Informatie

13.10: DNA-sequencing - Biologie


Leerresultaten

Beschrijf de meest gebruikte methode voor DNA-sequencing

Tot de jaren negentig was het sequencen van DNA (het aflezen van de volgorde van DNA) een relatief duur en langdurig proces. Het gebruik van radioactief gelabelde nucleotiden verergerde het probleem ook vanwege veiligheidsproblemen. Met de momenteel beschikbare technologie en geautomatiseerde machines is het proces goedkoop, veiliger en binnen enkele uren voltooid. Fred Sanger ontwikkelde de sequencing-methode die wordt gebruikt voor het sequencing-project van het menselijk genoom, dat tegenwoordig veel wordt gebruikt (Figuur 1).

Bezoek deze site om een ​​video te bekijken waarin de techniek voor het lezen van de DNA-sequentie wordt uitgelegd die het resultaat is van het werk van Sanger.

De methode staat bekend als de dideoxy-ketenbeëindigingsmethode. De sequencing-methode is gebaseerd op het gebruik van ketenterminators, de dideoxynucleotiden (ddNTP's). De dideoxynucleotiden, of ddNTPS's, verschillen van de deoxynucleotiden door het ontbreken van een vrije 3'-OH-groep op de vijf-koolstofsuiker. Als een ddNTP wordt toegevoegd aan een groeiende DNA-streng, wordt de keten niet verder verlengd omdat de vrije 3'-OH-groep die nodig is om nog een nucleotide toe te voegen, niet beschikbaar is. Door een vooraf bepaalde verhouding van deoxyribonucleotiden tot dideoxynucleotiden te gebruiken, is het mogelijk om DNA-fragmenten van verschillende groottes te genereren.

Het DNA-monster waarvan de sequentie moet worden bepaald, wordt gedenatureerd of in twee strengen gescheiden door het tot hoge temperaturen te verhitten. Het DNA is verdeeld in vier buisjes waarin een primer, DNA-polymerase en alle vier de nucleotiden (A, T, G en C) zijn toegevoegd. Naast elk van de vier buisjes worden aan elk buisje gelimiteerde hoeveelheden van één van de vier dideoxynucleotiden toegevoegd. De buizen zijn gelabeld als A, T, G en C volgens de toegevoegde ddNTP. Voor detectiedoeleinden draagt ​​elk van de vier dideoxynucleotiden een ander fluorescerend label. Ketenverlenging gaat door totdat een fluorescerende dideoxynucleotide is ingebouwd, waarna geen verdere verlenging plaatsvindt. Nadat de reactie voorbij is, wordt elektroforese uitgevoerd. Zelfs een verschil in lengte van een enkele basis kan worden gedetecteerd. De sequentie wordt afgelezen van een laserscanner. Voor zijn werk aan DNA-sequencing ontving Sanger in 1980 de Nobelprijs voor scheikunde.

Zoals al vermeld, gel elektroforese (Figuur 2) is een techniek die wordt gebruikt om DNA-fragmenten van verschillende groottes te scheiden. Meestal is de gel gemaakt van een chemische stof die agarose wordt genoemd. Agarosepoeder wordt toegevoegd aan een buffer en verwarmd. Na afkoeling wordt de geloplossing in een gietschaal gegoten. Zodra de gel is gestold, wordt het DNA op de gel geladen en wordt er elektrische stroom aangelegd. Het DNA heeft een netto negatieve lading en beweegt van de negatieve elektrode naar de positieve elektrode. De elektrische stroom wordt lang genoeg toegepast om het DNA naar grootte te laten scheiden; de kleinste fragmenten zullen het verst van het putje zijn (waar het DNA was geladen), en de zwaardere fragmenten met een molecuulgewicht zullen het dichtst bij het putje zijn. Zodra het DNA is gescheiden, wordt de gel gekleurd met een DNA-specifieke kleurstof om het te bekijken.

Sanger's genoomsequencing heeft geleid tot een race om menselijke genomen met hoge snelheid en lage kosten te sequensen, vaak aangeduid als de $ 1000 in één dag-sequentie. Lees hier meer door de animatie Sequencing at Speed ​​te bekijken.

Neanderthaler-genoom: hoe zijn we verwant?

De eerste conceptsequentie van het Neanderthaler-genoom werd gepubliceerd door Richard E. Green et al. in 2010.[1] Neanderthalers zijn de naaste voorouders van de huidige mens. Het was bekend dat ze in Europa en West-Azië leefden voordat ze ongeveer 30.000 jaar geleden uit fossielen verdwenen. Het team van Green bestudeerde bijna 40.000 jaar oude fossiele overblijfselen die werden geselecteerd op locaties over de hele wereld. Vanwege de fragiele aard van de botten en de zware microbiële besmetting werden uiterst geavanceerde methoden voor monstervoorbereiding en DNA-sequencing gebruikt. In hun onderzoek waren de wetenschappers in staat om zo'n vier miljard basenparen te sequensen. De sequentie van de Neanderthalers werd vergeleken met die van de huidige mens van over de hele wereld. Na vergelijking van de sequenties ontdekten de onderzoekers dat het Neanderthaler-genoom 2 tot 3 procent meer gelijkenis vertoonde met mensen die buiten Afrika wonen dan met mensen in Afrika. Hoewel de huidige theorieën hebben gesuggereerd dat alle huidige mensen kunnen worden herleid tot een kleine voorouderlijke populatie in Afrika, kunnen de gegevens van het Neanderthaler-genoom deze opvatting tegenspreken. Green en zijn collega's ontdekten ook DNA-segmenten bij mensen in Europa en Azië die meer lijken op Neanderthaler-sequenties dan op andere hedendaagse menselijke sequenties. Een andere interessante observatie was dat Neanderthalers net zo nauw verwant zijn aan mensen uit Papoea-Nieuw-Guinea als aan die uit China of Frankrijk. Dit is verrassend omdat fossiele resten van Neanderthalers alleen in Europa en West-Azië zijn gevonden. Hoogstwaarschijnlijk vond genetische uitwisseling plaats tussen Neanderthalers en moderne mensen toen moderne mensen uit Afrika kwamen, vóór de divergentie van Europeanen, Oost-Aziaten en Papoea-Nieuw-Guinea.

Verschillende genen lijken veranderingen te hebben ondergaan ten opzichte van Neanderthalers tijdens de evolutie van de huidige mens. Deze genen zijn betrokken bij de schedelstructuur, het metabolisme, de huidmorfologie en de cognitieve ontwikkeling. Een van de genen die van bijzonder belang is, is: RUNX2, wat anders is bij moderne mensen en Neanderthalers. Dit gen is verantwoordelijk voor het prominente voorhoofdsbeen, de klokvormige ribbenkast en de gebitsverschillen die bij Neanderthalers worden gezien. Er wordt gespeculeerd dat een evolutionaire verandering in RUNX2 was belangrijk in de oorsprong van de moderne mens, en dit had invloed op de schedel en het bovenlichaam.

Bekijk de lezing van Svante Pääbo waarin hij het Neanderthaler-genoomonderzoek uitlegt op de jaarlijkse TED-conferentie (Technology, Entertainment, Design) in 2011.

Een YouTube-element is uitgesloten van deze versie van de tekst. Je kunt het hier online bekijken: pb.libretexts.org/bionm1/?p=494



Bekijk de video: Experiment 6 Isolation DNA (Januari- 2022).