Informatie

Horizontale genoverdracht van mensen


Het is bekend dat sommige virussen zich inbedden in het menselijk genoom. Is er een mechanisme waarmee menselijke genen kunnen worden overgedragen op andere dieren of planten door middel van virussen die ze van mensen naar andere organismen brengen?


Ja, horizontale genoverdracht (HGT) kan op beide manieren plaatsvinden, van prokaryoten naar eukaryoten en vice versa. Van eukaryoten tot prokaryoten HGT wordt tot nu toe minder aandacht besteed. Het heeft ook een zeer belangrijke rol gespeeld in de eukaryote evolutie. De volgende figuur uit (Patrick en Palmer 2008) toont enkele mogelijke gevallen in eukaryote fylogenie.

U kunt veel van dergelijke voorbeelden vinden in de bovenstaande referentie. Wat het menselijke deel betreft, zijn er enkele gevallen zoals Van mensen tot Plasmodium vivax en Van mens tot Neisseria gonorrhoeae, waar onderzoekers bewijs hebben aangetoond van HGT van mensen tot prokaryoten. Helaas is er heel weinig over het mechanisme waarmee ze worden overgedragen. Het is op dit moment een kwestie van speculatie, aangezien deze studies controversieel zijn.


Een inleiding en gesprek over de biologie en evolutie van SARS-CoV-2, het virus dat Covid-19 veroorzaakt

Er zijn veel woorden geschreven (of in ieder geval getypt) over het coronavirus SARS-CoV-2, het virus dat Covid-19 veroorzaakt. Maar hoewel zijn verhaal de nieuwscycli heeft gedomineerd en ons hele leven heeft veranderd, wordt er heel weinig gezegd over zijn biologie en, in het bijzonder, zijn evolutie. Het virus is een voorbeeld van de realtime gevolgen en dynamiek van snelle evolutie. Het evolueerde, opnieuw, in China en verspreidde zich van land tot land, en veranderde de wereld zoals het deed. Het heeft een kracht die veel groter is dan zijn omvang, een kracht die logischer is in het licht van de evolutionaire biologie.

Om wat meer context te bieden voor de huidige discussies over de gevolgen van het virus SARS-CoV-2, ging professor Toegepaste Ecologie Rob Dunn (RRD) om de tafel met Tom Gilbert (TG) van het Center for Evolutionary Hologenomics, Katia Koelle (KK) van Emory University, Julie Casani (JC), Matt Koci (MK) en David Rasmussen (DR) van NC State, en Sergios-Orestis Kolokotronis (SOK) van SUNY om over het virus te praten. Of liever gezegd, hij ging virtueel bij hen zitten en oefende goede fysieke afstandsoefeningen.

Het volgende gesprek weerspiegelt een reeks e-mails heen en weer tussen de deelnemers als antwoord op de vragen van Rob. Met dank aan Olivia Sanchez Dunn voor hulp bij het bewerken van de tekst voor de duidelijkheid.

voorwaarden vet en cursief zijn opgenomen in de woordenlijst aan het einde van het artikel.


Invoering

Horizontale genoverdracht (HGT) van antibioticaresistentiegenen, virulentiefactoren, toxines en genen die betrokken zijn bij stressrespons en metabolisme zijn alomtegenwoordig onder prokaryoten, vooral bacteriën 1 . HGT is zelfs meer wijdverspreid in de met de mens geassocieerde micro-organismen 2,3,4 vanwege de nauwe fysieke nabijheid en het toegenomen cel-tot-cel contact in het menselijk lichaam (bijv. biofilmvorming in de mondholte en het maagdarmkanaal). De fylogenetische structuur van microbiële gemeenschappen kan de HGT-waarschijnlijkheid 5 verder vergroten, aangezien wordt verwacht dat nauw verwante micro-organismen die vergelijkbare mobilomen delen 6 vergelijkbare habitats koloniseren. Nabijheid biedt mogelijkheden voor genetische uitwisseling die plaatsvindt via plasmide (conjugatie) en faag-gemedieerde genoverdrachtsmechanismen (transductie) en opname van exogeen DNA (transformatie) uit de omgeving. Hoe de korte afstand (dwz HGT's binnen een lichaamslocatie) en lange afstand genoverdrachten (dwz HGT's tussen lichaamslocaties) plaatsvinden in het menselijk lichaam in de context van ecologische, temporele, ruimtelijke en fylogenetische structuur van microbiële gemeenschappen zijn daarom van vitaal belang vragen om te begrijpen hoe de menselijke microbiota biochemische en genetische netwerken tot stand brengt die verantwoordelijk zijn voor het in stand houden van de fysiologie en gezondheid van de gastheer 2 .

Nauwkeurige detectie en classificatie van oude en recente HGT-gebeurtenissen blijft een grote rekenkundige en conceptuele uitdaging 7,8. Historisch gezien zijn sequentieovereenkomst en op samenstelling gebaseerde statistieken zoals GC-gehalte, oligonucleotidefrequentie en codongebruiksbias 9,10,11 gebruikt om horizontale en verticale evolutie te onderscheiden. Op samenstelling gebaseerde methoden werken echter slecht voor oude genoverdrachten 12,13 en geven vaak contrasterende resultaten wanneer de methoden worden gewijzigd 14 . Een recente studie implementeerde bijvoorbeeld een op BLAST gebaseerde methode om zeer vergelijkbare nucleotidegebieden (>99% identiteit in blokken van >500 bp) over ver verwante genomen (<97% 16S ribosomaal RNA-overeenkomst) te detecteren als bewijs van HGT2. De auteurs ontdekten dat genoverdrachten op lange afstand vaker plaatsvonden binnen het menselijk lichaam dan tussen de genomen van mens-geassocieerde en niet-menselijke omgevingen, wat suggereert dat ecologie de belangrijkste drijfveer was achter het verhogen van HGT 2 . Hoewel hun methode krachtig was, was deze beperkt tot de detectie van recente HGT-gebeurtenissen, aangezien statistisch detecteerbare sequentieovereenkomst in de loop van de evolutionaire tijd vervaagt 15 . Om oude HGT-gebeurtenissen bij verschillende prokaryotische soorten beter te detecteren, kunnen op fylogenie gebaseerde benaderingen van gen-species-boomreconstructie en verzoening een diepere resolutie bieden 16 .

Hier hebben we >80.000 gen- en soorten fylogenetische boomreconstructies en afstemmingen uitgevoerd om "kandidaat" HGT-gebeurtenissen te detecteren in 1.059 referentie-prokaryotische genomen waarvan de sequentie is bepaald op zes belangrijke lichaamslocaties van "gezonde" menselijke volwassenen die zijn bemonsterd door het NIH Human Microbiome Project (HMP) 17 ,18,19 . We gebruikten een aangepaste versie van de HGTree pijpleiding, een op fylogenie gebaseerde HGT-detectiemethode die eerder is ontwikkeld door Jeong et al. 16 . HGTree is gebaseerd op een expliciete evolutionaire methode die een combinatie implementeert van spaarzaamheid 20 , buurman-joining 21 en maximale waarschijnlijkheid (ML) 22 benaderingen om topologieën van genbomen te reconstrueren en te vergelijken met overeenkomstige 16S ribosomale RNA (rRNA) soorten (referentie) bomen (Fig. 1). Gen-species tree verzoeningen worden geëvalueerd onder een spaarzaam kader 20 waar kosten worden toegekend aan elk van de vier mogelijke gebeurtenissen die de evolutie van de genfamilie beschrijven (d.w.z. soortvorming, duplicatie, horizontale overdracht en verlies). Het doel is om de meest spaarzame verzoening van gensoorten-bomen te vinden die de totale kosten minimaliseert en om knopen te identificeren die worden gelabeld door overdrachten op de genbomen (zie Methoden) 20 . De gedetecteerde "kandidaat" HGT-gebeurtenissen samen met aanduidingen van donor- en ontvangergenomen worden opgeslagen in de online HGTree databank (afb. 1). De HGTree database (beschikbaar op http://hgtree.snu.ac.kr/) biedt daarom snelle toegang tot vooraf berekende HGT-gebeurtenissen in 2.472 genomen van prokaryotische soorten geïsoleerd uit diverse natuurlijke habitats (hierna: HGTree-genomen, Aanvullende tabel S1) en kan eenvoudig worden toegepast op door de gebruiker verstrekte genomische datasets (bijv. HMP-genomen, Aanvullende tabel S2).

