Informatie

9.1: DNA-isolatie, sequentiebepaling en synthese - biologie


5.1 DNA-isolatie, sequentiebepaling en synthese

Genomisch DNA versus gratis DNA

Genomisch desoxyribonucleïnezuur is chromosomaal DNA, in tegenstelling tot extra-chromosomaal DNA zoals dat wordt aangetroffen in de mitochondriën van zoogdieren of plasmidestructuren in bacteriën (Figuur 5.1). Het wordt dan ook afgekort als gDNA. De meeste organismen hebben in elke cel hetzelfde genomische DNA; er zijn echter alleen bepaalde genen actief in elke cel om celfunctie en differentiatie in het lichaam mogelijk te maken.

Het genoom van een organisme (gecodeerd door het genomische DNA) is de (biologische) informatie over erfelijkheid die wordt doorgegeven van de ene generatie van het organisme naar de volgende. Dat genoom wordt getranscribeerd om verschillende RNA's te produceren, die nodig zijn voor de functie van het organisme. Precursor-mRNA (pre-mRNA) wordt getranscribeerd door RNA-polymerase II in de kern. pre-mRNA wordt vervolgens verwerkt door splitsing om introns te verwijderen, waardoor de exons in het rijpe boodschapper-RNA (mRNA) achterblijven. Aanvullende verwerking omvat de toevoeging van een 5'-cap en een poly(A)-staart aan het pre-mRNA. Het rijpe mRNA kan vervolgens naar het cytosol worden getransporteerd en door het ribosoom in een eiwit worden vertaald. Andere soorten RNA zijn ribosomaal RNA (rRNA) en transfer-RNA (tRNA). Deze typen worden getranscribeerd door respectievelijk RNA-polymerase II en RNA-polymerase III en zijn essentieel voor eiwitsynthese. 5s-rRNA is echter het enige rRNA dat wordt getranscribeerd door RNA-polymerase III.

In de genetica, complementair DNA (cDNA) is DNA dat is gesynthetiseerd uit een enkelstrengs RNA (bijv. messenger RNA (mRNA) of microRNA)-matrijs in een reactie die wordt gekatalyseerd door het enzym reverse transcriptase (Figuur 5.1). Reverse transcriptase is een enzym dat wordt aangetroffen in retrovirussen zoals HIV die RNA als hun genetisch kernmateriaal hebben. Bij binnenkomst in de gastheercel wordt het RNA omgekeerd getranscribeerd om een ​​kopie van cDNA te produceren die vervolgens kan integreren in het genomische DNA van de gastheer. In de biotechnologie wordt reverse transcriptase vaak gebruikt om cDNA te maken van het mRNA dat tot expressie wordt gebracht in specifieke cellen of weefsels. Op deze manier kunnen de eukaryote genen worden gekloond zonder dat er introns in de structuur zijn ondergebracht. Dit is vooral nuttig als het doel is om het eiwit tot expressie te brengen in een prokaryotische (bacteriële) gastheer. Bedenk dat bacterieel DNA geen intronsequenties herbergt in zijn chromosomale DNA. Als u dus een prokaryotisch systeem gebruikt om eukaryote eiwitten tot expressie te brengen, moet u cDNA gebruiken, omdat het prokaryotische systeem na gentranscriptie geen intronsequenties kan verwijderen.

De voorwaarde cDNA wordt ook gebruikt, meestal in een bioinformatica-context, om te verwijzen naar de sequentie van een mRNA-transcript, uitgedrukt als DNA-basen (GCAT) in plaats van RNA-basen (GCAU).

  • cDNA is afgeleid van mRNA, dus het bevat alleen exons maar geen introns.

Figuur 5.1. Genomisch DNA (gDNA) versus gratis DNA (cDNA). Linkerdiagram toont de verwerking van genomisch DNA in een cel om een ​​eiwit te produceren (Bovenste blauwe paneel toont de structurele elementen die gemeenschappelijk zijn voor eukaryote genen. Het proces van gentranscriptie produceert een boodschapper-RNA (mRNA)-molecuul dat post-translationeel moet worden aangepast, grijs paneel, om de niet-coderende intronsequenties te verwijderen en de secties 5'-CAP en Poly-A-Tail toe te voegen. Het rijpe mRNA wordt van de kern naar het cytoplasma getransporteerd waar het door het ribosoom wordt getranslateerd in de eiwitsequentie, rood paneel.) Rechter diagram laat zien dat de isolatie van mRNA uit een cel kan worden gebruikt om cDNA te synthetiseren met behulp van het enzym reverse transcriptase. Het resulterende cDNA bevat alleen elementen van het rijpe mRNA, inclusief de exons en poly-A-staart.

Afbeelding gewijzigd van Wikipedia


DNA-isolatietechnieken

DNA isolatie is een proces van zuivering van DNA uit een monster met behulp van een combinatie van fysische en chemische methoden. De eerste isolatie van DNA werd in 1869 gedaan door Friedrich Miescher. Momenteel is het een routineprocedure in de moleculaire biologie of forensische analyses. Voor de chemische methode zijn er veel verschillende kits die worden gebruikt voor extractie, en het selecteren van de juiste zal tijd besparen op kitoptimalisatie en extractieprocedures. PCR-gevoeligheidsdetectie wordt geacht de variatie tussen de commerciële kits aan te tonen.

Er zijn drie standaard DNA-zuiveringstechnieken die hieronder worden beschreven:

  • Cellen die moeten worden bestudeerd, moeten worden verzameld.
  • Het openbreken van de celmembranen om het DNA samen met het cytoplasma binnenin bloot te leggen (cellysis).
    • Lipiden uit het celmembraan en de kern worden afgebroken met detergenten en oppervlakteactieve stoffen.
    • Eiwitten breken door een protease toe te voegen (optioneel).
    • RNA breken door een RNase toe te voegen (optioneel).
  • De oplossing wordt behandeld met geconcentreerde zoutoplossing (zoutoplossing) om puin zoals gebroken eiwitten, lipiden en RNA te laten samenklonteren.
  • Centrifugatie van de oplossing, die de samengeklonterde celresten van het DNA scheidt.
  • DNA-zuivering van detergentia, eiwitten, zouten en reagentia die worden gebruikt tijdens de cellysisstap. De meest gebruikte procedures zijn:
    1. Ethanolprecipitatie gewoonlijk door ijskoude ethanol of isopropanol. Omdat DNA onoplosbaar is in deze alcoholen, zal het samenklonteren, waardoor een korreltje bij centrifugeren. Neerslag van DNA wordt verbeterd door verhoging van de ionsterkte, meestal door toevoeging van natriumacetaat.
    2. Fenol-chloroform extractie waarin fenol eiwitten in het monster denatureert. Na centrifugatie van het monster blijven gedenatureerde eiwitten in de organische fase, terwijl de waterige fase die nucleïnezuur bevat wordt gemengd met de chloroform die fenolresten uit de oplossing verwijdert.
    3. Minikolom zuivering die berust op het feit dat de nucleïnezuren kunnen binden (adsorptie) aan de vaste fase (silica of andere), afhankelijk van de pH en de zoutconcentratie van de buffer (Figuur 5.2).

Cellulaire en histon-eiwitten die aan het DNA zijn gebonden, kunnen worden verwijderd door ofwel een protease toe te voegen of door de eiwitten te laten neerslaan met natrium- of ammoniumacetaat, of ze te extraheren met een fenol-chloroform-mengsel voorafgaand aan de DNA-precipitatie.

Na isolatie wordt het DNA opgelost in een licht alkalische buffer, meestal in een Tris-EDTA-buffer, of in ultrazuiver water. Aanpassingen aan deze standaardtechnieken worden vaak gedaan als het gebruikte weefsel moeilijk afbreekbaar is, als er verontreinigingen in de lysisoplossing achterblijven die verdere reacties remmen, of als het monster uiterst minimaal is, zoals vaak het geval is bij forensisch onderzoek. Daarnaast zullen verschillende commerciële kits op maat worden gemaakt voor de isolatie van groter genomisch DNA of kleiner plasmide-DNA.

Figuur 5.2 Silica spinkolom gebruikt voor DNA-zuivering. Nucleïnezuurzuivering op basis van een spinkolom is een vaste-fase-extractiemethode om nucleïnezuren snel te zuiveren. Deze methode is gebaseerd op het feit dat nucleïnezuur onder bepaalde omstandigheden bindt aan de vaste fase van silica en vervolgens vrijkomt wanneer die omstandigheden worden gewijzigd. Voor binding wordt een bufferoplossing toegevoegd aan het DNA-lysaat samen met ethanol of isopropanol. Dit vormt de bindende oplossing. De bindingsoplossing wordt overgebracht naar een spinkolom en de kolom wordt in een centrifuge geplaatst. De centrifuge dwingt de bindingsoplossing door een silicagelmembraan dat zich in de spinkolom bevindt. Als de pH en zoutconcentratie van de bindingsoplossing optimaal zijn, zal het nucleïnezuur zich binden aan het silicagelmembraan als de oplossing er doorheen gaat. Om niet-specifieke cellulaire componenten uit de kolom te wassen, wordt de doorstroom verwijderd en wordt een wasbuffer aan de kolom toegevoegd. De kolom wordt opnieuw in een centrifuge geplaatst, waardoor de wasbuffer door het membraan wordt geperst. Dit verwijdert alle resterende onzuiverheden van het membraan, waardoor alleen het nucleïnezuur aan de silicagel gebonden blijft. Om te elueren wordt de wasbuffer verwijderd en wordt een elutiebuffer met laag zoutgehalte (of eenvoudigweg water) aan de kolom toegevoegd. De kolom wordt opnieuw in een centrifuge geplaatst, waardoor de elutiebuffer door het membraan wordt geperst. De elutiebuffer verdringt het nucleïnezuur uit de kolom waardoor het in de doorstroom kan worden opgevangen. In tegenstelling tot RNA, dat zeer snel afbreekt, is DNA vrij stabiel en kan het lange tijd bij -20 worden bewaardOC.

Afbeelding door Squidonius

Terug naar de top


Technieken voor DNA-sequencing

DNA sequentie is het proces van het bepalen van de nucleïnezuursequentie - de volgorde van nucleotiden in DNA. Het omvat elke methode of technologie die wordt gebruikt om de volgorde van de vier basen te bepalen: adenine, guanine, cytosine en thymine. De komst van snelle DNA-sequencingmethoden heeft biologisch en medisch onderzoek en ontdekking enorm versneld.

Kennis van DNA-sequenties is onmisbaar geworden voor fundamenteel biologisch onderzoek en in tal van toepassingsgebieden zoals medische diagnose, biotechnologie, forensische biologie, virologie en biologische systematiek. Het vergelijken van gezonde en gemuteerde DNA-sequenties kan verschillende ziekten diagnosticeren, waaronder verschillende kankers, het antilichaamrepertoire karakteriseren en kan worden gebruikt om de behandeling van patiënten te begeleiden. Dankzij een snelle manier om DNA te sequensen, kan snellere en meer geïndividualiseerde medische zorg worden toegediend en kunnen meer organismen worden geïdentificeerd en gecatalogiseerd.

De hoge snelheid van sequencing die met moderne DNA-sequencingtechnologie wordt bereikt, heeft een grote rol gespeeld bij de sequencing van volledige DNA-sequenties, of genomen, van talloze soorten en soorten van leven, waaronder het menselijk genoom en andere complete DNA-sequenties van veel dieren, planten en microbiële soort.

De eerste DNA-sequenties werden begin jaren zeventig verkregen door academische onderzoekers met behulp van omslachtige methoden op basis van tweedimensionale chromatografie. Na de ontwikkeling van op fluorescentie gebaseerde sequencing-methoden met een DNA-sequencer, is DNA-sequencing eenvoudiger en orden van grootte sneller geworden.

De canonieke structuur van DNA heeft vier basen: thymine (T), adenine (A), cytosine (C) en guanine (G). DNA-sequencing is de bepaling van de fysieke volgorde van deze basen in een DNA-molecuul. DNA-basen worden echter vaak gemodificeerd door epigenetische processen om genexpressie te regelen. Dus veel andere gemodificeerde basen die in een DNA-molecuul aanwezig kunnen zijn dan de standaard vier basen. In sommige virussen (in het bijzonder bacteriofaag) kan cytosine bijvoorbeeld worden vervangen door hydroxymethyl- of hydroxymethylglucose-cytosine. In eukaryoot DNA kunnen variante basen met methylgroepen of fosfosulfaat worden gevonden (Figuur 5.3). Afhankelijk van de sequentietechniek kan een bepaalde modificatie, bijvoorbeeld de 5mC (5-methylcytosine) die bij mensen gebruikelijk is, al dan niet worden gedetecteerd.

Figuur 5.3 DNA-modificaties met epigenetische regulerende functies en hun onderlinge afhankelijkheden. Cytosine (C) wordt gemethyleerd tot 5-methylcytosine (5mC) door DNA-methyltransferasen (DNMT) en vervolgens verder geoxideerd tot 5hmC, 5fC en 5caC door Tet-dioxygenases. 5-Hydroxyuracil (5hmU) wordt geproduceerd door Tet-gekatalyseerde oxidatie van thymine (T). N6-methyladenine (6mA) wordt waarschijnlijk gekatalyseerd door DNA N6-adeninemethyltransferasen (DAMT-1 in C. elegans), hoewel de biochemische activiteit van deze enzymen nog moet worden gekarakteriseerd. Van de Tet-achtige ALKB-enzymen NMAD (N6-methyladeninedemethylase 1) en DMAD (DNA 6mA-demethylase) is aangetoond dat ze betrokken zijn bij 6mA-demethylering in C. elegans en in Drosophilarespectievelijk mogelijk door gebruik te maken van een geconserveerd dioxygenasemechanisme.

Afbeelding door Breiling en Lyko (2015) Epigenetica en chromatine 8:24"


  • Vroege methoden voor DNA-sequencing

De eerste methode voor het bepalen van DNA-sequenties omvatte een locatiespecifieke primerverlengingsstrategie die in 1970 werd vastgesteld door Ray Wu aan de Cornell University. DNA-polymerase-katalyse en specifieke nucleotide-labeling, die beide prominent aanwezig zijn in de huidige sequentieschema's, werden gebruikt om de samenhangende uiteinden te sequensen van lambda faag DNA. Tussen 1970 en 1973 hebben Wu, R Padmanabhan en collega's aangetoond dat deze methode kan worden gebruikt om elke DNA-sequentie te bepalen met behulp van synthetische locatiespecifieke primers. Frederick Sanger nam vervolgens deze primer-extensiestrategie over om snellere DNA-sequencingmethoden te ontwikkelen in het MRC Centre, Cambridge, VK en publiceerde in 1977 een methode voor "DNA-sequencing met ketenbeëindigende remmers". Walter Gilbert en Allan Maxam van Harvard ontwikkelden ook sequentiemethoden, waaronder een voor "DNA-sequencing door chemische afbraak". In 1973 rapporteerden Gilbert en Maxam de sequentie van 24 basenparen met behulp van een methode die bekend staat als zwervende-vlekanalyse. Vooruitgang in sequencing werd geholpen door de gelijktijdige ontwikkeling van recombinant-DNA-technologie, waardoor DNA-monsters konden worden geïsoleerd uit andere bronnen dan virussen.

Maxam-Gilbert-sequencing vereist radioactieve labeling aan één 5'-uiteinde van het DNA en zuivering van het DNA-fragment waarvan de sequentie moet worden bepaald. Chemische behandeling genereert dan breuken bij een klein deel van een of twee van de vier nucleotidebasen in elk van de vier reacties (G, A+G, C, C+T). De concentratie van de modificerende chemicaliën wordt gecontroleerd om gemiddeld één modificatie per DNA-molecuul te introduceren. Zo wordt een reeks gemerkte fragmenten gegenereerd, vanaf het radioactief gemerkte uiteinde tot de eerste "knip"-plaats in elk molecuul. De fragmenten in de vier reacties worden naast elkaar geëlektroforeerd in denaturerende acrylamidegels voor scheiding op grootte. Om de fragmenten zichtbaar te maken, wordt de gel blootgesteld aan röntgenfilm voor autoradiografie, wat een reeks donkere banden oplevert die elk overeenkomen met een radioactief gemerkt DNA-fragment, waaruit de sequentie kan worden afgeleid.

De technische aspecten van Maxam-Gilbert-sequencing zorgden ervoor dat het uit de gratie raakte toen de Sanger-sequencingmethode eenmaal goed ingeburgerd was, zoals hieronder beschreven.

De in 1977 door Frederick Sanger en collega's ontwikkelde kettingbeëindigingsmethode werd al snel de voorkeursmethode vanwege het relatieve gemak en de betrouwbaarheid ervan. Bij de uitvinding gebruikte de kettingbeëindigingsmethode minder giftige chemicaliën en lagere hoeveelheden radioactiviteit dan de Maxam-Gilbert-methode. Vanwege het relatieve gemak werd de Sanger-methode al snel geautomatiseerd en was de methode die werd gebruikt in de eerste generatie DNA-sequencers.

De klassieke ketenbeëindigingsmethode vereist een enkelstrengs DNA-matrijs, een DNA-primer, een DNA-polymerase, normale deoxynucleotidetrifosfaten (dNTP's) en gemodificeerde di-deoxynucleotidetrifosfaten (ddNTP's), waarvan de laatste de verlenging van de DNA-streng beëindigen. Deze ketenbeëindigende nucleotiden missen een 3'-OH-groep die nodig is voor de vorming van een fosfodiesterbinding tussen twee nucleotiden, waardoor DNA-polymerase de verlenging van DNA stopt wanneer een gemodificeerd ddNTP wordt ingebouwd. De ddNTP's kunnen radioactief of fluorescent gelabeld zijn voor detectie in geautomatiseerde sequencing-machines.

Het DNA-monster is verdeeld in vier afzonderlijke sequentiereacties, die alle vier de standaard deoxynucleotiden (dATP, dGTP, dCTP en dTTP) en het DNA-polymerase bevatten. Aan elke reactie wordt slechts één van de vier dideoxynucleotiden (ddATP, ddGTP, ddCTP of ddTTP) toegevoegd, terwijl de andere toegevoegde nucleotiden gewone zijn (Figuur 5.4).

