Informatie

Hoe werkt het enzym Dicer in het RISC-complex?


Ik weet dat het RISC (RNA-geïnduceerde silencing complex) een van de belangrijkste complexen is die betrokken zijn bij genregulatie via RNAi. Wat ik wil weten is, welke rol speelt Dicer precies in dit complex?


Dicer is een endo-ribonuclease dat behoort tot de RNAse-III-klasse. Dicer maakt geen deel uit van de RISC. Het helpt echter bij de vorming van RISC door dsRNA of de stengel van haarspeld-RNA aan twee uiteinden te splitsen, waardoor een klein dsRNA-product vrijkomt. Vervolgens wordt een van de strengen in de RISC geladen.

Er zijn verschillende recensies over dit onderwerp en er is ook een video die je op youtube kunt vinden.


Grenzen in moleculaire biowetenschappen

De affiliaties van de redacteur en de recensenten zijn de meest recente op hun Loop-onderzoeksprofielen en weerspiegelen mogelijk niet hun situatie op het moment van beoordeling.


  • Artikel downloaden
    • Download PDF
    • LeesCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Aanvullend
      Materiaal
    • Eindopmerking
    • Referentiemanager
    • Eenvoudig TEXT-bestand
    • BibTex


    DELEN OP

    Toegangsopties

    Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

    Alle prijzen zijn NET prijzen.
    De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
    De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

    Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

    Alle prijzen zijn NET prijzen.


    Berkeley-wetenschappers krijgen eerste gedetailleerde blik op Dicer

    BERKELEY, CA '8211 Wetenschappers hebben voor het eerst een gedetailleerde kijk gekregen op de moleculaire structuur van een enzym dat de natuur al eeuwen gebruikt om ongewenste genetische berichten het zwijgen op te leggen. Een team van onderzoekers van het Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) en de University of California in Berkeley gebruikten röntgenkristallografie van de Advanced Light Source (ALS) van Berkeley Lab om de kristalstructuur te bepalen van Dicer, een enzym dat een cruciale rol speelt in het proces dat bekend staat als RNA-interferentie. Het Dicer-enzym is in staat om een ​​dubbelstrengige vorm van RNA in segmenten te knippen die zich aan genen kunnen hechten en hun activiteit kunnen blokkeren.

    Jennifer Doudna is een biochemicus die gezamenlijke afspraken heeft met Berkeley Lab, UC Berkeley en HHMI. Ze is een toonaangevende autoriteit op het gebied van RNA-moleculaire structuren.

    "Met deze kristalstructuur hebben we geleerd dat Dicer dient als een moleculaire liniaal, met een klem aan het ene uiteinde en een hakmes aan het andere uiteinde op een bepaalde afstand, die RNA-fragmenten produceert van een ideale grootte voor gen-uitschakeling," zei Jennifer Doudna , een biochemicus die deze studie leidde. Doudna, een toonaangevende autoriteit op het gebied van RNA-moleculaire structuren, heeft gezamenlijke afspraken met Berkeley Lab's Physical Biosciences Division, UC Berkeley's Department of Molecular and Cell Biology en Department of Chemistry. Ze is ook een onderzoeker bij het Howard Hughes Medical Institute (HHMI).

    "Het kennen van de structuur van Dicer vormt de basis om te begrijpen hoe Dicer-enzymen betrokken zijn bij andere fasen van de RNA-interferentieroute," zei Doudna. "In menselijke cellen wijst het bewijs erop dat Dicer deel uitmaakt van een groter moleculair complex dat het RNA-interferentieproces aanstuurt. De kernstructuur van Dicer is sterk geconserveerd door evolutie en zou kunnen dienen als een gids bij het herontwerpen van de RNA-moleculen die specifieke gen-uitschakelingsroutes aansturen.&rdquo

    RNA-interferentie is een oud genuitschakelingsproces dat een fundamentele rol speelt in een aantal belangrijke functies, waaronder virale verdediging, chromatine-remodellering, genoomherschikking, ontwikkelingstiming, hersenmorfogenese en stamcelonderhoud. Al deze RNA-interferentie-activiteiten zijn afhankelijk van Dicer, dus het begrijpen van de moleculaire structuur van dit enzym is een cruciale stap.

    De resultaten van dit onderzoek worden gerapporteerd in de editie van 13 januari 2006 van het tijdschrift Wetenschap in een paper getiteld: Structurele basis voor dubbelstrengs RNA-verwerking door Dicer. Co-auteur van het artikel met Doudna waren Ian MacRae, Kaihong Zhou, Fei Li, Adrian Repic, Angela Brooks, Zacheus Cande en Paul Adams.

    RNA & mdash ribonucleïnezuur & mdash staat al lang bekend als een veelzijdig biologisch werkpaard, dat verantwoordelijk is voor het overbrengen van genetische boodschappen van DNA uit de kern van een levende cel en die boodschappen gebruikt om specifieke eiwitten in het cytoplasma van een cel te maken. In 1998 ontdekten wetenschappers echter dat RNA ook de synthese van eiwitten uit sommige van die genetische boodschappen kan blokkeren. Dit genuitschakelingsproces wordt RNA-interferentie genoemd en begint wanneer een dubbelstrengs RNA-segment het enzym Dicer tegenkomt. Dubbelstrengs RNA (dsRNA) wordt gevormd uit twee enkelstrengs RNA met complementaire basensequenties.

    Dicer splitst dsRNA in kleinere fragmenten die korte interfererende RNA's (siRNA's) en microRNA's (miRNA's) worden genoemd. Dicer helpt vervolgens deze siRNA- en miRNA-fragmenten te laden in een groot multi-eiwitcomplex genaamd RISC, voor RNA-Induced Silencing Complex. RISC kan boodschapper-RNA (mRNA)-moleculen (het RNA dat codeert voor de boodschap van een gen) zoeken en vangen met een basensequentie die complementair is aan die van zijn siRNA of miRNA. Dit dient om ofwel de genetische boodschap die door het mRNA wordt gedragen te vernietigen, ofwel de daaropvolgende synthese van een eiwit te blokkeren.

