Informatie

Recept voor hoge stroom (snelheid) overdrachtbuffer


Weet iemand een effectieve buffermix om te gebruiken voor hoge huidige westerse overschrijvingen? We gebruiken met succes de voorgemengde buffer van de leverancier om een ​​breed scala aan eiwitgroottes gedurende 10 minuten bij 1A/25V over te brengen naar PVDF-membranen. We behalen geweldige resultaten met de dure buffer van de leverancier.

Ik heb geen niet-gepatenteerd recept kunnen vinden dat werkt. De beste die we hebben, houden de 25V vast, maar hebben dan een afname in geleidbaarheid (toename in weerstand) waar ze beginnen bij 1A, maar dalen tot 0,4A aan het einde van de 10 minuten. De buffer van de verkoper lijkt de hoge stroom vast te houden en resulteert in betere overdrachten.

Ik weet niet of het nuttig zal zijn om alle variaties die ik heb geprobeerd in detail op te sommen, maar ze draaiden om het aanpassen van een traditionele Towbin-buffer plus SDS, meer glycine/Tris of MgCl2. Dit waren allemaal verschillende suggesties van mensen rond de afdeling, maar ik heb niet veel gepubliceerd bewijs gevonden voor een buffer onder deze omstandigheden.

Ik realiseer me dat 1A (en nee, ik bedoel niet 1mA) veel stroom is, maar het systeem van de leverancier werkt echt goed. Om het even welke wijzers over wat ik zou kunnen proberen/toevoegen zou worden gewaardeerd, zelfs als je geen uitgewerkt protocol hebt.

Bewerken: Info van de MSDS geeft aan dat het 3 reagentia heeft:

Lijst van gevaarlijke en niet-gevaarlijke componenten: Eigen reagens K 10-20% Eigen reagens EB II 5-10% Eigen reagens S 1,0-2,5% 7732-18-5 water 50-100% ·… Oplosmiddelgehalte: Organische oplosmiddelen: 0,0 % Water: 74,8 % Vaste stofgehalte: 25,2 %

[Ik weet niet zeker of deze MSDS-informatie hier moet worden geplaatst, alleen omdat ik op zoek ben naar iemand die al een hoge stroombuffer heeft gebruikt waarvan ze de formulering kennen, geen gok naar wat ik heb.]


Dus na veel werk in optimalisatie, dacht ik dat ik zou posten wat het beste voor mij werkte. Dit bufferrecept was in staat om met succes EGFR en insuline van hetzelfde lysaat over te brengen, en een duidelijke band voor beide (respectievelijk groot en klein eiwit). 10% SDS-PAGE-gels werden gedurende 10 minuten bij 1A overgebracht.

Hoge stroomoverdrachtsbuffer

  1. 48 mM Tris
  2. 15 mM HEPPS
  3. 1,0 mM EDTA
  4. 1,3 mM NaHSO3
  5. 1,3 mM N,N-dimethylformamide
  6. 25 mm gLY-GLY
  7. 20% Methanol (v/v)

Ik hoop echt dat dit iemand anders kan helpen, en wil Garic et al als een prachtig startpunt plaatsen. Hun publicatie werd gemaakt nadat ik de vraag had gesteld, zoals @user4148 opmerkte.


De SB-buffer bestaat al een tijdje en ik heb hem zeker al een tijdje met succes gebruikt voor zowel agarose- als PAGE-gelbuffers. Het enige is dat je de gel in een koude kamer moet laten lopen (hoogspanning is gelijk aan hoge temperatuur) en dat je de timing en omstandigheden moet optimaliseren zodat je monsters niet van de gel aflopen.


Recept voor overdrachtbuffer met hoge stroom (snelheid) - biologie

WAYNE L. RICKOLL , . ELIZABETH S. HAYES, in Ecdysone, 1986

Gelelektroforese (SDS-PAGE)

Porties van de NP-40 lysisbufferextracten werden gemengd met NP-40-ureumlysisbuffer waarbij de verhouding van eiwit tot NP-40-ureumlysisbuffer voor elk monster constant werd gehouden (2 g eiwit/ul buffer). Tweedimensionale (2D) elektroforese werd uitgevoerd zoals beschreven door O⟺rrell (1975). Gelijke hoeveelheden radioactiviteit (1 x 106 cpm) werden op alle te vergelijken gels geladen. De tweede SDS-PAGE-dimensie werd uitgevoerd op een 7,5-17,5% acrylamidegradiëntplaatgel, met behulp van een 4,5% acrylamide-stapelgel.

NP-40 lysisbufferextracten werden ook geanalyseerd op 7,5% SDS-PAGE. Om elk monster te vergelijken, werden aliquots van NP-40 lysisbufferextracten met gelijke hoeveelheden radioactiviteit toegevoegd aan SDS-monsterbuffer. De verhouding van eiwit tot SDS-monsterbuffer (2 g/μl buffer) werd voor elk monster constant gehouden. Alle gels werden gedroogd en autoradiografie werd uitgevoerd bij -70°C met behulp van versterkende schermen (Dupont Lightning Plus) en Kodak SB-5 röntgenfilm. Ten minste drie onafhankelijke labelingen en scheidingen werden uitgevoerd op zowel met hormoon behandelde als niet-behandelde cellen.


