Informatie

6.2: De celcyclus - biologie


De celcyclus is een geordende reeks gebeurtenissen met betrekking tot celgroei en celdeling die twee nieuwe dochtercellen produceert. Cellen op weg naar celdeling doorlopen een reeks nauwkeurig getimede en zorgvuldig gereguleerde stadia van groei, DNA-replicatie en deling die twee genetisch identieke cellen produceren. De celcyclus kent twee hoofdfasen: de interfase en de mitotische fase (Figuur 6.2.1). Tijdens de interfase groeit de cel en wordt het DNA gerepliceerd. Tijdens de mitotische fase worden het gerepliceerde DNA en de cytoplasmatische inhoud gescheiden en deelt de cel zich. Bekijk deze video over de celcyclus: https://www.youtube.com/watch?v=Wy3N5NCZBHQ

Interfase

Tijdens de interfase ondergaat de cel normale processen terwijl hij zich ook voorbereidt op celdeling. Om een ​​cel van de interfase naar de mitotische fase te laten gaan, moet aan veel interne en externe voorwaarden worden voldaan. De drie stadia van interfase worden G . genoemd1, S en G2.

G1 Fase

De eerste fase van interfase heet de G1 fase, of eerste gap, omdat er weinig verandering zichtbaar is. Echter, tijdens de G1 stadium is de cel behoorlijk actief op biochemisch niveau. De cel verzamelt de bouwstenen van chromosomaal DNA en de bijbehorende eiwitten, evenals voldoende energiereserves om de taak van het repliceren van elk chromosoom in de kern te voltooien.

S-fase:

Gedurende de interfase blijft nucleair DNA in een semi-gecondenseerde chromatineconfiguratie. In de S-fase (synthesefase) resulteert DNA-replicatie in de vorming van twee identieke kopieën van elk chromosoom - zusterchromatiden - die stevig vastzitten in het centromeergebied. In dit stadium is elk chromosoom gemaakt van twee zusterchromatiden en is het een gedupliceerd chromosoom. Het centrosoom wordt gedupliceerd tijdens de S-fase. De twee centrosomen zullen aanleiding geven tot de mitotische spoel, het apparaat dat de beweging van chromosomen tijdens de mitose orkestreert. Het centrosoom bestaat uit een paar staafvormige centriolen die haaks op elkaar staan. Centriolen helpen bij het organiseren van celdeling. Centriolen zijn niet aanwezig in de centrosomen van veel eukaryote soorten, zoals planten en de meeste schimmels.

G2 Fase

in de G2 fase, of tweede kloof, vult de cel zijn energievoorraden aan en synthetiseert de eiwitten die nodig zijn voor chromosoommanipulatie. Sommige celorganellen worden gedupliceerd en het cytoskelet wordt ontmanteld om middelen te verschaffen voor de mitotische spoel. Er kan extra celgroei zijn tijdens G2. De laatste voorbereidingen voor de mitotische fase moeten worden voltooid voordat de cel in staat is om de eerste fase van de mitose in te gaan.

De mitotische fase

Om twee dochtercellen te maken, moet de inhoud van de kern en het cytoplasma worden verdeeld. De mitotische fase is een meerstapsproces waarbij de gedupliceerde chromosomen worden uitgelijnd, gescheiden en verplaatst naar tegenovergestelde polen van de cel, en vervolgens wordt de cel verdeeld in twee nieuwe identieke dochtercellen. Het eerste deel van de mitotische fase, mitose, bestaat uit vijf fasen, die nucleaire deling bewerkstelligen. Het tweede deel van de mitotische fase, cytokinese genaamd, is de fysieke scheiding van de cytoplasmatische componenten in twee dochtercellen.

Mitose

Mitose is verdeeld in een reeks fasen - profase, prometafase, metafase, anafase en telofase - die resulteren in de deling van de celkern (Figuur 6.2.2).

KUNSTVERBINDING

Welke van de volgende is de juiste volgorde van gebeurtenissen bij mitose?

  1. Zusterchromatiden staan ​​opgesteld op de metafaseplaat. De kinetochoor wordt gehecht aan de mitotische spoel. De kern wordt opnieuw gevormd en de cel deelt zich. De zusterchromatiden scheiden.
  2. De kinetochoor wordt gehecht aan de mitotische spoel. De zusterchromatiden scheiden. Zusterchromatiden staan ​​opgesteld op de metafaseplaat. De kern wordt opnieuw gevormd en de cel deelt zich.
  3. De kinetochoor wordt gehecht aan de metafaseplaat. De kinetochoor wordt afgebroken en de zusterchromatiden scheiden zich. De kern wordt opnieuw gevormd en de cel deelt zich.
  4. De kinetochoor wordt gehecht aan de mitotische spoel. De kinetochoor breekt uit elkaar en de zusterchromatiden scheiden. De kern wordt opnieuw gevormd en de cel deelt zich.

Tijdens de profase, de "eerste fase", moeten verschillende gebeurtenissen plaatsvinden om toegang te krijgen tot de chromosomen in de kern. De nucleaire envelop begint te breken in kleine blaasjes, en het Golgi-apparaat en het endoplasmatisch reticulum fragmenteren en verspreiden zich naar de periferie van de cel. De nucleolus verdwijnt. De centrosomen beginnen te bewegen naar tegenovergestelde polen van de cel. De microtubuli die de basis vormen van de mitotische spil strekken zich uit tussen de centrosomen en duwen ze verder uit elkaar naarmate de microtubulusvezels langer worden. De zusterchromatiden beginnen strakker op te rollen en worden zichtbaar onder een lichtmicroscoop.

Tijdens de prometafase gaan veel processen die in de profase zijn begonnen door en culmineren ze in de vorming van een verbinding tussen de chromosomen en het cytoskelet. De overblijfselen van de nucleaire envelop verdwijnen. De mitotische spil blijft zich ontwikkelen naarmate meer microtubuli zich verzamelen en zich uitstrekken over de lengte van het voormalige nucleaire gebied. Chromosomen worden meer gecondenseerd en visueel discreter. Elke zusterchromatide hecht zich aan spindelmicrotubuli in het centromeer via een eiwitcomplex dat de kinetochoor wordt genoemd.

Tijdens de metafase zijn alle chromosomen uitgelijnd in een vlak dat de metafaseplaat wordt genoemd, of het equatoriale vlak, halverwege tussen de twee polen van de cel. De zusterchromatiden zijn nog steeds stevig aan elkaar gehecht. Op dit moment zijn de chromosomen maximaal gecondenseerd.

Tijdens de anafase worden de zusterchromatiden op het equatoriale vlak uit elkaar gesplitst in het centromeer. Elke chromatide, nu een chromosoom genoemd, wordt snel naar het centrosoom getrokken waaraan zijn microtubulus was bevestigd. De cel wordt zichtbaar langwerpig als de niet-kinetochoor-microtubuli tegen elkaar schuiven op de metafaseplaat waar ze elkaar overlappen.

Tijdens de telofase worden alle gebeurtenissen die de gedupliceerde chromosomen voor mitose tijdens de eerste drie fasen hebben opgezet, omgekeerd. De chromosomen bereiken de tegenovergestelde polen en beginnen te decondenseren (ontrafelen). De mitotische spindels worden afgebroken tot monomeren die zullen worden gebruikt om cytoskeletcomponenten voor elke dochtercel samen te stellen. Nucleaire enveloppen vormen zich rond chromosomen.

CONCEPT IN ACTIE

Deze pagina met films illustreert verschillende aspecten van mitose. Bekijk de film getiteld "DIC microscopie van celdeling in een newt-longcel" en identificeer de fasen van mitose.

Cytokinese

Cytokinese is het tweede deel van de mitotische fase waarin de celdeling wordt voltooid door de fysieke scheiding van de cytoplasmatische componenten in twee dochtercellen. Hoewel de stadia van mitose vergelijkbaar zijn voor de meeste eukaryoten, is het proces van cytokinese heel anders voor eukaryoten met celwanden, zoals plantencellen.

