Informatie

Wat zijn de problemen bij het gebruik van een ssDNA of een mRNA voor expressie in plaats van een plasmide?


Stel dat u een genkloneringsexperiment wilt doen. Je hebt een lege expressievector (mRNA of DNA) en je wilt er een gen X in klonen. Hoe komt het dat je alleen X kunt kopen die al in een vector zit (die op zijn beurt vaak in een bacteriële drager zit)?

Wat is het probleem met het hanteren van zuivere mRNA-nucleotiden van gen X? Of zelfs sscDNA?


Wat is het probleem met het hanteren van zuivere mRNA-nucleotiden van gen X? Of zelfs sscDNA?

Problemen bij het direct transfecteren van een mRNA/ssDNA

mRNA's kunnen in de cellen worden getransfecteerd en wordt vrij vaak gedaan. Het probleem met het direct transfecteren van mRNA's is dat het mRNA snel wordt afgebroken en je geen aanhoudende expressie zult hebben. Dit is echter erg handig in bepaalde gevallen, zoals het creëren van geïnduceerde pleuripotente stamcellen (iPSC's) waarbij je niet wilt dat de cellen de Yamanaka-factoren voortdurend tot expressie brengen (waarvan sommige ook oncogenen zijn).

Ook zijn RNA's als zodanig behoorlijk vatbaar voor afbraak. Het is veel gemakkelijker om DNA-oplossingen voor een lange tijd te bereiden en op te slaan.

Soortgelijke problemen doen zich voor met een ssDNA.

Hoe komt het dat je alleen X kunt kopen die al in een vector zit (die op zijn beurt vaak in een bacteriële drager zit)?

Een groot voordeel van het gebruik van plasmiden is dat je je gen oneindig kunt vermeerderen. Als je in plaats daarvan een vaste hoeveelheid mRNA zou krijgen, dan ben je snel op. Sommige verkopers voeren zo'n hebzuchtig kapitalistisch beleid: P

Wanneer u een DNA amplificeert met behulp van PCR, dan heeft klonen een bijkomend voordeel:

  • je kunt het gen sequencen met behulp van goed gestandaardiseerde primers (zoals T7)
  • je kunt constructies maken die het gen voorwaardelijk tot expressie kunnen brengen

Je hebt een lege expressievector (mRNA of DNA) en je wilt er een of ander gen X in klonen.

Je kunt niet gemakkelijk iets in een RNA klonen. Je hebt specifieke RNA-endonucleasen nodig. Bovendien is een dubbele spijsvertering in dit geval desastreus.

Waarom verkopers over het algemeen geen dsDNA-insert verkopen, maar deze in een plasmide gekloond aanbieden?

  • Een circulair dsDNA is stabieler
  • Verkopers kunnen de voorraad van het inzetstuk bewaren voor toekomstige klanten zonder PCR opnieuw te hoeven doen
  • Gekloneerde insert kan worden geamplificeerd via bacterieculturen om zeer grote hoeveelheden te verkrijgen (maxi/giga preps)

Huiswerkproblemen - Literatuurleermodule: Transcriptiefactor Ikaros onderdrukt eiwitfosfatase 2A

  • Bijgedragen door Henry Jakubowski
  • Professor (Chemie) aan het College van St. Benedict/St. John's Universiteit

Deze pagina bevat beoordelings-/examenvragen met behulp van gegevens, cijfers en grafieken uit onderzoekstijdschriften zoals de Journal of Biological Chemistry die het gebruik ervan toestaan, of uit tijdschriften zoals uit PLOS die volledig open access zijn. De gekozen papers en onderwerpen zijn geselecteerd om te beoordelen student begrip van de basisconcepten en leerdoelen van de American Society for Biochemistry and Molecular Biology (ASBMB), evenals de fundamentele concepten en doelstellingen van MCAT2015. Deze twee sets van normen overlappen elkaar in grote lijnen. Zowel ASBMB als de MCAT2015 leggen sterk de nadruk op wetenschappelijke onderzoeks- en redeneervaardigheden, die misschien het best kunnen worden beoordeeld aan de hand van open vragen die zijn afgeleid van de literatuur waarin studenten Bloom-vaardigheden van een hoger niveau voor toepassing en analyse moeten gebruiken.

Deze vragen kunnen ook worden gebruikt door studenten die meer mogelijkheden zoeken om te oefenen met het interpreteren van onderzoeksliteratuurresultaten. Het vermogen om informatie en concepten toe te passen, te analyseren en te evalueren vormt de kern van wetenschappelijk onderzoek en redeneervaardigheden die centraal staan ​​in de nieuwe ASBMB- en MCAT2015-competentienormen. De vragen in deze leermodule zijn bedoeld om deze competenties te beoordelen met open antwoorden in plaats van meerkeuzevragen. De antwoorden zijn te vinden via de link onderaan deze pagina.


Het Guide-it Long ssDNA-productiesysteem v2 bevat verfijningen die een efficiëntere verwerking van uitdagende sjablonen mogelijk maken, hogere ssDNA-opbrengsten bieden en een eenvoudiger protocol mogelijk maken in vergelijking met onze eerste generatie ssDNA-kits (Cat. # 632644, 632645).*

Verbeterde generatie van ssDNA met het Guide-it Long ssDNA Production System v2. Gelafbeelding met het dsDNA-uitgangsmateriaal (baan 1) en sense (SS) of antisense (AS) ssDNA-producten voor verschillende HDR-sjablonen die zijn gegenereerd met behulp van de originele (v1) of bijgewerkte (v2) versies van het Guide-it Long ssDNA-productiesysteem ( Baan 2 en Baan 3, respectievelijk). dsDNA-templates die in deze analyse waren opgenomen, waren geïdentificeerd als uitdagende substraten voor het genereren van ssDNA met behulp van de v1 Guide-it-kit. Het dsDNA en ssDNA werden geanalyseerd via agarosegelelektroforese met ethidiumbromide als kleurmiddel. ssDNA-producten werken met een kleiner molecuulgewicht dan overeenkomstige dsDNA-substraten. In alle gevallen genereerde het Guide-it Long ssDNA-productiesysteem v2 een schonere band van ssDNA dan de vorige versie van de kit, wat een completere en uniformere vertering suggereert.

*Houd er rekening mee dat met de lancering van het Guide-it Long ssDNA Production System v2 de originele Guide-it ssDNA-kits (Cat. # 632644, 632645) zijn stopgezet.

