Informatie

28.6: Hulpmiddelen en technieken - Biologie


Technieken voor het bestuderen van bevolkingsrelaties

Er zijn verschillende methoden om populatierelaties met genetische gegevens te bestuderen. Zelfs als de resultaten van het onderzoek correct zijn, zijn ze ook onzeker.

De tweede methode om relaties tussen subpopulaties te analyseren is genetische clustering. Clusters kunnen worden gevormd met behulp van zelfgedefinieerde voorouders [1] of de STRUCTURE-database. [3] Deze methode wordt te veel gebruikt en kan de gegevens overmatig aanpassen; de samenstelling van de database kan de clusteringresultaten vertekenen.

Technologische vooruitgang en toegenomen gegevensverzameling hebben echter geleid tot datasets die 10.000 keer groter zijn dan voorheen, wat betekent dat de meeste specifieke claims kunnen worden weerlegd door een subset van gegevens. Dus in feite zullen veel modellen die worden voorspeld door fylogenie en migratie of genetische clustering op een bepaald moment worden weerlegd, wat leidt tot grootschalige verwarring van resultaten. Een oplossing voor dit probleem is het gebruik van een eenvoudig model dat een verklaring aflegt die zowel nuttig is als minder waarschijnlijk wordt vervalst.

DNA extraheren uit neanderthalerbotten

Laten we eens kijken hoe je te werk gaat om DNA van oude overblijfselen te vinden en te sequencen. Eerst moet je een botmonster met DNA van een Neanderthaler halen. Menselijk DNA en Neanderthaler-DNA lijken erg op elkaar (we lijken meer op hen dan op chimpansees), dus bij het sequencen van korte uitlezingen met heel oud DNA, is het onmogelijk om te zeggen of het DNA Neanderthaler of menselijk is. De grot waar de botten werden gevonden, wordt eerst geclassificeerd als menselijk of niet-menselijk met behulp van afval of gereedschap als identificatiemiddel, wat de oorsprong van de botten helpt voorspellen. Zelfs als je een bot hebt, is het nog steeds zeer onwaarschijnlijk dat je enig te redden DNA hebt. In feite is 99% van de reeks Neanderthalers afkomstig van slechts drie lange botten die op één plek zijn gevonden: de Vindija-grot in Kroatië (5,3 Gb, 1,3x volledige dekking).

Vervolgens wordt het DNA naar een oud-DNA-lab gestuurd. Omdat het 40.000 jaar oude botten zijn, zit er nog maar heel weinig DNA in. Ze worden dus eerst gescreend op DNA. Als ze DNA vinden, is de volgende vraag of het DNA van primaten is? Meestal is het DNA van microben en schimmels die in de bodem leven en dode organismen verteren. Slechts ongeveer 1-10% van het DNA op oude botten is het DNA van primaten. Als het DNA van primaten is, is het dan besmetting door de mens (archeoloog of laboratoriumtechnicus) die ermee omgaat? Slechts één op de 600 bp verschilt tussen het DNA van de mens en het Neanderthaler-DNA. De grootte van de aflezingen van een 40.000 jaar oud botmonster is 30-40 bp. De lezingen zijn bijna altijd identiek voor een mens en een Neanderthaler, dus het is moeilijk om ze te onderscheiden.

In één geval werden 89 DNA-extracten gescreend op Neanderthalers-DNA, maar slechts 6 botten werden daadwerkelijk gesequenced (vereist gebrek aan besmetting en een voldoende hoge hoeveelheid DNA). Het proces van het ophalen van het DNA vereist boren onder het botoppervlak (om contaminatie tot een minimum te beperken) en het nemen van monsters van binnenuit. Voor de drie lange botten kon minder dan 1 gram botpoeder worden verkregen. Vervolgens wordt het DNA gesequenced en uitgelijnd met een referentie-chimp-genoom. Het is toegewezen aan een chimpansee in plaats van aan een bepaald mens, omdat het toewijzen aan een mens vooringenomenheid kan veroorzaken als u wilt zien hoe de reeks zich verhoudt tot specifieke menselijke subpopulaties.