In cellen zoals dierlijke cellen die celwanden missen, begint cytokinese na het begin van de anafase. Een samentrekkende ring bestaande uit actinefilamenten vormt zich net binnen het plasmamembraan op de voormalige metafaseplaat. De actinefilamenten trekken de evenaar van de cel naar binnen en vormen een spleet. Deze spleet, of "scheur", wordt de splitsingsgroef genoemd. De groef wordt dieper naarmate de actinering samentrekt en uiteindelijk worden het membraan en de cel in tweeën gesplitst (Figuur 6.2.3).

In plantencellen is een splitsingsgroef niet mogelijk vanwege de starre celwanden die het plasmamembraan omringen. Tussen de dochtercellen moet zich een nieuwe celwand vormen. Tijdens de interfase accumuleert het Golgi-apparaat enzymen, structurele eiwitten en glucosemoleculen voordat het uiteenvalt in blaasjes en zich door de delende cel verspreidt. Tijdens de telofase bewegen deze Golgi-blaasjes op microtubuli om zich te verzamelen op de metafaseplaat. Daar fuseren de blaasjes vanuit het midden naar de celwanden; deze structuur wordt een celplaat genoemd. Naarmate meer blaasjes samensmelten, wordt de celplaat groter totdat deze samengaat met de celwand aan de periferie van de cel. Enzymen gebruiken de glucose die zich tussen de membraanlagen heeft opgehoopt om een ​​nieuwe celwand van cellulose te bouwen. De Golgi-membranen worden het plasmamembraan aan weerszijden van de nieuwe celwand (Figuur 6.2.3).

G0 Fase

Niet alle cellen houden zich aan het klassieke celcycluspatroon waarin een nieuw gevormde dochtercel onmiddellijk de interfase ingaat, op de voet gevolgd door de mitotische fase. Cellen in de G0 fase bereiden zich niet actief voor om te verdelen. De cel bevindt zich in een ruststadium (inactief) en heeft de celcyclus verlaten. Sommige cellen gaan G . binnen0 tijdelijk totdat een extern signaal het begin van G . activeert1. Andere cellen die zich nooit of zelden delen, zoals rijpe hartspier- en zenuwcellen, blijven in G0 permanent (Figuur 6.2.4).


Afbeelding 6.2.4: Cellen die zich niet actief voorbereiden om te delen, gaan een alternatieve fase in genaamd G0. In sommige gevallen is dit een tijdelijke toestand totdat deze wordt geactiveerd om G . in te voeren1. In andere gevallen blijft de cel in G0 permanent.

Controle van de celcyclus

De lengte van de celcyclus is zeer variabel, zelfs binnen de cellen van een individueel organisme. Bij mensen varieert de frequentie van celvernieuwing van enkele uren in de vroege embryonale ontwikkeling tot gemiddeld twee tot vijf dagen voor epitheelcellen, of tot een heel menselijk leven doorgebracht in G.0 door gespecialiseerde cellen zoals corticale neuronen of hartspiercellen. Er is ook variatie in de tijd die een cel doorbrengt in elke fase van de celcyclus. Wanneer sneldelende zoogdiercellen in cultuur worden gekweekt (buiten het lichaam onder optimale groeiomstandigheden), is de duur van de cyclus ongeveer 24 uur. In snel delende menselijke cellen met een 24-uurs celcyclus, de G1 fase duurt ongeveer 11 uur. De timing van gebeurtenissen in de celcyclus wordt gecontroleerd door mechanismen die zowel intern als extern van de cel zijn.

Regelgeving bij interne controlepunten

Het is essentieel dat dochtercellen exacte duplicaten zijn van de oudercel. Fouten in de duplicatie of distributie van de chromosomen leiden tot mutaties die kunnen worden doorgegeven aan elke nieuwe cel die door de abnormale cel wordt geproduceerd. Om te voorkomen dat een aangetaste cel zich blijft delen, zijn er interne controlemechanismen die werken op drie belangrijke celcycluscontrolepunten waar de celcyclus kan worden gestopt totdat de omstandigheden gunstig zijn. Deze checkpoints vinden plaats aan het einde van G1, bij de G2–M-overgang en tijdens metafase (Figuur 6.2.5).

De G1 Controlepunt

De G1 checkpoint bepaalt of alle omstandigheden gunstig zijn om de celdeling door te laten gaan. De G1checkpoint, ook wel het restrictiepunt genoemd, is het punt waarop de cel zich onomkeerbaar verbindt aan het celdelingsproces. Naast voldoende reserves en celgrootte wordt er gecontroleerd op schade aan het genomische DNA bij de G1 controlepunt. Een cel die niet aan alle eisen voldoet, wordt niet vrijgegeven in de S-fase.

De G2 Controlepunt

De G2 checkpoint verspert de toegang tot de mitotische fase als niet aan bepaalde voorwaarden wordt voldaan. zoals in de G1checkpoint, celgrootte en eiwitreserves worden beoordeeld. De belangrijkste rol van de G2controlepunt is om ervoor te zorgen dat alle chromosomen zijn gerepliceerd en dat het gerepliceerde DNA niet is beschadigd.

Het M-controlepunt

Het M-controlepunt vindt plaats aan het einde van de metafasefase van de mitose. Het M-controlepunt staat ook bekend als het spilcontrolepunt omdat het bepaalt of alle zusterchromatiden correct zijn bevestigd aan de spilmicrotubuli. Omdat de scheiding van de zusterchromatiden tijdens de anafase een onomkeerbare stap is, zal de cyclus niet doorgaan totdat de kinetochoren van elk paar zusterchromatiden stevig verankerd zijn aan spilvezels die voortkomen uit tegenovergestelde polen van de cel.

CONCEPT IN ACTIE

Kijk wat er gebeurt bij de G1, G2, en M checkpoints door deze animatie van de celcyclus te bezoeken.

Samenvatting

De celcyclus is een geordende opeenvolging van gebeurtenissen. Bij eukaryoten bestaat de celcyclus uit een lange voorbereidende periode, interfase genaamd. Interfase is verdeeld in G1, S en G2 fasen. Mitose bestaat uit vijf fasen: profase, prometafase, metafase, anafase en telofase. Mitose gaat meestal gepaard met cytokinese, waarbij de cytoplasmatische componenten van de dochtercellen worden gescheiden door een actinering (dierlijke cellen) of door celplaatvorming (plantencellen).

Elke stap van de celcyclus wordt gecontroleerd door interne controles, checkpoints genaamd. Er zijn drie belangrijke controlepunten in de celcyclus: één aan het einde van G1, een seconde bij de G2-M overgang, en de derde tijdens metafase.

Woordenlijst

anafase
het stadium van mitose waarin zusterchromatiden van elkaar worden gescheiden
celcyclus
de geordende opeenvolging van gebeurtenissen die een cel doormaakt tussen de ene celdeling en de volgende
celcyclus checkpoints
mechanismen die de paraatheid van een eukaryote cel controleren om de verschillende stadia van de celcyclus te doorlopen
celwand
een structuur gevormd tijdens cytokinese van plantencellen door Golgi-blaasjes die samensmelten op de metafaseplaat; zal uiteindelijk leiden tot de vorming van een celwand om de twee dochtercellen te scheiden
centriool
een gepaarde staafachtige structuur opgebouwd uit microtubuli in het midden van elk centrosoom van dierlijke cellen
decolleté groef
een vernauwing gevormd door de actinering tijdens cytokinese van dierencellen die leidt tot cytoplasmatische deling
cytokinese
de deling van het cytoplasma na mitose om twee dochtercellen te vormen
G0 fase
een celcyclusfase die verschilt van de G1 fase van interfase; een cel in G0 bereidt zich niet voor om te verdelen
G1 fase
(ook eerste tussenruimte) een celcyclusfase; eerste fase van interfase gericht op celgroei tijdens mitose
G2 fase
(ook tweede tussenruimte) een celcyclusfase; derde fase van interfase waar de cel de laatste voorbereidingen voor mitose ondergaat
interfase
de periode van de celcyclus die leidt tot mitose; omvat G1, S en G2 fasen; de tussentijd tussen twee opeenvolgende celdelingen
kinetochoor
een eiwitstructuur in het centromeer van elke zusterchromatide die spoelmicrotubuli aantrekt en bindt tijdens de prometafase
metafase plaat
het equatoriale vlak halverwege tussen twee polen van een cel waar de chromosomen tijdens de metafase op één lijn liggen
metafase
het stadium van mitose waarin de chromosomen op de metafaseplaat liggen
mitose
de periode van de celcyclus waarin de gedupliceerde chromosomen worden gescheiden in identieke kernen; omvat profase, prometafase, metafase, anafase en telofase
mitotische fase
de periode van de celcyclus waarin gedupliceerde chromosomen worden verdeeld in twee kernen en de cytoplasmatische inhoud wordt verdeeld; omvat mitose en cytokinese
mitotische spindel
het microtubuli-apparaat dat de beweging van chromosomen tijdens mitose orkestreert
prometafase
het stadium van mitose waarin mitotische spoelvezels zich hechten aan kinetochoren
profase
het stadium van mitose waarin chromosomen condenseren en de mitotische spoel begint te vormen
rustig
beschrijft een cel die normale celfuncties uitvoert en geen voorbereidingen heeft getroffen voor celdeling
S fase
de tweede of synthesefase van de interfase waarin DNA-replicatie plaatsvindt
telofase
het stadium van mitose waarin chromosomen bij tegenovergestelde polen aankomen, decondenseren en worden omgeven door nieuwe nucleaire enveloppen