    Tot nu toe was niet bekend hoe Dicer dsRNA kan herkennen en die moleculen kan splitsen in producten met een lengte die precies is wat nodig is om specifieke genen het zwijgen op te leggen. Doudna en haar co-auteurs waren in staat om een ​​Dicer-enzym te zuiveren en te kristalliseren uit Giardia intestinalis, een eencellige microscopische parasiet die de darmen van mens en dier kan infecteren. Dit Dicer-enzym in Giardia is identiek aan de kern van een Dicer-enzym in hogere eukaryoten, waaronder mensen, dat dsRNA in lengtes van ongeveer 25 basen splitst.

    Een vooraanzicht van een lintweergave van Dicer laat zien dat het enzym lijkt op een bijl met de RNA-klem aan het handvat (het PAZ-domein) en het hakmes bij het mes (RNase IIIa en IIIb). Een vlak connectorgebied van 65 angstrom is het liniaalgedeelte dat wordt gebruikt om segmenten van 25 nucleotiden (basen) lang te meten. Een segment van dubbelstrengs RNA (blauw) wordt getoond dat door het Dicer-enzym gaat.

    in hun Wetenschap paper beschrijven Doudna en haar collega's een vooraanzicht van de structuur als een bijl. Aan het uiteinde van het handvat bevindt zich een domein waarvan bekend is dat het bindt aan kleine RNA-producten, en aan het uiteinde van het blad is er een domein dat RNA kan splitsen. Tussen de klem en het hakmes bevindt zich een gebied met een vlak oppervlak dat een positieve elektrische lading draagt. Doudna en haar collega's stellen voor dat dit platte gebied bindt aan het negatief geladen dsRNA zoals biologisch klittenband, waardoor Dicer gespecificeerde lengtes van siRNA kan meten en afsnijden.

    &ldquoAls je de klem, het platte gedeelte en het hakmes samenvoegt, krijg je een redelijk goed idee van hoe Dicer werkt,&rdquo, zei Doudna. &ldquoWe gebruiken dit structurele model nu om experimenten te ontwerpen die ons kunnen vertellen wat Dicer aanzet tot actie.&rdquo

    Het is bekend dat verschillende vormen van het Dicer-enzym verschillende lengtes van siRNA produceren. Nadat het positief geladen gebied met vlak oppervlak in Dicer is geïdentificeerd als het "heerser" deel van het enzym, kan het mogelijk zijn om de lengte van een lange connector-helix binnen dit domein te veranderen om de lengte van de resulterende siRNA-producten te veranderen.

    &ldquoOne size fits all voor Dicer, het maakt dsRNA-producten met een lengte van 21 tot 30 basenparen of langer. We willen graag zien wat er gebeurt als je een natuurlijke dobbelsteen neemt en de lengte van zijn helix verandert,' zei Doudna.

    Het bepalen van de kristalstructuur van Dicer werd mogelijk gemaakt door de unieke kristallografiemogelijkheden van ALS Beamline 8.2.1 en 8.2.2, zei Doudna. Gefinancierd door HHMI, worden bundellijnen 8.2.1 en 8.2.2 aangedreven door een supergeleidende buigmagneet, een ideale bron van röntgenstraling voor experimenten met eiwitkristallografie. De "superbend"-magneet wordt gebruikt om röntgenstralen te extraheren uit een relativistische elektronenstraal die door de ALS-opslagring circuleert met energieën tot twee miljard elektronvolt.

    Röntgenstralen bij de ALS zijn typisch honderd miljoen keer helderder dan die van de beste röntgenbuizen. Wanneer een bundel röntgenstralen door een kristal wordt gestuurd, zorgen de atomen in het kristal ervoor dat de röntgenstralen worden verstrooid, waardoor een diffractiepatroon ontstaat. Dit diffractiepatroon kan met de computer worden vertaald in 3D-beelden van het kristal.

    Het werk gerapporteerd in de Wetenschap paper van Doudna en haar collega's werd ondersteund door financiering van het Basic Energy Sciences-programma van het Department of Energy en de National Institutes of Health.


    Discussie

    Onze resultaten geven aan dat Loqs en Dicer-1 een complex vormen dat pre-miRNA's omzet in volwassen miRNA's, dus hoe werken ze samen in pre-miRNA-verwerking? Sequentievergelijking laat zien dat Loqs een paraloog is van R2D2 (zie figuur 1). Daarom kan Loqs de moleculaire rol spelen van R2D2 voor Dicer-1. R2D2 vormt een stabiel heterodimeer complex met Dicer-2, terwijl elk eiwit alleen in vivo onstabiel lijkt te zijn [59]. Bij afwezigheid van R2D2 is Dicer-2 nog steeds in staat om lang dsRNA efficiënt te verwerken tot siRNA's. Daarom is de siRNA-genererende activiteit van Dicer-2 niet afhankelijk van R2D2. De resulterende siRNA's worden echter niet effectief naar RISC gekanaliseerd in afwezigheid van R2D2. Het Dicer-2-R2D2-complex, maar niet alleen Dicer-2, bindt aan siRNA, wat aangeeft dat siRNA-binding door het heterodimeer belangrijk is voor RISC-invoer [59,66]. In het geval van Loqs is dit eiwit alleen niet in staat om pre-miRNA's om te zetten in volwassen miRNA's, maar het stimuleert en stuurt duidelijk de specifieke pre-miRNA-verwerkingsactiviteit van Dicer-1. Bovendien verminderde het uitschakelen van Loqs de pre-miRNA-verwerkingsactiviteit in cytoplasmatische lysaten in vitro aanzienlijk (zie figuren 4C en 5B), maar veroorzaakte het geen significante verlaging van het niveau van Dicer-1-eiwit (zie figuur 2B), wat impliceert dat Dicer- 1 kan grotendeels afhankelijk zijn van Loqs voor zijn pre-miRNA-verwerkingsactiviteit. De moleculaire rol van Loqs voor Dicer-1 is dus niet eenvoudigweg vergelijkbaar met die van R2D2 voor Dicer-2.