HGT-detectieworkflow. Uit een grote pool van beschikbare genomen, waarvan de sequentie volledig is bepaald, worden niet-redundante genomen gefilterd en geselecteerd voor stroomafwaartse analyse. Vermeende orthologe genensets en overeenkomstige bomen van referentiesoorten worden vervolgens gereconstrueerd op basis van verschillende criteria (bijv. NJ, ML en andere benaderingen 16 ). Gensets worden 'vermeende' orthologen genoemd omdat ze worden onderworpen aan downstream-tests voor HGT-deelname. Elk boompaar van een gensoort wordt beoordeeld op topologische incongruentie (zie het donker gearceerde gebied in bomen). Boomconflicten kunnen het gevolg zijn van elk van de volgende evolutiegebeurtenissen van de genfamilie: (i) duplicatie, (ii) HGT, en (iii), genverlies, algemeen bekend als het duplicatie-transfer-loss (DTL)-probleem 20 . Uit de meest spaarzame verzoening (in termen van totale kosten van genfamilie-evolutiegebeurtenissen) 20 worden conflicten die voortkomen uit overdracht opgeslagen voor verdere analyse.

De licht gewijzigde versie van de HGTree-pijplijn implementeren om HMP-genomen (zie Methoden), zagen we dat HGT-activiteit significant toenam voor elk gen dat horizontaal werd uitgewisseld door de HMP-genomen in verhouding tot HGTree-genomen en dat meer dan de helft van de totale genen in HMP-genomen zijn overgedragen (geschonken of ontvangen) door HGT. We ontdekten dat ongeveer 40% van de totale gedetecteerde HGT-gebeurtenissen plaatsvonden onder micro-organismen die dezelfde niche of lichaamslocatie delen (d.w.z. vanwege ecologische gelijkenis en fysieke nabijheid) en HGT-activiteit werd sterk beïnvloed door de fylogenetische diversiteit van het ecosysteem. De overige HGT-gebeurtenissen (

60%) duidde ofwel op de overdracht van DNA van de ene lichaamsplaats naar de andere door tot nu toe slecht begrepen mechanismen, ofwel voorafgegaan door microbiële kolonisatie van het menselijk lichaam. We identificeerden ook verschillende kerngenen die algemeen werden gedeeld door micro-organismen en evalueerden hun HGT-gevoeligheid (neiging om deel te nemen aan HGT). We ontdekten dat verschillende van de bekende fylogenetische markers (bijv. Ribosomale eiwitten, transcriptiefactoren) zeer gevoelig waren voor HGT, waardoor hun brede gebruik in op concatenatie gebaseerde fylogenieën in twijfel werd getrokken. Ten slotte belichten we verschillende uitdagingen bij de grootschalige implementatie van op fylogenie gebaseerde HGT-detectiemethoden en suggereren we verschillende strategieën om hun bruikbaarheid in continu opkomende microbioom- en (meta)-genoomdatasets te verbeteren.


Directe impact van overdrachten in menselijke microbiomen

Mensen leven, net als andere dieren, in nauwe interactie met een groot aantal micro-organismen (voornamelijk bacteriën en archaea) die de verschillende microbiomen vormen die verband houden met de verschillende organen en systemen (darm, huid, genitaal, enz.). Deze associaties tussen sommige microben en mensen bieden de laatste een efficiënte bescherming tegen andere pathogene microben en kunnen, zoals in het geval van het darmmicrobioom, samenwerken met voedselverwerking via de darm. In de afgelopen jaren hebben verschillende onderzoeken ook aangetoond dat veranderingen in het darmmicrobioom in verband kunnen worden gebracht met belangrijke neurodegeneratieve ziekten [22, 23].

Microbiomen zijn gemeenschappen van organismen waar genoverdracht tussen verschillende prokaryoten kan worden vergemakkelijkt door het delen van habitats [24, 25]. Bovendien kunnen fysisch-chemische factoren in een situatie van gastheerstress de uitwisseling van genetisch materiaal door verschillende mechanismen bevorderen, met name in de menselijke darm, waar veranderingen in pH en mechanische en hydrostatische druk kansen bieden die de afbraak van celintegriteit bevorderen [26, 27] . Dit idee wordt ondersteund door genomische studies die aantonen dat menselijke en dierlijke microbiomen hotspots zijn voor HGT waarvan we de gevolgen nog maar net beginnen te kennen [25, 28, 29].

In dit opzicht kan genoverdracht tussen bacteriën of archaea die in een bepaald microbioom wonen of tussen deze en incidentele micro-organismen (zoals ingenomen bacteriën die verband houden met voedsel in het darmmicrobioom) gevolgen hebben voor de gastheer. Omgekeerd kan de levensstijl van de gastheer gevolgen hebben voor de bijbehorende microbiomen die hun samenstelling veranderen of de uitwisseling van genen tussen residente en occasionele micro-organismen mogelijk maken [26, 27, 30] (Fig. 2).

Een goed voorbeeld hiervan is de verwerving van genen van mariene bacteriën die het metabolisme mogelijk maken van porfyran en andere polysacchariden die aanwezig zijn in zeewieren door bacteriën in het darmmicrobioom van Japanse mensen. De verwerving van porfyranase, agarase en verwante genen door Bacteroides plebius, een bacterie die aanwezig is in het darmmicrobioom van sommige Japanse individuen van occasionele mariene bacteriën is gedocumenteerd [31]. Verworven genen maken de vertering mogelijk van koolhydraten die aanwezig zijn in zeewieren die een belangrijk deel uitmaken van de dagelijkse voeding in deze menselijke populatie. Onlangs heeft Mathieu et al. [32] hebben de oude verwerving gepostuleerd van alginaat (het belangrijkste polysacharide in de celwand van bruine algen) metabolismegenen afkomstig van mariene Bacteroidetes door bacteriën van het menselijke darmmicrobioom. Ondanks dat in dit geval de acquisitie niet beperkt is tot Japanse mensen, suggereren auteurs een soortgelijk scenario van acquisitie via consumptie van zeealgen geassocieerd met incidentele mariene bacteriën.

Deze voorbeelden onderstrepen de mogelijke impact van het dieet als bron van occasionele microben op de menselijke gezondheid en fysiologie. Probiotica, kazen en andere zuivelproducten zijn rijk aan micro-organismen die kunnen deelnemen aan genetische uitwisselingsprocessen met in het darmmicrobioom aanwezige organismen [26]. In die zin benadrukt het feit dat de kaas- en zuivelindustrie hotspots zijn voor genetische uitwisseling [33] de mogelijke impact van voedsel op het menselijke darmmicrobioom.

Een belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden, is de mogelijkheid dat pathogene microben genen die verband houden met pathogeniteit kunnen uitwisselen met aanwezige componenten van menselijke microbiomen die voorheen onschadelijk waren. Echter, ondanks in vitro horizontale overdracht van pathogeniteitsdeterminanten is gedocumenteerd [34] en de rol ervan in de evolutie van pathogene bacteriën die de menselijke darm bewonen, zoals Helicobacter pylori, is gesuggereerd [35, 36] , voor zover wij weten, niet één duidelijk geval van ter plaatse transformatie van onschadelijke naar pathogene bacteriën in menselijke of dierlijke microbiomen is gemeld.

In dezelfde geest zorgt de contrasterende aanwezigheid van meerdere antibioticaresistentiegenen in het menselijke darmmicrobioom ervoor dat dit microbioom wordt beschouwd als een optimaal milieu voor de verspreiding van antibioticaresistentiegenen [37, 38], zowel tussen residente als tussen residente en occasionele microben, bijdragen aan de intensivering van het probleem van de verspreiding van antibioticaresistentie, dat tegenwoordig een ernstige bedreiging vormt voor het gebruik van antibiotica als klinisch hulpmiddel. Een recente en elegante studie [39], gebaseerd op de vergelijking van driedimensionale structuren, toont echter aan dat de meeste resistentiedeterminanten van het menselijke intestinale resistoom zich in bacteriële chromosomen bevinden en dat ze niet geassocieerd zijn met mobilisatie-elementen zoals transposasen, conjugatieve elementen of integronen , wat suggereert dat overdracht van deze resistentiegenen tussen soorten, inclusief opportunistische pathogenen, zeldzaam is. Dit komt overeen met het lage aantal overdrachtsgebeurtenissen van intestinale commensalen naar pathogene bacteriën die tot nu toe zijn waargenomen [40, 41].