Invoering

Het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide lentivirus behoort tot de familie Retroviridae 1 . Het wordt gekenmerkt door het opnemen van viraal RNA in het DNA van delende en niet-delende cellen. Om een ​​lentivirus te produceren dat gastheercellen kan infecteren, moeten drie typen vectoren samen tot expressie worden gebracht in virusproducerende cellen (meestal HEK293T-cellen): een ruggengraatvector die het transgen van interesse bevat en zelf-inactiverende 3'-LTR-regio's, één construct dat eiwitten met virale structuur tot expressie brengt en één vector die codeert voor vesiculair stomatitisvirus-glycoproteïne (VSVG) voor inkapseling 2 . De nieuwste generatie van het lentivirussysteem scheidt het Rev-gen verder van andere structurele genen, wat een verhoogde bioveiligheid biedt door de mogelijkheid van omgekeerde recombinatie te verminderen 3 . Tegenwoordig is lentivirustechnologie een van de meest efficiënte hulpmiddelen geworden om exogene genen in verschillende soorten cellen te brengen, zowel in vitro en in vivo 4,5,6,7 .

De zuivering van lentivirus met hoge titer (>107 TU/ml) uit een grote hoeveelheid virusbevattend medium is cruciaal voor de toepassing van lentivirus. De routineconcentratie van het lentivirus vereist ultracentrifugatie met relatieve centrifugale kracht (RCF), meestal meer dan 90.000 G 8,9,10,11,12,13 , om onzuiverheden te verwijderen en een hoog infectiepercentage te garanderen, vooral voor in vivo toepassingen. Dit kan alleen worden bereikt door een ultracentrifuge, wat niet gebruikelijk is in een laboratorium. Bovendien is het vermogen van centrifugeren met lage snelheid om een ​​virus met hoge titer te produceren niet grondig onderzocht. Zo werd de relatie tussen RCF en de concentratie-efficiëntie van het lentivirus systematisch geëvalueerd en de huidige gegevens toonden aan dat sucrosegradiëntcentrifugatie met een relatief lage snelheid (≤ 10.000 G) produceert een virus met hoge titer dat vergelijkbaar is met een in de handel verkrijgbaar virus dat is gezuiverd met ultracentrifugatie in zowel opbrengst als titer. Bovendien is de optimale sucroseconcentratie 10%. Zo wordt een efficiënt protocol beschreven voor lentiviruszuivering met hoge titer dat gemakkelijk kan worden bereikt met een gewone laboratoriumcentrifuge.


Volg het Western Blot-protocol voor natte overdracht

1 Voer de monsters zoals gewoonlijk uit in SDS-PAGE.
2 Bereid en markeer het membraan (juiste maat, PVDF of nitrocellulosemembraan) met een potlood, laat het een paar minuten in methanol weken en spoel het af met gedestilleerd water.
3 Breng het membraan, de pads, het filterpapier (4 stuks) en het transferschuim in evenwicht in de Transfer Buffer (bewaren bij 4°C) gedurende 5 minuten.
4 Monteer de transfersandwich in de volgende volgorde: zwart frame (negatieve elektrode) >> schuim >> 3 stuks filterpapier >> SDS-PAGE gel >> membraan >> 3 stuks filterpapier >> schuim >> rood kader (positieve elektrode). Zorg dat de gemarkeerde kant van het membraan naar de gel wijst. Doe het in de transfertank.

Fig 2. Schematische afbeelding van Western Blot natte transfer sandwich
5 Breng de gel over op 80 V gedurende 90 minuten in de koude kamer. U kunt ook een ijszak en magneetroerstaaf gebruiken om de gel op kamertemperatuur over te brengen.
6 Demonteer het gelpak en gebruik een potlood om de putafdrukken op het membraan te markeren.

REAGENTIA EN OPLOSSINGEN

½ MS medium platen

  • 0,5× Murashige & Skoog medium inclusief vitamines (Duchefa Biochemie, cat.nr. M0255)
  • 15 g/L sucrose
  • Stel de pH in op 5,7 met KOH
  • 3 g/L Phytagel (Sigma, cat.nr. P8169)
  • Autoclaaf bij 121°C gedurende 15 min
  • Koel af tot ∼60°C en giet in borden
  • Bewaren ≤6 maanden bij 4°C

Coomassie Brilliant Blue R-250 ontkleuringsoplossing

Coomassie Brilliant Blue R-250 kleuroplossing

  • 0,1% (g/v) Coomassie Briljantblauw R-250
  • 25% (v/v) isopropanol
  • 10% (v/v) azijnzuur
  • Bewaren (1 jaar bij kamertemperatuur)

