Informatie

6.4: Intermediaire filamenten - biologie


Intermediaire filamenten zijn gemaakt van verschillende strengen vezelachtige eiwitten die samen zijn gewikkeld (Figuur 1). Deze elementen van het cytoskelet danken hun naam aan het feit dat hun diameter, 8 tot 10 nm, tussen die van microfilamenten en microtubuli ligt.

Intermediaire filamenten spelen geen rol bij celbewegingen. Hun functie is puur structureel. Ze dragen spanning, waardoor de vorm van de cel behouden blijft, en verankeren de kern en andere organellen op hun plaats. Figuur 2 laat zien hoe intermediaire filamenten een ondersteunende steiger in de cel creëren.

De intermediaire filamenten zijn de meest diverse groep cytoskeletelementen. In de intermediaire filamenten worden verschillende soorten vezelachtige eiwitten gevonden. U bent waarschijnlijk het meest bekend met keratine, het vezelachtige eiwit dat uw haar, nagels en de opperhuid van de huid versterkt.


Meerdere mRNA's coderen voor periferine, een neuronaal intermediair filamenteiwit.

Drie cDNA-klonen van 1,6 (3u), 1,2 (5g) en 0,6 (5b) kbp, specifiek voor periferine, een neuronaal intermediair filamenteiwit (IFP), zijn geïsoleerd uit een lambda gt11-bibliotheek van muizenneuroblastoomcellen door middel van immunoscreening met behulp van periferine-antiserum. Antilichamen geëlueerd uit de fusie-eiwitten geproduceerd door klonen 3u en 5g herkennen de periferinevlekken op immunoblots. Waar ze elkaar overlappen, hebben de drie cDNA's identieke sequenties. cDNA 5g vertoont de nauwste homologie met type III IFP-cDNA's. cDNA 3u is identiek aan het overeenkomstige gebied van cDNA 5g, behalve de insertie van een fragment van 96 bp op een positie die overeenkomt met de verbinding van exons 4 en 5 in type III IFP-cDNA's. cDNA 5b is ook identiek aan het overeenkomstige gebied van cDNA 5g, behalve de deletie van een 62 bp-fragment op de kruising van exons 8 en 9 in type III IFP-cDNA's. S1-mapping-experimenten uitgevoerd met probes die het 3'-uiteinde van de twee onverwachte gebieden bedekken, tonen aan dat drie verschillende mRNA's overeenkomen met de drie cDNA's. Bovendien worden drie periferineproducten, twee minder belangrijke 61 en 56 kd-producten naast de belangrijkste 58 kd-periferine, waargenomen wanneer poly(A)+-RNA in vitro wordt getranslateerd, waarbij het 61 kd-periferine wordt getranslateerd uit het 3u-geselecteerde RNA. De drie RNA's zijn afkomstig van alternatieve splitsing van een uniek periferine-gen, waardoor polymorfisme van periferine wordt gegenereerd.


Toegang tot document

  • APA
  • Auteur
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standaard
  • RIS
  • Vancouver

In: Trends in celbiologie, Vol. 6, nr. 4, 01.01.1996, p. 123-126.

Onderzoeksoutput : Bijdrage aan tijdschrift › Commentaar/debat › peer-review

T1 - Het kralenfilament van de ooglens

T2 - Een onverwachte sleutel tot tussenliggende filamentstructuur en functie

N2 - In 1959 werd in de lens van het oog een ongebruikelijk filamenteus polymeer beschreven, nu het kralenfilament genoemd. De samenstellende eiwitten, assemblage-eigenschappen en functies van het kralenfilament waren ongrijpbaar. De recente publicatie van de sequenties voor twee belangrijke lensfilamenteiwitten (CP49 en filensine) en de reconstitutie in vitro van structuren die sterk lijken op gerolde filamenten, suggereert dat het gerolde filament structureel verwant is aan intermediaire filamenten (Ifs). De associatie van de lenticulaire chaperonnes, de α-kristallines, met het filament draagt ​​bij aan de karakteristieke kralenmorfologie en geeft belangrijke aanwijzingen voor de functie van dit ongebruikelijke filament in de lens. Deze recente resultaten hebben verschillende implicaties voor IF-functie en assemblage.

AB - In 1959 werd in de lens van het oog een ongebruikelijk filamenteus polymeer beschreven, nu het kralenfilament genoemd. De samenstellende eiwitten, assemblage-eigenschappen en functies van het kralenfilament waren ongrijpbaar. De recente publicatie van de sequenties voor twee belangrijke lensfilamenteiwitten (CP49 en filensine) en de reconstitutie in vitro van structuren die sterk lijken op gerolde filamenten, suggereert dat het gerolde filament structureel verwant is aan intermediaire filamenten (Ifs). De associatie van de lenticulaire chaperonnes, de α-kristallines, met het filament draagt ​​bij aan de karakteristieke kralenmorfologie en geeft belangrijke aanwijzingen voor de functie van dit ongebruikelijke filament in de lens. Deze recente resultaten hebben verschillende implicaties voor IF-functie en assemblage.


Celbiologie van glioblastoma multiforme: van basiswetenschap tot diagnose en behandeling

Voor het eerst beschreven in de jaren 1800, is glioblastoma multiforme (GBM), een klasse IV neoplasma met astrocytische differentiatie, volgens de herziene classificatie van de 2016 Wereldgezondheidsorganisatie van tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) de meest voorkomende kwaadaardige tumor van het CZS. GBM heeft een extreem brede reeks veranderingen, zowel genetische als epigenetische, die een groot aantal mutatiesubgroepen opleveren, waarvan sommige een gevestigde rol spelen in de onafhankelijke overleving van de patiënt en de respons op de behandeling. Al deze componenten vertegenwoordigen niet alleen een gesloten cyclus, maar zijn ook relevant voor het biologische gedrag van de tumor en de weerstand tegen behandeling, aangezien zij het pathobiologische gedrag en het klinische verloop vormen. De aanwezigheid van verschillende uitlokkende mutaties op de achtergrond van de aanwezigheid van sleutelmutaties in de GBM-stamcellen (GBMsc) scheidt GBM verder als primair de novo voortkomend uit neurale stamcelprecursoren die zich ontwikkelen tot GBMsc en secundair, door middel van geaggregeerde mutaties. Een deel van de verandering in cellulaire biologie in GBM kan worden waargenomen via een lichtmicroscoop omdat ze de cellulaire en weefselkenmerken van de aandoening vormen. Veranderingen in genetische informatie, resulterend in wijziging, onderdrukking en expressie van genen in vergelijking met hun fysiologische niveaus in gezonde astrocyten, leiden niet alleen tot cellulaire, maar ook tot extracellulaire matrixreorganisatie. Deze veranderingen resulteren in een veelvormig aantal micromorfologische en puur immunologische/biochemische vormen. Daarom is in de eenentwintigste eeuw de term multiforme, voorheen verstoten uit nomenclaturen, aan populariteit gewonnen tegen de achtergrond van genotypische diversiteit in deze neoplastische inzending.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Toegang tot document

  • APA
  • Auteur
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standaard
  • RIS
  • Vancouver

Onderzoeksoutput : Bijdrage aan tijdschrift › Artikel › peer-review

T1 - Relatie tussen intermediaire filamenten en microfilamenten in gekweekte fibroblasten

