Informatie

Kan RNA worden geëxtraheerd uit in formaline gesuspendeerd weefsel?


Er drijven twee tumormonsters in een 10% formaldehyde-oplossing (d.w.z. formaline). Is er onder deze omstandigheden een protocol voor RNA-extractie? Ik ben bang dat het gebruik van het protocol voor Formaline Fixed Paraffin Embedded (FFPE) weefsel het RNA zal beschadigen, aangezien er geen paraffine is om het xyleen te verwijderen.

Als ik het FFPE-protocol zonder xyleen zou gebruiken, moet ik dan het weefsel homogeniseren voordat de formaline wordt verwijderd, of daarna?


Formaldehyde vormt adducten met RNA en kan het ook vatbaarder maken voor afbraak. Het kan ook crosslinks veroorzaken tussen RNA en eiwitten (of mogelijk andere RNA's). Om al deze redenen is extractie van hoogwaardig RNA uit met formaldehyde gefixeerde monsters erg moeilijk en zijn de opbrengsten laag (Howat en Wilson, 2014).

Bekijk dit artikel van Evers et al. (2011) waarin de optimale omstandigheden voor de verwijdering van de formaldehyde-adducten worden onderzocht. Deze studie omvat echter geen daadwerkelijke RNA-extractie uit vaste weefsels, wat nog moeilijker zou zijn.

RNeasy FFPE Kit van Qiagen beweert speciaal te zijn ontworpen voor RNA-extractie uit met formaldehyde gefixeerde monsters. In de productbeschrijving staat dat de lysisbuffer stoffen bevat die de door formaldehyde gevormde modificaties ongedaan maken. Er is een vergelijkbare kit van Thermo-Fisher. Russel et al. (2013), melden dat de RNA-opbrengst vergelijkbaar was tussen vaste (met behulp van Qiagen RNeasy FFPE-kit) en niet-gefixeerde monsters (met behulp van Qiagen RNeasy Plus mini Total RNA-extractiekit).

moet ik het weefsel homogeniseren voordat de formaline wordt verwijderd, of daarna?

Homogeniseer na het verwijderen van formaline. Omdat de weefsels al broos zijn vanwege de fixatie van formaldehyde, hoeft u geen harde homogenisatieprocedures te gebruiken. Pipetteer voorzichtig. U kunt proteïnase-K en DNAse gebruiken om respectievelijk eiwitten en DNA te verwijderen (RNeasy kit omvat deze stappen).

Voor toekomstige experimenten kun je de weefsels in RNA opslaanlater oplossing (Thermo-Fisher; of soortgelijke formuleringen van andere leveranciers/lab). Bewaar een deel van het weefsel in formaldehyde voor IHC/ISH en het andere in RNAlater voor RNA/DNA-extractie.


Toepassing van RT-PCR in in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde longkankerweefsels

Om genexpressie te analyseren in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde longkankerweefsels met behulp van een aangepaste methode.

Methoden:

Totaal RNA uit bevroren weefsels werd geëxtraheerd met behulp van TRIZOL-reagens. RNA werd geëxtraheerd uit formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels door digestie met proteïnase K vóór de zuur-fenol:chloroform-extractie en dragerprecipitatie. We hebben deze methode aangepast door een hogere concentratie proteïnase K te gebruiken en een langere verteringstijd, geoptimaliseerd tot 16 uur. RT-PCR en real-time RT-PCR werden gebruikt om de reproduceerbaarheid en de overeenstemming tussen bevroren en in paraffine ingebedde monsters te controleren.

Resultaten:

De resultaten toonden aan dat het RNA geëxtraheerd uit de in paraffine ingebedde longweefsels een hoge kwaliteit had met de meeste fragmentlengte tussen 28S- en 18S-banden (ongeveer 1000 tot 2000 basen). Het huishoudgen GUSB vertoonde een lage variatie van expressie in ingevroren en in paraffine ingebedde longweefsels, terwijl PGK1 de laagste variatie in lymfoomweefsels had. Bovendien toonde realtime PCR-analyse van de expressie van bekende prognostische genen in niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) een extreem hoge correlatie aan (R>0.880) tussen de gepaarde bevroren en formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters.

Conclusie:

Deze verbeterde methode van RNA-extractie is geschikt voor realtime kwantitatieve RT-PCR en kan worden gebruikt voor globale genexpressieprofilering van in paraffine ingebedde weefsels.


Abstract

In formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels zijn een bron van biologisch materiaal voor moleculaire studies. Er zijn verschillende methoden gerapporteerd om DNA uit FFPE-weefsels te extraheren. Dit proces is een uitdaging vanwege de door formaldehyde geïnduceerde verknoping tussen eiwitten en DNA, evenals molecuulfragmentatie wanneer niet-gebufferde formaline wordt gebruikt voor fixatie. Hier werden 2 methoden voor DNA-extractie uit FFPE-weefsels, gebaseerd op een chelerende hars en silicamembraankolommen, gemodificeerd en vergeleken in hun vermogen om humaan cytomegalovirus (HCMV) te detecteren bij aangeboren infecties. Beide methoden werden getest op 121 monsters van hersenen, longen, milt en lever afkomstig van 36 overleden premature pasgeborenen. Twaalf patiënten werden geselecteerd en UL55- en UL75-HCMV-genen werden gedetecteerd door polymerasekettingreactie in 16/36 monsters. Deze 2 methoden vormen een handig hulpmiddel voor DNA-herstel uit FFPE-weefsels en moleculaire identificatie van HCMV met het voordeel van lage kosten, minimale stappen, minimaal monstergebruik, oplosmiddelvrij en eenvoudig te implementeren in het laboratorium.