Naast klassieke antibiotica zijn antimicrobiële peptiden (AMP's) geproduceerd door het slijmvlies van de gastheer belangrijke componenten van de aangeboren immuunrespons van meercellige organismen. In die zin zou de mogelijke mobilisatie van resistentiegenen tegen deze AMP's voor opportunistische pathogenen deze aangeboren reactie ernstig in gevaar kunnen brengen. Bovendien zijn AMP's van bacteriële oorsprong onlangs opnieuw in de klinische praktijk geïntroduceerd als 'laatste redmiddel' voor de bestrijding van multiresistente infecties. Mobilisatie van resistentiedeterminanten tegen deze AMP's zou een ernstige bedreiging kunnen vormen voor het gebruik van deze peptiden als 'laatste redmiddel'-wapens.

Een ander recent onderzoek waarin antibioticaresistentiegenen en AMP-resistentiegenen [42] worden vergeleken, toont aan dat AMP-resistentiegenen zelfs minder vatbaar zijn voor mobilisatie dan antibioticaresistentiegenen in het menselijke darmmicrobioom: Escherichia coli van AMP-resistentiegenen van fylogenetische verre bacteriën toont aan dat ze slechts een beperkt potentieel hebben om resistentie te verlenen, wat suggereert dat er fylogenetische barrières zijn voor horizontale overdracht van deze AMP-resistentiegenen die waarschijnlijk verband houden met de verschillende genetische achtergrond van donoren en ontvangers.

Deze resultaten nemen echter niet de dreiging weg die incidentele mobilisatie van AMP's-resistentiegenen of antibioticaresistentiegenen met zich meebrengt voor het gebruik van deze middelen in de menselijke gezondheidszorg, omdat recente mobilisatie en verspreiding van resistentiegenen tegen het van bacteriën afgeleide AMP-colistine is gemeld [43] , 44].

De ontwikkeling van nieuwe bio-informatische hulpmiddelen die de identificatie van HGT op gemeenschapsniveau mogelijk maken zonder de vereiste van referentiegenomen en om de richting van de overdrachtsstroom te volgen, zoals MetaCHIP [45], biedt nieuwe mogelijkheden om de impact van HGT in menselijke microbiomen te begrijpen.

Een ander belangrijk aspect dat moet worden overwogen, is de mogelijke overdracht van genetisch materiaal van bacteriën naar menselijke somatische cellen en de betrokkenheid ervan bij menselijke ziekten. In die zin is onthuld dat sommige menselijke getransformeerde somatische cellen, zoals acute myeloïde leukemiecellen of maagadenocarcinoomcellen sequenties lijken te bevatten die afkomstig zijn van bacteriën die zich in het menselijke microbioom bevinden [46, 47]. Deze studies openen een nieuwe poort om de mogelijke relatie tussen HGT en kanker te onderzoeken.


Oorzaken (bemiddelaars) van HGT

HGT-mechanismen in prokaryoten

In de natuur zijn transformatie, transductie en conjugatie de belangrijkste mechanismen van HGT. Andere mechanismen omvatten genoverdrachtsmiddelen (GTA's), nanobuisjes en membraanblaasjes (MV's) [die ook extracellulaire blaasjes (EV's) of exosomen worden genoemd] (Figuur 1 Dauros Singorenko et al., 2017 Hong et al., 2019). Dienovereenkomstig kan de productie van recombinant DNA worden bereikt door DNA of RNA van een donor direct te transformeren en vervolgens vreemd genetisch materiaal te integreren in het genoom van de ontvangende cel. Dit fenomeen vindt plaats in een grote verscheidenheid aan bacteriën en is verantwoordelijk voor de overdracht van mobiele genetische elementen (MGE's) zoals transposons, integrons en/of gencassettes tussen bacteriesoorten.

Ondertussen worden integrons, als natuurlijke kloneringssystemen en genexpressievectoren, gebruikt als een onafhankelijk mechanisme voor genoverdracht tussen veel bacteriële genomen, waardoor ontvangers de antibioticaresistente gencassettes kunnen verwerven, dragen en tot expressie brengen (Gillings, 2014). Van belang is dat horizontale integronoverdracht bekend staat als de belangrijkste manier voor verspreiding en diffusie van antibioticaresistentiegenen (ARG's) tussen bacteriestammen. Bovendien bevordert het vermogen van selectieve overdracht van resistente genen de evolutie van het bacteriegenoom om aanpassing aan veranderingen in de omgeving mogelijk te maken (Mazel, 2006 Engelstํter et al., 2016).

Evenzo vindt transductie plaats wanneer de bacteriofaag een deel van de bacteriële genetische informatie van een bacterie naar een andere bacterie draagt. Tijdens het conjugatieproces wordt een volledige DNA-sequentie, bijv. een plasmide, overgedragen tussen bacteriële cellen via directe cel-naar-cel verbinding door pilus te conjugeren, wat bewezen is een efficiënt proces te zijn voor de overdracht van genetisch materiaal (Lang et al. al., 2012).

Genoverdrachtsmiddelen zijn bacteriofaagachtige deeltjes die bekend staan ​​als natuurlijke vectoren. Genuitwisseling via GTA werd voor het eerst aangetoond in de paarse niet-zwavelbacteriën Rhodobacter. Sommige bacteriën produceren GTA's om willekeurige delen van het DNA van de gastheerbacterie naar een receptorcel te transporteren. Genoverdracht door nanobuisjes en exosomen zijn de nieuw gespotte mediatoren van HGT, waarbij de overdracht van genetisch materiaal verder gaat dan DNA (Bronkhorst et al., 2019).

Intercellulaire nanobuisjes van eindige grootte die zijn samengesteld uit bacterieachtige membranen kunnen aangrenzende cellen overbruggen om gemakkelijk intracellulaire moleculen uit te wisselen, waaronder metabolieten, eiwitten, mRNA en plasmide-DNA. Het overdrachtsmechanisme omvat het genereren van een netwerk van buisvormige leidingen, waardoor de overdracht van de cytoplasmatische inhoud mogelijk wordt (Ficht, 2011). Het is aangetoond dat MV's, als dubbellaagse structuren, biomoleculen tussen bacteriën overbrengen in een beschermde vorm, dus de kans op succesvolle genoverdracht is groot (Dubey en Ben-Yehuda, 2011 Brimacombe et al., 2015 Soucy et al., 2015 Shin et al. al., 2016 Domingues en Nielsen, 2017).

HGT-mechanismen in eukaryoten

Horizontale genoverdracht vindt op verschillende manieren plaats in meercellige organismen. In planten kan HGT bijvoorbeeld werken via natuurlijke factoren, zoals gastheer-parasietverbinding. De parasiet werkt als een vector die mitochondriale genen overdraagt ​​tussen twee verschillende plantensoorten. Epifyten en parasieten kunnen zelfs genetische veranderingen veroorzaken wanneer ze DNA tussen planten overbrengen (Richardson en Palmer, 2006).

Horizontale genoverdracht via transposons is een veel voorkomende methode bij zowel planten als dieren die genetisch materiaal delen. De overdracht van transposons tussen rijst- en gierstplantensoorten is een van de duidelijkste voorbeelden van genetische uitwisselingen die worden gemedieerd door transposons, die ook bekend staan ​​als springgenen of egoïstisch DNA (El Baidouri et al., 2014).

Andere nieuw opgekomen mediatoren van HGT in eukaryoten met klinische implicaties zijn exosomen, apoptotische lichamen en cfDNA, die in de volgende paragrafen zullen worden besproken.


Discussie

Dit werk beschrijft de drie belangrijkste methoden om de HGT van genetische determinanten te bestuderen in S. aureus. Hoewel transductie en conjugatie al tientallen jaren worden bestudeerd, werd het bestaan ​​van natuurlijke transformatie pas recentelijk erkend . Dus, S. aureus is uitgerust met alle drie de belangrijkste vormen van HGT, en het is nodig om ze allemaal te testen om de mogelijke verspreidingsroutes van genetische determinanten te verduidelijken. Het doel van dit werk is om volledige protocollen samen te stellen en praktische informatie te verschaffen over de methodologieën die in een eerder gepubliceerd werk werden gebruikt7. Hoewel conjugatie- en transductieprotocollen beschikbaar zijn, is dit het eerste artikel waarin een gedetailleerd transformatieprotocol wordt beschreven.