T2 - Bewijs voor gemeenschappelijke foci tijdens celspreiding

N2 - Verspreidende en volledig uitgespreide kippenembryofibroblasten (CEF) werden onderzocht met dubbel-label fluorescentiemicroscopie met behulp van de actine-specifieke probe rhodamine-phalloidin en een antilichaam gericht tegen CEF intermediaire filamenten (IF). Tijdens midspreading werd een opvallende relatie waarneembaar: statistische analyse toonde aan dat ongeveer de helft van de celpopulatie een of meer fase-dichte, falloïdine-bindende knobbeltjes vertoonde die leken te fungeren als foci waarvan IF afweek. Toeval tussen actine-bevattende structuren en IF was niet beperkt tot deze centra. IF kon ook vaak worden gezien in nauwe parallelle arrays met stressvezels. Ultrastructurele analyse bevestigde de aanwezigheid van niet-membraangebonden uitsteeksels langs de lengte van spanningsvezels waarvan 10 nm IF divergeerde. Deze structuren varieerden in grootte en vorm en vertoonden een dicht, fijn fibrillair uiterlijk. IF en microfilamenten (MF) werden onderscheiden door grootte en door decoratie van MF met myosine-subfragment‐1. Andere IF‐MF-interacties werden waargenomen in cellen van alle stadia: IF werd waargenomen door stressvezels te lussen, meestal aan de celranden. In met colchicine behandelde cellen werd IF herverdeeld in kabels die vaak parallel liepen en leken te versmelten met stressvezels. Cytochalasine D-behandeld CEF vertoonde losse aggregaten van actine-bevattend materiaal dat geassocieerd leek te zijn met IF. Deze resultaten suggereren de mogelijkheid van een interactie tussen actine-bevattende structuren en IF, met name tijdens celverspreiding in gekweekte fibroblasten.

AB - Verspreidende en volledig uitgespreide kippenembryofibroblasten (CEF) werden onderzocht met dubbel-label fluorescentiemicroscopie met behulp van de actine-specifieke probe rhodamine-phalloidin en een antilichaam gericht tegen CEF intermediaire filamenten (IF). Tijdens midspreading werd een opvallende relatie waarneembaar: statistische analyse toonde aan dat ongeveer de helft van de celpopulatie een of meer fase-dichte, falloïdine-bindende knobbeltjes vertoonde die leken te fungeren als foci waarvan IF afweek. Toeval tussen actine-bevattende structuren en IF was niet beperkt tot deze centra. IF kon ook vaak worden gezien in nauwe parallelle arrays met stressvezels. Ultrastructurele analyse bevestigde de aanwezigheid van niet-membraangebonden uitsteeksels langs de lengte van spanningsvezels waarvan 10 nm IF divergeerde. Deze structuren varieerden in grootte en vorm en vertoonden een dicht, fijn fibrillair uiterlijk. IF en microfilamenten (MF) werden onderscheiden door grootte en door decoratie van MF met myosine-subfragment‐1. Andere IF‐MF-interacties werden waargenomen in cellen van alle stadia: IF werd waargenomen door stressvezels te lussen, meestal aan de celranden. In met colchicine behandelde cellen werd IF herverdeeld in kabels die vaak parallel liepen en leken te versmelten met stressvezels. Cytochalasine D-behandeld CEF vertoonde losse aggregaten van actine-bevattend materiaal dat geassocieerd leek te zijn met IF. Deze resultaten suggereren de mogelijkheid van een interactie tussen actine-bevattende structuren en IF, met name tijdens celverspreiding in gekweekte fibroblasten.


Invoering

Bij mensen heeft de familie van genen die coderen voor de structurele eiwitten van de cytoplasmatische intermediaire filamenten (IF's) meer dan 60 leden en is een van de 100 grootste multigenfamilies (Hesse et al., 2001). Sequentie-identiteitsniveaus van IF-eiwitten, de organisatie van de overeenkomstige genen en hun expressiepatronen definiëren verschillende IF-subtypen (Fuchs en Weber, 1994 Herrmann en Aebi, 2000 Coulombe et al., 2001). Type I en type II keratines zijn de grootste subfamilies. Ze geven aanleiding tot de epitheliale keratinefilamenten die zijn gebaseerd op obligate heteromere dubbelstrengs opgerolde spiralen gevormd door een type I en een type II keratine. Type III omvat vier eiwitten die homopolymere IF's kunnen vormen. De genen voor de zeven type IV-eiwitten vertonen een heel ander intronpatroon dan type I-III-genen. Ze hebben slechts twee tot drie introns die gerelateerd zijn aan het centrale staafdomein van de eiwitten en deze introns komen voor op posities die niet worden gezien in type I-III-genen. De nucleaire lamines vormen het type V, terwijl de ooglenseiwitten filensin en phakinine een aparte groep vormen (BF, voor gerolde filamenten). Een overzicht van de conceptsequentie van het menselijk genoom (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001) laat zien dat genen die coderen voor niet-keratine IF-eiwitten niet geclusterd zijn (Hesse et al., 2001). Daarentegen vormen alle type I keratinegenen behalve K18 een dicht cluster op chromosoom 17q21, terwijl alle type II keratinegenen en K18 een vergelijkbaar cluster vormen op chromosoom 12q13 (Waseem et al., 1990).

Puntmutaties in een nog steeds groeiend aantal IF-genen zijn verbonden met menselijke ziekten. Mutaties in ten minste 14 epidermale keratinegenen veroorzaken fragiliteitssyndromen van de huid (Irvine en McLean, 1999) en soortgelijke mutaties in het type III desmine-gen verbinden met myopathieën van hart en skeletspieren (Goldfarb et al., 1998), terwijl mutaties in het GFAP-gen wordt gevonden bij de ziekte van Alexander (Brenner et al., 2001 Li et al., 2002). Eindelijk, in Caenorhabditis elegans, zijn ten minste vier van de 11 IF-genen essentieel voor de ontwikkeling van nematoden (Karabinos et al., 2001). Type I-III-genen zijn niet beperkt tot gewervelde dieren, maar zijn ook gedocumenteerd in de vroege chordaten, die echter type IV-genen lijken te missen (besproken in Karabinos et al., 2002 Wang et al., 2002).

Sommige genen voor type I-IV cytoplasmatische IF-eiwitten van vissen zijn eerder gedocumenteerd door cDNA-klonering, met name in de goudvis en de regenboogforel (Markl en Schechter, 1998 Schaffeld et al., 2002a, b), en nucleaire lamines zijn geanalyseerd in de goudvis (Yamaguchi et al., 2001) en de zebravis (Hofemeister et al., 2002). Echter, alleen het opkomende genoom van de teleostvissen Fugu rubripes (Aparicio et al., 2002) maakt een gedetailleerde vergelijking mogelijk van de organisatie en complexiteit van IF-genen bij de mens en een lagere gewervelde. Hier rapporteren we over enkele onverwachte verschillen tussen IF-genen in F. rubripes en zoogdieren.


