Informatie

Is het AT- of GC-gehalte belangrijk bij elektroforese?


Zal het een verschil maken in loopsnelheid als we monsters van hetzelfde aantal bases maar verschillende AT-GC-inhoud gebruiken?


Op polyacrylamide maakt het wel een verschil. A en C zijn sneller, terwijl G en T langzamer zijn.

Afbeelding uit publicatie:

De "standaarden" zijn AAA/TTT/GGG/CCC-moleculen.


Praktisch gezien heb ik nog nooit een verschil gezien, maar de agarosegels die gewoonlijk in het lab worden gebruikt, hebben niet de hoogste resolutie. Er is één artikel waaruit blijkt dat de vorm (A- of B-vorm) en het GC-gehalte een rol spelen, aangezien DNA-moleculen met een hoger GC-gehalte minder flexibel zijn en daardoor meer problemen hebben om door de agarosematrix te komen. Interessant artikel, maar waarschijnlijk niet erg relevant in het lab (onder "gerelateerde publicaties" aan de rechterkant van de PubMed-site vind je meer over dit onderwerp):

Er is echter een techniek die gebruik maakt van de verschillende GC-inhoud van DNA-monsters. Het wordt "denaturerende gradiëntgelelektroforese" genoemd en maakt gebruik van gradiënten (chemisch of temperatuur) om DNA op de gel te denatureren. Afhankelijk van het GC-gehalte gebeurt dit eerder of later, wat het migratiepatroon beïnvloedt (gedenatureerd DNA is veel groter en langzamer). Zie hier voor meer details.


DENATURING GRADIENTNT GEL ELEKTROPHORESE (DGGE): EEN OVERZICHT

Stel je een scenario voor waarin je een patiënt hebt met een levensbedreigende infectie. Een dergelijke patiënt kan onmiddellijke antimicrobiële therapie nodig hebben. In de klinische microbiologie is er echter een constante race tegen de klok bij het identificeren van deze ziekteverwekkende organismen, zodat een effectieve behandeling kan worden geboden. In feite is het vaak pas na het overlijden van een patiënt dat het ziekteverwekkende organisme wordt geïdentificeerd. Dit komt vooral omdat traditionele kweekmethoden omslachtig kunnen zijn en in het geval van gemengde culturen andere analyses nodig zijn om micro-organismen op soortniveau te identificeren. Alles bij elkaar genomen kan het hele proces tijdrovend zijn, waarbij soms meer dan een maand nodig is om het ziekteverwekkende organisme nauwkeurig te identificeren (2).

Het is daarom belangrijk om manieren te vinden om deze problemen op te lossen die worden gevonden in uitgebreide kweekmethoden, en PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) is zo'n manier. In wezen omvat PCR-DGGE amplificatie van DNA door geslachtsspecifieke primers die zich richten op 16S rDNA-sequenties en de daaropvolgende differentiatie van dit DNA op DGGE-gel (1-5).

DNA is een molecuul dat verantwoordelijk is voor het behoud van genetische informatie over soorten en door de tijd heen. Het bestaat uit een betekenisvolle rangschikking van chemicaliën die nucleotiden worden genoemd en die worden gesymboliseerd door "A", "T", "C" en "G". Deze arrangementen vertellen ons een verhaal van elk organisme of individu, in die zin dat de code die ze produceren een gedetailleerd instructieboek voor dat organisme of individu vertegenwoordigt. Elke verandering die in deze sequentie wordt geïntroduceerd, wordt een mutatie genoemd, en hoewel mutaties willekeurig plaatsvinden, blijven velen bestaan ​​als een organisme "acclimatiseert" aan een nieuwe omgeving. Daarom zou het observeren en begrijpen van deze mutaties ongetwijfeld ons begrip van resterende en voorbijgaande organismen in verschillende omgevingen verbeteren wanneer observatie moeilijk is. Dit zou bijvoorbeeld nuttig zijn voor het monitoren van microbiële populaties, waar kweekafhankelijke methoden tekortschieten.

Denaturerende gradiëntgelelektroforese (DGGE) is zo'n techniek die dit probeert te doen. Deze moleculair-biologische benadering is een methode voor het nemen van vingerafdrukken die heeft geleid tot revolutionaire veranderingen in veel van de traditionele routines die worden gebruikt bij het beoordelen van microbiële populaties (1). Daarom zal dit artikel kort een aantal toepassingen toelichten waarbij de techniek betrokken is en ook onderzoeken hoe DGGE in het algemeen werkt.

Toepassingen van PCR-DGGE

PCR-DGGE is geclassificeerd als onderdeel van de nieuwe discipline van de moleculaire microbiële ecologie (5). Microbiële ecologie is gericht op het bestuderen van interacties tussen micro-organismen en tussen micro-organismen en hun omgeving. Het gaat om een ​​langetermijnstudie, waaronder verschillende en talrijke analyses van milieumonsters (5). Conventionele klonerings-, hybridisatie- en kweekmethoden zoals hierboven vermeld zijn echter niet altijd praktisch voor dergelijke onderzoeken. Bovendien geven deze technieken geen informatie over de dynamiek van de microbiële populaties in complexe ecosystemen en mogelijke effecten van veranderingen in het milieu op dergelijke populaties (4, 5, 6). Het belangrijkste is dat deze methoden een uitgebreide kennis van de micro-organismen vereisen om aangepaste sondes te ontwikkelen die gericht zijn op bepaalde individuen onder verschillende populaties (5).

PCR-DGGE heeft het voordeel dat er geen voorkennis over microbiële populaties nodig is. Het is een benadering van vingerafdrukken die een patroon van genetische diversiteit kan genereren in complexe microbiële ecosystemen zoals maagdarmkanaal, bodem, sedimenten, diepe zeeën, rivieren, warmwaterbronnen en biofilms (4, 5). Een groot voordeel van deze methode is het potentieel om veranderingen die zich voordoen in verschillende microbiële gemeenschappen, die verschillende behandelingen of modificaties ondergaan, visueel te profileren en te volgen. Het is een snelle en efficiënte scheidingstechniek van DNA-sequenties van dezelfde lengte (geamplificeerd door PCR), die slechts een enkele basepaarmodificatie kan variëren (4, 5, 6).

Bovendien is PCR-DGGE een flexibele methode die een unieke combinatie van verschillende benaderingen mogelijk maakt voor een nauwkeurigere identificatie van bijvoorbeeld functionele genen die aanwezig zijn in bepaalde bacteriepopulaties of specifieke bacteriesoorten door gebruik te maken van hybridisatie of soortspecifieke probes (2, 4 , 5). Deze methodologie kan worden gebruikt in diverse vakgebieden, zoals klinische en milieumicrobiologie en voedselveiligheid.

PCR-DGGE in klinische microbiologie

Voorbeelden van DGGE-toepassingen in de klinische microbiologie zijn er in overvloed. DGGE stond bijvoorbeeld de identificatie toe van meer dan 65 Mycoplasma soorten van menselijke en veterinaire oorsprong in minder dan 24 uur (7). Mycoplasma's zijn veeleisende organismen die vele weken nodig hebben om te kweken en andere serologische tests om te worden geïdentificeerd. Ze veroorzaken verschillende ziekten die verband houden met longontsteking, artritis, conjunctivitis, onvruchtbaarheid en abortus (7). Deze toepassing van PCR-DGGE kan mogelijk aanzienlijke besparingen opleveren in tijd, leven en behandelingskosten.

Een andere belangrijke prestatie was dat DGGE is opgericht om een ​​reëel potentieel te hebben bij het screenen van een groot aantal patiënten voor snelle en betrouwbare identificatie van schadelijke veranderingen in beide borstkankergenen BRCA1 en BRCA2. (8). Vandaar dat PCR-DGGE de detectie van talrijke mutaties mogelijk maakte en het bestaan ​​van niet-geclassificeerde varianten aan het licht bracht die niet eerder waren gerapporteerd (8). Deze methode kon ook aantonen dat dieren, zoals de Nijlkrokodil, baviaan, rode panda, wolf en Taiwanese schoonheidsslang, ook besmet konden worden door Helicobacter soorten, bacteriën waarvan vermoed wordt dat ze verantwoordelijk zijn voor maagzweren (9).

PCR-DGGE in milieumicrobiologie en voedselveiligheid

PCR-DGGE is ook een nuttig hulpmiddel bij het bestuderen van complexe microbiële gemeenschappen zoals het maagdarmkanaal (GI) van voedselproducerende dieren. Voedselproducerende dieren zijn dieren die worden gefokt voor de productie van melk, vlees en eieren. Deze dieren kunnen in hun maagdarmkanaal ziekteverwekkende organismen in de hele productieketen naar de detailhandelsmarkt en van de detailhandelsmarkt naar de eettafel van de consument vervoeren (10). Het is daarom erg belangrijk om de exacte microbiële populaties van het maagdarmkanaal van voedselproducerende dieren op te helderen. Dit zal een betere controle mogelijk maken van de uitscheiding van dodelijke bacteriestammen in mest die wordt gebruikt als meststof voor producten zoals fruit en groenten.

De recente uitbraak van E. coli op spinazie in Californië is een pijnlijke herinnering dat zelfs vegetariërs niet veilig zijn voor de schade die wordt veroorzaakt door een verslechterde gezondheidstoestand van voedselproducerende dieren. De behoefte aan snelle en nauwkeurige methoden voor het screenen van totale microbiële populaties in complexe ecosystemen is duidelijker dan ooit. PCR-DGGE is een krachtig hulpmiddel gebleken bij het beoordelen van de totale darmmicrobiële populaties en werd ook gebruikt om voorheen onbekende bacteriesoorten in het maagdarmkanaal van dieren te detecteren (1, 2, 9, 11). Het begrijpen van de relatie tussen de gastheer en de ziekteverwekkende organismen zal ons zeker helpen bij het definiëren van efficiënte bestrijdingsmaatregelen voor pathogenen. Dit is van het grootste belang bij voedselveiligheid en voedselverwerking, waar kwaliteitscontrole- en -borgingsprogramma's bekwame methoden vereisen om de overdrachtscyclus van levensbedreigende microben te stoppen.

Last but not least werd PCR-DGGE gebruikt om complexe ecosystemen zoals rivieren, zeeën, bodems en diepzee hydrothermale bronnen te onderzoeken (4, 5, 12, 13). Het begrijpen van complexe microbiële populaties zou ons zeker helpen bij snelle besluitvorming met betrekking tot adequate behandeling en andere grote interventies die erop gericht zijn de wereld een betere en veiligere plek te maken om te leven.

Ten eerste worden DNA-fragmenten van een monster dat meerdere organismen bevat, geamplificeerd met behulp van de PCR-techniek (klik op de volgende link voor meer informatie over PCR.) Deze geamplificeerde producten bevatten over het algemeen sequenties die goed geconserveerd zijn van organisme tot organisme - bijvoorbeeld sequenties voor de 16S rDNA zijn een veel voorkomende keuze. Deze verzameling fragmenten wordt vervolgens onderworpen aan de DGGE-component van de procedure.