Inheemse eiwitextractiebuffer

  • 1× NativePAGE™-monsterbuffer (Thermo Fisher Scientific, cat.nr. BN2008)
  • 1× proteaseremmers (Roche, cat.nr. 5056489001)
  • 1% (g/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM Thermo Fisher Scientific, cat.nr. BN2005)
  • Direct voor gebruik vers bereiden

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (PBST)

  • 1,8 mM KH2PO4
  • 10 mM Na2HPO4
  • 2,7 mM KCl
  • 137 mM NaCl
  • Stel de pH in op 7,2 met 1 M NaOH
  • Steriliseren door autoclaveren
  • Bewaren ≤6 maanden bij kamertemperatuur
  • Voeg 0,1% (v/v) Tween 20 direct voor gebruik toe

Eiwitlaadbuffer, 4×

  • 200 mM Tris·HCl, pH 6,8
  • 8% (w/v) VIB
  • 40% (v/v) glycerol
  • 0,032% (w/v) broomfenolblauw
  • Bewaren (1 jaar bij kamertemperatuur)
  • Verdun tot 1× en voeg 100 mM DTT toe voor gebruik

ALTERNATIEF PROTOCOL 1

ADDITIEF SCHERM OM DE EIWITSTABILITEIT TE OPTIMALISEREN

Dit secundaire protocol is ideaal voor het screenen van een breed scala aan additieven zodra een geoptimaliseerde buffer is geïdentificeerd in het basisprotocol.

Materialen

Zelfde materialen als voor Basisprotocol 1

96-well deepwell-blok met 5× additiefscherm naar keuze (zie tabel 2)

Tafel 2

Samenstelling van het additiefscherm met 96 putjes

We zullenAdditiefWe zullenAdditief
A1waterE15 mM EDTA
A2waterE2100 mM natriumfluoride
A3waterE3100 mM kaliumfluoride
A4waterE 4100 mM lithiumchloride
A5100 mM ureumE5100 mM kaliumchloride
A6250 mM ureumE6100 mM ammoniumchloride
A7500 mM ureumE7100 mM natriumjodide
A81 M ureumE8100 mM kaliumjodide
A925 mM Guanidine HClE9100 mM natriumbromide
A1050 mM Guanidine HClE1010 mM magnesiumchloride
A11100 mM Guanidine HClE1110 mM calciumchloride
A12250 mM Guanidine HClE125 mM mangaanchloride
B1500 mM Guanidine HClF15 mM nikkelchloride
B21% (v/v) DMSOF25 mM ijzer (III) chloride
B32% (v/v) DMSOF35 mM zinkchloride
B42,5% (v/v) GlycerolF45 mM kobaltchloride
B55% (v/v) GlycerolF5100 mM natriumformiaat
B610% (v/v) GlycerolF6100 mM natriumacetaat
B715% (v/v) GlycerolF7100 mM natriummalonaat
B820% (v/v) GlycerolF8100 mM natriumnitraat
B92,5% (v/v) D-glucoseF9100 mM natriumthiocyanaat
B105% (v/v) D-glucoseF10100 mM natriumsulfaat
B112,5% (v/v) sucroseF11100 mM ammoniumsulfaat
B125% (v/v) sucroseF12100 mM ammoniumchloride
C12,5% (v/v) PEG400G12 mM AMP + 5 mM MgCl2
C25% (v/v) PEG400G22 mM ADP + 5 mM MgCl2
C32,5% (g/v) PEG1000G32 mM ATP + 5 mM MgCl2
C45% (g/v) PEG1000G42 mM AMPPNP + 5 mM MgCl2
C52,5% (m/v) PEG4000G52 mM cAMP + 5 mM MgCl2
C65% (g/v) PEG4000G62 mM BBP + 5 mM MgCl2
C72,5% (v/v) EthyleenglycolG72 mM GTP + 5 mM MgCl2
C85% (v/v) EthyleenglycolG82 mM cGMP + 5 mM MgCl2
C91 mM OctylglucosideG92 mM NAD + 5 mM MgCl2
C102 mM CHAPSG102 mM NADH + 5 mM MgCl2
C1110 mM L-ProlineG1110 mM betaïne
C1250 mM L-glycineG121 mM sperma
D125 mM L-histidineH11 mM Spermidine (elke keer vers toevoegen)
D250 mM L-arginineH210 mM β-mercaptoethanol (telkens vers toevoegen)
D350 mM L-glutamaatH35 mM DTT (elke keer vers toevoegen)
D450 mM L-Arg/50 mM L-GluH42 mM TCEP (elke keer vers toevoegen)
D525 mM L-glutamineH5open voor door de gebruiker bepaalde additieven
D650 mM L-lysineH6open voor door de gebruiker bepaalde additieven
D750 mM L-cysteïneH7open voor door de gebruiker bepaalde additieven
D850 mM TaurineH8open voor door de gebruiker bepaalde additieven
D950 mM imidazool pH 7,6H9open voor door de gebruiker bepaalde additieven
D10100 mM imidazool pH 7,6H10open voor door de gebruiker bepaalde additieven
D11250 mM imidazool pH 7,6H11open voor door de gebruiker bepaalde additieven
D12500 mM imidazool pH 7,6H12open voor door de gebruiker bepaalde additieven

De vermelde concentraties vertegenwoordigen de eindconcentratie in de thermische verschuivingstest.