Figuur 5.4. Fluorescerende ddNTP's voor Sanger-sequencing. Dideoxynucleotiden worden gebruikt voor sequencing omdat ze niet verder kunnen worden verlengd als ze eenmaal in het nacent DNA zijn opgenomen.

Afbeelding door Fibonachi

Terug naar de top


De dideoxynucleotide-concentratie moet ongeveer 100-voudig lager zijn dan die van het overeenkomstige deoxynucleotide (bijv. 0,005 mM ddTTP: 0,5 mM dTTP) om voldoende fragmenten te kunnen produceren terwijl nog steeds de volledige sequentie wordt getranscribeerd. In dit proces zijn in totaal vier afzonderlijke reacties nodig om alle vier de ddNTP's te testen (Figuur 5.5).

Figuur 5.5. De Sanger-methode (ketenbeëindiging) voor DNA-sequencing. (1) Een primer wordt aan een sequentie gehecht, (2) Reagentia worden aan de primer en template toegevoegd, waaronder: DNA-polymerase, dNTP's en een kleine hoeveelheid van alle vier de dideoxynucleotiden (ddNTP's) gelabeld met fluoroforen. Tijdens primerverlenging beëindigt de willekeurige insertie van een ddNTP in plaats van een dNTP de synthese van de keten omdat DNA-polymerase niet kan reageren met het ontbrekende hydroxyl. Hierdoor ontstaan ​​alle mogelijke lengtes van kettingen. (3) De producten worden gescheiden op een enkelbaans capillaire gel, waar de resulterende banden worden afgelezen door een beeldvormingssysteem. (4) Dit levert enkele honderdduizenden nucleotiden per dag op, gegevens die opslag en daaropvolgende computationele analyse vereisen.

Afbeelding door Estevezj


Na ronden van matrijs-DNA-verlenging van de gebonden primer worden de resulterende DNA-fragmenten met warmte gedenatureerd en op grootte gescheiden met behulp van gelelektroforese. Deze techniek werd vaak uitgevoerd met behulp van een denaturerende polyacrylamide-ureumgel waarbij elk van de vier reacties werd uitgevoerd in een van de vier afzonderlijke lanen (lanen A, T, G, C). De DNA-banden kunnen vervolgens worden gevisualiseerd door autoradiografie of UV-licht en de DNA-sequentie kan direct worden afgelezen van de röntgenfilm of het gelbeeld (Figuur 5.6).

Figuur 5.6. Traditionele Sanger Sequencing Gel. Sequentie gevisualiseerd door autoradiografie. Elke baan bevat een enkele reactie die alle vier de reguliere nucleotiden heeft en een kleine hoeveelheid van een van de dideoxynucleotiden (ddNTP's). Na verloop van tijd zullen de ddNTP's worden ingebouwd op elke positie die dat specifieke nucleotide bevat. De gel kan dan van onder naar boven worden afgelezen, aangezien de kleinste fragmenten (de fragmenten die het dichtst bij de primer aan het 5'-uiteinde eindigen) de verste afstand in de gel zullen lopen. De volgorde van dit fragment is:

5'-TACGAGATATATGGCGTTAATACGATATATTGGAACTTCTATTGC-3'

Afbeelding door John Schmidt


Automatisering van de Sanger-sequencingmethode werd mogelijk gemaakt toen de verschuiving van radioactief gelabelde nucleotiden naar fluorescent gelabelde nucleotiden werd gemaakt. Binnen de geautomatiseerde sequencers wordt capillaire gelelektroforese uitgevoerd in plaats van de monsters te scheiden met behulp van gelelektroforese. De output van capillaire elektroforese zijn fluorescerende pieksporenchromatogrammen (Figuur 5.7). Geautomatiseerde instrumenten voor DNA-sequencing (DNA-sequencers) kunnen tot 384 DNA-monsters in één batch sequencen. Batchruns kunnen tot 24 keer per dag plaatsvinden, waardoor de snelheid waarmee monsters kunnen worden gesequenced en geanalyseerd, aanzienlijk wordt verbeterd. Veelvoorkomende uitdagingen van DNA-sequencing met de Sanger-methode omvatten slechte kwaliteit in de eerste 15-40 basen van de sequentie als gevolg van primerbinding en verslechterende kwaliteit van sequencing-sporen na 400-500 basen.

Afbeelding 5.7 Vergelijking zij aan zij van gelelektroforese en capillaire elektroforese. Links diagram toont het traditionele autoradiogram van Sanger-sequencingmonsters. De Rechter diagram toont dezelfde reacties met behulp van fluorescent gelabelde ddNTP's gescheiden door capillaire elektroforese. De chromatogramuitvoer wordt uiterst rechts weergegeven.

Afbeelding door Abizar


Sanger-sequencing is de methode die heerste van de jaren tachtig tot ~2005. In die periode zijn er grote vorderingen gemaakt in de techniek, zoals fluorescerende labeling, capillaire elektroforese en algemene automatisering. Deze ontwikkelingen maakten een veel efficiëntere sequencing mogelijk, wat leidde tot lagere kosten. De Sanger-methode, in massaproductievorm, is de technologie die in 2001 het eerste menselijke genoom produceerde en het tijdperk van de genomica inluidde.

  • Microfluïdische Sanger-sequencing

Microfluïdische Sanger-sequencing is een lab-on-a-chip-toepassing voor DNA-sequencing, waarbij de Sanger-sequencingstappen (thermische cycli, monsterzuivering en capillaire elektroforese) zijn geïntegreerd op een chip op waferschaal met behulp van monstervolumes op nanoliterschaal (Figuur 5.8). Deze technologie genereert lange en nauwkeurige sequentielezingen, terwijl veel van de significante tekortkomingen van de conventionele Sanger-methode worden verholpen (bijv. hoog verbruik van dure reagentia, afhankelijkheid van dure apparatuur, personeelsintensieve manipulaties, enz.) door de Sanger-sequencingstappen te integreren en te automatiseren .

Afbeelding 5.8 Lab-On-A-Chip-technologieën. Voorbeeld van een microfluïdisch lab-on-a-chip-apparaat dat op een polystyreenschaal zit. Roestvrijstalen naalden die in het apparaat worden gestoken, dienen als toegangspunten voor vloeistoffen in kleine kanalen in het apparaat, die ongeveer zo groot zijn als een mensenhaar.

Afbeelding door Nationaal Instituut voor Standaarden en Technologie (NIST)


  • Sequentie van de volgende generatie

Next-generation sequencing (NGS), ook bekend als high-throughput sequencing, is de verzamelnaam die wordt gebruikt om een ​​aantal verschillende moderne sequencing-technologieën te beschrijven. Deze technologieën maken sequencing van DNA en RNA veel sneller en goedkoper mogelijk dan de eerder gebruikte Sanger-sequencing, en hebben als zodanig een revolutie teweeggebracht in de studie van genomica en moleculaire biologie. Dergelijke technologieën omvatten:

Illumina-volgorde - In NGS worden grote aantallen korte uitlezingen in een enkele slag gesequenced met behulp van de hierboven beschreven lab-on-a-chip-technologie. Om dit te doen, moet het invoermonster in korte secties worden gesplitst. Bij Illumina-sequencing worden 100-150bp-uitlezingen gebruikt. Iets langere fragmenten worden aan generieke adapters geligeerd en met behulp van de adapters op een objectglaasje gegloeid. PCR wordt uitgevoerd om elke uitlezing te versterken, waardoor een plek ontstaat met veel exemplaren van dezelfde uitlezing. Ze worden vervolgens gescheiden in enkelstrengs DNA om de sequentie te bepalen (Figuur 5.9).

Afbeelding 5.9 Procedure voor Illumina-sequencing. (A) De dia met PCR-versterkte fragmenten van DNA wordt overspoeld met nucleotiden en DNA-polymerase. Deze nucleotiden zijn fluorescerend gelabeld waarbij elke kleur overeenkomt met een specifieke base. De reacties hebben ook een terminator, zodat er maar één base tegelijk wordt toegevoegd. (B) Er wordt een afbeelding van de dia genomen. Op elke reactielocatie zal er een fluorescerend signaal zijn dat aangeeft dat er een specifieke base is toegevoegd. (C) De gegevens worden geregistreerd en de dia wordt vervolgens voorbereid op de volgende cyclus. Ter voorbereiding worden de terminators verwijderd, waardoor de volgende base kan worden toegevoegd, en het fluorescerende signaal wordt gesplitst, waardoor wordt voorkomen dat het fluorescerende signaal het volgende beeld besmet. Het proces wordt herhaald, waarbij één nucleotide per keer wordt toegevoegd (G, A, T of C) en beeldvorming ertussen. Alle sequentielezingen zullen dezelfde lengte hebben als bij elke cyclus enkele basen worden toegevoegd.

Afbeelding gewijzigd van EMBL-EBI

Terug naar de top


Roche 454-Sequencingis vergelijkbaar met het Illumina-proces, maar kan veel langere uitlezingen volgen. Net als Illumina doet het dit door meerdere uitlezingen tegelijk te rangschikken door optische signalen te lezen terwijl basen worden toegevoegd.

Net als in Illumina wordt het DNA of RNA gefragmenteerd in kortere reads, in dit geval tot 1 kb (1.000 bp). Generieke adapters worden aan de uiteinden toegevoegd en deze worden geanneald tot kralen, één DNA-fragment per kraal. De fragmenten worden vervolgens geamplificeerd door middel van PCR met gebruikmaking van adaptor-specifieke primers. Elke kraal wordt vervolgens in een enkel putje van een objectglaasje geplaatst. Dus elk putje zal een enkele kraal bevatten, bedekt met veel PCR-kopieën van een enkele sequentie. De putjes bevatten ook DNA-polymerase- en sequentiebuffers (Figuur 5.10).

5.10 Procedure voor Roche 454 Sequencing. (A) Zodra het PCR-product aan de kraal is bevestigd, wordt de dia overspoeld met een van de vier NTP-soorten. Waar dit nucleotide de volgende is in de sequentie, wordt het toegevoegd aan de gelezen sequentie. Als die ene base zich herhaalt, wordt er meer toegevoegd. Dus als we overstromen met Guanine-basen, en de volgende in de reeks is G, dan wordt één G toegevoegd, maar als het volgende deel van de reeks GGGG is, dan worden er vier G's toegevoegd. (B) De toevoeging van elk nucleotide geeft een lichtsignaal af. Deze locaties van signalen worden gedetecteerd en gebruikt om te bepalen aan welke kralen de nucleotiden worden toegevoegd. (C) De NTP-mix wordt weggespoeld. De volgende NTP-mix wordt nu toegevoegd en het proces wordt herhaald, waarbij de vier NTP's worden doorlopen. Alle sequentielezingen van 454 sequencing zullen verschillende lengtes hebben, omdat bij elke cyclus verschillende aantallen basen worden toegevoegd.

Afbeelding gewijzigd door EMBL-EBI


Nieuwere technologieën zoals de Ion Torrent-technologieen de MinION-systeem sequentiegegevens detecteren met behulp van elektrische signalen op een halfgeleiderchip, in plaats van het optisch lezen van kleurstof-gelabelde nucleotiden. Dit is mogelijk omdat de toevoeging van een dNTP aan het DNA-polymeer de afgifte van een H . veroorzaakt+ ion (Figuur 5.11). Net als bij andere soorten NGS is het ingevoerde DNA of RNA gefragmenteerd, dit keer ~200bp. Adapters worden toegevoegd en één molecuul wordt op een kraal geplaatst. De moleculen worden op de korrel geamplificeerd door emulsie-PCR. Elke kraal wordt in een enkele put van een dia geplaatst.

Afbeelding 5.11 Ion Torrent Sequencing-technologie. (A) Net als bij 454 sequencing, wordt de dia overspoeld met een enkele soort dNTP, samen met buffers en polymerase. De pH wordt in elk van de putjes gevolgd na de toevoeging van het specifieke dNTP. De pH zal afnemen wanneer het dNTP wordt opgenomen in het polymeer waardoor een proton vrijkomt (H+). De veranderingen in pH stellen ons in staat om te bepalen of die base en hoeveel daarvan aan de afgelezen reeks zijn toegevoegd. (B) de dNTP's worden weggespoeld en het proces wordt herhaald door de verschillende dNTP-soorten te fietsen. (C) De eventuele pH-verandering wordt gebruikt om te bepalen hoeveel basen (indien aanwezig) bij elke cyclus zijn toegevoegd.

Afbeelding gewijzigd van EMBL-EBI


Dergelijke ionentechnologieën die geen optische detectie vereisen, hebben de productie mogelijk gemaakt van kleine draagbare DNA-sequencing-apparaten die kunnen worden aangesloten op de USB-drive van een laptopcomputer en in het veld kunnen worden gebruikt onder realtime-verzamelingsomstandigheden (Figuur 5.12).

Afbeelding 5.12 Het draagbare realtime sequencing-apparaat MinION. De MinION kan tot 30 Gb aan DNA-sequentiegegevens per monster produceren

Afbeelding door Oxford Nanopore-technologieën


De vier belangrijkste voordelen van NGS ten opzichte van klassieke Sanger-sequencing zijn:

Steekproefgrootte:

NGS is aanzienlijk goedkoper, sneller, heeft aanzienlijk minder DNA nodig en is nauwkeuriger en betrouwbaarder dan Sanger-sequencing. Laten we dit nader bekijken. Voor Sanger-sequencing is voor elke uitlezing een grote hoeveelheid template-DNA nodig. Er zijn verschillende strengen template-DNA nodig voor elke base waarvan de sequentie wordt bepaald (dwz voor een sequentie van 100 bp zou u vele honderden kopieën nodig hebben, voor een sequentie van 1000 bp zou u vele duizenden kopieën nodig hebben), aangezien een streng die op elke base eindigt, nodig om een ​​volledige reeks te construeren. In NGS kan een sequentie worden verkregen uit een enkele streng. Bij beide soorten sequentiebepaling worden meerdere verspringende kopieën genomen voor contigconstructie en sequentievalidatie.

Snelheid

NGS is op twee manieren sneller dan Sanger-sequencing. Ten eerste kan de chemische reactie worden gecombineerd met de signaaldetectie in sommige versies van NGS, terwijl dit bij Sanger-sequencing twee afzonderlijke processen zijn. Ten tweede, en belangrijker, kan er maar één read (maximaal ~1kb) tegelijk worden genomen in Sanger-sequencing, terwijl NGS enorm parallel is, waardoor 300Gb DNA kan worden gelezen op een enkele run op een enkele chip.

Kosten

Door de kortere tijd, mankracht en reagentia in NGS zijn de kosten veel lager. De eerste menselijke genoomsequentie kostte in 2003 ongeveer $ 2,7 miljard. Met behulp van moderne Sanger-sequencingmethoden, geholpen door gegevens van de bekende sequentie, kostte een volledig menselijk genoom in 2006 nog steeds $ 300.000. Het sequencen van een menselijk genoom met NGS kost vandaag ongeveer $ 1.000.

Nauwkeurigheid

Herhalingen zijn intrinsiek aan NGS, omdat elke uitlezing wordt versterkt vóór de sequentiebepaling, en omdat het afhankelijk is van veel korte overlappende uitlezingen, zodat elke sectie van DNA of RNA meerdere keren wordt gesequenced. Omdat het zoveel sneller en goedkoper is, is het ook mogelijk om meer herhalingen te doen dan met Sanger-sequencing. Meer herhalingen betekent een grotere dekking, wat leidt tot een nauwkeurigere en betrouwbaardere reeks, zelfs als individuele metingen minder nauwkeurig zijn voor NGS.

Sanger-sequencing kan worden gebruikt om veel langere sequentielezingen te geven. Het parallelle karakter van NGS betekent echter dat langere uitlezingen kunnen worden opgebouwd uit vele aaneengesloten korte uitlezingen.

DNA-synthesetechnieken

DNA-synthese is de natuurlijke of kunstmatige aanmaak van deoxyribonucleïnezuur (DNA) moleculen. De term DNA-synthese kan verwijzen naar: DNA-replicatie (die in hoofdstuk XX meer in detail zal worden behandeld), polymerasekettingreactie (PCR)of gensynthese (fysiek creëren van kunstmatige gensequenties).

  • Polymerasekettingreactie (PCR)

Polymerasekettingreactie (PCR) verwijst naar een techniek die veel wordt gebruikt in de basis- en biomedische wetenschappen. PCR is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-segmenten te amplificeren voor een breed scala aan laboratorium- en/of klinische toepassingen. Voortbouwend op het werk van Panet en Khorana's succesvolle amplificatie van DNA in vitro, ontwikkelden Kary Mullis en collega's PCR in het begin van de jaren tachtig, nadat ze slechts tien jaar later een Nobelprijs hadden ontvangen. Door meer dan de miljard-voudige versterking van specifieke doelregio's mogelijk te maken, is het instrumenteel geworden in veel toepassingen, waaronder het klonen van genen, de diagnose van infectieziekten en het screenen van prenatale zuigelingen op schadelijke genetische afwijkingen.

grondbeginselen

De belangrijkste componenten van PCR zijn een sjabloon, primers, vrije nucleotidebasen en het DNA-polymerase-enzym. De DNA-sjabloonbevat het specifieke gebied dat u wilt versterken, zoals het DNA dat bijvoorbeeld uit een haar wordt gehaald. Inleidingenof oligonucleotiden, zijn korte strengen enkelstrengs DNA die complementair zijn aan het 3'-uiteinde van elk doelgebied. Zowel een voorwaartse als een achterwaartse primer zijn vereist, één voor elke complementaire DNA-streng. DNA-polymerase is het enzym dat DNA-replicatie uitvoert. Thermostabiele analogen van DNA-polymerase I, zoals Taq-polymerase, dat oorspronkelijk werd gevonden in een bacterie die in warmwaterbronnen groeit, is een veelvoorkomende keuze vanwege de weerstand tegen de verwarmings- en koelcycli die nodig zijn voor PCR.