Conjugatie met behulp van de filter-paringsmethode is een eenvoudige techniek en kan worden toegepast op de studie van conjugatieve overdracht in verschillende bacteriesoorten7,10. Door gebruik te maken van de gestandaardiseerde inocula bereiken de ontvangertellingen na 18-24 uur een waarde van

10 9 KVE/ml. Het aantal transconjuganten is variabel en de waarden laten een sterke afhankelijkheid van stam tot stam zien, maar typisch werd een transconjugantbereik van 102 tot 105 verkregen wanneer de conjugatieresultaten positief waren. Met behulp van het hier verstrekte protocol was de bereikte detectielimiet 㰐 transconjuganten/ml. Deze grens kan worden geoptimaliseerd door de filtersuspensie te concentreren.

Het hier beschreven natuurlijke transformatieprotocol is opgesteld in S. aureus N315-afgeleide stammen. Het gebruik van CS2-medium is van cruciaal belang voor transformatie, aangezien de transformatie niet detecteerbaar is in andere standaard laboratoriummedia, zoals TSB en BHI13.

Het gebruik van langdurig opgeslagen plasmiden (bijv. pT181 en pHY300) als donor resulteerde in een ongeveer 10- tot 50-voudige verminderde frequentie (gegevens niet getoond), wat suggereert dat de DNA-kwaliteit de transformatiefrequentie zou kunnen beïnvloeden. Het is bekend dat nicked plasmiden niet geschikt zijn voor natuurlijke transformatie in B. subtilis16.

DNA verkregen van beide S. aureus en E coli kan worden gebruikt als de donor in natuurlijke transformatie-assays, wat suggereert dat een restrictiebarrière de natuurlijke transformatie niet remt. We hebben ook dezelfde transformatiefrequentie waargenomen tussen het DNA dat is bereid uit E coli HST04 (dam - /dcm - ) zonder de DNA-methylase-genen en van JM109, wat het idee ondersteunt dat de methyleringsstatus de transformatiefrequentie niet beïnvloedt.

Opgemerkt moet worden dat de transformatiefrequentie die werd gedetecteerd met behulp van dit protocol laag was (

10 -9 -10 -10), en de transformeerbare stammen zijn beperkt tot N315-derivaten2. Het is waarschijnlijk dat de transformatie-efficiëntie in S. aureus kan stamspecifiek zijn, zoals ook is gemeld bij andere transformeerbare bacteriën15,16,17. Verdere studies zijn aan de gang om de transformatie-efficiëntie te verbeteren, dit zal elders worden beschreven.

Faagtransductie lijkt het meest voorkomende HGT-mechanisme te zijn in S. aureus omdat de meeste S. aureus isolaten worden gelysogeniseerd door bacteriofagen18. Het infectievermogen van de transducerende faag hangt af van de gevoeligheid van de gastheer en moet worden gecontroleerd door middel van plaque-assay. Een andere beperking van faagtransductie is de grootte van het DNA. Klein DNA kan efficiënt worden overgebracht, maar DNA-fragmenten groter dan 45 kb kunnen niet worden verpakt in de stafylokokkenfaagkop19. Er is echter onlangs een nieuwe gigantische stafylokokkenfaag geïsoleerd uit de omgeving en het is mogelijk dat deze grotere DNA-fragmenten kan overbrengen .

De plaque-assaymethode die in dit werk wordt beschreven, is eenvoudiger dan het conventionele protocol, waarbij top-agar wordt gebruikt. De huidige methode vereist echter dat de bacteriële cellen gelijkmatig worden verspreid om kleine plaques op het oppervlak te detecteren. Om een ​​volledig gelijkmatige verspreiding te bereiken, raden we aan om voldoende volume van de bacteriesuspensie op het agar-oppervlak te verspreiden en te stoppen wanneer de vloeistof het agar-oppervlak gelijkmatig bedekt. Droog de platen vervolgens in luchtstroom in een schone bank. Als het nodig is om de lysogenisatie van de transducerende faag te vermijden, wordt een lage multipliciteit van infectie aanbevolen (de MOI mag niet hoger zijn dan 1). Gelysogeniseerde cellen kunnen worden onderscheiden door hun verminderde gevoeligheid voor fagen in de plaque-assay.


HGT in biofilms: mogelijke toepasbaarheid op de menselijke darm

Biofilmvorming vertegenwoordigt een van de belangrijkste bacteriële basisstrategieën voor groei en overleving in de natuur en bij ziekte (70). Biofilms zijn gemeenschappen van microben ingebed in matrices die zijn samengesteld uit extracellulaire polymere stoffen, en ze waren betrokken bij zowel de gezonde als de ziektetoestand van de gastheer. Biofilmhabitats komen veel voor in veel biologische ecosystemen. De meerderheid van de microbiota die in natuurlijke, klinische en industriële omgevingen wordt aangetroffen, blijft bestaan ​​​​in associatie met oppervlakken en niet in de planktonische toestand. Ze worden meestal aangetroffen in veel ecosystemen, waaronder de tanden van mensen en dieren, en in het darmlumen (71).

Het immuunsysteem herkent veel verschillende bacteriële patronen, maar deze componenten kunnen worden gecamoufleerd in de biofilm-modus van het leven. Overgang van de plankton- naar de biofilm-geassocieerde toestand induceert bacteriële productie van kleine moleculen, die ontstekingen kunnen verhogen, celdood en necrose kunnen induceren en mogelijk de posttranslationele modificatie van meer dan één eiwit naar immunogene kunnen versterken, waardoor ongewenste immuunreacties worden uitgelokt (72, 73). Terwijl planktonische cellen gemakkelijk worden gewist, zijn cellen in biofilms veel minder vatbaar voor klaring door neutrofielen en macrofagen. Bovendien wordt in de aanwezigheid van deze gastheercellen de vorming van biofilms versterkt en kunnen de componenten van het immuunsysteem van de gastheer worden opgenomen in de extracellulaire polymere substantiematrix (71). Met name de vorming van biofilms in de darmen wordt vergemakkelijkt door humane secretoire immunoglobuline A-moleculen (74). En de biofilmomgeving staat bekend om de HGT-bevorderende eigenschappen (5).

Coöperatieve fenotypen zijn belangrijk voor het functioneren van bacteriële gemeenschappen in veel contexten, waaronder syntrofie, koppeling via quorum sensing, biofilmvorming, uitwisseling van antibioticaresistentie en voortgang van polymicrobiële infecties. De menselijke darm herbergt een dichte en diverse microbiële populatie die van cruciaal belang is voor de gezondheid, maar de samenwerking binnen dit belangrijke ecosysteem, dat zich tijdens een lang co-evolutionair proces heeft ontwikkeld, wordt slecht begrepen (75). Op basis van het bovengenoemde wederzijdse, bidirectionele, coöperatieve en verfijnde evenwicht tussen ons en de microbiota kunnen verschillende vragen rijzen, zoals of er een risico is verbonden aan verstoring van dit evenwicht, of dat probiotica en het gebruik van recombinante enzymen in voedingsmiddelen kunnen HGT in de menselijke darm beïnvloeden, of, als het gewijzigde microbiële/microbiële productprofiel de menselijke gezondheid kan beïnvloeden.


Horizontale genoverdracht van mensen - Biologie

Mensen verwerpen genetisch gemodificeerde organismen als voedsel (GGO's) om verschillende redenen, maar de meest genoemde reden is de valse overtuiging dat ze ongezond zijn. Die specifieke overtuiging vertegenwoordigt ook de grootste kloof tussen de mening van wetenschappers en het grote publiek in een Pew-peiling van 2015, groter dan evolutie, klimaatverandering of vaccinveiligheid.

De reden voor deze ontkoppeling is dat het publiek op hun intuïtie vertrouwt, in plaats van op wetenschappelijke kennis, om tot hun conclusie te komen. Verder is die intuïtie gekaapt door een opzettelijke anti-ggo-campagne, georkestreerd door misleide milieuactivisten en door de biologische voedsellobby om hun merk te helpen promoten.

Zoals Stefaan Blancke en zijn co-auteurs in bovenstaand artikel beweren:

Deze intuïtieve redenering omvat volksbiologie, teleologische en opzettelijke intuïties en walging.

