Informatie

B1. Aminozuuranalyse en chemische sequentiebepaling - biologie


Zoals beschreven in de Inleiding tot eiwitten, kunnen we de structuur van eiwitten op verschillende niveaus van complexiteit begrijpen.

Figuur: Eiwitanalyse van lage naar hoge resolutie.

In het laatste hoofdstuk hebben we geleerd over de ladings- en chemische reactiviteitseigenschappen van geïsoleerde aminozuren en aminozuren in eiwitten. De analyse van een heel eiwit is ingewikkeld omdat elk verschillend aminozuur vele malen in de sequentie kan worden weergegeven. Elk eiwit heeft een N-terminaal en C-terminaal aminozuur en een secundaire structuur. Sommige eiwitten bestaan ​​biologisch als multisubunit-eiwitten, wat bijdraagt ​​aan de complexiteit van de analyses, aangezien de eiwitten nu meerdere N- en C-terminale uiteinden zouden hebben. Bovendien kunnen geïsoleerde eiwitten chemische modificaties hebben (post-translationeel) die bijdragen aan de functionaliteiten van de eiwitten, maar ook aan de complexiteit van de analyses. Bekijk de structuur van het RhoA-programma hieronder om enkele van deze problemen te illustreren.

Bijgewerkt RhoA - een cytoplasmatisch eiwit - De complexiteit van eiwitanalyse Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)


Aminozuursamenstelling

Bij een laag resolutieniveau kunnen we de aminozuursamenstelling van het eiwit bepalen door het eiwit gedurende verschillende tijdsintervallen onder vacuüm te hydrolyseren in 6 N HCl, 100oC. Na het verwijderen van het HCl wordt het hydrolysaat aangebracht op een ionenuitwisselingskolom of hydrofobe interactiekolom en worden de aminozuren geëlueerd en gekwantificeerd met betrekking tot bekende standaarden. Een niet van nature voorkomend aminozuur zoals norleucine wordt in bekende hoeveelheden toegevoegd als interne standaard om de kwantitatieve terugwinning tijdens de reacties te controleren. De gescheiden aminozuren worden vaak gederivatiseerd met ninhydrine of fenylisothiocyantaat om hun detectie te vergemakkelijken. De reactie wordt gewoonlijk 24, 36 en 48 uur uitgevoerd, aangezien aminozuren met OH (zoals ser) worden vernietigd. Een tijdsverloop maakt het mogelijk om de concentratie van Ser op tijdstip t=0 te extrapoleren. Trp wordt ook vernietigd tijdens het proces. Bovendien worden de amideverbindingen in de zijketens van Gin en Asn gehydrolyseerd om respectievelijk Glu en Asp te vormen.

  • AA-analyse: Eiwitfaciliteit van de Iowa State University

N- en C-terminal aminozuuranalyse

De aminozuursamenstelling geeft niet de volgorde van het eiwit. Het N-uiteinde van het eiwit kan worden bepaald door het eiwit te laten reageren met fluorodinitrobenzeen (FDNB) of dansylchloride, dat reageert met elk vrij amine in het eiwit, inclusief de epsilon-aminogroep van lysine. De aminogroep van het eiwit is gekoppeld aan de aromatische ring van de DNB via een amine en aan de dansylgroep door een sulfonamide, en is daarom stabiel tegen hydrolyse. Het eiwit wordt gehydrolyseerd in 6 N HCl en de aminozuren worden gescheiden door TLC of HPLC. Er zouden twee vlekken moeten ontstaan ​​als het eiwit een enkele keten was, met enkele Lys-residuen. Het gelabelde aminozuur anders dan Lys is het N-terminale aminozuur. Het C-terminale aminozuur kan worden bepaald door toevoeging van carboxypeptidasen, enzymen die aminozuren van de C-terminal afsplitsen. Er moet een tijdsverloop worden gedaan om te zien welk aminozuur als eerste vrijkomt. N-terminale analyse kan ook worden uitgevoerd als onderdeel van de sequentiebepaling van het gehele eiwit, zoals hieronder wordt besproken (Edman-degradatiereactie).

Analyse voor specifieke aminozuren

Aromatische aminozuren kunnen worden gedetecteerd aan de hand van hun karakteristieke absorptieprofielen. Aminozuren met specifieke functionele groepen kunnen worden bepaald door chemische reacties met specifieke modificerende groepen, zoals weergegeven in paragraaf 2A.

Afbeelding: aminozuurabsorptieprofielen

Aminozuursequentie - Edman Degradation

Er bestaan ​​twee methoden om de volledige sequentie van een eiwit te bepalen. In één wordt het eiwit gesequenced; in de andere wordt het DNA dat voor het eiwit codeert, gesequenced, waaruit de aminozuursequentie kan worden afgeleid. Het eigenlijke eiwit kan worden gesequenced door geautomatiseerde, opeenvolgende Edman Degradation.