Aanvullende productinformatie

Raadpleeg het analysecertificaat van het product voor informatie over opslagomstandigheden, productcomponenten en technische specificaties. Raadpleeg de lijst met kitcomponenten om de kitcomponenten te bepalen. Analysecertificaten en lijsten met kitcomponenten bevinden zich onder het tabblad Documenten.


MMLV Retrovirus-genexpressievector

Het retrovirale vectorsysteem van MMLV is een efficiënt vehikel voor het permanent inbrengen van genen in zoogdiercellen. Het werd vooral populair als een methode voor het afleveren van genen voor het maken van iPS-cellen.

MMLV retrovirale vectoren zijn afgeleid van Moloney muizenleukemievirus, dat lid is van de retrovirusfamilie. Wildtype MMLV-virus heeft een lineair RNA-genoom met een plus-streng.

Een MMLV retrovirale vector wordt eerst geconstrueerd als een plasmide in E. coli. Het wordt vervolgens getransfecteerd in verpakkingscellen samen met verschillende helperplasmiden. In de verpakkingscellen wordt vector-DNA dat zich tussen de twee lange terminale herhalingen (LTR's) bevindt, getranscribeerd in RNA, en virale eiwitten die door de helperplasmiden tot expressie worden gebracht, verpakken het RNA verder in virus. Levend virus wordt vervolgens afgegeven in het supernatant, dat kan worden gebruikt om doelcellen direct of na concentratie te infecteren.

Wanneer het virus aan doelcellen wordt toegevoegd, wordt de RNA-lading in cellen gependeld waar het omgekeerd wordt getranscribeerd in DNA en willekeurig wordt geïntegreerd in het gastheergenoom. Alle genen die tijdens het klonen van vectoren tussen de twee LTR's zijn geplaatst, worden naast de rest van het virale genoom permanent in het DNA van de gastheer ingevoegd.

Door hun ontwerp missen MMLV-retrovirale vectoren de genen die nodig zijn voor virale verpakking en transductie (deze genen worden gedragen door helperplasmiden of in plaats daarvan geïntegreerd in verpakkingscellen). Dientengevolge hebben virussen die uit de vectoren worden geproduceerd het belangrijke veiligheidskenmerk dat ze replicatie-incompetent zijn (wat betekent dat ze doelcellen kunnen transduceren, maar er niet in kunnen repliceren).

Raadpleeg de onderstaande documenten voor meer informatie over dit vectorsysteem.

Referenties Onderwerp
Exp Hematol. 31:1007 (2003) Beoordeling
J Virol. 61:1639 (1987) Uitgebreid verpakkingssignaal verhoogt de titer van MMLV-vectoren
Gene Ther. 7:1063 (2000) Tropisme van MMLV-vectoren hangt af van verpakkingscellijnen
Nat Protoc. 6:346 (2011) Tropisme van MMLV-vectoren hangt af van verpakkingsplasmiden

Onze vector is geoptimaliseerd voor replicatie met een hoog aantal kopieën in E. coli, verpakking met hoge titer van levend virus, efficiënte virale transductie van een breed scala aan cellen, efficiënte vectorintegratie in het gastheergenoom en transgenexpressie op hoog niveau.

Permanente integratie van vector-DNA: Conventionele transfectie resulteert in bijna volledig tijdelijke afgifte van DNA in gastheercellen als gevolg van het verlies van DNA in de loop van de tijd. Dit probleem is vooral prominent aanwezig in snel delende cellen. Daarentegen kan retrovirale transductie genen permanent in gastheercellen afleveren vanwege integratie van de virale vector in het gastheergenoom.

Breed tropisme: Ons verpakkingssysteem voegt het VSV-G-envelopeiwit toe aan het virale oppervlak. Dit eiwit heeft een breed tropisme. Hierdoor kunnen uit veelgebruikte zoogdiersoorten zoals mens, muis en rat worden getransduceerd. Bovendien kunnen veel celtypen worden getransduceerd, hoewel onze vector moeite heeft met het transduceren van niet-delende cellen (zie nadelen hieronder).

Grote laadruimte: Het wildtype MMLV retrovirale genoom is

8 kB. In onze vector nemen de componenten die nodig zijn voor virale verpakking en transductie in beslag

5,5 kb om tegemoet te komen aan het DNA van de gebruiker van belang. Omdat onze vector is ontworpen voor het inbrengen van alleen een ORF, is deze laadruimte voldoende voor de meeste toepassingen.

Uitdrukking op hoog niveau: De 5' LTR bevat een sterke alomtegenwoordige promotor die expressie op hoog niveau van het gen van de gebruiker van belang stimuleert.

Relatieve uniformiteit van genafgifte: In het algemeen kan virale transductie vectoren op relatief uniforme wijze in cellen afleveren. Daarentegen kan conventionele transfectie van plasmidevectoren zeer niet-uniform zijn, waarbij sommige cellen veel kopieën ontvangen, terwijl andere cellen weinig of geen kopieën ontvangen.

Effectiviteit in vitro en in vivo: Hoewel onze vector meestal wordt gebruikt voor in vitro transductie van gekweekte cellen, kan hij ook worden gebruikt om cellen in levende dieren te transduceren.

Veiligheid: De veiligheid van onze vector wordt verzekerd door genen die nodig zijn voor virale verpakking en transductie in verschillende helperplasmiden te verdelen of te integreren in verpakkingscellen. Dientengevolge is levend virus geproduceerd uit onze vector replicatie-incompetent.

nadelen

Afhankelijkheid van de 5' LTR-promotor: Expressie van het gen van belang in onze vector wordt aangedreven door de alomtegenwoordige promotorfunctie in de 5' LTR. Dit is een duidelijk nadeel in vergelijking met onze lentivirale vectoren waarmee de gebruiker zijn eigen promotor kan inbrengen om zijn gen van belang aan te sturen.

Matige virale titer: Virale titer van ons vectorbereik

107 TU/ml in het supernatant van verpakkingscellen zonder verdere concentratie. Dit is ongeveer een orde van grootte lager dan onze lentivirale vectoren.

Moeilijkheden bij het transduceren van niet-delende cellen: Onze vector heeft moeite met het transduceren van niet-delende cellen.

Technische complexiteit: Het gebruik van retrovirale MMLV-vectoren vereist de productie van levend virus in verpakkingscellen, gevolgd door meting van de virale titer. Deze procedures zijn technisch veeleisend en tijdrovend in vergelijking met conventionele plasmidetransfectie.

