Informatie

Kun je specifieke receptoren uitschakelen bij een volwassene?


Sorry, ik heb geen goed begrip van dit onderwerp, maar ik vermoed dat "receptor-knock-out" gerelateerd is aan/een deel is van "gen-knock-out"?

En als ik het goed begrijp, is gen-knock-out momenteel nog niet mogelijk bij een volwassene (misschien mogelijk in een klein gebied/specifiek orgaan, maar niet systemisch)?

Betekent dit dat een systemische receptor knock-out niet mogelijk is en misschien wel in kleine specifieke gebieden?


Kort antwoord: Ja, het is mogelijk.

Maar er zijn enkele vereisten voor uw bezorgsysteem. "Gene knock-out" ("gen KO") betekent een dergelijke DNA-modificatie die permanent is (wordt geërfd door het nageslacht van de cel) en schadelijk voor de genfunctie (bijv. er wordt geen eiwit meer geproduceerd).

Dus uw systeem moet DNA "mutatiemiddel" afleveren aan alle cellen (van het organisme of een klein specifiek gebied). Dit kan door gebruik te maken van virussen en bijvoorbeeld het CRISPR/Cas9-systeem voor genome editing. Het idee is dat het virus de cel binnendringt, componenten tot expressie gaat brengen voor genoombewerking, zich vermenigvuldigt en naburige cellen infecteert. Wijziging in het virus kan het niet-dodelijk en minder schadelijk maken, zodat u tijdens het proces geen weefsel doodt. De levering van virussen kan plaatsspecifiek zijn (bijv. directe injectie in het gebied), het kan ook celtype specifiek zijn als het virus dienovereenkomstig is aangepast.

Onthoud ook dat CRISPR/Cas9 en andere vergelijkbare technieken een efficiëntie hebben die ver onder de 100% ligt en ook dat je vaak twee exemplaren van hetzelfde gen hebt. Dit betekent dat de totale KO-kans kwadraat is van de KO-kans van één kopie. Als voor één gebeurtenis de kans 50% is, is het voor beide 25%; 10% wordt 1%.

Dus alle hoofdcomponenten voor een dergelijk experiment bestaan ​​al.


TGF-β-signalering in vasculaire biologie en disfunctie

Transformerende groeifactor (TGF)-β-familieleden zijn multifunctionele cytokinen die hun effecten op cellen opwekken, inclusief endotheel- en wandcellen, via specifieke type I en type II serine/threoninekinasereceptoren en intracellulaire Smad-transcriptiefactoren. Knock-out muismodellen voor componenten van de TGF-β-familie van signaalroutes hebben hun cruciale belang bij een goede dooierzak-angiogenese onthuld. Genetische studies bij mensen hebben mutaties in deze signaalcomponenten in verband gebracht met specifieke cardiovasculaire syndromen zoals erfelijke hemorragische teleangiëctasie, primaire pulmonale hypertensie en Marfan-syndroom. In deze review presenteren we recente vorderingen in ons begrip van de rol van TGF-β-receptorsignalering in vasculaire biologie en ziekte, en bespreken we hoe dit kan worden toegepast voor therapie.


Receptorlocatie speelt een sleutelrol in hun functie

In het hart zijn er twee verschillende subtypes van bèta-adrenerge receptoren - bèta1 en bèta2 - die worden geactiveerd door de stresshormonen adrenaline en noradrenaline. Ze veroorzaken allebei de sterkste stimulatie van de hartslag en pompcapaciteit die we kennen. De twee subtypes lijken biochemisch sterk op elkaar, maar verschillen aanzienlijk in hun functionele en therapeutische relevantie.

Beide receptortypes kunnen het hart op korte termijn stimuleren, maar wanneer de bèta1-receptor gedurende een langere periode wordt geactiveerd, heeft deze een reeks effecten die niet worden waargenomen bij bèta2. Beta1 kan een aantal aanhoudende veranderingen teweegbrengen en is begiftigd met het vermogen om - vaak schadelijke - groei van de hartspiercellen te initiëren door verschillende genen te activeren.

Recente studies door onderzoekers van de universiteiten van Wümlrzburg en Erlangen, het Max Delbrümck Center for Molecular Medicine in de Helmholtz Association (MDC) in Berlijn en het ISAR Bioscience Institute in München-Planegg hebben nu licht geworpen op de mechanismen achter deze verschillende effecten. De onderzoeksteams hebben de resultaten van hun werk gepubliceerd in het huidige nummer van het tijdschrift Proceedings van de National Academy of Sciences.

Speciale liganden en nieuwe microscopiemethoden

"Met behulp van een fluorescerend ligand gesynthetiseerd aan de Universiteit van Erlangen en nieuwe, zeer gevoelige microscopiemethoden, konden we voor het eerst aantonen waar deze receptoren zich op hartspiercellen bevinden", legt professor Martin Lohse van het Instituut voor Farmacologie en Toxicologie bij de Julius Maximilians Universiteit van Wümlrzburg (JMU). Hij is co-hoofdauteur van de studie samen met Dr. Paolo Annibale, die waarnemend hoofd is van het Receptor Signaling Lab van de MDC. "De endogene receptoren worden op relatief lage niveaus tot expressie gebracht", legt Annibale uit. "Om hun beweging te detecteren, was het nodig om een ​​vorm van spectroscopie te gebruiken op basis van de analyse van de minuscule fluorescentiefluctuaties van het signaal."

Hieruit bleek dat bèta1-receptoren op het gehele oppervlak van hartspiercellen worden aangetroffen, terwijl bèta2-receptoren uitsluitend worden aangetroffen in specifieke structuren in deze cellen, T-tubuli genaamd. Door invaginaties van het celoppervlak creëren deze tubuli een pijpachtig netwerk dat door het hele binnenste van hartspiercellen loopt. "Een van de onderzoeksfocussen van ons team bij de MDC is de relatie tussen receptorfunctie en subcellulaire lokalisatie", voegt Annibale toe. "Dus de biofysische omgeving van T-tubuli, die gebogen membranen hebben, is van bijzonder belang voor ons."

Niet alle hartspiercellen hebben bèta1-receptoren

"De specifieke cellulaire locatie van bèta2-receptoren verklaart waarom ze een veel kleinere functionaliteit hebben dan bèta1-receptoren en waarom ze beperkt zijn tot directe en kortdurende stimulatie van het hart", legt Lohse uit. Een dergelijke stimulatie wordt gemedieerd door signalen die plaatselijk beperkt zijn tot het celmembraan. Genactivering en celgroeistimulatie vinden daarentegen plaats via verdergaande signalen die alleen kunnen worden geactiveerd aan het celoppervlak, waar alleen bèta1-receptoren zich bevinden.

Een andere verrassende bevinding van het onderzoek is dat niet alle hartspiercellen deze receptoren hebben. "Er zijn blijkbaar verschillende soorten of toestanden van hartspiercellen, dus niet alle cellen reageren op adrenaline," zei Lohse. Tot nu toe werd aangenomen dat hartspiercellen in de grote kamers allemaal hetzelfde waren.

Nieuw doelwit voor hartfalentherapie

Het is al jaren bekend dat bij chronisch hartfalen te veel adrenaline en noradrenaline in de bloedbaan circuleren en het hart zodanig stimuleren dat het veranderingen in het hart en zijn cellen veroorzaakt. Dit compenseert aanvankelijk hartfalen, maar op de lange termijn beschadigt de overmatige groei het hart. Daarom is, mede op basis van eerdere bevindingen van het Würzburg-team, het blokkeren van bètareceptoren de geaccepteerde therapie voor chronisch hartfalen geworden.

De nieuwe bevindingen laten nu zien waarom bèta1-receptoren een veel grotere rol spelen bij het veroorzaken van deze nadelige effecten dan bèta2-receptoren. Bèta1-receptoren zijn gelokaliseerd op het gehele celoppervlak, waardoor ze een meer diverse impact hebben dan bèta2-receptoren. De nieuwe kennis over de differentiële lokalisatie en duidelijke functionele effecten van bèta1- en bèta2-receptoren in het hart kan mogelijk worden benut om betere therapieën voor chronisch hartfalen te ontwikkelen. Deze zouden selectief de schadelijke effecten van bètareceptoren remmen (zoals de groei van hartspiercellen), terwijl ze tegelijkertijd de gunstige effecten activeren (zoals stimulatie van de hartfunctie).


Knock-out muizen onthullen een belangrijke rol voor alveolaire epitheliale type I-cellen in alveolaire vloeistofklaring

Actief ionentransport door basolaterale Na-K-ATPase (Na-pomp) creëert een Na+-gradiënt die de vloeistofabsorptie door het alveolaire epitheel van de longen stimuleert. De α1- en β1-subeenheden zijn de meest tot expressie gebrachte Na-pompsubeenheden in alveolaire epitheelcellen (AEC). De specifieke bijdrage van de β1-subeenheid en de relatieve bijdragen van alveolaire epitheliale type II (AT2) versus type I (AT1) cellen aan de alveolaire vloeistofklaring (AFC) werden onderzocht met behulp van twee celtype-specifieke muis-knock-outlijnen waarin de β1-subeenheid was uitgeschakeld in AT1-cellen of zowel AT1- als AT2-cellen. AFC was aanzienlijk verlaagd in beide knock-outlijnen, wat naar wij geloven voor het eerst onthult dat AT1-cellen een belangrijke rol spelen in AFC en inzicht verschaffen in AEC-specifieke rollen in alveolaire homeostase. AEC-monolagen afgeleid van knock-outmuizen vertoonden verminderde kortsluitstroom en actieve Na+-absorptie, consistent met in vivo waarnemingen. Noch hyperoxie, noch door beademing veroorzaakte longbeschadiging verhoogde de verhouding tussen nat en droog longgewicht in knock-outlongen ten opzichte van controlelongen. Knockout-muizen vertoonden verhogingen in expressie van Na-pomp β3-subeenheid en β2-adrenerge receptor expressie. Deze resultaten demonstreren een cruciale rol voor de Na-pomp β1-subeenheid in alveolair ion- en vloeistoftransport en geven aan dat zowel AT1- als AT2-cellen een belangrijke bijdrage leveren aan deze processen en aan AFC. Bovendien ondersteunen ze de haalbaarheid van een algemene benadering voor het veranderen van de alveolaire epitheelfunctie op een celspecifieke manier die direct inzicht geeft in AT1- versus AT2-celspecifieke rollen in de long.

Deze studie toont een belangrijke rol aan voor de Na-K-ATPase β1-subeenheid in ionentransport en alveolaire vloeistofklaring en dat AT1-cellen een groot deel van de alveolaire vloeistofklaring in de longen bijdragen. Compensatoire mechanismen met verhoogde β3-subeenheidniveaus en β2-adrenerge receptoreiwitexpressie kan worden geactiveerd als reactie op deletie van de β1-subeenheid.

Long alveolair epitheel, samengesteld uit alveolair epitheel type I (AT1) en type II (AT2) cellen, vormt een strakke barrière die lekkage van opgeloste stoffen en water uit de interstitiële en vasculaire compartimenten naar alveolaire luchtruimten beperkt. Regulering van alveolaire vloeistofhomeostase is gebaseerd op actief ionentransport door het alveolaire epitheel (1). Gepolariseerde lokalisatie en functie van de basolaterale Na-K-ATPase (Na-pomp) en apicale natriumkanalen (2) zijn van cruciaal belang bij transepitheliaal ionentransport en de bijbehorende vloeistofklaring door de alveolaire epitheliale barrière (3, 4).

Er wordt aangenomen dat AT2-cellen, ondanks dat ze slechts ∼ 2,5% van het alveolaire oppervlak bedekken (5), het grootste deel van de transportactiviteit in alveolair epitheel bijdragen, op basis van de hoge kanaal- en pompdichtheid in dit celtype (6). AT1-cellen brengen echter zowel epitheliale natriumkanaal (ENaC) als Na-K-ATPase-subeenheid-eiwitten (7-9) tot expressie en hebben, naast het bedekken van een groot oppervlak, een zeer hoge waterpermeabiliteit (10). Het is daarom waarschijnlijk dat AT1-cellen een belangrijke bijdrage leveren aan de klaring van alveolaire vloeistof (AFC) (11, 12), hoewel de relatieve bijdragen van AT1- en AT2-cellen aan ionentransport en AFC in de long volledig onbekend zijn.