Resultaten

Kwantiteit en kwaliteit van aRNA verkregen uit FFPE-monsters vergeleken met FF-monsters. RNA uit FF- of FFPE-monsters werd geëxtraheerd na het schrapen van secties of na celopname met behulp van laseropname-microdissectie (figuur 1A). RNA-opbrengst na extractie was hoger na schrapen, zoals verwacht op basis van het aantal cellen (Fig. 1B). Om te bepalen of de hoeveelheid uitgangsmateriaal de opbrengst beïnvloedt, deden we amplificaties met een bereik van 5 tot 30 ng uitgangs-RNA. Voor FFPE-monsters varieerde de totale opbrengst van aRNA van 20 tot 40 g na twee amplificatieronden en werd niet beïnvloed door de hoeveelheid uitgangs-RNA-materiaal. Voor FF-monsters varieerde de opbrengst van 60 tot 200 g en nam toe met een toename van de hoeveelheid uitgangs-RNA-materiaal (figuur 1B). aRNA van beide monstertypen vertoonde een vergelijkbaar patroon na elektroforetische scheiding (figuur 1C).

EEN, laser capture microdissectie. FFPE pGBM-monsters werden verwerkt voor H&E-kleuring om tumorcellen te identificeren. Representatieve beelden van een pGBM werden genomen voor en na het vangen van tumorcellen uit dezelfde sectie, en gevangen cellen worden getoond. B, RNA-opbrengst voor en na lineaire amplificatie in FF- en FFPE-monsters. RNA werd geëxtraheerd uit objectglaasjes na microdissectie met schrapen of laservangen, en 5 tot 10 ng werden onderworpen aan twee ronden van T7-RNA-polymerase-amplificatie. De RNA-opbrengst was hoger na schrapen en de amplificatiecoëfficiënt was constant hoger in FF vergeleken met FFPE-monsters. C, Ectroforetische scheiding van aRNA van FF- en FFPE-monsters. aRNA (2 g) van een representatief aantal monsters van FF- en FFPE pGBM-monsters werd onderworpen aan elektroforese om de aanwezigheid en de grootte van het geamplificeerde materiaal te beoordelen. De grootte van aRNA was tussen 300 en 600 bp en vergelijkbaar in beide materiële bronnen. NS, RT-PCR-detectie van β-actine-, YB-1- en PDGFRa-gen op RNA geëxtraheerd uit paraffinemonsters. RT-PCR werden uitgevoerd met behulp van willekeurige primers en beginnend met 200 ng aRNA. Een referentiegen (β-actine) werd gecoamplificeerd met PDGFRa en YB-1 met behulp van genspecifieke primers die waren ontworpen binnen de laatste 300 basen van elk gen. Alle 16 pGBM FFPE-monsters en een CB worden getoond. β-actine wordt uitgedrukt in alle monsters zoals verwacht, terwijl PDGFRβ en YB-1-expressie worden alleen in sommige monsters gedetecteerd. e, patroon van YB-1-expressie in FFPE pGBM. Immunohistochemische kleuring voor YB-1 werd gedaan op 14 pGBM en 2 CB's. Anti-YB-1 COOH-terminus antilichaamkleuring en scoren van objectglaasjes werden gedaan zoals eerder beschreven (47). Kleuring bevestigt de resultaten verkregen door RT-PCR op dezelfde monsters.

Om de kwaliteit van aRNA te beoordelen dat uit beide materiaalbronnen is geëxtraheerd, hebben we de Agilent Bioanalyzer 2100 Picochip gebruikt. Scherpe 18S- en 28S-rRNA-pieken werden verkregen uit FF-weefsels, en alleen 18S-ribosomale pieken werden verkregen uit FFPE-weefsels in combinatie met een karakteristieke verandering in het RNA-profiel die indicatief is voor afbraak (gegevens niet getoond). We deden nog steeds RT-PCR-assays met behulp van primers die waren ontworpen voor het 3'-uiteinde van genen die een huishoudgen, β-actine en genen bevatten waarvan we eerder hadden aangetoond dat ze tot overexpressie werden gebracht in een subset van bevroren pGBM, PDGFRβ, en YB-1 (31). RT-PCR werd uitgevoerd op RNA na extractie en na de eerste en de tweede amplificatiestap. β-actine was aanwezig in alle monsters, terwijl PDGFRβ transcript werd in sommige monsters bij alle stappen gezien (Fig. 1D). Gegevens correleerden met eerdere bevindingen verkregen uit FF pGBM waarin: PDGFRβ werd slechts in een aantal monsters opgereguleerd. YB-1 werd ook uitgedrukt in sommige monsters (Fig. 1D). Belangrijk, resultaten voor YB-1 gecorreleerd met de immunohistochemische analyse die parallel werd uitgevoerd op objectglaasjes van dezelfde FFPE-monsters, waarbij monsters negatief waren door RT-PCR die geen kleuring voor YB-1 vertoonden en positieve monsters die verhoogde eiwitexpressie vertoonden door immunohistochemie (Fig. 1E).