Afbeelding: Edman-degradatie

Bij deze techniek reageert een aan een vaste fase geadsorbeerd eiwit met fenylisothiocyanaat. Een intramoleculaire cyclisatie en splitsing van het N-terminale aminozuur resulteert, die van het geadsorbeerde eiwit kan worden gewassen en gedetecteerd door HPLC-analyse. De opbrengsten van deze techniek zijn bijna 100%. Na verloop van tijd hopen zich echter meer ketens op waarin een N-terminaal aminozuur niet is verwijderd. Als het in de volgende stap wordt verwijderd, zullen twee aminozuren elueren, waardoor een toenemende "ruis" in de elutiestap ontstaat - d.w.z. er zal meer dan 1 aminozuurderivaat worden gedetecteerd. Daarom is de maximale lengte van het peptide waarvan de sequentie kan worden bepaald ongeveer 50 aminozuren. De meeste eiwitten zijn groter dan dat. Daarom moet het eiwit, voordat de sequentie kan worden bepaald, worden gesplitst met specifieke enzymen, endoproteasen genaamd, die eiwitten na specifieke zijketens splitsen. Trypsine splitst bijvoorbeeld eiwitten binnen een keten na Lys en Arg, terwijl chymotrypsine zich splitst na aromatische aminozuren, zoals Trp, Tyr en Phe. Chemische splitsing door kleine moleculen kan ook worden gebruikt. Cyanogeenbromide, CNBr, splitst eiwitten na methioninezijketens. De individuele eiwitten moeten worden gesplitst met behulp van twee verschillende methoden, en elk peptidefragment moet worden geïsoleerd en gesequenced. Vervolgens kan de volgorde van de gesplitste peptiden met een bekende sequentie worden samengevoegd door de peptidesequenties te vergelijken die zijn verkregen met behulp van verschillende splitsingsmethoden. Veel eiwitten hebben ook disulfidebindingen die Cys-zijketens distaal van elkaar in de polypeptideketen verbinden. Proteolytische of chemische splitsing van het eiwit zou leiden tot de vorming van een fragment dat twee peptiden bevat die door disulfiden zijn verbonden. Edman-degradatie zou twee aminozuren uit dergelijke fragmenten vrijmaken. Om dit probleem te voorkomen, wordt het eiwit geoxideerd met permierenzuur, dat onomkeerbaar vrij Cys oxideert, of Cys-Cys disulfiden tot cysteïnezuurresiduen. Een samenvatting van de stappen die betrokken zijn bij eiwitsequencing worden hieronder weergegeven:

EIWIT SEQUENCING STRATEGIE - 8 STAPPEN

  1. Als het eiwit meer dan één polypeptideketen bevat, worden de ketens gescheiden en gezuiverd. Als disulfidebindingen twee verschillende ketens verbinden, moet de S-S-binding worden gesplitst (zoals beschreven in stap 2) en moet elk peptide onafhankelijk worden gezuiverd.
  2. Intrachain SS-bindingen tussen Cys-zijketens worden gesplitst met permierenzuur. (Zie hierboven voor SS-bindingen tussen ketens).
  3. De aminozuursamenstelling van elke keten wordt bepaald
  4. De N-terminale en C-terminale residuen worden geïdentificeerd.
  5. Elke polypeptideketen wordt in kleinere fragmenten gesplitst en de aminozuursamenstelling en sequentie van elk fragment wordt bepaald.
  6. Stap 5 wordt herhaald, waarbij een andere splitsingsprocedure wordt gebruikt om een ​​andere en overlappende set peptidefragmenten te genereren.
  7. De totale aminozuursequentie van het eiwit wordt gereconstrueerd uit de sequenties in overlappende fragmenten.
  8. De positie van de S-S is gelegen. (Zie online probleemset - Eiwitten)

Identificatie van nieuwe kopdatumdeterminanten in tarwe 5B-chromosoom

Variabiliteit van de koersdatum kan helpen bij de aanpassing van tarwe aan lokale omgevingen. Daarna is de ontdekking van nieuwe determinanten van de koersdatum belangrijk voor de verbetering van granen. In deze studie gebruikten we zachte tarwecultivar Chinese Spring (CS) en de substitutielijn van CS met 5B-chromosoom van T. dicoccoides (CS-5Bdic), verschillend in hun kopdatum met twee weken, om determinanten van kopdatum op 5B-chromosoom te detecteren.

Resultaten

De mogelijke invloed van de VRN-B1 gen, de krachtigste regulator van bloei, gelokaliseerd op het 5B-chromosoom, voor verschillen in koerstijd tussen CS en CS-5Bdic werd bestudeerd. De sequentiebepaling van dit gen uit CS-5Bdic toonde aan dat een insertie van een nucleotide-triplet een extra aminozuur produceerde in het overeenkomstige eiwit. Geen veranderingen in de transcriptieniveaus van elk homoloog VRN-1 loci werden gevonden in CS-5Bdic in vergelijking met CS. Om het loci-bepalende koersdatumverschil vast te stellen, werd een set van 116 recombinante inteelt 5'-chromosomale lijnen ontwikkeld als resultaat van hybridisatie van CS met CS-5Bdic en hun koersdata werden geschat. Met behulp van het Illumina Infinium 15 k Wheat-platform werden 379 5B-specifieke polymorfe markers gedetecteerd en werd een genetische kaart met 82 skeletmarkers geconstrueerd. Fenotype (kopdatum) - analyse van genotype-associatie onthulde achtenzeventig markers in het pericentromere gebied van 5B-chromosoom die significant geassocieerd waren met variatie in kopdatum. Op basis van deze schatting en syntenie met genomen van modelgewassen hebben we de drie beste kandidaatgenen geïdentificeerd: WRKY, ERF/AP2 en FHY3/FAR1.

Conclusies

We veronderstelden dat het verschil in activiteit van WRKY, ERF/AP2 en/of FHY3/FAR1 transcriptiefactoren tussen CS en CS-5Bdic een waarschijnlijke reden zijn voor het waargenomen verschil in kopdatums. De gegevens die in dit onderzoek zijn verkregen, vormen een goede basis voor het daaropvolgende onderzoek naar koerstijdpaden in tarwe.