De Na-pomp katalyseert actief transport van cytoplasmatisch Na+ in ruil voor extracellulair K+ op het basolaterale celoppervlak (13, 14). Na-K-ATPase is een heterotrimeer bestaande uit een α-, een β- en een -subeenheid. De α-subeenheid herbergt de katalytische functie van de Na-pomp, terwijl de β-subeenheid belangrijk is bij de rijping van de structuur en de functie van het holo-enzym en voor het transport en de lokalisatie ervan naar het celmembraan (15). De functie van de γ-subeenheid is minder duidelijk, maar experimenten hebben een modulerende rol van Na-pompactiviteit en ionaffiniteit aangetoond die weefselspecifiek is, op basis van de differentiële expressie van verschillende γ-subeenheden (FXYD-eiwitten) in verschillende weefsels (16) . De β1-subeenheid wordt sterk tot expressie gebracht in zowel AT1- als AT2-cellen (17), en men denkt dat Na-pompen die zijn samengesteld uit α1- en β1-subeenheden het overheersende isozym zijn dat in beide celtypen tot expressie wordt gebracht (18, 19), hoewel expressie van de α2-subeenheid in long- en AT1-cellen is gemeld (12). Een aantal in vivo studies op basis van overexpressie van de Na-pomp β1-subeenheid in de longen van knaagdieren leveren bewijs ter ondersteuning van een belangrijke rol van deze subeenheid in de Na-pompfunctie en AFC, zowel bij aanvang als tijdens longletsel (19-24). Expressie van de β3-subeenheid is aangetoond in de long van de rat (25), maar de rol van deze subeenheid in de long is grotendeels onbekend. Klinisch is bij patiënten met acuut longletsel/acuut respiratoir distress syndroom het vermogen tot hogere niveaus van AFC geassocieerd met betere resultaten (26, 27).

De primaire doelen van deze studie waren het ophelderen van de rol van de Na-pomp β1-subeenheid in actief transepitheliaal ionentransport en AFC en het bepalen van de relatieve bijdragen van AT1- versus AT2-cellen aan deze processen. We hebben twee muislijnen gegenereerd met voorwaardelijke knock-out van de β1-subeenheid in AT1-cellen of in zowel AT1- als AT2-cellen in muizenlong. Deze benadering stelde ons in staat om de bijdrage van de "1 subeenheid" direct te beoordelen in vivo en, we geloven voor de eerste keer, om specifiek de rollen van de twee verschillende soorten alveolaire epitheelcellen (AEC) in de alveolaire functie te onderzoeken. Sommige van de resultaten van deze onderzoeken zijn eerder in abstracte vorm gerapporteerd (28-30).

Muizen met een floxed allel van het Na-pomp β1-subeenheidgen (Atp1b1 F/F ) zijn gegenereerd (zien online aanvulling). Kort, Atp1b1 F/F muizen werden gekruist met Aqp5-cre muizen (31) om te genereren Atp1b1 Aqp5-cre muizen met een tekort aan de β1-subeenheid in AT1-cellen, en Sftpc-cre muizen (32) om te genereren Atp1b1 Sftpc-cre muizen met een tekort aan de β1-subeenheid in het gehele alveolaire epitheel (d.w.z. zowel AT1- als AT2-cellen). Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Southern California.

Fosfaatgebufferde zoutoplossing met 5% runderserumalbumine (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en 0,25 milligram per milliliter BSA-Alexa Fluor 594-conjugaat (Life Technologies, Carlsbad, CA) als tracer werden intratracheaal in verdoofde muizen. Alveolair vocht werd na 30 minuten opgezogen. AFC werd berekend uit fluorescentie gemeten in instillaat en aspireren.

permeabiliteit in vivo werd berekend na injectie in de halsader van 10 milligram fluoresceïne-BSA (Life Technologies) per kilogram lichaamsgewicht uit fluorescentie gemeten 2 uur later in bronchoalveolaire spoelvloeistof en serum.

De longen werden operatief verwijderd, gewogen en vervolgens 48 uur bij 65°C gedroogd. Het drooggewicht werd geregistreerd en de nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen werden berekend.

AT2-cellen werden geïsoleerd uit muizenlongen en monolagen van alveolaire epitheelcellen van muizen (MAECM) werden gekweekt zoals eerder beschreven (33).

Transepitheliale elektrische weerstand (Rt) (kΩ·cm 2 ) en spontaan potentiaalverschil (PD) (mV) van MAECM werden gemeten met behulp van een Millicell-ERS-apparaat (Millipore, Bedford, MA) op dag 6 nadat AT2-cellen waren getransdifferentieerd naar een AT1-celachtig fenotype. Equivalente kortsluitstroom (lEQ) (μA/cm 2 ) werd berekend als PD/Rt. PD en kortsluitstroom (lSC) (μA/cm2) werden gemeten in gemodificeerde Ussing-kamers in aanwezigheid of afwezigheid van terbutaline, amiloride en pimozide.

Unidirectionele flux van Na+ werd gemeten over MAECM bij 37°C met 22 NaCl (American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO).

Details over de gebruikte methoden en antilichamen vindt u in het online supplement.

Standaardmethoden zoals beschreven in online supplement werden gebruikt.

Kleuringsmethoden en informatie over antilichamen worden beschreven in het online supplement.

Details over methoden vindt u in het online supplement. De primersequenties staan ​​vermeld in Tabel 1.

Tafel 1. Kwantitatieve reverse transcriptase-polymerasekettingreactieprimers

Definitie van afkortingen: bp, basenpaar FP, forward primer RP, reverse primer.

Muizen werden gehuisvest in kooien in een hyperoxiekamer met 95% zuurstof gedurende 65 uur.

Verdoofde muizen werden geventileerd met een Inspira ASV-ventilator (Harvard Apparatus, Holliston, MA) onder niet-schadelijke of schadelijke ventilatie-omstandigheden (zien online aanvulling).

Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Ongepaarde studenten t test werd gebruikt voor vergelijkingen van twee groepsgemiddelden. Meerdere (drie of meer) groepsgemiddelden werden geanalyseerd door eenrichtingsanalyse van variantie met post-hoctests op basis van Student-Newman-Keuls-benaderingen. P < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

We hebben een muislijn gegenereerd met een voorwaardelijk (floxed) allel van de Atp1b1 gen (dat codeert voor de Na-K-ATPase β1-subeenheid) om celspecifieke gen-knock-out door Cre/loxP-recombinatie mogelijk te maken (Figuur 1). Muis Atp1b1 bevat zes exons die exon 1 codeert voor het cytoplasmatische domein van het Na-K-ATPase β1-subeenheid-eiwit, en het eerste deel van exon 2 codeert voor het transmembraandomein. De rest van het gen codeert voor het grote extracellulaire domein dat 243 van de 305 aminozuren in dit eiwit vormt. We flankeerden exon 4 van Atp1b1 met loxP-sites om een ​​voorwaardelijk allel van dit gen te creëren (Atp1b1 F/F ) ( Figuur 1 ). Cre/loxP-gemedieerde deletie van exon 4 resulteert in een frame-shift-mutatie na splitsing van exon 3 naar exon 5. Om het belang van de β1-subeenheid in de longvloeistofhomeostase van volwassen muizen en het relatieve belang ervan in AT1- versus AT2-cellen op te helderen, hebben we genereerde twee afzonderlijke regels, één met een voorwaardelijke β1 knock-out specifiek in AT1-cellen met behulp van Aqp5-cre muizen (31) en een waarbij β1 werd geïnactiveerd in zowel AT1- als AT2-cellen (alveolair epitheel-specifieke knock-out) met behulp van Sftpc-cre muizen (32). Deze twee knock-outlijnen worden aangeduid als: Atp1b1 Aqp5-cre en Atp1b1 Sftpc-cre , respectievelijk. Knock-outlijnen werden geanalyseerd om deletie van het Na-pomp β1-subeenheidgen te verifiëren (zien online aanvulling). Genomische PCR (zien Figuur E1A in de online bijlage) bevestigde dat de floxed Atp1b1 allel kon correct worden verwijderd door Cre/loxP-recombinatie. Westerse analyse (Figuur E1B) bevestigde dat Na-pomp β1-eiwit afwezig was in AT2-cellen geïsoleerd uit Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen. We hebben bevestigd (Figuur E1C) dat: Aqp5-cre activeert expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) van a ROSA mT/mG reportertransgen specifiek in AT1-cellen in het alveolaire epitheel en dat de efficiëntie van deze Cre/loxP-gemedieerde reporteractivering zeer hoog is (>90% van AT1-cellen) (31). Eindelijk hebben we dat bevestigd: Sftpc-cre activeert GFP-expressie in de ROSA mT/mG reportertransgen in zowel AT1- als AT2-cellen, hoewel het GFP-signaal aanzienlijk sterker is in AT2-cellen, deels als gevolg van de zeer dunne AT1-celarchitectuur in vivo (Figuur E1C).

Figuur 1. Gentargetingstrategie. Een Atp1b1 gentargeting-vector werd gemaakt door exon 4 te floxen, een PGK-Neo R-positieve selectiemarker stroomopwaarts van de 3'-loxP-site te introduceren en een HSV-tk negatieve selectiemarker in een 3'-flankerende positie in het genomische fragment. De Atp1b1 gentargeting-vector werd geïntroduceerd in W2-embryonale stamcellen (ES) en klonen die homologe recombinatie hadden ondergaan, werden geïdentificeerd door Southern-blot met behulp van een flankerende probe (3'FP) die een Xba I-fragment van 6,5 kb van het beoogde allel en een 10,2 -kb fragment van het wildtype allel. Positieve klonen werden vervolgens geverifieerd door PCR, met primers die een deel van 3,0 kb amplificeren aan de 5'-kant van het beoogde allel. Na karyotypering van positieve ES-celklonen werden chimere muizen geproduceerd. Kiemlijn-overdragende chimeren werden gefokt met FLPeR-muizen om de FRT-geflankeerde PGK-Neo R-selectiemarker te verwijderen, waardoor muizen werden gegenereerd die de laatste floxed herbergden Atp1b1 allel (Atp1b1 F/F ). Cre/loxP-gemedieerde deletie van exon 4 genereert een verwijderd allel (Atp1b1 exon4 ) met een out-of-frame mutatie die de coderende sequentie in exons 5 en 6 verstoort (E5 en E6). FRT, flippase-herkenningsdoel PGK, fosfoglyceraatkinase-promoter WT, wildtype.

We hebben AFC gemeten in de twee knock-outlijnen van de β1-subeenheid (Atp1b1 Aqp5-cre en Atp1b1 Sftpc-cre ) en vergeleek ze met respectieve gevlochten nestgenoot-controlemuizen (Atp1b1 F/F ). AFC in Atp1b1 Aqp5-cre knock-out muizen, die deficiënt zijn in de β1-subeenheid, specifiek in AT1-cellen, vertoonden een zeer significante (P = 0,006) reductie (43%) in AFC vergeleken met Atp1b1 F/F muizen (Figuur 2A). Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen, die de β1-subeenheid in zowel AT1- als AT2-cellen missen, onthulden een nog lagere AFC, wat significant was (P = 0,002) verminderd met 78% vergeleken met controlemuizen (Figuur 2B). Deze gegevens tonen aan dat de Na-pomp β1-subeenheid van cruciaal belang is in AFC na vloeistofinstillatie en dat zowel AT1- als AT2-cellen een belangrijke bijdrage leveren aan AFC in de long van volwassen muizen. Het deel van AFC dat kan worden toegeschreven aan AT1- en AT2-cellen kan worden geschat op respectievelijk ∼55% (dwz 43/78 = 0,55) en ∼45% (dwz [78–43]/78 = 0,45), aangenomen dat AT1/ AT2-celaantalverhoudingen zijn vergelijkbaar in controle- en knock-outmuizen op basis van histologisch onderzoek van longen van gefloxde controlemuizen en beide knock-outlijnen die geen duidelijke morfologische verschillen vertoonden (Figuur E2). AFC in Atp1b1 Aqp5-cre en Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen (respectievelijk 57% en 22% ten opzichte van gefloxde controlemuizen) zijn waarschijnlijk gebaseerd op actief natriumtransport vanwege de resterende Na-pompactiviteit.

Figuur 2. Alveolaire vloeistofklaring (AFC), longpermeabiliteit en nat-tot-droog longgewichtsverhouding (W/D) in β1 knock-out muizen. (EEN) AFC (% per uur) in Atp1b1 Aqp5-cre muizen (13,6 ± 1,5) (N = 7) was significant verminderd in vergelijking met Atp1b1 F/F muizen (23,7 ± 2,6) (N = 7). (B) AFC (% per uur) in Atp1b1 Sftpc-cre muizen (6,6 ± 1,5) (N = 4) was significant verminderd in vergelijking met Atp1b1 F/F muizen (29,8 ± 4,2) (N = 4). (C en NS) Er was geen significant verschil in in vivo permeabiliteit voor fluoresceïne – runderserumalbumine tussen Atp1b1 F/F (0.248 ± 0.047) (N = 6) en Atp1b1 Aqp5-cre muizen (0.232 ± 0.055) (N = 7) (C) of tussen Atp1b1 F/F (0.196 ± 0.020) (N = 6) en Atp1b1 Sftpc-cre muizen (0,227 ± 0,038) (N = 6) (NS). (E en F) Bij baseline, W/D van Atp1b1 F/F (4.37 ± 0.15) (N = 8) versus Atp1b1 Aqp5-cre (4.38 ± 0.05) (N = 12) muizen (E) en van Atp1b1 F/F (3.84 ± 0.08) (N = 6) versus Atp1b1 Sftpc-cre (3.88 ± 0.08) (N = 6) muizen (F) waren niet significant verschillend. **P < 0,01. NS, niet significant verschillend van elkaar (P > 0,05).