De meest succesvolle vondsten zijn in koele kalksteengrotten, waar het droog en koud is en misschien een beetje basic. De beste kans op bewaring vindt plaats in permafrostgebieden. Uit de tropen is heel weinig DNA terug te winnen. De tropen hebben een geweldig fossielenbestand, maar DNA is veel moeilijker te verkrijgen. Omdat de meeste botten niet genoeg of goed DNA opleveren, laten wetenschappers de monsters keer op keer screenen totdat ze uiteindelijk een goede vinden.

Oud DNA weer in elkaar zetten

DNA geëxtraheerd uit Neanderthaler botten heeft korte meetwaarden, gemiddeld ongeveer 37 bp. Er zijn veel gaten als gevolg van mutaties die zijn veroorzaakt door tijdserosie van het DNA. Het is moeilijk te zeggen of een reeks het gevolg is van besmetting, omdat mensen en Neanderthalers slechts in één op de duizend basen verschillen. We kunnen echter DNA-schade die kenmerkend is voor oud DNA gebruiken om oud en nieuw DNA te onderscheiden. Oud DNA heeft de neiging tot C tot T en G tot A fouten. De C tot T-fout is verreweg de meest voorkomende en wordt ongeveer 2% van de tijd gezien. Na verloop van tijd wordt een methylgroep van een C geslagen, waardoor deze op U lijkt. Wanneer PCR wordt gebruikt om het DNA te amplificeren voor sequencing, ziet de polymerase een U en herstelt deze tot een T. Om deze fout te bestrijden , gebruiken wetenschappers een speciaal enzym dat de U herkent en de streng doorknipt in plaats van deze te vervangen door een T. Dit helpt om die locaties te identificeren. De G naar A-mutaties zijn het resultaat van het zien dat op de tegenovergestelde streng.

De gemiddelde fragmentgrootte is vrij klein en het foutenpercentage is nog steeds 0,1% - 0,3%. Een manier om de mutaties te bestrijden is door op te merken dat op een dubbelstrengs fragment het DNA naar de uiteinden wordt gerafeld, waar het ongeveer 10 bp enkelstrengs wordt. Er zijn vaak hoge mutaties in de eerste en laatste 10 basen, maar elders hoogwaardig DNA, d.w.z. meer C- naar T-mutaties in het begin en G naar A aan het einde. Bij chimpansees zijn de meest voorkomende mutaties overgangen (purine naar purine, pyrimidine naar pyrimidine), en transversies zijn veel zeldzamer. Hetzelfde geldt voor mensen. Aangezien de G naar A en C naar T mutaties overgangen zijn, kan worden vastgesteld dat er ongeveer 4x meer mutaties in het oude Neanderthaler DNA zijn dan wanneer het vers zou zijn door het aantal waargenomen overgangen te noteren in vergelijking met het aantal waargenomen transversies (door Neanderthaler vergelijken met menselijk DNA). Transversies hebben een redelijk stabiele frequentie van voorkomen, dus die verhouding helpt bepalen hoeveel fout er is opgetreden door C- naar T-mutaties.

We zijn nu in staat om menselijke besmetting van artefact-DNA terug te brengen tot ongeveer ( ext{i} 1 \%). Wanneer het DNA wordt binnengebracht, wordt het, zodra het uit het bot wordt verwijderd, voorzien van een streepjescode met een tag van 7 bp. Met die tag kunt u besmetting op een later moment in het experiment voorkomen, maar niet eerder. Extractie gebeurt ook in een cleanroom met UV-licht, na het bot te hebben gewassen. Mitochondriaal DNA is nuttig om te onderscheiden welk percentage van het monster is verontreinigd met menselijk DNA. Mitochondriaal DNA is gevuld met karakteristieke gebeurtenislocaties omdat mensen en Neanderthalers wederzijds monofylogenetisch zijn. De verontreiniging kan worden gemeten door de verhouding van die locaties te tellen. In het Neanderthaler-DNA was besmetting aanwezig, maar het was ( ext { ¡ } 0,5 \%).