Abstract

We beschrijven een nieuw celpenetrerend eiwit, B1, dat in staat is om geconjugeerde eiwitten en nucleïnezuren in zoogdiercellen af ​​te leveren. B1 is een 244-aminozuurproduct van een frameshift met één base in het gen dat codeert voor verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP). Het molecuul heeft een netto positieve lading van 43 en een zeer hoge lading-tot-massaverhouding van 1,5. Met eGFP gefuseerd B1 dringt krachtig door in zowel hechtende als suspensiecellen, waarbij >80% van de cellen het eiwit opnemen bij blootstelling aan concentraties zo laag als 1 M. Het eiwit bleek te clusteren in het paranucleaire gebied van TZM-bl-cellen. Het belangrijkste is dat we laten zien dat B1 niet alleen de cellulaire opname vergemakkelijkt, maar het ook mogelijk maakt dat biomoleculaire lading sites van biologisch belang bereikt. Niercellen van babyhamsters ondergingen bijvoorbeeld DNA-recombinatie wanneer ze werden blootgesteld aan B1-gelabeld Cre-recombinase bij eiwitconcentraties zo laag als 2, 5 M, wat wijst op een krachtige nucleaire afgifte van functionele eiwitladingen. Bovendien levert B1 niet-covalent geconjugeerd RNA en DNA over het celmembraan naar cytosolische en nucleaire locaties die toegankelijk zijn voor de cellulaire translatie- en transcriptiemachines, zoals gemeten door detectie van gecodeerde reporterfuncties, met een efficiëntie die vergelijkbaar is met in de handel verkrijgbare kationische lipidereagentia. B1 lijkt gebruik te maken van glycanen op het celoppervlak en meerdere concurrerende endocytische routes om cellen binnen te komen en er doorheen te stromen. Deze studies bieden zowel een nieuw hulpmiddel voor intracellulaire levering van biomoleculen als inzichten die kunnen helpen bij het ontwerpen van effectievere celpenetrerende eiwitten.


De klassieke benadering begint met willekeurige mutagenese

Vóór de komst van de technologie voor het klonen van genen werden de meeste genen geïdentificeerd door de processen die werden verstoord toen het gen werd gemuteerd. Deze klassieke genetische benadering, die de genen identificeert die verantwoordelijk zijn voor mutante fenotypes, wordt het gemakkelijkst uitgevoerd in organismen die zich snel voortplanten en vatbaar zijn voor genetische manipulatie, zoals bacteriën, gisten, nematoden en fruitvliegen. Hoewel spontane mutanten soms kunnen worden gevonden door extreem grote populaties te onderzoeken, duizenden of tienduizenden individuele organismen, kan het proces van het isoleren van mutanten veel efficiënter worden gemaakt door mutaties te genereren met agentia die DNA beschadigen. Door organismen met mutagenen te behandelen, kunnen snel zeer grote aantallen mutanten worden gemaakt en vervolgens worden gescreend op een bepaald defect van belang, zoals we binnenkort zullen zien.

Een alternatieve benadering van chemische of stralingsmutagenese wordt genoemd insertie mutagenese. Deze methode is gebaseerd op het feit dat exogeen DNA dat willekeurig in het genoom wordt ingebracht, mutaties kan produceren als het ingevoegde fragment een gen of zijn regulerende sequenties onderbreekt. Het ingevoegde DNA, waarvan de sequentie bekend is, dient dan als een moleculaire tag die helpt bij de daaropvolgende identificatie en klonering van het verstoorde gen (Figuur 8-55). In Drosophila, heeft het gebruik van het transponeerbare P-element om genen te inactiveren een revolutie teweeggebracht in de studie van de genfunctie in de fruitvlieg. Transponeerbare elementen (zie Tabel 5-3, p. 287) zijn ook gebruikt om mutanten te genereren in bacteriën, gisten en in de bloeiende plant Arabidopsis. Retrovirussen, die zichzelf kopiëren naar het gastheergenoom (zie figuur 5-73), zijn gebruikt om genen in zebravissen en muizen te verstoren.

Afbeelding 8-55

Insertionele mutant van de leeuwebek, Antirrhinum. Een mutatie in een enkel gen dat codeert voor een regulerend eiwit zorgt ervoor dat bladscheuten zich ontwikkelen in plaats van bloemen. Door de mutatie kunnen cellen een karakter aannemen dat geschikt zou zijn voor een ander (meer.)

Dergelijke studies zijn zeer geschikt om biologische processen in wormen en vliegen te ontleden, maar hoe kunnen we de genfunctie bij mensen bestuderen? In tegenstelling tot de organismen die we hebben besproken, planten mensen zich niet snel voort en worden ze niet opzettelijk behandeld met mutagenen. Bovendien zou elk mens met een ernstig defect in een essentieel proces, zoals DNA-replicatie, lang voor de geboorte overlijden.

Er zijn twee antwoorden op de vraag hoe we menselijke genen bestuderen. Ten eerste, omdat genen en genfuncties gedurende de evolutie zo sterk geconserveerd zijn, onthult de studie van minder complexe modelorganismen cruciale informatie over vergelijkbare genen en processen bij mensen. De overeenkomstige menselijke genen kunnen dan verder worden bestudeerd in gekweekte menselijke cellen. Ten tweede zijn veel mutaties die geen dodelijke weefselspecifieke defecten zijn in bijvoorbeeld lysosomen of in celoppervlakreceptoren, spontaan ontstaan ​​in de menselijke populatie. Analyses van de fenotypes van de getroffen individuen, samen met studies van hun gekweekte cellen, hebben veel unieke inzichten opgeleverd in belangrijke menselijke celfuncties. Hoewel dergelijke mutaties zeldzaam zijn, worden ze zeer efficiënt ontdekt vanwege een unieke menselijke eigenschap: de gemuteerde individuen vestigen de aandacht op zichzelf door speciale medische zorg te zoeken.