De mechanische eigenschappen van gehydrateerde intermediaire filamenten: inzichten uit slijmdraden van slijmvliezen

Intermediaire filamenten (IF's) verlenen cellen mechanische integriteit, maar IF-mechanica wordt slecht begrepen. Er wordt aangenomen dat IF's in cellen zo stijf zijn als harde alfa-keratine, F-actine en microtubuli, maar de hoge buigflexibiliteit van IF's en de lage stijfheid van zachte alfa-keratines suggereren dat gehydrateerde IF's vrij zacht kunnen zijn. Om deze hypothese te testen, hebben we de trekmechanica van de keratine-achtige draden van hagfish-slijm gemeten, die een ideaal model zijn voor het verkennen van de mechanica van IF-bundels en IF's omdat ze bestaan ​​uit dicht opeengepakte en uitgelijnde IF's. Trektests suggereren dat gehydrateerde IF-bundels een lage initiële stijfheid (E(i) = 6,4 MPa) en opmerkelijke elasticiteit hebben (tot spanningen van 0,34), die we toeschrijven aan terminale domeinen van zacht elastomeer IF-eiwit in serie met stijvere coiled coils. De hoge treksterkte (180 MPa) en taaiheid (130 MJ/m (3)) van IF-bundels ondersteunen het idee dat IF's mechanische integriteit verlenen aan cellen. Hun elasticiteit op lange afstand suggereert dat IF's cellen ook kunnen laten herstellen van grote vervormingen. Röntgendiffractie en congo-roodkleuring geven aan dat vervorming na de opbrengst leidt tot een onomkeerbare alfa-->beta conformationele overgang in IF's, wat leidt tot plastische vervorming, en door cellen kan worden gebruikt als een mechanosensorische aanwijzing.

Figuren

( EEN ) SEM van een volwassen klierdraadcel (zonder zijn plasma ...

Micromechanische testapparatuur gebruikt om...

Micromechanische testapparatuur voor het meten van de trekeigenschappen van geïsoleerde lengtes van...

Stress-rekcurves voor de acht ...

Spanning-rekcurves voor de acht slijmerige draden die worden gebruikt om de initiële treksterkte te meten ...

Ultiem trekgedrag van slijmprikken...

Ultiem trekgedrag van slijmerige draden in zeewater. ( EEN ) Typische stress-stam...

Herstelgedrag van slijmerige draden...

Herstelgedrag van slijmprikken in zeewater. ( EEN ) Typische laadcyclus...

CR-kleuring van slijmerige draden...

CR-kleuring van slijmerige draden na uitpersen in zeewater. ( EEN ) Ongetraind…

Röntgendiffractiepatronen voor slijmprikken...

Röntgendiffractiepatronen voor hagfish-draadbundels gespannen in zeewater. ( EEN )…

Het effect van subfilament glijden...

Het effect van het glijden van subfilamenten op de persistentielengte van IF's, uitgaande van een ...

Voorgesteld mechanisch gedrag van IF...

Voorgesteld mechanisch gedrag van IF-dimeren in mechanisch gebied I. Aannames van de...

Voorgesteld mechanisch gedrag van IF...

Voorgesteld mechanisch gedrag van IF-dimeren in regio's I-III. In regio I, vervorming...


De moleculaire architectuur voor de intermediaire filamenten van Hard α-Keratine op basis van de superroostergegevens verkregen uit een onderzoek van zoogdieren met behulp van synchrotron-vezeldiffractie

Hoge- en lagehoekröntgendiffractiestudies van harde α-keratine zijn bestudeerd en er zijn de afgelopen 70 jaar verschillende modellen voorgesteld. De meeste van deze onderzoeken zijn beperkt tot een of twee vormen van alfa-keratine. Dit onderzoek naar synchrotronvezeldiffractie met hoge en lage hoek breidt het onderzoek uit tot alle beschikbare gegevens voor alle bekende vormen van harde α-keratine inclusief haren, vingernagels, hoeven, hoorn en stekels van zoogdieren, buideldieren en een monotreme, en het bevestigt dat het voorgestelde model universeel aanvaardbaar is voor alle zoogdieren. Een complete Bragg-analyse van de meridionale diffractiepatronen, inclusief meervoudige belichtingen om zwakke reflecties te verifiëren, verifieerde het bestaan ​​van een superrooster bestaande uit twee oneindige roosters en drie eindige roosters. Een analyse van de equatoriale patronen stelt de stralen vast van de oligomere niveaus van dimeren, tetrameren en intermediaire filamenten (IF's) samen met de hart-op-hart afstand voor de IF's, waardoor de voorgestelde helices binnen de moleculaire architectuur van helices voor harde α-keratine. De resultaten bevestigen dat de door Feughelman en James voorgestelde structuur voldoet aan de criteria voor een valide α-keratine structuur.

1. Inleiding

Ondanks 70 jaar onderzoek naar de interne en externe organisatie van de intermediaire filamenten (IF's) van α-keratine, bestaat er nog steeds een grote ongelijkheid in de meningen die in een groot aantal tijdschriften zijn gepubliceerd over de architectuur van deze IF's. Monsters voor vezeldiffractie-experimenten worden normaal zo gemonteerd dat de röntgenstraal loodrecht staat op de groeirichting van het monster. Alle lineaire roosters in het monster, uitgelijnd in deze richting of in staat om erop te projecteren, zullen bijdragen aan het verkregen meridionale diffractiepatroon [1], op voorwaarde dat de roosterafstand binnen de resolutie van de apparatuur valt. De roosterperiodiciteit

voor elk rooster kan worden bepaald door de wet van Bragg.

In 1983 en in latere artikelen [2-4] suggereerden Fraser en MacRae dat zowel een eindig rooster van 19,79 nm als een ontwricht oneindig rooster van 47,00 nm kon worden bepaald met behulp van röntgendiffractie. Lawrence [5] meldde echter dat dit niet voldeed aan alle bekende gegevens. Verdere roosters 19,8 nm, 27,2 nm, 12,2 nm en 7,8 nm werden toegevoegd door Wilk et al. [6] en James et al. [7]. Er bleven echter nog 4 vrij grote niet-verklaarde reflecties over waarvan later werd aangetoond dat ze in intensiteit toenemen voor haar van insulineafhankelijke diabetische (IDDM) mensen en IDDM-bavianen, James et al. [8]. Als resultaat werd de aanwezigheid van nog een oneindig rooster van 62,6 nm bevestigd, waardoor de totale zichtbare roosters op twee oneindige roosters en 3 eindige roosters kwamen met nog twee mogelijke roosters (7,8 nm en 15,6 nm) onder water. Een mogelijke moleculaire assemblage van al deze roosters voor mensenhaar werd voorgesteld door Feughelman en James [9] voor mierenegelveer, Lincolnwol en paardenhaar. Dit werd uitgebreid tot mensenhaar door James en Amemiya [10] en voor pathologische haarspecimens [8, 11]. Wiskundige bevestiging gecombineerd met resultaten van mechanische eigenschappen bevestigden deze voorgestelde structuur verder [12].

Dit helices binnen helices-model wordt getoond in figuur 1 als het eindresultaat van twee heterokeratine-helices die samen kronkelen om een ​​strak dimeer te vormen (figuur 1(a)), waarvan de straal tweemaal de straal is van die van de enkele helices. Twee van deze dimeren winden vervolgens samen om een ​​tetrameer te vormen, met behulp van een Crick "knob in hole" -pakking, [13], (Figuur 1 (b)). Acht tetrameren winden zich vervolgens in een verspringende reeks rond het oppervlak van de tussenliggende filamenten. De herhalingsafstand van 62,6 nm is de projectie in de richting van de vezel van de volledige tetrameren, dat is de projectie van de som van de lengtes van de spiraalvormige en niet-helische secties van de tetrameer, bijvoorbeeld AC, terwijl deze door 120 kronkelt. °. Figuur 1 (c) toont de laatste set roosters.