    Het kan worden voorgesteld dat Loqs een van de verschillende rollen kan hebben in pre-miRNA-verwerking. Dicer-1 bevat slechts één dsRBD, wat mogelijk niet voldoende is voor sterke interactie met en/of specifieke herkenning van het pre-miRNA-substraat (zie figuur 6C en 6D). Loqs, die drie dsRBD's bevatten zonder dat andere identificeerbare domeinen duidelijk zijn, zouden de extra RNA-bindende modules kunnen leveren die nodig zijn voor specifieke herkenning van het pre-miRNA, en daardoor de pre-miRNA-binding voor Dicer-1 stabiliseren. Loqs zou ook de binding van Dicer-1 op het pre-miRNA kunnen organiseren, wat bijdraagt ​​​​aan de specifieke positionering van de Dicer-1-splitsingsplaats. Als alternatief, aangezien bekend is dat dsRBD's niet alleen dsRNA's binden, maar ook eiwit-eiwit-interacties [67] bemiddelen, kan Loqs Dicer-1 direct binden via zijn dsRBD's. Deze eiwit-eiwitinteractie kan een conformationele verandering van Dicer-1 veroorzaken die ofwel de vorming van een intramoleculaire dimeer van zijn twee RNase III-domeinen [50,68] vergemakkelijkt, wat een paar katalytische plaatsen creëert, of de overdracht van de Dicer- 1 splitste volwassen miRNA's aan de RISC.

    Sequentie-analyse onthulde dat eiwitactivator van eiwitkinase dsRNA-afhankelijk (PKR) (PACT) [69] en HIV TAR RNA-bindend eiwit (TRBP) [70] bij zoogdieren 34% identiteit hebben met Loqs en een sterk vergelijkbare domeinstructuur ermee delen (Figuur 8). Aangenomen wordt dat zowel PACT als TRBP een rol spelen bij de regulatie van translatie door PKR te moduleren die ook twee dsRBD's bevat [71–73]. PACT interageert met PKR en verbetert de autofosforylering van PKR [67], dat op zijn beurt de α-subeenheid van eukaryote translatie-initiatiefactor 2 (eIF2α) fosforyleert en leidt tot een remming van mRNA-translatie als reactie op virale infectie en andere stimuli. TRBP voorkomt PKR-gemedieerde remming van eiwitsynthese door binding aan PKR [74]. Samen beschouwd, zal het belangrijk zijn om andere partners van Loqs dan Dicer-1 te achterhalen voor mogelijke betrokkenheid van Loqs bij miRNA-gemedieerde translationele regulatie in Drosophila.

    Het dsRNA-bindende motief (dsRBD) wordt aangegeven als een zwarte doos. Deze eiwitten bevatten drie vermeende dsRBD's. Loqs deelt ∼34% aminozuuridentiteit met TRBP en PACT en ∼31% identiteit met Xlrbpa (Xenopus laevis RNA-bindend eiwit A). Sequentievergelijking tussen Loqs en zijn menselijke en Xenopus homologen vertoonden ook een hogere mate van aminozuurconservering in dsRBD's, waaronder C-terminale niet-canonieke dsRBD's. DeXenopus homoloog, Xlrbpa, van TRBP/PACT blijkt te associëren met ribosomen in het cytoplasma [77], zoals het geval is voor veel RNAi-factoren, waaronder miRNA's [47,78-82].


    Hoe werkt het enzym Dicer in het RISC-complex? - Biologie

    Gemaakt door Alexandra Asaro

    Het eiwit Dicer is een belangrijke verwerkingscomponent in de biogenese van kleine interfererende RNA's (siRNA's), waaronder microRNA's (miRNA's). De essentiële functie van Dicer is het herkennen, binden en splitsen van langere segmenten van dubbelstrengs RNA (dsRNA) in dsRNA-duplexen van ongeveer 25 basenparen. (1) Eiwit-RNA-interacties liggen ten grondslag aan de RNA-hydrolysefunctie van Dicer. Over het algemeen functioneert Dicer om stam-lus-dsRNA om te zetten in RNA-duplexvoorlopers van siRNA en miRNA. Het Dicer RNA-duplexproduct heeft een 3'-overhang van twee nucleotiden, kenmerkend voor RNAaseIII-splitsing. Eenmaal gesplitst door Dicer, worden de duplexen van 25 bp gescheiden en wordt een van de RNA-strengen opgenomen in het RNA Induced Silencing Complex (RISC). De kleine RNA-streng vergemakkelijkt RNA-interferentie, negatieve regulatie van genexpressie op RNA-niveau, door de RISC naar een geschikt mRNA-doelwit te leiden en te binden aan een specifiek gebied binnen het mRNA, waardoor translationele remming en/of afbraak van het mRNA wordt geïnduceerd. (1) De structuur van Dicer werd aanvankelijk verduidelijkt in Giardia intestinalis.