PCR maakt gebruik van de complementaire basenparing, dubbelstrengige aard en smelttemperatuur van DNA-moleculen. Dit proces omvat het doorlopen van 3 opeenvolgende rondes van temperatuurafhankelijke reacties: DNA-smelten (denaturatie), annealing en enzymgestuurde DNA-replicatie (verlenging). Denaturatiebegint met het verwarmen van de reactie tot ongeveer 95OC, waardoor de waterstofbruggen worden verbroken die de twee strengen sjabloon-DNA bij elkaar houden. Vervolgens wordt de reactie teruggebracht tot ongeveer 50 tot 65OC, afhankelijk van de fysisch-chemische variabelen van de primers, waardoor gloeienvan complementaire basenparen. De primers, die in overmaat aan de oplossing worden toegevoegd, binden aan het begin van het 3'-uiteinde van elke matrijsstreng en voorkomen herhybridisatie van de matrijsstreng met zichzelf. Ten slotte, enzymgestuurde DNA-replicatie, of verlenging, begint met het instellen van de reactietemperatuur op de hoeveelheid die de activiteit van DNA-polymerase optimaliseert, die ongeveer 75 tot 80 isOC. Op dit punt synthetiseert DNA-polymerase, dat dubbelstrengs DNA nodig heeft om met replicatie te beginnen, een nieuwe DNA-streng door vrije nucleotiden in oplossing te assembleren in de 3'- naar 5'-richting om 2 volledige sets complementaire strengen te produceren. Het nieuw gesynthetiseerde DNA is nu identiek aan de sjabloonstreng en zal als zodanig worden gebruikt in de progressieve PCR-cycli (Video 5.1).

[video width="1280" height="720" mp4="https://wou.edu/chemistry/files/2019/09/Figs1.mp4"][/video]

Video door Mousa Ghannam

Terug naar de top


Aangezien eerder gesynthetiseerde DNA-strengen als sjablonen dienen, neemt de amplificatie van DNA met behulp van PCR exponentieel toe, waarbij de kopieën van DNA aan het einde van elke replicatiestap verdubbelen. De exponentiële replicatie van het doel-DNA bereikt uiteindelijk een plateau van ongeveer 30 tot 40 cycli, voornamelijk als gevolg van reagensbeperking, maar kan ook te wijten zijn aan remmers van de polymerasereactie die in het monster worden gevonden, zelfontharding van het accumulerende product en accumulatie van pyrofosfaatmoleculen.

Realtime PCR

Bij zijn komst was de PCR-technologie beperkt tot kwalitatieve en/of semi-kwantitatieve analyse vanwege beperkingen op het vermogen om nucleïnezuren te kwantificeren. Op dat moment werd het DNA-product, om te verifiëren of het doelgen met succes was geamplificeerd, op grootte gescheiden via agarosegelelektroforese. Ethidiumbromide, een molecuul dat fluoresceert wanneer het wordt gebonden aan dsDNA, kon een ruwe schatting van de hoeveelheid DNA geven door de helderheid van gescheiden banden ruwweg te vergelijken, maar was niet gevoelig genoeg voor rigoureuze kwantitatieve analyse.

Verbeteringen in de ontwikkeling en instrumentatie van fluorofoor leidden tot thermocyclers die niet langer alleen het DNA van het eindproduct hoefden te meten. Dit proces, bekend als realtime-PCR,of kwantitatieve PCR (qPCR), heeft de detectie van dsDNA tijdens amplificatie mogelijk gemaakt. qPCR-thermocyclers zijn uitgerust met de mogelijkheid om fluoroforen op specifieke golflengten te exciteren, hun emissie te detecteren met een fotodetector en de waarden vast te leggen. De gevoelige verzameling van numerieke waarden tijdens amplificatie heeft de kwantitatieve analytische kracht sterk verbeterd.

Er zijn twee hoofdtypen fluoroforen die in qPCR worden gebruikt: die welke specifiek binden aan een bepaalde doelsequentie en die welke dat niet doen. De gevoeligheid van fluoroforen is een belangrijk aspect geweest van de ontwikkeling van qPCR. Een van de meest effectieve en meest gebruikte niet-specifieke markers, SYBR Green, vertoont na binding aan de kleine groef van dsDNA een 1000-voudige toename in fluorescentie vergeleken met vrij zijn in oplossing (video 5.1). Als echter nog meer specificiteit gewenst is, kan een sequentiespecifieke oligonucleotide of hybridisatieprobe worden toegevoegd, die op een bepaald punt voor de primer (na het 3'-uiteinde) aan het doelwitgen bindt. Deze hybridisatieprobes bevatten een reportermolecuul aan het 5'-uiteinde en een quencher-molecuul aan het 3'-uiteinde. Het quencher-molecuul verhindert effectief dat de reporter fluoresceert terwijl de sonde intact is. Bij contact met DNA-polymerase I wordt de hybridisatieprobe echter gesplitst, waardoor de fluorescentie van de kleurstof mogelijk wordt (video 5.1).

Omgekeerde transcriptie PCR

Sinds de komst is de PCR-technologie creatief uitgebreid, en omgekeerde transcriptie PCR (RT-PCR) is een van de belangrijkste vorderingen. Real-time PCR wordt vaak verward met reverse-transcriptie PCR, maar het zijn aparte technieken. Bij RT-PCR wordt het geamplificeerde DNA afgeleid van mRNA met behulp van reverse-transcriptase-enzymen om een ​​cDNA-kopie van het gen te produceren. Met behulp van primersequenties voor genen van belang, kunnen traditionele PCR-methoden worden gebruikt met het cDNA om de expressie van genen kwalitatief te bestuderen. Momenteel wordt reverse-transcriptie PCR vaak gebruikt met real-time PCR, waardoor men de relatieve verandering in genexpressie over verschillende monsters kwantitatief kan meten.

Kwesties van zorg

Een nadeel van PCR-technologie is dat deze extreem gevoelig is. Sporen van RNA- of DNA-verontreiniging in het monster kunnen uiterst misleidende resultaten opleveren. Een ander nadeel is dat de primers die zijn ontworpen voor PCR sequentiegegevens vereisen en daarom alleen kunnen worden gebruikt om de aan- of afwezigheid van een bekend pathogeen of gen te identificeren. Een andere beperking is dat de primers die voor PCR worden gebruikt soms niet-specifiek kunnen hechten aan sequenties die vergelijkbaar zijn met, maar niet identiek zijn aan het doelgen.

Een ander potentieel probleem bij het gebruik van PCR is de mogelijkheid van vorming van primerdimeer (PD). PD is een potentieel bijproduct en bestaat uit primermoleculen die met elkaar zijn gehybridiseerd vanwege de reeksen complementaire basen in de primers. De DNA-polymerase amplificeert de PD, wat leidt tot competitie voor PCR-reagentia die kunnen worden gebruikt om de doelsequenties te amplificeren.

Klinische betekenis

PCR-amplificatie is een onmisbaar hulpmiddel bij verschillende toepassingen binnen de geneeskunde. Vaak wordt het gebruikt om te testen op de aanwezigheid van specifieke allelen, zoals bij het screenen van aanstaande ouders op genetische dragers, maar het kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van ziekte direct en op mutaties in het zich ontwikkelende embryo te diagnosticeren. De eerste keer dat PCR op deze manier werd gebruikt, was bijvoorbeeld voor de diagnose van sikkelcelanemie door de detectie van een enkele genmutatie.

Bovendien heeft PCR een revolutie teweeggebracht in het diagnostische potentieel voor infectieziekten, omdat het kan worden gebruikt om snel de identiteit te bepalen van microben die traditioneel niet konden worden gekweekt, of die weken nodig hadden om te groeien. Pathogenen die routinematig worden gedetecteerd met behulp van PCR omvatten Mycobacterium tuberculosis, humaan immunodeficiëntievirus, herpes simplex-virus, syfilis en talloze andere pathogenen. Bovendien wordt qPCR niet alleen gebruikt voor het testen van de kwalitatieve aanwezigheid van microben, maar ook om de bacteriële, schimmel- en virale ladingen te kwantificeren.

De gevoeligheid van diagnostische hulpmiddelen voor mutaties voor oncogenen en tumorsuppressiegenen is ten minste 10.000 keer verbeterd dankzij PCR, waardoor een eerdere diagnose van kankers zoals leukemie mogelijk is. PCR heeft ook meer genuanceerde en geïndividualiseerde therapieën voor kankerpatiënten mogelijk gemaakt. Bovendien kan PCR worden gebruikt voor de weefseltypering die van vitaal belang is voor orgaanimplantatie en is zelfs voorgesteld als vervanging voor op antilichamen gebaseerde tests voor bloedgroep. PCR heeft ook klinische toepassingen op het gebied van prenataal testen voor verschillende genetische ziekten en/of klinische pathologieën. Monsters worden verkregen via vruchtwaterpunctie of vlokkentest.

In de forensische geneeskunde worden korte stukjes herhalend, zeer polymorf DNA, bedacht korte tandemherhalingen (STR's), geamplificeerd en gebruikt om specifieke variatie binnen genen te vergelijken om individuen te differentiëren.[9] Primers die specifiek zijn voor de loci van deze STR's worden gebruikt en geamplificeerd met behulp van PCR. Verschillende loci bevatten STR's in het menselijk genoom en de statistische kracht van deze techniek wordt verbeterd door meerdere sites te controleren.

Kunstmatige gensynthese, ook wel bekend als DNA afdrukken is een methode in de synthetische biologie die wordt gebruikt om kunstmatige genen te creëren in het laboratorium. Op basis van vaste-fase-DNA-synthese verschilt het van moleculaire klonering en polymerasekettingreactie (PCR) doordat het niet hoeft te beginnen met reeds bestaande DNA-sequenties.Daarom is het mogelijk om een ​​volledig synthetisch dubbelstrengs DNA-molecuul te maken zonder duidelijke beperkingen op nucleotidesequentie of grootte.

De methode is gebruikt om functionele bacteriële of gistchromosomen te genereren die ongeveer een miljoen basenparen bevatten. Het creëren van nieuwe nucleobasenparen naast de twee basenparen in de natuur zou de genetische code aanzienlijk kunnen uitbreiden.

De synthese van het eerste volledige gen, een gist-tRNA, werd in 1972 aangetoond door Har Gobind Khorana en collega's. De synthese van de eerste peptide- en eiwitcoderende genen werd uitgevoerd in de laboratoria van respectievelijk Herbert Boyer en Alexander Markham.

Commerciële gensynthesediensten zijn nu beschikbaar. Benaderingen zijn meestal gebaseerd op een combinatie van organische chemie en moleculair-biologische technieken en volledige genen kunnen "de novo" worden gesynthetiseerd, zonder dat sjabloon-DNA nodig is. Gensynthese is een belangrijk hulpmiddel op vele gebieden van recombinant-DNA-technologie, waaronder heterologe genexpressie, vaccinontwikkeling, gentherapie en moleculaire engineering. De synthese van nucleïnezuursequenties kan economischer zijn dan klassieke klonerings- en mutageneseprocedures. Het is ook een krachtig en flexibel technisch hulpmiddel voor het creëren en ontwerpen van nieuwe DNA-sequenties en eiwitfuncties.

Gen-optimalisatie

Terwijl het vermogen om steeds langere stukken DNA efficiënt en tegen lagere prijzen te maken een technologische drijfveer is op dit gebied, wordt er steeds meer aandacht besteed aan het verbeteren van het ontwerp van genen voor specifieke doeleinden. Vroeg in het tijdperk van genoomsequencing werd gensynthese gebruikt als een (dure) bron van cDNA's die werden voorspeld door genomische of gedeeltelijke cDNA-informatie, maar die moeilijk te klonen waren. Omdat bronnen van op sequentie geverifieerd gekloond cDNA beschikbaar zijn gekomen van hogere kwaliteit, is deze praktijk minder urgent geworden.

Het produceren van grote hoeveelheden eiwit uit gensequenties (of in ieder geval de eiwitcoderende regio's van genen, het open leeskader) dat in de natuur wordt gevonden, kan soms moeilijk zijn en is een probleem met voldoende impact dat wetenschappelijke conferenties aan het onderwerp zijn gewijd. Veel van de meest interessante eiwitten waarnaar door moleculair biologen wordt gezocht, worden normaal gereguleerd om in zeer lage hoeveelheden tot expressie te worden gebracht in wildtype cellen. Het opnieuw ontwerpen van deze genen biedt in veel gevallen een middel om de genexpressie te verbeteren. Het herschrijven van het open leeskader is mogelijk vanwege de degeneratie van de genetische code. Zo is het mogelijk om tot ongeveer een derde van de nucleotiden in een open leesraam te veranderen en toch hetzelfde eiwit te produceren. Het beschikbare aantal alternatieve ontwerpen dat mogelijk is voor een bepaald eiwit is astronomisch. Voor een typische eiwitsequentie van 300 aminozuren zijn er meer dan 10150 codoncombinaties die zullen coderen voor een identiek eiwit. Codonoptimalisatie of het vervangen van zelden gebruikte codons door meer algemene codons hebben soms dramatische effecten. Verdere optimalisaties zoals het verwijderen van secundaire RNA-structuren kunnen ook worden opgenomen. Tenminste in het geval van E coli, wordt eiwitexpressie gemaximaliseerd door voornamelijk codons te gebruiken die overeenkomen met tRNA die aminozuurlading behouden tijdens uithongering. Computerprogramma's die zijn geschreven om deze uit te voeren, en andere gelijktijdige optimalisaties worden gebruikt om de enorme complexiteit van de taak aan te pakken. Een goed geoptimaliseerd gen kan eiwitexpressie 2 tot 10 keer verbeteren, en in sommige gevallen zijn meer dan 100 keer verbeteringen gemeld. Vanwege het grote aantal nucleotide-veranderingen die in de oorspronkelijke DNA-sequentie zijn aangebracht, is de enige praktische manier om de nieuw ontworpen genen te creëren, het gebruik van gensynthese.

Oligonucleotide synthese

Oligonucleotiden worden chemisch gesynthetiseerd met behulp van bouwstenen die nucleosidefosforamidieten worden genoemd. Dit kunnen normale of gemodificeerde nucleosiden zijn die beschermende groepen hebben om te voorkomen dat hun aminen, hydroxylgroepen en fosfaatgroepen een verkeerde interactie aangaan. Eén fosforamidiet wordt tegelijk toegevoegd, de 5'-hydroxylgroep wordt ontschermd en een nieuwe base wordt toegevoegd, enzovoort. De keten groeit in de richting van 3' naar 5', wat achteruit is ten opzichte van DNA-biosynthese in vivo. Aan het einde worden alle beschermende groepen verwijderd.

Afbeelding 5.13 Vierstaps fosforamidiet oligodeoxynucleotide synthesecyclus. De fosforamidietmethode, ontwikkeld door Marvin Caruthers in het begin van de jaren tachtig en verbeterd door de toepassing van vastefasetechnologie en automatisering, is nu stevig verankerd als de voorkeursmethode. De synthese van fosforamidietoligonucleotiden verloopt in de 3 tot 5 richting (tegenover de 5 tot 3 richting van DNA-biosynthese bij DNA-replicatie). Per synthesecyclus wordt één nucleotide toegevoegd. De fosforamidiet-DNA-synthesecyclus bestaat uit een reeks stappen die in de figuur worden beschreven:

Afbeelding door Ni, S., et al (2017) International Journal of Molecular Sciences 18(8):1683


Omdat het echter een chemisch proces is, treden er verschillende onjuiste interacties op die tot defecte producten leiden. Hoe langer de oligonucleotidesequentie die wordt gesynthetiseerd, hoe meer defecten er zijn, dus dit proces is alleen praktisch voor het produceren van korte sequenties van nucleotiden. De huidige praktische limiet is ongeveer 200 bp (basenparen) voor een oligonucleotide met voldoende kwaliteit om direct voor een biologische toepassing te worden gebruikt. HPLC kan worden gebruikt om producten met de juiste volgorde te isoleren. Ondertussen kan een groot aantal oligo's parallel worden gesynthetiseerd op genchips. Voor optimale prestaties bij daaropvolgende gensyntheseprocedures moeten ze afzonderlijk en op grotere schaal worden bereid.

  • DNA-synthese en synthetische biologie

De aanzienlijke daling van de kosten van gensynthese in de afgelopen jaren als gevolg van de toenemende concurrentie van bedrijven die deze service leveren, heeft geleid tot het vermogen om volledige bacteriële plasmiden te produceren die nooit in de natuur hebben bestaan. Het gebied van synthetische biologie maakt gebruik van de technologie om synthetische biologische circuits te produceren, dit zijn stukken DNA die zijn gemanipuleerd om de genexpressie in cellen te veranderen en ervoor te zorgen dat de cel een gewenst product produceert.

Het vermogen om synthetisch DNA te produceren zal de ontwikkeling van milieu-, medische en commercieel relevante producten mogelijk maken. In 2015 bijvoorbeeld, Novartis, in samenwerking met de Synthetic Genomics Vaccines inc. en de Amerikaanse Biomedical Advanced Research and Development Authority, kondigden aan dat ze effectief een synthetisch DNA-griepvaccin hadden gecreëerd. Nieuwe synthetische DNA-vaccins zijn veelbelovend om een ​​alternatief te bieden voor de huidige, uit eieren geproduceerde conventionele vaccins die kunnen worden geplaagd door een lage werkzaamheid.

DNA-vaccins kunnen veel problemen vermijden die verband houden met de productie van vaccins op basis van eieren door virale eiwitten in gastheercellen te genereren. Om een ​​DNA-vaccin te creëren, wordt een voor antigeen coderend gen gekloneerd in een niet-replicatief expressieplasmide, dat via traditionele vaccinatieroutes aan de gastheer wordt afgeleverd. Gastheercellen die het plasmide opnemen, brengen het vaccinantigeen tot expressie dat aan immuuncellen kan worden aangeboden via de major histocompatibility complex (MHC) routes. Activering van CD4+ T-helpercellen na MHC klasse II-presentatie van uitgescheiden DNA-vaccineiwit is van cruciaal belang voor de productie van antigeenspecifieke antilichamen (Figuur 5.14).

Figuur 5.14 Aanmaak van een DNA-vaccin. Een antigeen gen wordt gesynthetiseerd en gekloneerd in een plasmidevector. (Stappen met betrekking tot het kloonproces worden in meer detail beschreven in paragraaf 5.3). Het DNA-vaccin wordt aan de gastheer afgeleverd, waar het tot expressie zal worden gebracht om antigeen te produceren en te presenteren aan het immuunsysteem van de gastheer.