B1. Aminozuuranalyse en chemische sequentiebepaling - biologie

Semaforinen en hun receptoren, plexinen, komen wijdverbreid tot expressie in embryonale en volwassen weefsels. Over het algemeen zijn hun functies slecht gekarakteriseerd, maar in neuronen bieden ze essentiële aantrekkelijke en afstotende signalen die nodig zijn voor axongeleiding 1, 2, 3. De Rho-familie GTPases Rho, Rac en Cdc42 controleren signaaltransductieroutes die plasmamembraanreceptoren verbinden aan het actine-cytoskelet en reguleren zo veel door actine aangestuurde processen, waaronder celmigratie en axongeleiding 4, 5, 6, 7. Met behulp van gist-twee-hybride screening en in vitro interactie-assays laten we zien dat Rac in zijn actieve, GTP-gebonden toestand interageert direct met het cytoplasmatische domein van zoogdieren en Drosophila B plexinen. Plexine-B1-clustering in fibroblasten veroorzaakt geen vorming van lamellipodia, wat suggereert dat Rac niet wordt geactiveerd. In plaats daarvan resulteert het in de assemblage van actine: myosinefilamenten en celcontractie, wat wijst op Rho-activering. Verrassend genoeg zijn deze veranderingen in het cytoskelet zowel afhankelijk van Rac als Rho. Clustering van een mutant plexine, zonder het Rac-bindingsgebied, induceerde vergelijkbare veranderingen in het cytoskelet, en deze bevinding geeft aan dat de fysieke interactie van plexine-B1 met Rac niet vereist is voor Rho-activering. Onze bevindingen dat plexine-B-signalering naar het cytoskelet zowel Rac- als Rho-afhankelijk is, vormen een startpunt voor het ontrafelen van het mechanisme waarmee semaforines en plexines axongeleiding en celmigratie regelen.

Huidig ​​adres: Afdeling Celbiologie, Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam 1066 CX, Nederland.


Discussie

In deze studie hebben we het exacte auto-remmende gebied (β-streng B1 en α-helix H2) in het EcoRII N-uiteinde opgehelderd dat blijkbaar werkt als een moleculaire rem en enzymactiviteit reguleert door auto-inhibitie. Verlies van B1 en H2 door deletiemutagenese verlichtte autoinhibitie en leidde tot sterk geactiveerde EcoRII-enzymvarianten die zeer afgelegen afzonderlijke plaatsen in faag T3-DNA splitsten. Dit gedrag bleek in tegenstelling tot de volledige EcoRII, die ten minste twee kopieën van de herkenningssequentie voor DNA-splitsing vereist (Mucke et al., 2002a Tamulaitis et al., 2006 ). Onze studie bevestigt het voorgestelde model afgeleid van een ingekorte en daardoor geactiveerde vorm van EcoRII (Mucke et al., 2002a) en de kristalstructuur (Zhou et al., 2004 ). Bovendien zijn onze resultaten met behulp van EcoRII-C-repressie door het remmende domein EcoRII-N of kleine synthetische peptiden in trans en plaatsspecifieke mutagenese definieert het minimale regulerende gebied dat essentieel is voor auto-inhibitie.

Auto-inhibitie is een wijdverbreid fenomeen in biologische regulatie en werd geverifieerd voor diverse eiwitten, b.v. transcriptiefactoren, proteïnekinasen, reparatiehelicasen, proto-oncogenen en menselijke dicer (Pufall en Graves, 2002 Smith et al., 2007 Li et al., 2008 mei et al., 2008 Richards et al., 2008 ). EcoRII was het eerste restrictie-endonuclease waarvoor autoinhibitie werd voorgesteld (Zhou et al., 2004 ). Ondertussen werd een soortgelijk mechanisme geclaimd voor het tetramere restrictie-endonuclease Bse634I ( Zaremba et al., 2005) en voor het metaalonafhankelijke restrictie-enzym BfiI. In het geval van Bse634I werd auto-inhibitie opgeheven door scheiding van het tetramere enzym in dimeren door plaatsspecifieke mutatie ( Zaremba et al., 2005 ). Hoewel BfiI een C-terminaal DNA-bindend domein bevat dat erg lijkt op EcoRII-N, suggereert de kristalstructuur dat de interdomein-linker kan werken als een auto-remmend element dat de katalytische activiteit van BfiI regelt in afwezigheid van specifiek DNA (Grazulis et al., 2005 ).

De meeste mechanistische modellen van auto-inhibitie voorspellen het bestaan ​​van intramoleculaire interacties tussen de remmende elementen en het functionele domein. Dit intramoleculaire interactiemodel kan in het algemeen experimenteel worden getest met behulp van de gescheiden domeinen of mutaties die deze interacties verstoren (Pufall en Graves, 2002). Het feit dat het N-domein heeft toegevoegd in trans veroorzaakt een afname van de EcoRII-C-activiteit en heeft geen invloed op de isochizomeer MvaI, suggereert een specifieke eiwit-eiwitinteractie tussen het N- en C-domein, wat leidt tot inactivering van EcoRII-C. Om EcoRII-C volledig te onderdrukken, is een molaire overmaat van het remmende domein EcoRII-N nodig die waarschijnlijk het binden van beide domeinen in EcoRIIwt nabootst. De marginale afname van splitsingsactiviteit in het MvaI-experiment met de hoogste EcoRII-N-concentratie kan te wijten zijn aan binding van EcoRII-N aan de herkenningsplaats en dus concurreren met MvaI, of aan niet-specifieke eiwit-eiwit-interacties. In tegenstelling tot MvaI ondersteunt de afname van splitsing door EcoRII-C door stoichiometrische hoeveelheden EcoRII-N een specifieke eiwit-eiwitrelatie tussen beide domeinen.

De enkele aminozuursubstituties E145A, S173A en E351A laten duidelijk zien dat een verstoring van enkele interdomein waterstofbruggen het effect van repressie vermindert. De gedeeltelijke de-repressie is blijkbaar te wijten aan een onvolledige verstoring van de eiwit-eiwit interactie tussen het N- en C-terminale domein van EcoRII. Voor het gemuteerde enzym E351A kan het waargenomen functionele effect niet worden verklaard door een verlies van waterstofbruggen tussen de hoofdketens van Glu351 en Ala27, aangezien ze behouden blijven, zelfs wanneer glutaminezuur wordt gemuteerd tot alanine. De gedeeltelijke verlichting van auto-inhibitie kan echter worden veroorzaakt door verlies van het uitgebreide netwerk van waterstofbruggen tussen de zijketen van Glu351, Arg24 en Gly158, gemedieerd door watermoleculen (McDonald en Thornton, 1994 Wallace et al., 1995 ). De creatie van EcoRII dubbele mutanten E145A/S173A, E145A/E351A, E145A/S354A, S173A/E351A en S173A/S354A vertoonde geen additieve effecten. Deze bevinding werd ook gemeld door Reichmann et al. (2005) die eiwit-eiwit-interacties tussen TEM1-β-lactamase en β-lactamase-remmereiwit onderzochten door clusteranalyses. Ze meldden dat enkele mutaties binnen hetzelfde interactiecluster niet noodzakelijkerwijs additief zijn.