Een van de belangrijkste 'folkbiologie'-pratises van de anti-ggo-menigte is dat het 'onnatuurlijk' is om genen van de ene soort in een verre soort te plaatsen. Er wordt geen verdere redenering gegeven om dit standpunt te verdedigen, alleen het aanroepen van wat 'natuurlijk' is, lijkt voldoende. Degenen die het wetenschappelijke standpunt verdedigen, wijzen er vaak op dat dit irrelevant is, slechts een manifestatie van het beroep op de natuur drogreden. Of iets in de natuur voorkomt of niet, bepaalt niet of het goed of slecht is voor de menselijke gezondheid.

In feite hebben de meeste planten toxines en vergiften ontwikkeld die specifiek schadelijk zijn voor dieren en dingen die ze zouden opeten. Mensen hebben het aantal planten dat ze kunnen eten enorm uitgebreid door die planten kunstmatig en drastisch te veranderen, natuurlijke gifstoffen te verminderen en de smaak en voedingswaarde te verbeteren.

De anti-ggo-menigte verwerpt dat argument echter en zegt dat er een verschil is tussen het langzaam veranderen van een plant in de loop van de tijd door middel van veredeling en teelt versus het snel veranderen van een plant door directe genetische manipulatie. Maar nogmaals, ze beroepen zich alleen op hun intuïtie, en niet op een specifieke wetenschappelijke realiteit.

Horizontale genoverdracht

Er is nog een, even fatale, fout in het argument dat GGO's “onnatuurlijk” zijn omdat verre soorten geen genen uitwisselen in de natuur -8211 dat is verkeerd. Biologen noemen de overdracht van genen van ouder op kind verticale genoverdracht. Evenzo wordt de overdracht van genen van het ene organisme naar het andere, niet via afstamming, horizontale genoverdracht genoemd.

Genetische modificatie is gewoon een techniek om gerichte horizontale genoverdracht tot stand te brengen, maar een dergelijke uitwisseling van genetisch materiaal vindt voortdurend plaats in de natuur, zonder enige menselijke tussenkomst, en zelfs tussen koninkrijken.

Dit kan deels gebeuren omdat een ander stukje anti-ggo volksbiologie ook helemaal verkeerd is. De beruchte “fishmato” roept bij sommigen walging op vanwege hun valse intuïtie dat visgenen niet in tomaten thuishoren. In feite geloofde 40% van de ondervraagde Amerikanen dat een tomaat die is gemodificeerd met een visgen, visachtig zou smaken. (Ondertussen dacht 22% van de Canadezen in een ander onderzoek dat ze visachtig zouden smaken, maar 30% in datzelfde onderzoek dacht niet dat gewone tomaten genen hebben.)

De wetenschappelijke realiteit is heel anders. Er bestaat in feite niet zoiets als een 'visgen'. Natuurlijk hebben vissen genen, maar hun genen zijn hetzelfde als elk ander gen. Elk levend organisme op aarde deelt dezelfde genetische structuur, machinerie en genetische code. We delen ook een evolutionaire geschiedenis. Vis en tomaten delen al zo'n 60% van hun genen (afhankelijk van hoe je het telt, maar dat is een redelijke schatting). Jij en tomaten delen ongeveer 60% van je genen.

Er is niets inherent "visachtig" aan de genen in vissen, en het overbrengen van een "visgen" in een plant zal er geen visachtige essentie mee overbrengen. Het zal eenvoudig het eiwit overdragen waarvoor dat gen codeert.

Als een duidelijke demonstratie dat genen gemakkelijk kunnen worden uitgewisseld tussen verschillende soorten (soorten die niet kunnen broeden) en zelfs tussen koninkrijken, zijn er veel voorbeelden uit de natuur. In feite heeft elke soort genetisch materiaal dat ze in hun evolutionaire geschiedenis hebben verkregen door horizontale genoverdracht. But here are some examples of functional genes acquired this way.

Viruses that infect bacteria often “steal” genes from those bacteria, but a recent study shows that one such virus, that infects bacteria that live in insects and spiders, acquired genes from a black widow spider for a poison that enables it to punch through cell walls.

Another recent study demonstrates that an amoeba, Paulinella, which is photosynthetic, took genes from engulfed bacteria to replace broken genes that it needed. Specifically, Paulinella has an endosymbiotic organelle that does the photosynthesis (it had previously engulfed a photosynthetic bacteria about 100 million years ago). There is a tendency for endosymbiotic organisms to lose function over time as their genes succumb to random mutations, since they are isolated from their free-living cousins. Paulinella solved this problem by engulfing other bacteria and taking their genes to replace the broken genes in their photosynthetic organelles.

“The major finding of the study is the microbial world, which we know is full of valuable genes, can move these genes between organisms according to need,” said Debashish Bhattacharya, a study co-author and distinguished professor in the Department of Ecology, Evolution and Natural Resources at Rutgers. “When a microbe has a gene deficit, it can in some cases fill that deficit by grabbing the same gene from the environment. This shows how fluid microbial genomes really are.”

Genes are more fluid in the microbial world, but they are also fluid in the macro world as well. Sweet potatoes have been found to have a gene acquired from soil bacteria about 8,000 years ago. All domestic sweet potato varieties examined to date have the bacterial genes, which likely helped the plants develop their enlarged and edible roots.

Bacteria are a different kingdom of life from plants. You cannot get more evolutionary distance than that. And yet the bacteria gene, transferred by nature without any human intervention, works just fine in the plant.

Our intuitions about nature do not seem to be accurate. This is broadly true – science has largely been the practice of disproving our intuitions about reality.

Our intuition tells us that species are very specific things unto themselves. Pre-evolutionary biologists certainly accepted this without question. That is why our creation myths talk about creating creatures each according to its own “kind.”

The reality is that species are fuzzy, they blend into each other. Life is messy, and all living things are related to each other. We also swap genes all the time.

Human, for whatever reason, evolved strong emotions and intuitions surrounding food. We tend, in fact, to be neurotic about food. This probably had an advantage when we had to find food in a hostile world of mostly poison. Now it leads to some strange behaviors, like the obsession of many children with keeping their food segregated on their plate.

The emotion of disgust is clearly adaptive, but emotions are blunt instruments. We like our food to be pure and pristine, uncontaminated, and wholesome. This is reasonable, but the problem comes when we try to operationally define what we mean by these things.

The “clean eating” and “natural” eating movement is largely based on a misapplication of the clumsy emotion of disgust and our inaccurate intuitions about nature. Putting a gene from one kingdom into another is not unnatural, and being natural does not mean anything anyway. Genes are being swapped all over the place. Genes do not contain the “essence” of the “species” to which they belong. Genes are just tools, they are instructions for assembling amino acids into proteins. Genes are promiscuous tools – they don’t care who they work for.


Horizontal gene transfer from humans - Biology

Horizontal Gene Transfer The Hidden Hazards of Genetic Engineering

Mae-Wan Ho - Institute of Science in Society and Department of Biological Sciences,
Open University, Walton Hall, Milton Keynes, MK7 6AA, UK

A version of this paper will appear on the website of SCOPE - a NSF-funded research project involving Science Journal and groups
at the University of California at Berkeley and the University of Washington in Seattle.

Genetic engineering involves designing artificial constructs to cross species barriers and to invade genomes. In other words, it
enhances horizontal gene transfer the direct transfer of genetic material to unrelated species. The artificial constructs or transgenic
DNA typically contain genetic material from bacteria, viruses and other genetic parasites that cause diseases as well as antibiotic
resistance genes that make infectious diseases untreatable. Horizontal transfer of transgenic DNA has the potential, among other
things, to create new viruses and bacteria that cause diseases and spread drug and antibiotic resistance genes among pathogens.
There is an urgent need to establish effective regulatory oversight to prevent the escape and release of these dangerous constructs into
the environment, and to consider whether some of the most dangerous experiments should be allowed to continue at all.

Key words: antibiotic resistance genes, dormant viruses, CaMV promoter, cancer, naked DNA, transgenic DNA,

Transgenic pollen and baby bees

Prof. Hans-Hinrich Kaatz from the University of Jena, is reported to have new evidence, as yet unpublished, that genes engineered
into transgenic plants have transferred via pollen to bacteria and yeasts living in the gut of bee larvae(1).

If Prof. Kaatz claim can be substantiated, it indicates that the new genes and gene-constructs introduced into transgenic crops and
other transgenic organisms can spread, not just by ordinary cross-pollination or cross-breeding to closely related species, but by the
genes and gene-constructs invading the genomes (the totality of the organisms own genetic material) of completely unrelated species,
including the microorganisms living in the gut of animals eating transgenic material.