Figuur door Lee, L.Y.Y., Izzard, L., en Hurt, AC (2018) Frontiers in Immunology, doi: 10.3389/fimmu.2018.01568

Terug naar de top


Na twee decennia van onderzoek is de DNA-vaccintechnologie aan het rijpen - verschillende veterinaire DNA-vaccins hebben momenteel een vergunning voor het West-Nijlvirus en melanoom, en het is opmerkelijk dat het eerste commerciële DNA-vaccin tegen H5N1 bij kippen onlangs voorwaardelijk is goedgekeurd door de USDA. Bovendien bieden lopende grote dierproeven met DNA-vaccins tegen andere ziekten, zoals tegen HIV, hepatitis en Zika-virus, waardevolle inzichten die kunnen worden toegepast op het ontwerp van influenza-DNA-vaccins. Veelbelovende benaderingen zijn voortgekomen uit de talrijke onderzoeken die verschillende DNA-vaccinformuleringen en toedieningssystemen evalueren, maar een strategie die consequent bescherming tegen influenza in grote diermodellen uitlokt, is nog niet naar voren gekomen. Succesvolle afgifte van plasmiden en het gebruik van geschikte adjuvantia blijven belangrijke uitdagingen die moeten worden aangepakt voordat influenza-DNA-vaccins effectief worden voor menselijk gebruik.


Genbibliotheken maken (met diagram)

De verzameling DNA-fragmenten (met name genen) van een bepaalde soort vertegenwoordigt genenbibliotheken.

De creatie of constructie van genbibliotheken (in grote lijnen genomische bibliotheken) wordt bewerkstelligd door het volledige genoom (volledig DNA van een cel) te isoleren dat in fragmenten wordt geknipt en in geschikte vectoren wordt gekloneerd.

Vervolgens kan de specifieke kloon die het gewenste (doelwit)-DNA draagt, worden geïdentificeerd, geïsoleerd en gekarakteriseerd. Op deze manier kan een bibliotheek van genen of klonen (op passende wijze beschouwd als genenbank) voor het gehele genoom van een soort worden geconstrueerd. De grootte van genomen bij verschillende soorten is variabel (Tabel 9.1). Een complete genenbibliotheek voor elk organisme bevat al het genomische DNA.

Biotechnologen zijn vooral geïnteresseerd in het isoleren van genen (en dus het creëren van genenbibliotheken) die coderen voor eiwitten. Er is een duidelijk verschil in de genen van prokaryotische en eukaryote cellen. In prokaryotische organismen zijn de structurele genen die coderen voor eiwitten continu. In het geval van eukaryoten worden de coderende gebieden (exons) van structurele genen echter gescheiden door niet-coderende gebieden (introns). Om deze reden is de constructie van genbibliotheken voor eukaryoten ingewikkelder.

Een genenbibliotheek maken:

Het DNA van het bronorganisme wordt verteerd door restrictie-endonuclease (bijv. EcoRI), wat resulteert in fragmenten. Het is wenselijk om omstandigheden te creëren zodat een gedeeltelijke vertering en geen volledige vertering optreedt. Op deze manier kunnen alle mogelijke DNA-fragmenten van variabele grootte worden geproduceerd. De gedeeltelijke digestie van een DNA met een restrictie-endonuclease is weergegeven in Fig. 9.1.

De splitsingen vinden op verschillende plaatsen plaats om te resulteren in DNA-fragmenten van verschillende lengtes, waarvan sommige groot kunnen zijn en andere klein. In de praktijk wordt een combinatie van restrictie-enzymen gebruikt om bron-DNA te verteren om een ​​groot aantal DNA-fragmenten vrij te maken. De gewenste fragmenten kunnen worden geïsoleerd en gekloneerd.

Sommige werknemers gebruiken de term shotgun-experiment (of shotgun-benadering) voor het maken van willekeurige klonen (zonder ze noodzakelijkerwijs allemaal te identificeren) uit een genomisch DNA. Bij shotgun-benadering wordt het DNA onderworpen aan willekeurige splitsing door restrictie-endonucleasen.

Maniatis-techniek voor het maken van een genenbibliotheek:

In de door Maniatis et al (1978) ontwikkelde techniek worden twee restrictie-endonucleasen gebruikt om het doel-DNA te knippen. Gedeeltelijke digestie maakt de vorming mogelijk van de meeste DNA-fragmenten met een lengte van 10-30 kb. De fragmenten overlappen elkaar vaak en kunnen worden gefractioneerd door gelelektroforese. De geïsoleerde fragmenten (ongeveer 20 kb groot) worden in de λ-faagvector geïnsereerd en gekloneerd.

Het opzetten van een genenbibliotheek voor mensen:

Het menselijke cellulaire DNA (het gehele genoom) kan worden onderworpen aan digestie door restrictie-endonucleasen (bijv. EcoRI). De gevormde fragmenten zijn gemiddeld ongeveer 4 kb groot (d.w.z. 4000 stikstofbasen). Elk menselijk chromosoom, dat ongeveer 100.000 kb bevat, kan in ongeveer 25.000 DNA-fragmenten worden geknipt. Omdat de mens 23 verschillende chromosomen heeft (24 bij de mens), zijn er in totaal 575.000 fragmenten van 4 kb lengte gevormd. Onder deze 575.000 DNA-fragmenten bevindt zich het DNA of gen van belang (zeg insulinegen).

Nu is de selectie van een vector en klonen proces. E.coli, een ongevaarlijke bacterie voor de mens, wordt het meest gebruikt. De plasmiden van E. coli worden geïsoleerd. Ze worden verteerd door hetzelfde restrictie-enzym dat werd gebruikt voor het knippen van het menselijk genoom om open plasmiden te vormen. De menselijke chromosomale DNA-fragmenten en open plasmiden worden samengevoegd om gerecombineerde plasmiden te produceren.

Deze plasmiden bevatten verschillende DNA-fragmenten van mensen. De gerecombineerde plasmiden worden in E. coli ingevoegd en de cellen vermenigvuldigen zich (Fig. 9.2). De E. coli-cellen bezitten al het menselijke DNA in fragmenten. Er moet echter aan worden herinnerd dat elke E. coli-cel verschillende DNA-fragmenten bevat. Alle E. coli-cellen samen vertegenwoordigen gezamenlijk de genomische bibliotheek (met ongeveer 575.000 DNA-fragmenten).

Andere vectoren voor het maken van genomische bibliotheken:

In plaats van fagen en plasmiden zijn andere vectoren in gebruik voor de constructie van grote DNA-bibliotheken. Deze omvatten cosmiden, bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC's) en kunstmatige gistchromosomen (YAC's). Deze worden beschouwd als vectoren met een hoge capaciteit. Hoewel ze ideaal zijn voor het construeren van genbibliotheken, zijn er veel praktische moeilijkheden verbonden aan het gebruik ervan.

PCR als alternatief voor de constructie van genomische bibliotheek:

PCR is een techniek voor amplificatie van een specifieke DNA-sequentie. PCR met primers kan worden gebruikt om doel-DNA rechtstreeks uit het genoom te isoleren. PCR dient dus als een alternatief voor de constructie van een DNA-bibliotheek (genenbibliotheek) door middel van klonering. Dit is niet altijd mogelijk omdat PCR-techniek kan worden gebruikt voor amplificatie van DNA's met een korte lengte (meestal 1-2 kb met een maximum van 5 kb). Verder veroorzaakt de hoge temperatuur die bij PCR wordt gebruikt soms schade aan basen en veroorzaakt het inkepingen in DNA-strengen.

Met enkele aanpassingen in de PCR is het nu mogelijk om DNA-fragmenten te amplificeren tot een lengte van 22 kb van het humane genomische DNA. Dit wordt bereikt door een combinatie van twee DNA-polymerase-enzymen te gebruiken, naast het verlagen van de reactietemperatuur. Een van de DNA-polymerasen heeft proefleesactiviteit om de niet-overeenkomende basen te verwijderen.

Sommige commerciële bedrijven bieden in feite enzymcocktails die bij uitstek geschikt zijn voor lange PCR, bijvoorbeeld het TaqPlus Long PCR-systeem dat op de markt wordt gebracht door Strata-gen. Het bevat Taq-polymerase en het thermostabiele proefleesenzym Pfee-polymerase.

Lange PCR is toegepast voor de gestructureerde analyse van menselijke genen en genomen van HIV. Het is onwaarschijnlijk dat lange PCR de constructie van genomische bibliotheken zal vervangen. Dit komt omdat het creëren van DNA-bibliotheken permanent is, terwijl lange PCR tijdelijk is. Verder kan PCR worden gebruikt voor het amplificeren van geselecteerde DNA-fragmenten (van belang) uit genomische bibliotheken.

Fragmentbibliotheken:

Biotechnologen komen vaak minuscule hoeveelheden uitgangsmateriaal tegen, bijvoorbeeld afzonderlijke cellen, gefixeerde weefsels, fossielen enz. Het is vrij moeilijk om traditionele technieken toe te passen voor het construeren van genomische bibliotheken uit dergelijke monsters. PCR is bij uitstek geschikt voor isolatie en amplificatie van genen uit zeer kleine monsters. PCR kan dus worden gebruikt voor het creëren van willekeurige genomische fragmentbibliotheken.

Complementaire DNA-bibliotheken:

Het klonen van eukaryote genen is nogal ingewikkeld en vereist speciale technieken. Dit komt voornamelijk door de niet-coderende sequenties (introns) in het DNA. In de eukaryote cel, terwijl het gen wordt getranscribeerd, ondergaat het RNA verschillende veranderingen in de kern (aangeduid als splicing) om een ​​rijp en functioneel mRNA in het cytoplasma af te geven.

Op deze manier worden de introns verwijderd. In sommige genen vormen introns een groot deel van het gen. In het humane dystrofine-gen bestaat bijvoorbeeld maar liefst 99% van de DNA-sequentie uit introns. Er zijn maar liefst 79 introns!

De prokaryoten, met name de bacteriën, hebben niet het vermogen om de introns te verwijderen. Daarom wordt het functionele mRNA niet correct gevormd in een prokaryotische cel voor een eukaryoot gen. Het klonen van eukaryote genen wordt dus een moeilijke taak.

Synthese van complementair DNA:

Complementair DNA (cDNA) is een dubbelstrengs complement van een mRNA. cDNA kan worden gesynthetiseerd uit mRNA door middel van reverse transcriptie. Een eukaryoot functioneel mRNA dat geen introns heeft, heeft een G-cap op 5'8242 en een poly (A)-staart op het 3'8242-uiteinde (ongeveer 200 adenineresten).

Het vereiste mRNA wordt geïsoleerd en gezuiverd (in het bijzonder uit cellen die rijk zijn aan het specifieke mRNA, bijv. pancreascellen voor insuline-mRNA). Een oligo-dT-primer wordt toegevoegd om te binden aan het korte segment van het poly A-staartgebied (door annealing). Deze primer levert de 3'8242-hydroxylgroep voor de synthese van een DNA-streng.

Met de toevoeging van het enzym reverse transcriptase en vier deoxynucleotiden (dATP, dTTP, dGTP en dCTP) gaat de DNA-synthese verder. Voor de basen A, G, C en U in de template (mRNA) zijn de overeenkomstige complementaire basen in DNA respectievelijk T, C, G en A. De nieuw gesynthetiseerde eerste DNA-streng heeft de neiging om gedurende een enkele nucleotiden om een ​​haarspeldlus te vormen (Fig. 9.3).

De lus van de eerste DNA-streng dient als sjabloon voor de synthese van de tweede DNA-streng. Door de toevoeging van E. coli DNA-polymerase (Klenow-fragment) vindt de synthese van de tweede DNA-streng plaats vanaf het einde van de haarspeldlus. Bij behandeling met het enzym RNase H worden mRNA-moleculen afgebroken. Het enzym SI-nuclease klieft, de haarspeldlussen en degradeert enkelstrengs-DNA-extensies. De eindproducten zijn complementaire DNA-kopieën van origineel mRNA, waarvan sommige compleet zijn, terwijl andere onvolledig zijn.

Beperking van de techniek:

Het belangrijkste nadeel van de haarspeldmethode is het verlies van een kleine sequentie aan het 5'8242-uiteinde van cDNA als gevolg van splitsing door SI-nuclease.

Verbeterde methode voor cDNA-synthese:

Om de hierboven beschreven beperking te overwinnen, zijn er enkele verbeteringen aangebracht in de cDNA-synthese. Een dergelijke verbeterde techniek wordt getoond in Fig. 9.4.

Terwijl de eerste cDNA-streng wordt gesynthetiseerd, wordt deze van een staart voorzien met cytidine-residuen met behulp van het enzym terminale transferase. De mRNA-streng wordt gehydrolyseerd met alkali en het cDNA van volledige lengte wordt teruggewonnen. Een synthetische oligo-dG-primer wordt vervolgens geanneald met oligo-dC. Dit maakt op zijn beurt de synthese van de tweede cDNA-streng mogelijk. Door deze verbeterde techniek wordt een volledige lengte van cDNA verkregen dat overeenkomt met mRNA (op zijn beurt het gen). Maar de efficiëntie van deze methode is relatief lager.

Constructie van cDNA-bibliotheken:

De complementaire DNA-moleculen kunnen worden gekloneerd in een kloneringsvector (bijv. plasmide), voor het creëren van cDNA-bibliotheken. De cDNA-insertie in de vector moet de juiste oriëntatie hebben. Dit wordt bereikt door de toevoeging van een synthetische linker aan het dubbelstrengs cDNA. In een door Okayama en Berg (1982) ontwikkelde techniek wordt het mRNA eerst gekoppeld aan de plasmide-kloneringsvector en vervolgens wordt cDNA-synthese uitgevoerd.

RT-PCR als alternatief voor cDNA-klonering:

Omgekeerde transcriptie gevolgd door PCR (RT-PCR) kan het mRNA amplificeren om cDNA te geven. RT-PCR is erg snel en daarom kunnen cDNA-moleculen in korte tijd worden verkregen. Verder kunnen zelfs de lange mRNA's gemakkelijk worden gebruikt in RT-PCR. Er zijn ook enkele nadelen aan RT-PCR.De DNA-polymerase die in RT-PCR wordt gebruikt, is foutgevoelig en zelfs een zeer kleine contaminatie van mRNA (met andere mRNA's) zal valse resultaten opleveren.

Screeningsstrategieën:

Zodra een DNA-bibliotheek of een cDNA-bibliotheek is gecreëerd, moeten de klonen (d.w.z. de cellijnen) worden gescreend op identificatie van specifieke klonen. De screeningstechnieken zijn meestal gebaseerd op de sequentie van de kloon of de structuur/functie van het product.

Screening door DNA-hybridisatie:

De doelsequentie in een DNA kan worden bepaald met een DNA-probe (Fig. 9.5). Om te beginnen wordt het dubbelstrengs DNA van belang omgezet in enkele strengen door hitte of alkali (denaturatie). De twee DNA-strengen worden uit elkaar gehouden door te binden aan een vaste matrix zoals nitrocellulose of nylonmembraan.

Nu worden de enkele strengen DNA-probe (100-1.000 bp) gelabeld met radio-isotoop toegevoegd. Hybridisatie (d.w.z. basenparing) vindt plaats tussen de complementaire nucleotidesequenties van het doelwit-DNA en de probe. Voor een stabiele basenparing moet ten minste 80% van de basen in de twee strengen (doel-DNA en de probe) overeenkomen. Het gehybridiseerde DNA kan worden gedetecteerd door autoradiografie.

DNA-sondes:

De DNA-probes die voor screeningdoeleinden worden gebruikt, kunnen op vele manieren worden gesynthetiseerd.

Willekeurige primermethode::

Met deze techniek kunnen met radio-isotoop gemerkte DNA-primers worden geproduceerd (Fig. 9.6). Het dubbelstrengs DNA dat de sequentie bevat die nodig is om als probe te dienen, wordt gedenatureerd. Een mengsel van synthetische oligonucleotiden, met alle mogelijke combinaties van basen (A, G, C en T), met een lengte van elk 6 nucleotiden, dienen als primers. Sommige van deze primers met complementaire sequenties zullen hybridiseren met het matrijs-DNA. Dit optreden is geheel toevallig en de kans is redelijk goed.

Door toevoeging van vier deoxyribonucleotiden (waarvan één radioactief gelabeld is) en in aanwezigheid van het enzym DNA-polymerase van E. coli (Klenow-fragment), worden de primers verlengd op het template-DNA. Omdat een radioactief label wordt gebruikt, worden de nieuw gesynthetiseerde DNA-fragmenten op geschikte plaatsen gelabeld, en dit zijn de DNA-probes. Een aantal gelabelde DNA-probes kan worden geproduceerd uit een niet-gelabeld matrijs-DNA.

Niet-isotopische DNA-sondes:

Voor de productie van niet-isotopische DNA-probes wordt een van de vier deoxynucleotiden (gebruikt voor primerverlenging zoals hierboven beschreven) gelabeld met een label (bijv. biotine). Het label van de DNA-probes kan worden gedetecteerd door middel van chemische en enzymatische reacties.

Screening door koloniehybridisatie:

De DNA-sequentie in de getransformeerde kolonies kan worden gedetecteerd door hybridisatie met radioactieve DNA-probes (soms kunnen ook gelabelde RNA-probes worden gebruikt). Koloniehybridisatietechniek wordt door sommige auteurs ook wel replicaplating genoemd. De in Fig. 9.7 afgebeelde techniek wordt kort beschreven.

De getransformeerde cellen worden als kolonies op een moederplaat gekweekt. Monsters van elke kolonie worden overgebracht naar een vaste matrix zoals nitrocellulose of nylonmembraan. De overdracht wordt zorgvuldig uitgevoerd om het patroon van de kolonies op de moederplaat te behouden. Het nitrocellulosepapier bevat dus een fotokopiepatroon van de moederplaatkolonies. De koloniecellen worden gelyseerd en gedeproteïneerd.