BrdU/EdU dubbele labeling om de celcyclusdynamiek van gedefinieerde cellulaire subpopulaties te bepalen

Meten van de gemiddelde duur van de synthesefase (Ts) en van de totale celcyclus (TC) binnen progenitorcelpopulaties kunnen belangrijke inzichten verschaffen in de biologie die deze cellen bestuurt. In plaats van een passief proces dat weinig variabiliteit vertoont tussen cellulaire contexten, is de celcyclus in plaats daarvan sterk gereguleerd. Bijvoorbeeld, in de voorhersenen van knaagdieren, Ts wordt selectief verlengd in radiale gliale voorlopercellen die symmetrische versus asymmetrische deling ondergaan. Aangenomen wordt dat deze verlenging de kans op kopieerfouten die tijdens DNA-replicatie kunnen optreden, minimaliseert. Het manipuleren van de duur van de celcyclus kan ook het lot van de cel beïnvloeden, wat aantoont dat de duur van de celcyclus in bepaalde omstandigheden een leerzaam proces is. Momenteel wordt de lengte van de celcyclus meestal gemeten met behulp van ofwel cumulatieve labeling met een enkele thymidine-analoog, of via dubbele thymidine-analoge labelingbenaderingen. Deze methoden zijn echter vaak tijdrovend en inefficiënt. Hier, met behulp van de embryonale muis hersenschors als modelsysteem, beschrijven we een vereenvoudigd dual thymidine analoog protocol met behulp van BrdU en EdU dat kan worden gebruikt om T te metens en TC. Het voordeel van dit protocol ten opzichte van cumulatieve etiketteringsbenaderingen is dat er slechts één tijdpunt nodig is voor de meting. Een bijkomend voordeel van dit protocol ten opzichte van bestaande dual-analoge benaderingen (CldU/IdU) is de antilichaamvrije detectie van EdU en de zuurvrije detectie van BrdU, processen die het parallelle gebruik van specifieke antilichamen mogelijk maken om de cel- cyclus in immunologisch gedefinieerde cellulaire subpopulaties.

trefwoorden: BrdU Celcyclus Cumulatieve labeling Dubbele labeling EdU S-fase.


Ventilatie en longziekte

Studenten beginnen met te kijken naar de spiersamentrekkingen die de drukveranderingen in de thorax veroorzaken die lucht in en uit de longen dwingen om ze te ventileren. Dit wordt gevolgd door een experiment om de ademhalingsfrequenties te controleren (Praktisch 6) en er is een activiteit om studenten voor te bereiden op hun IA-onderzoek. Twee korte video's over longziekte sluiten de activiteiten af. De leerlingen wordt gevraagd verbanden te leggen tussen de longen.

Om toegang te krijgen tot de volledige inhoud van deze site, moet u inloggen of u erop abonneren.


Verscheidenheid in intracellulaire diffusie tijdens de celcyclus

Tijdens de celcyclus ondergaat de organisatie van het cytoskeletale netwerk dramatische veranderingen. Om mogelijke veranderingen van de visco-elastische eigenschappen in de intracellulaire ruimte tijdens de celcyclus te onthullen, hebben we de diffusie van endogene lipidekorrels in de splijtingsgist onderzocht Schizosaccharomyces Pombe optisch pincet gebruiken. De celcyclus werd verdeeld in interfase en mitotische celdeling, en de mitotische celdeling werd verder onderverdeeld in zijn stadia. Tijdens alle stadia van de celcyclus ondergingen de korrels voornamelijk een subdiffusieve beweging, gekenmerkt door een exponent α die ook gekoppeld is aan de visco-elastische moduli van het cytoplasma. De exponent α was significant kleiner tijdens interfase dan tijdens elk stadium van de mitotische celdeling, wat betekent dat het cytoplasma elastischer was tijdens interfase dan tijdens deling. We vonden geen significante verschillen in de subdiffusieve exponenten van korrels gemeten in verschillende stadia van celdeling. Ook vertoonden onze resultaten voor de exponent geen significante afhankelijkheid van de positie van de korrel in de cel. De waarneming dat het cytoplasma tijdens interfase elastischer is dan tijdens mitotische celdeling komt overeen met het feit dat elastische cytoskeletelementen zoals microtubuli minder overvloedig aanwezig zijn tijdens celdeling dan tijdens interfase.


Celcyclus

Onze redacteuren zullen beoordelen wat je hebt ingediend en bepalen of het artikel moet worden herzien.

Celcyclus, de geordende opeenvolging van gebeurtenissen die plaatsvinden in een cel ter voorbereiding op celdeling. De celcyclus is een proces in vier fasen waarin de cel in omvang toeneemt (gap 1, of G1, stadium), zijn DNA kopieert (synthese of S, stadium), zich voorbereidt om te delen (gap 2 of G2, stadium) , en verdeelt (mitose, of M, stadium). De stadia G1, S en G2 vormen de interfase, die verantwoordelijk is voor de spanwijdte tussen celdelingen. Op basis van de stimulerende en remmende berichten die een cel ontvangt, "beslist" hij of hij in de celcyclus moet komen en zich moet delen.

De eiwitten die een rol spelen bij het stimuleren van celdeling kunnen worden ingedeeld in vier groepen: groeifactoren, groeifactorreceptoren, signaaltransducers en nucleaire regulerende eiwitten (transcriptiefactoren). Om ervoor te zorgen dat een stimulerend signaal de kern bereikt en de celdeling "aanzet", moeten er vier hoofdstappen plaatsvinden. Ten eerste moet een groeifactor binden aan zijn receptor op het celmembraan. Ten tweede moet de receptor tijdelijk geactiveerd worden door deze bindingsgebeurtenis. Ten derde moet deze activering een signaal stimuleren dat van de receptor op het celoppervlak naar de kern in de cel moet worden overgedragen of getransduceerd. Ten slotte moeten transcriptiefactoren in de kern de transcriptie initiëren van genen die betrokken zijn bij celproliferatie. (Transcriptie is het proces waarbij DNA wordt omgezet in RNA. Eiwitten worden vervolgens gemaakt volgens de RNA-blauwdruk en daarom is transcriptie cruciaal als een eerste stap in de eiwitproductie.)