DGGE is een bepaald type gelelektroforese waarbij een constante hitte (ongeveer 60ºC) en een toenemende concentratie van denaturerende chemicaliën worden gebruikt om DNA-moleculen te dwingen zich af te wikkelen. Een snelle blik op elektroforese leert ons dat dit een scheidingstechniek is die gebaseerd is op de elektrische lading, vorm en molecuulgewicht van deeltjes zoals DNA, eiwitten en RNA (3). In DGGE wordt DNA, dat negatief geladen is, aangetrokken door de positieve elektrode en gedwongen te migreren door de poriën van een polyacrylamidegel. Zodra het de concentratie van denaturerende reagentia bereikt waarbij het afwikkelt, zou het zijn gesmolten. Dit bepaalt de smeltdomeinen (4, 5), die worden gedefinieerd als stukken basenparen met een identieke smelttemperatuur (4). Met andere woorden, basenparen gevormd door nucleotiden A (adenine) en T (thymine), en die gevormd door C (cytosine) en G (guanine) worden chemisch uit elkaar gesmolten. Wat er in feite gebeurt, is dat de waterstofbinding tussen de basenparen wordt verbroken door de temperatuur en de toenemende gradiënt van denaturerende chemicaliën (ureum en formamide) (4, 5). Elke variatie van DNA-sequenties binnen deze domeinen zal resulteren in verschillende smelttemperaturen, waardoor verschillende sequenties op verschillende posities in de gel migreren (4). Dit geeft DGGE het vermogen om onderscheid te maken tussen gemuteerde en wildtype sequenties zonder voorafgaande kennis van wat deze sequenties zijn, wat rechtvaardigt waarom deze methode wordt gebruikt om mutaties binnen nauw verwante organismen te detecteren (1, 2).


Figuur 1: een voorbeeld van een DGGE-gel met bandsamenstellingen van verschillende populatiemonsters, representatief voor complexe microbiële ecosystemen. Elke band in elke baan vertegenwoordigt een met 16S geamplificeerd product dat migreert naar een unieke positie in de gel, die op een sequentieafhankelijke manier smelt.

Deze scheiding wordt ook aanzienlijk geholpen wanneer een korte reeks G's en C's (ongeveer 40 nucleotiden), vaak GC-clamp genoemd, aan één uiteinde van de geamplificeerde DNA-producten wordt bevestigd (4, 6). Dit kan worden gedaan door deze GC-sequentie op te nemen in een van de primers die worden gebruikt voor het amplificeren van de 16S-rDNA-fragmenten.

DGGE is ontegensprekelijk een waardevolle benadering bij het op grote schaal screenen van complexe ecosystemen en het in korte tijd analyseren van verschillende milieumonsters. Met behulp van deze techniek kan de diagnose van opkomende infecties eenvoudiger en sneller worden en kan nu ook de identificatie van niet-cultiveerbare pathogenen worden vergemakkelijkt. Hoewel er beperkingen zijn, is DGGE een interessante en unieke benadering die vele moleculair-biologische hulpmiddelen samenbrengt, en de beperkingen zijn voornamelijk te wijten aan het feit dat het nog steeds een relatief nieuwe techniek is. Indien verbeterd,

1. McAuliffe L, Ellis RJ, Lawes JR, Ayling RD, Nicholas RA. 2005. 16S rDNA PCR en denaturerende gradiëntgelelektroforese een enkele generieke test voor het detecteren en differentiëren van Mycoplasma-soorten. J Med Microbiol. 54 (Pt 8): 731-9.

2. Walter J, Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S, Loach DM, Munro K, Alatossava T. 2000. Detectie en identificatie van gastro-intestinale Lactobacillus-soorten met behulp van denaturerende gradiëntgelelektroforese en soortspecifieke PCR-primers. Appl Environ Microbiol. 66(1):297-303.

3. Creighton, Thomas C. 1999. Encyclopedia of Molecular Biology, Volumes 1-4. John Wiley '038 Zonen.

4. Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. 1993. Profilering van complexe microbiële populaties door denaturerende gradiëntgelelektroforese-analyse van met polymerasekettingreactie geamplificeerde genen die coderen voor 16S-rRNA. Appl Environ Microbiol. 59(3):695-700.

5. Muyzer Gerard en Smalla Kornelia. 1998. Toepassing van denaturerende gradiëntgelelektroforese (DGGE) en temperatuurgradiëntgelelektroforese (TGGE) in microbiële ecologie. Antonie van Leeuwenhoek. 73: 127-141.

6. Sheffield VC, Cox DR, Lerman LS, Myers RM. 1989. Bevestiging van een G+C-rijke sequentie van 40 basenparen (GC-clamp) aan genomische DNA-fragmenten door de polymerasekettingreactie resulteert in een verbeterde detectie van enkelvoudige baseveranderingen. Proc Natl Acad Sci U S A. 86(1):232-6.

7. McAuliffe Laura, Ellis Richard J, Lawes Jo R, Ayling Roger D en Nicholas Robin AJ. 2005. 16S rDNA PCR en denaturerende gradiëntgelelektroforese een enkele generieke test voor het detecteren en differentiëren van Mycoplasma-soorten. J Med Microbiol 54:731-739.

8. van der Hout Annemarie H., van den Ouweland Ans MW, van der Luijt Rob B., Gille Hans JP, ¨lle Bodmer Danie, Bru¨ggenwirth Hennie, Mulder Inge M., van der Vlies Pieter, Elfferich Peter, Huisman Maarten T., ten Berge Annelies M., Kromosoeto Joan, Jansen Rumo PM, van Zon Patrick HA, Vriesman Thyrsa, Arts Neeltje, Boutmy-de Lange Majella, Oosterwijk Jan C., Meijers-Heijboer Hanne,. Ausems Margreet GEM, Hoogerbrugge Nicoline, Verhoef Senno, Halley Dicky JJ, Vos Yvonne J., Hogervorst Frans, Ligtenberg Marjolijn en Hofstra Robert MW 2006. Een DGGE-systeem voor uitgebreide mutatiescreening van BRCA1 en BRCA2: toepassing in een Nederlandse kankerkliniek Instelling. Menselijke mutatie. 27(7):654-666.

9. Al-Soud Waleed Abu, Bennedsen Mads, W Stephen L. On, Ouis Ibn-Sina, Vandamme Peter, Nilsson Hans-Olof, Ljungh Åsa en Wadström Torkel. Beoordeling van PCR-DGGE voor de identificatie van diverse Helicobacter-soorten en toepassing op fecale monsters van dierentuindieren om de prevalentie van Helicobacter te bepalen. J Med Microbiol 52 (2003), 765-771

10. Nationale Onderzoeksraad. Comité voor drugsgebruik bij voedseldieren. Panel voor diergezondheid, voedselveiligheid en volksgezondheid. Raad over Landbouw. Voedsel- en Voedingsraad. Het gebruik van medicijnen bij voedseldieren. Voordelen en risico's. Washington, DC: National Academy Press 1999.

11. Gong Jianhua, Forster Robert J., Yu Hai,. Chambers James R, Sabour Parviz M., Wheatcroft Roger en Chen Shu. 2002. Diversiteit en fylogenetische analyse van bacteriën in het slijmvlies van kip ceca en vergelijking met bacteriën in het cecal lumen. FEMS Microbiologie Brieven. 208(1):1-7.

12. Nakatsu Cindy H., Torsvik Vigdis en Øvreås Lise. Bodemgemeenschapsanalyse met behulp van DGGE van 16S rDNA Polymerase Chain Reaction-producten. Soil Science Society of America Journal 64:1382-1388.

13. Muyzer G, Teske A, Wirsen CO, Jannasch HW. 1995. Fylogenetische relaties van Thiomicrospira-soorten en hun identificatie in diepzee hydrothermale ventilatiemonsters door denaturerende gradiëntgelelektroforese van 16S rDNA-fragmenten. Boog Microbiol. 164(3):165-72.


MATERIALEN EN METHODES

Toegewezen leesbestanden

De belangrijkste dataset die we gebruiken, bestaat uit twee DNA-monsters van een patiënt met eierstokkanker: een monster van de tumor en een ander normaal monster (van witte bloedcellen). Elk van deze DNA-monsters werd omgezet in twee afzonderlijke fragmentbibliotheken, die verschilden in de verdeling van de fragmentlengte. Fragmenten werden aan beide uiteinden gesequenced - 75 bp leest aan elk uiteinde - volgens standaard Illumina-procedures. Elk fragment werd vervolgens terug in kaart gebracht naar het menselijke referentiegenoom, op basis van de 5'-lezing. Deze gesequenced leesparen werden toegewezen aan een referentie met behulp van BWA (versie 0.4.9, 15). Menselijke genomen werden toegewezen aan NCBI build 36 versie 3 ( //ftp.ncbi.nih.gov/genomes). De gegevens zijn beschikbaar in het NCBI Sequence Read Archive onder toegangsnummers SRX011739 (tumor) en SRX011777 (normaal). Tenzij anders vermeld, zijn alle plots van chromosoom 1 (chr1) van normaal Lib1. Bovendien analyseerden we een ander monster van een borsttumorcellijn (Figuur 11), gezonde genoombibliotheken die waren gegenereerd onder geoptimaliseerde protocollen (aanvullende figuren S5 en S6) en gegevens van een ChIP-sequencing-experiment van Arabidopsis (aanvullende figuren S7 en S8). Zie Tabel 1 voor details.

Lijst met datasets geanalyseerd in dit artikel

Naam . Typ . Datum . Instituut. Fragmenten a (bp ± SD) . Leest (bp) .
TCGA-13-0723
Normaal Lib 1 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 154 ± 17 75
Normaal Lib 2 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 284 ± 38 75
Tumor Lib 1 Ovariële tumor 4/09 Wassen 173 ± 22 75
Tumor Lib 2 Ovariële tumor 4/09 Wassen 293 ± 31 75
HCC1569 Borsttumor 1/09 UC Berkeley 507 ± 40 45
SRX040660 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 172 ± 19 101
SRX040661 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 173 ± 19 101
ChIP Rep 1 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36
ChIP Rep 2 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36
Naam . Typ . Datum . Instituut. Fragmenten a (bp ± SD) . Leest (bp) .
TCGA-13-0723
Normaal Lib 1 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 154 ± 17 75
Normaal Lib 2 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 284 ± 38 75
Tumor Lib 1 Ovariële tumor 4/09 Wassen 173 ± 22 75
Tumor Lib 2 Ovariële tumor 4/09 Wassen 293 ± 31 75
HCC1569 Borsttumor 1/09 UC Berkeley 507 ± 40 45
SRX040660 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 172 ± 19 101
SRX040661 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 173 ± 19 101
ChIP Rep 1 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36
ChIP Rep 2 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36

Lib1 en Lib2 komen uit hetzelfde monster.

a Mediaan en SD van fragmentlengte zijn gebaseerd op het in kaart brengen van gepaarde uiteinden, indien beschikbaar, of b schattingen van bibliotheekvoorbereiding anderszins.