    De functies van Giardia Dicer omvatten herkenning en binding van een RNA-substraat met een secundaire structuur van de stamlus en een 3'-overhang van twee nucleotiden. Dicer moet dit stamlus-RNA op een specifieke manier binden langs zijn verschillende domeinen, zodat het RNA op de juiste plaats wordt gepositioneerd voor splitsing. Splitsing van het RNA in een kleinere dsRNA-duplex omvat geconserveerde residuen, homodimeervorming tussen katalytische domeinen en kationcoördinatie. Studies met bacteriële RNase en complexere Dicer-enzymen, zoals Dicer bij muizen en mensen, kunnen helpen om de structuur van domeinen die Giardia Dicer deelt met deze verwante enzymen op te helderen. Giardia Dicer bevat een PAZ-domein dat functioneert bij specifieke dsRNA-herkenning en -binding, en twee ribonuclease III (RNase III)-domeinen die splitsing van het substraat-dsRNA uitvoeren. (1) De PAZ- en RNase-domeinen zijn verbonden door een 65 angstrom lange connectorhelix. De lengte ervan komt overeen met de lengte van het dsRNA-product van 25 nucleotiden. (1) Een N-terminaal domein, het p latform-domein, dat bestaat uit drie alfa-helices en een beta-geplooid vel, ligt ten grondslag aan het alfa-helix-connectorsegment. De twee RNase III-domeinen zijn verbonden via een multi-alpha-helixdomein dat het bridging-domein wordt genoemd. (1) Over het algemeen bevat Dicer alfa-helix, beta-geplooid blad, windingen en een economische structuur van willekeurige spoel.

    Het PAZ-domein, dat een alfa-helix en een bèta-vel omvat, herkent en bindt specifieke dsRNA's met een 3'-overhang van 2 nucleotiden. De herkende 3'-overhang is gebonden door een bindingsplaats binnen het PAZ-domein. Om binding tot stand te brengen, vormen residuen in het PAZ-bindende domein van Dicer waterstofbindingen met de hydroxylgroepen van het RNA. (1) Studies door Zhang et. al. hebben bevestigd dat het PAZ-domein van dicer bij voorkeur dsRNA-substraten bindt met twee nucleotide 3'-overhangen. (2) Het uiteinde van de RNA-duplex gebonden aan het PAZ-domein bevat het 3'-uiteinde van één streng van de duplex, die bindt aan de 3'-overhangende bindingsholte van het PAZ-domein (geel gemarkeerd), en het 5'-uiteinde van de andere streng, die bindt aan een ab asisch residurijk lusgebied in het PAZ-domein. Deze basische resten kunnen dienen om de bindingsinteractie bij de 3'-overhangende bindingsholte eronder te stabiliseren. (1) Met één uiteinde van het dsRNA-substraat gebonden aan het PAZ-domein, is het andere uiteinde van de RNA-duplex gepositioneerd tussen de RNase IIIa- en RNase IIIb-domeinen, die segmenten met een alfa-helixstructuur bevatten.

    Positionering van de RNA-duplex vereist conformationele flexibiliteit in Dicer. Na binding van het dsRNA zorgt een conformationele verandering in het eiwit voor geschikte substraatbuiging en positionering in het katalytische gebied. (3) Het PAZ-domein verschuift aanzienlijk bij RNA-binding. Deze verschuiving wordt mogelijk gemaakt door een proline-residu in de connector-helix, proline-266, dat functioneert als een scharnier en een knik in de helix veroorzaakt. Ook de RNase-domeinen ondergaan een verschuiving. De interface van het platform en de RNase-domeinen bevat een ander scharniergebied dat bijdraagt ​​aan conformationele beweging. (3) Giardia Dicer is in staat om een ​​verscheidenheid aan dsRNA-moleculen te binden, zelfs die met een onvolmaakte basenparing. Omdat niet-overeenkomende basenparen in dsRNA variabele secundaire structuurlussen en uitstulpingen kunnen veroorzaken, is conformationele flexibiliteit van Dicer de sleutel voor de binding van diverse dsRNA-moleculen. (3) Een ander sleutelelement bij het uitlijnen van substraten is de positioneringslus in het RNase IIIa-domein, die helpt om de RNA-duplex op de katalytische plaats correct te positioneren. De lus ligt onder het katalytische grensvlak van de twee RNase-subeenheden waar het dsRNA bindt. Studies in Dicer positioneringslusmutanten hebben aangetoond dat de positioneringslus nodig is om het gewenste product van 25 nucleotiden te geven na splitsing in tegenstelling tot de precisie die wordt gezien in normale Dicer, de mutanten genereerden RNA-producten van afwijkende grootte. (4)

    Elk van de RNase III-domeinen bevat vier of vijf geconserveerde zure aminozuurresiduen. Binnen RNase IIIa zijn de resten E407, D340, D404 en E336 en binnen RNase IIIb zijn de resten E684, E723, D653, D720 en E649. (1) Deze negatief geladen aspartaat- en glutamaatresiduen vergemakkelijken de binding van twee metaalkationen per RNase-domein. Zijketens van de residuen nemen deel aan waterstofbinding en vormen een pocket waarin ionische interacties plaatsvinden tussen de metaalkationen en de negatief geladen zijketens. De metaalkationen, gewoonlijk Mg2+ (hoewel Mn2+ hier wordt getoond) zijn katalytisch vereist voor de RNase III-domeinen om splitsing van fosfodiesterbindingen in de twee strengen van het RNA-helixsubstraat uit te voeren. (1) De metaalionenparen van de twee RNase III-domeinen zijn gescheiden door een afstand, 17,5 angstrom, gelijk aan de breedte van het dsRNA-substraat. (1)