De peptide-experimenten werden uitgevoerd om te onderzoeken of deze vrij kleine synthetische moleculen delen van het interdomeininterface van EcoRII kunnen nabootsen en daardoor EcoRII-C kunnen remmen. De gebruikte oplosbare 30-meer-peptiden vertegenwoordigden respectievelijk van EcoRII afgeleide aminozuurposities 4-33 (peptide 1) en 144-173 (peptide 2). Peptide 1 bevat Ser26 en Ala27, waarvan wordt voorspeld dat ze een interactie aangaan met Glu351. Peptide 2 bevat Glu145 en Ser173, waarvan wordt voorspeld dat ze een interactie aangaan met Arg330 en Arg262 (Fig. 2). We vonden dat peptide 1 de activiteit van EcoRII-C volledig remt en daarentegen geen effect had op het isoschizomeer Mval. Het experiment met het controlepeptide 3 ondersteunt onze resultaten dat de remming veroorzaakt door peptide 1 specifiek is en niet alleen een kunstmatig effect door peptiden in het algemeen. Hoewel beide van EcoRII afgeleide peptiden regio's van het N-domein vertegenwoordigen die een interactie aangaan met het katalytisch actieve domein (Zhou et al., 2004), vertoont alleen peptide 1 een remmend effect op EcoRII-C. Daarom concludeerden we dat peptide 1 een cruciale rol moet spelen in het auto-inhibitieproces.

Door opeenvolgende deletie van de drie secundaire structurele elementen waaruit peptide 1 bestaat (α-helix H1, β-streng B1 en α-helix H2), hebben we voor het eerst het exacte auto-remmende element van EcoRII opgehelderd. De korte β-streng B1 (aminozuren 18-24) en α-helix H2 (aminozuren 26-30) die slechts door een enkel aminozuur worden gescheiden, zijn essentiële regelelementen om de EcoRII-enzymactiviteit stevig onderdrukt te houden in de afwezigheid van specifiek DNA. Beide deletiemutante enzymen vertoonden een volledige afschaffing van auto-inhibitie en hun T3-DNA-splitsingspatroon was vergelijkbaar met dat van EcoRII-C. De EcoRII-kristalstructuur toonde aan dat aminozuurresiduen Ser26 en Ala27 in α-helix H2 waterstofbruggen vormen aan Glu351 in de C-terminus van EcoRII en kunnen bijdragen aan het blokkeren van de katalytische plaats door het N-terminale domein (Zhou et al., 2004 ). Echter, na vervanging van Glu351 door alanine, verkregen we een EcoRII-mutant enzym met slechts gedeeltelijk verlichte auto-inhibitie. Volgens de 3D-structuur van EcoRII worden verschillende contacten gevormd tussen B1 en H2 met Tyr41 waarvan we eerder hebben aangetoond dat het betrokken is bij sequentiespecifieke DNA-binding in de EcoRII-effectorspleet (Mucke et al., 2002b) Tyr21 en Lys23 in B1 en Asp29 in H2 interageren via waterstofbruggen met Tyr41. Blijkbaar wordt door het vormen van waterstofbruggen tussen H2 en B2 met Tyr41 een remmingsvouw gevormd. Als een EcoRII-DNA-herkenningssequentie wordt gebonden door het N-terminale domein, vormt Tyr41 stabiliserende interacties met het DNA. Vanwege het gebonden DNA verandert hoogstwaarschijnlijk de verdeling van ladingen binnen de inhibitievouw en resulteert in een conformationele verandering, die een verlies van waterstofbindingen tussen B1 en H2 met Tyr41 veroorzaakt. Deze conformationele verandering zou ook leiden tot een vernietiging van de interactie tussen Ala27 en Glu351. Daardoor kan het N-terminale domein weg bewegen en de katalytische actieve plaats onthullen.

In tegenstelling tot EcoRII-ΔB1 en EcoRII-ΔH2 leidde het gemuteerde enzym EcoRII-ΔH1 niet tot een volledige verlichting van autoinhibitie. Deze bevinding was niet verrassend omdat a-helix H1 niet sterk betrokken is bij interactie met het EcoRII C-terminale domein of met het vermeende DNA-bindingsplaatsresidu Tyr41 (Mucke et al., 2002b Zhou et al., 2004 ). Het in kaart brengen van de structurele elementen B1 en H2 als de onderdrukkende determinanten tussen remmende en katalytische domeinen levert een bewijs van autoinhibitie voor EcoRII en stelt ons in staat om te definiëren hoe het remmings- en activeringsproces van EcoRII-enzymactiviteit kan worden gereguleerd.