(een)
(B)
(C)
(NS)
(een)
(B)
(C)
(NS) (a) Deze figuur toont het samensmelten van twee heterokeratinefibrillen om een ​​dimeer te vormen. (b) Deze afbeelding toont de samenwikkeling van twee dimeren in een Crick "knob in hole" -pakking. (c) Deze figuur toont de roosters die superponeren op het diffractiepatroon, wat resulteert in het superrooster dat het resultaat is van de superpositie van de zeven roosters die hieronder worden besproken. Het 47 nm-rooster wordt geassocieerd met de afstand tussen het begin van de spiraalvormige sectie van een tetrameer en het begin van de spiraalvormige sectie van de op één na volgende tetrameer, bijvoorbeeld AB, BD, waardoor een duidelijk oneindig en continu rooster in de richting van het haar. De eindige roosters (19,8 nm, 272 nm en 12,4 nm), opgenomen door Wilk et al. [6], James et al. [7], Feughelman et al. [12] en James [11] zijn deelverzamelingen van de projecties van het 47 nm-rooster, zijnde de projectie van de 200 nm-sectie van de spiraalvormige sectie [15] plus en minus de niet-helische sectie [8, 11, 12]. Alle reflecties van de twee andere roosters 7,8 nm en 15,6 nm die de C- en N-terminale niet-opgerolde uiteinden en hun som [15] vertegenwoordigen, zijn begraven onder reflecties van de andere roosters. De herhalingsafstand van 62,6 nm is de projectie in de richting van de vezel van de volledige tetrameren, dat wil zeggen, de projectie van de som van de lengtes van de spiraalvormige en niet-helische secties van de tetrameer, bijvoorbeeld AC, terwijl het door de 120 °. Gezien een lijn die bij A binnenkomt en bij C vertrekt, is de aanwezigheid van een oneindig rooster met een tussenruimte van 62,6 nm niet zo duidelijk. Zoals de geometrische analyse laat zien [10] is het wiskundig mogelijk voor één en slechts één voorwaarde, namelijk dat de afstand tussen de IF's driemaal de straal van de IF is. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2 waar A, B, C, D en E opeenvolgende punten langs het rooster zijn. Ze zijn gescheiden door

Gezien een lijn die binnenkomt bij A en vertrekt bij C, is de aanwezigheid van een oneindig rooster met een tussenruimte van 62,6 nm niet zo duidelijk, vooral niet met de bekende hexagonale pakking. Zoals de geometrische analyse laat zien [10] is dit wiskundig mogelijk voor één en slechts één voorwaarde, namelijk dat de afstand tussen de IF's driemaal de straal van de IF is. Dit wordt geïllustreerd in figuur 1 (d) waar A, B, C, D en E opeenvolgende punten langs het rooster zijn. Ze zijn gescheiden door

63,1 nm die op de richting van het haar projecteert als 62,6 nm. Het inzetstuk is een verticaal naar beneden aanzicht en toont een opeenvolging van roosterpunten van dit oneindige rooster die door de zeshoekige reeks gaan terwijl het langs het haar voortgaat.

De volgende discussie is gebaseerd op de hypothese dat deze architecturale opstelling niet alleen geldig is voor deze monsters, maar ook universeel geldt voor een breed spectrum van harde alfa-keratineweefsels.

2. materialen en methoden

2.1. Monsters

Alleenstaande mens, paard, koe, geit, hond, kat, olifant (Elephas maximus), baviaan (Papio hamadryas), en orang-oetan (Pongo pygmaeus abelii) haren werden van dichtbij de huid afgesneden en geanalyseerd zonder enige speciale chemische voorbereiding, behalve een korte reiniging met gedestilleerd water voorafgaand aan montage in cellen die speciaal zijn ontworpen om de haren strak te houden zonder uit te rekken. Een leeftijdsreeks van haren van koeien werd opgenomen, samen met haren die uit de staart en ook uit het oor werden gehaald. Bundels van 20 of meer pelsvezels gesneden uit de buurt van de huid van een rotswallaby (Petrogale lateralis), een noordelijke koala (Petrogale lateralis), een westelijke grijze kangoeroe (Macropus fuliginosus), en een rode kangoeroe (Macropus rufus) samen met bundels alpacawol werden zorgvuldig in parallelle rijen uitgelijnd, aan de uiteinden aan elkaar gebonden en in de speciaal ontworpen cellen gemonteerd, zodat elk haar in de bundel strak en niet uitgerekt was. Kleine delen van neushoornhoorn (Neushoorn unicornis), paardenhoef en vingernagels van ongeveer 3 mm bij 0,9 mm werden gesneden in de richting evenwijdig aan de groei van de α-helices. Deze secties werden ingebracht in en bevestigd aan de uiteinden van glazen capillairen met een inwendige diameter van ongeveer 1 mm, zodat het te onderzoeken monster uit de uiteinden stak. Stekelvarken stekels (Stekelvarken hystrix indica) en mierenegelstekels (Tachyglossus aculeatus) werden ook in de uiteinden van glazen capillairen gemonteerd, zodat hun uiteinden uitsteken voor bestraling met röntgenstralen. Deze capillairen werden tijdens het verzamelen van gegevens op hun plaats gehouden in speciaal gegroefde platen. De zeer uniforme wol die voor analyse werd gekozen, was afkomstig van Lincoln-schapen die waren opgesloten en gevoerd onder gecontroleerde omstandigheden voor uniformiteit van groei en aangeduid als SW 296 [14]. Aangezien er weinig of geen statistische variatie was over de lengte van deze wol, konden voor dit onderzoek enkele vezels worden gebruikt.

Alle monsters werden verzameld in overeenstemming met het ethische beleid van de respectieve dierentuinen en de experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het ethische en veiligheidsbeleid van de respectieve synchrotrons en onderzoekslaboratoria. Het transport en de export van en experimenten met alle Cites en inheemse Australische monsters werden goedgekeurd door het Australische ministerie van Milieu en Waterbronnen. De invoer van monsters naar de Verenigde Staten werd goedgekeurd door de TSA van de VS.

2.2. Röntgenverstrooiing instellen en gegevens verzamelen

Tweedimensionale röntgendiffractiepatronen werden verkregen met behulp van de synchrotron-röntgenbron bij de Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory) op zowel de BioCAT- als ChemMatCARS-bundellijnen. Op de BioCAT-bundellijn was de röntgenenergie 120 keV, de afstand van het monster tot de MAR165-detector gebaseerd op de tweede-orde diffractiering in het verstrooiingspatroon van Silver Behenate

was 1048,5 mm. Fuji Bas III-beeldvormingsplaten, loodrecht op de invallende bundel en voor de detector, werden ook gebruikt op de BioCAT-bundellijn. De pixelgrootte van de opslagfolies was

mm. Op elk van deze bundellijnen werden drie of meer monsters van elke soort onderzocht. De straalgrootte was 100 μm in horizontale richting en 50 μm in de verticale richting, zodat alle monsters werden gemonteerd met de groeirichting van de α-keratine in horizontale richting en het monster gecentreerd in de straal. Monsters werden over hun lengte heen en weer bewogen omdat het belangrijk is om de optimale positie langs het monster te lokaliseren en vervolgens op en neer bewogen om ervoor te zorgen dat de straal zich centraal in het monster bevindt. Dit was vooral belangrijk voor de hoorn, hoeven, nagels en stekels en voor de vacht van het buideldier, waar enkele haarpatronen te zwak waren om betekenisvol te zijn en dus bundels parallelle vezels moesten worden gebruikt. Typische voorbeelden van het diffractiepatroon zoals verkregen op BioCAT voor de hoorns en stekels worden gegeven in figuur 2(a) en voor de buideldierbundels in figuur 2(b).