    Studies naar bacterieel RNase III hebben geholpen het mechanisme van RNase-splitsing op te helderen. De kationen zijn niet alleen nodig voor splitsing, maar ook voor een goede binding van het RNA-substraat in het RNase-gebied. (1) De twee RNase-subeenheden vormen een katalytische vallei en het RNA moet in deze vallei worden geplaatst om splitsing te laten plaatsvinden. De kationen voorkomen ladingsafstoting tussen negatieve residuen in de katalytische vallei en de negatieve fosfaten die de dsRNA-ruggengraat bekleden, waardoor de substraat-RNA-duplex stabiel in de vallei kan binden. (5) Zonder de vier gebonden Mg2+-kationen kan het RNA-substraat binden, maar kan het niet binden in de katalytische vallei en kan het vervolgens niet worden gesplitst. (5) De katalytische vallei wordt gecreëerd door dimerisatie van de twee RNase III-domeinen. homodimeervorming in dit gebied is vereist voor de katalytische activiteit van Dicer. (4) Waterstofbindingen mediëren binding van het RNA-substraat langs de verschillende domeinen van Dicer. Waterstofbinding vindt plaats tussen aminozuur- en nucleotideresiduen in het RNase-katalytische gebied. (5) Het mechanisme van splijtbare bindingssplitsing is een fosforylgroepoverdrachtsreactie. Het vereist twee Mg2+-kationen voor splitsing binnen elke RNA-streng. Om één deelbare binding te splitsen, verlaagt het eerste Mg2+-kation de pKa van een watermolecuul, waardoor het een proton kan verliezen en een -OH wordt. Deze -OH werkt als een nucleofiel om het fosforatoom aan te vallen dat is gebonden aan het nucleotide dat zal worden gesplitst. Bij deze nucleofiele aanval vormt zich een vijfwaardig tussenproduct rond het fosforatoom. Het tweede Mg2+ interageert met de vertrekkende groep en vergemakkelijkt de ineenstorting van dit tussenproduct door de negatieve lading van het zuurstofatoom te neutraliseren. Het tussenproduct stort in met het verbreken van een fosfor-zuurstofbinding om RNA-strengsplitsing te bereiken. (5) Het mechanisme onthult het belang van de Mg2+-kationen voor katalyse. Twee van de kationen zijn nodig om één streng van het RNA te splitsen, dus om het duplex-RNA-substraat te splitsen, moeten in totaal vier kationen worden gebonden.

    Giardia Dicer deelt structurele gelijkenis met het Nuclease-domein van Ribonuclase III van Mycobacterium Tuberculosis. Net als Giardia bestaat het tuberculose-endoribonuclease-domein uit twee RNase III-domeinen, die elk twee metaalkationen binden via vier geconserveerde zure resten. De afstand tussen deze domeinen past bij de spanwijdte van de dsRNA-suiker-fosfaatruggengraat en de splitsing van het dsRNA produceert een 3'-overhang van twee nucleotiden. (6) Al deze kenmerken zijn consistent met de Giardia-domeinen, wat aantoont dat de RNaseIII-endoribonucleasen zeer structureel en functioneel geconserveerd zijn. Veel andere RNaseIII-enzymen behouden deze karakteristieke kenmerken. Naast structurele gelijkenis heeft Giardia Dicer overeenkomsten in sleutelsequenties met het ribonuclease III C-terminale domein van eukaryote, bacteriële en archeale RNase III-eiwitten, zoals blijkt uit een BLAST-query. 5 van de 5 residuen die de RNase III-actieve plaats vormen, 3 van de 3 residuen die de RNase III-metaalbindingsplaats vormen en 15 van de 15 residuen die de RNase III-dimerisatie-interface vormen die is toegewezen aan Giardia Dicer. Op deze plaatsen kunnen zowel R Nase III-enzymen als Dicer dsRNA binden en splitsen op de katalytische plaats van het subeenheid-interface.

    Giardia Dicer deelt ook structurele componenten met Human Dicer. Human Dicer heeft het PAZ-domein en twee RNase III-domeinen. De Human Dicer heeft echter ook een Helicase-domein, een dsRBD-domein (dubbelstrengs RNA-binding) en een DUF283-domein (domein met onbekende functie), dat lijkt op het Giardia-platformdomein. (1) Human Dicer bindt zijn dsRNA-substraat met een hogere affiniteit dan Giardia Dicer, wat kan worden toegeschreven aan zijn extra kenmerken en complexere structuur. (1) Er bestaat een hoge structurele overeenkomst tussen de alfa-helices van Giardia en Human Dicer's connector die het gebied tussen de PAZ- en RNase III-domeinen overspannen. Deze alfa-helix, zowel bij de mens als bij Giardia, bestaat uit afwisselende hydrofobe en hydrofiele resten en bevat een knik-creërende proline-rest die nodig is om het dsRNA zodanig te binden dat het een uiteinde tussen de RNase III-domeinen plaatst. (1) De RNase III-domeinen van Human Dicer lijken op de Giardia RNase III-domeinen. Net als in Giardia bindt elk domein twee metaalkationen en produceert een 3'-overhang van twee nucleotiden bij substraatsplitsing. (7) Het RNase-gedeelte van Human Dicer is groter en complexer dan dat van Giardia Dicer, maar hun RNase-domeinen vertonen een significante structurele overeenkomst.

    Mouse Dicer bevat veel van dezelfde structurele elementen en domeinen als Giardia Dicer. Eén Giardia Dicer RNase-domein kan worden geplaatst op één Mouse Dicer RNase-domein. Een van de RNase III-domeinen van Mouse Dicer bevat een alfa-helixgebied en een lusgebied dat niet aanwezig is in Giardia Dicer. Zowel muis- als humane dicers bevatten deze extra helix in hun RNase IIIb-domeinen, wat mogelijk extra interacties met het dsRNA mogelijk maakt. (8) Onderzoek van de muis-dicer RNase III-domeinen heeft een lysineresidu (K-1790) geïdentificeerd dat aanwezig is in deze katalysator regio. Het lysineresidu is een geconserveerd element van bacteriële en Giardia Dicers en is betrokken bij de katalyse van splitsing van fosfodiesterbindingen. (8) Het functionele lysine in Mouse Dicer is K-1790. Deze kritische lysine is geconserveerd in Giardia Dicer en verschijnt als K-400.