Voorraden moeten worden gemaakt met een concentratie van 5×.

Opmerking: Breng vóór gebruik 5× additiefscherm op kamertemperatuur vanaf een opslag van 4ଌ (

Voeg voldoende van de geoptimaliseerde buffer (bij een concentratie van 1×, geïdentificeerd in het initiële bufferoptimalisatiescherm hierboven) toe aan eiwitvoorraad in een conische buis van 15 ml om een ​​eindvolume van 5 ml te verkrijgen, voldoende om een ​​96-wells testplaat te screenen. Voeg 4 µl SYPRO Orange kleurstof toe (voorraadconcentratie: 5000×). De uiteindelijke concentraties van eiwit en kleurstof in het mengsel moeten respectievelijk 5 µM en 2× zijn.

Meng grondig door de buis meerdere keren om te keren en plaats de oplossing in een meerkanaals pipetreservoirbak. Gebruik een meerkanaalspipet om 40 µl oplossing over te brengen in elk putje van de testplaat.

Centrifugeer kamertemperatuur 5× additieve zeefplaat bij 800 × G gedurende 2 minuten bij 25 ଌ.

Trek de zelfklevende aluminium afdichtingsfolie voorzichtig los. Gebruik de meerkanaalspipet om 10 µl van de 5× additieve screenstocks van het 96-well deepwell-blok aan de assayplaat toe te voegen. Meng de putinhoud met dezelfde pipet en tips door meerdere keren op en neer te pipetteren.

Ontwerp uw additiefscherm met 96 putjes zo dat er ten minste vier putjes zijn zonder toevoegingen (d.w.z. alleen water in putjes A1� in de zeefplaat met 96 putjesadditieven) om de thermische verschuiving van additieven ten opzichte van de geoptimaliseerde buffer te beoordelen.

Bedek de testplaat met een vel optisch heldere lijm en sluit elk putje zorgvuldig af. Sluit het additiefscherm opnieuw af met zelfklevende aluminiumfolie en bewaar bij 4 ଌ.

Centrifugeer de testplaat bij 800 × G gedurende 2 minuten bij 25 ° C om oplossingen in de bodem te verzamelen en bellen uit de putjes te verwijderen.

Plaats de testplaat in het realtime PCR-instrument en start een temperatuurgradiëntprogramma voor thermische denaturatie van eiwitten.

Bepaal de thermische verschuiving (Δtm) van alle omstandigheden met betrekking tot de controle ‘geen additief’ om additieven te identificeren die de stabilisatie van het eiwit bevorderen.


Column en mediavoorbereiding

Equilibreer de kolom met 5-10 kolomvolumes startbuffer of totdat de basislijn, de pH van het eluens en de geleidbaarheid stabiel zijn.

Het gebruik van voorverpakte kolommen wordt ten zeerste aanbevolen om de beste prestaties en reproduceerbare resultaten te garanderen. Een gelijkmatig gepakte kolom zorgt ervoor dat componentpieken niet onnodig worden verbreed als het monster door de kolom gaat, zodat de beste resolutie kan worden bereikt.

Laat buffers, media of voorverpakte kolommen vóór gebruik op dezelfde temperatuur komen. Snelle temperatuurveranderingen, bijvoorbeeld het verwijderen van gepakte kolommen uit een koude ruimte en vervolgens het aanbrengen van buffer bij kamertemperatuur, kunnen luchtbellen in de pakking veroorzaken en de scheiding beïnvloeden.

Was opslagoplossingen en conserveermiddelen weg voordat u een IEX-medium gebruikt.

Verhoog de volumes die worden gebruikt voor kolomevenwicht vóór de eerste run als u buffers gebruikt die detergentia of een ander tegenion bevatten dan die waarin het medium is opgeslagen.

Bijlage 3 geeft details over kolompakking. Het benodigde volume voor het gepakte bed wordt bepaald door de hoeveelheid te zuiveren monster en het bindingsvermogen van het medium. Pak een kolom in die ongeveer 5 keer zoveel bindingscapaciteit heeft als nodig is met een bedhoogte tot 20 cm.

Controleer de kolomprestaties regelmatig door de kolomefficiëntie en pieksymmetrie te bepalen. Bijlage 3. Merk op dat dit niet van toepassing is op HiTrap- of HiPrep™-kolommen.