Belangrijke onderdelen

MMLV 5' LTR: MMLV retrovirus 5' lange terminale herhaling. In wildtype MMLV-retrovirus zijn 5'-LTR en 3'-LTR in sequentie in wezen identiek. Ze bevinden zich aan twee uiteinden van het virale genoom en wijzen in dezelfde richting. Na virale integratie wordt de 3'-LTR-sequentie gekopieerd op de 5'-LTR. De LTR's dragen zowel de promotor- als de polyadenyleringsfunctie, zodat de 5'-LTR werkt als een promotor om de transcriptie van het virale genoom aan te sturen, terwijl de 3'-LTR werkt als een polyadenyleringssignaal om het stroomopwaartse transcript te beëindigen.

&Psi plus-pakket2: MMLV-retrovirusverpakkingssignaal vereist voor het verpakken van viraal RNA in virus.

Kozak: Kozak-consensussequentie. Het wordt voor het startcodon van het ORF van belang geplaatst omdat wordt aangenomen dat het de translatie-initiatie in eukaryoten vergemakkelijkt.

ORF: Het open leeskader van uw gen van interesse wordt hier geplaatst. De expressie ervan wordt aangedreven door de alomtegenwoordige promotorfunctie in de 5' LTR.

MMLV 3' LTR: MMLV retrovirus 3' lange terminale herhaling. Het polyadenyleringssignaal dat aanwezig is in 3'-LTR dient om het transcript van het stroomopwaartse ORF te beëindigen.

pUC-ori: pUC oorsprong van replicatie. Plasmiden die deze oorsprong dragen, komen in hoge kopieaantallen voor in E. coli.

Ampicilline: Ampicilline-resistentiegen. Hierdoor kan het plasmide worden gehandhaafd door ampicillineselectie in E. coli.


Sommige CFTR-mutaties kunnen worden behandeld zonder RNA-therapieën

De meeste gentargets liggen ergens in een spectrum tussen TTR, wat ideaal is, en een genetisch onstabiele kanker, wat niet ideaal is. Een voorbeeld hiervan is CF, een ziekte die wordt veroorzaakt door autosomaal recessieve mutaties in de CFTR, gelegen op chromosoom 7 (Fig. 1a). 21 In de Verenigde Staten wordt bij ongeveer 1 op de 2500 blanke kinderen de ziekte vastgesteld. Er worden aanzienlijk lagere incidenties waargenomen bij zowel Afro-Amerikaanse als Aziatische populaties. 22 Prognoses zijn aanzienlijk verbeterd sinds de ontdekking van de ziekte, hoewel ze nog steeds veel lager zijn dan die van een persoon zonder CF, de gemiddelde levensverwachting nu meer dan 40 jaar bedraagt, grotendeels als gevolg van de ontwikkeling van behandelingen die bacteriële infecties beheersen, pancreasenzymen vervangen, de opname van voedingsstoffen verbeteren en vergemakkelijken de klaring van dik slijm uit de borst 23,24

Er zijn veel CFTR recent gemuteerde genotypen, wetenschappers schatten dat meer dan 1.000 genetische variaties in de CFTR gen zijn vertegenwoordigd in minder dan vijf patiënten elk wereldwijd. 25 Toch kan deze reeks mutaties worden gegroepeerd in slechts zes klassen, te onderscheiden door het effect op het CFTR-eiwit en zijn stroomafwaartse fenotype in de cel. 26 Sommige mutaties binnen deze klassen kunnen al worden behandeld met door de FDA goedgekeurde kleine moleculen. 25,26 Andere mutaties kunnen en kunnen daarom in de toekomst meer afhankelijk zijn van RNA-therapieën (Fig. 2).

Figuur 2. CF-mutaties vallen onder zes verschillende klassen. Deze klassen variëren van het genereren van mutante CFTR-mRNA-transcripten die niet worden vertaald tot het genereren van defect CFTR-eiwit, waardoor er onvoldoende ionentransport door het celmembraan mogelijk is. Er zijn verschillende kleine moleculen gebruikt om de zes klassen te behandelen, waaronder doorlees kleine moleculen, corrector en op potentiator gebaseerde therapieën. CFTR mutaties die waarschijnlijk niet worden aangepakt door bestaande kleine moleculen, kunnen betere kandidaten zijn voor RNA-gentherapieën.

Klasse I-mutaties zoals G542X, W1282X of R553X resulteren in een voortijdig stopcodon, dat voorkomt dat functioneel eiwit wordt aangemaakt. 27,28 Om dit soort mutaties te behandelen, hebben wetenschappers doorleesbare kleine moleculen ontwikkeld. Deze kleine moleculen omzeilen voortijdige stopcodons om transcriptie te stimuleren. 26 Readthrough kleine moleculen zijn getest in verschillende onderzoeken en klinische proeven, maar het is niet bekend of ze door de FDA zullen worden goedgekeurd. 29 Dit potentiële gebrek aan geneesmiddelen met kleine moleculen om klasse I-mutaties te behandelen, kan ook worden aangepakt door mRNA-therapieën die zijn ontworpen om de ontbrekende CFTR gen.

Klasse II-mutaties creëren verkeerd gevouwen eiwitten die het celmembraan niet kunnen bereiken. 26 Opvallend onder deze mutaties is de ΔF508-variant: een mutatie die wordt veroorzaakt door de deletie van drie basenparen in exon 10 die leidt tot de afwezigheid van een fenylalanineresidu van het CFTR-eiwit. 30 Meer dan 70% van defect CFTR allelen omvatten deze mutatie, waardoor het de belangrijkste oorzaak van CF in de Verenigde Staten is. 23,27 Als gevolg hiervan is er enorm veel onderzoek gedaan naar het vinden van behandelingen voor patiënten met de ΔF508-mutatie, wat heeft geleid tot goedgekeurde therapieën met kleine moleculen.