Bij sequencing is het foutenpercentage bijna altijd hoger dan het polymorfisme. Daarom worden de meeste plaatsen in de sequentie die verschillen van mensen veroorzaakt door sequentiefouten. We kunnen dus niet precies leren over de biologie van Neanderthalers door de gegenereerde sequentie, maar we kunnen bepaalde SNP's analyseren zolang we weten waar we moeten kijken. De kans dat een bepaalde SNP wordt gewijzigd vanwege een fout in de volgorde, is slechts (frac{1}{300}) tot 11000, dus er kunnen nog steeds bruikbare gegevens worden verkregen.

Nadat we de chimpansee, Neanderthaler en moderne menselijke sequenties op één lijn hebben gebracht, kunnen we de afstand meten van Neanderthalers tot mensen en chimpansees. Deze afstand is slechts ongeveer 12,7% van de menselijke referentiesequentie. Een Frans monster meet ongeveer 8% afstand van de referentiereeks en een Bosjesman ongeveer 10,3%. Wat dit zegt, is dat het Neanderthaler-DNA als soort binnen ons variatiebereik valt.


4squareviews

Dit proces is waar de activiteiten in de activiteitenlijst, de output van het vorige proces 6.2 Activiteiten definiëren, worden geanalyseerd om te zien welke van hen logischerwijs vóór de andere zouden moeten komen. Er zijn drie basistechnieken, de methode voor prioriteitsdiagrammen (PDM), afhankelijkheidsbepaling en integratie, en het toevoegen van leads en vertragingen tussen activiteiten indien nodig. Het basisinstrument van dit proces is het Project Management Informatie Systeem of PMIS (zoals Microsoft Project).

6.3.2 Volgorde activiteiten: hulpmiddelen en technieken

6.3.2.1 Precedence Diagramming Method (PDM)

De methode voor het maken van voorrangsdiagrammen vertegenwoordigt activiteiten door vakken die knooppunten worden genoemd. Als een bepaalde activiteit logischerwijs voorafgaat aan een andere activiteit waarvan ze afhankelijk is, dan heet dat een voorafgaande activiteit. En omgekeerd, als een bepaalde activiteit logischerwijs na een andere activiteit in een planning komt, dan heet dat een vervolgactiviteit. Het is de volgende techniek, Afhankelijkheidsbepaling en Integratie, die kan helpen bepalen welke activiteiten op deze manier logisch met elkaar verbonden zijn.

Dit is het “precedentie” deel van de methode. Het diagramgedeelte komt vervolgens, waar de activiteiten worden weergegeven door rechthoekige vakken die knooppunten worden genoemd. Deze knooppunten worden vervolgens gekoppeld, afhankelijk van het type afhankelijkheid of de logische relatie ertussen.

Er zijn vier soorten logische relaties tussen een voorganger en een opvolgeractiviteit. Twee zijn serierelaties, waarbij de activiteiten na elkaar worden uitgevoerd. Twee zijn parallelle relaties, waarbij de activiteiten gedeeltelijk overlappen in de tijd.

Bij de volgende vier aanduidingen die bestaan ​​uit de twee letters “F” (voor “finish”) en “S” (voor “start”), verwijst de eerste letter naar de voorgaande activiteit en de tweede letter letter verwijst naar de vervolgactiviteit.