    Het PAZ-domein van het humaan Argonaute-eiwit lijkt qua structuur en functie sterk op het PAZ-domein van Giardia Dicer. Argonaute functioneert stroomafwaarts van Dicer in de RNAi-route en dient om dubbelstrengs siRNA te binden in het RISC-complex. (9) In beide eiwitten functioneren de PAZ-domeinen in dsRNA-substraatbinding. De RNA-binding is afhankelijk van de herkenning van een 3'-overhang van twee nucleotiden in de duplex. Argonaute mist echter in zijn PAZ-domein een Dicer-specifieke lus die rijk is aan basische residuen, die functioneert in binding aan het 5'-uiteinde en kan dienen om de algehele RNA-binding en afgifte van Dicer te mediëren. (1) Een Dali Server-zoekopdracht onthulde significante sequentieovereenkomst in de PAZ-domeinen van Argonaute2 en Giardia Dicer. (11)


    Hoe RNAi werkt

    Twee soorten kleine RNA-moleculen functioneren in RNAi. De eerste zijn synthetische, korte interfererende RNA (siRNA) moleculen die zich richten op mRNA-splitsing, waardoor de expressie van een gen van belang effectief wordt uitgeschakeld. MicroRNA (miRNA) -moleculen daarentegen zijn van nature voorkomende enkelstrengs RNA's van 19-22 nucleotiden lang, die genexpressie reguleren door te binden aan de 3' niet-vertaalde regio's (UTR's) van doel-mRNA's en hun translatie te remmen (Ambros, 2004 ).

    SiRNA-analyse

    Er zijn verschillende manieren om RNAi te induceren: synthetische moleculen, RNAi-vectoren en in vitro dobbelstenen (Figuur 1, hieronder). In zoogdiercellen initiëren korte stukjes dsRNA - kort interfererend RNA - de specifieke afbraak van een gericht cellulair mRNA. In dit proces wordt de antisense-streng van siRNA onderdeel van een multi-eiwitcomplex of RNA-geïnduceerd silencing-complex (RISC), dat vervolgens het overeenkomstige mRNA identificeert en het op een specifieke plaats splitst. Vervolgens wordt deze gesplitste boodschap gericht op afbraak, wat uiteindelijk resulteert in het verlies van eiwitexpressie.

    Figuur 1: Methoden voor RNAi-knockdown in zoogdiercellen.

    MiRNA-analyse

    Zowel RNA-polymerase II als III transcriberen miRNA-bevattende genen, waardoor lange primaire transcripten (pri-miRNA's) worden gegenereerd die worden verwerkt door het RNase III-type enzym Drosha, wat haarspeldstructuren oplevert van 70 tot 90 bp lang (pre-miRNA's). Pre-miRNA-haarspelden worden geëxporteerd naar het cytoplasma, waar ze verder worden verwerkt door het RNase III-eiwit Dicer tot korte dubbelstrengs miRNA-duplexen van 19 tot 22 nucleotiden lang. De miRNA-duplex wordt herkend door het RNA-geïnduceerde silencing-complex (RISC), een nucleasecomplex met meerdere eiwitten, en een van de twee strengen, de gidsstreng, helpt dit eiwitcomplex bij het herkennen van zijn verwante mRNA-transcript. Het RISC-miRNA-complex interageert vaak met de 3'-UTR van doel-mRNA's in regio's die imperfecte sequentiehomologie vertonen, waardoor de eiwitsynthese wordt geremd door een mechanisme dat nog volledig moet worden opgehelderd (Figuur 2 hieronder).

    Plant-miRNA's kunnen binden aan sequenties op doel-mRNA's door exacte of bijna exacte complementaire basenparing en daardoor directe splitsing en vernietiging van het mRNA (Rhoades et al., 2002 Chen, 2005). Vergelijkbaar met het mechanisme dat wordt gebruikt bij RNA-interferentie (RNAi), vindt de splitsing van een enkele fosfodiesterbinding op het doelwit-mRNA plaats tussen basen 10 en 11 (Elbashir et al., 2001). Daarentegen vertonen bijna alle tot nu toe bestudeerde dierlijke miRNA's geen perfecte complementariteit met hun mRNA-doelen en lijken ze de eiwitsynthese te remmen terwijl de stabiliteit van het mRNA-doelwit behouden blijft (Ambros, 2004). Er is gesuggereerd dat transcripten kunnen worden gereguleerd door meerdere miRNA's, en een individueel miRNA kan zich richten op talrijke transcripten. Onderzoek suggereert dat maar liefst een derde van de menselijke genen kan worden gereguleerd door miRNA's (Lim et al., 2003). Hoewel honderden miRNA's zijn ontdekt in een verscheidenheid aan organismen, is er weinig bekend over hun cellulaire functie. Verschillende unieke fysieke kenmerken van miRNA's, waaronder hun kleine formaat, gebrek aan gepolyadenyleerde staarten en de neiging om hun mRNA-doelen te binden met imperfecte sequentiehomologie, hebben ze ongrijpbaar en uitdagend gemaakt om te bestuderen.

    Figuur 2: Biogenese en functie van miRNA. MicroRNA-transcripten, gegenereerd door RNA-polymerasen II en III, worden verwerkt door de RNase III-enzymen Drosha (nucleair) en Dicer (cytoplasmatisch), wat 19-22 nucleotide miRNA-duplexen oplevert. Een van de twee strengen van de duplex is opgenomen in het RISC-complex, dat de eiwitexpressie reguleert.