De combinatie lumacaftor/ivacaftor-therapeutisch werkt bijvoorbeeld om de CFTR-functie gedeeltelijk te herstellen. Met name lumacaftor is een CFTR-corrector die helpt tijdens het eiwitvouwingsproces, waardoor CFTR naar het celoppervlak kan worden gesmokkeld. 31 Zodra CFTR het celoppervlak bereikt, werkt ivacaftor als een potentiator, die ervoor zorgt dat CFTR chloride-ionen doorlaat. 32 Met name in het geval van ΔF508 is ivacaftor op zichzelf niet effectief, omdat het correct gevouwen CFTR-eiwit vereist om op te werken. 32,33

Correctors van de volgende generatie zijn ook ontwikkeld om verschillende verwerkingsafwijkingen aan te pakken, waaronder tezacaftor en elexacaftor. 25 Specifiek bindt elexacaftor aan een andere pocket in het CFTR-eiwit en resulteert in een verbetering van de longfunctie en andere ademhalingsgerelateerde factoren wanneer het wordt toegediend in combinatie met tezacaftor en ivacaftor. 34 In feite heeft de FDA onlangs Trikafta goedgekeurd, een drievoudige combinatietherapie die elexacaftor, ivacaftor en tezacaftor combineert. Trikafta is goedgekeurd voor gebruik bij patiënten met ten minste één ΔF508-mutatie, terwijl eerdere enkelvoudige of combinatietherapieën alleen patiënten behandelden die homozygoot waren voor de ΔF508-mutatie. 35,36 Deze behandelingen met kleine moleculen markeren een enorm succes voor CF-wetenschappers en -patiënten. Toekomstige CF-therapieën, waaronder mRNA-therapieën, zullen een buitengewoon hoge veiligheid en werkzaamheid moeten aantonen om deze bestaande geneesmiddelen te vervangen.

andere waargenomen CFTR mutaties vallen binnen de klassen III-VI. Een klasse III-mutatie mist een functionele ionkanaalpoort, een klasse IV heeft een gebrekkige ionengeleiding over het CFTR-kanaal, een klasse V resulteert in onvoldoende CFTR-eiwit dat het celoppervlak bereikt en een klasse VI heeft een hoge CFTR-turnover als gevolg van een laag eiwitgehalte stabiliteit op het celmembraan. 27 Ivacaftor, de CFTR-potentiator, is door de FDA goedgekeurd voor de behandeling van 38 varianten van CFTR mutaties, meestal binnen Klasse III, maar interessant genoeg, laten verschillende mate van verbetering zien, afhankelijk van het genotype van de patiënt. 25,37

In verband daarmee zijn er veel CFTR varianten die uiterst zeldzaam zijn (soms zo zeldzaam als een enkele persoon). 25 Als gevolg hiervan kan het moeilijk zijn om voldoende krachtig klinisch bewijs te verkrijgen om een ​​goedkeuring voor geneesmiddelen met kleine moleculen te ondersteunen, waardoor deze patiënten in het ongewisse blijven. Zelfs als er klinisch bewijs is dat een zeldzame of nog te onderzoeken mutatie kan worden behandeld met een bestaand klein molecuul, kan toegang tot deze "off-label" medicijnen duur zijn, waardoor de toegang voor de patiënt wordt geblokkeerd. 25 Er is een gezamenlijke inspanning om beter te begrijpen welke mutaties behandelbaar zijn met bestaande therapieën met kleine moleculen, en hoe ze zich onderscheiden van onbehandelbare mutatievarianten. 25,27 Het begrijpen van deze verschillen en de uitdagingen die ze vormen voor CF-patiënten is belangrijk voor het identificeren van mutaties die mogelijk moeten worden aangepakt met behulp van RNA-therapieën.


Toepassingen

  • Enkelstrengs DNA-afbraak
  • Verwijdering van ssDNA-fragmenten in een reactiemengsel
  • PCR-primerdigestie na reactie

Opmerkingen:

Exonuclease I mag niet worden gebruikt voor het afstompen van DNA-uiteinden korte DNA-uiteinden zijn geen geschikt substraat voor Exonuclease I. Gebruik voor het afstompen van DNA-uiteinden DNA Polymerase I, Klenow Fragment (2140A, 2140AK, 2140B, 2140BK) of Mung Bean Nuclease (2420A, 2420B) in plaats daarvan.

Buffer

Geleverd met 1 ml 10X Exonuclease I Buffer [670 mM Glycine-KOH, pH 9,5, 10 mM DTT, 67 mM MgCl2].

Aanvullende productinformatie

Raadpleeg het analysecertificaat van het product voor informatie over opslagomstandigheden, productcomponenten en technische specificaties. Raadpleeg de lijst met kitcomponenten om de kitcomponenten te bepalen. Analysecertificaten en lijsten met kitcomponenten bevinden zich onder het tabblad Documenten.

Takara Bio USA, Inc.
Verenigde Staten/Canada: +1.800.662.2566 &stier Azië-Pacific: +1.650.919.7300 &stier Europa: +33.(0)1.3904.6880 &stier Japan: +81.(0)77.565.6999
UITSLUITEND VOOR ONDERZOEK. NIET VOOR GEBRUIK IN DIAGNOSTISCHE PROCEDURES. &kopie 2021 Takara Bio Inc. Alle rechten voorbehouden. Alle handelsmerken zijn eigendom van Takara Bio Inc. of haar dochteronderneming(en) in de VS en/of andere landen of hun respectievelijke eigenaren. Bepaalde handelsmerken zijn mogelijk niet in alle rechtsgebieden geregistreerd. Aanvullende informatie over producten, intellectueel eigendom en beperkt gebruik is beschikbaar op Takarabio.com.

Takara Bio Europe is lid van de Takara Bio Group, een toonaangevend life sciences bedrijf dat zich inzet voor het verbeteren van de menselijke conditie door middel van biotechnologie. Via onze merken Takara, Clontech en Cellartis is het onze missie om innovatieve tools en diensten van hoge kwaliteit te ontwikkelen om ontdekking te versnellen.


Arber S, Han B, Mendelsohn M, Smith M, Jessell TM, Sockanathan S (1999) Vereiste voor het homeobox-gen Hb9 bij de consolidatie van motorneuronidentiteit. Neuron 23(4):659-674

Bader M (2010) Rattenmodellen van hart- en vaatziekten. Methoden Mol Biol 597:403–414

Brenner M, Kisseberth WC, Su Y, Besnard F, Messing A (1994) GFAP-promotor stuurt astrocyt-specifieke expressie in transgene muizen. J Neurosci 14:1030-1037

Brown AJ, Fisher DA, Kouranova E, McCoy A, Forbes K, Wu Y, Henry R, ​​Ji D, Chambers A, Warren J, Shu W, Weinstein E, Cui X (2013) Voorwaardelijke knock-out van het hele rat via genoombewerking . Nat-methoden 10:638-640

Chen J, Li Y, Wang L, Lu M, Zhang X, Chopp M (2001) Therapeutisch voordeel van intraveneuze toediening van beenmerg-stromacellen na cerebrale ischemie bij ratten. Slag 32(4):1005-1011

Chou WC, Takeo M, Rabbani P, Hu H, Lee W, Chung YR, Carucci J, Overbeek P, Ito M (2013) Directe migratie van folliculaire melanocytstamcellen naar de epidermis na verwonding of UVB-bestraling is afhankelijk van Mc1r-signalering. Nat Med 19(7):924-929

Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (2013) Multiplex-genoomengineering met behulp van CRISPR / Cas-systemen. Wetenschap 339:819

Fan X, Petitt M, Gamboa M, Huang M, Dhal S, Druzin ML, Wu JC, Chen-Tsai Y, Nayak NR (2012) Voorbijgaande, induceerbare, placenta-specifieke genexpressie bij muizen. Endocrinologie 153(11):5637-5644

Feil R, Brocard J, Mascrez B, LeMeur M, Metzger D, Chambon P (1996) Ligand-geactiveerde plaatsspecifieke recombinatie bij muizen. Proc Natl Acad Sci VS 93:10887–10890

Feil R, Wagner J, Metzger D, Chambon P (1997) Regulatie van Cre-recombinase-activiteit door gemuteerde oestrogeenreceptor-ligand-bindende domeinen. Biochem Biophys Res Commun 237:752-757

Feil S, Valtcheva N, Feil R (2009) Inducible Cre-muizen. Protocol. Gene knock-out protocollen, vol 530 van de serie methoden in de moleculaire biologie. blz. 343-363

Flood DG, Lin YG, Lang DM, Trusko SP, Hirsch JD, Savage MJ, Scott RW, Howland DS (2007) Een transgeen rattenmodel van de ziekte van Alzheimer met extracellulaire Abeta-afzetting. Neurobiol veroudering 30(7):1078-1090

Franz WM, Mueller OJ, Fleischmann M et al (1999) De 2,3 kb gladde spier-myosine-zware-keten-promoter stuurt genexpressie in het vasculaire systeem van transgene muizen en konijnen. Cardiovasculaire Res 43:1040-1048

Groth AC, Calos MP (2004) Faagintegrasen: biologie en toepassingen. J Mol Biol 335(3):667-678

Guenther C, Tasic B, Luo L, Bedell M, Kingsley D (2014) Een moleculaire basis voor klassieke blonde haarkleur in Europeanen. Nat Genet. https://doi.org/10.1038/ng.2991

Jinek M, East A, Cheng A, Lin S, Ma E, Doudna J (2013) RNA geprogrammeerde genoombewerking in menselijke cellen. eLife 2:e00471

Keravala A, Groth AC, Jarrahian S, Thyagarajan B, Hoyt JJ, Kirby PJ, Calos MP (2006) Een diversiteit aan serine-faagintegrasen mediëren plaatsspecifieke recombinatie in zoogdiercellen. Mol Gen Genom 276:135-146

Kobayashi T, Ebihara S, Ishii K, Kobayashi T, Nishijima M, Endo S, Takakub A, Sakagami H, Kondoe K, Tashirog F, Miyazakig J, Obata K, Tamura S, Yanagawa Y (2003) Structurele en functionele karakterisering van de muis glutamaat decarboxylase 67 genpromotor. Biochem Biophys Acta 1628 (2003): 156-168

Lakso M, Sauer B, Mosinger J, Lee EJ, Manning RW, Yu SH, Mulder KL, Westphal H (1992) Gerichte oncogenactivering door plaatsspecifieke recombinatie in transgene muizen. PNAS 89:6232–6236

Lange A, Gegg M, Burtscher GM, Bengel D, Kremmer E, Lickert H (2012) Fltp (T2AiCre): een nieuwe knock-in muislijn voor conditionele gentargeting in verschillende mono- en multiciliated weefsels. Differentiatie 83 (2): S105-S113. https://doi.org/10.1016/j.diff.2011.11.003

Lewandoski M (2001) Voorwaardelijke controle van genexpressie bij de muis. Nat Rev Genet 2:743-755

Li J, Ishii T, Feinstein P, Mombaerts P (2004) Geurreceptorgenkeuze wordt gereset door nucleaire overdracht van olfactorische sensorische neuronen van de muis. Natuur 428(6981):393-399

Lobe CG, Nagy A (1998) Voorwaardelijke genoomverandering bij muizen. BioEssays 1998(20):200-208

Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM (2013) RNA-geleide menselijke genoomtechniek via Cas9. Wetenschap 39(6121):823-826. https://doi.org/10.1126/science.1232033

Meyer M, de Angelis MH, Wurst W, Kühn R (2010) Gentargeting door homologe recombinatie in muiszygoten gemedieerd door zinkvingernucleasen. Proc Natl Acad Sci VS 107(34):15022–15026

Meyer M, Ortiz O, Hrabé de Angelis M, Wurst W, Kühn R (2012) Modellering van ziektemutaties door gentargeting in eencellige muizenembryo's. Proc Natl Acad Sci VS 109(24):9354-9359

Minskaia E, Ryan MD (2013) Co-expressie van eiwitten met behulp van FMDV2A: effect van "linker" -residuen. Biomed Res Int 2013:291730. https://doi.org/10.1155/2013/291730

Nakano T, Windrem M, Zappavigna V, Goldman SA (2005) Identificatie van geconserveerde Hb9-versterker met 125 basenparen die genexpressie specificeert voor spinale motorneuronen. Dev Biol 283(2):474-485

Ohtsuki S, Kamiya N, Hori S, Terasaki T (2005) Vasculaire endotheel-selectieve geninductie door Tie2-promotor / versterker in de hersenen en het netvlies van een transgene rat. Pharm Res 22(6):852–857

Orban PC, Chui D, Marth JD (1992) Weefsel- en plaatsspecifieke DNA-recombinatie bij transgene muizen. Proc Natl Acad Sci VS 89:6861–6865

Overstreet DH (1993) De Flinders-gevoelige lijnratten: een genetisch diermodel van depressie. Neurosci Biobehav Rev 17(1):51-68

Rasiman G, Li Y (2007) Reparatie van neuronale paden door olfactorische omhullende cellen. Nat Rev Neurosci 8(4):312-319

Rasmussen M, Kong L, Zhang GR, Liu M, Wang X, Szabo G, Curthoys NP, Geller AI (2007) Glutamaterge of GABAergic neuron-specifieke, langdurige expressie in neocorticale neuronen van helper virus-vrije HSV-1 vectoren die de fosfaat-geactiveerde glutaminase, vesiculaire glutamaat transporter-1 of glutaminezuur decarboxylase promotor. Hersenonderzoek 1144:19–32

Ruan J, Li H, Xu K, Wu T, Wei J, Zhou R, Liu Z, Mu Y, Yang S, Ouyang H, Chen-Tsai RY, Li K (2015) Zeer efficiënte CRISPR/Cas9-gemedieerde transgene knockin bij de H11-locus bij varkens. Wetenschappelijke Rep 5:14253. https://doi.org/10.1038/srep14253