  • Finish-to-start (FS)'dit is het meest voorkomende type logische relatie, waarbij een vervolgactiviteit pas kan beginnen als de voorgaande activiteit is voltooid.
  • Finish-to-finish (FF) Dit is het volgende meest voorkomende type logische relatie, waarbij een opvolgende activiteit pas kan worden voltooid als de voorgaande activiteit is voltooid. De activiteiten kunnen echter in de tijd overlappen. Het voorbeeld dat in de PMBOK®-gids wordt gebruikt, is waar u een document moet schrijven (de voorgaande activiteit) voordat u het kunt bewerken (de vervolgactiviteit). Zodra u echter een paar pagina's van het document hebt geschreven, kunt u beginnen met het bewerken van die pagina's voordat u doorgaat met het schrijven van de rest van het document, zodat het schrijven en bewerken van een document elkaar in de tijd kunnen overlappen.
  • Start-to-start (SS) Dit is het volgende meest voorkomende type logische relatie, waarbij een vervolgactiviteit pas kan beginnen als de voorgaande activiteit is gestart. In het voorbeeld dat wordt gebruikt in de PMBOK® Guide, kan de activiteit van het egaliseren van het beton (de vervolgactiviteit) pas beginnen als de funderingsstorting (opvolgeractiviteit) begint. Hoewel u kunt beginnen met het egaliseren van het beton dat al in een gedeelte van de fundering is gestort terwijl een ander gedeelte van de fundering wordt gestort, kunt u het beton niet egaliseren voordat het is gestort.
  • Start-to-finish (SF) Dit is het minst voorkomende type logische relatie, waarbij een opvolgende activiteit pas kan beginnen als de voorgaande activiteit is gestart. Dit wordt zeer zelden gebruikt, hoewel het voorbeeld in de PMBOK® Guide is dat een nieuw crediteurensysteem (opvolgeractiviteit) succesvol moet worden opgestart voordat het oude crediteurensysteem wordt afgesloten (voorgangeractiviteit).

6.3.2.2 Afhankelijkheidsbepaling en integratie

De afhankelijkheden tussen activiteiten kunnen worden gekenmerkt door bepaalde attributen, waarvan sommige elkaar uitsluiten. Afhankelijkheden kunnen a) verplicht of discretionair zijn, en b) extern of intern.

  • Verplichte afhankelijkheden: afhankelijkheden die wettelijk of contractueel vereist zijn of inherent zijn aan de aard van het werk.
  • Discretionaire afhankelijkheden: afhankelijkheden die tot stand komen via algemene best practices binnen een bepaald toepassingsgebied.

Discretionaire afhankelijkheden zijn niet 'vastgelegd' zoals de verplichte afhankelijkheden zijn. Dit is belangrijk omdat ze indien nodig kunnen worden gewijzigd, terwijl verplichte afhankelijkheden niet zo kunnen worden gewijzigd.

Hier is de andere set van elkaar uitsluitende attributen.

  • Externe afhankelijkheden: afhankelijkheden die gewoonlijk buiten de controle van een projectteam vallen
  • Interne afhankelijkheden: afhankelijkheden die over het algemeen binnen de controle van een projectteam vallen

De interne afhankelijkheden die binnen de controle van een projectteam vallen, kunnen daarom indien nodig gemakkelijker worden gewijzigd in vergelijking met externe afhankelijkheden.

Een voorsprong is de hoeveelheid tijd die een opvolgende activiteit kan vorderen ten opzichte van een voorgaande activiteit. Een voorsprong van twee weken voor een vervolgactiviteit zou betekenen dat deze twee weken voorafgaand aan de voltooiing van de voorgaande activiteit zou kunnen worden gestart.

Een lag is de tijd dat een opvolgende activiteit kan worden uitgesteld ten opzichte van een voorgaande activiteit. Een vertraging van twee weken voor een vervolgactiviteit zou betekenen dat deze pas twee weken na voltooiing van de voorgaande activiteit zou kunnen worden gestart.

Als je een voorbeeldexamenvraag wilt zien met de methode voor prioriteitsdiagrammen, inclusief leads en vertragingen, kun je naar het volgende bericht gaan dat ik heb gedaan bij het beoordelen van de 5e editie van de PMBOK®-gids.

6.3.2.4 Projectmanagement Informatiesysteem (PMIS)

Dit is de planningssoftware die u gebruikt om de activiteiten te sequensen (zoals Microsoft Project of Primavera).


Les AM. Sequentieanalyse in de moleculaire biologie schatkamer of triviale achtervolging. Trends Biochem Sci. 198813(10):410. https://doi.org/10.1016/0968-0004(88)90198-3.

Park YM, et al. De EBI-zoekmachine: EBI-zoekopdracht als een service—biologische gegevens voor iedereen toegankelijk maken. Nucleïnezuren Res. 201745(W1). https://doi.org/10.1093/nar/gkx359.

Moller S, et al. Community-gedreven computationele biologie met Debian Linux. BMC Bioinformatica. 201011(S12). https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-s12-s5.