Om te onderzoeken of β1 knock-out longen een veranderde paracellulaire permeabiliteit hebben die zou kunnen bijdragen aan verlagingen van AFC, hebben we fluoresceïne-BSA geïnjecteerd in de halsader van floxed en knock-out muizen. Zoals getoond in Figuren 2C en 2D, was de longpermeabiliteit voor fluoresceïne-BSA niet verschillend in β1 knock-out muizen vergeleken met floxed controlemuizen. In overeenstemming met deze bevindingen, longen van beide Atp1b1 Aqp5-cre en Atp1b1 Sftpc-cre muizen hadden nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen die niet verschilden van hun respectieve gefloxde controlemuizen (figuren 2E en 2F), wat suggereert dat, in beide knock-outlijnen van de β1-subeenheid, de resterende Na-pompactiviteit voldoende is om de homeostase van de longvloeistof te behouden.

Bio-elektrische eigenschappen (Rt en lEQ) werden geëvalueerd in monolagen van alveolaire epitheelcellen (MAECM) van muizen, bereid door het kweken van vers geïsoleerde AT2-cellen afgeleid van Atp1b1 F/F controle en Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen. Zoals weergegeven in figuur 3A, Rt van Atp1b1 F/F controle en Atp1b1 Sftpc-cre knock-out monolagen op dag 6 waren niet significant verschillend. In tegenstelling tot, lEQ van Atp1b1 Sftpc-cre knock-out monolagen waren significant verminderd in vergelijking met Atp1b1 F/F controle monolagen, consistent met resultaten in vivo (Figuur 3B) en ondersteunt de observatie dat de Na-pomp β1-subeenheid een cruciale rol speelt in actief ionentransport door MAECM.

Figuur 3. Bio-elektrische eigenschappen en Na+-absorptie van β1 knock-out alveolaire epitheelcelmonolagen van muizen (MAECM). (EEN) Transepitheliale elektrische weerstand (Rt) aan de overkant Atp1b1 F/F MAECM (1,72 ± 0,09 kΩ·cm 2 ) (N = 42) was niet significant verschillend vergeleken met Atp1b1 Sftpc-cre MAECM (1,95 ± 0,11 kΩ·cm 2 ) (N = 45). (B) Equivalente kortsluitstroom (lEQ) was beduidend lager in Atp1b1 Sftpc-cre MAECM (3,81 ± 0,11 A/cm 2 ) (N = 45) vergeleken met Atp1b1 F/F MAECM (7,00 ± 0,18 A/cm 2 ) lEQ (N = 42). (C) Unidirectionele Na + fluxen in de apicaal-naar-basolaterale (A→B) richting waren significant lager in Atp1b1 Sftpc-cre MAECM, terwijl de fluxen in de basolateraal-naar-apicaal (B → A) richting onveranderd waren (N = 3). (NS) Netto Na + absorptie van Atp1b1 F/F en Atp1b1 Sftpc-cre MAECM (N = 3) waren significant verschillend, met lagere absorptie in knock-out monolagen. *P < 0,05 **P < 0,01 ***P < 0,001.

Om het actieve ionentransport directer te evalueren: Atp1b1 F/F controle en Atp1b1 Sftpc-cre knock-out MAECM, unidirectionele Na+-flux en netto Na+-absorptie werden bepaald onder omstandigheden van een elektrische gradiënt van nul (d.w.z. kortsluiting) in Ussing-kamers. Figuur 3C toont de unidirectionele Na+-flux in elke richting (d.w.z. apicaal naar basolateraal [A→B] en basolateraal naar apicaal [B→A]). In zowel controle- als knock-out-monolagen was de unidirectionele Na + -flux in de A → B-richting aanzienlijk groter dan die in de B → A-richting. Knock-out monolagen hadden een significant lagere unidirectionele Na + flux in de A → B-richting (P < 0.01) en onveranderde unidirectionele Na + flux in de B→A richting, vergeleken met controle monolagen. Baseline netto Na + absorptie van knock-out monolagen was significant lager dan die van controle monolagen (Figuur 3D). De netto Na+-absorptie in controle- en knock-out-monolagen was niet significant verschillend van de waargenomen actieve ionentransportsnelheid (d.w.z. lSC) tijdens de Na+-fluxmetingen (gegevens niet getoond), wat aangeeft dat de geschatte netto Na+-absorptie verantwoordelijk is voor het grootste deel van het waargenomen actieve ionentransport door MAECM.

AEC herbergt apicale amiloride-gevoelige ENaC en pimozide-gevoelige cyclische nucleotide-gated (CNG) niet-selectieve kationkanalen (4). Om te bepalen of knock-out van de Na-pomp β1-subeenheid effecten had op deze ionenkanalen, werd MAECM behandeld met ENaC- of CNG-kanaalremmers en werden bio-elektrische eigenschappen geëvalueerd. De toevoeging van amiloride aan apicale vloeistof veroorzaakte een snelle daling van ∼70% in lSC van zowel controle- als knock-out MAECM (figuren 4A en 4B). Daaropvolgende behandeling met apicaal pimozide (10 M) na 60 minuten leidde tot een lichte extra afname van lSC van beide monolagen. Toen de CNG-remmer pimozide eerst werd toegevoegd, lSC van zowel controle- als knock-out-monolagen nam geleidelijk af met -45% (figuren 4C en 4D). Toen amiloride (10 M) vervolgens aan apicale vloeistof werd toegevoegd, lSC van beide monolagen nam snel verder af met -35%. Deze gegevens suggereren dat de functie van apicale natriumkanalen onveranderd blijft in β1 knock-out MAECM.

Figuur 4. Kortsluitstroom (lSC) reactie op amiloride en pimozide. (EEN en B) Op t = 0 werd amiloride (10 M) toegevoegd aan apicale vloeistof van (EEN) Atp1b1 F/F MAECM (N = 3) en (B) Atp1b1 Sftpc-cre MAECM (N = 3). Na 60 minuten werd pimozide (10 M) toegevoegd aan apicale vloeistof. (C en NS) Op t = 0 werd pimozide (10 M) toegevoegd aan apicale vloeistof van (C) Atp1b1 F/F MAECM (N = 3) en (NS) Atp1b1 Sftpc-cre MAECM (N = 3). Na 60 minuten werd amiloride (10 M) aan de apicale vloeistof toegevoegd.

Hoewel de resterende AFC in beide β1-knock-outlijnen voldoende was om een ​​normale longvloeistofbalans in de onbetwiste long te behouden, hebben we beoordeeld of verminderde AFC bij muizen met een tekort aan de β1-subeenheid hun gevoeligheid voor longbeschadiging door hyperoxie of door beademing geïnduceerde longbeschadiging al dan niet beïnvloedde (VILI). Alle dieren ontwikkelden verhoogde nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen na 65 uur blootstelling aan >95% zuurstof (Figuur 5A), maar geen van beide Atp1b1 Aqp5-cre noch Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen vertoonden andere verhoudingen dan Atp1b1 F/F controlemuizen onderworpen aan dezelfde experimentele omstandigheden. Muizen van beide Atp1b1 F/F en Atp1b1 Sftpc-cre genotypen mechanisch geventileerd gedurende 3 uur met een piekinademingsdruk van 40 cm H2O en zonder positieve uitademingsdruk hadden significant hogere nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen in vergelijking met muizen die werden geventileerd onder niet-schadelijke omstandigheden bij 20 cm H2O, ook zonder expiratoire druk aan het positieve einde (Figuur 5B), maar er was geen significant verschil in nat-naar-droog gewichtsverhoudingen tussen controle- en knock-outmuizen na VILI.

Figuur 5. W/D bij muizen blootgesteld aan hyperoxie of onderworpen aan ventilator-geïnduceerde longbeschadiging (VILI). (EEN) W/D waren niet significant verschillend tussen gefloxeerde en knock-out muizen na hyperoxische verwonding (65 uur in >95% zuurstof). W/D in Atp1b1 F/F en Atp1b1 Aqp5-cre muizen waren 6,70 ± 0,22 versus 6,66 ± 0,09 (N = 3) en in Atp1b1 F/F en Atp1b1 Sftpc-cre muizen waren 6,47 ± 0,30 versus 5,96 ± 0,40 (N = 3). (B) Er werd geen significant verschil in W/D tussen genotypen waargenomen na ofwel niet-schadelijke (PIP = 20 cm H2O) of schadelijk (PIP = 40 cm H2O) ventilatie. W/D in Atp1b1 F/F en Atp1b1 Sftpc-cre waren 4,70 ± 0,11 versus 4,72 ± 0,02 (N = 3) na niet-schadelijke beademing en 6,12 ± 0,17 versus 6,57 ± 0,26 (N = 5) na VILI. PIP, piek inspiratiedruk. **P < 0,01 ***P < 0,001.

Beide Atp1b1 Aqp5-cre en Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen hadden normale nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen bij de basislijn (figuren 2E en 2F), wat suggereert dat resterende Na-K-ATPase-activiteit voldoende was om vloeistofhomeostase te handhaven. De Na-pomp β3-subeenheid is de op één na hoogste uitgedrukte β-subeenheid in AEC. Westerse analyse onthulde verhoogde β3-eiwitexpressie in vers geïsoleerde AT2-cellen afgeleid van Atp1b1 Sftpc-cre muizen (Figuur 6A en 6B), en antilichaamkleuring van MAECM van knockout-muizen vertoonden verhoogde expressie van β3-subeenheideiwit vergeleken met controle-MAECM (Figuur 6C en 6D), hoewel β3-subeenheidexpressie op mRNA-niveau in vers geïsoleerde AT2-cellen van de hele long of MAECM is niet veranderd (Figuur 6E–6H). Relatieve mRNA-expressieniveaus van andere α- en β-subeenheidgenen in de hele long van Atp1b1 Aqp5-cre knock-out muizen waren ofwel onveranderd of slechts matig verschillend van Atp1b1 F/F controle longen, terwijl in Atp1b1 Sftpc-cre knock-out longen werd een meer substantiële verlaging van de RNA-niveaus van de β1-subeenheid waargenomen (Figuur 6F), waarschijnlijk omdat het β1-gen in het gehele epitheel is verwijderd. evenzo, Atp1b1 Sftpc-cre knock-out AT2-cellen en MAECM vertoonden een significant lagere expressie van β1-subeenheid (figuren 6G en 6H). Expressie van Na-pomp α1-subeenheid-eiwit in AT2-cellen verkregen uit Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen waren onveranderd, terwijl β1-subeenheid-eiwit afwezig was (Figuur 6A). Verhoogde expressie van β3-subeenheid-eiwit kan bijdragen aan resterende AFC-in Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen.

Figuur 6. Expressie van Na-pompsubeenheden in natrium β1 knock-out muizen. (EEN) Representatieve Western-blots onthullen dat Na-pomp α1-subeenheid onveranderd was, β1 niet detecteerbaar was en β3 was verhoogd in alveolaire epitheliale type II (AT2) cellen van knock-outmuizen. De bovenste band in β1-blot lijkt niet-specifiek te zijn. (B) Deletie van Na-pomp β1-subeenheid verhoogde significant β3-eiwit in AT2-cellen geïsoleerd uit Atp1b1 Sftpc-cre (KO) vergeleken met Atp1b1 F/F (V/V) muizen (N = 3). (C en NS) Antilichaamkleuring van MAECM (dag 6) voor Na-pomp β3-subeenheid in Atp1b1 F/F cellen (C) en Atp1b1 Sftpc-cre cellen (NS) toont verhoogde expressie in MAECM gegenereerd uit β1 knock-out muizen. (EH) Relatieve mRNA-expressie van α- en β-subeenheidgenen in de hele long van (E) Atp1b1 Aqp5-cre en (F) Atp1b1 Sftpc-cre muizen (N = 4), en (G) geïsoleerde AT2-cellen (N = 3) en (H) MAECM van Atp1b1 Sftpc-cre muizen (N = 3). Niveaus zijn relatief ten opzichte van expressie in Atp1b1 F/F controlelong, geïsoleerde AT2-cellen of MAECM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Toen terbutaline werd toegevoegd aan het instillaat in AFC-experimenten, nam AFC in beide aanzienlijk toe Atp1b1 Aqp5-cre en Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen, die niveaus bereiken die dicht in de buurt komen van de gemeten in Atp1b1 F/F controlemuizen (+Terbutaline in Figuren 7A en 7B). Dit was in tegenstelling tot AFC in de afwezigheid van terbutaline, die significant lagere AFC vertoonde in beide knock-out muizen (aTerbutaline in Figuren 7A en 7B). Om de mogelijkheid te onderzoeken dat deze waarnemingen kunnen worden veroorzaakt door een hogere expressie van de β2-adrenerge receptor (β2AR) in knock-outmuizen hebben we westerse analyse van de hele long uitgevoerd. Zoals getoond in Figuren 7C en 7D,2AR-eiwitniveaus waren significant hoger in de longen van muizen van beide knock-outlijnen in vergelijking met die van controlemuizen, wat kan bijdragen aan een verhoogde respons op terbutaline-stimulatie en resterende AFC in Atp1b1 Aqp5-cre en Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen.