Ryan MD, King AM, Thomas GP (1991) Splitsing van polyproteïne van mond- en klauwzeervirus wordt gemedieerd door residuen die zich binnen een sequentie van 19 aminozuren bevinden. J Gen. Virol 72:2727-2732

Sasahara M, Fries JW, Raines EW, Gown AM, Westrum LE, Frosch MP, Bonthron DT, Ross R, Collins T (1991) PDGF B-keten in neuronen van het centrale zenuwstelsel, achterste hypofyse en in een transgeen model. Cel 1:217–227

Sauer B (1987) Functionele expressie van het Cre-Lox plaatsspecifieke recombinatiesysteem in de gist Saccharomyces cerevisia. Mol Cell Biol 7:2087-2096

Sauer B, Henderson N (1988) Plaatsspecifieke DNA-recombinatie in zoogdiercellen door het Cre-recombinase van bacteriofaag P1. Proc Natl Acad Sci VS 85:5166-5170

Schlaeger TM, Bartunkova S, Lawitts JA, Teichmann G, Risau W, Deutsch U, Sato TN (1997) Uniforme vasculaire-endotheelcel-specifieke genexpressie in zowel embryonale als volwassen transgene muizen. Proc Natl Acad Sci VS 94(7):3058–3063

Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005) Een gids voor het kiezen van fluorescerende eiwitten. Nat-methoden 2 (12): 905-909

Singh P, Schimenti JC, Bolcun-Filas E (2015) Een praktische gids voor muizengenetica voor CRISPR-toepassingen. Genetica 199(1):1–15

Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, Gamboa M, Zong H, Chen-Tsai Y, Luo L (2011) Plaatsspecifieke integrase-gemedieerde transgenese bij muizen via pronucleaire injectie. Proc Natl Acad Sci USA 108(19):7902-7907

Tasic B, Miyamichi K, Hippenmeyer S, Dani VS, Zeng H, Joo W, Zong H, Chen-Tsai Y, Luo L (2012) Uitbreidingen van MADM (mozaïekanalyse met dubbele markers) bij muizen. PLoS ONE 7(3):e33332. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033332

Vassalli A, Rothman A, Feinstein P, Zapotocky MP (2002) Minigene geeft geurreceptor-specifieke axonbegeleiding in de bulbus olfactorius. Neuron 35:681-695

Weber T, Schönig K, Tews B, Bartsch D (2011) Induceerbare genmanipulaties in serotonerge hersenneuronen van transgene ratten. PLoS EEN 6(11):e28283

West AG, Gaszner M, Felsenfeld G (2002) Isolatoren: veel functies, veel mechanismen. Genen Dev 16 (3): 271-288

Witten IB, Steinberg EE, Lee SY, Davidson TJ, Zalocusky KA, Brodsky M, Yizhar O, Cho SL, Gong S, Ramakrishnan C, Stuber GD, Tye KM, Janak PH, Deisseroth K (2011) Recombinase-driver rattenlijnen: hulpmiddelen, technieken en optogenetische toepassing op dopamine-gemedieerde versterking. Neuron 72 (5): 721–733

Yang X, Arber S, William C, Li L, Tanabe Y, Jessell TM, Birchmeier C, Burden SJ (2001) Patterning van spieracetylcholinereceptorgenexpressie in afwezigheid van motorische innervatie. Neuron 30(2):399–410

Young JI et al (1998) Authentieke celspecifieke en ontwikkelingsgereguleerde expressie van pro-opiomelanocortine-genoomfragmenten in hypothalamische en achterhersenneuronen van transgene muizen. J Neurosci 18:6631–6640

Zhang J, Zhang L, Jiao H, Zhang Q, Zhang D, Lou D, Katz JL, Xu M (2006) C-Fox vergemakkelijkt het verwerven en uitsterven van door cocaïne geïnduceerde aanhoudende veranderingen. J Neurosci 26(51):13287-13296

Zhu F, Gamboa M, Farruggio AP, Hippenmeyer S, Tasic B, Shule B, Chen-Tsai Y, Calos MP (2013) Dice, een efficiënt systeem voor iteratieve genomische bewerking in menselijke pluripotente stamcellen. Nucleïnezuur Res 42(5):e34. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1290


Technologische ontwikkeling

Ons lab is geïnteresseerd in het ontwikkelen van nieuwe genetische technologieën met toepassingen voor genontdekking en menselijke gezondheid. Enkele van de technologieën die we momenteel onderzoeken, zijn genetische screening met RNAI- en ORF-bibliotheken, ontdekking van auto-antilichamen en nieuwe methoden voor de ontdekking van antilichamen. Momenteel zijn we vooral geïnteresseerd in auto-immuunziekten en vaccinontwerp. Een deel van ons werk wordt hieronder beschreven.

ShRNA-bibliotheken

We hebben samen met onze medewerkers in het laboratorium van Greg Hannon grote bibliotheken van shRNA's gegenereerd die het volledige genoom van mens en muis bestrijken (171, 183). De bibliotheken zijn ontworpen met behulp van shRNA-voorspellingsalgoritmen en gesynthetiseerd op een massaal parallelle manier met behulp van Agilent-microarrays. Oligonucleotiden worden door PCR geamplificeerd en gekloneerd in retrovirale of lentivirale vectoren. Op dit punt kunnen ze ofwel direct worden gebruikt of op volgorde worden geverifieerd en gerangschikt. Elke vector heeft ook een unieke bijbehorende barcode voor microarray-deconvolutie van pools. Op deze manier kunnen we grote bibliotheken met shRNA's genereren voor genetische screening (zie de sectie Technologieontwikkeling voor meer details).

Nieuwe shRNA-vectoren, de PRIME-vectoren

tDe komst van RNAi heeft geleid tot het vermogen om te interfereren met genexpressie en heeft ons vermogen om genetische screenings uit te voeren in zoogdiercellen aanzienlijk vergroot. De expressie van kort haarspeld-RNA van polymerase III-promotors kan worden gecodeerd in transgenen en worden gebruikt om siRNA's te produceren die specifieke genen neerwaarts reguleren. We ontdekten echter dat door polymerase II getranscribeerde shRNA's een zeer efficiënte knockdown van genexpressie vertonen wanneer het shRNA is ingebed in een micro-RNA-context (182). Belangrijk is dat ons shRNA-expressiesysteem (genaamd PRIME-vectoren) de multicistronische co-transcriptie van een reportergen mogelijk maakt, waardoor het volgen van shRNA-productie in individuele cellen wordt vergemakkelijkt. Op basis van dit systeem hebben we een reeks lentivirale vectoren ontwikkeld die een tetracycline-responsieve knockdown van genexpressie bij één exemplaar vertonen. De hoge penetrantie van deze PRIME-vectoren zal genoombrede functieverliesscreens vergemakkelijken en is een belangrijke stap in de richting van het gebruik van barcodestrategieën om het verlies van specifieke sequenties in complexe populaties te volgen.