O'connor BD, et al. De Dockstore: modulaire, op de gemeenschap gerichte delen van op Docker gebaseerde genomics-tools en workflows mogelijk maken. F1000Onderzoek. 20176:52. https://doi.org/10.12688/f1000research.10137.1.

Redactioneel: de 16e jaarlijkse uitgave van de webserver voor nucleïnezuren 2018. Nucleic Acids Res. 201846(W1). https://doi.org/10.1093/nar/gky518.

Artimo P, et al. ExPASy: SIB bioinformatica resource portal. Nucleïnezuren Res. 201240(W1). https://doi.org/10.1093/nar/gks400.

Ison J, et al. Register voor hulpmiddelen en gegevensservices: een inspanning van de gemeenschap om bronnen voor bio-informatica te documenteren. Nucleïnezuren Res. 201544(D1). https://doi.org/10.1093/nar/gkv1116.

Ison, Jon, et al. "EDAM: een ontologie van bio-informatica-operaties, soorten gegevens en identifiers, onderwerpen en formaten." Bioinformatica, vol. 29, nee. 10, 2013, blz. 1325-1332., doi:https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt113.

Farnham A, et al. Vroege carrière onderzoekers willen Open Science. Genoom Biol. 201718(1). https://doi.org/10.1186/s13059-017-1351-7.

Ison J, et al. Communautaire beheer van bio-informatica-software en gegevensbronnen. Briefings Bioinformatica (aanvaard). https://doi.org/10.1093/bribio/bbz075.

Wise J, et al. Implementatie en relevantie van FAIR-gegevensprincipes in biofarmaceutische R&D. Drugsontdek vandaag. 2019. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2019.01.008.

Palmblad M, et al. Geautomatiseerde workflowsamenstelling in op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Bio-informatica. 201835(4):656-64. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty646.

Brancotte B, et al. Een herbruikbare, op bomen gebaseerde webvisualisatie om door EDAM-ontologie te bladeren en hieraan bij te dragen. J Open source-software. 20183(27):698. https://doi.org/10.21105/joss.00698.

Doppelt-Azeroual, Olivia, et al. "ReGaTE: registratie van galaxy-tools in elixer." GigaScience, vol. 6, nee. 6, 2017, doi:https://doi.org/10.1093/gigascience/gix022.

Leprevost, Felipe Da Veiga, et al. "BioContainers: een open-source en community-gedreven raamwerk voor softwarestandaardisatie." Bioinformatica, vol. 33, nee. 16, 2017, blz. 2580-2582., doi:https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx192.

Willighagen, Egon en Jonathan Melius. "Automatische OpenAPI naar bio.tools-conversie." 2017, voordruk op doi:https://doi.org/10.1101/170274.

Hillion K-H, et al. Bio.tools gebruiken om beschrijvingen van werkbanktools te genereren en te annoteren. F1000Onderzoek. 20176:2074. https://doi.org/10.12688/f1000research.12974.1.

Afgan E, et al. Het melkwegplatform voor toegankelijke, reproduceerbare en collaboratieve biomedische analyses: update 2018. Nucleïnezuren Res. 201846(W1). https://doi.org/10.1093/nar/gky379.

Linden M, et al. Gemeenschappelijke ELIXIR-service voor authenticatie en autorisatie van onderzoekers. F1000Res. 20187:1199. https://doi.org/10.12688/f1000research.15161.1.

Larcombe L, et al. ELIXIR-UK rol in bio-informatica training op nationaal niveau en over ELIXIR heen. F1000Onderzoek. 20176:952. https://doi.org/10.12688/f1000research.11837.1.

Mcquilton P, et al. BioSharing: samengestelde en crowd-sourced metadatastandaarden, databases en databeleid in de biowetenschappen. Gegevensbestand. 2016 2016. https://doi.org/10.1093/database/baw075.

Ison J, et al. Het bio.tools register van softwaretools en databronnen voor de life sciences. Github-repository. 2019. https://github.com/bio-tools/biotoolsRegistry. Toegankelijk in augustus 2019.