Lijst met datasets geanalyseerd in dit artikel

Naam . Typ . Datum . Instituut. Fragmenten a (bp ± SD) . Leest (bp) .
TCGA-13-0723
Normaal Lib 1 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 154 ± 17 75
Normaal Lib 2 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 284 ± 38 75
Tumor Lib 1 Ovariële tumor 4/09 Wassen 173 ± 22 75
Tumor Lib 2 Ovariële tumor 4/09 Wassen 293 ± 31 75
HCC1569 Borsttumor 1/09 UC Berkeley 507 ± 40 45
SRX040660 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 172 ± 19 101
SRX040661 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 173 ± 19 101
ChIP Rep 1 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36
ChIP Rep 2 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36
Naam . Typ . Datum . Instituut. Fragmenten a (bp ± SD) . Leest (bp) .
TCGA-13-0723
Normaal Lib 1 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 154 ± 17 75
Normaal Lib 2 Komt overeen met normaal 4/09 Wassen 284 ± 38 75
Tumor Lib 1 Ovariële tumor 4/09 Wassen 173 ± 22 75
Tumor Lib 2 Ovariële tumor 4/09 Wassen 293 ± 31 75
HCC1569 Borsttumor 1/09 UC Berkeley 507 ± 40 45
SRX040660 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 172 ± 19 101
SRX040661 Komt overeen met normaal 9/10 Breed 173 ± 19 101
ChIP Rep 1 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36
ChIP Rep 2 Arabidopsis 7/09 UC Berkeley 100 dollar 36

Lib1 en Lib2 komen uit hetzelfde monster.

a Mediaan en SD van fragmentlengte zijn gebaseerd op het in kaart brengen van gepaarde uiteinden, indien beschikbaar, of b schattingen van bibliotheekvoorbereiding anderszins.

Voor elke bibliotheek resulteerde deze procedure in een lijst met fragmenten. Elk fragment kan worden beschreven door de locatie van het 5'-uiteinde (chromosoom, locatie en streng) en de lengte ervan. De lengte werd afgeleid uit het in kaart brengen van het 3'-uiteinde, gebaseerd op de uitlijning van het gepaarde uiteinde van BWA. Alleen die paren waarin de 5′-uitlezing uniek in kaart was gebracht, werden bewaard (vlag XT:A:U of BWA), omdat de toewijzing van uitlezingen die zijn toegewezen aan meerdere locaties erg gevoelig is voor de volledigheid van de referentie. We hebben echter geen paar weggegooid toen de 3' niet in kaart was gebracht, dus voor het grootste deel van deze analyse is de fragmentenset vergelijkbaar met die verkregen uit single-end gegevens. Alleen waar fragmentlengte expliciet wordt besproken, hebben we fragmenten verwijderd wanneer de 3' niet in kaart was gebracht (∼1% van de fragmenten). Er is geen aanvullende kwaliteitsfiltering toegepast.

Löss-model

Eerdere analyses van GC waren gericht op de relatie tussen het aantal fragmenten en de GC-samenstelling voor bepaalde bin-afmetingen (zie bijvoorbeeld referentie 6, 16). We noemen dit het ‘löss-model’ en beschrijven in het kort hoe we een dergelijke schatting reproduceren. Voor een bepaalde bin (interval van het genoom) is GC de fractie van G- en C-basen in die bin volgens het referentiegenoom. Bin-tellingen zijn het totale aantal (voorwaartse) fragmenten met het 5'-uiteinde in de bin. Om rekening te houden met de uniciteit van sequenties, wordt voor elke positie (basenpaar) in de bak een maat voor de kaartbaarheid berekend. Een locatie wordt ‘mappable’ genoemd als de k -meer van het referentiegenoom beginnend op de locatie wordt niet perfect herhaald op een andere locatie in het genoom, waarbij k is de leeslengte [gecontroleerd door een Python-script met behulp van de Bowtie-mapper ( 17 )]. Alle daaropvolgende analyses worden gedaan in R (18). De GC-biascurve wordt bepaald door löss-regressie van telling door GC (met behulp van het 'löss' R-pakket) op een willekeurige steekproef van 10.000 bins met hoge mappabiliteit (>0.9). De gladheidsparameter voor de löss moet worden afgestemd om curven te produceren die vloeiend zijn maar toch de hoofdtrend in de gegevens vastleggen. We gebruiken 0.3 als de standaardwaarde. De geschatte snelheden voor GC-waarden met te weinig datapunten zijn ingesteld op 0.

Modellen met één positie

We noemen ‘single position models’ die modellen die het ‘mean fragment count’ schatten (de tarief ) voor individuele locaties in plaats van bakken. We beschouwen een familie van dergelijke modellen die het aantal fragmenten koppelt aan GC, waarbij het verwachte aantal fragmenten beginnend (5'-uiteinde) bij x hangt af van de GC-telling in een venster dat begint een bp van x . Figuur 1 illustreert het geval waarin GC wordt berekend vanuit een 4-bp-venster beginnend bij het fragment 5'-uiteinde. Elk dergelijk model kan worden gekenmerkt door de verschuiving een en de lengte ik van zijn 'rijdende' GC-venster. Ween , ik geeft het model aan waarin het aantal fragmenten begint bij x (5′-end) hangt af van de GC tussen x + een en x + een + ik . (We zullen gebruiken GC ( x + een , ik ) voor de GC-telling van de ik bp-venster beginnend bij x + een ). Bijvoorbeeld in W 0, R het aantal fragmenten wordt bepaald door de GC van de eerste R bp van het fragment. Het model Ween , ik heeft ik + 1 snelheidsparameters, λ 0ik , overeenkomend met vensters met gc = 0,…, ik .

Schatting van een enkelvoudig positiemodel. ( EEN ) Toewijsbare posities langs het genoom worden willekeurig bemonsterd (⇓) ( B ) deze posities worden gestratificeerd door de GC-telling in het bijbehorende schuifvenster (hier een = 0, ik = 4) ( C ) het aantal fragmenten (→) met 5'-uiteinde (○) op bemonsterde locaties wordt geteld ( NS ) gemiddelde fragmentsnelheden voor elk stratum worden geschat, waarbij de verhouding wordt genomen tussen het aantal fragmenten en de posities in het stratum. Deze vormen de GC-curve (hier de curve voor een = 75, ik = 50 uit figuur 4 C).

Schatting van een enkelvoudig positiemodel. ( EEN ) Toewijsbare posities langs het genoom worden willekeurig bemonsterd (⇓) ( B ) deze posities worden gestratificeerd door de GC-telling in het bijbehorende schuifvenster (hier een = 0, ik = 4) ( C ) het aantal fragmenten (→) met 5'-uiteinde (○) op bemonsterde locaties wordt geteld ( NS ) gemiddelde fragmentsnelheden voor elk stratum worden geschat, waarbij de verhouding wordt genomen tussen het aantal fragmenten en de posities in het stratum. Deze vormen de GC-curve (hier de curve voor een = 75, ik = 50 uit figuur 4 C).

Het volgende is een beschrijving van onze methode voor het schatten van de parameters voor een model met één positie: Ween , ik . Een grote ( N ≈ 10 miljoen) willekeurige steekproef van toewijsbare locaties wordt uit het genoom genomen. Grote genomische regio's met ofwel nul fragmenttellingen of met tellingen die extreem hoog zijn (>0.99 kwantiel + mediaan) werden uit het monster verwijderd. Het monster wordt gepartitioneerd (gestratificeerd) volgens de GC van het referentiegenoom: als gc = GC ( x + een , ik ) dan positie x is toegewezen aan stratum Sgc . Laten Ngc geef het aantal monsterposities aan dat is toegewezen aan Sgc . Merk op dat de toewijzing aan lagen alleen afhangt van eigenschappen van het model en het referentiegenoom, niet van de sequentiegegevens.

Modellen vergelijken

Bovenstaande (TV) score is een gewogen L1 afstand van het globale gemiddelde, gedeeld door (dus tussen 0 en 1). Met andere woorden, het is de totale variatieafstand tussen de empirische verdeling voor een enkel fragment (onder specifieke GC-categorieën) en een uniforme verdeling. Het meet dus het aandeel fragmenten dat wordt beïnvloed door de stratificatie en is vergelijkbaar tussen datasets. We zoeken naar hoge tv, wat betekent dat tellingen sterk afhankelijk zijn van GC onder een bepaalde stratificatie. Dit zou erop kunnen wijzen dat correctie voor een dergelijk model zou beste correct voor de GC-afhankelijkheid.

Modellen met fragmentlengte

Voorspelde tarieven

In wezen 'egaliseren' we het aantal waargenomen fragmenten met behulp van Ween , ik . Dat wil zeggen, we schatten het aantal fragmenten op x onder het model Ween , ik , door het gemiddelde van al dergelijke getallen gevonden in x 's met dezelfde waarde van GC ( x + een , ik ) (in ons voorbeeld van toewijsbare locaties). Daarom, wanneer we willen verwijderen, d.w.z. corrigeren voor de GC-bias, zoals beoordeeld door Ween , ik Bij x , zouden we het waargenomen aantal fragmenten delen dat afkomstig is van any x door μx . In de praktijk gebruiken we de uiteindelijke correctie zelden bij de resolutie van het enkele basenpaar, maar meestal na aggregatie in bins, zie hieronder.

Evaluatie

Vergelijkingen met Poisson-variatie

RV meet dus hoe goed een model de snelheidsparameters vastlegt en kan niet minder zijn dan de pure Poisson-variantie. We vergelijken de RV van het mappability-model (MR) en de RV van het fragment-GC-model (GR) met een onafhankelijke schatting van de pure Poisson-variantie ( ). Extreem hoge aantallen [ FB > 0,99 kwantiel + mediaan( F )] zijn hieruit verwijderd.

Hoewel we extreem hoge aantallen verwijderen, kunnen varianties nog steeds worden beïnvloed door een relatief kleine set bins met hoge aantallen. We willen de resterende variatie van de verschillende modellen vergelijken op een manier die robuuster is voor die modellen. Naar aanleiding van Ref. ( 20 ), kijken we naar de empirische kwantielkrommen. Voor een bepaald model hebben we tellingen van 1 kb-bakken gegroepeerd volgens hun voorspellingen). We berekenden voor elke groep de waargenomen 0,1 en 0,9 kwantielen. Uitgezet tegen de geschatte snelheid van de groep, vormt elk kwantielniveau een curve. De afstand tussen de curven weerspiegelt de variatie rond de voorspelde gemiddelden. Wanneer deze afstand aanzienlijk groter is dan die van de Poisson, geeft dit aan dat verschillende snelheden werden toegewezen aan dezelfde voorspelde waarde, wat betekent dat veel variatie onverklaard blijft door het model.

Beschikbaarheid van software en gegevens

GCcorrect is een R-pakket dat verkennende analyse-, schattings- en correctiemethoden voor GC-inhoudseffecten implementeert en kan worden gedownload van http://www.stat.berkeley.edu/


Elektroforese: betekenis, definitie en classificatie (met diagram)

De term elektroforese beschrijft de migratie van een geladen deeltje onder invloed van een elektrisch veld (elektro-geladen deeltje en forese-beweging). Veel belangrijke biologische moleculen, zoals aminozuren, peptiden, eiwitten, nucleotiden en nucleïnezuren, bevatten ioniseerbare groepen en daarom bestaan ​​ze bij elke gegeven pH in oplossing als elektrisch geladen soorten, hetzij als kationen of anionen.

Onder de lading van een elektrisch veld zullen deze geladen deeltjes ofwel naar de kathode ofwel naar de an­ode migreren, afhankelijk van de aard van hun netto lading. Dit is een van de meest fundamentele processen die worden gebruikt in alle soorten moleculaire bio- en shyogy- en RDT-experimenten.

Definitie van elektroforese:

Elektroforese is migratie van geladen deeltjes of moleculen in een medium onder invloed van een aangelegd elektrisch veld.