(een)
(B)
(een)
(B) (a) Typische diffractiepatronen verkregen uit kleine secties van neushoornhoorn en uit de toppen van stekelvarken- en echidna-stekels met behulp van een straal centraal op het monster in de BioCAT-faciliteit. (b) Typische diffractiepatronen verkregen bij de BioCAT-faciliteit voor bundels parallelle pelsvezels van Australische buideldieren. Deze monsters bleken slecht diffracterend te zijn en er moesten dertig of meer parallelle strengen worden bestraald om betrouwbare resultaten te geven.

Vanwege de beperking van de grootte van de output die wordt opgelegd door de afmetingen van de detectoren of beeldplaten en de geëvacueerde vluchtbuis, waarbij de laatste essentieel is om de absorptie van de zwakke afgebogen bundel te verwijderen, werd de zeer sterke meridionale reflectie van 5,15 gemist. Om een ​​uitgebreid beeld mogelijk te maken, werd de detector op ChemMatCARS, nadat diffractiepatronen vergelijkbaar met die hierboven waren verkregen, uit het midden verplaatst en werden de bredere diffractiepatronen opnieuw in deze positie genomen. Enkele voorbeelden hiervan voor haar- en snorharenachtergrond verwijderd door SAX15ID worden getoond in figuur 3.


Typische excentrische diffractiepatronen van 5 zoogdieren genomen op ChemMatCARS met meridionale reflecties die verder reiken dan de 5,15 nm-reflectie, de 91e orde van het 46,7 nm-rooster. Deze patronen weerspiegelen de rijkdom aan diffractie van dergelijke keratinemonsters.

Het gladstrijken van de gegevens en het verwijderen van de achtergrond werden bereikt met behulp van combinaties van een aantal verschillende technieken, FIT2D en SAX15ID, MATLAB en ProcessFITS, en IRAF en SAO. De eerste en derde hiervan gebruikten een achtergrondverwijderingsproces dat in mijn laboratorium was ontworpen als de meest efficiënte methode voor de analyse van keratine, gerapporteerd door Wilk et al. [6]. In deze procedure worden de gegevens gladgestreken zoals in figuur 6.

Achtergrondverwijdering met behulp van de combinatie van MATLAB en Proces werd uitgevoerd door 20 of meer punten langs de curve te nemen en de beste polynoompassing voor deze punten te vinden. De resultaten waren voor alle geanalyseerde patronen zeer vergelijkbaar met die verkregen uit de IRAF- en SAO-pakketten. Intensiteitsgrafieken van stroken van 10 mm aan weerszijden van de verticale en horizontale assen werden ook verkregen met behulp van IRAF en de posities en intensiteiten van alle pieken van elk van deze grafieken werden gelezen en geregistreerd.

3. Resultaten

3.1. Meridiaanpatroon

De meridionale patroon voor elk vezeldiffractiepatroon is de superpositie van de diffractiepatronen van alle roosters eindig en oneindig in de richting langs de vezel die aanleiding geeft tot een superrooster wanneer er meer dan één rooster is. In elk superrooster zijn de intensiteiten van de verschillende punten langs het rooster de optellingen van de golfbijdragen van alle roosters of de resultante van zowel de fasen als de intensiteiten. De resulterende intensiteiten kunnen worden teruggebracht tot zeer lage waarden, vooral als de verstrooiingsfactoren vergelijkbaar zijn of de faseverschillen π radialen uit fase. De intensiteiten zijn pas groot als alle maxima op dat punt samenvallen. Het meridionale patroon van hard α-keratine heeft zeer weinig sterke reflecties. De sterkste van alle lage hoekpieken is die bij 67 . Deze piek is de resultante van het maximum van de 7e orde van het rooster van 46,7 nm, het maximum van de derde orde van het rooster van 19,67 nm, de maximum van de tweede orde van het rooster van 12,4 nm en het maximum van de vierde orde van de 27,2 nm met het maximum van de negende orde van het 62,6 nm-rooster nabij de basis van de piek die zich het dichtst bij het patrooncentrum bevindt, waardoor een uitstulping op de piek ontstaat. De reflectie van 5,15 met hoge intensiteit is ook een combinatie van de maxima van al deze roosters, inclusief de 91e orde van het 46,7 nm-rooster, het 39e-orde maximum van het 19,67 nm-rooster, de 26e orde van het 12,4 nm-rooster en het 52e -orde maximum van de 27,2 nm met de 121e orde maximum van de 62,6 nm rooster nabij de basis van de piek op de onderste hoekrand. De 14e, 18e, 22e en 47e roosterpunten van het 62,6 nm rooster zijn echter uniek en vrij sterk in alle patronen.

De meeste van de resterende pieken zijn vrij zwak, maar er zijn voldoende unieke orden van gemiddelde intensiteit van elk rooster om snel de aanwezigheid van het rooster te verifiëren. Bij het zoeken naar de zwakke orden die aanwezig waren, was het essentieel om onderscheid te maken tussen echte pieken en ruis. Hiertoe werden de patronen voor hetzelfde monster in dezelfde positie genomen gedurende 10 seconden, 20 seconden en 30 seconden en uitgezet in dezelfde grafiek. Als de reflectie een echt roosterpunt is, moet de intensiteit toenemen met een langere belichtingstijd. Als dat niet het geval is, moet het worden afgedaan als lawaai. Met behulp van dit criterium voor de selectie van echte roosterpunten, werd de positie van alle pieken voor alle monsters gelokaliseerd. Het totale aantal bestellingen dat aanwezig is voor het 46,7 nm-rooster en het 62,6 nm-rooster is weergegeven in tabel 1.

Sommige individuele extra reflecties zijn zichtbaar in verschillende groepen dieren zoals buideldieren en snorharen, maar deze worden bovenop de keratinestructuur geplaatst en kunnen betrekking hebben op monsters of ander gebruik van snorharen. Deze worden hier niet besproken.

3.2. Equatoriaal patroon

Een plot van de intensiteitsverdeling in de equatoriaal richting na verwijdering van de achtergrond, met behulp van een snede van 1 mm breed aan weerszijden van de as voor een catwhisker wordt gegeven in figuur 4(a) met het middelste detail gegeven in figuur 4(b) en het detail van de brede 9,5 piek in Figuur 4 (c). These postbackground correction X-ray equatorial profiles (perpendicular to the length of the hair) were very well resolved for all samples including the area of the broad 9.5 Å peak. As can be seen from Figures 4(a) and 4(c) this broad peak is the resultant of three diffuse peaks and one sharp arc. This sharp arc is present in all samples and has been regarded by all investigators as the result of interference between the tightly coiled α-keratin polypeptide chains verifying the centre to centre distance between the α-keratin helices is approximately equal to the diameters of the individual helices [6, 17–19].


(een)
(B)
(C)
(een)
(B)
(C) These three patterns are background-corrected equatorial plots, taken over 1 mm on either side of the meridional axis. (a) shows the complete plot showing sets of “spots” and arcs. There were usually 9 spots, the one nearest the centre illustrated in (b) giving the centre to centre distance between the IFs. The other “spots” are the various orders of the Bessel functions from which the IF and tetramer (protofibril) radii can be calculated. In most cases there were six orders available to determine the IF radii and 2 for the tetramer radii. For most samples there were 8 arcs which index onto a spacing of

As can be seen from the corresponding diffraction pattern in Figure 3, the maxima in Figure 4 correspond to the series of dots and arcs in the diffraction pattern. Up to 8 orders of the arcs are present in the samples examined. These arcs, which index onto a spacing of

45 Å, were initially attributed to crystallised lipids but later identified more precisely as soaps (Briki et al. [16]). Since the arcs are not related to the α-keratin architecture, they fall outside the scope of this study.

