algemene term “Restriction Enzyme Anchored Sequencing” gebruiken (REAS zie figuur  4 ).

Schematisch overzicht van een typische 'Restriction Enzyme Anchored Sequencing'-benadering (REAS). (1) DNA van verschillende genotypen wordt verteerd met een of meerdere restrictie-enzymen. (2) Gebiotinyleerde adapters die een streepjescode dragen om de verschillende genotypen te onderscheiden, worden aan de restrictieplaats geligeerd. (3) Er kan een tweede fragmentatiestap worden toegepast, ofwel met willekeurige afschuiving, ofwel met verdere digestie van het monster met een tweede restrictie-enzym. Gebiotinyleerde fragmenten worden vervolgens gebonden aan een streptavidinematrix. Een tweede adapter wordt geligeerd aan het construct dat nu klaar is voor sequencing, meestal na enkele PCR-cycli. Een grootteselectiestap kan worden opgenomen na de eerste of de tweede restrictiedigestie om de complexiteit verder te verminderen. Een mix van beide adapters of Y-adapters kan ook direct na de eerste of tweede digestie of na willekeurig knippen worden afgebonden. (4) Monsters worden gesequenced en (5) gesorteerd volgens streepjescode, en de tag-sequenties worden vergeleken voor detectie van enkelvoudig nucleotide polymorfisme.

Restrictie Enzyme Anchored Sequencing: RADseq en verwante benaderingen

Afhankelijk van de herkenningsvolgorde, richt een bepaald restrictie-enzym zich slechts op een klein deel van het gehele genoom. Restrictiedigestie is daarom de eerste (en soms enige) stap om de genomische complexiteit in REAS te verminderen. Aangezien de restrictieplaatsen in genomen van nauw verwante genotypen gewoonlijk worden gedeeld, worden orthologe genetische regio's gesequenced over de verschillende genotypen. Door een geschikt (paar) restrictie-enzym(en) te kiezen, kan de mate van reductie van genoomrepresentatie experimenteel worden aangepast. Een snijder met vier basen zou bijvoorbeeld (in een theoretisch genoom met een willekeurige basisdistributie) elke 256਋p snijden, en een snijder met zes basen elke 4.096਋p. Om de sequencing te concentreren op de niet-repetitieve, transcriptioneel actieve delen van het genoom, maken de meeste toepassingen gebruik van methylatie-gevoelige enzymen die alleen niet-gemethyleerde sites verteren. Hoewel verschillende epigenetische regulatie en bijbehorende methylatiepatronen kunnen voorkomen in de verschillende genotypen van belang en er dus het risico is van sequencing en vergelijking van verschillende genetische regio's in verschillende genotypen, wegen de voordelen op tegen dit risico.

Een versie van de vele verschillende REAS-technieken is samengevat in figuur  4 , als representatief voorbeeld. Na digestie wordt een adapter geligeerd aan de restrictieplaats, die direct kan worden gebruikt voor sequencing op het gewenste high-throughput-platform. De adapter bevat een monsterspecifieke barcodevolgorde die de gelijktijdige 'multiplexed' high-throughput sequencing van talrijke monsters mogelijk maakt. De adapter kan worden gebiotinyleerd aan het andere uiteinde van de ligatieplaats (zoals in figuur 4 ) of andere modificaties bevatten die concatemerisatie van de adapters remmen. Na barcodering kan het DNA ofwel verder worden verteerd met een ander restrictie-enzym, zoals in 𠇍ouble Digest RADseq” [326], of het kan willekeurig worden geknipt om de optimale grootte voor het gewenste sequentieplatform te bereiken. De laatste benadering werd gekozen in het originele RADseq-artikel [319]. Een tweede, platformspecifieke adapter wordt vervolgens geligeerd aan het andere uiteinde van het adapter-DNA-fragment. Een verdere reductie van complexiteit kan worden bereikt door selectie op grootte van het gedigereerde DNA. In dit geval wordt een vaak snijdend restrictie-enzym gebruikt, zoals voorgesteld door Elshire en collega's [320] die hun techniek “genotyping-by-sequencing” noemden en door Andolfatto en collega's [318], die de term “genotyping-by-sequencing” noemden. x0201cgemultiplexte jachtgeweergenotypering”.