Figuur 7. AFC in de afwezigheid of aanwezigheid van terbutaline en westerse analyse van β2-adrenerge receptor (β2AR) expressie in Na pomp β1 knock-out muizen. (EEN) AFC-metingen in afwezigheid van terbutaline toonden een lagere AFC-in Atp1b1 Aqp5-cre versus controlemuizen. Terbutaline-gestimuleerde AFC daarentegen Atp1b1 Aqp5-cre muizen bereikten 22,5 ± 2,6% per uur (N = 4), wat niet significant verschilde van Atp1b1 F/F controlemuizen (27,3 ± 4,7% per uur, N = 4). (B) AFC in afwezigheid van terbutaline was significant lager in Atp1b1 Sftpc-cre versus controlemuizen, terwijl terbutaline-gestimuleerde AFC in Atp1b1 Sftpc-cre muizen was 30,9 ± 1,0% per uur (N = 4), wat niet significant verschilde van Atp1b1 F/F controlemuizen (36,4 ± 2,9% per uur, N = 4). (C en NS) Westerse analyse van β2AR-eiwit in hele long in (C) Atp1b1 Aqp5-cre en (NS) Atp1b1 Sftpc-cre muizen vertonen verhoogde expressie in beide knock-outlijnen vergeleken met Atp1b1 F/F muizen onder controle. *P < 0,05 **P < 0,01.

We hebben twee muislijnen gegenereerd en geanalyseerd die de knock-out van de Na-K-ATPase β1-subeenheid herbergen, alleen in AT1-cellen (Atp1b1 Aqp5-cre muizen) of in zowel AT1- als AT2-cellen (Atp1b1 Sftpc-cre muizen) in de longen. AFC werd verlaagd met 78% in Atp1b1 Sftpc-cre muizen, die bewijs leveren voor een belangrijke rol van de β1-subeenheid onder omstandigheden van overmatig alveolair vloeistofvolume. AFC werd ook aanzienlijk verlaagd in Atp1b1 Aqp5-cre muizen (met 43%), wat aangeeft dat AT1-cellen een belangrijke bijdrage leveren aan actief ionentransport en de bijbehorende vloeistofklaring (∼55% van de totale AFC) in de long van de muis. Er waren geen veranderingen in de longpermeabiliteit bij muizen met een tekort aan de Na-pomp β1-subeenheid.Ondanks lager actief ionentransport en verminderde AFC, hadden beide knock-outlijnen normale nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen bij baseline, en er werden geen verschillen in nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen waargenomen tussen genotypen na hyperoxie of VILI. Analyse van de bio-elektrische eigenschappen van gekweekte AEC-monolagen toonde aan dat AT1-achtige cellen die deficiënt zijn in de Na-pomp β1-subeenheid significant verminderde actieve Na+-absorptie en lEQ (en lSC), consistent met de waarneming dat knock-outmuizen niet in staat waren om vloeistof met dezelfde snelheid te verwijderen als gefloxde controlemuizen en aan te tonen dat de β1-subeenheid cruciaal is voor AFC. Eindelijk, in vitro analyse onthulde dat Rt was niet beïnvloed in MAECM-deficiëntie in de β1-subeenheid, consistent met onveranderde permeabiliteit in knock-outlongen.

In figuur 6E, die subeenheidexpressieniveaus in de hele long in AT1-celspecifieke knock-outmuizen laat zien, bereikte de afname in β1-mRNA geen statistische significantie. Gezien het feit dat AT2-cellen in grotere aantallen aanwezig zijn dan AT1-cellen in de long (∼2:1) (5), kan een relatief beperkt effect op de β1-expressieniveaus van de hele long worden verwacht in AT1-celspecifieke knock-outlongen. Het is ook mogelijk dat het β1-expressieniveau per cel verschilt tussen wildtype AT1- en AT2-cellen. Als het niveau hoger is in AT2-cellen, zou dit ook bijdragen aan de schijnbaar beperkte afname van β1-mRNA in hele longen van AT1-celspecifieke knock-outmuizen. Een compenserende toename van β1-expressie in AT2-cellen in AT1-celspecifieke knock-outmuizen zou hetzelfde effect hebben als het maskeren van het verlaagde mRNA-niveau in AT1-cellen bij het analyseren van expressie in de hele long. De verlaagde mRNA-niveaus van de α1-, α2- en β2-subeenheden in vers geïsoleerde AT2-cellen getoond in figuur 6G waren relatief klein maar niettemin significant. Op eiwitniveau konden we α1 detecteren, dat niet significant veranderde (Figuur 6A), terwijl α2- en β2-eiwitten niet detecteerbaar waren. Uit andere onderzoeken met natriumpompsubeenheden is bekend dat veranderingen in het mRNA-niveau niet altijd worden weerspiegeld op het eiwitniveau (bijv. β1-subeenheid is verhoogd op het mRNA-niveau in rattenlongen die zijn blootgesteld aan hyperoxie, terwijl er geen overeenkomstige toename van β1-eiwit werd waargenomen. gevonden [34]).

AT1-celspecifieke β1-knockout-muizen vertoonden een reductie van ∼43% in AFC, terwijl dieren die β1 in zowel AT1- als AT2-cellen misten, ∼78% reductie in AFC vertoonden. Zoals hierboven vermeld, geven deze resultaten aan dat een groot deel (∼55%) van AFC in de long normaal gesproken wordt aangedreven door AT1-cellen, wat naar onze mening het eerste directe bewijs is dat een belangrijke bijdrage van AT1-cellen aan AFC in de long ondersteunt. . Aangezien het aantal AT2-cellen in de long groter is dan het aantal AT1-cellen (5), is de bijdrage van AFC per AT1-cel groter dan dat per AT2-cel. Deze bevinding staat in contrast met de eerdere veronderstelling dat AT2-cellen verantwoordelijk zijn voor het grootste deel van het ionentransport (en het begeleidende vocht) in de long (6). Omdat het totale oppervlak van AT1-cellen echter veel groter is dan dat van AT2-cellen (73-voudig verschil in rattenlong [5]), is de dichtheid van Na-pompen per AT2-cel waarschijnlijk veel hoger dan die per AT1-cel. In deze berekeningen van de relatieve bijdrage aan AFC van AT1- en AT2-cellen, namen we aan dat β1 efficiënt en op vergelijkbare wijze wordt uitgeschakeld in zowel AT2- als AT1-cellen in de Atp1b1 Sftpc-cre knock-out lijn, wat waarschijnlijk is omdat de Sftpc promotor die de auto bestuurt cre transgen komt vroeg tot expressie tijdens de longontwikkeling (35) en de Atp1b1 gen zal dus worden verwijderd in voorlopers van zowel AT2- als AT1-cellen (36). Figuur E1C (rechter paneel) toont efficiënte Cre-gemedieerde reporteractivering, resulterend in GFP-expressie in zowel AT1- als AT2-cellen, hoewel expressie aanzienlijk zwakker is in AT1-cellen. Omdat het gemyristoyleerde GFP-reportereiwit dat wordt gecodeerd door de ROSA mT/mG transgen in het plasmamembraan wordt ingebracht, zou een gelijke hoeveelheid gemyristoyleerd GFP tot expressie gebracht per cel in AT2- en AT1-cellen naar verwachting resulteren in een zwakker signaal in AT1-cellen gezien hun aanzienlijk grotere celoppervlak. Bij het vergelijken van de twee knock-outlijnen en het berekenen van de relatieve bijdragen van AT1- en AT2-cellen, zijn we uitgegaan van een gelijke knock-outefficiëntie in AT1-cellen in de twee lijnen op basis van efficiënte reporteractivering in AT1-cellen in beide Aqp5 cre ROSA mT/mG en Sftpc cre ROSA mT/mG (Figuur E1C, links en rechter paneelrespectievelijk).

Geïsoleerde muis-AT2-cellen gekweekt op polycarbonaatfilters transdifferentiëren in AT1-achtige cellen en vormen functionele monolagen met hoge Rt die geschikt zijn voor karakterisering van ionentransport en bio-elektrische eigenschappen (33). Aangezien Na-pomp β1-subeenheid de meest tot expressie gebrachte β-subeenheid in de long is, veronderstelden we dat knock-out van Atp1b1 zou resulteren in een verminderd actief Na+-transport. MAECM-deficiënt in β1-subeenheid vertoonde een lagere netto Na+-absorptie in vergelijking met MAECM van gefloxeerde muizen. Deze resultaten, die het belang aantonen van de Na-pomp β1-subeenheid voor ionentransport in AT1-achtige cellen in kweek, zijn consistent met onze bevindingen in vivo in Atp1b1 Aqp5-cre muizen waarbij deletie van β1 specifiek in AT1-cellen resulteerde in een grote verlaging van AFC. In experimenten om reacties in MAECM op een remmer van ENaC (amiloride) of CNG (pimozide) kanalen te evalueren, vonden we proportionele remming van actief ionentransport in knock-out- en controlemuizen, wat suggereert dat β1-subeenheiddeficiëntie de relatieve bijdragen van deze kanalen niet verandert. naar transepitheliaal ionentransport. Omdat bekend is dat pimozide D . beïnvloedt2-dopaminereceptoren, kunnen we de mogelijkheid niet volledig uitsluiten dat de waargenomen effecten van pimozide op lSC mogelijk verschillend zijn geweest tussen de genotypen. Verhoogde expressie van β3-subeenheid en β2AR in MAECM waren niet voldoende om ionentransport te herstellen. Hoewel is gerapporteerd dat β1-subeenheden in naburige cellen direct interageren als adhesiemoleculen (37-39), Rt was niet verlaagd in β1 knock-out MAECM. Hoewel niet opgenomen in deze studie, is evaluatie van de bio-elektrische eigenschappen van MAECM afgeleid van AT2-cellen van Atp1b1 Aqp5-cre muizen zouden de effecten van de novo β1 gendeletie. Het β1-subeenheidgen zou dus geleidelijk worden verwijderd tijdens het proces van transdifferentiatie van AT2-cellen tot AT1-cellen, omdat getransdifferentieerde cellen zich beginnen uit te drukken. Aqp5 en Cre. In beide knock-outmodellen is deletie van het β1-subeenheidgen afhankelijk van het spatiotemporele expressieprofiel van de promotor die Cre-expressie aanstuurt. Sftpc-cre komt al tot expressie in vroege longvoorlopers in het zich ontwikkelende embryo, terwijl Aqp5-cre bereikt perinataal aanzienlijke expressieniveaus. Omdat alle onderzoeken bij volwassen muizen zijn uitgevoerd, kunnen er in beide knock-outlijnen compensatiemechanismen zijn ontstaan.

We hebben geen verschillen gedetecteerd in de verhouding tussen nat en droog longgewicht tussen genotypen na hyperoxie of VILI, hoewel de verhouding tussen nat en droog longgewicht relatief ongevoelig is voor kleine veranderingen in het alveolaire vloeistofvolume. Hoewel AFC-gegevens nuttiger zouden zijn geweest, verhinderden technische uitdagingen een nauwkeurige meting van AFC in gewonde longen. De afwezigheid van hogere nat-tot-droog longgewichtsverhoudingen na verwonding bij β1 knock-out muizen versus controlemuizen kan gedeeltelijk het gevolg zijn van een compenserende toename in expressie van natriumpomp β3-subeenheid en/of verhoogde expressie van β2-adrenerge receptoren. Expressie van de β3-subeenheid is gemeld in normale rattenlongen (25), maar er zijn geen rapporten over de rol ervan bij longbeschadiging. Verhoogde uitdrukking van β2-adrenerge receptoren in knock-out muizen correleerden met een verhoogde respons op terbutaline, wat een mogelijke rol ondersteunt van adrenerge signalering als compensatiemechanisme in β1 knock-out longen. Een hogere toename (∼4-voudig) in AFC als reactie op terbutaline-in Atp1b1 Sftpc-cre knock-out muizen is waarschijnlijk een weerspiegeling van verhoogde adrenerge signalering in zowel AT1- als AT2-cellen, omdat beide celtypen β1 missen in deze knock-outlijn. In Atp1b1 Aqp5-cre knock-out muizen, β1 ontbreekt echter alleen in AT1-cellen, dus de adrenerge respons zal minder uitgesproken zijn (∼2-voudig) omdat verhoogde adrenerge signalering waarschijnlijk alleen in AT1-cellen plaatsvindt. Deze redenering is gebaseerd op de veronderstelling dat verhoogde adrenerge signalering een intrinsieke reactie is in cellen die het β1-eiwit missen en dat verhoogde adrenerge responsiviteit alleen in deze cellen wordt gevonden. We hebben de expressieniveaus van Na-pomp γ-subeenheden in β1 knock-out muizen niet onderzocht, hoewel een recent rapport expressie van alle zeven aantoonde. FXYD genen (coderend voor γ-subeenheden) in menselijke longen op mRNA-niveau (40). Deze studie suggereerde ook dat FXYD1 een negatieve regulator is van de Na-pompactiviteit en dat verhoogde expressie van FXYD1 in de longen van patiënten met ARDS kan wijzen op een rol voor γ-subeenheden bij gebrekkig ionentransport en vochtopruiming.