Deze resultaten geven aan dat de RNA-opbrengst, evenals de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA, lager zijn uit FFPE-monsters. Zoals eerder is aangetoond, kan RNA-analyse echter nog steeds worden uitgevoerd op deze materiële bron, zelfs als RNA van FFPE-monsters wordt afgebroken.

Genexpressieprofilering van FFPE-monsters. De 28S/18S-verhouding, zoals gemeten met de Bioagilent picochip, kan een misleidende categorisering opleveren vóór microarray-analyse (34). Op basis van de zeldzaamheid van FF-monsters van pGBM, hebben we ervoor gekozen om microarray-analyse uit te voeren op aRNA dat is geëxtraheerd uit FFPE-pGBM-monsters om verder te valideren op een onafhankelijke dataset van pGBM-genexpressieprofielen die we hebben verkregen op 14 FF pGBM-monsters (27). Bij het hybridiseren van menselijke 19K-cDNA-spot-arrays met 5 g cDNA, werden weinig specifieke vlekken gezien, in schril contrast met FF-monsters, waarbij het aantal vlekken met hoge intensiteit altijd bevredigend was voor hybridisaties van hoge kwaliteit. We deden daarom hybridisaties met een bereik van 10, 15 en 20 g cDNA voor hetzelfde pGBM-monster en dezelfde controle. Met hogere cDNA-concentraties (15 of 20 g) werd meer achtergrondruis verkregen, terwijl het aantal vlekken dat specifieke hybridisatie op het objectglaasje vertoonde niet toenam (gegevens niet getoond). Optimale resultaten en reproduceerbare resultaten op 13 van de 16 FFPE pGBM-monsters werden verkregen voor 10 μg geamplificeerd cDNA, zelfs als, in vergelijking met aRNA van FF-monsters, de achtergrondruis hoger was en een significant lager aantal vlekken werd gezien op de array-dia's.

GeneSpring's Filter on Confidence-tool identificeerde een lijst van transcripten met statistisch significante veranderingen in overvloed in FFPE pGBM-monsters vergeleken met de gepoolde controles (Welch t toets, P < 0,05 meervoudige testcorrectie: Benjamini en Hochsberg, percentage valse ontdekkingen van 3,4%). Andere statistische algoritmen (de Wilcoxon-Mann-Whitney-test van significantieanalyse van microarrays) werden getest met vergelijkbare resultaten. Differentieel tot expressie gebrachte transcripten tussen pGBM en CB werden verkregen voor FF- of FFPE-pGBM-monsters. Analyse van de gegevens toonde aan dat 777 transcripten differentieel tot expressie werden gebracht in FFPE-monsters vergeleken met de gepoolde controle en 3.647 gemoduleerde transcripten in FF-monsters vergeleken met de FF-gepoolde CB. Een tweedimensionale grafiek en tweedimensionale hiërarchische clustering organiseerden en visualiseerden de profielen van deze differentieel gereguleerde transcripten (Y as) van elk van de 13 FFPE pGBM-monsters en de eerder gerapporteerde 14 FF pGBM-monsters (x as Fig. 2B en C respectievelijk ref. 27). Zowel de grafiek die differentieel tot expressie gebrachte transcripten tussen pGBM-monsters en de gepoolde controles weergeeft, als de clusterboom van deze differentieel tot expressie gebrachte transcripten laten zien dat een significant aantal transcripten verloren gaat in de FFPE vergeleken met de FF-monsters. Zoals te zien is in de tweedimensionale grafiek, de clusteringboom en de spreidingsplotgrafiek van alle monsters van beide materiële bronnen, geven transcripten van de FFPE-monsters ook een verminderde vouwverandering aan ten opzichte van de CB in vergelijking met dezelfde transcripten van FF monsters (Fig. 2A). Ondanks deze verschillen in aantal differentieel tot expressie gebrachte transcripten en vouwverandering en het gebruik van verschillende controles, vonden we nog steeds een redelijke correlatie van R 2 = 0,649 tussen beide monstertypes. Belangrijk is dat een vergelijkbaar patroon van genexpressieprofielen werd gehandhaafd tussen FF- en FFPE-pGBM-monsters: transcripten die tot overexpressie waren gebracht (kleurgecodeerd in rood) in de FF-monsters werden ook tot overexpressie gebracht in de FFPE, en omgekeerd, transcripten die in beide monstertypes waren vergelijkbaar (kleurgecodeerd in groen Fig. 2B en C). Dit geeft aan dat, zelfs als we een aantal differentieel gereguleerde transcripten in de FFPE-monsters verliezen in vergelijking met de FF-monsters, evenals de mate van de vouwverandering, we een vergelijkbaar expressiepatroon behouden voor de significante differentieel gereguleerde transcripten in FFPE monsters.