Protocol voor S30-ribosoom-lysaat

(aangepast van Kigawa et al. (2004), Bereiding van Escherichia coli-celextract voor zeer productieve celvrije eiwitexpressie, J. Struct. Fun. Gen., 5, 63-68)

E. coli-stam: BL21(DE3), BL21(DE3) CodonPlus RIL of varianten (niet pLysS!)

! uit 1 liter kweek kan ongeveer 7 ml S30-ribosoom-lysaat worden geïsoleerd!

Per liter medium:

5,6 gram KH2PO4
28,9 gram K2HPO4
10 gram gist extract
15 mg Thiamine toevoegen na sterilisatie (gefilterd steriel)
40 ml 25% glucose toevoegen na sterilisatie (gefilterd steriel)

Alle buffers en voorraadoplossingen moeten worden bereid met met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld H2O (DNAse/RNAse-vrij).
Alle voorraadoplossingen kunnen wekenlang bij -20°C worden bewaard, behalve creatinekinase. Creatinekinase moet worden opgelost in 30 mM Glycine, pH = 9,0 + 20 mM DTT. Na bevriezing in vloeibare stikstof is het wekenlang stabiel bij -80°C.
Alle afzonderlijke aminozuren moeten worden opgelost zoals beschreven op de verpakking. Het mengsel bevat 5 mM van elk aminozuur met een pH van 7,5 aangepast met KOH.


PrimerDigitaal

De procedure is geschikt voor alle soorten weefsels van een grote verscheidenheid aan dieren, bloed, plantensoorten en bodem.
Het volgende protocol is bedoeld voor kleine en grote weefselmonsters (weefselvolume 100-200 l).
Merk op dat het isoleren van genomisch DNA niet voorzichtig mengen vereist, omdat het DNA niet wordt geschoren door vortexen.

Kalendar R, Boronnikova S, Seppänen M 2021. Isolatie en zuivering van DNA uit gecompliceerde biologische monsters. Methoden in de moleculaire biologie, 2222: 57-67. DOI: 10.1007/978-1-0716-0997-2_3

CTAB-protocol voor de isolatie van DNA

  • CTAB oplossing: 2% CTAB, 1,5 M NaCl, 10 mM Na3EDTA, 0,1 M HEPES-zuur
    100 ml: 2 g CTAB, 2,4 g HEPES-zuur, 2 ml 0,5 M Na3EDTA, 30 ml 5 M NaCl
  • Chloroform-isoamylalcohol mix (24:1)
  • 100% isopropanol (isopropylalcohol, 2-propanol)
  • 70% ethanol
  • 1xTE (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0)
  1. 2 ml Eppendorf Safe-Lock microcentrifugebuis met weefselmonster en glazen bol (6 mm), vermalen in de MM300 Mixer Mill gedurende 2-10 min bij 30 Hz.
  2. In tube van 2 ml met mechanisch verstoorde zaden/bladeren/herbarium- of DNA-oplossing (CTAB zuivering) voeg 1 ml toe CTAB oplossingsbuffer, meng in de MM300 Mixer Mill gedurende 2 minuten bij 30 Hz en incubeer de monsters gedurende 1 uur bij 65 °C.
  3. Draai 2 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge, breng de geklaarde oplossing over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml die een gelijk volume chloroform bevat.
  4. Mix 3 minuten heel goed in de MM300 Mixer Mill op 30 Hz.
  5. Centrifugeer 2 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge, breng de bovenste waterige laag over in een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml die 600 l 2-propanol bevat, vortex goed en centrifugeer de buisjes gedurende 2 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge.
  6. Gooi supernatant weg en was de pellet door 1,8 ml 70% EtOH toe te voegen, zeer goed vortexen. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 2 minuten en gooi ethanol weg.
  7. De DNA-pellet droogt niet en loste onmiddellijk op in 300 &mul 1xTE, pH 8,0 bij 55°C gedurende 5-10 minuten.

CTAB-protocol voor de isolatie van DNA uit moeilijke weefsels (hoge niveaus van secundaire metabolieten of polysachariden), herbarium en bodem