This finding is not unexpected. Some scientists have been drawing attention to this possibility recently(2), but the warnings actually
date back to the mid-1970s when genetic engineering began. Hundreds of scientists around the world are now demanding a
moratorium on all environmental releases of transgenic organisms on grounds of safety(3), and horizontal gene transfer is one of the
major considerations.

Some of us have argued that the hazards of horizontal gene transfer to unrelated species are inherent to genetic engineering(4). De
genes and gene-constructs created in genetic engineering have never existed in billions of years of evolution. They consist of genetic
material originating from bacteria, viruses and other genetic parasites that cause diseases and spread drug and antibiotic resistance
genen. They are designed to cross all species barriers and to invade genomes. The spread of such genes and gene-constructs have the
potential to make infectious diseases untreatable and to create new viruses and bacteria that cause diseases.

Horizontal gene transfer may spread transgenes to the entire biosphere

Horizontal gene transfer is the transfer of genetic material between cells or genomes belonging to unrelated species, by processes
other than usual reproduction. In the usual process of reproduction, genes are transferred vertically from parent to offspring and
such a process can occur only within a species or between closely related species.

Bacteria have been known to exchange genes across species barriers in nature. There are three ways in which this is accomplished. In
conjugation, genetic material is passed between cells in contact in transduction, genetic material is carried from one cell to another
by infectious viruses and in transformation, the genetic material is taken up directly by the cell from its environment. For horizontal
gene transfer to be successful, the foreign genetic material must become integrated into the cell s genome, or become stably
maintained in the recipient cell in some other form. In most cases, foreign genetic material that enters a cell by accident, especially if it
is from another species, will be broken down before it can incorporate into the genome. Under certain ecological conditions which are
still poorly understood, foreign genetic material escapes being broken down and become incorporated in the genome. Bijvoorbeeld,
heat shock and pollutants such as heavy metals can favor horizontal gene transfer and the presence of antibiotics can increase the
frequency of horizontal gene transfer 10 to 10 000 fold(5).

While horizontal gene transfer is well-known among bacteria, it is only within the past 10 years that its occurrence has become
recognized among higher plants and animals(6). The scope for horizontal gene transfer is essentially the entire biosphere, with bacteria
and viruses serving both as intermediaries for gene trafficking and as reservoirs for gene multiplication and recombination (the process
of making new combinations of genetic material (7)).

There are many potential routes for horizontal gene transfer to plants and animals. Transduction is expected to be a main route as
there are many viruses which infect plants and animals. Recent research in gene therapy indicates that transformation is potentially very
important for cells of mammals including human beings. A great variety of naked genetic material are readily taken up by all kinds of
cells, simply as the result of being applied in solution to the eye, or rubbed into the skin, injected, inhaled or swallowed. In many
cases, the foreign gene constructs become incorporated into the genome(8).

Direct transformation may not be as important for plant cells, which generally have a protective cell wall. But soil bacteria belonging to
the genus Agrobacterium are able to transfer the T (tumour) segment of its Tumour-inducing (Ti) plasmid (see below) into plant cells
in a process resembling conjugation. This T-DNA is widely exploited as a gene transfer vehicle in plant genetic engineering (see
onderstaand). Foreign genetic material can also be introduced into plant and animal cells by insects and arthropods with sharp mouthparts.
In addition, bacterial pathogens which enter plant and animal cells may take up foreign genetic material and carry it into the cells, thus
serving vectors for horizontal gene transfer(9). There are almost no barriers preventing the entry of foreign genetic material into the
cells of probably any species on earth. The most important barriers to horizontal gene transfer operate after the foreign genetic
material has entered the cell(10).

Most foreign genetic material, such as those present in ordinary food, will be broken down to generate energy and building-blocks for
growth and repair. There are many enzymes which break down foreign genetic material and in the event that the foreign genetic
material is incorporated into the genome, chemical modification can still put it out of action and eliminate it.

However, viruses and other genetic parasites such as plasmids and transposons, have special genetic signals and probably overall
structure to escape being broken down. A virus consists of genetic material generally wrapped in a protein coat. It sheds its overcoat
on entering a cell and can either hi-jack the cell to make many more copies of itself, or it can jump directly into the cell s genome.
Plasmids are pieces of free , usually circular, genetic material that can be indefinitely maintained in the cell separately from the cell s
genoom. Transposons, or jumping genes , are blocks of genetic material which have the ability to jump in and out of genomes, with
or without multiplying themselves in the process. They can also land in plasmids and be propagated there. Genes hitch-hiking in
genetic parasites, ie, viruses, plasmids and transposons, therefore, have a greater probability of being successfully transferred into cells
and genomes. Genetic parasites are vectors for horizontal gene transfer.

Natural genetic parasites are limited by species barriers, so for example, pig viruses will infect pigs, but not human beings, and
cauliflower viruses will not attack tomatoes. It is the protein coat of the virus that determines host specificity, which is why naked viral
genomes (the genetic material stripped of the coat) have generally been found to have a wider host range than the intact virus(11).
Similarly, the signals for propagating different plasmids and transposons are usually specific to a limited range of host species, although
there are exceptions.

As more and more genomes have been sequenced, it is becoming apparent that gene trafficking or horizontal gene transfer has played
an important role in the evolution of all species(12). However, it is also clear that horizontal gene trafficking is regulated by internal
constraints in the organisms in response to ecological conditions(13).

Genetic engineering is unregulated horizontal gene transfer

Genetic engineering is a collection of laboratory techniques used to isolate and combine the genetic material of any species, and then
to multiply the constructs in convenient cultures of bacteria and viruses in the laboratory. Most of all, the techniques allow genetic
material to be transferred between species that would never interbreed in nature. That is how human genes can be transferred into pig,
sheep, fish and bacteria and spider silk genes end up in goats. Completely new, exotic genes are also being introduced into food and
other crops.

In order to overcome natural species barriers limiting gene transfer and maintenance, genetic engineers have made a huge variety of
artificial vectors (carriers of genes) by combining parts of the most infectious natural vectors viruses, plasmids and transposons -
from different sources. These artificial vectors generally have their disease-causing functions removed or disabled, but are designed to
cross wide species barriers, so the same vector may now transfer, say, human genes spliced into the vector, to the genomes of all
other mammals, or of plants. Artificial vectors greatly enhance horizontal gene transfer (see Box 1).(14)

Artificial vectors enhance horizontal gene transfer

They are derived from natural genetic parasites that mediate
horizontal gene transfer most effectively.
Their highly chimaeric nature means that they have sequence
homologies (similarities) to DNA from viral pathogens,
plasmids and transposons of multiple species across Kingdoms.
This will facilitate widespread horizontal gene transfer and
recombination.
They routinely contain antibiotic resistance marker genes which
enhance their successful horizontal transfer in the presence of
antibiotics, either intentionally applied, or present as xenobiotic
in the environment. Antibiotics are known to enhance horizontal
gene transfer between 10 to 10 000 fold.
They often have origins of replication and transfer
sequences , signals that facilitate horizontal gene transfer and
maintenance in cells to which they are transferred.
Chimaeric vectors are well-known to be structurally unstable,
ie, they have a tendency to break and join up incorrectly or with
other DNA, and this will increase the propensity for horizontal
gene transfer and recombination.
They are designed to invade genomes, to overcome mechanisms
that breakdown or disable foreign DNA and hence will increase
the probability of horizontal transfer.

Although different classes of vectors are distinguishable on the basis of the main-frame genetic material, practically every one of them
is chimaeric, being composed of genetic material originating from the genetic parasites of many different species of bacteria, animals
and plants. Important chimaeric shuttle vectors enable genes to be multiplied in the bacterium E. coli and transferred into species in
every other Kingdom of plants and animals. Simply by creating such a vast variety of promiscuous gene transfer vectors, genetic
engineering biotechnology has effectively opened up highways for horizontal gene transfer and recombination, where previously the
process was tightly regulated, with restricted access through narrow, tortuous footpaths. These gene transfer highways connect
species in every Domain and Kingdom with the microbial populations via the universal mixing vessel used in genetic engineering, E.
coli. What makes it worse is that there is currently still no legislation in any country to prevent the escape and release of most artificial
vectors and other artificial constructs into the environment (15).