Vaak krijgt het auto-inhiberende domein een nieuwe functie in het geactiveerde molecuul (Pufall en Graves, 2002). In het geval van restrictie-endonuclease EcoRII is het het vermogen om een ​​tweede DNA-herkenningsplaats te binden. Dit mechanisme verhoogt enerzijds de precisie van de DNA-herkenning en waarborgt daardoor de juiste functie van het eiwit, maar beperkt anderzijds de kracht van EcoRII als restrictie-endonuclease. Een gunstig gevolg van het vereisen van twee niet-gemethyleerde herkenningsplaatsen voor DNA-splitsing is het voorkomen van onbedoelde splitsing van enkele niet-gemethyleerde plaatsen in het cellulaire genoom (wat kan optreden als gevolg van onvolledige DNA-methylatie of DNA-herstel) die tot celdood zou leiden (Bickle en Kruger, 1993). Interactie met twee DNA-plaatsen is ook bekend voor eiwitten die betrokken zijn bij DNA-recombinatie en transpositie. In feite toonden eerdere rapporten behoud van functionele motieven tussen EcoRII en de familie van integrasen (Topal en Conrad, 1993 Nunes-Duby et al., 1998 ). Daarom zou het verwerven van een extra DNA-bindend domein een evolutionaire stap kunnen zijn in de evolutie van het restrictie-endonuclease EcoRII naar een nieuwe functie. Naast de splitsing van de fosfodiësterbinding, zou EcoRII dan de verspreiding van zijn coderende sequentie in andere bacteriële populaties kunnen realiseren die verwant zijn aan een transponeerbaar element.

Interessant is dat de EcoRII-N-vouw ook werd gevonden in het B3-DNA-bindende domein van plantspecifieke transcriptiefactoren ( Yamasaki et al., 2004 2008 ). NMR-experimenten van de op koude reagerende transcriptiefactor RAV1 van Arabidopsis thaliana onthulde, naast de sequentieovereenkomst tussen zijn B3-domein en EcoRII N-domein, ook een sterk geconserveerde tertiaire structuur. Opmerkelijk is dat het B3-DNA-bindende domein van RAV1 de dubbelstrengs DNA-sequentie 5'-CA herkent CCTG die overlapt (vet en onderstreept) met de EcoRII-herkenningssequentie 5'- CCA/TG G. De locatie van de DNA-contactresten bleek inderdaad vergelijkbaar te zijn met die van EcoRII-N ( Yamasaki et al., 2004 ). Omdat de twee structuren structureel en functioneel verwant zijn, zou dit kunnen betekenen dat deze transcriptiefactorfamilie ook wordt gereguleerd door auto-inhibitie. Plantspecifieke transcriptiefactoren worden geclassificeerd volgens DNA-bindende domeinen waarvan werd aangenomen dat ze verschillen van die van prokaryoten of andere lijnen van eukaryoten. In de genomen van verschillende bacteriën die symbiotisch of pathogeen zijn voor hogere planten, werden intussen eiwitten geïdentificeerd die regio's bevatten die vergelijkbaar zijn met EcoRII-N. Horizontale genoverdracht van deze bacteriën naar een voorouderlijke zaadplant, of vice versa, zou een vermoedelijke genoverdrachtsroute kunnen zijn ( Yamasaki et al., 2008 ).


Discussie

Immunofluorescentie gelokaliseerde h-tekB1 tot 2 primaire regio's. Het belangrijkste stuk menselijk sperma was over de gehele lengte positief, hoewel kleuring vrijwel afwezig was op het eindstuk en het middenstuk. De dwarsdoorsnede van het flagellum van het menselijk sperma varieert proximaal tot distaal. Het middenstuk bevat een mitochondriale omhulling die het axoneme omringt met zijn 9+2-rangschikking van microtubuli. De mitochondriën wijken in het hoofddeel uit tot een vezelachtige omhulling rond de standaard axonemale structuur. Het eindstuk bevat alleen axonemale microtubuli omgeven door het plasmalemma. Met betrekking tot de 9 + 2 microtubuli-rangschikking zijn de middelste 2 microtubuli afwezig in het eindstuk en zijn de 9 buitenste microtubuli aanwezig als enkele ongepaarde microtubuli. Dit is precies het gebied van het flagellum van menselijk sperma waar geen positieve reactiviteit is op het h-tekB1-antiserum. Nojima et al. [ 19] veronderstelde uit immuno-elektronmicroscopische studies van gefractioneerde zee-egelsperma flagella dat tektin aanwezig kan zijn als het enige bestanddeel van een protofilament in de A-vezel op het grensvlak tussen de A- en B-componenten van het doublet. Hun hypothese wordt ondersteund door onze waarneming van de afwezigheid van tektin-reactiviteit in het eindstuk van menselijk sperma, wat de suggestie ondersteunt dat tektin noodzakelijk is voor de aanmaak van het A-B-doublet [33]. Onze gegevens tonen ook een afwezigheid van h-tekB1-kleuring in het middenstuk aan, waarvan de axonemale microtubule-structuur vergelijkbaar is met die van het positief kleurende hoofdstuk. Het is niet duidelijk of tektin aanwezig is in de axoneme-microtubuli in deze sectie, omdat het mogelijk is dat kleuring werd voorkomen door de omringende sperma-mitochondriën.

Een puntvormig gebied aan de basis van de kop van het sperma was ook positief voor h-tekB1. Dit gebied van het menselijk sperma komt overeen met het basale lichaam en bevat een ring van 9 aangrenzende triplet-microtubuli. Het basale lichaam wordt als centriol-achtig beschouwd en dient als startpunt voor de groei van de buitenste doublet-microtubuli tijdens flagellaire morfogenese. Als zodanig grenst het aan de rest van het axoneem. Deze waarneming is in overeenstemming met eerdere immunofluorescentiestudies die reactiviteit van tektin-antilichamen met basale lichamen in zee-egelsperma [34], immunoblots van geïsoleerde Chlamydomonas basale lichamen [10], en preparaten van basale lichamen in zowel coquillekieuw- als konijnentracheale epitheelcellen [35].