Het DNA is gedenatureerd en onomkeerbaar gebonden aan de matrix. Nu wordt een radioactief gemerkte DNA-probe toegevoegd die hybridiseert met het complementaire doelwit-DNA. De niet-gehybridiseerde probe-moleculen worden weggewassen. De kolonie met gehybridiseerde sonde kan worden geïdentificeerd op autoradiografie. De cellen van deze kolonie (van de moederplaat) kunnen worden geïsoleerd en gekweekt.

Vele malen worden meerdere kolonies gedetecteerd bij hybridisatie door een DNA-probe. Dit komt door overlappende sequenties. Om te identificeren welke kolonie de volledige sequentie van het doelgen heeft, zullen gegevens die zijn waargenomen uit de restrictie-endonuclease-analyse nuttig zijn.

Wijzigingen van koloniehybridisatietechniek:

In de afgelopen jaren zijn verschillende verbeteringen aangebracht in de koloniehybridisatietechniek, zoals hierboven beschreven. Bij de plaque-lifttechniek wordt nitrocellulosepapier direct op het bovenoppervlak van de master-agarplaat aangebracht en maakt het direct contact. Op deze manier kunnen plaques worden opgetild en kunnen meerdere identieke DNA-afdrukken van één plaat worden gemaakt. Deze techniek verhoogt de betrouwbaarheid. Meer recentelijk wordt het screenen van DNA-bibliotheken uitgevoerd met geautomatiseerde technieken.

Screening door PCR:

Polymerasekettingreactie (PCR) is zo goed als hybridisatietechniek voor het screenen van DNA-bibliotheken. Maar er moet voldoende informatie (over de frankeersequenties van doel-DNA) beschikbaar zijn om primers voor deze methode te bereiden. De kolonies worden in meerwandige platen gehouden, elk putje wordt gescreend met PCR en de positieve putjes worden geïdentificeerd.

Screening door immunologische test:

Immunologische technieken kunnen worden gebruikt voor de detectie van een eiwit of een polypeptide, gesynthetiseerd door een gen (via transcriptie gevolgd door translatie). De toegepaste procedure voor immunologische test- en hybridisatietechniek (reeds beschreven) is redelijk vergelijkbaar. De screeningsprocedure door middel van een immunologische test wordt weergegeven in Fig. 9.8 en wordt hieronder kort beschreven.

De cellen worden gekweekt als kolonies op moederplaten die worden overgebracht naar een vaste matrix (d.w.z. nitrocellulose). De kolonies worden vervolgens onderworpen aan lysis en de vrijgekomen eiwitten worden aan de matrix gebonden. Deze eiwitten worden vervolgens behandeld met een primair antilichaam dat specifiek bindt aan het eiwit (werkt als een antigeen), dat wordt gecodeerd door het doel-DNA. Na het verwijderen van het ongebonden antilichaam door wassen, wordt een tweede antilichaam toegevoegd dat specifiek aan het eerste antilichaam bindt.

Opnieuw worden de ongebonden antilichamen verwijderd door te wassen. Het tweede antilichaam draagt ​​een enzymlabel (bijvoorbeeld paardenrood peroxidase of alkalische fosfatase) dat eraan is gebonden. Het detectieproces is zo ontworpen dat als een kleurloos substraat wordt ingewerkt door dit enzym, een gekleurd product wordt gevormd. De kolonies die een positief resultaat geven (d.w.z. gekleurde vlekken) worden geïdentificeerd. De cellen van een specifieke kolonie kunnen worden gesubkweekt vanaf de moederplaat.

Screening op eiwitfunctie:

Als het doelwit-DNA van de genenbibliotheek in staat is een eiwit (in het bijzonder een enzym) te synthetiseren dat normaal niet door de gastheercel wordt geproduceerd, kan de eiwitactiviteit worden gebruikt voor screening. Er wordt een specifiek substraat gebruikt en het gebruik ervan door een kolonie cellen wijst op de aanwezigheid van een enzym dat op het substraat inwerkt. Met deze techniek kunnen bijvoorbeeld de genen die coderen voor de enzymen -amylase en β-glucosidase worden geïdentificeerd.


Genisolatie en klonen van DNA | Biotechnologie

In dit artikel zullen we het hebben over de genisolatie en het klonen van DNA.

De vorming van nieuwe combinaties van genetisch materiaal door het inbrengen van buiten de cel geproduceerd nucleïnezuur in een virus, bacterieel plasmide of een ander vectorsysteem om de opname ervan in een gastheerorganisme mogelijk te maken waarin het in staat is tot voortdurende replicatie en expressie, wordt aangeduid als genetische manipulatie.

De betrokken technieken worden ook wel genklonering, in vitro genetische manipulatie of recombinanttechnologie genoemd. De overdracht van genetisch materiaal tussen individuen vindt in de natuur plaats door conjugatie, transductie en transformatie.

Wat het langetermijndoel van een moleculair-biologisch project ook is, het oorspronkelijke doel is meestal om een ​​enkel gen of een ander gespecificeerd DNA-segment te isoleren van het organisme dat wordt bestudeerd. Dit is de essentiële voorbereidende stap voor DNA-sequencing, om het expressieprofiel van een gen te onderzoeken of voor zuivering van het eiwit dat door een gen wordt gecodeerd.

Dit aanvankelijke doel kan op twee manieren worden bereikt:

l. Door DNA-klonering, waarbij het gewenste DNA-molecuul in een kloneringsvector wordt ingebracht, gevolgd door replicatie van de kloneringsvector in een kweek van E. coli-bacteriën?

ii. Door PCR, waarbij enzymatische amplificatie van het gewenste DNA-fragment betrokken is?

‘Gene Cloning’ is een methode om een ​​specifiek DNA-gebied te isoleren en miljoenen identieke kopieën van het DNA (gen) te produceren in een microbiële celcultuur.

De basisstappen in een genkloneringsexperiment zijn:

l. Isolatie en zuivering van DNA

ii. Knippen van DNA op de vereiste plaatsen door dezelfde restrictie-enzymen.

iii. Verbinden (ligeren) van het vereiste stuk DNA aan een vector

NS. De vector implanteren in de gastheercel door transformatie

v. Selectie van de transformanten

vi. De recombinante DNA-moleculen repliceren in de gastheercellen.

vii. Wanneer de gastheercel zich deelt, worden kopieën van de recombinante DNA-moleculen doorgegeven aan het nageslacht.

viii. Voortdurende replicatie van de gastheercellen resulteert in klonen, die elk bestaan ​​uit identieke cellen die allemaal kopieën van een enkel recombinant DNA-molecuul bevatten.

Deze reeks manipulaties resulteert in een kloonbibliotheek die veel verschillende klonen omvat, die elk een ander segment van het oorspronkelijke DNA dragen. De volgende stap is daarom om de kloon te identificeren die het gen van interesse PCR in hoofdlijnen bevat - PCR is een heel andere benadering om het DNA-segment te isoleren.

In plaats van een lange reeks manipulaties waarbij levende cellen betrokken zijn, is PCR een reageerbuisreactie die eenvoudig wordt uitgevoerd door de juiste reagentia te mengen en ze te incuberen in een thermische cycler, een apparaat waarmee de incubatietemperatuur kan worden gevarieerd over tijd op een voorgeprogrammeerde manier.

De basisstappen in een PCR-experiment zijn als volgt DNA wordt bereid uit het organisme dat wordt bestudeerd en gedenatureerd door verhitting tot 94°C. Een paar oligonucleotiden wordt aan het DNA toegevoegd. De sequenties van deze oligonucleotiden stellen hen in staat om beide zijden van het gen of een ander DNA-segment dat moet worden geïsoleerd te hybridiseren, en het mengsel wordt afgekoeld tot 50-60°C zodat deze oligonucleotiden zich hechten aan hun doellocaties.

Een thermostabiel DNA-polymerase wordt toegevoegd samen met een voorraad deoxy-ribonucleotiden en het mengsel wordt verwarmd tot de optimale temperatuur voor DNA-synthese. De cyclus van denaturatie-annealing-extensie wordt 25-30 keer herhaald, waarbij het aantal nieuw gesynthetiseerde DNA-moleculen tijdens elke cyclus verdubbelt. Deze exponentiële amplificatie resulteert in de synthese van een groot aantal kopieën van de DNA-sequentie geflankeerd door het paar oligonucleotiden.

Basistechnieken die nodig zijn voor klonen en PCR zijn:

4. Scheiding van DNA en RNA door gelelektroforese

5. Zuivering van DNA-moleculen uit elektroforesegels

6. Constructie van recombinante DNA-moleculen

7. Introductie van recombinante moleculen in gastheercellen en recombinante selectie

Een van de belangrijkste praktische vaardigheden die je als microbioloog hebt, is het vermogen om zuivere culturen van bacteriën te kweken, inclusief culturen die zijn geïnfecteerd met bacteriofagen. Dit komt omdat de meeste experimenten met het klonen van genen de bacterie E. coli als gastheerorganisme gebruiken. Zelfs als het doel op lange termijn is om een ​​gen in een ander organisme dan E. coli te klonen, zullen de eerste manipulaties in E. coli worden uitgevoerd vanwege het gemak waarmee deze bacterie kan worden gehanteerd.

Voor velen is de eerste echte moleculaire biologie die wordt geprobeerd, de zuivering van DNA uit het organisme dat wordt bestudeerd.

De bereiding van zuiver, intact RNA is relatief moeilijk vanwege de alomtegenwoordigheid van vervuilende enzymen die RNA-moleculen afbreken. RNasen die aanwezig zijn in de cellen waaruit het RNA wordt geëxtraheerd, kunnen tijdens de zuiveringsprocedure worden geïnactiveerd door een geschikte RNase-remmer, maar er kunnen aanzienlijke problemen optreden bij glaswerk en oplossingen die zijn verontreinigd met RNasen die afkomstig zijn van huidafscheidingen. Deze enzymen zijn zeer resistent tegen fysieke behandelingen, sommige zelfs bestand tegen autoclaveren en hun controle kan een probleem zijn. In plaats van DNA kan ook RNA worden gebruikt als uitgangsmateriaal voor PCR.

Scheiding van DNA en RNA door gelelektroforese:

Het scheiden van DNA- en RNA-moleculen van verschillende groottes wordt bereikt door elektroforese in een agarose- of, zeldzamer, polyacrylamidegel. Agarosegels worden routinematig gebruikt om de grootte van DNA- en RNA-moleculen te schatten, waardoor het succes van een preparatieve techniek of enzymatische manipulatie kan worden beoordeeld. Agarosegelelektroforese is ook de inleiding voor de analyse van DNA-moleculen door technieken zoals Southern-hybridisatie.

Zuiveren van DNA-moleculen uit elektroforesegels:

Op sommige gebieden van de moleculaire biologie zijn er een aantal alternatieve procedures om hetzelfde doel te bereiken.

1. De zuivering van DNA-moleculen uit gels is zo'n geval. Vaak zal een agarose- of polyacrylamidegel een band verschaffen waarvan met zekerheid kan worden vastgesteld dat deze een van belang zijnd DNA-fragment bevat.

2. De volgende stap zou kunnen zijn om de band uit te snijden en de DNA-moleculen te zuiveren voorafgaand aan de constructie van recombinante DNA-moleculen en verder onderzoek.

Constructie van recombinante DNA-moleculen:

De eerste echte stap in een genkloneringsexperiment is de constructie van recombinante moleculen door het invoegen van DNA-fragmenten in vectormoleculen.

Introductie van recombinante moleculen in gastheercellen en recombinante selectie:

Zodra recombinante DNA-moleculen zijn geconstrueerd, moeten ze in E. coli-cellen worden ingebracht. Dit is een vrij ongecompliceerde en standaardtechniek voor verschillende soorten vectoren.

Het zou inmiddels duidelijk moeten zijn dat de keuze van de kloneringsvector een belangrijke is. Het moet de aard van de procedure bepalen die wordt gebruikt om de recombinante moleculen in de gastheercellen te introduceren en het moet de manier specificeren waarop recombinanten worden geselecteerd.

Het is belangrijk om een ​​vector te kiezen die geschikt is voor de grootte van de DNA-fragmenten die u wilt klonen, aangezien sommige vectoren zijn ontworpen voor relatief kleine fragmenten (5 kb en minder), terwijl andere fragmenten boven een bepaalde grootte nodig hebben.


Genomische DNA-isolatie

Opbrengst, zuiverheid en integriteit zijn essentieel voor prestaties in downstream-toepassingen zoals PCR en sequencing. Optimalisatie van extractiemethodologieën is de sleutel tot succes met uitdagende monstertypen en veeleisende downstream-toepassingen. Het gezuiverde doel-DNA moet vrij zijn van verontreinigingen, waaronder eiwitten, andere cellulaire componenten en ongewenste nucleïnezuren.

Gespecialiseerde, monstertype-specifieke zuiveringskits kunnen nodig zijn voor complexere en uitdagendere monsters die afgebroken DNA bevatten of een lage DNA-concentratie hebben. Uitdagende monstertypes zijn onder meer FFPE-weefsel, plasma of serum dat celvrij DNA bevat, forensische monsters of elke bron waar de hoeveelheid monsters beperkt is.

Promega was een van de eerste bedrijven die kits leverde voor de zuivering van DNA, evenals van plasmiden, met meer dan 30 jaar ervaring in nucleïnezuurextractie. We bieden een breed scala aan genomische DNA-extractiekits die geschikt zijn voor een verscheidenheid aan monstertypes en doorvoerbehoeften, en die hoge opbrengsten en hoogwaardig DNA produceren voor gebruik in uw downstream-toepassingen. Onze producten omvatten een verscheidenheid aan doorvoeropties en verwerkingsmethoden die geschikt zijn voor uw specifieke behoeften en van handmatige single-preps tot kleine benchtop- of grootschalige geautomatiseerde systemen.

Door gebruik te maken van spin-, vacuüm- of magnetische methoden, zijn onze handmatige single-prep-oplossingen het beste voor het verwerken van minder dan 24 monsters tegelijk. Als u op zoek bent naar een geautomatiseerde oplossing, kunnen onze op cartridges gebaseerde kits voor gebruik met Maxwell® Instruments tot 48 monsters in dezelfde run verwerken. We bieden ook volledig geautomatiseerde extractie-opties met hoge doorvoer door gebruik te maken van plaatgebaseerde verwerkingsmethoden, volledig compatibel met vloeistofverwerkingsplatforms.

Hoewel technieken zoals Southern-blotting, waarvoor microgram-hoeveelheden DNA nodig zijn, nog steeds worden uitgevoerd in laboratoria voor moleculair-biologie, worden de meeste beoordelingen van chromosomaal DNA uitgevoerd door op PCR gebaseerde technologieën. Deze omvatten monoplex of multiplex PCR, SNP-arrays, analyse en real-time PCR, ddPCR en next-generation sequencing (NGS). Deze laatste technieken gebruiken nanogram hoeveelheden DNA per reactie. Ongeacht het gekozen systeem bieden Promega genomische DNA-zuiveringskits de vereiste opbrengsten van hoogwaardig DNA met minimale verontreinigingen.

Handmatige zuiveringssystemen

Oplossingsgebaseerde systemen

Promega biedt genomische DNA-isolatiesystemen op basis van lysis van monsters door detergentia en zuivering met verschillende methoden. Deze omvatten zowel op membraan gebaseerde systemen (bijv. het enkelkoloms Wizard® SV Genomic DNA Purification System (cat.# A2360, A2361) of het high-throughput, 96-well Wizard® SV 96 Genomic DNA Purification System (cat.# A2370, A2371) en gemakkelijk te automatiseren paramagnetische silicasystemen.Al deze systemen zuiveren genomisch DNA dat geschikt is voor gebruik in veel downstream-toepassingen.

De Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Cat.# A1120, A1125, A1620) is zowel een veelzijdig als schaalbaar systeem voor het isoleren van genomisch DNA met behulp van een op neerslag gebaseerde methode. Met dit systeem alleen kan chromosomaal DNA worden geïsoleerd uit volbloed (5), plantenblad (6), Gram-positieve (7) en Gram-negatieve bacteriën (8), muizenstaart (9) en gist (10). Andere soorten monsters zoals schimmel (11), geïnfecteerde kikkerweefsels ingebed in paraffine (12), speeksel (13) en meelenkevers (14) zijn ook met succes gebruikt.

Dit genomische zuiveringssysteem is niet alleen succesvol bij veel monstertypes, het kan ook eenvoudig worden aangepast aan de hoeveelheid uitgangsmateriaal door de reagensvolumes aan te passen aan uw behoeften.

Op kolommen gebaseerde systemen

Traditionele op kolommen gebaseerde systemen

Voor isolatie met één kolom biedt het Wizard® SV Genomic DNA Purification System een ​​snelle, eenvoudige techniek voor de bereiding van gezuiverd en intact DNA uit muizenstaarten, weefsels en gekweekte cellen in slechts 20 minuten, afhankelijk van het aantal verwerkte monsters (tot 24 door centrifugeren, afhankelijk van de rotorgrootte, of tot 20 door vacuüm). Voor de monsterverwerking wordt een vacuümverdeelstuk of een microcentrifuge gebruikt. Met enkele aanpassingen kan ook volbloed worden gebruikt met dit isolatiesysteem (15). Dit is een op silicamembraan gebaseerd systeem, wat betekent dat er beperkingen zijn aan de hoeveelheid materiaal die op een enkele SV-kolom kan worden geladen tot 20 mg weefsel (muizenstaart of dierlijk weefsel) of tussen 1 × 10 4 en 5 × 10 6 weefselkweekcellen kunnen per zuivering worden verwerkt. Bij meer monster moet het bereide lysaat mogelijk over twee of meer kolommen worden verdeeld om verstopping te voorkomen.

Figuur 2. Amplificatie van genomisch DNA geïsoleerd uit verschillende weefselbronnen met behulp van het Wizard® SV Genomic DNA Purification System. Eén microliter gezuiverd genomisch DNA werd geamplificeerd met behulp van PCR Master Mix (Cat. # M7502) en muisspecifieke IL-1&beta-primers (1,2 kb product). Reacties met muis genomisch DNA (Cat. # G3091 +C) en zonder DNA (&ndashC) werden uitgevoerd als respectievelijk positieve en negatieve controles. Thermische cyclusomstandigheden waren: één cyclus van 3 minuten bij 95°C gevolgd door 30 cycli van: 95°C gedurende 30 seconden, 60°C gedurende 1 minuut, 70°C gedurende 1 minuut en 30 seconden laatste verlenging bij 70°C gedurende 7 minuten 4°C weken. Alle banen bevatten 10 µl reactieproduct gescheiden op een 1% agarosegel. PCR-producten werden zichtbaar gemaakt door kleuring met ethidiumbromide.&ldquoSpin&rdquo en &ldquoVacuum&rdquo-aanduidingen geven het protocol aan dat wordt gebruikt voor genomische DNA-isolatie.