De primaire gegevens omvatten de sequentie-informatie van het gebied dat de restrictieplaats flankeert waaraan de adapters waren geligeerd. Deze restrictieplaats-geassocieerde DNA-sequenties worden “tags” of “RAD-tags” genoemd. Sequentiebepaling kan worden uitgevoerd door middel van sequencing met één uiteinde of met gepaarde uiteinden. Dit laatste is meestal kostenefficiënter en vergemakkelijkt het in kaart brengen van het gesequenced gebied aan bekende verwante genomen [327.328]. Verreweg het grootste deel van de restrictieplaatsen zal gewoonlijk orthologe loci vertegenwoordigen in de verschillende genomen. De getagde sequenties kunnen dan direct worden uitgelijnd en vergeleken, wat de identificatie van SNP's of indels mogelijk maakt. De RAD-sequencingbenadering verschilt van AFLP's of CAPS-markers, die zich richten op verschillen in de herkenningssites zelf. De genoomruimte die wordt geanalyseerd door een REAS is daarom veel groter in vergelijking met procedures die alleen zijn gebaseerd op polymorfismen op restrictieplaatsen. Afwezigheid versus aanwezigheid van restrictieplaatsen in de verschillende organismen kan echter ook worden benut.

Op voorwaarde dat het onderzochte genoom niet te groot is en een adequate sequentiedekking wordt verkregen, wordt elke specifieke RAD-tag vele malen opnieuw gesequenced. De gegevens verkregen uit een REAS-experiment kunnen daarom worden gebruikt voor het identificeren van enorme aantallen SNP-markers [329.330]. REAS-gegevens kunnen ook direct worden gebruikt voor het genereren van koppelingskaarten van een segregerende populatie [331], of de polymorfe DNA-sequenties kunnen worden geannoteerd naar een referentiegenoom, voor genomische lokalisatie van de nieuw geïdentificeerde markers [92]. De RAD-tags kunnen ook als kruisverwijzing worden geannoteerd op genomen van planten met een hoog synteniegehalte. Dit is een groot voordeel ten opzichte van veel andere DNA-vingerafdruktechnieken, omdat, wanneer een referentiegenoom beschikbaar is, de polymorfismen vaak direct kunnen worden gelokaliseerd, wat bijvoorbeeld het fijn in kaart brengen van QTL vergemakkelijkt. De nieuw ontdekte SNP's en andere polymorfismen kunnen ook worden gebruikt als markers voor vingerafdrukken of mapping in volgende stappen - bijvoorbeeld in microarrays of CAPS [330]. Voor de analyse van de gegevens zijn verschillende programma's beschikbaar, zoals “RADtools”, in gebruik genomen door Baxter en collega's [332], “Stacks” [333], “UNEAK” [334], “TASSEL' x0201d [335] en “Rainbow'x0201d [336]. Om punten van chromosomale recombinatie te bepalen, werd een verborgen Markov-model geïmplementeerd door Andolfatto en collega's [318].

Talloze toepassingen van REAS zijn recentelijk beschreven in planten (zie de review door Polen en Rife [337]). In artisjok bijvoorbeeld, Cynara cardunculus, Scaglione en collega's [330] ontdekten ongeveer 34.000 SNP's en bijna 800 indels van 9,7 miljoen reads, wat overeenkomt met 1.000 Mb sequentie. Bus en collega's [329] hebben meer dan 113.000 RAD-tags gesequenced en meer dan 20.000 SNP's en indels geïdentificeerd in het allotetraploïde koolzaad, Brassica napus. Yang en collega's [338] gebruikten RADseq in een BSA om markers voor anthracnoseziekteresistentie te identificeren in Lupinus angustifolius. Ten slotte gebruikten Pfender en collega's [331] RADseq om 193ꃱ individuen te genotyperen uit een kruising tussen stamroestbestendige en gevoelige ouderlijnen van Lolium perenne en vond verschillende belangrijke QTL's voor roestbestendigheid.

Transcriptoomsequencing: RNAseq en gerelateerde benaderingen

Een andere veelgebruikte toepassing van high-throughput sequencing voor de ontdekking van polymorfismen is de sequencing van cDNA in een benadering bedacht RNAseq (sequencing van getranscribeerde regio's). RNAseq is in feite EST-sequencing zonder voorafgaande klonen en op high-throughput sequencing-machines. De techniek en de toepassingen ervan in planten zijn onlangs beoordeeld door Martin en collega's [88], en een “RNAseq-tutorial” werd gepresenteerd door Wolf [339]. Verschillende voordelen maken transcriptoomsequencing erg aantrekkelijk. (1) Na de novo assemblage of annotatie worden zowel de eiwitsequentie als de varianten ervan direct onthuld. Deze polymorfismen vertegenwoordigen de ideale markers voor genidentificatie in een mappingbenadering, aangezien het gen zelf en niet een co-segregerende, anonieme genomische regio wordt gemarkeerd. (2) De methode reduceert de complexiteit van een genoom tot zijn transcriptioneel actieve delen en maakt zo de vergelijking van zeer grote genomen mogelijk. (3) RNAseq maakt tegelijkertijd zowel de bepaling van een genotype als de beoordeling van kwantitatieve genexpressie mogelijk, wat de analyse van expressie-QTL's mogelijk maakt. Dit concept werd door Harper en collega's [340] beschreven als 𠇊ssociative transcriptomics”. Deze auteurs gebruikten transcriptoomsequencing in Brassica napus om verschillen in gensequenties en genexpressie enerzijds te correleren met eigenschapvariatie anderzijds. Het nadeel van de RNAseq-benadering is dat, om een ​​transcript te kunnen sequencen, het tot expressie moet worden gebracht onder de gegeven omstandigheden - dat wil zeggen in het onderzochte weefsel - en op het moment van RNA-isolatie. Een ander probleem is de ongelijke verdeling van de transcriptsoort, die ofwel zeer diepe sequencing vereist, ofwel normalisatie voorafgaand aan sequencing. Dit probleem betreft met name zeldzame transcripten, zoals die welke coderen voor transcriptiefactoren of andere regulerende elementen.