    Een vereenvoudigd model voor de RNAi-route

    Een vereenvoudigd model voor de RNAi-route is gebaseerd op twee stappen, waarbij elk ribonuclease-enzym betrokken is. In de eerste stap wordt het trigger-RNA (ofwel dsRNA of miRNA primair transcript) verwerkt tot een kort, interfererend RNA (siRNA) door de RNase II-enzymen Dicer en Drosha. In de tweede stap worden siRNA's geladen in het effectorcomplex RNA-geïnduceerde silencing-complex (RISC). Het siRNA wordt afgewikkeld tijdens RISC-assemblage en het enkelstrengs RNA hybridiseert met mRNA-doelwit. Gen-uitschakeling is het resultaat van nucleolytische afbraak van het beoogde mRNA door het RNase H-enzym Argonaute (Slicer). Als de siRNA/mRNA-duplex mismatches bevat, wordt het mRNA niet gesplitst. Gene silencing is eerder een gevolg van translationele remming.


    Toegang tot document

    • APA
    • Auteur
    • BIBTEX
    • Harvard
    • Standaard
    • RIS
    • Vancouver

    Onderzoeksoutput : Bijdrage aan tijdschrift › Artikel › peer-review

    T1 - Functionele analyse van dicer-2 missense-mutaties in de siRNA-route van Drosophila

    N1 - Financieringsinformatie: Wij danken Qinghua Liu voor de gift van antilichamen. Dit werk werd ondersteund door de Korea Research Foundation Grant, gefinancierd door de Koreaanse regering (MOEHRD, KRF-2006-331-C00213) en een Korea University Grant.

    N2 - Het Drosophila RNase III-enzym Dicer-2 verwerkt voorlopers van dubbelstrengs RNA (dsRNA) tot kleine interfererende RNA's (siRNA's). Het interageert ook met het siRNA-product en het R2D2-eiwit om de assemblage van een RNA-geïnduceerd silencing-complex (RISC) dat RNA-interferentie bemiddelt, te vergemakkelijken. Hier hebben we zes onafhankelijke missense-mutaties in het dicer-2-gen gekarakteriseerd. Vier mutaties (P8S, L188F, R269W en P365L) in het DExH-helicasedomein verminderden de dsRNA-verwerkingsactiviteit. Twee mutaties waren gelokaliseerd binnen een RNase III-domein. P1496L veroorzaakte een verlies van dsRNA-verwerkingsactiviteit vergelijkbaar met een nul-dicer-2-mutatie. A1453T verminderde zowel de dsRNA-verwerking als de RISC-activiteit sterk en verlaagde de niveaus van Dicer-2- en R2D2-eiwitten, wat suggereert dat deze mutatie Dicer-2 destabiliseert. We hebben ook gevonden dat het carboxyl-terminale gebied van R2D2 essentieel is voor Dicer-2-binding. Deze resultaten geven verder inzicht in de structuur-functierelatie van Dicer, dat een cruciale rol speelt in de siRNA-route.

    AB - Het Drosophila RNase III-enzym Dicer-2 verwerkt voorlopers van dubbelstrengs RNA (dsRNA) tot kleine interfererende RNA's (siRNA's). Het interageert ook met het siRNA-product en R2D2-eiwit om de assemblage van een RNA-geïnduceerd silencing-complex (RISC) dat RNA-interferentie bemiddelt, te vergemakkelijken. Hier hebben we zes onafhankelijke missense-mutaties in het dicer-2-gen gekarakteriseerd. Vier mutaties (P8S, L188F, R269W en P365L) in het DExH-helicasedomein verminderden de dsRNA-verwerkingsactiviteit. Twee mutaties waren gelokaliseerd binnen een RNase III-domein. P1496L veroorzaakte een verlies van dsRNA-verwerkingsactiviteit vergelijkbaar met een nul-dicer-2-mutatie. A1453T verminderde zowel de dsRNA-verwerking als de RISC-activiteit sterk en verlaagde de niveaus van Dicer-2- en R2D2-eiwitten, wat suggereert dat deze mutatie Dicer-2 destabiliseert. We hebben ook gevonden dat het carboxyl-terminale gebied van R2D2 essentieel is voor Dicer-2-binding. Deze resultaten geven verder inzicht in de structuur-functierelatie van Dicer, die een cruciale rol speelt in de siRNA-route.


    DISCUSSIE

    Since the first discovery of the passenger-strand cleavage mechanism a decade ago, it has been widely recognized that slicer-dependent unwinding is a prerequisite for the assembly of highly complementary siRNAs into RISCs ( 10, 11, 13). Our collective results indicate that this assumption is typically valid, but not always, particularly for mammals and birds. Earlier biochemical studies relied mainly on target cleavage assays to understand the overall nature of RISC catalysis, which often tended to dismiss important differences during the early stages of RISC assembly. Through a careful re-examination of RISC assembly using a variety of several biochemical analyses, including duplex loading, slicer-dependent and -independent unwinding, and classical target cleavage assays, we established here that slicer-independent unwinding is a more prevalent mechanism for human RISC maturation than previously thought, not only for miRNA duplexes but also for highly complementary siRNAs as well. Aside from the main findings, there are several other findings that are important to discuss in detail.

    Small RNA sorting and the Mg 2+ level in slicer-dependent unwinding

    It has been previously recognized that only AGO2 can efficiently unwind siRNA duplexes via passenger-strand cleavage in humans ( 21), and this is reasonable in the sense that AGO2 is among the most advantageous human AGO proteins that can utilize its slicer-activity ( 42, 43) for RISC maturation (Figure 7E). Nonetheless, we showed that cleavage-deficient AGOs (1, 3, and 4) can also be programmed with siRNAs at the physiologically relevant temperature of humans, suggesting that slicer-independent unwinding is likely a common feature of human AGO proteins. These observations provided a natural explanation for why both miRNAs and siRNAs are found in all four human AGO proteins, irrespective of their sequences ( 44, 45). In contrast with weak small RNA sorting in humans, siRNA duplexes are specifically sorted into fly AGO2 ( 46, 47), which is essential for antiviral defense ( 48). The fly AGO2 should therefore acquire an additional strategy for siRNA maturation (i.e., passenger-strand cleavage), otherwise not efficient at their body temperature.