Genexpressieprofilering van FFPE-monsters reproduceert het patroon van expressieprofielen verkregen op FF pGBM-monsters. EEN, profielovereenkomsten tussen verschillende subgroepen van GBM. Scatterplots die de verandering in transcript-abundantie vergelijken tussen paren subgroepen van pGBM: FF pGBM (links), FFPE (midden-), en FFPE versus FF (Rechtsaf). Transcripties gekleurd in rood (opwaarts gereguleerd) en blauw (naar beneden gereguleerd) tonen een statistische verandering in overvloed tussen het paar subgroepen van GBM dat is geanalyseerd ten opzichte van de controle (Welsh t toets, Pafsnijden < 0,05 meervoudige testcorrectie: Benjamini en Hochsberg False Discovery Rate). Log 2-intensiteitsspreidingsgrafieken werden gegenereerd met behulp van onbewerkte intensiteitsgegevens en Pearson-correlatiecoëfficiënten werden berekend voor FF- versus FFPE-monsters (links R = 0.649). B, niet-gecontroleerde hiërarchische clustering van de probes met een statistisch significante verandering in transcript-abundantie (Welsch t toets, P < 0,05 Benjamini en Hochsberg) tussen FF pGBM, FFPE pGBM en de pool van normaal hersenweefsel (x as) toont een afname in het aantal en de vouwverandering van transcriptprofielen in FFPE-monsters (probes op de Y as). Elk experimenteel gegevenspunt is gekleurd volgens de verandering in fluorescentieverhouding: overvloediger in pGBM (rood) en minder overvloedig gekleurd (groente). C, tweedimensionale hiërarchische clustering van 486 probes die de hoogste statistisch significante verandering in transcript-abundantie tussen monsterparen in FF-monsters vertonen (Welsch t toets, P < 0.05 Benjamini en Hochsberg zie Aanvullende genenlijsten) laat zien dat het patroon van tot overexpressie gebrachte/naar beneden gereguleerde genen vergelijkbaar is in FFPE-monsters. Elk experimenteel gegevenspunt is gekleurd volgens de verandering in fluorescentieverhouding: overvloediger in pGBM (rood) en minder overvloedig gekleurd (groente). NS, Venn-diagram van differentieel gereguleerde transcripten ten opzichte van de gepoolde CB in FFPE pGBM-monsters (N = 777) en in FF-voorbeelden (N = 3847 Welch t toets, P < 0.05) met een significante overlap (N = 606) tussen beide lijsten met transcripten (aanvullende genenlijsten).

Analyse van genexpressieprofielen van FFPE-monsters weerspiegelt resultaten verkregen uit FF-monsters. Vervolgens hebben we Venn-diagrammen gebruikt om de lijst met significant gemoduleerde transcripten te vergelijken voor beide voorbeeldsets die we hebben gegenereerd met behulp van de P-waarde cutoff van 0,05. Deze grens is gekozen omdat veel transcripties op het punt van statistische significantie werden gemist door een strengere P waarde, zoals ook eerder beschreven in onderzoeken die verschillende platforms of RNA van verschillende materiële bronnen vergelijken met variabele gevoeligheid voor het detecteren van transcripten, inclusief zwak tot expressie gebrachte genen (34-38). We zagen een overlap tussen beide genenlijsten van 606 genen die worden gedeeld door de twee subsets van pGBM-monsters, wat een significantie van overlap van 1.0e−09 geeft volgens de exacte test van Fischer (Fig. 2D Aanvullende genenlijsten). We analyseerden de gegevensset met behulp van een weergave op moduleniveau verkregen uit een "kankercompendium" (39) en organiseerden de genensets ook met behulp van GoMiner, een computerhulpmiddel dat de hiërarchische structuur van het genontologieconsortium bevat (2) om een ​​functionele categorisering van genenlijsten op basis van biologische processen. Beide methoden hebben tot doel een hogere orde te destilleren uit een grote lijst van genen. Ze leverden vergelijkbare resultaten op, wat aantoont dat modules en genontologietermen elkaar overlappen voor de top 15 categorieën die zijn verkregen op significant gemoduleerde transcripten van FF- en FFPE-gegevenssets (tabel 2). Het gebruik van verschillende CB's zou deels het gebrek aan volledige overlap tussen beide soorten monsters op genenlijsten kunnen verklaren. We hadden eerder voor FF-monsters vastgesteld dat verschillende CB vergelijkbare, zo niet volledig overlappende, genexpressieprofielen hadden (Pearson-correlatie, R = 0,93). Bij het categoriseren van de aard van deze 171 genen door genontologieprocessen, werden ze voornamelijk gegroepeerd in katabole transcripten (aanvullende genenlijsten). Toen we keken naar de statistisch significante transcripten die aanwezig zijn in beide genenlijsten, waren de meeste genen die we hadden gevalideerd door qRT-PCR in FF-monsters en die we wilden nastreven op basis van hun mogelijke betrokkenheid bij de oncogenese van pGBM ook aanwezig bij het analyseren van significant gemoduleerde transcripten in FFPE-monsters (Tabel 3 Aanvullende genenlijsten).