The positions of the six to nine clearly visible spots on the equatorial intensity plots were recorded for each sample. The radii of the IFs, the tetramers, and the centre to centre spacings of the IFs were determined assuming sets of solid cylinders using a Bessel function analysis [6, 20–22]. The results obtained for each of these parameters for all samples are given in Table 2. The graphs of the Bessel function calculations of the IF radius and the tetramer radius for the fine hair of the 50-year-old elephant are given in Figures 5(a) and 5(b), respectively. In these graphs the Bessel function (

, is the pixel value of the relevant peak,

nm, = pixel value for 46.7 nm spacing. Figure 5(a) is the graph for the calculation of the IF radius and Figure 5(b) is the graph for the calculation of the tetramer radius. The slope of the graph gives the required radius in each case and


(een)
(B)
(een)
(B) These are typical examples of the first-order Bessel function graphs used to determine the radii of the IFs (a) and the tetramers (b). De

-axis represent the Bessel functions, the

is the pixel value of the relevant peak,

= pixel value for 46.7 nm spacing. The slope of the line of best fit for each graph gives the required radius whilst


4. Discussion and Conclusion

The results in Table 1 confirm the presence of the two infinite lattices of the superlattice for all samples. For samples mounted centrally, although the fourth order was the first order resolvable,

orders of the 46.7 nm lattice and orders of the 62.6 nm lattice were present for all samples studied at APS, 50 orders of the 46.7 nm and 72 orders of the 62.6 nm for samples studied at the Photon Factory. When the samples were positioned off centre on ChemMatCARS so as to record higher orders, 119 orders of the 46.7 nm lattice and 158 orders of the 62.6 nm lattice were recorded. The peaks for these lattices were identified in series of plots along the meridional axes. The 4 : 3 relationships between these two lattice parameters give some superposition of these reflections but three quarters of the 62.6 nm peaks were unique to this lattice and resolvable. These results verify absolutely the presence of a 62.6 nm infinite lattice for all samples.

The results obtained from the Bessel function analysis of the equatorial intensity distribution are listed in Table 2. These results indicate very accurate values for the IF radii, the tetramer radius, and the distance apart of the helices. Other lattices also appeared in the mouse and cat whisker samples but were not common to other samples, so, have not been included in this analysis. The results verify that the required relationship between the radius of the intermediate filaments and the distance apart of the intermediate filaments required to validate the proposed architecture of the α-keratin also holds. The average value obtained for this ratio for the 27 samples was 3.0, standard deviation 0.04. These results verify the second requirement for this structure.

Since all results that are present in the fibre diffraction patterns must relate to any proposed architectural arrangement for the α-keratin intermediate filaments, the presence of the 62.6 nm lattice and the fact that the distance apart of the IFs is 3-times the IF radius must be explicable by any proposed structure in addition to the accepted 46.7 nm lattice and subsets of this lattice. The results presented here indicate that the model proposed by Feughelman and James in 1998 based on mechanical experimental results and fibre diffraction results certainly meets these criteria.

Dankbetuigingen

The author would like to thank Dr. Helen Robertson of the Perth Zoo for providing me with the samples of the Australian marsupials, the orang-utans, and the 50-year-old elephant and her assistance with the Cites permits and Ms. Caroline Greentree, Taronga Zoo Sydney for providing me with the porcupine and echidna quill samples. I would like to acknowledge the financial support of the Whittington Hospital Postgraduate Research Fund, of The Courthouse Collection, WA, and of the Access to Major Research Facilities Program and the Australian Synchrotron research program, which are funded by the Commonwealth of Australia, for travel-related costs to enable the research at the various synchrotrons. The author would also like to acknowledge the generous support of the Photon Factory for use of Beamline BL15A, of the BioCAT and ChemMatCARS facilities (APS), Argonne National Laboratory, and for the assistance provided by the BioCAT director, professor T. Irvine, and the beamline staff of both facilities. The Advanced Photon Source is supported by the US Department of Energy, Basic Energy Sciences, Office of Science under Contract no. W-31-109-ENG-38 W-31-109-Eng-38. BioCAT is a National Institute of Health-supported research centre RR-08630. I am deeply grateful to associate professor David Miller and Dr. Marlene Read (UNSW, Australia) and Dr. Murugesan (Whittington Hospital, UK) for their efficient help in the data collection at APS.

Referenties

  1. A. Guinier, “X-ray diffraction,” in Crystals, Imperfect Crystals, and Amorphous Bodies, W. H. Freeman and Company, Eds., chapter 8, pp. 254–257, Paris, France, 1956. View at: Google Scholar
  2. R. D. B. Fraser and T. P. MacRae, “Surface lattice in α-keratin filaments,” International Journal of Biological Macromolecules, vol. 10, nee. 3, pp. 178–184, 1988. View at: Google Scholar
  3. R. D. B. Fraser and T. P. MacRae, “Intermediate filament structure,” Bioscience Reports, vol. 5, nee. 7, pp. 573–579, 1985. View at: Google Scholar
  4. R. D. B. Fraser and T. P. MacRae, “The structure of the α-keratin microfibril,” Bioscience Reports, vol. 3, nee. 6, pp. 517–525, 1983. View at: Publisher Site | Google Scholar
  5. M. C. Lawrence, “Modelling the surface lattice of α-keratin filaments,” International Journal of Biological Macromolecules, vol. 11, nee. 5, pp. 285–289, 1989. View at: Google Scholar
  6. K. E. Wilk, V. J. James, and Y. Amemiya, “The intermediate filament structure of human hair,” Biochimica en Biophysica Acta, vol. 1245, no. 3, pp. 392–396, 1995. View at: Publisher Site | Google Scholar
  7. V. J. James, K. E. Wilk, J. F. McConnell, E. P. Baranov, and Y. Amemiya, “Intermediate filament structure of α-keratin in baboon hair,” International Journal of Biological Macromolecules, vol. 17, no. 2, pp. 99–104, 1995. View at: Publisher Site | Google Scholar
  8. V. J. James, L. Delbridge, S. V. McLennan, and D. K. Yue, “Changes in the molecular structure of hair in insulin dependent diabetes,” Biochemische en biofysische onderzoekscommunicatie, vol. 233, pp. 76–80, 1997. View at: Google Scholar
  9. M. Feughelman and V. James, “Hexagonal packing of intermediate filaments (microfibrils) in α-keratin fibers,” Textile Research Journal, vol. 68, no. 2, pp. 110–114, 1998. View at: Google Scholar
  10. V. J. James and Y. Amemiya, “Intermediate filament packing in α-keratin of echidna quill,” Textile Research Journal, vol. 68, no. 3, pp. 167–170, 1998. View at: Google Scholar
  11. V. J. James, “Fibre diffraction from a single hair can provide an early non-invasive test for colon cancer,” Medical Science Monitor, vol. 9, no. 8, pp. MT79–MT84, 2003. View at: Google Scholar
  12. M. Feughelman, B. Willis, and V. James, “The Tetrameric Structure of the Intermediate Filaments of Alpha-Keratin Fibres,” in Proceedings of the 11th International Wool Research Conference, vol. 65Fi, Fibres, 2005. View at: Google Scholar
  13. F. H. C. Crick, “The Packing of the alpha-helices: simple coiled coils,” Acta Crystallographica, vol. 6, pp. 689–697, 1953. View at: Google Scholar
  14. M. Feughelman, “Mechanical hysteresis in wool Keratin fibres,” Journal of Macromolecular Science: Physics B, vol. 7, nee. 3, pp. 569–582. View at: Google Scholar
  15. L. M. Dowling, W.G. Crewther, and D. A. D. Parry, “Secondary structure of component 8c-1 of alpha-Keratin,” Biochem J., vol. 236, no. 3, pp. 705–712, 1986. View at: Google Scholar
  16. F. Briki, C. Mérigoux, F. Sarrot-Reynauld et al., “Evidence for calcium soaps in human hair shaft revealed by sub-micrometer X-ray fluorescence,” Journal De Physique. NS, vol. 104, pp. 337–340, 2003. View at: Google Scholar
  17. R. D. Fraser, T. P. MacRae, and A. Miller, “The Fourier transform of the coiled-coil model for α-keratin,” Acta crystallographica, vol. 17, pp. 813–816, 1964. View at: Google Scholar
  18. R. D. Fraser, T. P. MacRae, A. Miller, and E. Suzuki, “The quantitative analysis of fibril packing from electron micrographs,” Tijdschrift voor Moleculaire Biologie, vol. 9, pp. 250–252, 1964. View at: Google Scholar
  19. M. E. Rafik, J. Doucet, and F. Briki, “The intermediate filament architecture as determined by X-ray diffraction modeling of hard α-keratin,” Biofysisch tijdschrift, vol. 86, no. 6, pp. 3893–3904, 2004. View at: Publisher Site | Google Scholar
  20. G. Oster and D. P. Riley, “Scattering from cylindrically symmetric systems,” Acta Crystallographica, vol. 5, pp. 272–276, 1952. View at: Google Scholar
  21. R. D. B. Fraser and T. P. Macrae, “Structural implications of the equatorial X-ray diffraction pattern of α-keratin,” Biochimica en Biophysica Acta, vol. 29, nee. 2, pp. 229–240, 1958. View at: Google Scholar
  22. E. F. Eikenberry, B. Brodsky, and D. A. D. Parry, “Collagen fibril morphology in developing chick metatarsal tendons: I. X-ray diffraction studies,” International Journal of Biological Macromolecules, vol. 4, nee. 6, pp. 322–328, 1982. View at: Publisher Site | Google Scholar