We gebruikten een uitgebreide 2D-kaart van menselijke sperma-eiwitten [22] om een ​​flagellair eiwit van menselijk sperma te identificeren en te klonen. Het 2D-spermaproteoom werd geconstrueerd om de complexiteit van sperma-eiwitten te begrijpen en op te lossen en om kandidaten te selecteren voor opname in een immunocontraceptief vaccin. Hiertoe hebben we menselijk sperma gelabeld met 125 I of biotine voorafgaand aan solubilisatie en elektroforese van de sperma-extracten. Vergelijking van de reeks gelabelde eiwitten met de originele 2D-kaart werd geponeerd om selectie van die sperma-eiwitcomponenten die op het celoppervlak zijn gelokaliseerd mogelijk te maken. De tektin-eiwitvlek werd oorspronkelijk geboord uit een gebied van dicht opeengepakte eiwitvlekken die ten minste 6125I-gelabelde eiwitten vertoonden. Het gebrek aan oppervlaktelokalisatie van de h-tekB1 die we in onze immunolokalisatiestudies hebben waargenomen, suggereert dat de vlek met een kern mogelijk met 125I is gelabeld vanwege beschadiging van het spermamembraan of het verkeerd scoren van een niet-gelabelde plek in het cluster. Hoewel het in het huidige werk gekloonde en onderzochte h-tekB1 geen oppervlaktemolecuul is, dient het werk om de h-tekB1-isovormen in het menselijke spermaproteoom te definiëren. We gebruiken momenteel biotine-labeling en fase-partitionering om vectorieel gelabelde sperma-oppervlakte-eiwitten te verrijken [23, 36].

De 2D Western-blot-gegevens die in deze studie worden gepresenteerd, geven aan dat er 3 afzonderlijke isovormen van h-tekB1 in menselijk sperma zijn. Deze immunoreactieve vormen van het eiwit verschillen niet door moleculaire massa (ze migreren allemaal met 54 kDa) maar door lading, wat aangeeft dat er enige posttranslationele modificatie heeft plaatsgevonden. De waargenomen massa van de h-tekB1 is bijna identiek aan de massa die wordt voorspeld op basis van de cDNA-sequentie, consistent met een niet-geglycosyleerd cytoskeleteiwit. Er mag worden aangenomen dat de 3 isovormen allemaal menselijk tektin B zijn, omdat tektinen A, B en C in andere soorten consequent verschillende molecuulmassa's hebben. Deze resultaten ondersteunen eerdere waarnemingen van microheterogeniteit in de patronen van tektins [37]. Verschuivingen van lading, zoals waargenomen in dit onderzoek, zijn meestal te wijten aan veranderingen in de niveaus van fosforylering. Hoewel de peptidefragmenten met microsequentie die werden gebruikt voor het ontwerp van oligonucleotide-primers geen fosforylering vertoonden op een van de serine- of threonine-residuen, kan de plek die we voor het eerste onderzoek hebben uitgezocht een niet-gefosforyleerde vorm van tektin B1 zijn geweest. Fosforylering kan echter betrokken zijn bij deze heterogeniteit van eiwitlading omdat bekend is dat kinasen belangrijk zijn bij de posttranslationele modificatie van andere sperma-eiwitten [38-40].

Onderzoek van de eiwitsequentie van h-tekB1 geeft aan dat de hoogste graad van homologie met een soort waarin alle 3 tektines zijn gekloond, is met zee-egel tektin B1. A BLOCKS search revealed a match to all 4 of the Tektin signature domains (BLOCKS PR00511A-D), providing further proof of the identity of the translated human cDNA clone. The differences in amino acid sequence between human and sea urchin tektin B1 are distributed evenly throughout the protein however, both the N- and C-termini of the human protein revealed no homology with any of the sea urchin tektins. De S. purpuratus tektin A1 contained an extra 54 amino acids at the N-terminus and was shorter by 22 amino acids at the C-terminus, whereas sea urchin tektin C1 demonstrated only 15% homology over the first 40 amino acids with human tektin B1. In addition to sequence homology, a structural similarity to other tektins consisting of 5 helical segments [ 14] was found by analysis with secondary structure prediction programs. This secondary structure has been hypothesized to reflect the evolutionary relatedness of tektins to the intermediate filament family of proteins [ 12, 14]. A match to a chaperonin signature was discovered during database searching [ 32]. Over amino acids 253–304 in h-tekB1, there is 47% homology (20% identity) with the bacterial Clp chaperonin (BLOCKS IBP001270) subfamily, which is known to present and activate proteins for repair during stress conditions. Interesting functional correlations arise because mammalian chaperones are associated with the centrosome [ 41].

Although h-tekB1 was cloned and sequenced from testis mRNA, Northern blots revealed the presence of the transcript in pools of mRNA from trachea, lung, ovary, pituitary, brain, and kidney. Trachea, lung, and brain tissues are known from histological examination to contain many cilia. Expression of tektin B1 in tracheal tissue, lung, and neural tissue was noted previously in the mouse [ 21]. Because of the wide transcriptional distribution of this gene product and the lack of surface localization, h-tekB1 would not appear to be useful as a contraceptive immunogen. The broad tissue distribution also diminishes the likelihood that an antagonist might be found that selectively affected sperm motility by targeting tektin B1.

The single closest match in the databases was a murine tektin B1 [ 15] (accession AB027138) that showed 83% identity with the translated human clone. This murine tektin-t (testis) has been termed haploid germ cell specific based on Northern blot analysis, which demonstrated only testis transcription, and the cloning of the transcript from a subtracted murine testis cDNA library [ 15]. Our results for h-tekB1 differ with respect to tissue specificity because our cDNA, also cloned from a testicular source, is found in multiple tissues, and therefore the designation of h-tekB1 as testicular or germ cell specific is inappropriate. Differences in expression of tektin B1 in murine and human tissues may account for the discrepancies in our results and in those of Iguchi et al. [ 15]. In addition, on Western blots we observed a molecular mass of 54 kDa for h-tekB1 whereas Iguchi et al. [ 15] noted a mass of 85 kDa for murine tektin-t.