RNAseq is ook gebruikt in BSA. Trick en collega's [341] hebben bijvoorbeeld een gekloond gen voor het eiwitgehalte van graan, GPC-B1, in tarwe nauwkeurig in kaart gebracht, terwijl Liu en collega's [342] het lang gezochte gen voor glossy direct konden lokaliseren, identificeren en klonen3 ( gl3), wat een vermeende myb-transcriptiefactor bleek te zijn. Een op high-throughput sequencing gebaseerde, verminderde complexiteitsanalysestrategie voor planttranscriptomen werd onlangs gepresenteerd door Kahl en collega's [343] die een Illumina-platform gebruikten om alleen de 3′-UTR's van de transcripten te sequensen met massale analyse van cDNA-uiteinden. Omdat 3′-UTR's de meest polymorfe gebieden van een transcript zijn, vormen ze een rijke bron van moleculaire markers. Deze strategie maakt de sequentiebepaling van een groter aantal genotypen in een multiplextest met voldoende dekking mogelijk, in vergelijking met RNAseq, maar onthult bovendien kwantitatieve genexpressiewaarden voor elk transcript. Om dit concept te beschrijven, is de term “TranSNiPtomics” uitgevonden [343]. In tegenstelling tot REAS is de techniek niet afhankelijk van restrictie-enzymen, maar richt ze zich op een gebied van 100 tot 500 bp stroomopwaarts van de poly-A-staart van elk transcriptmolecuul. De aanpak is onlangs met succes toegepast om een ​​introgressief gen voor de gele dwergvirusziekte nauwkeurig in kaart te brengen H. bulbosum tot gerst [344].

Outlook

De grootschalige identificatie van SNP's en SSR's via high-throughput sequencing-benaderingen wordt nu routine, en sterk gemultiplexte SNP-gebaseerde genotypering-by-sequencing-methoden zijn al gebruikt voor tal van toepassingen in veel gewassen en modelsoorten. Dit geldt met name voor genetische mapping, zoals beschreven in Genetic mapping. Een gestaag groeiend aantal studies zorgt ook voor niet-model wilde soorten, waar geen referentiegenoom beschikbaar is [345.346]. Op het gebied van populatiegenetica, bijvoorbeeld, overwint het vermogen om het genoom te bemonsteren met veel hogere dichtheden dan ooit tevoren de beperkingen van de traditionele markermethodologie, waardoor voor het eerst de evaluatie van genetische variatiepatronen over het hele genoom mogelijk is [347.348]. De resultaten en inzichten die worden verkregen met dergelijke 'populatie-genomische' benaderingen zullen een enorme impact hebben op het gebied van ecologie en natuurbehoud, zoals werd benadrukt in een recent speciaal nummer van Moleculaire ecologie (zie [349] en andere artikelen in hetzelfde volume). Plantensystematisten zullen profiteren van wat men de volgende generatie fylogenetica kan noemen [350], aangezien plantenfylogenieën nu kunnen worden opgezet op basis van volledig gesequeneerde plastidegenomen [351] en/of meerdere sets nucleaire genen [352] . Nieuwe en potentieel bruikbare nucleaire markers kunnen worden geïdentificeerd door sequentievergelijkingen over grote taxonomische afstanden [353], en directe sequentieanalyse van individuen met streepjescodes kan orthologische problemen in polyploïde fylogenetica oplossen [352]. Ten slotte zullen beter opgeloste fylogenieën helpen om soortgrenzen en soortrelaties in recente stralingen op te helderen (zie de recensie door Harrison en Kidner [354]).