Auteursrechten

Copyright © 2011 Veronica James. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.


Identification of the major 68,000-dalton protein of microtubule preparations as a 10-nm filament protein and its effects on microtubule assembly in vitro

Article Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.

Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.

The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated.

Opmerking: In lieu of an abstract, this is the article's first page.


Methoden:

Specimens of the collembolan species Isotomurus maculatus (Arthropoda, Schäffer 1986) were collected in the neighbourhood of Siena and dissected in phosphate buffered saline (PBS 171 mM NaCl, 6 mM Na phosphate, 3 mM KCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, pH 7.4). Midguts were then processed for electron microscopy, protein analysis, RNA extraction and immunomicroscopy as described below.

Cytoskeletal preparations

Midgut cytoskeletal insoluble fractions were obtained following the procedure described by Pruss et al. [32]. Briefly, 300-500 midguts were homogenized in a volume of 1.5 mL of PBS added with a cocktail of protease inhibitors (P2714, Sigma, NY, USA) and centrifuged at 10,000 G gedurende 10 minuten bij 4°C. The sediment was then extracted in 1.5 mL of PBS containing 0.6 M KCl and 0.5% Triton X-100 and centrifuged as above. The resulting pellet was washed twice in PBS and then either fixed for electron microscopy analysis or denatured for successive sodium dodecyl sulphate (SDS)-acrylamide gel electrophoresis.

Gel electrophoresis and immunoblot

Electrophoretic analysis of cytoskeletal fractions was carried out on 8% or 12% SDS-polyacrylamide gels according to the method used by Laemmli [33]. Gels were either stained using standard Coomassie blue staining procedures or transferred onto nitrocellulose for subsequent immunoblot analysis.

Electrophoretic transfer of proteins onto nitrocellulose was performed as described by Towbin et al. [34], using a modified transfer buffer, consisting of 50 mM Tris, 38 mM glycine and 5% methanol. Transferred protein bands were immunostained using the affinity-purified anti-isomin polyclonal antibody (see below) and a peroxidase-labelled anti-rabbit secondary antibody (Cappel, PA, USA). Blots were then processed for ECL detection (GE Healthcare, NJ, USA), with exposure times from 5 s to 5 min.

Protein analysis by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS)

Analysis by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) of the main tryptic fragments obtained by digestion of the isomin band was performed by the Swiss-2D Service (Geneva, Switzerland) the obtained peptide aminoacid sequences are listed in Additional File 1, Table S1.

RNA preparation and RT-PCR

Total RNA was isolated from adults of I. maculatus frozen in liquid nitrogen and homogenized using a Polytron homogenizer (Kinematica AG, Littau, Switzerland) according to the method described by Chomczynski and Sacchi [35]. RNAs (1 μg) were converted to cDNAs with an oligo(dT)18 primer and SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, CA, USA) according to manufacturer's instructions. Forward and reverse degenerate primers were designed on the basis of three amino acid sequences obtained by mass spectrometry: (B1-B2) YEAEAAK, (C1-C2) ESTGDAE and (D1-D2) FGHADQEK. Their sequences are listed in Additional File 1, Table S1. A partial 360 bp fragment of the isomin protein was amplified by RT-PCR using the combination B2/D1 of degenerate primers. Reactions were performed using Expand High Fidelity PCR System (Roche, Basel, Switzerland) under the following conditions: 95°C for 10 min cycles 1-5: 94°C for 1 min, 35°C for 1 min, 72°C for 1 min cycles 6-46: 94°C for 1 min, 54°C for 1 min, 72°C for 1 min and 72°C for 10 min. PCR products were purified using Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, WI, USA), cloned into a TA cloning vector (Invitrogen) and sequenced using a CEQ 8000XL automated DNA Analysis System (Beckman Coulter, CA, USA) on both strands. The 360 bp deduced amino acid sequence showed the complete sequences used to design B2 and D1 degenerate primers plus an additional one corresponding to the mass spectrometry fragment 5 (Additional File 1, Table S1).

Cloning of full length cDNA by rapid amplification of the complementary DNA ends (RACE)

In order to obtain the full-length cDNA for isomin, a 5' and 3' RACE was performed on I. maculatus total RNA using a GeneRacer™ Kit (Invitrogen) and following manufacturer's instructions. Isomin specific primers - D1_FEcoRI, Iso112_for (3' nested primer Additional File 1, Table S1) used in 3' amplification, B2_RBamHI and iso577_rev (5' nested primer Additional File 1, Table S1) used in 5' amplification - were designed based on the partial 360 bp sequence mentioned above. Both nested PCR reactions gave a single product of ≈1200 bp and ≈ 500 bp, respectively. The 5' and 3' RACE products were purified, cloned and sequenced as described above. The complete isomin cDNA sequence has been deposited in GenBank under accession number FJ264504.