What are the hazards of horizontal gene transfer?

Most artificial vectors are either derived from viruses or have viral genes in them, and are designed to cross species barriers and
invade genomes. They have the potential to recombine with the genetic material of other viruses to generate new infectious viruses that
cross species barriers. Such viruses have been appearing at alarming frequencies. The antibiotic resistance genes carried by artificial
vectors can also spread to bacterial pathogens. Has the growth of commercial-scale genetic engineering biotechnology contributed to
the resurgence of drug and antibiotic infectious diseases within the past 25 years (16)? There is already overwhelming evidence that
horizontal gene transfer and recombination have been responsible for creating new viral and bacterial pathogens and for spreading
drug and antibiotic resistance among the pathogens. One way that new viral pathogens may be created is through recombination with
dormant, inactive or inactivated viral genetic material that are in all genomes, plants and animals without exception. recombinatie
between external and resident, dormant viruses have been implicated in many animal cancers (17).

As stated earlier, the cells of all species including our own can take up foreign genetic material. Artificial constructs designed to invade
genomes may well invade our own. These insertions may lead to inappropriate inactivation or activation of genes (insertion
mutagenesis), some of which may lead to cancer (insertion carcinogenesis)(18). The hazards of horizontal gene transfer are
summarized in Box 2.

Potential hazards of horizontal gene transfer from genetic engineering

Generation of new cross-species viruses that cause disease
Generation of new bacteria that cause diseases
Spreading drug and antibiotic resistance genes among the viral
and bacterial pathogens, making infections untreatable
Random insertion into genomes of cells resulting in harmful
effects including cancer
Reactivation of dormant viruses, present in all cells and
genomes, which may cause diseases
Spreading new genes and gene constructs that have never existed
Multiplication of ecological impacts due to all of the above.

Transgenic DNA may be more likely to transfer horizontally than non-transgenic DNA

Both the artificial vectors used in genetic engineering and the genes transferred to make transgenic organisms are predominantly from
viruses and bacteria associated with diseases, and these are being brought together in combinations that have never existed in billions
of years of evolution.

Genes are never transferred alone. They are transferred in unit-constructs, known as an expression cassettes . Each gene has to be
accompanied by a special piece of genetic material, the promoter, which signals the cell to turn the gene on, ie, to transcribe the DNA
gene sequence into RNA. At the end of the gene there has to be another signal, a terminator, to end the transcription and to mark
the RNA, so it can be further processed and translated into protein. The simplest expression cassette looks like this:

Typically, each bit of the construct: promoter, gene and terminator, is from a different source. The gene itself may also be a composite
of bits from different sources. Several expression cassettes are usually linked in series, or stacked in the final construct. At least one
of the expression cassettes will be that of an antibiotic resistance marker gene to enable cells that have taken up the foreign construct
to be selected with antibiotics. The antibiotic resistance gene cassette will often remain in the transgenic organism.

The most commonly used promoters are from viruses associated with serious diseases. The reason is that such viral promoters give
continuous over-expression of genes placed under their control. The same basic construct is used in all applications of genetic
engineering, whether in agriculture or in medicine, and the same hazards are involved. There are reasons to believe that transgenic
DNA is much more likely to spread horizontal than the organisms own DNA (see Box 3) (19).

Reasons to suspect that transgenic DNA may be more likely to spread horizontally
than non-transgenic DNA

Artificial constructs and vectors are designed to be invasive to
foreign genomes and overcome species barriers.
All artificial gene-constructs are structurally unstable (20), and
hence prone to recombine and transfer horizontally.
The mechanisms enabling foreign genes to insert into the genome
also enable them to jump out again, to re-insert at another site,
or to another genome.
The integration sites of most commonly used artificial vectors
for transferring
genes are recombination hotspots , and so have an increased
propensity to transfer horizontally.
Viral promoters, such as that from the cauliflower mosaic virus,
widely used to make transgenes over-express, contain
recombination hotspots (21), and will therefore further enhance
horizontal gene transfer.
The metabolic stress on the host organism due to the continuous
over expression of transgenes may also contribute to the
instability of the insert (22).
The foreign gene-constructs and the vectors into which they are
spliced, are typically mosaics of DNA sequences from
numerous species and their genetic parasites that means they
will have sequence homologies with the genetic material of
many species and their genetic parasites, thus facilitating
wide-ranging horizontal gene transfer and recombination.

Additional hazards from viral promoters

We have recently drawn attention to additional hazards associated with the promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV) most
widely used in agriculture (23). It is in practically all transgenic plants already commercialized or undergoing field trials, as well as a
high proportion of transgenic plants under development, including the much acclaimed golden rice (24).

CaMV is closely related to human hepatitis B virus, and less so, to retroviruses such as the AIDS virus (25). Although the intact virus
itself is infectious only for cruciferae plants, its promoter is promiscuous in function, and is active in all higher plants, in algae, yeast,
and E. coli (26), as well as frog and human cell systems (27). Like all promoters of viruses and of cellular genes, it has a modular
structure, with parts common to, and interchangeable with promoters of other plant and animal viruses. It has a recombination
hotspot, flanked by multiple motifs involved in recombination, similar to other recombination hotspots including the borders of the
Agrobacterium T DNA vector most frequently used in making transgenic plants. The suspected mechanism of recombination
requires little or no DNA sequence homologies. Finally, viral genes incorporated into transgenic plants have been found to recombine
with infecting viruses to generate new viruses (28). In some cases, the recombinant viruses are more infectious than the original.

Proviral sequences generally inactive copies of viral genomes - are present in all plant and animal genomes, and as all viral
promoters are modular, and have at least one module the TATA box - in common, if not more. It is not inconceivable that the
CaMV 35S promoter in transgenic constructs can reactivate dormant viruses or generate new viruses by recombination. The CaMV
35S promoter has been joined artificially to copies of a wide range of viral genomes, and infectious viruses produced in the laboratory
(29). There is also evidence that proviral sequence in the genome can be reactivated (30).

These considerations are especially relevant in the light of recent findings that certain transgenic potatoes - containing the CaMV 35S
promoter and transformed with Agrobacterium T-DNA - may be unsafe for young rats, and that a significant part of the effects may
be due to "the construct or the genetic transformation (or both) (31)" The authors also report an increase in lymphocytes in the
intestinal wall, which is a non-specific sign of viral infection (32).

Evidence for horizontal transfer of transgenic DNA

It is often argued that transgenic DNA, once incorporated into the transgenic organism, will be just as stable as the organism s own
DNA. But there is both direct and indirect evidence against this supposition. Transgenic DNA is more likely to spread, and has been
found to spread by horizontal gene transfer.

Transgenic lines are notoriously unstable and often do not breed true (33). There is a paucity of molecular data documenting the
structural stability of the transgenic DNA, both in terms of its site of insertion in the genome and its arrangement of genes, in
successive generations. Instead, transgenes may be silenced in subsequent generations or lost altogether (34).

A herbicide-tolerance gene, introduced into Arabidopsis by means of a vector, was found to be up to 30 times more likely to escape
and spread than the same gene obtained by mutagenesis (35). One way this may happen is by secondary horizontal gene transfer via
insects visiting the plants for pollen and nectar (36). The reported finding that pollen can transfer transgenic DNA to bacteria in the gut
of bee larvae is relevant here.

Secondary horizontal transfer of transgenes and antibiotic resistant marker genes from genetically engineered crop-plants into soil
bacteria and fungi have been documented in the laboratory. Transfer to fungi was achieved simply by co-cultivation (37), while
transfer to bacteria has been achieved by both re-isolated transgenic DNA or total transgenic plant DNA (38). Successful transfers of
a kanamycin resistance marker gene to the soil bacterium Acinetobacter were obtained using total DNA extracted from homogenized
plant leaf from a range of transgenic plants: Solanum tuberosum (potato), Nicotiana tabacum (tobacco), Beta vulgaris (sugar
beet), Brassica napus (oil-seed rape) and Lycopersicon esculentum (tomato) (39). It is estimated that about 2500 copies of the
kanamycin resistance genes (from the same number of plant cells) is sufficient to successfully transform one bacterium, despite the
fact that there is six million-fold excess of plant DNA present. A single plant with say, 2.5 trillion cells, would be sufficient to
transform one billion bacteria.