We hebben ook een reeks PRIME-vectoren ontwikkeld die een betere knockdown laten zien in ES-cellen van muizen en andere cellen waar de CMV-promoter mogelijk niet optimaal is. Daarnaast hebben we meer tet-responsieve induceerbare vectoren ontwikkeld die coderen voor hun eigen omgekeerde tet-activator.

Recombinante DNA-technologieën

MAGIC: Een in vivo genetische methode voor de snelle constructie van recombinant DNA

We ontwikkelde een roman, hoogontwikkeld in vivo kloonmethode, MAGIC (Mating Assisted Genetically Integrated Cloning), die de snelle constructie van recombinante DNA-moleculen mogelijk maakt (180). MAGIC maakt gebruik van bacteriële paring, in vivo plaatsspecifieke endonucleasesplitsing en homologe recombinatie om de overdracht van DNA-fragmenten tussen een donorvector in één bacteriestam en een ontvangend plasmide in een afzonderlijke bacteriestam te katalyseren. Recombinatiegebeurtenissen worden genetisch geselecteerd en resulteren in plaatsing van het gen van belang onder de controle van nieuwe regulerende elementen met hoge efficiëntie. MAGIC elimineert de noodzaak voor restrictie-enzymen, DNA-ligasen, voorbereiding van DNA en alles in vitro manipulaties die nodig zijn voor subklonen en maakt de snelle constructie van meerdere constructen met minimale inspanning mogelijk. We demonstreren dat MAGIC constructies kan genereren voor expressie in meerdere organismen. As this new method requires only the simple mixing of bacterial strains, it represents a significant advance in high throughput recombinant DNA production that will save researchers significant amounts of time, effort and expense in functional genomics studies.

SLIC Cloning: a method for subcloning without restriction enzymes or DNA ligase

We developed a novel cloning method SLIC (Sequence and Ligation-Independent Cloning) that allows the assembly of multiple DNA fragments in a single reaction using in vitro homologous recombination and single-strand annealing (195). SLIC mimics in vivo homologous recombination by relying on exonuclease generation of single strand DNA (ssDNA) overhangs on insert and vector fragments and the assembly of these fragments by recombination in vitro. SLIC inserts can be prepared by incomplete PCR (lPCR) or mixed PCR. SLIC allows efficient and reproducible assembly of recombinant DNA with as many as 5 and 10 fragments simultaneously. SLIC circumvents the sequence requirements of traditional methods and is much more sensitive when combined with RecA to catalyze homologous recombination. It also provides a new method for site-directed mutagenesis of a gene. This flexibility allows much greater versatility in the generation of recombinant DNA for the purposes of synthetic biology.

Enhanced display technologies for biomarker discovery – PhIP Seq

the sensitive detection of circulating biomarkers represents a powerful approach to screening for early malignancy. However, current techniques are limited in their ability to distinguish normal from pathological states. This work aims to improve on current screening technology, utilizing novel principles in synthetic biology. In particular, we combine next generation DNA sequencing with the display of polypeptide libraries encoded by microarray-derived oligonucleotides. Using the T7 bacteriophage system, we are able to display the complete human peptidome and thereby seek to discover autoantigen biomarkers common to breast cancer patients. In parallel we are developing a fully defined, synthetic human single chain variable fragment (scFv) antibody library. This library will be used in ribosome display format for a scFv library-versus-peptide library screen in an effort to create a proteomic scale scFv set. Our hope is that development of these technologies will facilitate the identification of circulating cancer biomarkers, thereby enabling early diagnosis and treatment of the disease.

The pINDUCER lentiviral toolkit for inducible RNA interference in vitro and in vivo.

the discovery of RNAi has revolutionized loss-of-function genetic studies in mammalian systems. However, significant challenges still remain to fully exploit RNAi for mammalian genetics. For instance, genetic screens and in vivo studies could be broadly improved by methods that allow inducible and uniform gene expression control. To achieve this, we built the lentiviral pINDUCER series of expression vehicles for inducible RNAi in vivo. Using a multicistronic design, pINDUCER vehicles enable tracking of viral transduction and shRNA or cDNA induction in a broad spectrum of mammalian cell types in vivo. They achieve this uniform temporal, dose-dependent, and reversible control of gene expression across heterogenous cell populations via fluorescence-based quantification of reverse tet-transactivator expression. This feature allows isolation of cell populations that exhibit a potent, inducible target knockdown in vitro and in vivo that can be used in human xenotransplantation models to examine cancer drug targets.

OLDER TECHNOLOGIES

Lambda YES cDNA Expression System

We have developed a multifunctional lambda expression vector system, lambda YES, designed to facilitate gene isolation from eukaryotes by complementation of E. coli and S. cerevisiae mutations (23). Lambda YES vectors have a selection for cDNA inserts using an oligo adaptor strategy and are capable of expressing genes in both E. coli and S. cerevisiae. They also allow conversion from phage l to plasmid clones using the cre-lox site-specific recombination system, referred to as automatic subcloning. Lambda YES vectors utilize an adaptor selection for inserts and can generate libraries with 109 recombinants per mg of cDNA insert. cDNA libraries constructed in these vectors have been used to isolate genes from humans by complementation of yeast. Using this technology we isolated the human Cdk2 gene (24) by complementation of a yeast cdc28 Ts mutation and the Cyclin F gene (40) as a suppressor of cdc4 Ts mutations which led to the discovery of F-box proteins (77).

UPS – the Univector Plasmid Fusion System: A method for rapid construction of recombinant DNA molecules without restriction enzymes

modern biological research is highly dependent upon recombinant DNA technology. The functional analysis of a single gene requires the introduction of that gene into multiple vectors for different purposes. Conventional cloning methods are time-consuming and individual cloning events must be performed independently. To approach solving this problem, we sought to develop a systematic and uniform method with which to manipulate large sets of genes.