Deze bevindingen van longepitheelceltype-specifieke β1-subeenheid-knockout-muizen tonen een belangrijke bijdrage van AT1-cellen, groter dan die van AT2-cellen, aan alveolair ionentransport en AFC. Resterende AFC in β1-subeenheid-knockout-muizen, mogelijk gedeeltelijk veroorzaakt door verhoogde expressie van β3-subeenheid en β2AR lijkt voldoende om de homeostase van longvocht op baseline te handhaven. Deze studies tonen aan, we geloven voor de eerste keer, dat de rollen van AEC in de longen kunnen worden aangepakt op een AT1- versus AT2-celspecifieke manier in vivo, wat leidt tot een beter begrip van de klinische implicaties met betrekking tot specifieke celtypen in alveolair epitheel. Opheldering van de relatieve bijdragen van AT1- en AT2-cellen aan de alveolaire functie/homeostase kan helpen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen van longziekte.

De auteurs danken de USC Transgenic Core onder leiding van Dr. Robert Maxson en Dr. Nancy Wu voor vruchtbare samenwerkingen om Atp1b1 F/F muizen Dr. Gökhan Mutlu, Northwestern University, voor het genereus delen van AFC-protocollen en expertise van muizen en Dr. Alicia McDonough, USC, voor het delen van polyklonale β3-antilichamen van konijnen. Histologie- en microscopiediensten werden geleverd door de Cell and Tissue Imaging Core van het USC Research Center for Liver Diseases (National Institutes of Health P30 DK048522 en S10 RR022508).


Defecte aangeboren immuniteit en hyperontsteking bij pasgeboren cystische fibrose Transmembraangeleidingsregulator'x2013Knock-out fretlongen

Mucociliaire klaring (MCC) en submucosale klieren zijn belangrijke componenten van de aangeboren immuniteit van de luchtwegen die een verminderde functie hebben bij cystische fibrose (CF). Hoewel beide afweersystemen zich postnataal in de fret ontwikkelen, blijven de longen van pasgeboren fretten steriel in de aanwezigheid van een functionerend gen voor transmembraangeleidingsregulator voor cystische fibrose. We evalueerden verschillende componenten van aangeboren immuniteit en ontsteking van de luchtwegen in de vroege CF fretlong. Bij de geboorte verschilden de percentages van MCC niet tussen CF- en niet-CF-dieren, maar de hoogte van de luchtwegoppervlaktevloeistof was significant verminderd bij pasgeboren fretten met CF. CF-fretten hadden een verminderde MCC na een leeftijd van 7 dagen, ondanks normale tarieven van ciliogenese. Alleen niet-CF-fretten uitgeroeid Pseudomonas direct na de geboorte in de longen geïntroduceerd, terwijl beide genotypen zouden kunnen uitroeien Stafylokokken. CF bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) had een significant lagere antimicrobiële activiteit selectief tegen Pseudomonas dan niet-CF BALF, dat ongevoelig was voor veranderingen in pH en bicarbonaat. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie en cytokine-analyse van BALF van steriele keizersnede en niet-steriele natuurlijk geboren dieren toonden CF-geassocieerde stoornissen in IL-8, TNF-α en IL-β, en routes die immuniteit en ontsteking regelen, inclusief de complementsysteem, macrofaagfuncties, zoogdierdoelwit van rapamycine-signalering en eukaryote initiatiefactor 2-signalering. Interessant is dat tijdens de geboorteovergang IL-8 selectief werd geïnduceerd in CF BALF, ondanks dat er geen genotypisch verschil was in bacteriële belasting kort na de geboorte. Deze resultaten suggereren dat pasgeboren CF-fretten defecten hebben in zowel aangeboren immuniteit als inflammatoire signalering die belangrijk kunnen zijn bij het vroege begin en de progressie van longziekte bij deze dieren.

Diermodellen zijn van onschatbare waarde voor het onderzoeken van de pathogenese van longziekte met cystische fibrose (CF). In deze studie hebben we verschillende componenten van aangeboren immuniteit en ontsteking van de longen gekarakteriseerd bij cystische fibrose transmembraan geleidingsregulator-knock-out fretten bij de geboorte. We ontdekten dat de luchtwegen van pasgeboren CF-fretten uitgedroogd zijn, niet in staat zijn om bacteriën uit te roeien als gevolg van pH-onafhankelijke defecte antimicrobiële activiteit van longafscheidingen, en ontregelde inflammatoire signaalroutes in de longen hebben, zowel voor de geboorte als na de eerste bacteriële blootstelling tijdens de geboorte.

Longziekte blijft de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij cystische fibrose (CF), een ziekte die wordt veroorzaakt door defecten in het chloridekanaal voor de transmembraangeleidingsregulator (CFTR) van cystische fibrose (1). Eén model van de pathogenese van luchtwegaandoeningen bij CF stelt dat de afwezigheid van CFTR leidt tot hyperactivering van het epitheliale natriumkanaal en uitdroging van de periciliaire laag en de bovenliggende slijmlagen, en dat dit een omgeving creëert die ciliaire kloppen ineffectief maakt, waardoor de mucociliaire klaring in gevaar komt (MCC) en het bevorderen van bacteriële kolonisatie (2-4). Andere potentiële modellen roepen een meer directe rol op voor CFTR, met defecten in aangeboren immuundoding van bacteriën veroorzaakt door veranderde concentraties van chloride (5) of bicarbonaat (6) in de luchtwegoppervlakvloeistof als gevolg van defect CFTR-afhankelijk transport.

Naast MCC beschikt de luchtweg over tal van andere aangeboren immuunafweermechanismen waarvan is vastgesteld of verondersteld dat deze defect zijn bij CF (7, 8). Antimicrobiële eiwitten en kleine moleculen die worden uitgescheiden door het luchtwegepitheel of door submucosale klieren (SMG's) zijn noodzakelijk voor de verdediging van de luchtwegen en kunnen functioneel worden beïnvloed door het verlies van CFTR (9-13). Neutrofielen, macrofagen en dendritische cellen spelen ook een belangrijke rol in de cellulaire immuunrespons op vreemde pathogenen in de long, en toenemend bewijs suggereert dat antimicrobiële functies van deze cellen worden aangetast bij CF (7, 8, 14-17). Ondanks deze aanwijzingen dat veel aspecten van het aangeboren immuunsysteem direct worden aangetast bij CF, maakt de functionele redundantie van aangeboren immuunroutes het moeilijk om te bepalen in welke mate elk defect onderdeel bijdraagt ​​aan CF-longziekte.

Recente ontwikkelingen hebben het CF-onderzoeksveld enorm geholpen bij het onderzoeken van deze mechanismen door de creatie van de CF-varkens- en fretmodellen (18). Beide diermodellen ontwikkelen een progressieve longziekte vergelijkbaar met mensen met CF, waaronder verdikking van slijm, verstopping van de luchtwegen en longkolonisatie door talrijke soorten bacteriën (19-21). De CF-fret lijkt echter veel gevoeliger te zijn voor bacteriële longinfecties in de vroege neonatale periode, en heeft meerdere antibiotica nodig om te overleven tot het spenen (20, 21). Varkens worden geboren met een trilhaarepitheel van de luchtwegen en volledig ontwikkelde SMG's. Fretten daarentegen hebben bij de geboorte geen trilhaarcellen en SMG's in hun luchtwegen, en beide structuren ontwikkelen zich in de eerste levensmaand (22). Gezien de significante afhankelijkheid van de long van pasgeboren fretten van CFTR voor het voorkomen van bacteriële infecties, veronderstelden we dat dit model een mogelijkheid biedt om nieuwe mechanismen van gastheerafweer te ontleden die relevant kunnen zijn voor de distale luchtweg bij mensen met CF (dwz minder trilhaarcellen en gebrek aan van SMG's). We postuleerden verder dat, vanwege de postnatale ontwikkeling van trilhaarcellen en SMG's in de luchtwegen van fretten, CFTR-afhankelijke aangeboren immuunmechanismen in de long van deze soort afhankelijk zijn van de eigenschappen van de luchtwegoppervlaktevloeistof (ASL). In de huidige studie evalueerden we meerdere componenten van het aangeboren immuunsysteem van de pasgeboren en laat-embryonale CF fretlong. We identificeerden verschillende belangrijke defecten in de aangeboren immuniteit van de pasgeboren CF-fretlong, waaronder ASL-hoogte, de secretie en functie van antimicrobiële eiwitten en het doden van bacteriën. Bovendien identificeerden bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) proteomics en cytokine-analyse significante verstoringen in ontstekings- en immuniteitsroutes in de CF-long na natuurlijke geboorte. Interessant is dat proteomics en cytokine-analyse van steriele BALF van fretten met keizersnede (C-sectie) suggereert dat stoornissen in ontstekingsroutes vóór de geboorte in de CF-long kunnen bestaan ​​en de long kunnen voorbereiden op overmatige ontsteking na de eerste bacteriële blootstelling. Over het algemeen laten onze resultaten zien dat de long van de pasgeboren CF-fret verschillende aangeboren immuniteitsdefecten heeft die niet afhankelijk zijn van luchtwegklaring of SMG's, en een verhoogde ontstekingsreactie veroorzaakt op vroege bacteriële blootstelling bij de geboorte.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de University of Iowa. De CFTR knock-out (exon-10 verstoorde) fretten die in dit rapport worden gebruikt, zijn eerder beschreven (20, 21, 23) en werden ofwel gebruikt na de bevalling met een keizersnede of op verschillende tijdstippen na de natuurlijke geboorte. Voor details, zien de aanvullende materialen en methoden in het online supplement.

BALF werd geoogst van fretten door opeenvolgende lavages van 5% mannitol te verzamelen. IL-1β-, IL-8- en TNF-a-niveaus in de BALF werden bepaald met ELISA. Concentraties van stikstofmonoxide (NO) in pasgeboren CF en niet-CF fret BALF werden bepaald met behulp van de Sievers 280i Nitric Oxide Analyzer (GE Analytical Instruments, Boulder, CO). BALF-monsters werden ook verwerkt en onderworpen aan vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS/MS). Datasets die met deze techniek werden gegenereerd, werden geanalyseerd met behulp van Scaffold (Proteome Software, Portland OR) en Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, Redwood City, CA). Voor details, zien de aanvullende materialen en methoden in het online supplement.

Ferret-luchtpijpsecties werden gekleurd op lysozyme en lactoferrine door middel van immunofluorescentie en geanalyseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. BALF-monsters van pasgeboren of volwassen fretten werden geanalyseerd op de aanwezigheid van lysozyme, lactoferrine, lactoperoxidase (LPO) en oppervlakteactieve proteïne (SP)-A door Western blot. Voor details, zien de aanvullende materialen en methoden in het online supplement.

Tarieven van MCC werden geëvalueerd op luchtpijpen van fretten ex vivo door de beweging van 1,0 m fluorescerende kralen op het lumenoppervlak te meten. Ferret-luchtpijpen werden ook geanalyseerd ex vivo door microresolutie spectrale domein optische coherentie tomografie aan de Universiteit van Alabama (Birmingham, AL). Voor een gedetailleerde beschrijving van deze procedures, zien de aanvullende materialen en methoden in het online supplement.

Bacteriële challenge-experimenten werden uitgevoerd in vivo na intratracheale injectie bij pasgeboren fretten, en in vitro door bacteriën te incuberen met BALF geïsoleerd uit CF en niet-CF fretten. Voor een gedetailleerde beschrijving van deze procedures, zien de aanvullende materialen en methoden in het online supplement.