Het genomische DNA dat is geïsoleerd met het Wizard® SV Genomic DNA Purification System is van hoge kwaliteit en presteert goed in agarosegelanalyse, restrictie-enzymdigestie en PCR-analyse zoals te zien in figuur 2. Tabel 1 geeft typische opbrengsten van genomisch DNA gezuiverd uit een verscheidenheid aan bronnen.

Tabel 1. Typische opbrengst van genomisch DNA van verschillende weefsels met behulp van het Wizard® SV Genomic DNA Purification System.

Steekproef Hoeveelheid Gemiddelde opbrengst
Staart Knippen 20mg 20µg
Lever 20mg 15µg
Hart 20mg 10µg
Brein 20mg 6µg
CHO-cellen 1 × 10 6 5µg
NIH/3T3-cellen 1 × 10 6 9µg
293-cellen 1 × 10 6 8µg

Onderzoekers hebben dit eenvoudige en snelle systeem gebruikt voor veel extra soorten monsters en toepassingen, waaronder muggen (16), borststamcellen (17), Bacillus subtilis (18), Escherichia coli (19), de larvale vorm van de Schistosoma mansoni parasiet (20) en viraal DNA van met Kaposi's sarcoom herpesvirus geïnfecteerde BC3-cellen (21).

Voor high-throughput isolatie met 96 putjes is het Wizard® SV 96 Genomic DNA Purification System beschikbaar. Amplificeerbaar genomisch DNA kan worden geïsoleerd uit tot 5 x 106 cellen, 20 mg weefsel of tot 1,2 cm van een muizenstaartpunt zonder centrifugeren van het lysaat voorafgaand aan zuivering.

Dit systeem met meerdere putten vereist een vacuümverdeelstuk (Vac-Man® 96 vacuümspruitstuk, Cat. # A2291) en een vacuümpomp die 15&ndash20 inch kwik of het equivalent daarvan kan genereren. Genomisch DNA werd geïsoleerd uit drie verschillende brontypes, vervolgens gebruikt in een monoplex PCR en uitgevoerd op een agarosegel zoals getoond in figuur 3. Figuur 4 vergelijkt de opbrengst van de drie Wizard® SV Genomic DNA-zuiveringsmethoden (96-wells plaat, vacuüm en centrifugatie ).

Figuur 3. Agarosegelelektroforese van PCR-producten geamplificeerd uit 1µl muizenstaart, CHO-cellen en tomatenbladmonster genomisch DNA geïsoleerd met behulp van het Wizard® SV 96 Genomic DNA Purification System. Een totaal van 10 & microl PCR-product wordt zichtbaar gemaakt op een 1,5% agarosegel gekleurd met ethidiumbromide. Paneel A. IL-1&beta (1,2 kb) geamplificeerd uit muizenstaart. Paneel B. & beta-actine (250 bp) geamplificeerd uit CHO-cellen. Paneel C. Chloroplast-DNA (600 bp) geamplificeerd uit tomatenblad. Baan M, 1 kb DNA-ladder (Cat. # G5711).

Figuur 4. Vergelijking van DNA-opbrengsten met behulp van de Wizard® SV en SV 96 Genomic DNA Purification Systems. Gemiddelde opbrengst van genomisch DNA in microgram gezuiverd uit 20 mg muizenstaartknipsels. de gemiddelde A260/EEN280 verhoudingen zijn: SV 96, 1,7 ± 0,08 SV vacuümmethode, 1,7 ± 0,14 SV spinmethode, 1,7 ± 0,14.

Hoogwaardige kolomgebaseerde systemen

We bieden twee verschillende ReliaPrep&trade gDNA Miniprep-systemen die genomisch DNA zuiveren met behulp van een op cellulosekolom gebaseerde methode: ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep-systeem (Cat.# A5081, A5082) en ReliaPrep&trade gDNA Tissue Miniprep-systeem (Cat.# A2051, A2052). Beide zijn kant-en-klare systemen die intact genomisch DNA verkrijgen zonder gebruik te maken van wassingen met ethanol of precipitatie. Het ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep-systeem verwerkt 200&mul bloed of lichaamsvloeistof, vers of bevroren, in minder dan 40 minuten. Opbrengsten uit bloed zijn doorgaans 4&ndash10&mug, afhankelijk van het aantal witte bloedcellen. Met het ReliaPrep&trade gDNA Tissue Miniprep-systeem kan tot 25 mg weefsel, een wanguitstrijkje of een muizenstaart van 1 cm worden verwerkt en het geëlueerde DNA wordt binnen 30 minuten of minder teruggewonnen. Het gezuiverde DNA kan in slechts 50µl worden geëlueerd en is geschikt voor gebruik in stroomafwaartse toepassingen zoals RT-qPCR.

Afbeelding 5. De opbrengst aan genomisch DNA van het ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep-systeem varieert met het aantal witte bloedcellen. Volbloed werd verkregen van verschillende individuen en het aantal witte bloedcellen werd bepaald met behulp van een hemocytometer. Tweehonderd microliter bloed werd gebruikt voor genomische DNA-zuivering (n = 3 of 4), en de hoeveelheid geïsoleerd gDNA werd gekwantificeerd door absorptiespectroscopie.

Figuur 6. Vergelijking van elutievolume met concentratie, opbrengst en zuiverheid. Hoeveelheden bloed (200 µl) werden verwerkt met gebruikmaking van het ReliaPrep&trade Blood gDNA Miniprep-systeem (n = 4) en geëlueerd met 30 à 200 µl nucleasevrij water. concentratie (Paneel A), totale opbrengst (Paneel B) en zuiverheid (Paneel C) werden beoordeeld met behulp van absorptiespectroscopie. Opbrengst nam licht af bij afname van het elutievolume, terwijl de concentratie toenam. Zuiverheid zoals gemeten door optische dichtheidsverhoudingen bleef constant.

Geautomatiseerde systemen voor DNA-zuivering

Terwijl laboratoria proberen de productiviteit voor onderzoek, diagnostiek en toegepaste tests te verbeteren, is de behoefte aan gebruiksvriendelijke automatisering van zuiveringsprocessen met een lage tot matige doorvoer toegenomen. Automatisering elimineert de hands-on tijd en arbeid van handmatige zuivering, waardoor u meer tijd en energie heeft om u op uw onderzoek te concentreren.

Op cartridges gebaseerde systemen

Traditioneel verwijst automatisering naar het gebruik van grote, gespecialiseerde en dure apparatuur die uitgebreide training vereist om te bedienen en te onderhouden. Promega heeft de Maxwell®-systemen ontwikkeld, die flexibele, betrouwbare, compacte en gebruiksvriendelijke alternatieven bieden voor traditionele geautomatiseerde systemen.

De Maxwell®-systemen zijn ontworpen voor efficiënte, geautomatiseerde zuivering van een breed scala aan monstertypen (zie tabel 2). Maxwell® Instruments worden geleverd met voorgeprogrammeerde geautomatiseerde zuiveringsmethoden en kunnen tot 48 monsters in slechts 30-40 minuten verwerken (afhankelijk van instrument, monstertype en methode). Het gezuiverde geconcentreerde DNA of RNA is van hoge kwaliteit en heeft een hoge opbrengst, waardoor ze compatibel zijn met veel gangbare downstream-toepassingen, waaronder qPCR, ddPCR, genotypering, sequencing en NGS.

Figuur 7. De Maxwell® RSC (links) en Maxwell® RSC 48 (rechts).

Tabel 2. DNA-opbrengst van verschillende soorten monsters na zuivering met behulp van het Maxwell® RSC-instrument en DNA-zuiveringskits.

Tot 50 mg leverweefsel
Tot 50 mg longweefsel

Maxwell® Kits bieden voorverdeelde reagenscartridges voor de zuivering van genomisch DNA, RNA en totaal nucleïnezuur. Applicatie- en monstertype-gerichte kits maken de Maxwell® Instruments tot een veelzijdig extractie-instrument voor laboratoria die met een of al deze verschillende toepassingen kunnen werken.

Figuur 8. De Maxwell® RSC DNA- of RNA-extractiemethoden beginnen met cartridges die zijn voorgevuld met zuiveringsreagentia en paramagnetische deeltjes, klaar voor uw monsters. Na toevoeging van het monster beweegt de Maxwell® RSC de paramagnetische deeltjes en bijbehorende nucleïnezuren door meerdere stappen, wat uiteindelijk zeer zuiver RNA of DNA oplevert in 30-100 µl.

De Maxwell®-systemen zuiveren monsters met behulp van paramagnetische deeltjes (PMP's), die zorgen voor een mobiele vaste fase die het vangen, wassen en elueren van het nucleïnezuur optimaliseert. De Maxwell® Instruments zijn instrumenten voor het hanteren van magnetische deeltjes die op efficiënte wijze nucleïnezuren binden aan het paramagnetische deeltje in het eerste putje van een voorgevulde cartridge. De monsters worden verwerkt door een reeks wasbeurten voordat het nucleïnezuur wordt geëlueerd. De systematische op magnetische deeltjes gebaseerde methodologie die door de Maxwell® Instruments wordt gebruikt, voorkomt veelvoorkomende problemen die verband houden met geautomatiseerde op vloeistof handler gebaseerde zuiveringssystemen, zoals verstopte tips of gedeeltelijke reagensoverdrachten, die kunnen leiden tot suboptimale zuiveringsverwerking.

De benchtop-compacte Maxwell® Instruments zijn eenvoudig in te stellen en vereisen geen speciale training voor gebruik. Geoptimaliseerde geautomatiseerde methoden zijn vooraf geladen, de voorgevulde reagenscartridges worden op hun plaats geklikt, uw monster wordt toegevoegd en u selecteert "Start" om de juiste methode te starten. Een volledige lijst met nucleïnezuurextractiekits is hier beschikbaar.

Er zijn verschillende Maxwell® Instrument-reagenskits beschikbaar die een optimale extractie mogelijk maken uit verschillende soorten monsters, waaronder bloed, serum en plasma, in formaline gefixeerd, in paraffine ingebed (FFPE) weefsel, bacteriën, planten-, voedsel- en dierlijk weefsel.

Maxwell® HT-systemen maken zuivering van DNA of RNA op schaal mogelijk op elke laboratoriumvloeistofhandler in SLAS-formaat met 24 of 96 putjes. Maxwell® zuiveringschemie maakt gebruik van nieuwe op magnetische deeltjes gebaseerde oplossingen die de overdracht van verontreiniging op natuurlijke wijze verminderen.

Naast vertrouwde chemie krijgt u deskundige ondersteuning om aan de slag te gaan met automatisering of uw huidige HT-workflow te optimaliseren. Ons team van automatiseringsexperts kan assistentie bieden aan de meeste toonaangevende leveranciers van laboratoriumautomatisering ter wereld en u helpen bij het ontwikkelen en implementeren van een geautomatiseerde oplossing voor nucleïnezuurzuivering die is aangepast aan de behoeften van uw laboratorium.

Genomische DNA-extractiekits

Op zoek naar extractie-opties op monsterschaal of -type? Verken ons DNA-extractieportfolio om de juiste oplossing voor uw zuiveringsbehoeften te ontdekken.

Schaalbare automatiseringsoplossingen

De Maxwell® RSC Instruments bieden een compact, geautomatiseerd nucleïnezuurzuiveringsplatform dat tot 16 (Maxwell® RSC) of tot 48 (Maxwell® RSC 48) monsters tegelijk verwerkt.

Ondersteuning voor zuiveringschemie en automatisering met hoge doorvoer

Maxwell® HT-chemie maakt automatisering van nucleïnezuurzuivering op vloeistofverwerkers mogelijk. Ons team van automatiseringsexperts biedt hulp bij het ontwikkelen en implementeren van een geautomatiseerde oplossing voor nucleïnezuurzuivering die is aangepast aan de behoeften van uw laboratorium.

High-throughput-systemen voor genomische DNA-isolatie

Promega biedt verschillende geautomatiseerde high-throughput-opties om genomische DNA-isolatie uit bloedmonsters te isoleren. Sommige laboratoria, zoals biobanken, hebben de wens om DNA te isoleren uit grote hoeveelheden uitgangsmateriaal (bijvoorbeeld 10 ml bloed). Het ReliaPrep &trade Large Volume HT gDNA Isolation System (Cat. # A2751) biedt een effectief middel voor de isolatie van genomisch DNA afgeleid van bloedfracties afgeleid van 2,5 & ndash10 ml monsters van volbloed. Deze chemie kan worden geautomatiseerd op vloeistofverwerkers met behulp van een Promega HSM-apparaat, waarmee zuiveringsreacties in conische buizen van 50 ml kunnen worden verwerkt.

Vloeistofniveaudetectie en instrumentbesturingssoftware schalen de chemie naar het monsterinvoervolume voor elk afzonderlijk monster, waardoor verspilling en kosten van reagens worden verminderd. Het geautomatiseerde systeem kan ook monsters verwerken in buizen van 14 ml met behulp van de Low Volume Adapter XAT1020 (LVA en methoden), waarmee monsters van 0,25 en 3 ml kunnen worden verwerkt.

Er zijn geen vervelende centrifugatiestappen of gevaarlijke chemicaliën die inherent aan het werkstation werken, waardoor het genomisch DNA uit volbloed gemakkelijk kan worden gezuiverd, ongeacht de opslag- of transportomstandigheden van het monster.

Figuur 9. DNA werd via drie methoden uit volbloed geïsoleerd, gescheiden door CHEF-gelelektroforese en zichtbaar gemaakt door kleuring met ethidiumbromide. DNA geïsoleerd met behulp van het ReliaPrep&trade Large Volume HT gDNA-isolatiesysteem leverde DNA een groottebereik van 20-125 kb op precipitatie gebaseerde zuivering geïsoleerd DNA met een groottebereik van 20-200 kb, terwijl op kolom gebaseerde methoden gDNA met een grootte van 20-75 kb aantoonden.

Er is een optie voor isolatie met een lage doorvoer van gDNA van maximaal 32 monsters tegelijk wanneer het Heater Shaker Magnet Instrument (HSM 2.0 Cat.# A2715) wordt gebruikt op een werkbank versus geïntegreerd op een vloeistofverwerker waar de gebruiker doseert en opzuigt reagentia uit de monsters zoals aangegeven door de software op een computerscherm. De voorgeprogrammeerde methoden regelen het verwarmen, schudden, magnetiseren en timing van de stappen die nodig zijn voor de semi-automatische zuivering.

Naast volbloed kunnen ook verschillende andere monstertypes worden verwerkt, waaronder gestabiliseerd speeksel, buccale wasmonsters, bloedfracties, buffy coats, rode celpellets en alle celpellets. Voor volledig geautomatiseerde zuivering kan het HSM 2.0-instrument worden geïntegreerd met een robotwerkstation voor vloeistofbehandeling.

Het automatiseren van reagentia op instrumentatie vereist een zorgvuldig geplande en uitgevoerde aanpak. Door samen te werken met Promega krijgt u toegang tot wetenschappers die geautomatiseerde zuivering hebben ontworpen voor honderden laboratoria, voor een breed scala aan monstertypen.

Het automatiseren van reagentia op instrumentatie vereist een zorgvuldig geplande en uitgevoerde aanpak. Door samen te werken met Promega krijgt u toegang tot wetenschappers die geautomatiseerde zuivering hebben ontworpen voor honderden laboratoria, voor een breed scala aan monstertypen.

Figuur 10. Geautomatiseerde DNA-opbrengsten voor bloedfracties. De DNA-opbrengst is lineair met betrekking tot de oorspronkelijke bloedvolumes. Paneel A. DNA-opbrengsten zoals bepaald door NanoDrop-spectrofotometer. Paneel B. DNA-opbrengsten zoals bepaald met behulp van het QuantiFluor&trade dsDNA-systeem. Alle monsters werden bereid van een enkele donor. Handmatige monsters werden verwerkt met behulp van de Wizard® Genomic DNA Purification Kit. Elk punt is het gemiddelde van n=4 waarden met foutbalken van 1 standaarddeviatie.

Aangepaste HT-nucleïnezuurzuivering

Het implementeren van geautomatiseerde nucleïnezuurzuiveringstechnologieën in uw workflow met hoge doorvoer kan een uitdaging en tijdrovend zijn. Onze Field Support Scientists kunnen de ondersteuning bieden die u nodig hebt om aan de slag te gaan.

Geselecteerde DNA-zuiveringskits op monstertype

Lees hieronder meer over enkele van onze gespecialiseerde kits en verken de breedte van ons portfolio en vergelijk onze DNA-extractiekits met behulp van onze productvergelijkingspagina om de juiste oplossing voor uw DNA-zuiveringsbehoeften te ontdekken.

Vast weefsel genomisch DNA-isolatie

Het MagneSil® Genomic, Fixed-Tissue System (Cat.# MD1490), biedt een snelle, eenvoudige techniek voor de bereiding van genomisch DNA uit formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed weefsel. Na een nachtelijke Proteinase K-digestie kan genomisch DNA in minder dan een uur handmatig worden gezuiverd uit dunne FFPE-weefselcoupes. Amplificeerbaar genomisch DNA kan worden geïsoleerd uit secties van 10 m zonder centrifugeren van het lysaat voorafgaand aan zuivering. Maximaal 12 monsters kunnen worden verwerkt in het handmatige formaat met behulp van een MagneSphere® Technology Magnetic Separation Stand (Cat. # Z5332, Z5342).