De migratiesnelheid van geladen mol­ecules hangt af van de volgende factoren:

(a) De sterkte van elektrisch veld, grootte en vorm.

(b) Relatieve hydrofobiciteit van het monster.

(c) Ionische sterkte en temperatuur van de buffer.

(d) Moleculaire grootte van het genomen biomolecuul.

(e) Netto ladingsdichtheid van de genomen biomol­cule.

(f) Vorm van het genomen biomolecuul.

Tijdens het elektroforeseproces hebben grote mollenschubben meer moeite om door het ondersteunende medium (d.w.z. gel) te bewegen, terwijl het kleinere medium er meer doorheen beweegt.

Classificatie van elektroforese:

Alle moderne elektroforetische apparaten hebben tegenwoordig ondersteunende media. Een ondersteunend medium is een fysieke ondersteuning waardoor de geladen moleculen worden gescheiden. Het heeft twee primaire functies: adsorptie en moleculair zeven van de genomen moleculen die niet kunnen worden gescheiden.

Nu rijst de vraag waarom een ​​ondersteunend medium moet worden genomen en waarom niet de basisprincipes van elektrochemie en shytry worden gevolgd, waarbij een elektroforetische tank met twee elektroden wordt gebruikt om deze geladen mol en schubben te scheiden. Dit is wat er was gedaan in de dagen van be & shyginning.

Het baanbrekende werk aan elec­troforese door Tiselieus et al. in het jaar 1948 werd alleen in vrije oplossing uitgevoerd. Men realiseerde zich echter al snel dat veel van de problemen die met deze benadering gepaard gaan, met name de nadelige effecten van convectiestromen (stroom veroorzaakt door de uitzetting van een vloeistof, vaste stof of gas naarmate de temperatuur stijgt).

Dit maakt de gescheiden moleculen vervormd en zeer snel en verlegen gerangschikt), zou kunnen worden geminimaliseerd door het medium te stabiliseren. Dit werd bereikt door elektroforese uit te voeren op een poreuze mechanische drager. Vanwege de viscositeit (die afwezig is in de vrije oplossing) vermindert de ondersteunende me­dia de conventiestromen waardoor we de gescheiden moleculen in scherpe zones krijgen.

Enkele van de vaak gebruikte ondersteunende en shying media zijn zetmeel, agar, polyacrylamide en agarose. Afhankelijk van de aanwezigheid of afwezigheid van ondersteunende media kan de elektroforese worden geclassificeerd als vrije elektroforese en zone-elektroforese.

A. Gratis elektroforese:

Bij dit type elektroforese wordt een vrije elektro­lyt in plaats van ondersteunende media genomen. Tegenwoordig is dit type elektroforese achterhaald en wordt het meestal gebruikt in niet-biologische experimenten.

Het is meestal van twee soorten: de micro-elektroforese die meestal wordt gebruikt bij de berekening van zeta-potentialen (een colloïdale prop & shyerty van cellen in een vloeibaar medium) van de cellen en bewegende grenselektroforese die gedurende vele jaren werd gebruikt voor kwantitatieve analyse van complexe mengsels van macromol en schubben, vooral eiwitten.

B. Zone-elektroforese:

Dit is de meest voorkomende elektroforetische techniek van tegenwoordig. Bij dit type elektro­forese wordt het scheidingsproces uitgevoerd op een stabiliserend medium zoals hierboven besproken.

De zone-elektroforese is van de volgende typen:

(b) Celluloseacetaatelektroforese

(c) Capillaire elektroforese

(d) Gelelektroforese, die verder agarosegelelektroforese, SDS PAGE, PFGE en tweedimensionale elektroforese omvat.

C. Papierelektroforese:

Bij dit type elektroforese wordt een filtreerpapier (zoals chromatografiepapier) met een geringe adsorptiecapaciteit en uniforme poriegrootte gebruikt als ondersteunend medium voor het scheiden van monsters onder invloed van een aangelegd elektrisch veld. Tijdens het uitvoeren van papierelektroforese wordt een strook filtreerpapier bevochtigd met buffer en worden de uiteinden van de strook ondergedompeld in bufferreservoirs die de elektroden bevatten.

De monsters worden in het midden van het papier gespot, er wordt hoogspanning toegepast en de vlekken migreren volgens hun lading. Na elec­troforese kunnen de gescheiden componenten worden gedetecteerd door een verscheidenheid aan kleurtechnieken, afhankelijk van hun chemische identiteit.

(a) Serumanalyse voor diagnostische doeleinden wordt uitgevoerd door papierelektroforese.

(b) Spiereiwit (Myosine), ei-eiwit (al­bumine), melkeiwit (caseïne), slangen- en insectengif zijn op bevredigende wijze geanalyseerd met behulp van papierelektroforese.

Het kost veel tijd. Er zijn ongeveer 14-16 uur nodig voor het proces van volledige scheiding.

D. Celluloseacetaatelektroforese:

Het is een aangepaste versie van papierelektroforese & shysis, ontwikkeld door Kohn in 1958. Bij dit type elektroforese worden bacteriologische mem & shybrane-filters van acetaat gebruikt in plaats van regulier chro & shymatografiepapier.

De volgende voordelen zijn van celluloseacetaatstrips ten opzichte van chromatografiepapier:

(a) De celluloseacetaatstrips zijn chemisch zuiver en vrij van lignine en hemicelluloses en werken in het algemeen als barrières bij de vrije beweging van grote moleculen.

(b) Vanwege het lage gehalte aan glucose-celluloseacetaatstrips Eire geschikt voor elektroforese en shysis van polysachariden.

(c) Celluloseacetaat is niet hydrofiel en dit bevat zeer weinig buffer, wat verder helpt voor een betere resolutie in korte tijd.

Het wordt vooral gebruikt voor klinisch onderzoek zoals scheiding van glycoproteïnen, lipopro­teins en hemoglobine uit bloed.

E. Capillaire elektroforese:

Capillariteit van buis met smalle boring wordt gebruikt om de monsters te scheiden op basis van hun grootte: ladingsverhouding. Capillaire elektroforese (CE) is een relatief nieuwe scheidingstechniek in vergelijking met de traditionele technieken zoals agarosegelelektroforese of SDS-PAGE.

Het biedt zeer aantrekkelijke functies die het zowel competitief als een goed alternatief maken. Een van de belangrijkste voordelen van CE ten opzichte van andere scheidingstechnieken is het vermogen om zowel geladen als niet-geladen moleculen te scheiden. In CE wordt de scheiding van analyte-ionen uitgevoerd in een elektrolytoplossing (achtergrondelektrolyt) die aanwezig is in een smal fused-silica capillair.

De uiteinden van het capillair worden ondergedompeld in flesjes (inlaat en uitlaat) gevuld met elektrolytoplossing, die ook elektroden bevatten die zijn aangesloten op een hoogspanningsvoeding (Fig. 3.12). De monsteroplossing wordt als een kleine plug in het capillair gebracht door druk (hydrodynamische injectie) of spanning (elektrokinetische injectie) aan te brengen.

Met de toepassing van hoogspanning (5 – 30 kV) over het capillair, worden zones van analyt gevormd als gevolg van verschillende elektro- en shyforetische mobiliteiten van ionische soorten en migreren ze naar de uitlaatzijde van het capillair. In feite kunnen verschillende ionen worden gescheiden wanneer hun verhouding tussen lading en grootte verschilt. Alvorens het einde van het capillair te bereiken, worden de gescheiden analytbanden direct door de capil­lary-wand gedetecteerd.

(a) Hoge scheidingsefficiëntie

(c) Laag monster- en elektrolytverbruik

Door de kleine diameter van de capillaire buis wordt warmte afgevoerd die een verhoogde diffusie veroorzaakt. Hierdoor is de resolutie niet altijd correct.

CE wordt gebruikt bij de volgende analyse van voedsel, farmaceutische producten en milieuverontreinigende stoffen.

F. Gelelektroforese:

Bij gelelektroforese wordt gel gebruikt als ondersteunend medium voor het scheiden van DNA, RNA of eiwitten onder invloed van elektrische lading. Het wordt meestal uitgevoerd voor analytische doeleinden, maar kan worden gebruikt als een preparatieve techniek om moleculen gedeeltelijk te zuiveren voordat ze worden gebruikt voor andere methoden, zoals massaspecificatie en shytrometrie, PCR, klonen, DNA-sequencing en immunoblotting.

Dit is de meest gebruikte elektroforese in biotechnologische laboratoria en wordt gebruikt voor bijna alle soorten experimenten in RD.

De elektromotorische kracht (EMF) die over de elektroden wordt gegenereerd, duwt of trekt de mol en schubben (nucleïnezuren of eiwitten) door de gelmatrix. De moleculen bewegen naar de anode als ze negatief geladen zijn of naar de kathode als ze positief geladen zijn.

Een typisch apparaat voor gelelektroforese is van twee soorten:

(a) Verticale gelapparatuur:

Het wordt gebruikt voor de scheiding van eiwitten in SDS-PAGE.

(b) Horizontaal gelapparaat:

Het wordt gebruikt voor immuun-elektroforese, iso-elektrische focussering en elektroforese van DNA en RNA in de agarosegel.

Soorten gel-elektroforese:

(a) Agarosegelelektroforese:

Het ondersteunende medium bij dit type elektro- en shyforese is agarosegel. Dit wordt gebruikt voor de elektroforese van nucleïnezuren zoals DNA en RNA.

Wanneer een potentiaalverschil wordt aangelegd over de elektroden van een horizontale elektroforetische tank die agarosegel bevat en biomoleculen (zoals nucleïnezuren) worden geladen, worden ze gescheiden volgens hun moleculaire grootte (grotere moleculen hebben meer moleculaire grootte en kleinere moleculen hebben een kleine moleculaire grootte). grootte) en ga naar hun respectieve elektroden. Hier werkt de agarosegel als zeef.

Zoals in een zeef blijven de grote deeltjes boven en de deeltjes die kleiner zijn dan de poriegrootte er doorheen gaan, zo blijven in de gel de grotere en de volumineuze moleculen achter terwijl de kleinere moleculen sneller en snel naar hun respectieve elektroden bewegen.

Deze professie kan worden voorgesteld als een hardloopwedstrijd. Degene die dunner is en een flexibel en verlegen lichaam heeft, zal eerder op het eindpunt zijn dan degene die dik en volumineus is.

Dit omvat het fysieke lichaam van de experimentele opstelling.

Het is van de volgende drie typen:

(a) Elektroforetische apparatuur:

Hori­zontal Gel Electrophoresis System is ontworpen voor een zeer snelle en duidelijke scheiding van DNA-restrictiefragmenten in agarosegels. Gelapparaten variëren afhankelijk van de fabrikant. Het eenvoudigste apparaat wordt een flatbed horizon­tal-apparaat genoemd. Dit apparaat bestaat uit twee bufferkamers, een pit die uit de agarose wordt gegoten, en een plat horizontaal bed van agarose waarop kleine putjes voor het laden van monsters zijn geplaatst.

Voor een standaard aga­rose-gelelektroforese wordt een spanning van 5 volt per cm gel toegepast (de cm-waarde is de afstand tussen de twee elektroden, niet de lengte van de gel).