We wilden eerst de hypothese testen dat CF-luchtpijpen van fretten MCC hadden verminderd gedurende het tijdsverloop waarin ciliogenese en SMG-morfogenese plaatsvinden. Ciliogenese gedurende de eerste 3 weken van het leven was vergelijkbaar tussen genotypen, variërend van ongeveer 7% tot meer dan 50% dekking van het epitheel met trilharen tussen respectievelijk geboorte en 3 weken oud (Figuur 1A). MCC-percentages bij pasgeboren dieren waren extreem laag en er werden geen significante verschillen tussen genotypen waargenomen bij dieren van 0-3 dagen oud (Figuur 1B). Tussen de tweede en derde levensweek waren er echter grote stijgingen in de tarieven van tracheale MCC voor niet-CF-fretten, maar niet voor CF-dieren (Figuur 1B). De percentages van MCC waren 3,4- en 8,1-voudig lager bij CF-dieren (in vergelijking met niet-CF) op ontwikkelingstijdstippen die overeenkomen met ongeveer 30% (7-12 d) en ongeveer 60% (13-24 d) dekking van de cilia van respectievelijk het tracheale epitheel. Bovendien toonde lineaire regressie van MCC-percentages als een functie van het percentage ciliatie een significante positieve correlatie in niet-CF (P < 0,01 R 2 = 0,5872), maar niet CF (P = 0.06 R 2 = 0,3200), dieren. Deze resultaten laten zien dat MCC min of meer functioneel afwezig is in de luchtpijp van de fret bij de geboorte, wat suggereert dat MCC-defecten waarschijnlijk niet bijdragen aan CF-longziekte in de neonatale periode. Echter, na 1-3 weken van het leven, was de verslechtering van MCC bij CF-fretten ten opzichte van niet-CF-dieren significant, en zou dus in dit ontwikkelingsstadium mogelijk een rol kunnen spelen bij de pathogenese van longziekte.

Figuur 1. Eigenschappen van de zich ontwikkelende cystische fibrose (CF) en niet-CF fretluchtpijp. (EEN) Ciliogenese bij neonatale fretten. Secties van niet-CF en CF frettrachea's in verschillende ontwikkelingsstadia werden gekleurd voor geacetyleerd tubuline om trilhaartjes te markeren, en het percentage van het epitheeloppervlak dat met trilhaartjes was, werd bepaald met fluorescentiemicroscopie. Het percentage van het tracheale epitheliale oppervlak bedekt met trilhaartjes werd berekend voor elke leeftijdsgroep zoals beschreven. Het aantal dieren in elke leeftijdsgroep was als volgt: Dag 0, niet-CF = 11, CF = 9 Dag 1, niet-CF = 9, CF = 14 Dagen 2-3, niet-CF = 7, CF = 4 Dagen 4-6, niet-CF = 3, CF = 3 Dagen 7-12, niet-CF = 5, CF = 5, Dagen 13-24, niet-CF = 5, CF = 4. (B) Tracheale mucociliaire klaring (MCC) tarieven tijdens differentiatie. MCC werd gemeten in niet-CF en leeftijdsgebonden CF-trachea's ex vivo door de beweging van fluorescerende kralen in beeld te brengen. De dieren werden op leeftijd in groepen verdeeld zoals in (EEN), en de gemiddelde MCC-snelheden voor dieren in elke groep werden berekend. Het aantal dieren in elke leeftijdsgroep was als volgt: Dag 0, niet-CF = 10, CF = 10 Dag 1, niet-CF = 10, CF = 10 Dagen 2-3, niet-CF = 3, CF = 4 Dagen 4-6, niet-CF = 3, CF = 3 Dagen 7-12, niet-CF = 10, CF = 10 Dagen 13-24, niet-CF = 5, CF = 7. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. *P < 0,05, ****P < 0,0001 volgens Bonferroni's meervoudige vergelijkingstest. (C en NS) De hoogte van de luchtwegoppervlaktevloeistof (ASL) is verminderd in de luchtpijp van pasgeboren CF-fretten. Luchtpijpen van niet-CF en CF pasgeboren kits werden op Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium-gedrenkte Gelfoam in een vochtige kamer geplaatst en 30 minuten in evenwicht gebracht. Microresolutie spectrale domein optische coherentie tomografie (μOCT) beeldvorming werd vervolgens uitgevoerd in de lengterichting en de hoogte van de ASL in het tracheale lumen werd gemeten. (C) Representatieve μOCT-afbeeldingen van niet-CF- en CF-luchtpijpen, die de epitheliale laag (ep) en ASL-hoogte weergeven (witte verticale lijn). Schaalbalken in de rechterbovenhoek, 20 urn. (NS) Plot van ASL-hoogte in niet-CF en CF pasgeboren luchtpijpen. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. **P = 0,0014 door Mann-Whitney U-test N = 12 onafhankelijke luchtpijpen voor elk genotype.

Onlangs werd een debat over de vraag of de hoogte van de ASL bijdraagt ​​aan de pathogenese van CF-longziekte vernieuwd door de bevinding dat de hoogte van de periciliaire vloeistof niet verschilt bij CF- en niet-CF-varkens (24). Eerder hadden anderen gesuggereerd dat de CFTR-functie essentieel is voor de hydratatie van het luminale luchtwegoppervlak en dus voor een goed mucociliair transport (4, 25). Om vast te stellen of ASL-defecten aanwezig zijn in CF-fretten, analyseerden we de steady-state ASL-hoogte in de luchtpijpen van pasgeboren dieren (1-2 d oud) door microresolutie spectrale domein optische coherentietomografie, een live-beeldvormingstechniek die met succes is gebruikt om te bepalen ASL-hoogte in luchtwegmonsters van mensen en varkens (26). We ontdekten dat tracheale explantaten van niet-CF pasgeboren fretten een significant hogere (2,5-voudige) P = 0,0014) ASL-hoogte dan hun CF-tegenhangers (figuren 1C en 1D). Dit suggereert dat ofwel een verminderde vochtafscheiding ofwel een verhoogde vochtabsorptie optreedt in de luchtwegen van pasgeboren CF-fretten en mogelijk een rol kan spelen bij de ontwikkeling van longziekte.

CF-fretten ontwikkelen snelle bacteriële longinfecties binnen de eerste paar weken van hun leven (20), en er zijn meerdere antibiotica nodig om CF-dieren op te voeden tot het spenen (21). We veronderstelden dat aangeboren immuunmechanismen die verantwoordelijk zijn voor het doden van bacteriën inherent defect zijn in de CF-fret bij de geboorte. Om deze hypothese direct te testen, hebben we pasgeboren niet-CF- en CF-kits uitgedaagd met antibioticaresistente stammen van een van beide Pseudomonas aeruginosa (PA01) of Staphylococcus pseudintermedius (geïsoleerd uit een long van een volwassen CF-fret) (21) en direct getest op het doden van deze pathogenen in vivo (Figuur 2A). In dit experiment en in de volgende experimenten interpreteerden we gemeten bacteriële CFU's van lager dan input als algehele doding, en hoger dan input als algehele bacteriële groei of proliferatie. Dieren zonder CF hebben PA01 succesvol geëlimineerd ten opzichte van input-CFU (∼ 100-voudige afname P < 0,001) en in significant grotere mate (∼ 100-voudig P < 0,05) dan CF-dieren (Figuur 2B). Het is echter opmerkelijk dat het aantal bacteriën niet toenam in de CF-groep, wat aangeeft dat er geen significante bacteriële proliferatie plaatsvond in vivo. Daarentegen zagen we dat zowel niet-CF als CF pasgeboren fretten met succes werden gedood S. pseudintermedius in dezelfde mate (∼ 50-voudige afname P < 0,05) (Figuur 2C). Deze gegevens suggereren dat de in vivo aangeboren immuniteitsdefect in de pasgeboren CF-long heeft bacteriespecifieke componenten.

Figuur 2. CF pasgeboren frettenlongen kunnen niet worden bestraald Pseudomonas aeruginosa. (EEN) Schema van bacteriële challenge-assays. Pasgeboren niet-CF- en CF-kits (6-24 uur oud) werden uitgedaagd via intratracheale injectie met 1,5 x 104 CFU ampicilline-resistente P. aeruginosa (PA01) of erytromycine-resistent Staphylococcus pseudintermedius 6 uur in de luchtwegen. Het long- en tracheale weefsel werd vervolgens geoogst en gehomogeniseerd. Het totale aantal CFU werd bepaald door seriële verdunningen van longhomogenaat op Luria-Bertani-agarplaten met het juiste antibioticum uit te platen en de volgende dag kolonies te tellen. (B en C) Perceel van resultaten van in vivo bacteriële uitdaging na intratracheale injectie. Voor elk experiment werd ook de input-CFU bepaald om variatie op verschillende dagen te controleren, en de totale long-CFU werd berekend als een percentage van de input-CFU. Gemiddelde input CFU (100%) wordt aangegeven met a lijn op elke grafiek. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. *P < 0,05, ***P < 0,001, met behulp van de niet-parametrische Kruskal-Wallis-test met Dunn's meervoudige vergelijkings-posttest. (B) N = 8 niet-CF, 12 CF-dieren (C) N = 9 niet-CF, 6 CF-dieren.

De luchtwegen zijn in staat een groot aantal factoren af ​​te scheiden met directe en indirecte functies bij aangeboren immuniteit (27, 28). Onze hypothese was dat defecten in CFTR resulteren in een vermindering van de secretie van antibacteriële factoren in de luchtwegen van CF-fretten voor en na de geboorte. We hebben dus een proteomics-benadering gevolgd, waarbij we de samenstelling van BALF van natuurlijk geboren (vanaf hier aangeduid als pasgeborene, 6-24 uur oud) en C-sectie-geleverde luchtademhaling analyseerden (embryonale dag [E] 40-41) non-CF en CF fretten door LC-MS/MS. Geselecteerde eiwitten van pasgeboren en C-gesegmenteerde dieren die van belang zijn voor deze studie, worden weergegeven in tabel 1, en de volledige lijst is te vinden in tabel E1A in het online supplement (pasgeboren) en tabel E1B (C-doorgesneden). De resultaten van deze analyse toonden een aanzienlijk groter percentage unieke peptiden en eiwitten aan in zowel het pasgeboren als het C-gesegmenteerde CF BALF-monster dan dat waargenomen in niet-CF BALF-monsters (Figuur 3A-3D), wat aantoont dat de eiwitsamenstelling van vloeistof in de CF-long is aanzienlijk veranderd voor en na de geboorte. De pulmonale SP-A, SP-B, SP-C en SP-D behoorden tot de meest voorkomende eiwitten in pasgeboren BALF en waren verhoogd bij CF (Tabel 1 Tabel E1A). De overvloed aan deze oppervlakteactieve eiwitten was lager in BALF met C-sectie en miste genotypische verschillen (Tabel 1 Tabel E1B). Lactoferrine en lysozyme waren verhoogd in pasgeboren CF BALF, terwijl verschillende complementeiwitten,1-antitrypsine en apolipoproteïne A1 waren verminderd in pasgeboren CF-monsters. Sommige complementeiwitten waren op vergelijkbare wijze verminderd in BALF met C-doorsnede van CF, maar andere, zoals C3 en C6, waren verhoogd. Lactoferrine was over het algemeen verminderd in C-sectie CF BALF, terwijl lysozyme alleen detecteerbaar was in een van de drie runs bij CF. α1-Antitrypsine en apolipoproteïne A1 waren relatief onveranderd in BALF met CF C-sectie. Verschillende eiwitten die geassocieerd zijn met de neutrofielfunctie, zoals myeloperoxidase, neutrofiel elastase en neutrofiel collagenase, waren ofwel verhoogd in pasgeboren CF BALF of volledig afwezig in niet-CF BALF. Geen van deze eiwitten werd gedetecteerd in C-sectie fret BALF.

Tafel 1. Massaspectrometrie-geïdentificeerde eiwitten in bronchoalveolaire lavagevloeistof

Definitie van afkortingen: C-sectie, keizersnede CF, cystische fibrose ENSEMBL, een gezamenlijk project van het European Bioinformatics Institute, een buitenstation van het European Molecular Biology Laboratory, en het Wellcome Trust Sanger Institute N.v.t., niet van toepassing.

Vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (MS) werd drie onafhankelijke keren uitgevoerd op niet-CF en CF bronchoalveolaire lavagevloeistofmonsters van elk drie gepoolde dieren (in totaal, N = 9 niet-CF en N = 9 CF-dieren). Vouwverandering, met behulp van de gemiddelde vouwverandering in MS-ionisatie-intensiteit, wordt berekend als CF/niet-CF. Nvt geeft aan dat er geen eiwit werd gevonden in een van de genotypen.

*Remmer van ontstekingsreactie.

† Onderdeel van antimicrobiële/aangeboren immuunafweer.

‡ Potentiële modificator van luchtwegvloeistofcomponenten.

§ Structurele component/modificator van luchtwegoppervlaktevloeistof.