Genontologieclassificatie met behulp van genoncologiemijnwerker van de differentieel tot expressie gebrachte transcripten ten opzichte van de gepoolde CB's van FF- en FFPE-pGBM-monsters

Lijst van de top 100 differentieel tot expressie gebrachte transcripten in verhouding tot de gepoolde CB's die FF en FFPE pGBM gemeen hebben

We hebben eerder met behulp van FF-monsters aangetoond dat er ten minste twee prognostische subgroepen van pGBM zijn die moleculair kunnen worden gescheiden op basis van hun associatie of niet met bewijs dat consistent is met een afwijkende Ras-actieve route. De aanwezigheid van gefosforyleerde effectoren van Ras, waaronder pErk1/pErk2, gefosforyleerd MAP/ERK-kinase 1/MAP/ERK-kinase 2 en gefosforyleerd Raf, onderzocht door Western in FF-monsters en een positieve pErk1/pErk2-kleuring door immunohistochemie in FFPE-monsters, werden beschouwd als consistent met Ras-activering (Fig. 3A refs. 27, 32). Om deze bevindingen verder te valideren, werd dezelfde analyse uitgevoerd op FFPE-monsters met behulp van PCA, een methode voor gegevensreductie waarbij de hoge dimensionaliteit van de gegevens wordt teruggebracht tot twee tot drie zichtbare dimensies die lineaire combinaties van genen vertegenwoordigen die verantwoordelijk zijn voor het grootste deel van de variantie van de dataset en waarmee overeenkomsten binnen steekproeven kunnen worden gevisualiseerd. Net als onze bevindingen in FF-monsters (27), scheidde PCA beide sets FFPE- en FF-pGBM-monsters in twee groepen, wat de aanwezigheid van ten minste twee verschillende populaties pGBM aangeeft (figuur 3B). De twee pGBM-populaties gescheiden door PCA waren geassocieerd met bewijs dat consistent was met verschillende Ras-activiteit in monsters (Figuur 3B). ANOVA-tests waren ook in staat om transcripten te identificeren die tumoren konden onderscheiden die geassocieerd waren met verschillende Ras-activiteit in zowel FF- als FFPE-monsters, terwijl ze een significante mate van correlatie vertoonden tussen bevroren en FFPE (lineaire correlatie in de spreidingsgrafieken Fig. 3C).

Tumormonsters vertonen verschillende expressieprofielen die correleren met activering van de Ras-route. EEN, immunohistochemische analyses voor pErk, gliaal fibrillair zuur eiwit (astrocytische marker) werden uitgevoerd voor de 16 pGBM-monsters die in deze studie waren opgenomen. Monsters zijn genummerd zoals in Tabel 1 en Fig. 1D. B, de 13 FFPE- en 14 FF pGBM-monsters werden onderworpen aan een PCA op basis van het expressieprofiel gemeten op 15.068 individuele probes. Een driedimensionale plot van PCA-componenten 1, 2 en 3 onderscheidde de Ras-scores van de pediatrische tumoren, ongeacht de aard van de monsterbron. Monsters hebben een kleurcode voor duidelijkheidsproblemen: pGBM-monsters geassocieerd met actieve Ras-route (rood, FFPE donkerblauw, FF) pGBM-samples niet geassocieerd met actieve Ras (geel, FFPE lichtblauw, FF). Drie FFPE-monsters met een actieve Ras-route waarvoor we voldoende materiaal hadden, werden in duplo behandeld met afzonderlijke RNA-extractie, amplificatie en hybridisatie. Ze migreerden op dezelfde manier op de PCA-grafiek, wat de reproduceerbaarheid van de genexpressie-analyse op FFPE-monsters verder bevestigde. C, ANOVA identificeerde differentieel tot expressie gebrachte transcripten in beide monsterbronnen op basis van hun associatie / gebrek aan associatie met een actieve Ras-route. Log 2-intensiteitsspreidingsgrafieken werden gegenereerd met behulp van onbewerkte intensiteitsgegevens en Pearson-correlatiecoëfficiënten berekend voor FF- versus FFPE-monsters geassocieerd met Ras-activering (R = 0,651) en pGBM-monsters die niet zijn geassocieerd met Ras-activering (R = 0.712).


Discussie

Sinds hun ontdekking is miRNA-analyse over het algemeen uitgevoerd op snel ingevroren of verse monsters, met behulp van variabele technieken, waaronder microarray, Northern blot-analyse en PCR [2]. FFPE-weefsels, als een gemakkelijk beschikbare bron, zouden van onschatbare waarde kunnen zijn bij het uitvoeren van miRNA-expressie-analyse als hun expressie na verwerking zou worden gehandhaafd. In deze studie vergeleken we miRNA-profilering uitgevoerd op verse monsters en FFPE met behulp van stam-lus RT-PCR-kwantificatietechnieken in een cellijnmodel. We ontdekten dat miRNA-profilering kon worden uitgevoerd op routinematig vaste FFPE-blokken.