Cellen gebruiken speciale eiwitten en checkpoint signaleringssystemen om ervoor te zorgen dat de celcyclus goed verloopt. Controlepunten aan het einde van G1 en aan het begin van G2 zijn ontworpen om DNA voor en na de S-fase te beoordelen op schade. Evenzo zorgt een controlepunt tijdens de mitose ervoor dat de spilvezels van de cel goed zijn uitgelijnd in de metafase voordat de chromosomen in de anafase worden gescheiden. Als bij deze controlepunten DNA-schade of afwijkingen in spindelvorming worden gedetecteerd, wordt de cel gedwongen om geprogrammeerde celdood of apoptose te ondergaan. De celcyclus en zijn controlepuntsystemen kunnen echter worden gesaboteerd door defecte eiwitten of genen die een kwaadaardige transformatie van de cel veroorzaken, wat kan leiden tot kanker. Mutaties in een eiwit genaamd p53, dat normaal gesproken afwijkingen in het DNA op het G1-controlepunt detecteert, kunnen kankerverwekkende mutaties in staat stellen dit controlepunt te omzeilen en de cel te laten ontsnappen aan apoptose.

De redactie van Encyclopaedia Britannica Dit artikel is voor het laatst herzien en bijgewerkt door Kara Rogers, hoofdredacteur.


De rol van alternatieve splicing tijdens de celcyclus en geprogrammeerde celdood

Chanseok Shin, James L. Manley, in Handbook of Cell Signaling, 2003

Regeling celcyclus en splicing

Overgangen door de celcyclus worden sterk gereguleerd door de activiteiten van cycline-afhankelijke kinasen (CDK's). Cyclines, die associëren met en reguleren van de CDK's, accumuleren alleen op specifieke tijdstippen tijdens de celcyclus. Naast deze tijdelijke controle, die ubiquitine-gemedieerde proteolyse van de cycline omvat, kan CDK-activiteit worden gereguleerd door fosforylering en fysieke interactie met CDK-remmereiwitten (besproken in [26]).

Verbanden tussen pre-mRNA-splitsing en de celcyclus zijn waarschijnlijk, maar zijn niet volledig onderzocht. In gist, beide Schizosaccharomyces pombe en S. cerevisiae, bleken verschillende genen die aanvankelijk werden geïsoleerd op grond van celcyclusfenotypes te coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij splitsing, en mutaties in sommige bekende splitsingsfactorgenen vertonen celcyclusfenotypes (besproken in [27]). Maar er is weinig bekend over de functionele betekenis van deze genetische interacties.

Een aspect van celcycluscontrole is het tot zwijgen brengen van genexpressie die optreedt tijdens mitose in metazoaire cellen. De afgelopen jaren hebben inzicht gegeven in hoe dit gebeurt en in de onderliggende mechanismen die daarbij betrokken zijn, die bijvoorbeeld betrekking hebben op fosforylering van sleutelcomponenten van de transcriptie [28-30] en polyadenylatie [31]-machines, en defosforylering van een translatie-initiatiefactor die nodig is voor cap-afhankelijke vertaling [32]. In tegenstelling tot al deze processen is het onduidelijk wat er gebeurt met de splitsingsmachines tijdens de M-fase. Onze recente studies [ 32a ] hebben inzicht gegeven in deze kwestie. We hebben eerst de vraag behandeld of splitsing wordt geremd in M-fase-cellen en ontdekten dat het inderdaad werd geblokkeerd in extracten van hele cellen die zijn bereid uit door nocadazol gestopte cellen. Intrigerend is echter dat significante remming alleen werd gedetecteerd in extracten met een hoog zoutgehalte, wat suggereert dat een mitose-specifieke factor geassocieerd met onoplosbare cellulaire structuren vereist is voor remming. Een kandidaat is een nieuw SR-eiwit, SRp38, dat we recentelijk hebben gekarakteriseerd. SRp38 is anders dan andere SR-eiwitten omdat het de splicing-in niet kan activeren in vitro testen (besproken in [10]). Integendeel, SRp38 lijkt een toegewijde splicing-repressor te zijn en, belangrijker nog, zijn activiteit wordt sterk geactiveerd door defosforylering. Opmerkelijk is dat SRp38 tijdens de M-fase significant gedefosforyleerd wordt en alleen uit celextracten wordt geëxtraheerd bij dezelfde hoge zoutconcentraties die nodig zijn om M-fase-specifieke repressie te detecteren. Deze onderzoeken hebben aangetoond dat splicing, net als andere stappen in genexpressie, wordt onderdrukt tijdens mitose. Analoog aan het mechanisme dat betrokken is bij translatieremming [32], lijkt splicingremming defosforylering te omvatten, met name van het SR-eiwit SRp38.

Onlangs zijn twee cdk-gerelateerde kinasen beschreven die kunnen functioneren bij splitsing. Ko et al. [33] beschreef een nieuw eiwitkinase als Cdc2-Ruitgelaten kinase met een arginine/serine rijk (RS) domein (CrkRS). CrkRS heeft uitgebreide proline-rijke regio's die overeenkomen met de consensus voor SH3- en WW-domeinbindingsplaatsen en, het meest significant, een N-terminaal RS-domein. RS-domeinen, zoals geïllustreerd in SR-eiwitten, zijn eiwit-eiwitinteracties die kenmerkend zijn voor splicingfactoren. CrkRS colokaliseert in nucleaire spikkels met andere splicingfactoren, en immunoprecipitaten van CrkRS bleken CrkRS zelf, exogeen toegevoegde ASF/SF2 en het GST-gelabelde C-terminale domein van de grootste subeenheid van RNA-polymerase II (CTD) te fosforyleren. CrkRS is hypergefosforyleerd in mitose en hypogefosforyleerd in interfase. De functie van CrkRS is momenteel onbekend, maar het heeft het potentieel om te functioneren bij het koppelen van transcriptie en splitsing met de celcyclus.

In overeenstemming met het bestaan ​​van een RS-domeinbevattende cdk, heeft een recente zoekopdracht in een menselijke database een RS-domeinbevattend cycline geïdentificeerd, genaamd CYCLIN L [34]. Onlangs is de muizenhomoloog van CYCLIN L, ania-6 genaamd, beschreven. Intrigerend genoeg wordt ania-6 snel geïnduceerd in het volwassen striatum door cocaïne of directe dopaminestimulatie [35]. Verschillende soorten neurotransmitterstimulatie veroorzaken selectieve inductie van verschillende ania-6-isovormen (Ania-6a 60 en Ania-6a 25 ), door alternatieve splicing. Het langere eiwit, Ania-6a60, bevat een C-terminaal RS-domein, terwijl de kortere isovorm, Ania-6a25, dat niet heeft. Ania-6a 60 is gelokaliseerd in nucleaire spikkels, terwijl Ania-6a 25 niet is gelokaliseerd in de kern. Misschien wel significant, ania-6-sequenties lijken meer op ongewervelde homologen van cyclinen dan op andere zoogdiercycli, en dichter bij cyclinen geassocieerd met RNA pol II (zoals cycline K of T) dan met cyclinen die direct betrokken zijn bij celcycluscontrole (zoals zoals cycline A1). Immunoprecipitatieonderzoeken met FLAG-Ania-6a 60 geven aan dat het eiwit specifiek is geassocieerd met de hypergefosforyleerde vorm van RNA-polymerase (RNAP IIO), de splitsingsfactor SC35 en de p110 PITSLRE cdk. Het idee dat RNAP II, en specifiek de CTD, deelneemt aan mRNA-verwerking, is nu algemeen aanvaard (besproken in [36]) en het is aangetoond dat RNAP IIO pre-mRNA-splitsing stimuleert in vitro [ 37 ]. Het lijkt mogelijk dat Ania-6a 60 of CYCLIN L, evenals crKRS, een rol spelen bij het koppelen van transcriptie aan splicing. Hoe en of deze koppeling functioneert bij het reguleren van de expressie van specifieke genen, en of dergelijke controles mogelijk gerelateerd zijn aan de celcyclus, zijn interessante vragen voor de toekomst.