Dit is een ultraviolette lichtbak die wordt gebruikt om met ethidiumbromide gekleurd DNA in gels zichtbaar te maken.

2. Chemische componenten:

Dit omvat alle chemische componenten die een rol spelen bij de elektroforese van het biomolecuul.

Agarose is een polysacharide gewonnen uit zeewier. Het is een lineair polymeer bestaande uit afwisselende isomeren van de suiker D- en L-galactose. Agarose smelt ongeveer bij 90°C en geleert ongeveer bij 40°C (Fig. 3.14). Deze gela­tion resulteert in een netwerk van kanalen met een diameter variërend van 50-200nm. De diameters van deze kanalen verminderen de uiteindelijke porositeit van de gel en werken als zeef.

Door gels met verschillende concentraties agar­ose te gebruiken, kan men DNA-fragmenten van verschillende groottes oplossen. Hogere concentraties van agarose vergemakkelijken de scheiding van kleine DNA's, terwijl een lage concentratie van agarose behouden blijft tijdens de scheiding van DNA met een hoger molecuulgewicht. Het wordt meestal gebruikt in concentraties van 0,5 tot 2%.

De gel wordt ondergedompeld in een elektroforesebuffer die ionen levert om een ​​stroom te voeren en een soort buffer om de pH op een relatief constante waarde te houden. Afhankelijk van de grootte van het geëlektroforeerde DNA en de toepassing, kunnen verschillende buffers worden gebruikt voor agarose-elektroforese en -verwijding.

TAE-buffer (of Tris Acetate EDTA) is de meest gebruikte agarosegelelektroforesebuffer. TAE heeft de laagste buffercapaciteit van de buffers, maar TAE biedt de beste resolutie voor groter DNA. TAE vereist ook een lagere spanning en meer tijd.

TBE-buffer (Tris/Borate/EDTA) wordt vaak gebruikt voor kleinere DNA-fragmenten (d.w.z. minder dan 500 bp). Natriumboraat- of SB-buffer is een nieuwe buffer, maar is niet effectief voor het oplossen van fragmenten groter dan 5 kb. SB heeft voordelen in zijn lage geleidbaarheid, waardoor hogere spanningen mogelijk zijn (tot 35 V/cm). Dit zou een kortere analysetijd voor routinematige elektroforese mogelijk maken. Er worden twee soorten buffers gebruikt in het proces van aga­rose-elektroforese.

Elektroforesebuffer:

Dit type buffer wordt gebruikt om de gel die op de horizontale tank is geplaatst, te baden. Gewoonlijk wordt Tris-acetaat-EDTA (TAE) of Tris-boraat-EDTA (TBE) als elektrofoor­sis-buffer genomen.

Dit bevat een dicht medium (bijv. glycerol) om het monster in de monsterputjes te laten vallen, en een of twee volgkleurstoffen, die in de gel migreren en visuele controle van de mate van elektroforese mogelijk maken.

Dit is een volgmiddel dat tot doel heeft het afgescheiden nucleïnezuur te visualiseren na het proces van elec­troforese. In de agarosegel wordt elektro­forese Ethidiumbromide als kleurstof gebruikt. Ethidiumbromide is een fluorescerende en glanzende kleurstof die zich bindt aan DNA en inter­calaten tussen de gestapelde basen.

Bij bestraling met UV-licht met een golflengte van 302 nm, zal ethidium bro­mide fluorescentielicht uitstralen met een golflengte van 590 nm (oranje). Na het proces van elektroforese wordt de gel waargenomen onder de straal van UV-licht geproduceerd door de trans-illuminator. De kleurstof wordt alleen tijdens de voorbereiding aan de gel toegevoegd.

Allereerst wordt agarosepoeder gemengd met elektroforesebuffer tot de gewenste concentratie en vervolgens verwarmd in een magnetron tot het volledig gesmolten is. Meestal wordt op dit punt ethidiumbro­mide aan de gel toegevoegd (eindconcentratie 0,5 mg/ml) om de visualisatie van DNA na elektroforese te vergemakkelijken.

Nadat de oplossing is afgekoeld en geschud tot ongeveer 60°C, wordt deze in een gietschaal gegoten die een monsterkam bevat en men laat ze stollen bij kamertemperatuur. Nadat de gel is gestold, wordt de kam verwijderd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de bodem van de putjes niet wordt gescheurd.

De gel, nog steeds in zijn plastic bakje, wordt horizontaal in de elektroforesekamer ingebracht en net bedekt met buffer. Monsters die DNA bevatten gemengd met laadbuffer worden vervolgens in de monsterputjes gepipetteerd, het deksel en de voedingskabels worden op het apparaat geplaatst en een stroom wordt toegepast.

U moet worden bevestigd dat er stroom vloeit door te kijken naar bellen die van de elektroden komen. DNA zal migreren naar de positieve elektrode, die gewoonlijk rood gekleurd is. Wanneer voldoende migratie heeft plaatsgevonden, worden DNA-fragmenten zichtbaar gemaakt door kleuring met ethidiumbromide.

Deze fluorescerende kleurstof intercaleert tussen basen van DNA en RNA. Het wordt vaak in de gel opgenomen, zodat er kleuring optreedt tijdens de elektroforese, maar de gel kan ook worden gekleurd na elektroforese door deze in een verdunde oplossing van ethidiumbromide te weken.

Om DNA of RNA zichtbaar te maken, wordt de gel op een ul­traviolet trans-illuminator geplaatst. Houd er rekening mee dat DNA in de loop van de tijd in de gel zal diffunderen en dat exa­minatie of fotografie kort na het stoppen van de elektroforese moet plaatsvinden.

Toepassing van Agarose Gel Electrophore & shysis::

1. Scheiding van met restrictie-enzym gedigereerd DNA, inclusief genomisch DNA, voorafgaand aan Southern Blot-overdracht. Het wordt vaak gebruikt voor het scheiden van RNA voorafgaand aan Northern-overdracht.

2. Analyse van PCR-producten na polymerasekettingreactie om te beoordelen op doel-DNA-amplificatie.

3. Schatting van de grootte van DNA-moleculen mogelijk maken met behulp van een DNA-marker of ladder die DNA-fragmenten van verschillende bekende groottes bevat.

4. Staat de ruwe schatting van de hoeveelheid en kwaliteit van DNA toe.

5. De hoeveelheid wordt bepaald met behulp van een lambda-DNA-ladder die specifieke hoeveelheden DNA in verschillende banden bevat.

6. De kwaliteit van DNA wordt beoordeeld door de afwezigheid van strepen of fragmenten (of verontreinigende DNA-banden) waar te nemen.

7. Andere technieken vertrouwen op agarosegel-elec­troforese voor DNA-scheiding, inclusief DNA-fingerprinting.

Voordelen en nadelen van agar & shyose-gelelektroforese::

De voordelen zijn dat de gel gemakkelijk kan worden gegoten en de monsters niet denatureren. De monsters kunnen ook worden teruggevonden.

De nadelen zijn dat gels kunnen smelten tijdens elektroforese, de buffer uitgeput kan raken en dat verschillende vormen van genetisch materiaal in onvoorspelbare vormen kunnen lopen.

Natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamidegelelektroforese wordt meestal gebruikt om eiwitten dienovereenkomstig op grootte te scheiden. Dit is een van de krachtigste technieken om eiwitten te scheiden op basis van hun molecuulgewicht.

Deze techniek maakt gebruik van anionisch detergens natriumdodecylsulfaat (SDS) dat eiwitten dissocieert in hun individuele polypeptidesubeenheden en een uniforme negatieve lading geeft langs elk gedenatureerd polypeptide. SDS vervult ook nog een andere belangrijke taak.

Het dwingt polypeptiden om hun conformaties uit te breiden om een ​​vergelijkbare lading: massaverhouding te bereiken. SDS-behandeling elimineert daarom de effecten van vormverschillen, zodat de ketenlengte, die hun moleculaire massa weerspiegelt, de enige bepalende factor is voor de migratiesnelheid van eiwitten in het proces van elektroforese.

Wanneer deze gedenatureerde polypepen worden geladen aan het kathode-uiteinde van een elektroforetische tank met polyacrylamidegel (als de ondersteunende media) en worden onderworpen aan een elektrisch veld, dan krijgen we duidelijke banden van eiwitten die zijn gerangschikt in een afnemende volgorde van hun moleculaire massa van de kathode naar anode.

De bewegingssnelheid wordt beïnvloed door de poriegrootte van de gel en de sterkte van het elektrische veld. In SDS-PAGE wordt meestal het verticale gelapparaat gebruikt. Hoewel het routinematig wordt gebruikt om eiwitten te scheiden, kan SDS-PAGE ook worden gebruikt om DNA- en RNA-moleculen te scheiden.

Instrumentatie:

Dit omvat het fysieke lichaam van de experimentele opstelling. Het is van de volgende twee soorten:

A. Elektroforetische apparatuur:

Verticale horizontale tank met elektroden, gelcassettes, Teflon-afstandhouders, clips, pipet of sy­ringe, kam, acrylafdekking.

Er is een voeding van 100-200 volt nodig. Dit is ideaal voor het rennen en scheren en het overbrengen van eiwitoplossende gels.

Dit zijn bakjes waarin de gels zijn gekleurd en gemaakt van doorzichtig plastic. Deze zijn bestand tegen de meeste of­ganische kleurstoffen, zilver en andere vlekken.

Dit omvat het volgende:

Als draagmedium wordt SDS-PAGE acrylamide gebruikt. Het is een wit kristallijn poeder, wanneer acrylamide oplost in water, ondergaat het een polymerisatiereactie om een ​​netachtige structuur te vormen die polyacrylamide wordt genoemd. Polyacryl­lamide is een polymeer (CF2CHCONH2-) gevormd uit acrylamide-subeenheden die ook gemakkelijk kunnen worden verknoopt.

Dit type elektroforese heeft een discontinu gelsysteem, d.w.z. we hebben twee verschillende gelsystemen in de elektroforetische tank die fysiek over elkaar zijn geplaatst.

Dit wordt ook wel sepa­rating of running gel genoemd. De scheidingsgel vormt ongeveer 2/3 van de lengte van de gelplaat en wordt bereid met 5-10% acrylamide. De poriën in deze gel (die wordt gevormd nadat het polyacrylamide is verknoopt) zijn talrijk en kleiner in diameter, wat de zeefeigenschappen van deze gel beïnvloedt.

Stapelgel wordt bovenop de oplossende gel gegoten en er wordt een gelkam ingebracht die het putje vormt. Het is de up­per-laag van gel en vormt 1/3 van de gelplaat. Het percentage acrylamide wordt gekozen afhankelijk van de grootte van het eiwit dat men in het monster wil identificeren of onderzoeken.

Hoe kleiner het bekende gewicht, hoe hoger het percentage dat moet worden gebruikt. Over het algemeen is het percentage acrylamide in stapelgel 2-5%. Het is zeer poreus en heeft geen moleculaire zeefwerking.

In SDS-PAGE worden twee soorten buffers gebruikt. Het onderste reservoir (dat de loopgel heeft) heeft aminebuffers. Het wordt aangepast met behulp van HCl. Het bovenste re­servoir (met stapelgel) heeft ook aminebuffers, maar de pH ligt iets boven die van lopende gelbuffer en wordt aangepast met glycine in plaats van HCl.