MiRNA-overvloed in FFPE

Sommige laboratoria hebben mRNA-genexpressieprofielen onderzocht met behulp van real-time RT-PCR in gepaarde snel ingevroren en FFPE-weefselmonsters [7-10]. De algemene consensus is dat mRNA-detectie uit archiefmateriaal beperkt is vanwege de labiele aard van mRNA en de schadelijke effecten van enzymatische fragmentatie tijdens lange opslagperiodes en RNA-modificatie veroorzaakt door formalinefixatie. Vervolgens is gesuggereerd dat kleine amplicons [11] (korter dan

130 [7, 9] nucleotiden) kunnen bruikbaar zijn als robuuste markers in genexpressiestudies met FFPE-weefsels. Inderdaad, onze eigen experimenten (gegevens niet getoond) bevestigden dit fenomeen met behulp van mRNA-doelen over een reeks amplicon-afmetingen in dit cellijnmodel. FFPE-extracten produceerden bijvoorbeeld Cts 4 tot 10 cycli hoger dan hun snel ingevroren tegenhangers, afhankelijk van de gebruikte amplicongroottes (62 tot 164 bp). Cts tussen FFPE en snel bevroren waren dichter voor kleine amplicons dan die voor grote amplicons. Analyse van GAPDH met een doelamplicon van 67 bp liet bijvoorbeeld een gemiddeld verschil zien van 4,28 cycli, terwijl een test ontworpen voor hetzelfde gen (GAPDH) met een doelamplicongrootte van 122 bp een gemiddeld verschil van 6,51 Cts tussen FFPE en snap liet zien. bevroren materiaal.

miRNA's hebben het voordeel dat ze klein zijn en slechts ongeveer 20 tot 22 nucleotiden lang zijn. Bovendien zijn ze eiwit beschermd door het RISC-complex. Bijgevolg zijn ze mogelijk niet zo gevoelig voor RNA-afbraak als mRNA in FFPE-weefsels. Onze resultaten toonden aan dat de hoeveelheid miRNA in totaal RNA geëxtraheerd uit FFPE groter was dan die geëxtraheerd uit snel ingevroren cellen wanneer de invoerhoeveelheden totaal RNA identiek waren. De gemiddelde hoeveelheid miRNA's afgeleid van totaal RNA geëxtraheerd uit FFPE was het dubbele (een Ct lager) dan in snel ingevroren cellen, wat hoogstwaarschijnlijk een gevolg is van methylol-crosslinks tussen RNA en eiwit die tijdens de verwerking zijn geïntroduceerd.

We hebben identieke hoeveelheden totaal RNA (10.000 ng) geëxtraheerd voor analyse. In praktische termen vereiste dit invoer van bijna tien keer het aantal FFPE-cellen (2 × 106 cellen) vergeleken met snel bevroren (1,7 × 105 cellen). Dit verschil in geëxtraheerde opbrengsten was consistent met eerdere rapporten. Dit suggereert dat de hoeveelheid RNA die kan worden geëxtraheerd uit FFPE-weefsel slechts een fractie vertegenwoordigt van wat kan worden verkregen uit vers ingevroren weefsel [9]. De resterende verknopingen in elk RNA-molecuul die niet zijn verwijderd door proteïnase K-digestie, voorkomen dat dit RNA wordt geëxtraheerd (Figuur 3). Hoe langer een RNA-molecuul is, hoe groter de kans dat er nog steeds een verknoping bestaat na de proteïnase K-digestieprocedure. Daarom zijn kleine RNA-moleculen vatbaarder voor extractie dan grotere mRNA-moleculen, wat resulteert in een hogere expressie van miRNA in FFPE in vergelijking met die in snel ingevroren.

Een schematische weergave van de impact van cross-links op RNA-extractie. In FFPE-materialen is RNA chemisch gemodificeerd door methylolgroepen om verknopingen met eiwit te vormen. Digestie met proteïnase K [6] gevolgd door kolomelutie is de gebruikelijke methode om RNA uit FFPE te extraheren. Een fractie van RNA blijft echter ongevoelig voor extractie vanwege niet-verwijderde verknopingen. Hoe langer een RNA-molecuul is, hoe groter de kans dat er verknopingen overblijven na de verteringsprocedure. Daarom is het gemakkelijker om kleine RNA-moleculen te extraheren dan grotere uit archiefmateriaal.

Betrouwbaarheid van miRNA in FFPE

Het is aannemelijk dat miRNA-soorten minder gevoelig zijn voor RNA-degradatie geassocieerd met weefselverwerking dan gebeurt met mRNA, en dit vormde de hypothese die in deze studie moest worden getest. We vonden een goede correlatie van miRNA-expressieniveaus tussen FFPE en snel ingevroren cellen met R2 > 0,95. Onze gegevens toonden aan dat, voor de meeste miRNA's, de expressie in FFPE vergelijkbaar is met snel ingevroren cellen. 65,58% van de miRNA's vertoonden ΔΔCts in een bereik tussen +/- 1 wat aangeeft dat deze genormaliseerde profielen in wezen identiek waren tussen de twee monsters.