De NIMA-gerelateerde kinasen kunnen een belangrijke schakel zijn

We speculeren dat de Nek-familie een belangrijke algemene verbinding biedt tussen cilia en de regulatie van de voortgang van de celcyclus. In alle organismen waar ze zijn onderzocht, staan ​​NIMA en zijn broeders, de Neks, bekend als celcycluskinasen (O'Connell et al., 2003). We hebben opgemerkt dat deze familie is uitgebreid in lijnen met trilhaarcellen (Bradley et al., 2004), maar de enige directe ciliaire verbinding tot nu toe bij gewervelde dieren komt via studies van PKD-modellen: de oorzakelijke genen van twee muis-PKD-modellen zijn Neks. Studie van kat mutante muizen stelden vast dat Nek1 de oorzakelijke mutatie draagt ​​in dit model van autosomaal recessieve PKD (Upadhya et al., 2000). Van hNek1 is gevonden dat het bindt aan andere cystogene eiwitten, waaronder kinesine-2, dat ook nodig is voor ciliogenese (Surpili et al., 2003). Nek8 draagt ​​de oorzakelijke mutatie in het juveniele cystische niermuismodel, en morfolino's voor zebravis Nek8 veroorzaken niercysten in dat organisme (Liu et al., 2002). Een kinasedomeinmutatie van de menselijke ortholoog van Nek8 beïnvloedt de voortgang van de celcyclus, waarschijnlijk bij de G2/M controlepunt. Het is momenteel niet bekend of Nek1, Nek8 of andere zoogdieren Neks zich op cilia bevinden, maar het werk in Chlamydomonas suggereert dat zoogdieren Neks in trilhaartjes zullen worden gevonden.


Cytotoxische T-lymfocyten en natuurlijke killercellen

Stephen L. Nutt, Nicholas D. Huntington, in klinische immunologie (vijfde editie), 2019

Eerste activering

Naïeve T-cellen circuleren constant door secundaire lymfoïde organen, waar antigeen-ontmoeting plaatsvindt. Voor een CTL-respons wordt antigeen via het lymfestelsel door APC naar de lymfeknoop gebracht (Fig. 17.2). Deze APC's zijn typisch DC's die rijpen na antigeenacquisitie in niet-lymfoïde weefsels en migreren naar de lymfeknoop. Deze antigenen worden alleen herkend wanneer ze zijn gecomplexeerd met MHC-moleculen. APC's breken op efficiënte wijze eigen of vreemde (pathogeen-afgeleide) eiwitten af ​​tot kortere fragmenten (in het algemeen 8-10 aminozuren lang) door de werking van proteasen in het cytosol. Ze worden vervolgens getransporteerd naar het lumen van het endoplasmatisch reticulum, waar ze worden geladen op nieuw gesynthetiseerde MHC klasse I-moleculen voor presentatie aan het celoppervlak (Hoofdstuk 6). Hierdoor kunnen de APC's communiceren met de antigeenspecifieke CD8 T-cellen via interacties tussen de TCR- en MHC-moleculen.

In de lymfeklier scannen CTL's de APC's op de aanwezigheid van antigene peptiden die zijn gecomplexeerd met de MHC klasse I-moleculen, een proces dat immuun toezicht. Bij afwezigheid van een specifieke herkenning door de TCR, is de ontmoeting slechts van voorbijgaande aard en gaat de T-cel verder naar een andere APC om het proces te herhalen. Als het MHC klasse I-peptidecomplex wordt gebonden door de TCR en signalering initieert, treedt een meer duurzame interactie op.

TCR-activering bevordert de polarisatie van de T-cel en de vorming van de "immunologische synaps". 6 De immunologische synaps is een sterk gestructureerd lichaam dat functioneert om TCR-signalering in een bepaald gebied te concentreren. Het wordt geassocieerd met de selectieve rekrutering van signaalmoleculen en uitsluiting van negatieve regulatoren. De synaps wordt gestabiliseerd door een ring van adhesiemoleculen, waaronder bijvoorbeeld LFA-1, dat bindt aan ICAM1 op de APC (zie figuur 17.1). Om een ​​T-cel volledig actief te laten worden, is co-stimulatie via een tweede signaalroute vereist. 6 Veel co-simulatoren die zijn geïdentificeerd, hebben het gemeenschappelijke kenmerk dat ze transmembraanreceptoren zijn, vaak van de TNFR-superfamilie, die transmembraanliganden op de APC binden. De belangrijkste costimulator, CD28, bindt de liganden CD80 (B7.1) en CD86 (B7.2), die beide tot expressie worden gebracht op geactiveerde APC's. Costimulation results in the clonal expansion of CTLs with the selected antigen specificity. The expression of CD80/86 is tightly regulated. High-level expression occurs only after an APC receives activation signals, such as inflammatory cytokines, or components of the pathogens such as lipopolysaccharide. Costimulation via CD28 is most critical during the initiation of the immune response, as it promotes IL-2 production, which, in turn, supports the development of effector T cells. Naïve T cells that receive TCR stimulation in the absence of costimulatory signals can become nonresponsive to antigen, a state termed anergy.


Results

Discovery of cell cycle modulators

To discover novel cell cycle phase specific inhibitors, human HeLa cancer cells were plated into 384-well plates and a diverse compound library (79 827 small molecules) encompassing broad chemical space was used to place one compound per well at 10 μM final concentration (Figures 1a and b and Supplementary Table 1). These compounds were pre-selected based on their drug-like properties: predominantly conform to Lipinski’s rule of five for acceptable molecular properties for orally active drugs in humans. 16 Twenty hours later, the cells were fixed and stained with the DNA-selective stain Vybrant DyeCycle Green, which is cell membrane permeant and after binding to DNA emits a fluorescent signal that is proportional to DNA mass when exited at 488 nm. 17 Plates were scanned with a fluorescence micro-plate cytometer and a cell cycle histogram profile was generated for each well, which had been treated with one compound (Figure 1b). Cell cycle profiles were grouped and ranked according to the extent of G1, S, and G2/M arrest. The top hits from each phase were cherry picked and retested in triplicate and only those testing positive were considered further. In total we uncovered 69 G1-phase inhibitors (>4 S.D. from the mean), 148 S-phase inhibitors (> 5 S.D. from the mean), and 273 G2/M-phase inhibitors (% G2/M ≥ 67%) (Figures 1c and e and Supplementary Table 2). A representative example of each compound class and their associated cell cycle profiles are indicated in Figures 1f–h.

Identification of cell cycle phase specific inhibitors through a novel cell-based high-throughput small molecule screening approach. (een) Targeting the cell cycle in the treatment of cancer. (B) Cell-based high-throughput screening (HTS) of 79 827 drug-like molecules for cell cycle modulators. Twenty hours post compound treatment, HeLa cancer cells were fixed and stained with Vybrant DyeCycle green, and a high-content cytometer was used to generate a cell cycle profile for each compound. (ce) Scatter plots of percent G1, S, and G2/M arrest for all compounds. The cutoffs for G1-phase and S-phase inhibitors were set at >4 and >5 S.D. from the mean, respectively. The cutoff for G2/M inhibitors was set at ≥ 67% G2/M arrest. (fh) Examples of G1, S, and G2/M-phase arresting compounds and their cell cycle profiles. (i) Immunofluorescence HTS assay for distinguishing G2-phase inhibitors from M-phase inhibitors. Cells were co-stained with 1 μg/ml Hoechst 33342 (blue) and Alexa-488-phospho-histone-H3 (p-H3, green). Mitotic cells are positive for p-H3. Bar indicates 5 μm. (j) Summary of screen results indicating that 266 compounds arrest cells in mitosis and 7 compounds arrest cells in G2-phase. (k) Screen summary plot of percent hit rate indicates that M-phase inhibitors were the most abundant. (Bk) See also Supplementary Table 2

To distinguish between compounds that arrest cells in G2-phase or M-phase, the 273 G2/M compounds were subjected to a secondary high-throughput screen, where cells were fixed and co-stained with the DNA dye Hoechst 33342 and a Alexa-488 fluorescently labeled antibody that recognizes phospho-histone H3 (p-H3), which is specifically phosphorylated in mitosis 18,19 (Figure 1i). This analysis revealed that 266 compounds arrested cells in mitosis and 7 arrested cells in G2-phase (Figure 1j and Supplementary Table 2). In total, the screen resulted in a 0.613% cell cycle modulator hit rate, with 0.086% G1-phase inhibitors, 0.185% S-phase inhibitors, 0.009% G2-phase inhibitors, and 0.333% M-phase inhibitors (Figure 1k). These results indicated that our cell cycle profile based approach successfully identified inhibitors to all phases of the cell cycle and likely a broad array of targets.