SDS is het meest voorkomende dissociërende middel dat wordt gebruikt om inheemse eiwitten te dena­ture aan individuele polypep­tides. Wanneer een eiwitmengsel wordt verwarmd tot 100°C in aanwezigheid van SDS, wikkelt het wasmiddel & shygent zich rond het rug & shybone van het polypeptide.

Het bindt aan polypeptiden in een constante gewichtsverhouding van 1,4 g/g polypeptide. In dit proces worden de intrinsieke ladingen van polypeptiden verwaarloosbaar in vergelijking met de negatieve ladingen die worden bijgedragen door SDS. Polypeptiden worden dus na behandeling een staafachtige structuur die een uniforme ladingsdichtheid bezit, dat wil zeggen dezelfde netto negatieve lading per lengte-eenheid.

De vlekken worden gebruikt om de banden van gescheiden eiwitten te zien na de pro­cess van elektroforese. Coomassie Bril­liant Blue R-250 (CBB) is de meest populaire eiwitkleuring. Het is een anionische kleurstof, die zich niet-specifiek aan eiwitten bindt.

Pro­teins in de gel worden gefixeerd door azijnzuur en tegelijkertijd gekleurd. De overtollige kleurstof in de gel kan worden verwijderd door te ontkleuren met dezelfde oplossing maar zonder de kleurstof. De eiwitten worden gedetecteerd als blauwe banden op een heldere achtergrond.

De te analyseren eiwitoplossing wordt eerst gemengd met SDS, een anionisch detergens, een an&hyionisch detergens dat de secundaire structuur denatureert. Naast toevoeging van SDS kunnen eiwitten eventueel worden gekookt in aanwezigheid van een reductiemiddel, zoals Di-Thio-Threitol (DTT) of 2-mercapto-ethanol, dat de eiwitten verder denatureert door disulfidebindingen te verminderen, waardoor sommige vormen van tertiaire pro­teïne worden overwonnen het vouwen en opbreken van de quaternaire pro­teïnestructuur (Oligomere subeenheden).

Dit staat bekend als het verminderen van SDS-PAGE en wordt het meest gebruikt. Niet-reducerende SDS-PAGE (geen kook- en reductiemiddel) kan worden gebruikt wanneer de natieve structuur belangrijk is bij verdere analyse (bijv. enzymactiviteit, aangetoond door het gebruik van zymogrammen). De gedenatureerde eiwitten worden vervolgens geladen in de putjes met stapelgel die zijn overstroomd met stapelbuffer.

Dit uiteinde is verbonden met de kathode van de voeding. Vervolgens wordt een elektrische stroom over de gel aangelegd, waardoor negatief geladen eiwitten over de gel naar de anode migreren. Na het oversteken van de stapelgel komen gedenatureerde eiwitten in de loopgel die een eigen buffersysteem heeft (loopbuffer).

Elk eiwit zal, afhankelijk van hun grootte, anders door de gelmatrix bewegen: korte eiwitten passen gemakkelijker door de poriën in de gel, terwijl grotere eiwitten meer moeite hebben.

Nadat de scheiding voorbij is, wordt de gel voorzichtig verwijderd en overgebracht naar de kleurbox en behandeld met de kleurstof, bijvoorbeeld CBB R-250. Overtollige vlekken worden verwijderd door ontkleuring met azijnzuuroplossing. De banden lijken blauw gekleurd te zijn, die vervolgens worden geanalyseerd volgens de behoefte van het experiment.

SDS-PAGE kent vele toepassingen. Het wordt meestal gebruikt voor de volgende doeleinden:

1. Eiwitgrootte vaststellen

3. Bepaling van de zuiverheid van het monster

4. Identificatie van disulfidebindingen

Voordelen van SDS-PAGE:

SDS-PAGE heeft volgende voordelen:

1. De mobiliteit van de moleculen is hoog en de scheiding is snel.

2. Alle eiwitten zijn daarom negatief geladen, ze migreren allemaal naar de anode.

3. De eiwitten die zijn behandeld met SDS-vaste kleurstoffen zijn beter dan de natieve eiwitten.

4. SDS lost alle eiwitten op, inclusief zeer hydrofobe en zelfs gedenatureerde eiwitten.

(C) Pulse Field Gel-elektroforese (PFGE):

Conventionele methoden voor gelelektroforese worden uitgevoerd door DNA-monsters in een vaste matrix (agarose of polyacrylamide) te plaatsen en de moleculen onder een statisch elektrisch veld door de gel te laten migreren. Wanneer DNA-moleculen onder invloed zijn van dit elektrische veld, rekken ze uit en richten ze zich op het veld.

Bij DNA-elektroforese volgens de standaardmethode kunnen DNA-moleculen die groter zijn dan 20 kb echter niet worden gescheiden door agarosegelelektroforese of door SDS-PAGE. Dit wordt gedaan door pulsveldgelelektroforese.

Bij deze techniek wordt de periodieke verandering van oriëntatie van het elektrische veld uitgevoerd. Dit dwingt de grote DNA-mol en schubben in de gel om te ontspannen bij het verwijderen van de eerste en langwerpig om uit te lijnen met het nieuwe veld.

(D) Tweedimensionale elektroforese:

Dit is een zeer gevoelige techniek om een ​​mengsel van polypeptiden te zuiveren.

Het wordt uitgevoerd in twee dimensies:

1 e dimensie scheiding:

Het is waar we een proces uitvoeren dat iso-elektrische focussering wordt genoemd. De netto lading van een eiwit is de som van alle positieve en negatieve ladingen erin. Deze ladingen worden bepaald door ioniseerbare zure en basische zijketens en prothetische groepen van de eiwitten.

Het isolectrische punt (pi) van een polypep­tide is die pH-waarde waarbij de netto lading nul is. Op dit punt kunnen de polypeptiden zich nergens in de gel verplaatsen en maken daar banden. Iso-elektrische focussering is een procedure die wordt gebruikt om het iso-elektrische punt (pi) van een eiwit te bepalen (Fig. 3.18).

Een pH-gradiënt wordt tot stand gebracht door een mengsel van organische zuren en basen met een laag molecuulgewicht, amfolyten genaamd, zichzelf te laten verdelen in een elektrisch veld dat over de gel wordt gegenereerd. Wanneer een pro­teïne-mengsel wordt aangebracht, migreert elk eiwit totdat het de pH bereikt die overeenkomt met zijn pi. Eiwitten met verschillende iso-elektrische punten zijn dus verschillend over de gel verdeeld.

2e dimensie scheiding:

Iso-elektrisch scherpstellen wordt gevolgd door SDS-PAGE, zoals hierboven beschreven. In dit proces zullen de eiwitten van kathode naar anode gaan in afnemende volgorde van hun molecuulmassa (MR).


Capillaire elektroforese – Toepassingen en Procedure

Het is een analytische methode die wordt gebruikt om ionen te scheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit met behulp van een aangelegde spanning. Er zijn verschillende factoren die de elektroforetische mobiliteit aanzienlijk kunnen beïnvloeden, zoals:

De vuistregel is dat hoe groter de veldsterkte, hoe sneller de mobiliteit. Er zijn verschillende soorten elektroforese, maar de meest overheersende is de capillaire elektroforese omdat deze snellere resultaten oplevert en een scheiding met hoge resolutie biedt. (1, 2, 3 en 4)

Afbeelding 1: De afbeelding hierboven laat zien hoe capillaire elektroforese plaatsvindt.

Afbeeldingsbron:wikimedia.org

Wat is het basisprincipe van elektroforese?

Elektroforese is een methode waarbij het monster-ion beweegt door de invloed van aangelegde spanning. Het heeft betrekking op de migratie van geladen ionen in het elektrische veld. In een bepaalde oplossing vloeit de elektrische stroom tussen de elektroden en wordt gedragen door ionen.

Als we naar het principe kijken, worden de geladen moleculen in het elektrische veld geplaatst en migreren ze naar de pool van positief of negatief geladen. Een nucleïnezuur heeft een consistente negatieve lading die wordt verleend door de fosfaatruggengraat en migreert naar de anode. Daarom zal de kracht de beweging van het eiwit naar de kathode of anode versnellen, afhankelijk van de lading. (2, 3 en 4)

Om het proces samen te vatten, wordt het capillair gevuld met een geleidende vloeistof met een aangegeven pH-waarde. De geleidende vloeistof zal dienen als bufferoplossing waarin het monster zal worden gescheiden. Een monster wordt in het capillair geplaatst door middel van een drukinjectie of door middel van elektrokinetische injectie.

Er wordt een hoge spanning over het capillair geplaatst waardoor het monster met verschillende snelheden door het capillair kan bewegen. De positieve componenten gaan naar de negatieve elektrode, terwijl de negatieve naar de positieve elektrode gaan.

Afbeelding 2: Het principe van capillaire elektroforese zoals weergegeven in de afbeelding, waarbij positief geladen ionen de anode worden genoemd en de negatief geladen ionen de kathode.

Afbeeldingsbron:ytimg.com

Wat is het belang van elektroforese?

Elektroforese is een methode die wordt gebruikt door moleculair biologen. Het heeft betrekking op de migratie van een geladen molecuul door de beperkende matrix/gel getrokken door een elektrische kracht. Door middel van elektroforese kunnen laboratoriumprofessionals organische moleculen identificeren en bestuderen voor biomedische analyse. De betekenis van elektroforese omvat het volgende: afbeelding

Antibiotica testen

elektroforese speelt een belangrijke rol bij het testen van antibiotica. Antibiotica zijn nodig om ziekten en infecties te helpen bestrijden. Wat elektroforese doet, is dat het de antilichamen die aanwezig zijn in antibiotica scheidt van verschillende soorten onzuiverheden. Door middel van elektroforese kunnen de onderzoekers de concentratie antibiotica controleren, wat leidt tot een nauwkeurige dosering.

DNA-analyse

Elektroforese staat bekend om zijn bruikbaarheid bij DNA-analyse. Met gel als medium kan de onderzoeker met behulp van een elektrische lading DNA in segmenten vlokken en de moleculen op hun plaats houden op het moment dat de lading wordt verwijderd. Door middel van elektroforese kunnen de onderzoekers moleculen met een hoge resolutie controleren. Daarom zou het gemakkelijk zijn om de structuur van DNA te analyseren.

Vaccin testen

De ontwikkeling van moderne vaccins wordt mogelijk gemaakt met behulp van elektroforese. Het proces van elektroforese is nuttig bij het controleren van de zuiverheid en concentratie van de vaccins. Het maakt het testen van verschillende vaccins met verschillende soorten en niveaus van antilichamen mogelijk. (5, 6 en 7)

Eiwit- en antilichaamanalyse

Bij dit type elektroforese wordt een speciaal proces genaamd immuno-elektroforese gebruikt, waarmee onderzoekers interacties tussen eiwitten en antilichamen kunnen controleren.Door middel van immuno-elektroforese kunnen verschillende soorten immuunaandoeningen worden opgespoord, zoals niergerelateerde ziekten en multiple sclerose.