Figuur 11. Analyse van DNA gezuiverd uit in paraffine ingebedde, formaline-gefixeerde 10 µm dunne coupes met behulp van het MagneSil® Genomic, Fixed Tissue System. Gezuiverd DNA werd geamplificeerd en de amplificatieproducten werden geanalyseerd op een ABI PRISM® 310 of 3100 genetische analysator. Paneel A. Amplificatie met een set van 16 fluorescent gelabelde primers. Versterkingsproducten variëren in grootte van 104 tot 420 basen. Paneel B. Een fragment van 972 basen geamplificeerd met behulp van een amelogenine-primerset. Paneel C. Een fragment van 1,8 kb geamplificeerd uit de Adenomatose polyposis coli (APC) gen. Het verlengen van de verlengingstijd tijdens amplificatie kan helpen om opbrengsten tussen kleine en grote amplificatieproducten in evenwicht te brengen en opbrengsten voor grote amplificatieproducten te verhogen. De resultaten zullen variëren afhankelijk van de mate van verknoping als gevolg van formalinefixatie.

Een voordeel van dit systeem ten opzichte van andere zuiveringsmethoden, zoals fenol:chloroformextractie, is het vermogen om de meeste remmers van amplificatie te verwijderen, inclusief zeer kleine DNA-fragmenten. Weefsel dat gedurende langere tijd in formaline is opgeslagen, kan te verknoopt of te afgebroken zijn om goed te functioneren als een sjabloon voor amplificatie. Figuur 11 toont een amplificatie van 16 short tandem repeat (STR) loci en laat zien hoe goed het geïsoleerde DNA kan werken in multiplex PCR met behulp van het PowerPlex® 16 HS-systeem (Cat. # DC2101, DC2100).

De Maxwell® RSC FFPE Plus DNA Kit (Cat.# AS1720) is een geautomatiseerde methode voor het zuiveren van maximaal 48 monsters van één tot tien secties van 5 μm FFPE-weefselmonsters op het Maxwell® RSC Instrument (Cat.# AS4500 1–16 patronen per run) of Maxwell® RSC 48 Instrument (Cat. # AS8500 1–48 monsters per run). De FFPE Plus-chemie is ontworpen om een ​​hoge opbrengst aan DNA van FFPE te bieden wanneer gemeten met spectroscopie die geschikt is voor amplificatietoepassingen, waaronder qPCR, multiplex-PCR en NGS. Het protocol biedt flexibiliteit met een snelle deparaffinisatie van 1 uur of een protocol van 24 uur 's nachts om aan uw workflowbehoeften te voldoen.

De Maxwell® RSC DNA FFPE-chemie is Promega's nieuwste FFPE-technologie en is ontworpen om zeer amplificeerbaar DNA te leveren. Bespaar tijd en werk door ofwel FFPE-chemie te gebruiken met de Maxwell® Instruments, en vermijd blootstelling aan gevaarlijk xyleen dat in andere FFPE-zuiveringsproducten wordt gebruikt. Onze kwaliteitstests hebben ook aangetoond dat er vrijwel geen PCR-remmers in gezuiverde DNA-monsters zijn, waardoor uw PCR en andere downstream-toepassingen een fluitje van een cent zijn.

Gebruikmakend van dezelfde chemie als het Maxwell® RSC FFPE-DNA, biedt het Maxwell® HT DNA FFPE-isolatiesysteem (Cat. # A6372) een eenvoudige en betrouwbare methode voor snelle isolatie van genomisch DNA uit FFPE-weefselmonsters met hoge doorvoer. Het systeem vereist geen organisch oplosmiddel, waardoor het veilig en gemakkelijk te gebruiken is, en het gezuiverde DNA kan direct worden gebruikt in een verscheidenheid aan downstream-toepassingen, waaronder PCR en NGS.

Het Maxwell® HT DNA FFPE-isolatiesysteem zuivert nucleïnezuur met behulp van paramagnetische deeltjes, die zorgen voor een mobiele vaste fase om binding, wassing en zuivering van gDNA te optimaliseren. Het gebruik van paramagnetische deeltjes voor DNA-isolatie elimineert de noodzaak voor centrifugatie of vacuümverdeelstukken, waardoor het systeem geschikt is voor volledige automatisering.

Aangezien FFPE-monsters sterk variërende kwaliteit kunnen hebben vanwege de aard van het monsterfixatie- en inbeddingsproces, kan kwaliteitscontrole van monsters een belangrijk onderdeel zijn van de FFPE-workflow.

Afbeelding 12. Vergelijkende gegevens van de Maxwell® RSC DNA FFPE-chemie versus de Maxwell® RSC FFPE Plus DNA-chemie. Er is waargenomen dat de Maxwell® RSC FFPE Plus DNA-methode meer opbrengst oplevert door absorptie en fluorescentie, terwijl de Maxwell® RSC DNA FFPE-methode meer opbrengst oplevert door PCR.

Spectrofotometrie is een gebruikelijke manier om de kwaliteit van geëxtraheerd DNA en RNA te evalueren. De meeste laboratoria hebben een NanoDrop Microvolume Spectrophotometer (of vergelijkbaar apparaat) en ze zijn ongelooflijk gebruiksvriendelijk. Pipetteer 1-2 µl monster, selecteer "Analyseren" en het instrument geeft een uitlezing van de concentratie en zuiverheid via A260/EEN280 en een260/EEN230 verhoudingen in slechts enkele seconden. Deze apparaten hebben een revolutie teweeggebracht in de routinematige kwantificering van monsters in het laboratorium, maar is dit de beste methode voor het beoordelen van FFPE-monsters? Er zijn twee belangrijke overwegingen bij het gebruik van een NanoDrop: gevoeligheid en integriteit. FFPE-monsters kunnen een brede opbrengst aan DNA of RNA hebben, vaak slechts 10 ng of minder in een volume variërend van 10 µl tot 100 µl van een extractie. Dit kan resulteren in monsterconcentraties onder het lineaire bereik van de NanoDrop. Bovendien maakt het als spectrofotometer geen onderscheid tussen RNA, DNA of vrije nucleotiden, wat kan resulteren in dramatische onnauwkeurigheden in DNA/RNA-concentratiemetingen. Ten slotte is er geen manier om te bepalen of een monster toegankelijk is voor stroomafwaartse enzymatische tests, omdat het de aanwezigheid of afwezigheid van verknopingen (of andere schade) in een monster niet kan detecteren.

Op kleurstof gebaseerde kwantificering zoals het Promega QuantiFluor® dsDNA-systeem (Cat. # E2670, E2671), biedt een snelle en aanzienlijk gevoeligere methode om dsDNA of RNA te kwantificeren in vergelijking met absorptiespectroscopie. Deze methode biedt een algemeen bruikbare schatting van de concentratie. Bij het overwegen van FFPE-monsters is het belangrijk op te merken dat op kleurstof gebaseerde kwantificering de integriteit van het DNA/RNA of de mate van verknoping in het monster niet schat, wat het succes in downstream-assays zou kunnen beïnvloeden.

Maatbepalingen (bijv. agarosegel, tapestation, fragmentanalysator, DV200) kan een schatting geven van de concentratie en, belangrijker nog, informatie over de grootteverdeling van de fragmenten in het monster. Van FFPE afgeleid DNA kan door het fixatieproces aanzienlijk worden gefragmenteerd in vergelijking met DNA van vers ingevroren weefsel. Hieronder vindt u een fragmentanalysatorspoor (Figuur 13) en bijbehorende DV200-scores (Tabel 3) van DNA geïsoleerd uit FFPE-coupes met behulp van vijf verschillende zuiveringsmethoden. Hoewel de maatsporen de verdeling van de gezuiverde DNA-grootte bepalen, wordt niet de mate van verknoping in het monster of de aanwezigheid van remmers gemeten.

Afbeelding 13. Fragmentanalysator spoor van DNA geïsoleerd uit FFPE-coupes met behulp van vijf verschillende zuiveringsmethoden.

Tabel 3. DV200-scores van DNA geïsoleerd uit FFPE-secties met behulp van vijf verschillende zuiveringsmethoden in fragmentanalysatorspoor (Figuur 13).

Methode 1 (Lichtgroen) 2 (Blauw) 3 (Rood) 4 (oranje) 5 (Groen)
DV200 71.8 69.9 70.1 58.7 80.5

Als dezelfde monsters bijvoorbeeld werden gekwantificeerd met qPCR-assays van verschillende doelen en fragmentgroottes, correleert de opbrengst door qPCR niet goed met de DV200-scores. In dit voorbeeld hadden de monsters met de laagste DV200-scores zelfs de grootste opbrengst door qPCR (Figuur 14).

Afbeelding 14. qPCR-opbrengsten van DNA geïsoleerd uit FFPE-coupes. Dezelfde DNA-monsters die waren geïsoleerd met vijf verschillende zuiveringsmethoden in het fragmentanalysatorspoor en de bovenstaande DV200-tabel, werden gekwantificeerd met qPCR-assays van verschillende doelen en fragmentgroottes.

Hoewel er algemene trends zijn, correleert de DV200-score niet noodzakelijkerwijs met succes in downstream-assays zoals qPCR.

qPCR heeft verschillende voordelen voor de kwantificering van FFPE-monsters. Ten eerste kan qPCR erg gevoelig zijn, waarbij slechts een kleine hoeveelheid monster nodig is en pg/µl hoeveelheden DNA worden gedetecteerd. In termen van gevoeligheid bij nucleïnezuurdetectie wordt deze alleen overtroffen door ddPCR. qPCR kan ook een maatstaf bieden voor hoe afgebroken of verknoopt een DNA-monster kan zijn, aangezien nucleïnezuur een geschikt substraat moet zijn voor een DNA-polymerase voordat een signaal kan worden gegenereerd. Absorptie vertegenwoordigt mogelijk niet het monster dat geschikt is voor de downstream-assay omdat het DNA, gefragmenteerd DNA en nucleotiden zal detecteren. Ten slotte bieden de meeste qPCR QC-assays, zoals de ProNex® DNA QC-assay (Cat.# NG1004, NG1005) interne controles die worden gebruikt om de aanwezigheid van remmers in het monster te detecteren voordat een duurdere assay wordt geprobeerd. Dit kan u helpen niet alleen de integriteit van de nucleïnezuren te beoordelen, maar ook de kans dat een op amplificatie gebaseerde test succesvol is.

NGS is een andere test die door sommige laboratoria wordt gebruikt om hun monsters te QC. Hier zijn verschillende redenen voor. Sommige laboratoria proberen zoveel mogelijk gegevens uit zeer kostbare monsters te halen, in welk geval elke sequentie-informatie de kosten en het risico van mislukte sequencing-runs waard kan zijn. Als QC-test kan NGS veel informatie opleveren, maar het is duur en kan grote hoeveelheden monster en tijd vergen. Sommige laboratoria gebruiken low-pass NGS, waarbij gebruik wordt gemaakt van sterk gemultiplexte monsters om de kosten per monster te verlagen om te bepalen of het de tijd en middelen waard is om dieper te sequensen. De meeste sequencing- en zuiveringsproviders raden qPCR-assays aan om FFPE-DNA te kwantificeren, aangezien alle NGS-workflows voornamelijk afhangen van het succes van enzymatische amplificatiestappen om sequencing-klaar DNA te verkrijgen als onderdeel van bibliotheekvoorbereidingsstappen.

Tabel 4. Vergelijkende voor- en nadelen van verschillende QC-assays.

Methode Snelheid Gevoeligheid Kwantitatief? Zuiverheid meten? Grootte van NA beoordelen? Crosslinking detecteren? Kosten
Spectrofotometrie (NanoDrop) +++ + Semi - kwantitatief + - - $
Op kleurstof gebaseerde kwantificering +++ ++ Y - - - $
DV200 ++ + Semi - kwantitatief - +* - $$
Gelelektroforese ++ +/- Semi - kwantitatief - +* - $
qPCR ++ +++ Y +* + + $
NGS + Y + ++ + $$$

Genomische DNA-isolatie van planten

Het Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System (Cat.# FF3760, FF3761) is ontworpen voor handmatige of geautomatiseerde 96-wells zuivering van DNA uit plantenblad- en zaadweefsel. Het Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System is gevalideerd met maïs- en tomatenblad en met canola- en zonnebloemzaden. Het DNA dat uit deze monsters is gezuiverd, kan worden gebruikt in PCR en andere meer veeleisende toepassingen, zoals RAPD-analyse. Omdat plantaardig materiaal bijzonder moeilijk te lyseren kan zijn, vooral bij het werken met taai of houtachtig weefsel, omvat de extra benodigde apparatuur niet alleen een magneet (MagnaBot® FLEX 96 Magnetic Separation Device, Cat.# VA1920), maar ook een apparaat dat in staat is om zaad te breken of bladmateriaal (bijv. Geno/Grinder® 2000 van SPEX CertiPrep, Inc.).

De opbrengst hangt af van het bronmateriaal en hoe goed de zaden of bladschijven worden verpulverd voorafgaand aan de genomische DNA-isolatie. De opbrengst kan variëren van 10–100 ng van een enkele pons van 8 mm. Om de opbrengst van het Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System te vergroten, kan een opschaling in volume met maximaal 5 bladponsen worden gebruikt [zoals aangetoond in Promega-opmerkingen 79]. De potentiële opschaling wordt beperkt door het volume in een deep-well, 96-well plaat.

Een andere geautomatiseerde optie die we hebben om aan uw behoeften op het gebied van planten-DNA-extractie te voldoen, is de Maxwell® RSC Plant DNA Kit (Cat.# AS1490). De Maxwell® RSC Plant DNA Kit wordt gebruikt met de Maxwell® RSC en RSC 48 Instruments om een ​​eenvoudige methode te bieden voor efficiënte, geautomatiseerde zuivering van genomisch DNA (gDNA) uit een reeks plantenweefselmonsters, waaronder maïs, sojabonen en Arabidopsis. De instrumenten worden geleverd met voorgeprogrammeerde zuiveringsmethoden en maken gebruik van voorgedoseerde reagenscartridges, voor maximale eenvoud en gemak.

Met dit systeem kan DNA in minder dan 60 minuten uit plantenmonsters worden gezuiverd met minimale voorbewerking en zonder organische extracties. Geautomatiseerde zuivering resulteert in consistente zuivering, met minder variabiliteit dan traditionele DNA-extractiemethoden zoals CTAB en spinkolommen. Het resulterende gezuiverde DNA is klaar voor gebruik in stroomafwaartse toepassingen, inclusief amplificatietesten.

Serum-plasma genomische DNA-isolatie

Voor hoogwaardig, gezuiverd celvrij DNA uit plasmamonsters bieden wij de Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit (Cat.# AS1480) aan. Door gebruik te maken van het eenvoudige driestappenprotocol kan het Maxwell® RSC Instrument 1 tot 16 monsters verwerken en kan het Maxwell® RSC 48 Instrument 1 tot 48 monsters verwerken. Voeg eenvoudig 0,2-1,0 ml plasma toe aan de voorbereide cartridges en selecteer Start, geen voorbewerking van monsters vereist. In ongeveer 70 minuten heeft u een hoge opbrengst aan amplificeerbaar DNA dat klaar is voor gebruik in downstream-assays, waaronder qPCR, NGS en digitale PCR.

Als magnetische deeltjesverplaatser, niet als vloeistofverwerker, biedt de Maxwell® RSC bovendien verschillende voordelen ten opzichte van andere geautomatiseerde systemen. Aangezien er tijdens de monsterverwerking geen vloeistof wordt gehanteerd of spatten, is er een minimaal risico op kruisbesmetting van monsters. Het elimineert ook de zorgen van mogelijke verstoppingen en onvermijdelijke systeemstoringen die volgen, waardoor een soepele workflow met minder onderbrekingen wordt gegarandeerd.

Bacteriële genomische DNA-isolatie

Als u snel beslissingen moet nemen over mogelijke voedselbesmetting en bederf, biedt de Maxwell® RSC PureFood Pathogen Kit (Cat.# AS1660) een eenvoudig geautomatiseerd protocol met minimale praktische stappen. De kit elimineert effectief moeizame voorbewerkingsstappen voor monsters, zoals enzymatische voorbehandeling, omdat het werkt met het remmen van monstertypes en ook het vermogen heeft om zowel Gram+ als Gram–-bacteriën te lyseren.

Door de hoogwaardige Maxwell®-chemie te koppelen aan de vertrouwde benchtop Maxwell® RSC-instrumenten, kunt u in slechts 40 minuten effectief bacterieel DNA van maximaal 48 voedselmonsters zuiveren. Eenmaal geëxtraheerd, is het resulterende DNA klaar voor geavanceerde stroomafwaartse moleculaire analyses, inclusief serotypering, NGS en identificatie van bederforganismen.

Deze methode kan worden gebruikt voor zowel rauw als verwerkt voedsel en is met succes gebruikt om pathogeen-DNA te isoleren uit een grote verscheidenheid aan voedselmonsters, waaronder E coli 0157:H7 van ongekookt rundvlees, Salmonella enterica van ongekookte kip en Listeria monocytogenes van volle melk. Afbeelding 15 hieronder belicht een vergelijking van totaal DNA versus E coli 0157:H7 DNA geëxtraheerd uit koriandermonsters die waren verrijkt met de E coli 0157:H7 bacteriën.

Figuur 15. Vergelijking van totaal DNA en E coli 0157:H7 DNA geëxtraheerd uit koriandermonsters verrijkt met de aangegeven hoeveelheden E coli 0157:H7 bacteriën. De totale DNA-concentratie werd bepaald met behulp van het QuantiFluor® ONE dsDNA-systeem.

Buffy Coat Genomische DNA-isolatie

De Maxwell® RSC Buffy Coat DNA Kit (Cat.# AS1540) biedt een eenvoudige, geautomatiseerde methode voor genomische DNA-extractie met behulp van het handige, voorgevulde patroonformaat van het Maxwell® RSC Instrument. De kit bevat alle reagentia die u nodig heeft voor optimale DNA-extractie en is compatibel met bloed dat is opgeslagen in EDTA, heparine en citraat-anticoagulantia. Vermijd het vervelende en tijdrovende gedoe van het voorbewerken van monsters, voeg eenvoudig 50-250 μl van uw monster rechtstreeks toe aan well #1 van de cartridges. Uw gezuiverde DNA is in ongeveer 50 minuten klaar voor analyse en kan direct worden gebruikt in verschillende stroomafwaartse toepassingen, zoals agarosegelelektroforese.