Despite the misleading title in one of the publications,(40) a high gene transfer frequency of 5.8 x 10-2 per recipient bacterium was
demonstrated under optimum conditions. But the authors then proceeded to calculate an extremely low gene transfer frequency of 2.0
x 10-17 under extrapolated "natural conditions", assuming that different factors acted independently. The natural conditions,
however, are largely unknown and unpredictable, and even by the authors own admission, synergistic effects cannot be ruled out.
Free transgenic DNA is bound to be readily available in the rhizosphere around the plant roots, which is also an environmental
hotspot for gene transfer (41). Other workers have found evidence of horizontal transfer of kanamycin resistance from transgenic
DNA to Acinetobactor, and positive results were obtained using just 100ml of plant-leaf homogenate (42).

Defenders of the biotech industry still insist that just because horizontal gene transfer occurs in the laboratory does not mean it can
occur in nature. However, there is already evidence suggesting it can occur in nature. First of all, genetic material released from dead
and live cells, is now found to persist in all environments and not rapidly broken down as previously supposed. It sticks to clay, sand
and humic acid particles and retains the ability to infect (transform) a range of micro-organisms in the soil (43). De transformatie van
bacteria in the soil by DNA adsorbed to clay sand and humic acid has been confirmed in microcosm experiments (44).

Reseachers in Germany began a series of experiments in 1993 to monitor field releases of transgenic rizomania-resistant sugar beet
(Beta vulgaris), containing the marker gene for kanamycin resistance, for persistence of transgenic DNA and of horizontal gene
transfer of transgenic DNA into soil bacteria (45). It is the first such experiment to be carried out after tens of thousands of field
releases and tens of millions of hectares have been planted with transgenic crops. It will be useful to review their findings in detail.

Transgenic DNA was found to persist in the soil for up to two years after the transgenic crop was planted. Though they did not
comment on it, the data showed that the proportion of kanamycin resistant bacteria in the soil increased significantly between 1.5 and
2 years. Could it be due to horizontal transfer of antibiotic resistance marker gene in the transgenic DNA? Although none of 4000
colonies of soil bacteria isolated a rather small number - was found to have taken up transgenic DNA by the probes available, two
out of seven samples of total bacterial DNA yielded positive results after 18 months. This suggests that horizontal gene transfer may
have taken place, but the specific bacteria which have taken up the transgenic DNA cannot be isolated as colonies. That is not
surprising as less than 1% of all the bacteria in the soil are culturable. The authors were careful not to rule out transgenic DNA being
adsorbed to the surface of bacteria rather than being tranferred into the bacteria.

The researchers also carried out microcosm experiments to which total transgenic sugar-beet DNA was added to non-sterile soil with
its natural complement of microorganisms. The intensity of the signal for transgenic DNA decreased during the first days and
subsequently increased. This may be interpreted as a sign that the transgenic DNA has been taken up by bacteria and become
amplified as a result.

In parallel, soil samples were plated and the total bacterial lawn allowed to grow for 4 days, after which DNA was extracted. Meerdere
positive signals were found, "which might indicate uptake of transgenic DNA by competent bacteria."

The authors were cautious not to claim conclusive results simply because the specific bacteria carrying the transgenic DNA sequences
were not isolated. The results do show, however, that horizontal gene transfer may have taken place both in the field and in the soil
microcosm.

DNA is not broken down sufficiently rapidly in the gut either, which is why transfer of transgenic DNA to microorganisms in the gut of
bee larvae would not be surprising. A genetically engineered plasmid was found to have a 6 to 25% survival after 60 min. of exposure
to human saliva. The partially degraded plasmid DNA was capable of transforming Streptococcus gordonii, one of the bacteria that
normally live in the human mouth and pharynx. The frequency of transformation dropped exponentially with time of exposure to saliva,
but it was still detectable after 10 minutes. Human saliva actually contains factors that promote competence of resident bacteria to
become transformed by DNA (46).

Viral DNA fed to mice is found to reach white blood cells, spleen and liver cells via the intestinal wall, to become incorporated into
the mouse cell genome (47). When fed to pregnant mice, the viral DNA ends up in cells of the fetuses and the new born animals,
suggesting that it has gone through the placenta as well (48). The authors remark that "The consequences of foreign DNA uptake for
mutagenesis and oncogenesis have not yet been investigated (49)." As already mentioned, recent experiments in gene therapy leave
little doubt that naked nucleic acid constructs can readily enter mammalian cells and in many cases become incorporated into the cell s
genoom.

Horizontal gene transfer is an established phenomenon. It has taken place in our evolutionary past and is continuing today. Al de
signs are that natural horizontal gene transfer is a regulated process, limited by species barriers and by mechanisms that break down
and inactivate foreign genetic material. Unfortunately, genetic engineering has created a huge variety of artificial constructs designed to
cross all species barriers and to invade essentially all genomes. Although the basic constructs are the same for all applications, some of
the most dangerous may be coming from the waste disposal of contained users of transgenic organisms(50). These will include
constructs containing cancer genes from viruses and cells from laboratories researching and developing cancer and cancer drugs,
virulence genes from bacteria and viruses in pathology labs. In short, the biosphere is being exposed to all kinds of novel constructs
and gene combinations that did not previously exist in nature, and may never have come into being but for genetic
engineering.

There is an urgent need to establish effective regulatory oversight, in the first instance, to prevent the escape and release of these
dangerous constructs into the environment, and then to consider whether some of the most dangerous experiments should be allowed
to continue at all.


Microplastics, horizontal gene transfer, and impacts on human health

An estimated 300 million tons of plastics are produced annually. Millions of those tons enter our air, soil, and water as waste every year. As waste, some of this material–still millions of tons–breaks down into smaller particles, or microplastics (< 5 mm in size) the microplastics come from the manufacture of industrial products and the physical, chemical, and biological degradation of larger pieces of plastic waste. “In urban areas, waste-water treatment plants constitute … important sources of microplastics, releasing up to several million pieces per day.”

Microplastics constitute pollutants that decompose extremely slowly and “act as long-lasting reactive surfaces, containing additives and/or absorbing organic matter and chemical substances, such as heavy metals, antibiotics, pesticides, and other xenobiotics. Additionally, microplastics can be colonized by different microbial communities from natural surface-attached and free-living microbial communities.”

A feature of microplastics “is their potential as so-called ‘hot-spots’ of horizontal gene transfer (HGT), as they display areas of increased nutrient availability and high cell densities of microbial cells, allowing for intense interactions. Conjugation is the main mechanism of directed HGT, a process in which two bacteria in close contact can exchange genetic information via plasmid transfer from a donor to a recipient cell. This process can occur even between distantly related taxa, affecting bacterial evolution and the spread of multiple phenotypic traits, such as antibiotic or heavy metal resistance genes.”

Microplastics “provide new hot spots for spreading antibiotic resistance genes … in natural aquatic ecosystems. Tons of microplastics in sites like wastewater treatment plants that get colonized by a multitude of microorganisms including pathogenic bacteria from humans or animals pose a tremendous potential for antibiotic resistance spreading by HGT. Effluents of wastewater treatment plants often flow into natural aquatic ecosystems, where some of the original pathogenic species may persist in the floating biofilm. During the transit through these aquatic ecosystems, processes of horizontal and vertical gene transfer on the associated bacteria can occur continuously. Multiple encounters between the microplastics-associated bacterial community and various natural populations are likely given that plastic particles remain present in the environment for extremely long periods, resulting even in their transfer to the gut microbiota of organisms feeding on microplastics.”

“Microplastics provide favorable conditions for the establishment of groups of microorganisms that differ from those in the surrounding water or on natural aggregates, thereby altering the structure and composition of microbial communities in aquatic environments. On plastics, an increased permissiveness towards plasmids carrying antibiotic resistance genes and eventually other genes facilitates the establishment of novel traits in bacterial communities by evolutionary changes at the species and population levels. Microplastics provide ideal conditions for collection, transport and dispersion of microorganisms and their associated mobile genetic elements over long distances, which could even reach a global scale. This poses increasing but greatly neglected hazards to human health because pathogens can invade new localities and natural, non-pathogenic microorganisms can potentially acquire and thus rapidly spread antibiotic resistance.”

Featured article:

Arias-Andres, M., Klümper, U., Rojas-Jimenez, K., & Hans-Peter Grossart. (2018). Microplastic pollution increases gene exchange in aquatic ecosystems. Environmental Pollution, 237, 253-261. [PDF] [Cited by]

For additional research, please see the Science Primary Literature Database.