Het helpt ook bij het detecteren van de interactie van antilichamen met ongebruikelijke eiwitten die in de monsters aanwezig kunnen zijn. Daardoor kunnen we de beste remedies voor behandeling, genezing en beheer voor auto-immuunziekten vinden. (1, 5 en 7)


Fluorescerende ketenbeëindiging en capillaire elektroforese

Fluorescerende chromatogrammen worden gebruikt om de nucleotideketenterminatie te scoren. De amplitude van elke piek komt overeen met de sterkte of zekerheid van de nucleotide-aanroep. Chromatogrambestanden worden meestal naast het sequentiebestand geleverd met de extensie *.ab1 terwijl de sequentiebestanden worden geleverd als een tekstbestand in de vasten formaat. Meer over deze bestanden is te vinden hier . De ab1-bestanden zijn uiterst belangrijk om te analyseren wanneer er onduidelijkheden of fouten in de volgorde zijn. Deze ab1-bestanden kunnen ook worden gebruikt om een ​​kwaliteitsscore toe te kennen aan de basisoproep.

Wanneer er te veel onduidelijkheid in het signaal is door meerdere pieken, zul je vaak een N in plaats van een van de 4 nucleotiden (A,T,C,G).

Deze video (bron: www.yourgenome.org CC-BY ) illustreert het mechanisme van fluorescerende ketenbeëindiging en capillaire elektroforese.


OBSERVATIES EN UITKOMSTEN

Schoolbord elektroforese is door de auteur gebruikt in zes niet-gegradueerde biochemiecursussen voor niet-majors en in twee outreach-lezingen op middelbare scholen. De volgende observaties en indrukken ondersteunen de positieve educatieve impact van de oefening. Ten eerste is het zeer eenvoudig te implementeren gebleken. Alle doelgroepen - niet-gegradueerden en middelbare scholieren - zijn erin geslaagd de discussies rond elektroforeseprofielen op schoolborden te voorspellen en eraan bij te dragen. Gewoonlijk hebben studenten opmerkingen gemaakt over overeenkomsten tussen de verticale lijnen van lijnen op het bord met gelelektroforeseprofielen in leerboeken of in de media. Ten tweede zijn de indrukken van de auteur over de impact van de oefening op de motivatie van leerlingen en conceptueel leren zeer positief. Verschillende onderwijservaringen onthulden de auteur dat bij het sluiten van een traditionele restrictielaboratoriumklas, talrijke studenten niet in staat waren te beschrijven wat er in een gelband zit, hoe restrictie werkt of hoe gelprofielen verschillen in monster-DNA-sequenties kunnen weerspiegelen. In vergelijking met de traditionele restrictielaboratoria is het gebruik van de schoolbord elektroforese behaalt een betere ontwikkeling van de essentiële expertise om de experimentele elektroforetische profielen te interpreteren. Studenten kunnen een aantal anders moeilijke leerproblemen voorspellen, zoals begrijpen dat één band, ongeacht de sequenties, overeenkomt met de fragmenten van dezelfde grootte of dat de intensiteit van de banden gerelateerd is aan de hoeveelheid DNA van dezelfde grootte. Een zeer belangrijk voordeel is dat de oefening zowel de instructeur als de studenten helpt bij het diagnosticeren van leerproblemen op tijd dat ze in de klas kunnen worden aangepakt. Ten slotte is de aanvulling van natte restrictielaboratoria met de schoolbord elektroforese vergroot de individuele betrokkenheid in de klas. In algemene discussies is er een brede deelname van studenten die meer vragen stellen op conceptueel niveau in vergelijking met scenario's van traditionele restrictielaboratoria. De gunstige effecten van vragen stellen op het leren van biochemie [16, 17], en de positieve effecten op de motivatie van leerlingen van actieve pedagogiek zijn eerder beschreven [10-14].


Het GC-gehalte als belangrijkste factor die het aminozuurgebruik vormgeeft tijdens het bacteriële evolutieproces

Begrijpen hoe eiwitten evolueren is belangrijk, en de volgorde van aminozuren die worden gerekruteerd in de genetische codons bleek een belangrijke factor te zijn die de aminozuursamenstelling van eiwitten vormgeeft. Het laatste werk over de laatste universele gemeenschappelijke voorouder (LUCA) maakt het mogelijk om de potentiële factoren te bepalen die de aminozuursamenstellingen tijdens evolutie bepalen. Die LUCA-genen/-eiwitten van Methanococcus maripaludis S2, wat een van de mogelijke LUCA is, werd onderzocht. De evolutionaire snelheden van deze genen correleren positief met GC-inhoud met P-waarde significant lager dan 0,05 voor 94% homologe genen. Lineaire regressieresultaten toonden aan dat samenstellingen van aminozuren die worden gecodeerd door GC-rijke codons positief bijdragen aan de evolutiesnelheid, terwijl deze aminozuren volgens onze resultaten de neiging hebben om te worden gewonnen in GC-rijke organismen. De eerste hoofdcomponent correleert zeer goed met het GC-gehalte. De verhoudingen van aminozuren van de LUCA-eiwitten die worden gecodeerd door GC-rijke codons correleren positief met het GC-gehalte van verschillende bacteriegenomen, terwijl de verhoudingen van aminozuren die worden gecodeerd door AT-rijke codons negatief correleren met de toename van het GC-gehalte van genomen. Vervolgens ontdekten we dat de rekruteringsvolgorde correleert met de aminozuursamenstellingen, maar winst en verlies in codons toonden aan dat nieuw aangeworven aminozuren niet significant toenemen samen met de evolutie. We concluderen dus dat het GC-gehalte een primaire factor is die de aminozuursamenstellingen vormgeeft. Het GC-gehalte bepaalt de aminozuursamenstelling om de kosten van aminozuren af ​​te wisselen met basen, wat zou kunnen worden veroorzaakt door de energie-efficiëntie.

trefwoorden: GC inhoud aminozuur samenstelling aminozuur kosten bacteriën evolutionaire snelheid laatste universele gemeenschappelijke voorouder metabole efficiëntie.

Figuren

Genen hebben bevooroordeelde GC-inhoud ...

Genen hebben vooringenomen GC-inhoud en evolutionaire snelheden in en tussen genomen. (EEN)…

GC-inhoud draagt ​​aanzienlijk bij aan…

Het GC-gehalte draagt ​​aanzienlijk bij aan de evolutie van het LUCA-eiwit. (EEN) Evolutionaire snelheid (...

De wervingsvolgorde van amino ...

De wervingsvolgorde van aminozuren draagt ​​​​minder bij aan de LUCA-eiwitevolutie ...

De aminozuursamenstellingen voor…

De aminozuursamenstellingen voor mogelijke LUCA-organismen en alle andere micro-organismen. Clostridium…


Agarosegelelektroforese

Agarosegelelektroforese scheidt DNA-fragmenten op basis van hun grootte. Gewoonlijk wordt een DNA-molecuul verteerd met restrictie-enzymen en wordt de agarosegelelektroforese gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel om de fragmenten zichtbaar te maken. Een elektrische stroom wordt gebruikt om de DNA-moleculen over een agarosegel te bewegen, een polysacharidematrix die als een soort zeef fungeert. De matrix helpt de moleculen te "vangen" terwijl ze door de elektrische stroom worden getransporteerd.

Deze techniek heeft veel toepassingen. Over het algemeen kun je DNA-fragmenten analyseren die het resultaat zijn van een enzymdigestie van een groter stuk DNA om de fragmenten zichtbaar te maken en de grootte van de fragmenten te bepalen.

Naast het nut ervan in onderzoekstechnieken, is agarosegelelektroforese een veel voorkomende forensische techniek en wordt deze gebruikt bij DNA-vingerafdrukken.

Kun je niet gewoon verven?

Ethidiumbromide is een intercalerende kleurstof, wat betekent dat het zichzelf tussen de basen invoegt die in het midden van de DNA-helix zijn gestapeld. Eén ethidiumbromidemolecuul bindt aan één base. Omdat elk kleurstofmolecuul zich aan de basen bindt, wordt de helix afgewikkeld om de spanning van de kleurstof op te vangen.

Gesloten circulair DNA is beperkt en kan niet zoveel draaiende spanning weerstaan ​​als lineair DNA, dus circulair DNA kan niet zoveel kleurstof binden als lineair DNA.

Ethidiumbromide kan gemakkelijk in uw cellen komen. Menselijk DNA is lineair en kleurt goed. Dit betekent dat het in je DNA kan komen en het kan ontwarren. Dit is geen goede zaak, dus wees voorzichtig en beschermd bij het gebruik van ethidiumbromide.

Er zijn ook veiligere en minder giftige alternatieven die u mogelijk kunt gebruiken. GelRed en GelGreen zijn DNA-kleuringen die niet door celmembranen kunnen, waardoor ze veiliger te gebruiken en weg te gooien zijn.

Door matrix bewegen

De fosfaatmoleculen die de ruggengraat van DNA-moleculen vormen, hebben een hoge negatieve lading. Wanneer DNA met een elektrische stroom op een veld wordt geplaatst, migreren deze negatief geladen DNA-moleculen naar het positieve uiteinde van het veld, in dit geval een agarosegel ondergedompeld in een bufferbad.

De agarosegel is een verknoopte matrix die enigszins lijkt op een driedimensionaal gaas of scherm. De DNA-moleculen worden door de stroom naar het positieve uiteinde getrokken, maar ze ondervinden weerstand van dit agarose-gaas. De kleinere moleculen kunnen sneller door het gaas navigeren dan de grotere, dus komen ze verder in de gel dan de grotere moleculen. Dit is hoe agarose-elektroforese verschillende DNA-moleculen scheidt op basis van hun grootte. De gel is gekleurd met ethidiumbromide, zodat je kunt visualiseren hoe deze DNA-moleculen in banden langs de gel zijn opgelost.

Southern blotting kan ook worden gebruikt als een visualisatietechniek voor agarosegels.

Onbekende DNA-monsters worden meestal op dezelfde gel uitgevoerd met een "ladder". Een ladder is een DNA-monster waarvan de grootte van de banden bekend is. Dus nadat je monster op is, kun je de onbekende fragmenten vergelijken met de ladderfragmenten en de geschatte grootte van de onbekende DNA-banden bepalen door hoe ze overeenkomen met de bekende banden van de ladder.

Extra afbeeldingen van Wikimedia via Jacopo Werther (elektroforesemachine) en Mnolf (gelelektroforese)


Indicaties

Serumproteïne-elektroforese wordt vaak uitgevoerd wanneer multipel myeloom wordt vermoed. Het onderzoek moet ook in andere situaties worden overwogen (tabel 1) .2 – 4

Indicaties voor serumproteïne-elektroforese

Vermoedelijk multipel myeloom, macroglobulinemie van Waldenström, primaire amyloïdose of gerelateerde aandoening

Onverklaarde perifere neuropathie (niet toegeschreven aan langdurige diabetes mellitus, blootstelling aan toxine, chemotherapie, enz.)

Nieuw optredende anemie geassocieerd met nierfalen of nierinsufficiëntie en botpijn

Rugpijn waarbij multipel myeloom wordt vermoed

Hypercalciëmie toegeschreven aan mogelijke maligniteit (bijv. geassocieerd gewichtsverlies, vermoeidheid, botpijn, abnormale bloeding)

Rouleaux-formaties opgemerkt op perifere bloeduitstrijkjes

Nierinsufficiëntie met bijbehorende verhoging van serumeiwit

Onverklaarbare pathologische fractuur of lytische laesie geïdentificeerd op röntgenfoto

Informatie uit referenties 2 t/m 4 .