Er waren echter enkele afgelegen gegevens waarbij er een slechte correlatie was tussen expressieprofielen voor de gepaarde snel bevroren en FFPE-monsters. De meest significante hiervan was mir-146 met verminderde expressie en mir-302b* met verhoogde expressie. Deze veranderingen kunnen mogelijk optreden tijdens de formalinefixatieprocedure of kunnen ook worden veroorzaakt door postfixatiebehandeling. mir-146-overexpressie is gevonden in PTC-weefsels [12] en er werd ook gesuggereerd dat het betrokken is bij cellulaire stress [13] en aangeboren immuunresponsen [14]. Interessant genoeg vonden we dat het was afgenomen in met FFPE geëxtraheerde Nthy-ori-cellen. Voor die miRNA's tot overexpressie is het mogelijk dat voorlopers van miRNA door RNase zijn gesplitst om positieve signalen te produceren, omdat FFPE-blokken vaak bij kamertemperatuur worden bewaard in afwezigheid van een RNase-vrije omgeving. Als alternatief kan verhoogde cellulaire stress na het oogsten en tijdens het fixatieproces hebben bijgedragen aan de veranderde expressiepatronen in specifieke miRNA's. In deze gevallen zou het FFPE-materiaal nog steeds kunnen worden gebruikt om relatieve miRNA-expressiepatronen te vergelijken als een reeks bekende blokken gelijktijdig of op dezelfde manier zou worden gefixeerd en behandeld.


Kan RNA worden geëxtraheerd uit in formaline gesuspendeerd weefsel? - Biologie

Proteomische analyse van in formaline gefixeerd, in paraffine ingebed (FFPE) weefsel zou retrospectief biomarkeronderzoek mogelijk maken van dit enorme archief van pathologisch gekarakteriseerde klinische monsters die wereldwijd bestaan. Deze FFPE-weefsels zijn echter ongevoelig voor proteomische onderzoeken waarbij veel geavanceerde methoden worden gebruikt, grotendeels vanwege het hoge niveau van covalent verknoopte eiwitten die voortkomen uit formalinefixatie. Er is een nieuwe weefselmicrodissectietechniek ontwikkeld en gecombineerd met een methode om oplosbare peptiden rechtstreeks uit FFPE-weefsel te extraheren voor massaspectrale analyse van prostaatkanker (PCa) en goedaardige prostaathyperplasie (BPH). Honderden eiwitten uit PCa- en BPH-weefsel werden geïdentificeerd, waaronder verschillende bekende PCa-markers zoals prostaatspecifiek antigeen, prostaatzuurfosfatase en macrofaagremmend cytokine-1. Kwantitatieve proteomische profilering met behulp van stabiele isotooplabeling bevestigde vergelijkbare expressieniveaus van prostaatspecifiek antigeen en prostaatzuurfosfatase in BPH- en PCa-cellen, terwijl de expressie van macrofaagremmend cytokine-1 groter bleek te zijn in PCa in vergelijking met BPH-cellen.


FFPE versus FF-monsteranalyse

Om de robuustheid van het DASL WG-platform voor het analyseren van FF- en FFPE-monsters te beoordelen, werd de correlatie tussen verschillende monstertypen berekend. Het varieerde tussen 0,83 en 0,89 voor alle probes, en verbeterde tot 0,96𠄰.98 na genselectie die werd uitgevoerd zoals beschreven in de sectie methoden (Fig. .

Scatterplots die correlaties van genexpressie tussen FF- versus FFPE-monsters laten zien, beoordeeld met behulp van de DASL WG-assay, na selectie van de best presterende sondes

Hiërarchische clustering met behulp van de best presterende sondes vertoonde een significante homogeniteit, waarbij profielen van vier van de monsters (99085, 99028, 99066 en 99025) samen clusterden, ongeacht de oorsprong (Fig.  3 ). Er waren uitschieters, maar dit waren meestal monsters met een lager aantal betrouwbaar gedetecteerde genen.

Hiërarchische clustering van monsters beoordeeld met behulp van DASL WG-assays. FFPE & FF-monsters beoordeeld met behulp van de DASL WG-assay geclusterd in de meeste monsters (opmerking 99028ਏ is een uitbijter omdat er zeer weinig probes zijn gedetecteerd)

DASL WG-assay en Illumina BeadArray

De correlatie tussen alle sondes in de DASL WG en BeadArray werd beoordeeld om de twee platforms te vergelijken. De correlatie varieerde tussen 0,80 en 0,82, en verbeterde tot 0,83𠄰.89 wanneer alleen de best presterende probes werden gebruikt voor de analyse (tabel  1 ).

Hoewel de DASL WG-assaygegevens (met FFPE- en FF-monsters) en de BeadArray (met alleen FF-monsters) twee onafhankelijke platforms zijn, toonde hiërarchische clustering met alle sondes aan dat monsters gegroepeerd waren volgens de RNA-monsterbron en het gebruikte arrayplatform. In feite waren alle FFPE-monsters dichter bij elkaar in de hiërachische clusterstructuur in vergelijking met FF-monsters die waren beoordeeld met de BeadArray. Interessant is dat de FF-monsters die zijn beoordeeld door Illumina BeadArray en DASL WG niet naast elkaar zijn geclusterd, maar eerder in twee verschillende groepen.