Figuur 3. Proteomics en pathway-analyse van bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) bij pasgeboren en keizersnede (C-sectie). Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) werd uitgevoerd op sterke kationenuitwisselingsfracties van pasgeboren (EEN, B, E, en G) of C-sectie (C, NS, F, en H) niet-CF en CF BALF. Peptiden en eiwitten werden geïdentificeerd met behulp van Mascot en de resultaten van drie afzonderlijke runs op gepoolde monsters van drie dieren van elk genotype (N = 9 niet-CF dieren N = 9 CF-dieren in totaal) werden gecompileerd in Scaffold-software. (EENNS) Venn-diagrammen vatten het totale aantal exclusieve en niet-exclusieve peptiden samen (EEN en C) en eiwitten (B en NS) in elk genotype. De vetgedrukte cijfers in elk Venn-diagram staat het aantal peptiden of eiwitten dat in elke categorie is geïdentificeerd. De procent waarden gegeven in de Venn-diagrammen vertegenwoordigen het percentage unieke peptiden of eiwitten dat wordt waargenomen binnen een bepaald genotype. (EH) Lijsten met eiwitten van elk genotype werden onderworpen aan Integrated Pathway Analysis (Qiagen) voor canonieke routes, met behulp van (E en F) alle eiwitten die in elk genotype worden gevonden en (G en H) eiwitten die exclusief in slechts één genotype zijn geïdentificeerd. De schematisch invoegen: in elke paneel geeft de ondervraagde eiwitgroepen aan. Positieve padidentificatie werd ingesteld op een drempel van P < 0,05 (afgebeeld door de stippellijn in EH Fisher's exact test). De resultaten van geselecteerde paden afgezet tegen −log(P waarde) worden weergegeven. De gegevens die worden gebruikt om te genereren E en G, en F en H zijn te vinden in respectievelijk de tabellen E2B en E2C en de tabellen E3B en E3C. CCR5, chemokine (CC-motief) receptor 5 Cdc42, celdelingscontrole-eiwit 42 eIF2, eukaryote initiatiefactor 2 ILK, integrine-linked kinase LXR, lever X-receptor mTOR, zoogdierdoelwit van rapamycine NCF, niet-CF nNOS, stikstofoxidesynthase 1 NO, stikstofmonoxide ROS, reactieve zuurstofspecies RXR, retinoïde X-receptor.

Deze proteomische resultaten suggereerden dat aangeboren immuniteit en ontstekingsroutes in de CF-long anders kunnen worden gereguleerd tijdens de overgang van een steriele (d.w.z. in de baarmoeder) naar een niet-steriele omgeving (d.w.z. tijdens en na de geboorte). Met behulp van Ingenuity Pathway Analysis hebben we verschillende belangrijke genotypische verschillen geïdentificeerd in canonieke routes die betrokken zijn bij de regulatie van immuniteit en ontstekingsreacties. Netwerken die werden gegenereerd met behulp van pasgeboren CF BALF-eiwitten waren bijvoorbeeld significanter gericht op ontstekingsroutes, waaronder IL-8, zoogdierdoelwit van rapamycine (mTOR), en leukocytenextravasatiesignalering, evenals macrofaaggerelateerde routes, zoals fagocytose en productie van reactieve zuurstofspecies en NO, dan die gegenereerd met pasgeboren niet-CF-eiwitten (Figuur 3E). Genotypische verschillen in de betekenis van deze routes waren niet zo uitgesproken in C-doorgesneden BALF (Figuur 3F), wat het concept ondersteunt dat eerste bacteriële blootstelling overmatige ontsteking in de CF-long veroorzaakt. Bovendien was de eukaryote initiatiefactor 2 (eIF2)-signaleringsroute, die is geassocieerd met macrofaaginductie van pro-inflammatoire cytokines en NF-KB na bacteriële infectie (29), ook significant verrijkt in pasgeboren, maar niet in C-sectie, CF BALF-eiwitten (Figuur 3E en 3F). Interessant is dat mTOR- en eIF2-signaleringsroutes alleen werden geïdentificeerd in pasgeboren CF BALF wanneer genotype-exclusieve eiwitten werden ondervraagd (Figuur 3G). Daarentegen identificeerden genotype-exclusieve C-gesegmenteerde eiwitten mTOR- en IL-17-signaleringsroutes alleen in niet-CF, granzyme A-signalering (een T-celroute) alleen in CF, en de eIF2-signaleringsroute was significanter in CF (Figuur 3H ). Pathways die significant minder belangrijk waren bij pasgeboren CF BALF (dwz verrijkt in de niet-CF BALF-eiwitdatasets) omvatten het complementsysteem (een belangrijk onderdeel van aangeboren immuniteit), acute-faseresponssignalering (met opwaartse regulatie van verschillende serpin-peptidaseremmers). , zoals1-antitrypsine) en lever X-receptor/retinoïde X-receptor (LXR/RXR) activering (Figuur 3E) geen van deze routes vertoonde grote genotypische verschillen in P waarde met behulp van de C-doorsnede BALF-gegevenssets (Figuur 3F). Een mogelijke neerwaartse regulatie van de LXR / RXR-route in CF BALF is bijzonder interessant, aangezien is gesuggereerd dat overmatige NF-KB-gemedieerde ontsteking bij CF het gevolg is van verminderde LXR / RXR-expressie in CF-macrofagen (30). Een volledige lijst van canonieke paden voor pasgeborenen en C-secties wordt weergegeven in respectievelijk tabel E2 en E3. We hebben ook C-secties direct vergeleken met pasgeboren canonieke routes voor elk genotype (Figuur E1). Deze analyse identificeerde opnieuw CF-geassocieerde veranderingen in ontstekingsreactieroutes, waaronder IL-8-, mTOR-, LXR/RXR- en eIF2-signalering, die uniek anders waren dan niet-CF (Figuur E1). Door bijvoorbeeld eiwitten te gebruiken die exclusief zijn voor één genotype, nam de betekenis van mTOR- en EIF2-signaleringsroutes af na natuurlijke geboorte voor niet-CF-dieren, terwijl het tegenovergestelde gebeurde bij CF-dieren (figuren E1E-E1F).

Met behulp van gegevenstabellen met eiwitnamen en de gemiddelde vouwverandering in overvloed aan eiwitten tussen pasgeboren CF en niet-CF BALF (Tabel E1A), omvatten opmerkelijke canonieke routes van groot belang: (1) LXR/RXR-activering (2) acute fase respons signalering en (3) complementsysteem (Figuur E2A Tabel E2A). De meeste eiwitten die betrokken zijn bij deze canonieke routes werden neerwaarts gereguleerd in CF BALF. Interessant is dat de significantie van alle drie deze routes hoger was in C-doorgesneden BALF (Figuur E3A en Tabel E3A). De meeste eiwitten die werden geïdentificeerd in de acute-fase-responssignalering en LXR/RXR-activeringsroutes bij dieren met een C-sectie waren neerwaarts gereguleerd in CF, wat suggereert dat er reeds bestaande afwijkingen in deze inflammatoire routes bestaan ​​vóór infectie van de CF-long. De meeste eiwitten die in pasgeboren BALF werden geïdentificeerd als onderdeel van het complementsysteem waren verlaagd in CF (Figuur E2A). Deze veranderingen zouden naar verwachting verschillende delen van elk van de drie complementroutes beïnvloeden (Figuur E2B). Interessant is dat er duidelijke en tegengestelde veranderingen waren in veel van deze complementeiwitten in C-gesegmenteerde CF BALF (Figuur E3 en Tabel 1), wat opnieuw suggereert dat reeds bestaande veranderingen in deze route aan infectie kunnen voorafgaan.

We hebben ook routeanalyse uitgevoerd op ziekten en biologische functies met behulp van de genotypische vouwverandering in de overvloed aan eiwitten van BALF van pasgeboren (Tabel E4A) of C-sectie (Tabel E5A). Verrassend genoeg zijn de belangrijkste ziektecategorieën (door P waarde) veranderd door genotype waren zeer vergelijkbaar voor zowel pasgeboren als C-sectie vergelijkingen, en omvatten immunologische ziekte, ontstekingsziekte en immuuncelhandel (figuren E4A en E4B). Interessant is dat de meest verhoogde (volgens z-score) ziektefuncties bij pasgeboren CF BALF gerelateerd zijn aan chemotaxis/migratie van lymfocyten en leukocyten (Figuur E4C), terwijl celdood en apoptose van lymfocyten tot de meest verhoogde ziektefuncties behoorden in C-sectie CF BALF (Figuur E4C). Figuur E4D). Verschillende van de meest neerwaarts gereguleerde ziektefuncties bij pasgeboren CF BALF hadden betrekking op apoptose van immuuncellen en de productie van reactieve zuurstofsoorten (Figuur E4E), terwijl ziektefuncties gerelateerd aan migratie en activering van fagocyten, macrofagen, leukocyten en lymfocyten tot de het meest significant afgenomen (door z-score) in CF C-sectie BALF (Figuur E4F). Samengevat, gerelateerde biologische functies die verhoogd waren bij CF-pasgeborenen waren verminderd in CF C-gecouponeerde dieren, en vice versa.

Pathway-analyse waarbij veranderingen tussen C-sectie en natuurlijk geboren (dwz pasgeboren) BALF binnen een bepaald genotype werden vergeleken, toonde ook aan dat veel van de biofuncties van de ziekte die werden neerwaarts gereguleerd door natuurlijke geboorte bij niet-CF, opwaarts gereguleerd waren in CF, met name degenen die betrokken zijn bij de handel in en migratie van immuuncellen (met name tabel E6 en figuur E5, zien Afbeelding E5E). Deze vergelijkingen van ziekteroutes tussen C-sectie en pasgeboren BALF suggereren sterk dat veranderingen in de immuuncelfunctie in de CF-long voorafgaan aan infectie en de long kunnen voorbereiden op een overmatige ontstekingsreactie na de eerste bacteriële blootstelling bij de geboorte.

We kozen verschillende eiwitten die in ons pasgeboren LC-MS/MS-scherm werden gevonden om verder te analyseren door middel van immunoblot (Figuur 4A). Deze analyses bevestigden dat de niveaus van lysozym en LPO (vergeleken met volwassen) extreem laag of niet detecteerbaar waren in de BALF van pasgeboren fretten (beide genotypen), en bevestigden eveneens dat lactoferrine en SP-A aanwezig waren. De niveaus van zowel lysozym als lactoferrine waren significant lager in BALF van pasgeborenen zonder CF en CF dan in overeenkomstige monsters van volwassenen, terwijl er geen significant ontwikkelingsverschil werd waargenomen in het geval van SP-A (Figuur 4B). Immunofluorescentie-analyse van lysozyme-expressie in luchtpijpen van pasgeboren en volwassen fretten bevestigde de resultaten van de Western-blot-analyse, waarbij uitgebreide kleuring in de SMG's van de volwassene werd aangetoond, maar geen enkele in de pasgeborene (Figuur 4C). Met name in de pasgeboren fret was lactoferrine in hoge niveaus aanwezig in het eenvoudige kolomvormige luchtwegepitheel, maar bij de volwassene was het gelokaliseerd in de SMG's (Figuur 4D). Alles bij elkaar genomen suggereren deze resultaten dat lactoferrine, in plaats van lysozyme of LPO, een belangrijke determinant kan zijn van aangeboren immuniteit in de zich ontwikkelende luchtwegen van fretten.

Figuur 4. Immunoblot- en immunofluorescentie-analyse van BALF-antimicrobiële eiwitten. (EEN) Western-blotting die de expressie van BALF-componenten aantoont in volwassen niet-CF, pasgeboren niet-CF en pasgeboren CF BALF-dieren. Er werden monsters verzameld en 15 g totaal BALF-eiwit van drie dieren per groep werd gescheiden met behulp van SDS-PAGE. Antilichamen die bij Western-blotting werden gebruikt, waren tegen de volgende: lysozyme (LYZ), lactoferrine (LTF), lactoperoxidase (LPO) en pulmonair surfactant-geassocieerd eiwit (SP)-A. Getoond worden afbeeldingen van verschillende representatieve Western-blot-experimenten. (B) Kwantificering van gegevens over immunoblotting. Densitometrie werd uitgevoerd op banden voor elk eiwit met behulp van Metamorph-software. Waarden werden genormaliseerd naar de gemiddelde waarde voor de volwassen monsters (ingesteld op 100%). Vanwege een gebrek aan normaliteit werden deze waarden vóór analyse getransformeerd door middel van eenrichtings-ANOVA en werd de Bonferroni-correctie toegepast voor paarsgewijze vergelijkingen (SPSS-versie 18 SPSS, Chicago, IL). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Significante verschillen tussen volwassen en pasgeboren niveau zijn gemarkeerd als: *P < 0,05, P < 0,01, ^ P < 0,001. (C en NS) Lokalisatie van lysozym (C) en lactoferrine (NS) in de luchtpijp van de fret. Cyrosecties van niet-CF pasgeboren en volwassen frettenluchtpijp werden gekleurd door immunofluorescentie (rood), en beelden werden vastgelegd met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij een totale vergroting van 200 x. Monsters werden tegengekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindol om kernen te markeren (blauw). nb, pasgeboren SAE, oppervlakteluchtwegepitheel SMG, submucosale klier(en).