Compound chemical analysis and target prediction

To understand the physiochemical properties of compounds within each cell cycle class, we analyzed the chemical structures of the top compounds from each phase using our newly developed Chemical Similarity Network Analysis Pulldown (CSNAP) computational program. CSNAP searched the ChEMBL database for compounds sharing chemical similarity to hit compounds, retrieved the bioactivity information of each compound found in the ChEMBL database and organized these compounds into network similarity graphs sharing common chemotypes. An implemented scoring function (S-score) was used to score target assignments by counting the target annotation frequency in the nearest neighborhood of query compounds. The predicted compound on/off-targets represented by the S-score were visualized on heatmaps (scaled from 0 to 1) and the most prominent targets were selected from the top peaks, which correlated with the cumulative S-score (∑S-Score) of each assigned target in the target spectrum. This approach previously allowed us to successfully identify major drug targets for M-phase compounds, which included tubulin targeting compounds as well as novel ligands not previously annotated in bioactivity databases. CSNAP analysis of the 69 G1-inhibitors, 148 S-inhibitors, and 7 G2-inhibitors, resulted in the identification of 64 G1 chemotypes, 68 S chemotypes, and 5 G2 chemotypes, respectively. These results indicated that our screening had discovered phase specific and structurally diverse cell cycle inhibitors (Figures 2a–c and Supplementary Table 3).

Deconvolving cell cycle modulators. (eenc) CSNAP network similarity graphs showing 64 G1 chemotypes, 68 S chemotypes, and 5 G2 chemotypes, respectively. Query compounds are in red and ChEMBL compounds are in gray. (NSf) CSNAP S-score function analyses and prediction of compound on/off-targets. Heatmap summaries of S-scores are scaled from 0–1. The cumulative S-score (∑S-Score) of each assigned target in the target spectrum and the major predicted targets/off-targets are indicated. (Gi) Highlight of representative compounds within the top clusters for each cell cycle phase. (eeni) See also Supplementary Table 3

CSNAP analysis of G1-phase compounds identified kinase inhibitors like Staurosporine, Tyrphostin, and their analogs that mimicked the ATP substrate of PKC and EGFR, which were known to block the MAPK signaling pathway critical for tumor proliferation 20, 21, 22, 23, 24, 25 (Figures 2d and g). In addition, compounds capable of modulating the intracellular calcium concentration including the ion channel inhibitors Thapsigargin (sarco-endoplasmic reticulum Ca 2+ ATPase inhibitor), Ouabain (Na + /K + ATPase inhibitor), and the ionophore antibiotic A-23187 were also identified 26, 27, 28 (Figures 2d and g). This was consistent with reports indicating that calcium is an important secondary messenger and that oscillatory calcium signaling is required for MAPK activity and cyclin D1/E synthesis at the G1/S transition. 26 CSNAP analysis of S-phase compounds indicated that a group of compounds including 5309022 and 5113916 were likely inhibiting ribonucleotide reductase (catalyzes the reduction of ribonucleotides to deoxyribonucleotides the building blocks for DNA replication and repair 29 ) activities by iron chelation through a hydrazone motif similar to that of Triapine and its analog 311 29 (Figures 2e and h). In addition, two GSK3β inhibitors (5100772 and 5583777) were identified among the S-phase inhibitors consistent with its role in regulating cyclin D1 expression required for S-phase entry and progression 30, 31, 32 (Figures 2e and h). CSNAP analysis of the seven G2-phase compounds identified DNA topoisomerase II (TOP2) inhibitors including Etoposide and Amsacrine-like analogs 33 (Figures 2f and i). These DNA intercalating agents trap TOP2 : DNA covalent complexes, which induce DNA damage and G2 checkpoint arrest. 34 Thus, CSNAP highlighted compounds with known anti-proliferative properties and analogs of these compounds that may be more efficacious. Most importantly, CSNAP identified many novel compounds not sharing chemotype similarity to compounds in bioactivity databases that represent new anti-proliferative agents. Finally, it provided key information for selecting lead compounds with diverse mechanisms of action and targets that perturb distinct cellular pathways essential for cell cycle progression.

Characterization of M-phase inhibitor potency

Due to the large number and chemical diversity of M-phase inhibitors, the current lack of chemical probes to study cell division and the need for novel antimitotics, we focused on the detailed characterization of mitotic inhibitors. To assess the potential of the 266 mitotic inhibitors as anti-cancer agents, they were re-synthesized and the 211 that passed quality control (Mitotic Inhibitor 1-211) were tested for their ability to arrest cells in mitosis and to decrease cancer cell viability (Figure 3a). For mitotic arrest assays, HeLa cells were treated with a 20.2-fold-titration (190pM to 10 μM) of each compound for 20 h and the half maximal inhibitory concentration (IC50) was derived for each compound using the cell cycle profile assay used in the initial screen (Figures 3b and c and Supplementary Table 4). As an example, compound ASN05941236 displayed a mitotic arrest IC50 of 3.34 μM (Figure 3b). Within the titration series, all compounds displayed a percent mitotic arrest between 48.3 and 83.6% (Figure 3d and Supplementary Table 4). For viability assays, cells were treated with a 14.2-fold-titration (12.2 nM to 100 μM) of each compound for 72 h and cell viability was measured using the CellTiter-Glo luminescent cell viability assay (Figures 3e and f and Supplementary Table 4). As an example, compound ASN05941236 displayed a cell death IC50 of 3.38 μM (Figure 3e). Interestingly, all 211 compounds arrested cells in mitosis and decreased cell viability (Supplementary Table 4). Most of these compounds were potent 16 had a mitotic arrest IC50 of ≤100 nM, 56 had ≤500 nM, and 98 had ≤1 μM (Figure 3g and Supplementary Table 4). Similarly, 13 compounds had a cell viability IC50 of ≤100 nM, 56 had ≤500 nM, and 95 had ≤1 μM (Figure 3h and Supplementary Table 4).

Anti-mitotic compound potency. (een) Determination of compound mitotic arrest and cell viability IC50. HeLa cells were treated with increasing concentrations of each compound for 20 or 72 h and assayed for mitotic arrest and cell viability, respectively. (B) Example of mitotic arrest IC50 curve. x-axis is drug concentration in μM scale and y-axis is percent cells arrested in mitosis. (c) Scatter plot of mitotic arrest IC50 in μM scale (y-axis) for all mitotic compounds (x-axis). (NS) Scatter plot of the percent mitotic arrest IC50 in μM scale (y-axis) for all mitotic compounds (x-axis). (e) Example of the cell viability IC50 curve. x-axis is drug concentration in μM scale and y-axis represents cell viability in relative light units (RLU). (f) Scatter plot of the cell viability IC50 in μM scale (y-axis) for all mitotic compounds (x-axis). (G, h) Summary graphs of mitotic arrest and cell death potency for all compounds. x-axis is drug concentration in μM scale and y-axis represents the number of compounds within each category. Note that 56 compounds showed a mitotic arrest IC50 below 500 nM. (Bh) See also Supplementary Table 4

Multiparametric phenotypic analyses of M-phase inhibitors

To investigate the mechanism of action of each anti-mitotic compound we performed high-resolution immunofluorescence (IF) microscopy to analyze the mitotic defects induced by these compounds (Figure 4). HeLa cells were treated with each of the 211 compounds at a concentration corresponding to their mitotic arrest IC90 for 20 h. Cells were then fixed, permeabilized, and co-stained for DNA and α-tubulin. Six major classes of phenotypes were observed: multipolar spindle, normal bipolar spindle with unaligned chromosomes, defective bipolar spindle with unaligned chromosomes, mixed phenotype (containing more than one of the six phenotypes), depolymerized microtubules, and stabilized microtubules (Figure 4a and Supplementary Table 4). The compound class that induced microtubule depolymerization was the most abundant with 84 compounds falling into this category, followed by the mixed phenotype (54 compounds) and the multipolar phenotype (37 compounds) (Figure 4b and Supplementary Table 4).