    We showed that a certain level of Mg 2+ is required for slicer-dependent unwinding to occur efficiently (Figure 2A). While the free cytosolic Mg 2+ level is less than 1 mM under normal conditions ( 49), the total cellular Mg 2+ concentration can vary from 5 to 20 mM ( 50, 51), as most Mg 2+ ions are bound to proteins and negatively charged molecules ( 50, 51). Therefore, it is difficult to estimate the exact amount of Mg 2+ bound to AGO2, although previous studies typically used 1.5–5 mM Mg 2+ for the in vitro slicing assays ( 10, 11, 42, 43, 52). In addition, cytosolic Mg 2+ levels can be altered by ATP, which is capable of chelating Mg 2+ ions ( 53). In other words, a transient decrease in ATP levels may give rise to a sudden increase in the Mg 2+ concentration ( 53). During two steps of RISC assembly, duplex loading requires ATP hydrolysis, and subsequent cleavage of the passenger-strand requires a relatively high level of Mg 2+ . It is tempting to speculate that bursts of metabolic activity during pre-RISC formation may induce a transient decrease in ATP that results in an increase in Mg 2+ levels that allows for more efficient slicer-activity, although it is technically difficult to demonstrate such rapid and transient changes.

    Slicer-independent unwinding in human RISCs

    Although chaperone machinery-mediated duplex loading is relatively well understood ( 3–6), it is still remain elusive how the loaded duplex unwinds to form the mature RISC. The helicase model was proposed at the beginning of the RNAi field — an ATP-dependent helicase separates the two strands of the duplex before they are loaded into the AGO protein ( 30), although such an ‘unwindase’ has yet to be identified ( 2). Another model assumes that duplexes are loaded into the AGO protein, which itself can dissociate the two strands ( 2, 18, 19, 22). Our findings, combined with those of previous studies, point to the latter model as a more plausible scenario. It has been extensively demonstrated that AGO proteins receive duplexes, rather than single strands, during RISC assembly ( 4, 5, 10–13, 19, 21). Once a duplex is deeply buried within the AGO protein, it is difficult to comprehend how the duplex is further transferred from AGO proteins to other regulatory factors in an accessible form. We showed that the unwinding process was significantly influenced by intrinsic factors, such as temperature and Mg 2+ , both of which were closely related to duplex stability. Our functional analyses also indicated that the AGO protein itself is a key factor that is needed for duplex unwinding. Recent structural studies have corroborated the idea that target dissociation is strongly coupled to a profound conformational change in the AGO proteins, which results in a widening of the N-PAZ channel, thereby leading to a disruption of the base-pairing in the 3′ half of the guide ( 54, 55). We postulate that high temperature may favor a conformational change ( 56, 57) in the AGO protein that accelerates RISC maturation.

    miRNAs are the most abundant and common endogenous substrates for human AGOs and they often have multiple mismatches and G-U wobble base pairs (or even bulges) that enable highly efficient unwinding (Figure 7E and Supplementary Figure S6E). In contrast, a highly complementary siRNA duplex requires either a certain temperature or AGO2-mediated cleavage of passenger-strands, which results in a drastic change in the thermodynamic profile of the duplex. siRNA unwinding by AGO2 depends upon two main factors with opposite effects: temperature and Mg 2+ (Figure 7E). At the physiological temperature of humans, siRNAs could also be incorporated into slicer-deficient AGOs (1, 3 and 4) to form the mature RISC (Figure 7E). In mammals, endogenous siRNAs can repress complementary mRNAs and transposons in mouse oocytes ( 58) and embryonic stem cells ( 59), although little is known about their biological role.

    A thermodynamic perspective of RISC maturation

    In light of our current findings, as well as those of previous reports, we envision that the overall process of RISC assembly has characteristics closely resembling those of a classical thermodynamic reaction (Supplementary Figure S7). Duplex loading requires the energy from ATP hydrolysis (i.e. Eeen) to trigger a conformational change in the AGO proteins that is mediated by the Hsc70–Hsp90 chaperone machinery ( 3–6). In this regards, the pre-RISC can be considered to be a transition state during RISC assembly (Supplementary Figure S7). The mature RISC is thought to be the most stable and energetically favorable state (ΔH < 0) (Supplementary Figure S7). This assumption is supported by the fact that AGO proteins mostly co-purify with endogenous guide RNAs and were stable enough to be structurally resolved by crystallography ( 33, 34, 54, 60).

    Because duplex unwinding is generally accompanied by an increase in entropy ( 61, 62) (ΔS > 0), the spontaneity (ΔG = ΔHtΔS) of RISC maturation is then largely influenced by the temperature that contributes to the entropy of the system. Although this may seem to be plausible, we cannot warrant further speculation with our present biochemical data alone. Future studies combining structural analyses with biophysical techniques are necessary to reveal the structural basis for duplex unwinding, as well as its thermodynamics.

    Homeotherms, such as mammals and birds, have a specific physiological adaptation that enables them to regulate their body temperature from 36 to 42°C ( 63). In contrast, poikilotherms, including worms, flies, plants, and fish, lack the means to generate heat ( 64). Therefore, the body temperatures of these animals tend to conform to their external environment, and temperature fluctuations may affect numerous aspects of their physiology, including enzyme function, muscle activity, and energy metabolism ( 64). Our results suggested that the last step of small RNA biogenesis could be largely influenced by such temperature changes, which may provide a means to fine-tune the expression of small RNAs in various living organisms.