B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

Several studies have demonstrated protein-protein interactions between microsomal triglyceride transfer protein (MTP) and apolipoprotein B (apoB). However, the binding sites involved in these interactions have not been elucidated. To identify an MTP binding site in apoB, we have expressed several apoB sequences as fusion proteins with the eight-amino acid FLAG peptide. The chimeras were transiently expressed in COS cells, and conditioned media were used to study the binding of these sequences to either immobilized or soluble MTP. A polypeptide containing amino acids 270–570 (B:270–570), but not 1–300, bound to MTP. AGI-S17, an antagonist of apoB-MTP binding, inhibited the binding of B:270–570 to MTP but not to M2, a monoclonal antibody that recognizes the FLAG peptide. These data indicated that B:270–570 contains an MTP binding site. Next, sequences within 270–570 were subjected to C-terminal truncations at natural proline residues. B:270–509 bound less efficiently than B:270–570, whereas, B:270–430 and other shorter chimeras did not bind to MTP. Furthermore, truncations at amino acids 502 and 509 decreased MTP binding by 73 and 42%, respectively. These data indicate that B:430–570 in the α1-globular domain of apoB plays a crucial role in MTP binding and presumably in the initiation and maturation of apoB-containing lipoproteins.

This work was supported in part by the National Institutes of Health Grants DK-46900, HL-22633 (to M. M. H.), and HL-49373 (to G. S. S.) and the American Heart Association, National Center (to M. M. H.).The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

Visiting scientist from Université Chouaib Doukkali, Faculté des Sciences, Laboratoire de Biochimie Appliquée, El Jadida, Morocco.


B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

You have requested a machine translation of selected content from our databases. This functionality is provided solely for your convenience and is in no way intended to replace human translation. Neither BioOne nor the owners and publishers of the content make, and they explicitly disclaim, any express or implied representations or warranties of any kind, including, without limitation, representations and warranties as to the functionality of the translation feature or the accuracy or completeness of the translations.

Translations are not retained in our system. Your use of this feature and the translations is subject to all use restrictions contained in the Terms and Conditions of Use of the BioOne website.

Tektin B1 Demonstrates Flagellar Localization in Human Sperm

Michael J. Wolkowicz, 1 Soren Naaby-Hansen, 2 Angela R. Gamble, 3 P. Prabhakara Reddi, 1 Charles J. Flickinger, 1 John C. Herr 1,*

1 aDepartment of Cell Biology and the Center for Recombinant Gamete Contraceptive Vaccinogens, Univers
2 bLudwig Institute for Cancer Research, London W1W 7BS, United Kingdom
3 cBioQual, Inc., Rockville, Maryland 20850

* Correspondence: John C. Herr, Department of Cell Biology, Box 439 Jordan Hall, University of Virginia, Charlottesville, VA 22908. FAX: 804 982 3912 [email protected]

Includes PDF & HTML, when available

This article is only available to subscribers.
It is not available for individual sale.

The human flagellar protein tektin B1 (h-tekB1) in human sperm was cloned, and its sequence and subcellular location were determined. Human sperm proteins were separated by 2-dimensional electrophoresis, and a resolved protein spot of 54 kDa with an isoelectric point (pI) of 5.3 was removed from the gel, trypsinized, and microsequenced by tandem mass spectrometry. The resulting peptides did not match any protein in the (then current) protein databases. Degenerate oligonucleotides based on the microsequences were used with a polymerase chain reaction to amplify a partial cDNA clone from human testis poly(A) mRNA, and subsequently a full-length 1.5-kilobase (kb) clone (GenBank AF054910) was obtained from a testis cDNA library. The open reading frame encoded a 430-amino acid protein with 47% homology to the sea urchin tektin B1. Hybridization of labeled h-tekB1 cDNA to a multiple-tissue Northern blot demonstrated a transcript of 1.7 kb in human testis, and a multiple tissue dot-blot demonstrated high levels of expression in testis, trachea, and lung, intermediate levels in fetal brain and appendix, and low levels in ovary, pituitary, and fetal kidney. Rat polyclonal serum generated against a recombinant h-tekB1 demonstrated 3 h-tekB1 isoforms of pI 5.25, 5.5, and 5.35 at 53.5 kDa on a 2-dimensional Western blot of human sperm proteins. Immunofluorescent studies localized h-tekB1 to the principal piece of human sperm, but the endpiece was unstained.

This article is only available to subscribers.
It is not available for individual sale.


B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

cDNA clones encoding GalNAc alpha 2,6-sialyltransferase (EC 2.4.99.3) have been isolated from chick embryo cDNA libraries using sequence information obtained from the conserved amino acid sequence of the previously cloned enzymes. The cDNA sequence included an open reading frame coding for 566 amino acids, and the deduced amino acid sequence showed 12% identity with that of Gal beta 1,4GlcNAc alpha 2,6-sialyltransferase from chick embryo. The primary structure of this enzyme suggested a putative domain structure, like that in other glycosyltransferases, consisting of a short NH2-terminal cytoplasmic domain, a signal-membrane anchor domain, a proteolytically sensitive stem region, and a large COOH-terminal active domain. The identity of this enzyme was confirmed by the construction of a recombinant sialyltransferase in which the NH2-terminal part (232 amino acid residues) was replaced with the immunoglobulin signal sequence. The expression of this recombinant in COS-7 cells resulted in secretion of a catalytically active and soluble form of the enzyme into the medium. The expressed enzyme exhibited activity toward only asialomucin and (asialo)fetuin, no significant activity being detected toward the other glycoprotein and glycolipid substrates tested. 14C-Sialylated glycols obtained from asialomucin re-sialylated with this enzyme were identical to NeuAc alpha 2,6-GalNAc-ol and GlcNAc beta 1,3(NeuAc alpha 2,6) GalNAc-ol. Synthetic GalNAc-SerNAc also served as an acceptor for alpha 2,6-sialylation. These results clearly showed that the expressed enzyme is GalNAc alpha 2,6-sialyltransferase.


Bekijk de video: 454 Sequencing (Januari- 2022).