High-resolution phenotypic analysis of mitotic inhibitors. (een) Summary of the six phenotype classes observed upon treatment with MI-1 through MI-211: bipolar spindle with unaligned chromosomes, defective bipolar spindle with unaligned chromosomes, multipolar spindle, mixed phenotype, depolymerized microtubules, and stabilized microtubules imaged by immunofluorescence microscopy. Cells were treated with compounds for 20 h, fixed, and co-stained for α-tubulin (anti-tubulin antibodies, red) and DNA (Hoechst 33342, blue). Bar indicates 5 μm. (B) Summary of the percentage of the total M-phase inhibitors in each phenotypic category. See also Supplementary Table 4

Selection of MI-181 as a lead compound

To aid the selection of lead compounds to pursue for further characterization, we performed a clustering analysis of the compounds and their bioactive properties, including mitotic arrest IC50, cell death IC50, phenotypic class of mitotic arrest, and percentage of cells arrested in mitosis (Figure 5a). This analysis revealed that MI-181 was the most potent (mitotic arrest IC50=23 nM and cell death IC50= 17 nM) compound, similar to the taxol (mitotic arrest IC50=37 nM and cell death IC50=27 nM) and colchicine (mitotic arrest IC50=24 nM and cell death IC50=12 nM) controls (Figure 5a and Supplementary Figures 1 and 2). In addition, MI-181 arrested more cells in mitosis compared with colchicine and taxol, 77% versus 76%, and 74%, respectively (Supplementary Table 4). MI-181 is a small (266Da) synthetic benzothiazole-based compound, and in silico analysis of its physiochemical properties indicated that it conformed to parameters needed for oral bioavailability in humans 16 (Figure 5b and Supplementary Figure 3). Unsurprisingly a substructure search for FDA-approved benzothiazole-based and structurally related benzimidazole-based drugs revealed 8 benzothiazole-based drugs and 10 benzimidazole-based drugs approved for various clinical uses (Supplementary Figure 4). For example, benzothiazoles included the vasodilator Fostedil and a tetrodotoxin-sensitive sodium channel blocker Riluzole approved for the treatment of heart disease and amyotrophic lateral sclerosis, respectively (Supplementary Figure 4). 35, 36, 37, 38 Whereas benzimidazoles included inhibitors of tubulin polymerization like nocodazole and mebendazole approved for the treatment of neoplasms and warm infestations (Supplementary Figure 4). 39,40 Thus benzothiazoles that inhibit tubulin polymerization, like MI-181, have potential for clinical use. Although the benzothiazole and benzimidazole substructures share strong chemical similarity, the chemical diversity of FDA-approved drugs with these substructures is diverse, indicating that these substructures have been effectively used as scaffolds for generating specificity to various cellular targets for the treatment of various diseases (Supplementary Figure 4).

Selection of lead compound MI-181. (een) Clustering of 211 M-phase compounds based on their bioactive properties. For each compound the following data were grouped and the compounds were sorted based on mitotic arrest IC50: phenotype class, mitotic arrest IC50, cell death IC50, and percent mitotic arrest. Note that MI-181 was the most potent inhibitor (mitotic arrest IC50=24 nM). (B) Chemical structure of MI-181. (c) Cells were treated with DMSO or MI-181 for 20 h, fixed, co-stained for DNA (Hoechst 33342) and microtubules (anti-α-Tubulin antibodies), and imaged by immunofluorescence (IF) microscopy. Images show that MI-181-treated cells arrest with condensed chromosomes and depolymerized microtubules. (NS) Results from in vitro tubulin polymerization reactions in the presence or absence of DMSO, MI-181, colchicine, and taxol. Note that MI-181 inhibits tubulin polymerization. (e–g) IF microscopy showing that MI-181-treated cells arrest in mitosis (p-H3 positive) (e) and activate the SAC (Bub1 remains at the kinetochore region (f) and AurKB remains on chromosomes and kinetochores and does not transition to the central spindle (G)). (h) Immunoblot analysis of extracts prepared from DMSO or MI-181-treated cells, which were synchronized in G1/S and released into the cell cycle. Note that cyclin A levels decrease as cells enter mitosis concomitant with an increase in p-H3 signal, and cyclin B, while BubR1 remains phosphorylated only in MI-181-treated cells, indicative of an active spindle assembly checkpoint. (c, e–g) Bar indicates 5 μm

MI-181 inhibits tubulin polymerization

To evaluate MI-181’s mechanism of action, we treated HeLa cells with MI-181 for 20 h, fixed them, co-stained them for DNA and α-tubulin, and imaged them by IF microscopy (Figure 5c). These analyses revealed that MI-181-treated cells failed to form a mitotic spindle and only small tubulin puncta were observed, indicative of microtubule depolymerization (Figure 5c). This was further confirmed in vitro where MI-181 inhibited tubulin polymerization in an in vitro tubulin polymerization assay, similar to colchicine (Figure 5d).

MI-181 arrests cells in mitosis, activates the SAC, and triggers cell death

To explore the nature of the MI-181-induced mitotic arrest, we asked if it was activating the spindle assembly checkpoint (SAC) to arrest cells in mitosis. First, we confirmed that MI-181 was indeed arresting cells in mitosis. HeLa cells were treated with DMSO, MI-181, or colchicine for 18 h, cells were fixed, co-stained for DNA, microtubules, kinetochores, and the mitotic marker p-H3, and imaged by fluorescence microscopy. Similar to colchicine treatment, MI-181 treatment arrested cells in mitosis with p-H3-positive staining and unaligned tightly condensed chromosomes (Figure 5e). Next, we asked if the SAC was activated in these cells by co-staining for the SAC component Bub1. Indeed, Bub1 remained localized to the kinetochore region in colchicine-and MI-181-treated cells (Figure 5f). Similarly, in cells co-stained for the SAC kinase AurKB, AurKB remained localized to the kinetochore region and never transitioned to the central spindle as in control DMSO-treated cells (Figure 5g). These data indicated that MI-181-treated cells were arrested in early mitosis with an active SAC. To further validate this, cells were synchronized in G1/S, released into the cell cycle in the presence of DMSO or MI-181 and cell extracts were prepared at several time points post release. Consistent with our fixed-cell IF results, immunoblot analysis of these extracts revealed that MI-181-treated cells arrested in mitosis (p-H3 positive), activated the SAC (BubR1 remained phosphorylated), and stabilized cyclin B while degrading cyclin A (Figure 5h). In addition, the MI-181-induced mitotic arrest was reversible, as cells exited mitosis within 2 h of drug washout (Supplementary Figure 5).

To further analyze the cellular consequences of treating cancer cells with MI-181, we coupled cell synchronization with live-cell time-lapse IF microscopy. Synchronized HeLa fluorescent ubiquitination-based cell cycle (FUCCI) indicator cell line cells were treated with DMSO, MI-181, colchicine, or taxol 2 hours prior to mitotic entry and their effect on mitosis was assessed 41 (Figure 6a). Images were captured at 15-min intervals and processed into movie format (Figure 6a and Supplementary Movies 1). The movies were then analyzed to determine the percentage of cells with a defective mitosis and the length of time between mitotic entry and cell death 42 (Figures 6b and c). Whereas control DMSO-treated cells transitioned through mitosis (green fluorescence) and into G1 (red fluorescence) normally, MI-181-treated cells arrested in mitosis and failed to divide similar to colchicine- and taxol-treated cells (% normal cell divisions for MI-181=0, P<0.0001 colchicine=0, P<0.0001 taxol=3±0.8, P<0.0001 compared with DMSO=89.11±2.9) (Figure 6b). Although individual cell responses to drugs differed widely, colchicine-and MI-181-treated cells arrested for a shorter time-length than taxol prior to apoptosing (MI-181=5.3±0.96 h, colchicine=6.2±1.27 h, compared with taxol=23.78±9.03 h) (Figure 6c). These data indicated that MI-181 was a potent cell cycle-specific inhibitor, which arrested cells in mitosis, activated the SAC, and induced an apoptotic cell death with faster kinetics than taxol.