  • CTAB oplossing: 3% CTAB, 1,5 M NaCl, 10 mM Na3EDTA, 0,1 M MOPS-zuur
    100 ml: 3 g CTAB, 2,1 g MOPS-zuur, 2 ml 0,5 M Na3EDTA, 30 ml 5 M NaCl
  • Mini-spinkolom: HiBind® (Omega Bio-tek) of NucleoSpin® (MN) of compatibel met de volgende Qiagen-kits: Qiaprep Spin Mini, QiaQuick Gel Extraction, QiaQuick PCR Clean-up, DNeasy Plant DNA
  • Buffer QG (5,5 M guanidinethiocyanaat, 20 mM Tris-HCl pH 6,6)
  • DNA-wasbuffer PE (80% ethanol, 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5)
  • 96% ethanol
  • Elutiebuffer (0,5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0)
  1. 2 ml Eppendorf Safe-Lock microcentrifugebuis met herbariummonster (de monstermassa mag niet groter zijn dan 50 mg) en glazen bol (6 mm) vermalen in de MM300 Mixer Mill gedurende 15 minuten bij 30 Hz.
  2. Voeg 1 ml toe CTAB oplossingsbuffer, vortex om grondig te mengen en incubeer de monsters gedurende 1-2 of meer uur bij 65 ° C.
  3. Draai 2 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge, breng de geklaarde oplossing over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml die een gelijk volume van 96% ethanol bevat (50-100% van het volume van de CTAB-oplossing). Vortex om grondig te mengen.
  4. Plaats een HiBind DNA Mini-kolom in een verzamelbuisje van 2 ml. Breng maximaal 700 l monster van stap 3 over naar de HiBind DNA Mini-kolom. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 30 sec bij kamertemperatuur.
  5. Herhaal de vorige stap met hetzelfde verzamelbuisje totdat alle CTAB-mixoplossing door de HiBind DNA Mini-kolom is gegaan. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 30 sec. Gooi het filtraat en de verzamelbuis weg.
  6. Voeg 500 ul 96% ethanol toe. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 30 sec. Gooi het filtraat weg en hergebruik de verzamelbuis.
  7. Voeg 500 ul QG-buffer toe. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 30 sec. Gooi het filtraat weg en hergebruik de verzamelbuis.
  8. Voeg 700 ul DNA-wasbuffer PE toe. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 30 sec. Gooi het filtraat weg en hergebruik de verzamelbuis.
  9. Herhaal met dezelfde verzamelbuis de vorige stap voor de tweede stap van de DNA-wasbuffer. Centrifugeer gedurende 1 minuut op maximale snelheid.
  10. Breng de HiBind DNA Mini-kolom over in een schone buis van 1,5 ml. Voeg 200 l elutiebuffer toe en verwarm gedurende 10 minuten op 55°C.
  11. Centrifugeer gedurende 1 minuut op maximale snelheid. Bewaar geëlueerd DNA bij -20°C.

Proteïnase K-methode voor DNA-extractieprotocol

  1. Voeg in 2 ml Eppendorf Safe-Lock-buis met mechanisch verstoorde dierlijke of plantaardige weefsels verse 500 μl extractiebuffer toe (0,8 M guanidinethiocyanaat, 10 mM EDTA, 5% Tween 20, 0,5% Triton X-100, 50 mM HEPES-zuur* ) met 200 & mok proteïnase K, vortex zeer goed en incubeer de monsters enkele uren bij 55 & degC of beter 's nachts bij 37 & deg-55 & degC (hoe langer hoe beter, totdat het weefsel is opgelost) met af en toe vortexen.
  2. Voeg 700 l chloroform toe, vortex zeer goed gedurende 1 minuut en creëer een emulsie (in de MM300 Mixer Mill bij 30 Hz) optioneel: incubeer de monsters bij 55°C gedurende 30 min.
  3. Spin op maximale snelheid in een microcentrifuge gedurende 5 minuten.
  4. Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 2 ml met 500 ul 2-propanol en 100 &mul 3M Na-acetaat, vortex zeer goed en centrifugeer de buisjes op maximale snelheid in een microcentrifuge gedurende 4 minuten.
  5. Gooi het supernatant weg en voeg 1,8 ml 70% ethanol toe aan de buis en vortex de buis goed gedurende 5 minuten bij 14000 rpm en gooi het supernatant opnieuw weg.
  6. De DNA-pellet niet drogen en onmiddellijk oplossen in 300 μl 1xTE, pH 8,0 (met RNAse A) bij 55°C gedurende 10-20 minuten.

Protocollen

Auteursrechten

U bent geautoriseerd om de materialen op deze website alleen voor uw interne informatiedoeleinden te bekijken, op voorwaarde dat u:
(i) alle kennisgevingen in de originele materialen bewaren
(ii) alleen afbeeldingen gebruiken met omringende tekst met betrekking tot de afbeeldingen en
(iii) de volgende copyrightvermelding bevatten.


8 toptips voor immunoprecipitatie

I mmunoprecipitatie, of IP, is een gevestigde techniek voor de isolatie van eiwitten uit, nou ja, een nogal chaotisch mengsel van vele andere eiwitten in oplossing. De oplossing kan van alles zijn, van een weefselhomogenaat tot een cellysaat, maar het doel blijft hetzelfde: isolatie van één specifiek eiwit en niets anders - of in ieder geval heel weinig anders (zoals in het geval van co-immunoprecipitatie). Er zijn zelfs protocollen die zijn aangepast van de eiwit-IP-procedure voor de isolatie van chromatine (ChIP) en RNA (RIP), maar in deze blogpost zullen we ons alleen concentreren op de eiwitversie en tips geven over hoe u betere IP-experimenten kunt uitvoeren.