Hoe gaan we verder? De volledige technologische mogelijkheden zijn zeker nog lang niet bereikt, en “next-next-generation” single-molecule sequencing vervangt momenteel enkele van de baanbrekende methoden zoals 454 en SOLiD, die al op de rand van uitsterven staan. . Verdere verbeteringen en innovaties van de sequentiemethodologie kunnen worden verwacht, en zullen binnenkort kosteneffectieve genotypering-door-sequencing van alle niet-modelplantensoorten mogelijk maken. Voor bepaalde toepassingen, zoals de analyse van somaklonalen of mutatiescreening, zou zelfs het sequensen van het hele genoom haalbaar kunnen worden. Het verkrijgen van volledige genomische sequentiegegevens voor alle individuen die in een onderzoek zijn opgenomen, zou in de meeste situaties echter niet nodig zijn en de kosten alleen maar opdrijven. De enorm grote datasets die worden gegenereerd door sequencing van de volgende generatie moeten worden verwerkt en opgeslagen, en bio-informatica is nu al een echte uitdaging geworden. Daarom zal aan het begin van elk onderzoek een belangrijke vraag moeten worden gesteld - dat wil zeggen, hoe het eindige aantal bronnen toe te wijzen aan (1) sequentiedekking (dat wil zeggen, het aantal keren dat een bepaald nucleotide wordt gesequenced), ( 2) bemonsteringsdichtheid (dat wil zeggen, het aantal geanalyseerde individuen), en (3) de fractie van het genoom die wordt onderworpen aan sequencing [355]. We voorzien dat sequencing-inspanningen normaal gesproken ook in de toekomst tot het noodzakelijke minimum beperkt zullen blijven, en dat DNA-vingerafdrukken gegenereerd met een adequaat op maat gemaakte set markers, verkregen door low-coverage sequencing van een goed geselecteerde representatie van een genoom, de methode zullen blijven van keuze voor de meeste toepassingsgebieden in identificatie van plantengenotype, populatiegenetica, verwantschapsstudies en kartering. We verwachten daarom dat de term 𠇍NA-fingerprinting”, ooit bedacht door Alec Jeffreys om de ondubbelzinnige identificatie van menselijke individuen door minisatelliethybridisatie te beschrijven, op de lange termijn zal overleven, zelfs in het tijdperk van brute force DNA-sequencing.


6. Toekomstige vooruitzichten

Voor een betere service in POC en klinische toepassingen moet elk gecommercialiseerd geïntegreerd systeem ook geminiaturiseerd en betaalbaar zijn. Hoewel er momenteel veel producten zijn, zijn de kosten hoog en vormen ze een barrière voor brede toegankelijkheid van sommige economisch achtergestelde en landelijke gebieden. Om nucleïnezuurextractie-microfluïdica een integraal onderdeel te maken van landelijke of spoedeisende zorg, zal POC een aanzienlijke verbetering van de kosten in verband met de monstervoorbereiding en technologie vereisen. In de toekomst moet de toepassing van INEAD-systemen voor POC de kenmerken hebben van automatisering, lage kosten, veelzijdigheid en miniaturisatie. Het zou ook belangrijk zijn om een ​​gevisualiseerde data-outputmodule en informatietransmissiemodule te hebben om betere communicatie van resultaten tussen POC en potentiële klinische partners in meer grootstedelijke hubs mogelijk te maken. Daarom zou toekomstig POC-personeel geen gespecialiseerde, operationele training nodig hebben naast het zorgvuldig verzamelen van monsters en het hanteren van basisinstrumenten. Bovendien blijven voor de meeste landelijke en afgelegen gebieden een gebrek aan middelen en economische beperkingen beperkende factoren. In de toekomst zal de toepassing van het INEAD-systeem op mobiele detectievoertuigen hen in staat stellen meer mensen op medisch en voedselveiligheidsgebied te bedienen, wat de toepassing van POC-systemen zal bevorderen. Dit stelt hogere eisen aan de stabiliteit, bruikbaarheid en energie-eisen voor elk ontwikkeld systeem. In veel medische gebieden zijn nauwkeurige testresultaten vereist en SIDAO is een ideaal testproces dat leidt tot verbeterde monstervoorbereiding en nucleïnezuurdetectietechnologieën. We hopen dat deze beoordeling verdere dialoog en verkenning naar de ontwikkeling van microfluïdische systemen voor NAAT-integratie zal aanmoedigen. Verwacht wordt dat toekomstig onderzoek verdere integratieve oplossingen zal bieden voor het verbeteren van POC en het tot stand brengen van een bredere toegankelijkheid voor op microfluïdica gebaseerde technologie voor klinische toepassingen.


Bekijk de video: #Resistancecovid. EvoCyclone Lowtech. Tesla3Dair - Hightech 3D Ventilator (Januari- 2022).