MI-181 is a potent cell division inhibitor. (een) Live-cell time-lapse microscopy of HeLa FUCCI cells treated with DMSO, MI-181, colchicine, or taxol. Time is in minutes. (B) The percentage of cells undergoing normal cell division was quantified for DMSO, MI-181, colchicine, or taxol-treated cells. Asterisk denotes P-value <0.0001. (c) The time from mitotic entry to cell death was quantified for DMSO-, MI-181-, colchicine-, or taxol-treated cells. Error bars indicate ±S.D. from the mean

MI-181 is active in a broad array of cancers, especially melanomas

To determine if MI-181 had broad anti-cancer activity, we treated a diverse panel of cancer cell lines including cervical adenocarcinoma (HeLa), breast adenocarcinoma (MCF7), melanoma (M233), osteosarcoma (U2OS), acute lymphoblastic leukemia (CCRF-CEM), non-small cell lung carcinoma (NCI-H460), and breast adenocarcinoma (MCF7) with MI-181 and determined its cell viability IC50 (Figures 7a and b). Interestingly, MI-181 showed great efficacy across most cancer cell lines with a cell viability IC50 ranging from 0.03 to 0.36 μM, with the exception of MCF7 cells (IC50=11 μM) (Figures 7a and b). These results indicated that MI-181 was potent across a broad array of cancers and was most effective against cervical adenocarcinoma and melanoma cell lines. Therefore, we analyzed the efficacy of MI-181 in a panel of melanoma cell lines with defined genetic backgrounds including BRAF V600E and NRAS Q61L mutations and varied sensitivities to Vemurafenib (BRAF inhibitor) and Trametinib (MEK inhibitor), which are currently used to treat BRAF V600E melanomas 43,44 (Figure 7c). MI-181 displayed great potency across this panel (IC50=18–90 nM) (Figure 7c and Supplementary Table 5). As a general trend BRAF V600E cell lines were slightly more sensitive than NRAS Q61L cell lines and MI-181 was effective in Vemurafenib- and Trametinib-resistant cell lines (Figure 7c and Supplementary Table 5). Finally, we tested the ability of MI-181 to inhibit melanoma colony formation using the M233 and M308 cell lines (both resistant to Vemurafenib). Indeed, MI-181 was a potent inhibitor of colony formation (percentage colony formation for 10 nM MI-181=0.2±0.1 and 0.8±0.7 for 10 nM colchicine=0.1±0.06 and 1.5±0.5 and for 10 nM Vemurafenib= 94±7 and 102±5) (Figure 7d). Thus, MI-181 is a potent inhibitor of melanoma cell lines.

MI-181 is a potent cancer cell division inhibitor, especially melanomas. (een, B) MI-181 is potent against a broad panel of cancer cell lines. Cervical adenocarcinoma (HeLa), breast adenocarcinoma (MCF7), melanoma (M233), osteosarcoma (U2OS), acute lymphoblastic leukemia (CCRF-CEM), non-small cell lung carcinoma (NCI-H460), and breast adenocarcinoma (MCF7) cells were treated with increasing concentrations of MI-181 (190pM-10 μM) for 72 h and their cell viability IC50 was assessed using the CellTiter-Glo assay. (c) A panel of melanoma cells were treated with increasing concentrations of MI-181 and the IC50 was determined for each cell line as described in een. B, BRAF V600E N, NRAS Q61L R, resistant S, sensitive Tram, Trametinib Vem,Vemurafenib W, wildtype. (NS) MI-181 inhibits melanoma colony formation. M233 and M308 melanoma cells were treated with DMSO, Vemurafenib (1 μM), colchicine (100 nM), or MI-181 (100 nM) for 7 days and the percent colony formation, normalized to DMSO, was quantified. Percent colony formation and standard deviation are indicated at the bottom of each panel for each drug and cell line


6.2: The Cell Cycle - Biology

Table 1: Cell renewal rates in different tissues of the human body. Values are rounded to one significant digit. Giving context through daily life replacement processes, we note that hair elongates at about 1 cm per month (BNID 109909) while fingernails grow at about 0.3 cm per month (BNID 109990), which is about the same speed as the continental spreading in plate tectonics that increases the distance between North America and Europe (BNID 110286).

The question of cell renewal is one that all of us have intuitive daily experience with. We all notice that our hair falls out regularly, yet we don’t get bald (at least not until males reach a certain age!). Similarly, we have all had the experience of cutting ourselves only to see how new cells replaced their damaged predecessors. And we donate blood or give blood samples without gradually draining our circulatory system. All of these examples point to a replacement rate of cells, that is characteristic of different tissues and in different conditions, but which makes it abundantly clear that for many cell types renewal is a part of their story. To be more concrete, our skin cells are known to constantly be shed and then renewed. Red blood cells make their repetitive journey through our bloodstream with a lifetime of about 4 months (BNID 107875, 102526). We can connect this lifetime to the fact calculated in the vignette on “How many cells are there in an organism?” that there are about 3吆 13 red blood cells to infer that about 100 million new red blood cells are being formed in our body every minute! Replacement of our cells also occurs in most of the other tissues in our body, though the cells in the lenses of our eyes and most neurons of our central nervous system are thought to be special counterexamples. A collection of the replacement rates of different cells in our body is given in Table 1.

Figure 1. Inferring tissue turnover time from natural stable isotope labeling. The global 14C Levels in the environment are shown in red. A large addition of 14C in 1955–1963 is the result of nuclear bomb tests. Cell age in different adult human organs is inferred from analysis of 14C levels in genomic DNA measured in 2003-4 from the cerebellum, occipital-cortex, and small intestine. Birth year of the individual is indicated by a vertical line. Stable isotope levels reveal the differing turnover rates of cells in different tissues. (Adapted from K. L. Spalding, et al., Cell, 122:133-143, 2005.)

How can the replacement rates of the cells in various tissues in our body be measured? For rapidly renewing tissues common labeling tricks can be useful as with the nucleotide analog BrdU. But what about the very slow tissues that take years or a lifetime? In a fascinating example of scientific serendipity, Cold War nuclear tests have come to the aid of scientists as a result of the fact that they changed the atmospheric concentrations of the isotope carbon-14 around the globe. These experiments are effectively pulse-chase experiments but at the global scale. Carbon-14 has a half-life of 5730 years, and thus even though radioactive, the fraction that decays within the lifetime of an individual is negligible and this timescale should not worry us. The “labeled” carbon in the atmosphere is turned into CO2 and later into our food through carbon fixation by plants. In our bodies, this carbon gets incorporated into the DNA of every nascent cell and the relative abundance of carbon-14 remains stable as the DNA is not replaced through the cell’s lifetime. By measuring the fraction of the isotope carbon-14 in a tissue it is possible to infer the year in which the DNA was replicated as depicted in Figure 1. The carbon-14 time course in the atmosphere initially spiked due to bomb tests and then subsequently decreased as it got absorbed in the much larger pools of organic matter on the continents and the inorganic pool in the ocean. As can be seen in Figure 1, the timescale for the exponential decay of the carbon-14 in the atmosphere is about 10 years. The measured dynamics of the atmospheric carbon-14 content is the basis for inferring the rates of tissue renewal in the human body and yielded insights into other obscure questions such as how long sea urchins live and the origins of coral reefs.

Using these dating methods, it was inferred that fat cells (adipocytes) replace at a rate of 8±6% per year (BNID 103455). This results in the replacement of half of the body’s adipocytes in ≈8 years. A surprise arrived when heart muscle cells were analyzed. The long held dogma in the cardiac biology community was that these cells do not replace themselves. This paradigm was in line with the implications of heart attacks where scar tissue is formed instead of healthy muscle cells. Yet it was found that replacement does occur albeit at a slow rate. Estimates vary from 0.5% per year (BNID 107076) to as high as 30% per year (BNID 107078) depending on age and gender (BNID 107077). A debate is currently taking place over the very different rates observed, but it is clear that this peculiar scientific side-effect of Cold War tensions is providing a fascinating window onto the interesting question of the life history of cells making up multicellular organisms.


Bekijk de video: Celcyclus: interfase G1-, S- en G2-fase en mitose M-fase (Januari- 2022).