Voedsel genomische DNA-isolatie

Voedsel en plantaardig materiaal vormen vaak de grootste uitdaging voor cellysis en intact DNA-extractie, vanwege de lysiscondities die nodig zijn om het nucleïnezuur vrij te maken en de verwerking van plantaardig materiaal tot eetwaren.

Een ander gespecialiseerd genomisch DNA-isolatiesysteem is het Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food (Cat.# FF3750, FF3751). Dit handige protocol is ontworpen voor de handmatige zuivering van DNA uit een verscheidenheid aan voedselmonsters, waaronder maïszaden, maïsmeel, sojabonen, sojameel en sojamelk, en genereert resultaten in een derde van de tijd van traditionele methoden. Bovendien kan DNA worden gezuiverd uit bewerkte voedingsmiddelen zoals maïschips, chocolade en chocoladebevattende voedingsmiddelen, lecithine en plantaardige oliën indien gebruikt met de juiste geoptimaliseerde protocollen.

Het DNA dat uit veel van deze monsters is gezuiverd, kan worden gebruikt in PCR-gebaseerde tests voor DNA-sequenties van genetisch gemodificeerde organismen (GMO), zoals door kwantitatieve analyse met behulp van TaqMan®-assays. Zoals bij alle isolatiesystemen die de MagneSil® PMP's gebruiken, is een magnetische scheidingsstandaard nodig die de verwerking van maximaal 12 monsters per batch mogelijk maakt. Met monsters die sterk bewerkt voedsel bevatten, zal het geïsoleerde genomische DNA gefragmenteerd zijn en beter geschikt voor analyse met behulp van amplificatie in plaats van een Southern-blot. De opbrengst van DNA uit dit systeem zal variëren afhankelijk van het brontype en de mate van voedselverwerking.

De Maxwell® RSC PureFood GMO en authenticatiekit (Cat.# AS1600) biedt een gemakkelijke en geautomatiseerde methode voor efficiënte zuivering van DNA voor PCR-gebaseerde authenticatie van voedsel en ingrediënten. De kit wordt gebruikt met de Maxwell® RSC- en RSC 48-instrumenten en kan DNA zuiveren van rauwe en bewerkte voedselmonsters, waaronder maïs, sojabonen, canola, rundergehakt en gemalen varkensvlees.

Een protocol van 100 minuten vereist slechts 30 minuten hands-on tijd, waardoor niet alleen snellere resultaten worden bereikt met automatisering op afstand, maar ook laboratoriumresources worden vrijgemaakt voor waardevollere activiteiten. Het gezuiverde DNA dat is geëxtraheerd met behulp van de PureFood Kit is klaar voor gebruik voor verschillende toepassingen, waaronder realtime PCR, gelelektroforese, next-generation en Sanger-sequencing en microarrays.

Nucleïnezuurzuiveringsprotocollen voor planten- en voedselmonstertypes

Ontdek onze verzameling protocollen voor handmatige en geautomatiseerde DNA- of RNA-extractie uit een verscheidenheid aan voedsel- en plantenmonsters.


AQA nieuwe specificatie-DNA-structuur en eiwitsynthese-B13.5

Paperfriendlyresourcesuk PFR-bronnen zijn ontworpen om ervoor te zorgen dat onderwijs van goede kwaliteit niet in het gedrang komt door afdrukbeperkingen of het bufferen van video's. Lessen met werkbladen zijn gemaakt voor docenten om ten minste twee exemplaren af ​​te drukken op een A4-blad.

Deel dit

DNA-structuur en eiwitsynthese lessen gemaakt in overeenstemming met de NIEUWE AQA-specificatie (9-1). NB: ALLEEN BIOLOGIE. Ik heb dit onderwerp in twee lessen geleerd, omdat het een moeilijk concept is en effectief kan worden onderwezen in plaats van gehaast te zijn. Deze bron is ontworpen voor een hogere vaardigheidsklasse, hoewel de inhoud kan worden aangepast aan elke vaardigheid. Omvat: ingesloten video's en timers, dia-animaties, oefenvragen met antwoorden op dia's, werkbladen en een interactieve quiz.

AQA-specificatielink: 6.1.5
Relevant hoofdstuk: B13 Genetica en voortplanting. AQA Biology derde editie leerboek-pagina 204-205.

Studenten moeten DNA kunnen beschrijven als een polymeer gemaakt van vier verschillende nucleotiden. Elk nucleotide bestaat uit een gemeenschappelijke suiker- en fosfaatgroep met een van de vier verschillende basen die aan de suiker zijn bevestigd. DNA bevat vier basen, A, C, G en T. Een reeks van drie basen is de code voor een bepaald aminozuur. De volgorde van basen bepaalt de volgorde waarin aminozuren worden geassembleerd tot
een bepaald eiwit produceren.
De lange strengen DNA bestaan ​​uit afwisselende suiker- en fosfaatdelen. Aan elke suiker is een van de vier basen gehecht. Het DNA-polymeer is opgebouwd uit herhalende nucleotide-eenheden.

(alleen HT) Studenten moeten in staat zijn om: •• een eenvoudige beschrijving van eiwitsynthese te herinneren •• eenvoudig uit te leggen hoe de structuur van DNA het gemaakte eiwit beïnvloedt •• beschrijven hoe genetische varianten het fenotype kunnen beïnvloeden: a) bij het coderen van DNA door de activiteit van een eiwit: en b) in niet-coderend DNA door
veranderen hoe genen tot expressie worden gebracht.
(Alleen HT) In de complementaire strengen is een C altijd gekoppeld aan een G op de tegenoverliggende streng en een T aan een A.
(Alleen HT) Van studenten wordt niet verwacht dat ze de structuur van mRNA, tRNA of de gedetailleerde structuur van aminozuren of eiwitten kennen of begrijpen.
(alleen HT) Studenten moeten kunnen uitleggen hoe een verandering in de DNA-structuur kan leiden tot een verandering in het eiwit dat door een gen wordt gesynthetiseerd.
(Alleen HT) Eiwitten worden gesynthetiseerd op ribosomen, volgens atemplate. Dragermoleculen brengen specifieke aminozuren in de juiste volgorde aan de groeiende eiwitketen toe.
(alleen HT) Wanneer de eiwitketen compleet is, vouwt deze zich op tot een unieke vorm. Door deze unieke vorm kunnen de eiwitten hun werk doen als enzymen, hormonen of structuren in het lichaam vormen zoals collageen.

Krijg deze bron als onderdeel van een bundel en bespaar tot 42%

Een bundel is een pakket bronnen dat is gegroepeerd om een ​​bepaald onderwerp of een reeks lessen op één plek te onderwijzen.

AQA Biologie-AFZONDERLIJKE onderwerpen ALLEEN PAPIER 2

Afzonderlijke Wetenschappen B10.4, B10.5 & B10.6 B11.9 & B11.10 B12.1, B12.2, B12.3, B12.4. B12.5 B13.4, B13.5 & amp B13.6 B14.5 & amp B14.6 B15.1, B15,2, B15.3 & amp B15.4

AQA nieuwe specificatie-B13 Reproductiebundel-Biologie/afzonderlijke wetenschap

Op veler verzoek heb ik een B13-bundel geüpload. Deze bundel bevat de inhoud voor BIOLOGIE/SEPARATE bètastudenten. Het bevat alle bronnen die u nodig hebt om het onderwerp B13-reproductie te onderwijzen. Als je dit onderwerp (B12) leert aan gecombineerde bètastudenten, heb ik er een aparte bundel voor geüpload. Lessen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de specificatie-eisen. Video's ingebed voor gebruiksgemak, papiervriendelijke bronnen bijgevoegd. Zoek in de afzonderlijke lessen voor meer informatie over de lesinhoud. Bespaar 42% door deze bundel te kopen. Hogere onderwerpen inbegrepen. Totaal 11 lessen + vorig papieren vragenpakket over mitose en meiose. L1 = soorten voortplanting L2 = celdeling en seksuele voortplanting L3 = het beste van twee werelden L4 = DNA en het genoom L5a = DNA-structuur L5b = eiwitsynthese L6 = genexpressie en mutatie L7 = overerving in actie L8 = meer over genetica L9 = erfelijke aandoeningen L10 = screening op genetische aandoeningen


Conclusie

Specifieke inspanningen voor het bepalen van de omgevingssequentie die meer specifiek gericht zijn op picoeukaryoten zijn nodig, met minder nadruk op prokaryoten. Dit zou een betere dekking en dus grotere verzamelingen van eukaryote genomen mogelijk maken. Het doel van de Sargasso Sea-omgevingssequencing was duidelijk om prokaryotische sequenties te verkrijgen en dit werd gedaan door een zeer kleine filterporositeit te gebruiken, waarbij organismen tussen 0,22 en 0,8 m werden gezeefd. De eenvoudigste manier om de weergave van picoeukaryoten in een metagenoom te verbeteren, zou zijn om het filtratiebereik te verschuiven naar tussen 0,5 en 2 m en de sequencing-inspanning te verhogen tot minimaal een miljoen aflezingen. Dit zou een groot deel van de prokaryoten elimineren en het aandeel picoeukaryoten in het watermonster vergroten.


De DNA-faciliteit van het Iowa State University Office of Biotechnology biedt onderzoeksondersteunende diensten voor onderzoekers binnen de academische wereld, de industrie en de overheid. De DNA-faciliteit van de Iowa State University zet zich in voor het leveren van kwaliteitsservice op een consistent snelle, betrouwbare en economische manier.

Met het OnCore online bestel- en volgsysteem van de DNA-faciliteit van de Iowa State University kunnen klanten bestellingen plaatsen, de voortgang van bestellingen volgen en 24 uur per dag resultaten ontvangen van de server van de faciliteit. Zodra uw bestelling is geplaatst, hoeft u alleen maar een kopie van uw trackingnummer af te drukken en deze samen met uw monsters naar onze faciliteit te sturen. Wanneer uw monsters zijn verwerkt, ontvangt u een e-mail met de melding dat uw gegevens klaar zijn om te downloaden. Typische doorlooptijd voor de meeste van onze diensten is binnen twee werkdagen.

De DNA-faciliteit van de Iowa State University bevindt zich op de begane grond (kamer 1190) van het Molecular Biology Building op de centrale campus van de Iowa State University. Wij zijn geopend van maandag tot en met vrijdag van 7.30 tot 17.00 uur om al uw vragen over uw bestelling te beantwoorden.

Faciliteit Contact

David Wright, Ph.D.
Facilitair Manager
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-5415

Kevin Cavallin
Single-Tube Sanger Sequencing
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9585

Diane Shogren
Sequentie met hoge doorvoer
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9731

Michael Baker, Ph.D.
Chromium-bibliotheken
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-4705

Tanya Murtha
GridION, MiSeq, DNA, QuantSeq,
16S/18S, & sRNA-bibliotheken

E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-1813

Diane Shogren
HiSeq & RNA-bibliotheken
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9731

Amanda Brockman
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9837

Diane Shogren
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9731

Diane Shogren
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9731

Kevin Cavallin
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9585

Kevin Cavallin
Bioanalyzer & Qubit Contact
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9585

Tanya Murtha
Fragmentanalysator Contact
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-1813

Kevin Cavallin
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9585

Tanya Murtha
HMW Genomische DNA-extractie
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-1813

Tanya Murtha
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-1813

Kevin Cavallin
E-mailadres:
Telefoon: (515) 294-9585


SynXII-foutopsporing

Tijdens de assemblage van synXII werden verschillende hindernissen overwonnen. Eerste synXII groeide aanvankelijk langzamer dan het wildtype, deels als gevolg van de volledige verwijdering van alle tRNA-genen op het chromosoom, en in het bijzonder verwijdering van twee van de drie tL(UAG)L genen (Fig. 2 en Fig. S8). Een soortgelijk fenomeen werd waargenomen tijdens de synthese van synX, waarbij de deletie van tR(CCU)J, het enige arginine-tRNA met het CCU-anticodon, leidde tot een ernstig groeidefect in YPGE-medium (10) (afb. S17). Ten tweede was de locatie van selectieve markers in elke megachunk ontworpen om een ​​niet-essentieel gen te onderbreken, maar in veel gevallen leidde dit tot ernstig verminderde mitochondriale functie of stressresistentie. Theoretisch zou het defect hersteld moeten zijn nadat de volgende megachunk was geïntegreerd (fig. S18). De mitochondriale defecten resulteerden echter gewoonlijk in een aanzienlijk langzamere groeisnelheid, waardoor de vervangingscyclus aanzienlijk werd verlengd (fig. S16A). Ten derde wordt synonieme hercodering binnen een open leeskader over het algemeen goed getolereerd. We hebben ten minste één geval gevonden tijdens het proces van het vervangen van megachunk E, waarin de functie van MMM1 was aangetast als gevolg van hercodering om een ​​PCRTag (YLL006W.1F) te genereren (9, 10). Ten vierde, verwijdering van een hypothetisch intron binnen de 5' UTR van COQ9 leidde tot een transcriptieblokkade (fig. S16). Omdat we tijdens het assemblageproces veel aandacht hebben besteed aan celgroei in YPGE-medium, zijn de meeste gedetecteerde defecten gerelateerd aan de mitochondriale functie. Er kunnen andere kleine defecten in het synthetische genoom zijn, die onder de omstandigheden onopgemerkt bleven. Aangezien de uiteindelijke stammen echter bijna wildtype-fitness vertonen zodra een tRNA is geleverd, is synXII het grootste synthetische lineaire chromosoom dat is gesynthetiseerd en is het volledig functioneel.

SynXII heeft een zeer plastische rDNA-locus die niet alleen kan worden verplaatst naar andere chromosomale loci, maar ook kan worden gewijzigd in zijn ITS-regio om zich voor te doen als een afzonderlijke soort zoals gedefinieerd door "DNA-barcodering" die veel wordt gebruikt in taxonomie. Het vermogen om "soortverandering" uit te voeren die hier wordt vermeld, weerspiegelt vermoedelijk de mate van evolutionaire flexibiliteit waarmee deze ITS-regio's veranderen. Dit streepjescodegebied is echter duidelijk niet oneindig flexibel, aangezien slechts relatief bescheiden intragenus-baseveranderingen werden getolereerd. De ernstigere intergenus-verschillen in ITS-sequentie resulteerden niet in functionele rDNA's, waarschijnlijk vanwege een defect in rRNA-verwerking. Het vermogen om een ​​chromosoom ter grootte van een megabase te ontwerpen, te bouwen en te debuggen, samen met de flexibiliteit in de rDNA-locuspositie, spreekt tot de opmerkelijke algehele flexibiliteit van het gistgenoom.


Bioproductie van puur enkelstrengs DNA op kilobaseschaal

Schaalbare productie van kilobase enkelstrengs DNA (ssDNA) met sequentiecontrole heeft toepassingen in therapieën, gensynthese en sequencing, scaffolded DNA-origami en archiefopslag van DNA-geheugen. Biologische productie van circulair ssDNA (cssDNA) met M13 voorziet in deze behoeften tegen lage kosten. Een onvervuld doel is echter om de essentiële eiwitcoderende regio's van het geëxporteerde DNA te minimaliseren met behoud van de besmettelijkheid en productiezuiverheid om sequenties te produceren met een lengte van minder dan 3000 nt, relevant voor therapeutische en materiaalwetenschappelijke toepassingen. Hiertoe biedt synthetische minifaag met inserts van aangepaste sequentie en grootte schaalbare, goedkope synthese van cssDNA op milligram- en hogere schalen. Hier optimaliseren we de groeiomstandigheden met behulp van een E. coli-helperstam in combinatie met een minifaaggenoom dat alleen een f1-oorsprong en een β-lactamase-coderend (bla) antibioticumresistentiegen draagt, waardoor isolatie van puur cssDNA met een minimale sequentie-genoomlengte van 1.676 mogelijk wordt. nt, zonder dat extra zuivering nodig is om DNA te besmetten. Goedkope schaalbaarheid van isogeen cssDNA met aangepaste lengte is aangetoond voor een sequentie van 2520 nt met behulp van een bioreactor, gezuiverd met lage endotoxineniveaus (<5 E.U./ml). We passen deze exonuclease-resistente cssDNA's toe op de zelfassemblage van wireframe-DNA-origami-objecten en om digitale informatie over het minifaaggenoom te coderen voor biologische amplificatie.

Belangenconflict verklaring

T.R.S., R.R.D. en MB zijn mede-uitvinders van een octrooi aangevraagd (62/584,664) voor sommige van de hierin beschreven werkwijzen.

Figuren

Schaalbare bacteriofaagproductie van isogene…

Schaalbare bacteriofaagproductie van isogeen cssDNA. ( een ) Minifaag phpB52 werd geassembleerd ...

Shaker flacon productie van pure…

Shaker kolf productie van puur cssDNA. ( een ) Schudflesgroei van...

Batchvergisterproductie van pure…

Batch-fermentatieproductie van puur cssDNA. ( een ) Schaalbare productie in een…

Toepassingen van schaalbare, isogene minifaag…

Toepassingen van schaalbare, isogene minifaagproductie. ( een ) Vijfhoekige bipyramiden van 52 bp...


Interne financiering van NEB en Ginkgo Bioworks. Financiering voor open access kosten: New England Biolabs.

Belangenconflict verklaring. Vladimir Potapov, Jennifer L. Ong, Bradley W. Langhorst, Katharina Bilotti, Thomas C. Evans, Jr, Gregory J.S. Lohman zijn medewerkers van New England Biolabs, een fabrikant en leverancier van moleculair biologische reagentia, waaronder DNA-ligasen. Deze aansluiting heeft geen invloed op de onpartijdigheid van de auteurs, de naleving van de normen en het beleid van tijdschriften, of de beschikbaarheid van gegevens.

Dan Cahoon, Barry Canton en Thomas F. Knight zijn werknemers van Ginkgo Bioworks, Inc., een bedrijf dat enzymen en reagentia gebruikt voor gensynthese bij de ontwikkeling van gemanipuleerde microben. Deze aansluiting heeft geen invloed op de onpartijdigheid van de auteurs, de naleving van de normen en het beleid van tijdschriften, of de beschikbaarheid van gegevens.


Bekijk de video: Shotgun sequencing method explained (Januari- 2022).