Sequentieanalyse

Homology searches for nucleotide and amino acid sequences were performed using the BLAST suite of programs (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Programs employed for the prediction of molecular domains implicated in coiled coils formation were Coils (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) and Marcoil (http://bioinf.wehi.edu.au/folders/mauro/Marcoil/index.html) sequence alignments were obtained using ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Prediction of phosphorylated sites and of sumoylated residues was performed using NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) and SUMOsp 2.0 (http://sumosp.biocuckoo.org/prediction.php), respectively. Distance analysis of protostome cytoplasmic IF sequences was carried out using the Protdist and Neighbor programs of the Phylip package (JTT matrix, 100 bootstrap replicates) available at the Pasteur Institute web server (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py).

Bacterial expression of recombinant protein

For the preparation of the glutathione S-transferase (GST) fusion constructs, either a portion (360 bp, coding the protein region from Phe11 to Lys131) or the whole isomin protein coding region (1236 bp) were amplified by PCR. Oligonucleotide pairs containing sites for in-frame directional cloning in the pGEX-6P-2 vector (GE Healthcare, NJ, USA) were: D1_FBamHI/B2_RSmaI for the 360 bp fragment and isoml_BamHI/isoml_SmaI for the 1236 bp one (Additional File 1, Table S1). PCR cycling, for the short fragment amplification, included an initial denaturation at 94°C for 5 min followed by 40 cycles of 94°C for 1 min, 52°C for 1 min, 72°C for 1 min and a final extension step at 72°C for 10 min. The 1236 bp region was amplified under the same PCR conditions but with an annealing temperature of 56°C. The PCR products were cloned into the BamHI and SmaI sites of the bacterial expression vector pGEX-6P-2 (GE Healthcare, NJ, USA) in frame with the upstream gene GST. Expression of the fusion protein was induced in E coli by addition of Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG see below).

Purification of the fusion protein and production of specific antibodies

Recombinant bacterial strains expressing the fusion protein - either the whole isomin molecule or its 120 aa fragment from Phe11 to Lys131 (see Additional File 2, Figure S1) - were grown at 37°C in 400 mL of Luria-Bertani (LB) medium added with 50 μg/mL of ampicillin, until an OD600 of about 0.6-0.8 is achieved. After the addition of IPTG to a final concentration of 0.1 mM, the culture was incubated at 37°C for 2 h under shaking. Cells were harvested by centrifugation at 3500 G for 10 min, resuspended by vortexing in 25 mL of B-PER™ reagent (Pierce) and shaken at room temperature for 10 min soluble proteins were separated by insoluble material by centrifugation at 27000 G gedurende 15 minuten.

Most part of the fusion protein was contained in inclusion bodies. Only in the case of the 120 aa fragment it was possible to recover an amount of soluble protein sufficient for the subsequent purification by affinity chromatography on Gluthatione Sepharose 4B (GE Healthcare, NJ, USA). This procedure was carried out according to manufacturer's instructions. Briefly, the recovered soluble fraction was added with 1 mL of a 50% slurry of resin and incubated for 1 h with gentle agitation. Resin was then collected by centrifugation at 500 G for 5 min and washed twice in PBS. Protein bound to the resin was eluted with 10 mM glutathione in 50 mM Tris-HCl pH 8.0, dialyzed against 0.9% NaCl and used for rabbit immunization following standard procedures. The resulting polyclonal antibodies were blot-affinity purified according to Tang (36), using nitrocellulose membrane fragments containing the isomin 40 kDa protein band.

Isomin in vitroreassembly

Recombinant isomin was essentially recovered in the insoluble inclusion bodies. For their purification, the insoluble pelleted material obtained from a 50 mL-culture after cell lysis was resuspended by vortexing in 5 mL B-PER™, added with 200 μg/mL lysozime and incubated at room temperature for 5 min. The suspension was then added with 15 mL of B-PER™ diluted 1:10 in 20 mM Tris pH 7.5 and centrifuged for 15 min at 27000 G. Pelleted inclusion bodies were washed twice in B-PER™ diluted 1:10 in 20 mM Tris pH 7.5, then twice in 2% TRITON 10 mM EDTA. The final pellet essentially consisted of a band of about 66 kDa, corresponding to the recombinant protein (Additional File 5, Figure S4A). For cleavage of the GST moiety, pelleted inclusion bodies were thoroughly resuspended at about 75 μg/mL in a buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.0, added with 10 U of PreScission Protease (GE Healthcare, NJ, USA) and incubated at 5°C for 20 h. After centrifugation at 8000 G for 20 min, both supernatant and sediment fractions were analysed by SDS-page (Additional File 5, Figure S4B) most part of the recombinant protein was shown to be cleaved and still to be contained in the insoluble fraction, while the GST protein was recovered in the soluble fraction.

The insoluble pellet recovered after cleavage was dissolved in 10 mM Tris, 9.5 M urea, pH 7.0 and incubated for 1 h at room temperature. After centrifugation for 1 h at 150000 G, analysis by SDS-page of the soluble and insoluble fractions revealed that urea treatment solubilised about 50% of the isomin protein (Additional File 5, Figure S4C). As described by Herrmann et al. [24], urea-solubilized protein was then dialyzed against a series of solutions (1 h each) containing decreasing concentrations (8 M, 6 M, 4 M, 2 M) of urea dissolved in 5 mM Tris, 0.1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH8.4 and, finally, against the same buffer containing no urea. After dialysis, the sample was added with an appropriate volume of 10× reassembly buffer (0.2 M Tris, 0.5 M NaCl, pH 7.0), incubated for 1 h at room temperature and then centrifuged at 150000 G for 1 h. Sediment and supernatant were analysed by both SDS-page and negative staining.

Immunomicroscopy

For immunofluorescence microscopy, midguts were fixed in absolute ethanol for 1 h at 4°C and then paraffin-embedded. After rehydration, sections were treated with 1% NaBH4 for 30 min to quench autofluorescence and washed twice for 5 min with PBS. Successively, sections were incubated for 1 h in PBS containing 3% bovine serum albumine and 0.5% Tween-20, and for 2-4 h in the affinity-purified primary antibody. After two 10-min washes in PBS containing 0.1% Tween-20, sections were incubated for 1 h in the secondary antibody (fluorescein-conjugated anti-rabbit antibodies, Cappel), washed again in PBS-T and finally mounted in 90% glycerol.

Elektronenmicroscopie

Whole midguts or midgut TRITON-resistant fractions were fixed with glutaraldehyde and tannic acid, post fixed with uranyl acetate and embedded in an Epon/Araldite mixture as previously described in [37]. Before observation by TEM, thin sections were routinely stained with uranyl acetate and lead citrate.

For post-embedding electron microscopy immunolocalization, whole midguts were fixed at 4°C for 2 h in 0.1 M phosphate buffer (PB) pH 7.2, containing 0.2% glutaraldehyde and 2% p-formaldehyde, rinsed overnight in PB, dehydrated at 4°C in a graded ethanol series and embedded in Lowicryl K4M as described in [38]. For immunogold staining, sections were saturated with 3% bovine serum albumin (BSA), 15% normal serum in PBS (2 h), treated with 20 mM glycine in PBS (20 min), and then incubated overnight at 4°C in the primary antibody diluted in PBS containing 0.2% BSA. After one 10-min wash with PBS containing 0.5% Tween 20 and five 10-min washes in PBS, sections were incubated for 1 h at room temperature in the secondary antibody (GAM IgG-G10, Biocell, Cardiff, Wales, UK). Grids were then washed 5 × 10 min in PBS and 5 × 10 min in distilled water, then counterstained as above reported. All the ultrathin sections were observed at a Philips CM10 EM operating at 80 kV.


Bekijk de video: Section Sport - Biologie - La coordination de lactivité des muscles antagonistes (Januari- 2022).