Indicaties voor serumproteïne-elektroforese

Vermoedelijk multipel myeloom, macroglobulinemie van Waldenström, primaire amyloïdose of gerelateerde aandoening

Onverklaarde perifere neuropathie (niet toegeschreven aan langdurige diabetes mellitus, blootstelling aan toxine, chemotherapie, enz.)

Nieuw optredende anemie geassocieerd met nierfalen of nierinsufficiëntie en botpijn

Rugpijn waarbij multipel myeloom wordt vermoed

Hypercalciëmie toegeschreven aan mogelijke maligniteit (bijv. geassocieerd gewichtsverlies, vermoeidheid, botpijn, abnormale bloeding)

Rouleaux-formaties opgemerkt op perifere bloeduitstrijkjes

Nierinsufficiëntie met bijbehorende verhoging van serumeiwit

Onverklaarbare pathologische fractuur of lytische laesie geïdentificeerd op röntgenfoto

Informatie uit referenties 2 t/m 4 .

Als het onderzoek normaal is maar multipel myeloom, Waldenströms macroglobulinemie, primaire amyloïdose of een verwante aandoening nog steeds wordt vermoed, moet immunofixatie ook worden uitgevoerd omdat deze techniek gevoeliger kan zijn bij het identificeren van een klein monoklonaal (M)-eiwit.5


Polymerasen voor specifieke toepassingen

Hoogste trouw

PrimeSTAR-polymerasen bieden een betere betrouwbaarheid dan Pfu DNA-polymerase, dat algemeen wordt beschouwd als een high-fidelity-enzym. PrimeSTAR Max DNA-polymerase heeft de hoogste betrouwbaarheid wanneer dit enzym werd gebruikt om het gehele pUC119-plasmide te amplificeren, sequentieanalyse detecteerde slechts vier mutaties van 370.656 totale basen waarvan de sequentie werd bepaald (een foutenpercentage van 0,0010%). Bovendien, vergeleken met andere enzymen, repliceert PrimeSTAR Max DNA Polymerase herhaalde sequenties met een duidelijk betere betrouwbaarheid en vertoont het een lagere snelheid van matrijsuitwisseling (vorming van chimere moleculen) met analoge sequenties.

GC-rijke doelsequenties

Beschouw de volgende enzymen:

    Eerste keuze: PrimeSTAR GXL DNA-polymerase is het meest effectieve enzym voor GC-rijke sjablonen, zoals bacterieel genomisch DNA. Het vergemakkelijkt high-fidelity versterkingen met zeer weinig fouten. PrimeSTAR GXL DNA-polymerase is met succes gebruikt om een ​​regio te amplificeren met

Lange afstand PCR

PrimeSTAR GXL DNA-polymerase wordt aanbevolen wanneer zowel lengte (>6 kb) als betrouwbaarheid factoren zijn. Met dit enzym is amplificatie van producten van 30 kb uit humane genomische DNA-templates bereikt. Takara LA Taq DNA-polymerase kan ook worden gebruikt voor lange-afstands-PCR. Dit enzym wordt aanbevolen wanneer lengte en robuuste amplificatie prioriteit hebben.

Snelle PCR

We hebben verschillende PCR-enzymen die kunnen worden gebruikt voor snelle reacties.

  • Snelheid en betrouwbaarheid&mdashPrimeSTAR Max DNA-polymerase bevat een gepatenteerde rekfactor en vertoont een uitstekende priming-efficiëntie, waardoor verlengingstijden van slechts 5 sec/kb en een uitgloeitijd van slechts 5 sec mogelijk zijn. Dit enzym wordt aanbevolen voor klonerings- en expressiestudies.
  • High-throughput toepassingen en snelle kolonie PCR&mdashSapphireAmp Fast PCR Master Mix is ​​een voordelige keuze voor high-throughput projecten. Deze 2X-enzympremix bevat een hogesnelheidspolymerase, geoptimaliseerde buffer, dNTP-mengsel, gellaadkleurstof (blauw) en een dichtheidsreagens. Aangezien het een verlengingstijd van slechts 10 sec/kb vereist, kunnen kolonie-PCR-reacties worden voltooid in <1 uur voor inserts tot 1 kb.
  • SNP-genotypering en snelle lange-afstands-PCR & mdashSpeedSTAR HS DNA-polymerase is zeer efficiënt en kan op betrouwbare wijze PCR-amplificaties uitvoeren met verlengingstijden tussen 10 en 20 sec/kb.

AT-rijke doelsequenties

TaKaRa Ex Taq DNA-polymerase en PrimeSTAR GXL DNA-polymerase zijn effectief voor het amplificeren van AT-rijke doelsequenties, zoals genomisch DNA dat introns bevat of AT-rijk mitochondriaal DNA. We raden PrimeSTAR GXL DNA-polymerase aan voor het met hoge nauwkeurigheid amplificeren van AT-rijke sjablonen. In tegenstelling tot andere PCR-enzymen kan PrimeSTAR GXL-polymerase doelen met een AT-gehalte van >60% amplificeren met behulp van een standaard PCR-protocol en de meegeleverde reactiebuffer.

Opmerking: PrimeSTAR GXL DNA-polymerase kan niet worden gebruikt om met bisulfiet behandeld DNA of andere uracil-bevattende sjablonen te amplificeren. Probeer voor deze toepassing TaKaRa EpiTaq HS (voor met bisulfiet behandeld DNA).

Met bisulfiet behandeld DNA

Er zijn verschillende keuzes beschikbaar:

    is geoptimaliseerd voor PCR-amplificatie met behulp van met bisulfiet behandelde DNA-templates die uracil bevatten. Dit enzym bevat een hot-start-antilichaam en is ontworpen voor gebruik tijdens methyleringsanalyse, inclusief COBRA- en bisulfiet-sequencing-analyses.
  • De EpiScope MSP Kit is speciaal ontworpen voor methylatie-specifieke PCR (MSP)-assays. en TaKaRa Taq DNA Polymerase Hot Start-versie, die beide geen 3'&rarr5'-exonuclease-activiteit hebben, kan in sommige gevallen worden gebruikt.

PCR-remmende middelen

TaKaRa Ex Taq DNA-polymerase is uitzonderlijk robuust, zelfs in aanwezigheid van PCR-remmers zoals polyfenolen die worden aangetroffen in ruwe DNA-extracten van plantenweefsel. PrimeSTAR GXL DNA-polymerase wordt aanbevolen wanneer ook hoge betrouwbaarheid vereist is. Hoewel PrimeSTAR GXL-polymerase over het algemeen bevredigende resultaten oplevert met het standaardprotocol, kan een verdubbeling van de enzymconcentratie de resultaten verbeteren als er zeer hoge concentraties remmers aanwezig zijn.

Als alternatief maakt Terra PCR Direct Polymerase Mix directe amplificatie mogelijk van ruwe monsters die hoge niveaus van PCR-remmers kunnen bevatten. Terra PCR Direct-polymerase kan een breed scala aan doelen efficiënt amplificeren, waaronder GC- en AT-rijke doelen. Dit enzym kan ook worden gebruikt voor directe PCR uit bloedmonsters.

In gevallen waarin met deze enzymen geen amplificatieproducten kunnen worden geproduceerd, kan het nodig zijn om het template-DNA te zuiveren.

Paraffine/FFPE-coupes

De Terra PCR Direct FFPE Kit kan worden gebruikt voor ruwe DNA-bereiding en directe PCR-amplificatie van in paraffine ingebedde weefselcoupes.

Als het nodig is om eerst DNA uit in paraffine ingebed weefsel te extraheren, maken TaKaRa DEXPAT Easy en TaKaRa DEXPAT Reagent een snelle en efficiënte DNA-bereiding mogelijk, zelfs van objectglaasjes of monsters die al jaren zijn bewaard.

Gelelektroforese na PCR (bijv. genotyperingsschermen)

We raden EmeraldAmp GT PCR Master Mix aan. Deze PCR-mastermix bevat een groene gellaadkleurstof en dichtheidsreagens, waardoor het gemakkelijk is om PCR-reactiemengsels te bereiden die direct op een agarosegel kunnen worden geladen voor elektroforese na PCR. EmeraldAmp GT PCR Master Mix kan doelen met een lengte tot 10 kb versterken, inclusief doelen die GC- of AT-rijk zijn. Bovendien kunnen PCR-producten die zijn gegenereerd met EmeraldAmp GT PCR Master Mix direct worden gebruikt voor restrictie-enzymdigestie, sequencing of TA-klonering zonder zuivering.

Kolonie PCR

We raden SapphireAmp Fast PCR Master Mix aan voor kolonie-PCR. Dit enzymvoormengsel kan een aanzienlijke aanwezigheid van bacteriële nucleïnezuren verdragen. Tracking-kleurstof en dichtheidsreagens zijn opgenomen in de mastermix, waardoor de PCR-reactieproducten direct op een agarosegel kunnen worden geladen voor elektroforese.

Hoogste gevoeligheid

Voor de hoogste gevoeligheid raden we Titanium aan Taq DNA-polymerase of TaKaRa Ex Taq DNA-polymerase. Beide polymerasen zijn met succes gebruikt voor zeer gevoelige genotyperingstoepassingen.

Directe versterking van weefsel

We raden Terra PCR Direct Polymerase Mix aan voor het versterken van doelen uit ruwe extracten of rechtstreeks uit weefsels. De aanbevolen hoeveelheden van verschillende weefsels die voor directe PCR moeten worden gebruikt, worden hieronder vermeld:

  • Behandeld bloed: &le5 µl
  • Muisstaart: &le1 mm
  • Muisoor: &le1,5 mm 2
  • Plant blad: &le1.2 mm (diameter)
  • In paraffine ingebedde weefselsectie: &le1&ndash1,5 cm 2

Multiplex PCR

Wij adviseren TaKaRa Taq DNA-polymerase of titanium Taq DNA-polymerase voor multiplex-PCR. Bekijk onze technische opmerking voor meer informatie over het gebruik van Titanium Taq DNA-polymerase in multiplex-PCR voor genotypering met hoge doorvoer.

Takara Bio USA, Inc.
Verenigde Staten/Canada: +1.800.662.2566 &stier Azië-Pacific: +1.650.919.7300 &stier Europa: +33.(0)1.3904.6880 &stier Japan: +81.(0)77.565.6999
UITSLUITEND VOOR ONDERZOEK. NIET VOOR GEBRUIK IN DIAGNOSTISCHE PROCEDURES. &kopie 2021 Takara Bio Inc. Alle rechten voorbehouden. Alle handelsmerken zijn eigendom van Takara Bio Inc. of haar dochteronderneming(en) in de VS en/of andere landen of hun respectievelijke eigenaren. Bepaalde handelsmerken zijn mogelijk niet in alle rechtsgebieden geregistreerd. Aanvullende informatie over producten, intellectueel eigendom en beperkt gebruik is beschikbaar op Takarabio.com.

Takara Bio Europe is lid van de Takara Bio Group, een toonaangevend life sciences bedrijf dat zich inzet voor het verbeteren van de menselijke conditie door middel van biotechnologie. Via onze merken Takara, Clontech en Cellartis is het onze missie om innovatieve tools en diensten van hoge kwaliteit te ontwikkelen om ontdekking te versnellen.


Bekijk de video: Elektroforese - - GHG (Januari- 2022).