Nieuwe tools om biologie te manipuleren

Het anion-π-enzym bestaat uit een elektronenarme areen-cofactor (weergave van grijze staaf) ingebed in een eiwit (weergegeven als oppervlak)

De chemie heeft de afgelopen twintig jaar veel belangrijke hulpmiddelen en technieken geleverd aan de biologische gemeenschap. We kunnen nu eiwitten maken waar Moeder Natuur nooit aan had gedacht, unieke delen van levende cellen in beeld brengen en zelfs cellen in levende dieren zien. Deze week in ACS Central Science zetten drie onafhankelijke onderzoeksgroepen van de Universiteit van Genève (UNIGE) en één van de Universiteit van Basel (UNIBAS) deze prestaties een stap verder en rapporteren ze vooruitgang in zowel de manier waarop eiwitten worden gemaakt als hoe je hun expressiepatronen bij levende dieren.

Eiwitten zijn de werkpaarden van elke cel. Ze bestaan ​​uit bouwstenen, aminozuren genaamd, die aan elkaar zijn gekoppeld en samengevouwen tot functionele machines om elk belangrijk cellulair proces aan te drijven. Om deze taken uit te voeren, vertrouwt de natuur op twintig van deze blokken samen met een paar speciale "co-factoren", vaak vitamines. Chemici hebben echter slimme manieren ontdekt om het repertoire van een eiwit uit te breiden, door andere aminozuren of co-factoren te construeren dan je zou vinden in de natuurlijke biologie. Stefan Matile, Thomas Ward en collega's ontwierpen een nieuwe co-factor die een klassieke eiwitinteractie, de kation-Π genaamd, omkeert, wat de stabilisatie van een positieve lading op een elektronenrijk moleculair vlak betekent. De natuur gebruikt deze kation-Π-interacties om moleculen te maken die zo belangrijk zijn als steroïden, hormonen, vitamines, visuele pigmenten of geurstoffen, om signalen in de hersenen om te zetten, om antigenen te herkennen, enzovoort. Met behulp van hun nieuwe co-factor en het resulterende kunstmatige eiwit, werkten de groepen van Matile en Ward samen om het eerste "anion-Π" -enzym te creëren waarbij dat elektronenrijke moleculaire vlak wordt vervangen door een elektronenarm vlak om een ​​negatief in plaats van een positief te stabiliseren lading tijdens een moleculaire transformatie. In een reageerbuis waren eiwitten met deze nieuwe functionaliteit in staat om traditionele organische katalysatoren te overtreffen in een belangrijke maar ongunstige additiereactie met hoge specificiteit en selectiviteit. Ze geloven dat hun aanpak kan worden verplaatst naar het werken in cellen en kan helpen om andere momenteel onmogelijke chemische transformaties te realiseren.

Ondertussen erkenden Nicolas Winssinger en zijn lab de mogelijkheid om chemische reacties te gebruiken om mRNA in levende dieren te visualiseren. Alle eiwitten komen van mRNA, dus terwijl DNA de blauwdruk van het leven is, zorgen mRNA's voor de werkorders die verder worden gereguleerd door microRNA's. Als u deze kunt zien, kunt u veel vertellen over wat er in realtime met cellen en dieren gebeurt. Er zijn momenteel echter maar weinig hulpmiddelen waarmee u het RNA in levende dieren kunt zien, en de bestaande hulpmiddelen zijn meestal gebaseerd op gecompliceerde genetische strategieën. De teams van Winssinger en Gonzalez-Gaitan ontwierpen een reactie met sjablonen die fluorescerende markers oplevert voor specifieke RNA's die van belang zijn. Hun chemie is zo mild dat het werkt in levende zebravisembryo's zonder ze te storen, en omdat er geen genetisch gemodificeerde organismen voor nodig zijn, kan het snel worden aangepast voor andere systemen. Ten slotte stellen ze dat hun methode zou kunnen worden uitgebreid naar theragnostiek, waarbij je tegelijkertijd behandelingen kunt zien en richten op de moleculaire basis van de ziekte.


Bekijk de video: Basisstof 8 Erfelijkheidsonderzoek (Januari- 2022).