1. Lysaatvoorbereiding

Er is een oud gezegde in de Engelse taal: je komt er alleen uit wat je erin stopt, en dit gezegde is waar voor IP-experimenten. U wilt beginnen met een behoorlijke hoeveelheid materiaal, streef naar tussen de 1 en 3 mg totaal eiwit voor elke 0,2-0,5 ml van uw startmonstervolume. U moet er ook naar streven uw doeleiwit zo gelukkig mogelijk te houden tijdens de ontwrichtende procedure van cel- of weefsellysis. Het is echt een evenwichtsoefening: de ideale lysisbuffer laat eiwitten in hun oorspronkelijke conformaties en minimaliseert de denaturatie van antilichaambindingsplaatsen, maar geeft ook voldoende eiwit vrij om te vangen en te analyseren. Het Proteintech-lab gebruikt meestal RIPA-buffer, die efficiënte cellysis en eiwitoplosbaarheid mogelijk maakt, terwijl eiwitafbraak en interferentie met de immunoreactiviteit en biologische activiteit van de eiwitten worden vermeden. Het gebruik van RIPA-buffer resulteert in een lage IP-achtergrond en is met name handig voor verstoring van het kernmembraan voor kernextracten, maar het kan kinasen denatureren, dus pas op als kinase-activiteit uw doel is! En vergeet niet een proteaseremmer toe te voegen (en een fosfataseremmer als je naar fosforylering kijkt!)

Ons RIPA-bufferrecept vind je hier. Als u op zoek bent naar een alternatief voor RIPA-buffer, is ons belangrijkste advies om zo mogelijk het zout en de wasmiddelen te sparen! Houd u aan beproefde buffers (u kunt veel recepten vinden op wetenschappelijke fora) en als u uw bufferrecepten een beetje moet aanpassen, blijf dan binnen het bereik dat hieronder wordt aanbevolen door Harlow en Lane, pagina 231 (zie het kader hieronder).

2. Kies verstandig uw antilichaam

Over het algemeen moet u overwegen om, waar mogelijk, een polyklonaal antilichaam te gebruiken voor het vangen van uw doeleiwit. Figuur 1 geeft een goede visuele verklaring waarom dit het geval is, maar in het algemeen streef je naar het opzetten van een antigeen-antilichaam-immuuncomplex aan het begin van de IP-procedure. Omdat polyklonalen meerdere epitopen op het doeleiwit binden, behouden ze een grotere hoeveelheid ervan. Omdat het doel is om eventuele ongewenste eiwitten en bestanddelen later weg te spoelen, moeten de retentiepercentages behoorlijk hoog zijn om niet ook uw monster weg te spoelen! Daarom moet een polyklonaal van goede kwaliteit uw eerste keuze zijn voor een IP-procedure.

Figuur 1: Polyklonaal versus monoklonaal als capture-antilichamen. Polyklonalen vormen sterker bindende immuuncomplexen met hogere retentiesnelheden.

Het uitgebreide assortiment polyklonalen van Proteintech is ideaal voor IP, omdat ze niet alleen voldoen aan de bovenstaande functiebeschrijving, maar ook goed zijn in het herkennen van inheemse, intacte epitopen. Inheemse epitopen zullen nog steeds hun driedimensionale bevestigingen behouden, en aangezien Proteintech-antilichamen tegen hele eiwitten worden opgewekt, kunnen ze hele, intacte eiwitten in het IP-monster redelijk goed herkennen. (Dat gezegd hebbende, is het een goed idee om een ​​monoklonaal antilichaam te gebruiken voor detectie in het stadium van Western blotting (WB), maar daar komen we later op terug!)

3. Preclearen of niet preclearen

Preclearing is een stap die voorkomt dat niet-specifieke eiwitten, lipiden, koolhydraten of nucleïnezuren die u niet wilt binden aan de vaste drager die u in uw IP-experiment gebruikt. De stap wordt uitgevoerd door incubatie van het lysaat met de vaste drager (bijv. agarosekorrels) in afwezigheid van het invangantilichaam. De vaste drager die wordt gebruikt voor preclearing, en dus alles wat eraan gebonden is, wordt dan weggegooid. Deze stap is afhankelijk van het type vaste drager. Het komt ook neer op hoe goed uw detectie-antilichaam is en hoeveel van uw eiwit van belang in het lysaat zou kunnen zijn. Sommige vaste dragers binden eerder niet-specifiek aan bepaalde eiwitten, dus controleer eerst de aanbevelingen van de fabrikant. Mogelijk kunt u preclearing overslaan.

Er is ook een preclearing-techniek waarbij een niet-specifiek antilichaam van hetzelfde isotype als het capture-antilichaam wordt toegevoegd - dit kan worden gedaan om alles te verwijderen dat ook niet-specifiek aan het capture-antilichaam zou kunnen binden tijdens precipitatie.