Toen de analyse werd herhaald met alleen de best presterende sondes (zoals beschreven in Methoden), kwamen FF- en FFPE-monsters samen geclusterd overeen (Fig.਄). Dit is een van de eerste onderzoeken die deze significante overlap robuust aantoont met DASL en BeadArray. Vier van de vijf tumoren waarin genexpressie werd beoordeeld met behulp van zowel illumina BeadArray als DASL WG waren samen geclusterd.

Hiërarchische clustering van FF- en FFPE-monsters beoordeeld met behulp van de DASL WG-assay, en van FF-monsters beoordeeld met behulp van de Illumina BeadArray. Dit toont significante clustering van FF- en FFPE-samples, ongeacht of de DASL WG of de BeadArray (alleen aangegeven met een nummer) worden gebruikt

Gene-ontologie-analyse werd uitgevoerd om de sondes te beoordelen die in de FF- en FFPE-monsters tegenstrijdig waren om een ​​beter begrip te krijgen van de betrokken biologische processen (aanvullend bestand 1). Hieruit bleek dat wat betreft het biologische proces: het primaire metabolische proces en het nucleïnezuur metabolische proces de twee toppers waren in deze categorie. Terwijl Poly (A) RNA-binding en heterocyclische RNA-binging de bovenste twee moleculaire functies waren die in deze groep waren verrijkt.


Verbetering van de co-extractie van DNA en RNA uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) monsters

Het verkrijgen van hoogwaardig en hoogrenderend DNA of RNA is een uitdaging, aangezien nucleïnezuren in FFPE-weefselmonsters vaak gefragmenteerd zijn en vatbaar zijn voor chemische modificaties. Co-extractie is gunstig omdat monsters beperkt kunnen zijn. Hoewel er veel kits zijn om het DNA of RNA uit FFPE-monsters te zuiveren, zijn er maar een paar die zowel DNA als RNA uit hetzelfde monster kunnen zuiveren.

In dit webinar kijken we naar vergelijkingen van drie nucleïnezuurisolatiekits en leren we over de verschillende nucleïnezuurextractiemethodologieën om DNA en RNA samen te extraheren uit hetzelfde FFPE-monster en vergelijken we de analyse van hun opbrengst, kwaliteit en NGS-gegevens.

Schakel JavaScript in om deze video te bekijken en overweeg te upgraden naar een webbrowser die HTML5-video ondersteunt

Gepresenteerd door:

Nelson Cotrim

Nelson Cotrim (MSc) is a Product and Application Scientist at Omega Bio-tek, Inc, responsible for providing technical support for customers and distributors as well as installing, validating and training of nucleic acid purification solutions on high throughput automated platforms. Previously, he served as Research Assistant at Oxford Nanoimaging and Development Scientist at Healthcare Diagnostics where he developed the point of care diagnostic devices based on either nucleic acid amplification or using single-molecule fluorescence techniques. Nelson obtained his Masters of Science in Genetics and Molecular Biology from the University of São Paulo, Brazil working with human genetic diseases and population genetics in the African-Brazilian isolated population. He has served as a Genetic Technologist at the Institute of Medical Genetics analyzing results of NGS and Sanger sequencing assays for human genetic disease diagnostics. He has also authored several peer-reviewed journal papers.


Improving DNA and RNA co-extraction from Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples

Obtaining high quality and high yielding DNA or RNA is challenging since nucleic acids in FFPE tissue samples are often fragmented and prone to chemical modifications. Co-extraction is beneficial as samples may be limited. While there are many kits to purify either the DNA or RNA from FFPE samples, only a few can purify both DNA and RNA from the same sample.

In this webinar, we look at comparisons of three nucleic acid isolation kits and learn about the different nucleic acid extraction methodology to co-extract DNA and RNA from the same FFPE sample and comparing analysis of their yield, quality, and NGS data.

To view this video please enable JavaScript, and consider upgrading to a web browser that supports HTML5 video

Presented by:

Nelson Cotrim

Nelson Cotrim (MSc) is a Product and Application Scientist at Omega Bio-tek, Inc, responsible for providing technical support for customers and distributors as well as installing, validating and training of nucleic acid purification solutions on high throughput automated platforms. Previously, he served as Research Assistant at Oxford Nanoimaging and Development Scientist at Healthcare Diagnostics where he developed the point of care diagnostic devices based on either nucleic acid amplification or using single-molecule fluorescence techniques. Nelson obtained his Masters of Science in Genetics and Molecular Biology from the University of São Paulo, Brazil working with human genetic diseases and population genetics in the African-Brazilian isolated population. He has served as a Genetic Technologist at the Institute of Medical Genetics analyzing results of NGS and Sanger sequencing assays for human genetic disease diagnostics. He has also authored several peer-reviewed journal papers.


Extra informatie

Bijdragen van auteurs

JL performed the RNA extraction and TaqMan ® analysis and wrote original and final versions of the manuscript. PS, SC helped with the extraction and TaqMan ® analysis. PS, RF, KD helped draft the manuscript. KD, SA carried out cell culture. MP, SG helped with the analysis of the data. JOL and OS conceived the study and helped write the original and final versions of this manuscript. Alle auteurs hebben het definitieve manuscript gelezen en goedgekeurd.


Bekijk de video: How to isolate RNA from tissue or cells (Januari- 2022).