We developed a series of novel cloning methods that facilitate the rapid and systematic construction of recombinant DNA molecules (102). The central method is named the Univector Plasmid-fusion System (UPS). UPS employs cre-lox site-specific recombination to catalyze plasmid fusion between the Univector, a plasmid containing the gene of interest, and host vectors containing regulatory information. Fusion events are genetically selected and result in placement of the gene under the control of novel regulatory elements. A second UPS-related method allows for the precise transfer of coding sequences only from the Univector into a host vector. UPS eliminates the need for restriction enzymes, DNA ligases, and many in vitro manipulations required for subcloning and allows the rapid construction of multiple constructs for expression in multiple organisms. We demonstrate that UPS can be used to transfer whole libraries into new vectors. New methods for directional cloning of PCR fragments and for the generation of epitope tags and other fusions at the 3′ end of genes using homologous recombination in E coli are described that facilitate cloning and manipulation of genes in the Univector.

Together, these recombination-based cloning methods constitute a new comprehensive approach for the rapid and efficient generation of recombinant DNA that can be used for parallel processing of large gene sets, an ability required for future genomic analysis. We are continuing to develop large-scale capabilities using UPS as an alternative to the expensive and limited GATEWAY system.

Advances in the Two-Hybrid System

the two-hybrid cloning system is a powerful genetic method to identify genes via protein-protein interactions. We have made a number of improvements to this method which are designed to increase the number of potential protein-protein interactions detectable and to streamline the labor intensive process of authenticating clones identified in the primary screen. The first improvement was the design of genetic selections instead of screens to detect interacting proteins (32, 39). We developed the strain Y190 using HIS3 as a reporter and Y166 which employed a URA3 reporter for this purpose. A selection vastly increases the numbers of library clones that can be searched and is now built into all systems. Secondly, through the use of negative selections for plasmid loss coupled with a replica-mating strategy, we have developed a rapid method to distinguish between the genuinely interacting clones and the nonspecific background that is inherent to the system. Third, a lambda phage vector, lambda ACT2, was made that allows construction of highly complex, HA epitope-tagged, directional libraries of GAL4 activation domain-fused cDNAs that can be converted to plasmid form by in vivo cre-lox mediated site-specific recombination. We also introduced yeast mating of library clones to baits as a rapid way to both generate libraries and well as to counter screen against false positives. These methods have been incorporated into all current two-hybrid system kits. We used these methods to identify the human p21 and p57 Cdk inhibitors.

A Cytoplasmic Two Hybrid System, The SOS Recruitment System

ln collaboration with Michael Karin’s lab, we have developed a novel two hybrid system for the cloning of genes involved in protein-protein interactions (84). This system, called the SOS Recruitment System, SRS, relies on the activation of the ras signalling pathway when a fusion protein to the ras guanine nucleotide exchange factor, SOS, is recruited to the inner surface of the plasma membrane by physical association with a second protein targeted to the same membrane by a myristylation sequence. When SOS is successfully recruited to the plasma membrane, it activates ras and bypasses the need for the endogenous exchange factor, Cdc25, an essential protein. This system allows protein-protein interactions to be detected in the cytoplasm. Furthermore, proteins that activate transcription can be used in this system giving it an advantage over the transcriptionally based two-hybrid system. We have developed a lambda-based expression vector, lambda MS-TRP for expression of myristylation-fused cDNA libraries an other useful vectors for this method. Visit our protocols page for more information


Conclusies

In summary, a CRISPR/Cas9 toolbox was developed for efficient and comprehensive engineering of the industrial workhorse C. glutamicum. Markerless gene deletion, gene insertion, single-nucleotide editing and double-locus editing were achieved by using a customized two-plasmid-based CRISPR/Cas9 system and a simplified co-transformation strategy. This toolbox works well in several C. glutamicum strains and holds promise for renovating the genome editing of corynebacteria.


“Hacking the software of life”: Salesmanship versus cranks

It might be a bit harsh of me to say that the “mRNA vaccines are gene therapy” narrative by antivaxxers is a self-inflicted wound. However, it is not at all harsh to point out how Moderna scientists and executives selling their technology provided antivaxxers with language that they could easily weaponize against COVID-19 vaccines. In particular, Mercola makes a lot of this 2017 talk by Dr. Tal Zaks, chief medical officer of Moderna, in which he likened mRNA vaccines to “hacking the software of life”:

It gets worse, though, and Mercola gleefully takes advantage of Moderna’s loose analogies:

Zaks’ analogy to a prowler doesn’t even make a lot of sense biologically or as an analogy. He seems to be likening the RNA from a vaccine to being a “prowler” compared to the “prowler” of the virus outside of the cell. It’s no wonder that antivaxxers can so easily turn such language against COVID-19 vaccines, as it Zaks seems to be implying that the body is more alarmed by RNA in its cells than it is from foreign protein circulating in the body. As for “information therapy”, my only thought reading that dates back to the early 1980s: Gag me with a spoon.

Seriously, I wish Moderna would lose this particular analogy. It’s done (and continues to do) so much harm. I understand why it is attractive to view mRNA as “software”, but in reality it’s not. If you really wanted to pursue the analogy, I’d say that DNA is the software, mRNA is the compilation of that software, and the protein is the output, but even that’s a strained analogy. However you look at that analogy, though, it allows Mercola to pull off a favorite old antivaccine trope, one that was resurrected for COVID-19 vaccines, namely that vaccines are “transhumanism“, a claim by antivaxxers that I first noticed in 2012.

Seriously, look at Mercola run with this:

And, of course, according to Mercola, transhumanism due to COVID-19 vaccines is part and parcel of the “Great Reset”, a conspiracy theory claiming that the pandemic was engineered by the global elites to allow for a “reset” in which they take control of the world economy. I can’t help but note that “the Great Reset” is another example of how poorly chosen words basically give conspiracy theorists a gift. “The Great Reset” really is a plan first proposed by the World Economic Forum exploring how countries might recover from the COVID-19 pandemic. I mean, seriously? Who thought of this term? Who at Moderna thought it would be a good idea to present their treatments as “hacking the software of life”, given all the negative connotations of hacking?

Again, words matter. While I can’t be too hard on Moderna for being cautious in its SEC filing and using language that reflected regulatory uncertainties of the time, I can blame Tal Zaks and the leadership of Moderna for using such easily weaponized analogies, such as “hacking the software of life” to sell its product to investors. I can blame the World Economic Forum for coming up with a term like the “Great Reset”. These words matter, and these words have been a gift to COVID-19 conspiracy theorists and a burden to those trying to counter disinformation.


Bekijk de video: TEKNOLOGI PLASMID KLONING GENDNA REKOMBINAN (November 2021).