Over het algemeen preclearen we geen lysaten in het Proteintech-lab bij het uitvoeren van onze IP-validaties, omdat preclearing moeilijk te controleren is wanneer u regelmatig een groot aantal IP's uitvoert (zie ook het deel over de kwaliteit van het detectieantilichaam hierboven). Het is niet altijd nodig en vereist een zorgvuldige beoordeling van de hoeveelheid preclearingreagentia die nodig is om onnodig monsterverlies te voorkomen.

4. Wassen en uitwassen - let op hoe je gaat!

Het effect van centrifugeren op de uitkomst van een IP-experiment wordt vaak onderschat. Centrifugatie van het immuuncomplex met een te hoge snelheid zal de antilichaam-antigeen-interacties in het immuuncomplex verstoren en monsterverlies vóór elutie veroorzaken. Om die reden raden wij aan om centrifugeren volledig uit de was- en elutiestappen te laten. Voer in plaats daarvan wassen uit en verkrijg eluties met behulp van zwaartekrachtstroom door filterkolommen die in microfugebuizen zijn geladen.

5. Geëlueerde monsters versus gekookte monsters

Traditionele maatregelen om de signaal-ruisverhoudingen te verbeteren, hebben tot doel zoveel mogelijk doeleiwit te behouden ten koste van een efficiënte scheiding van immuuncomplexen in de laatste stadia van IP. Stappen die hiervoor worden ondernomen, omvatten meestal het weglaten van reductiemiddelen uit de elutiebuffer of de kookstap voorafgaand aan SDS-PAGE. Soms wordt elutie volledig weggelaten en worden monsters die nog aan de vaste fase vastzitten, gekookt na de wasfasen (zie Afbeelding 2A ). De resultaten zijn WB's die mogelijk een verbeterd doelsignaal hebben, maar enorme hoeveelheden niet-specifieke kleuring bijgedragen door de aanwezigheid van de vaste fase (zie Figuur 2 ). We raden u ten zeerste aan dit niet te doen en uw monsters eerst van de vaste drager te elueren voordat de gel wordt geladen.

Figuur 2: Toont vergelijking van kokende monsters (nog steeds bevestigd aan vaste drager) onmiddellijk na wassen (A) en na elutie (B) met behulp van PH 2-buffer (150 mM glycine, 500 mM NaCl) en geneutraliseerd voordat ze op een SDS-PAGE-gel worden geladen . Vang- en detectieantilichaam was anti-NFKBIA (cat.nr. 10268-1-P) secundaire detectie werd gedaan met HRP-geconjugeerd proteïne A (zie de sectie over alternatieve detectiemethoden). Cellysaat: HeLa.

6. Bewaar je breuken!

Het is raadzaam om vast te houden aan al uw IP-fracties (inclusief monsters van eventuele preclearing die u uitvoert) om ze later via SDS-PAGE te analyseren, mochten uw eerste pogingen tot immunopreciptatie niet succesvol zijn.

7. Antilichaamparen

Het gebruik van antilichaamparen, d.w.z. een vangantilichaam van de ene soort, en een antilichaam voor WB-detectie van een andere, is een extra factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het plannen van een IP-experiment. Het betrokken antilichaamselectieproces moet ervoor zorgen dat beide antilichamen verschillende epitopen van het doeleiwit herkennen, naast dat ze afkomstig zijn van verschillende soorten. Het antilichaamtype (d.w.z. polyklonaal of monoklonaal) is ook belangrijk. We stellen voor waar mogelijk een combinatie van een polyklonaal vangantilichaam en een monoklonaal antilichaam voor detectie, dit zorgt voor maximale efficiëntie van de vangst met een hoge detectiespecificiteit. Zie het voorbeeld in figuur 3 .

Figuur 3: Vergelijking van het gebruik van een polyklonaal vangantilichaam (10782-2-AP) en een monoklonaal detectieantilichaam (60019-1-Ig) (A) met hetzelfde antilichaam (10782-2-AP) voor zowel vangst als detectie (B ). Secundaire detectie werd uitgevoerd met HRP-geit-anti-muis (A) en HRP-geit-anti-konijn (B). Het gebruikte cellysaat was K-562 volledig cellysaat.

8. Probeer een alternatieve detectiemethode!

Iedereen die ooit eerder een IP-experiment heeft gedaan, weet dat de zware keten (HC) en lichte keten (LC) van het capture-antilichaam je doelsignaal kunnen verstoren. Dit is een onvermijdelijk artefact van het moeten gebruiken van hetzelfde antilichaam voor het vangen en detecteren, en vervolgens het gebruik van een soortspecifiek antilichaam voor secundaire detectie.

Referenties

Harlow, Ed en David Lane. Antilichamen gebruiken. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
Bonifacino, Juan S. et al. Huidige protocollen in immunologie 8.3.1-8.3.28, New York: John Wiley, 2001.


Bekijk de video: КАК ВЫТАЩИТЬ ТАМПОН БЕЗ НИТОЧКИ Beauty Обзоры (Januari- 2022).