Overmatige en ineffectieve luchtwegontsteking is voorgesteld als een onderdeel van CF-longziekte die bijdraagt ​​aan bacteriële kolonisatie (31). Onze BALF-proteomics-resultaten suggereerden dat inflammatoire afwijkingen in de CF-fretlong kunnen initiëren in de baarmoeder en leiden tot een abnormaal pro-inflammatoir fenotype na bacteriële blootstelling bij de geboorte. Om dit verder te onderzoeken, hebben we de niveaus van de cytokines, IL-1β, IL-8 en TNF-α, gemeten in BALF van pasgeboren en C-sectie niet-CF en CF fretten. We hebben ook NO-niveaus gemeten, wat belangrijk is voor de aangeboren immuniteit in de long en verminderd is in de uitgeademde adem van patiënten met CF en luchtwegen van CF-muizen (32, 33). Zoals getoond in Figuren 5A-5D, waren de concentraties van IL-1β en NO die werden gedetecteerd in pasgeboren CF BALF significant lager dan die in de niet-CF BALF, terwijl die van IL-8 en TNF-α significant verhoogd waren. Veranderingen in deze BALF-cytokinen en de overvloed aan NO waren consistent met proteomics-analyse waarbij deze routes betrokken waren. Daarentegen vertoonde BALF van niet-CF- en CF-fretten die steriel werden afgeleverd door een C-sectie op E40-41, en gedurende een korte periode konden ademen, geen significante genotypische verschillen in het niveau van deze cytokinen (figuren 5F-5H ). Er werden echter significante en interessante genotypische verschillen waargenomen in de inductie van deze cytokinen door natuurlijke geboorte (Figuur 5I). Natuurlijke geboorte leidde tot een significante inductie van TNF-α bij zowel niet-CF (P < 0,0001) en CF (P = 0,0007) BALF. De inductie van TNF-α was echter significant (P < 0,0001) hoger bij CF (27,3-voudig) dan bij niet-CF (12,7-voudig). Daarentegen leidde natuurlijke geboorte tot een significante inductie van IL-1β in niet-CF BALF (5,4-voudige P = 0,0014), maar er werd geen significante inductie waargenomen bij CF BALF. Het meest interessante was dat natuurlijke geboorte significant IL-8 induceerde in CF BALF (42,3-voudig, P = 0,036), maar er werd geen significante inductie waargenomen in niet-CF BALF. Deze veranderingen in uitgescheiden longcytokinen traden op ondanks het feit dat er geen verschillen waren in BALF-bacteriële belasting tussen genotypen, hoewel twee CF-dieren niet-steriele BALF vertoonden, en drie CF-dieren bacteriële genomen boven achtergrondniveaus van detectie hadden (Figuur 5E en 5J). Deze bevindingen suggereren dat de long van de pasgeboren fret met CF een overdreven ontstekingsreactie veroorzaakt op vroege bacteriële blootstelling na de geboorte en vóór overmatige bacteriële proliferatie.

Figuur 5. Ontstekingsmarkers veranderen dynamisch in CF BALF bij de geboorte tijdens de overgang van een steriele naar een niet-steriele omgeving. (EENC) Concentraties van (EEN) IL-1β, (B) IL-8, en (C) TNF-a in BALF van pasgeboren fretten werd bepaald met ELISA. (NS) Concentratie van NO in BALF van pasgeboren fretten gemeten met een Siever 280i stikstofoxide-analyser. (E) Bacteriële CFU-tellingen in niet-CF en CF pasgeboren fret BALF bepaald door groei op bloedagarplaten. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 volgens Mann-Whitney U-test. (FH) Concentraties van (F) IL-1β, (G) IL-8, en (H) TNF-a in BALF van ademhaling, fretten met C-sectie werden bepaald met ELISA. (l) Vouw veranderingen in cytokineniveaus tussen C-sectie en pasgeboren voor elk genotype. Cytokineconcentraties weergegeven (EENC) werden gedeeld door de gemiddelde C-sectie cytokineconcentraties (FH) om de vouwveranderingen voor elk genotype te verkrijgen, en de gemiddelden van deze waarden werden op dezelfde as uitgezet. Mann-Whitney U-tests werden uitgevoerd tussen de datasets in EENC en FH om te bepalen of de inductie door natuurlijke geboorte significant was voor elk genotype waren de resultaten als volgt: IL-1β, niet-CF, P = 0,0014, CF, P = 0,2954 IL-8, niet-CF, P = 0,9664, CF, P = 0,036 TNF-α, niet-CF, P < 0,0001, CF, P = 0,0007. Genotypische vergelijkingen voor de vouwverandering in cytokinen tussen C-sectie en pasgeboren dieren getoond in l gebruikte de Mann Whitney U-test: **P < 0,01, ***P <.0,001, ****P < 0,0001. (J) Bacteriële belasting in pasgeboren fret BALF werd beoordeeld door kwantitatieve PCR voor bacterieel 16S-ribosomaal DNA. De gevoeligheidsgrenzen voor deze test werden op nul gezet. Foutbalken vertegenwoordigen SEM overal.

Luchtwegvloeistof van patiënten met CF (5, 34), evenals pasgeboren CF-varkens (6), bleek gebrekkig te zijn in het doden van bacteriën. We hebben geprobeerd vast te stellen of BALF geïsoleerd uit pasgeboren CF-fretten eveneens aangetast is in het vermogen om bacteriën te doden. Zoals weergegeven in figuur 6A, werden er geen verschillen gevonden tussen niet-CF en CF BALF met betrekking tot het vermogen om de proliferatie van Escherichia coli, net zoals S. pseudintermedius (Figuur 6B). We zagen echter een bijna 10-voudige toename in CFU van P. aeruginosa geïncubeerd in BALF van pasgeboren CF-fretten vergeleken met de BALF van niet-CF-dieren (Figuur 6C). Deze bevinding, van een specifiek aangeboren immuniteitsdefect tegen P. aeruginosa, lijkt op in vivo bacteriële challenge-experimenten (Figuur 2) en kan van invloed zijn op waarom deze soort zo'n veel voorkomende longpathogeen is bij patiënten met CF (8).

Figuur 6. Antimicrobiële activiteit tegen P. aeruginosa wordt verminderd in BALF van pasgeboren CF-fretten op een pH- en bicarbonaat-onafhankelijke manier. (EENC) Proliferatie van verschillende bacteriestammen in BALF van niet-CF en CF pasgeboren fretten. BALF van niet-CF en CF pasgeboren fretten werd geconcentreerd tot 2-5 g/μl door centrifugeren zoals beschreven in Materialen en Methoden. Een monster van 15 μg van de BALF werd geïnoculeerd met 5.000 kve Escherichia coli (EC838) (EEN), S. pseudintermedius (klinisch isolaat van een volwassen CF-fretlong) (B), of P. aeruginosa (PA01) (C) en gedurende 3 uur bij 37°C geïncubeerd. De overlevende bacteriën werden vervolgens gekwantificeerd door CFU-assay. (NS) Proliferatie van PA01-bacteriën in BALF bij verschillende pH-niveaus. Geconcentreerde niet-CF of CF BALF (15 μg bereid zoals in EENC) werd geïnoculeerd met 5.000 CFU PA01 in natriumfosfaatbuffer bij de aangegeven pH, bij 37°C gedurende 3 uur, voorafgaand aan CFU-kwantificering. (E) Proliferatie van PA01 in aanwezigheid of afwezigheid van BALF bij verschillende bicarbonaatconcentraties. Geconcentreerde non-CF of CF BALF (15 g) in natriumfosfaatbuffer (bereid als in EENC) werd aangevuld met een vehikel of een geconcentreerde bicarbonaatoplossing tot de aangegeven eindconcentratie. Ook nepmonsters (geen BALF) werden als controle meegenomen. Deze monsters werden vervolgens gedurende 3 uur bij 37°C geïnoculeerd met 5.000 CFU PA01 vóór kwantificering van CFU. De gegevens in NS en E werden log getransformeerd voordat ze werden uitgezet. Gemiddelde input CFU (100%) wordt aangegeven met a stippellijn op elke grafiek. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. ***P < 0,001 volgens Mann-Whitney-test (C) significante verschillen tussen genotypen bij elke pH of bicarbonaatconcentratie worden gemarkeerd als: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en ****P < 0,0001 volgens Sidak's meervoudige vergelijkingstest (NS en E) een significant verschil ( P < 0,05) tussen niet-CF pH 7,2 en niet-CF pH 8,3 werd ook waargenomen (one-way ANOVA, Sidak's meervoudige vergelijkings-posttest).

De pH van het luchtwegoppervlak is aanzienlijk lager bij pasgeboren CF-varkens dan bij niet-CF-varkens, en de toevoeging van bicarbonaat aan de luchtwegen van CF-varkens in vivo is aangetoond dat het de bacteriedoding verhoogt (∼1.8-voudig), terwijl de pH van de luchtwegen wordt verhoogd (6). We hebben vergelijkbare kenmerken getest bij de CF-fret. Variaties in pH, variërend van 6,5 tot 8,3, veranderden niet significant P. aeruginosa doden door CF fret BALF (Figuur 6D). Er werd echter een significante vermindering (∼ 10-voudig) in bacteriedoding waargenomen tussen niet-CF BALF wanneer de pH werd verhoogd van 7,2 naar 8,3 (P < 0,05). Bij elke geteste pH zorgde CF BALF voor aanzienlijk meer groei van P. aeruginosa dan niet-CF BALF (P < 0,0001 bij tweerichtings-ANOVA). Hoewel we ontdekten dat bicarbonaat een significant effect had op de algemene groei van bacteriën (P < 0,0001 16,21% totale variatie door twee-weg ANOVA), het had dit effect zelfs in de afwezigheid van BALF en alleen bij 200 mM (P < 0,05 door Sidak's meervoudige vergelijking na test) (Figuur 6E). BALF-genotype had een groter algemeen effect op de bacteriegroei (P < 0,0001 39,24% totale variatie door twee-weg ANOVA), en er was geen statistische interactie tussen het BALF-genotype en de algehele bicarbonaatconcentratie (P = 0,0916). Bij elke geteste concentratie bicarbonaat was de bacteriegroei in CF BALF groter dan in niet-CF BALF, en de significantie van dit verschil was hoger in aanwezigheid dan in afwezigheid van bicarbonaat. Gezamenlijk suggereren de resultaten in figuur 6 dat: P. aeruginosa een uniek overlevingsvoordeel heeft in luchtwegvloeistof van pasgeboren CF-fret, en dat deze eigenschap niet afhankelijk is van pH of bicarbonaat.

De ontwikkeling van diermodellen voor CF bij de muis, het varken en de fret is van onschatbare waarde geweest bij het ontcijferen van de oorsprong van ziektepathogenese in de longen en andere organen (18). In de huidige studie hebben we verschillende belangrijke aspecten van aangeboren immuniteit in de long van pasgeboren fretten onderzocht en of deze defect zijn bij CF-dieren. Het ontbreken van trilhaarepitheelcellen en SMG's in de luchtpijp van de fret bij de geboorte stelde ons in staat om specifiek andere aspecten van CFTR-afhankelijke aangeboren immuniteit van de luchtwegen bij deze soort te ondervragen. Bevindingen uit deze onderzoeken tonen duidelijk aan dat CFTR-afhankelijke processen in luchtwegen zonder SMG's of MCC wel degelijk bijdragen aan aangeboren immuniteit. Deze processen lijken ook uniek anders te zijn dan in de luchtwegen van pasgeboren CF-varkens die SMG's en overvloedige trilhaarcellen bevatten.

Onze bevinding van een gebrek aan soortspecifieke bacteriedoding van P. aeruginosa in pasgeboren CF fretlongen en BALF is intrigerend, aangezien Stafylokokken wordt veel vaker waargenomen in de eindstadium CF fretlong (20, 21). Bacteriologie van CF fret- en varkenslongen suggereren beide niet-onderscheidende bacteriële afweerdefecten, met een breed scala aan bacteriële pathogenen geïdentificeerd (19-21). Er zijn talloze mechanismen voorgesteld om het unieke vermogen van P. aeruginosa om aan te houden in menselijke CF-longen (3, 35), en, hoewel Pseudomonas isolaten zijn verkregen uit de long van volwassen CF-fretten, vertegenwoordigen ze een ondergeschikte component van de totale bacteriële belasting (21). Onze studies suggereren ook verschillende CFTR-afhankelijke rollen voor cellulaire aangeboren immuuncomponenten in de longen P. aeruginosa-groei wordt onderdrukt in afwezigheid van niet-CF-long cellulaire componenten (alleen BALF), terwijl doden (∼ 100-voudig) optreedt in vivo. Gezien de immuun- en ontstekingsafwijkingen die zijn waargenomen bij CF fret BALF voor en na de geboorte, kan een verklaring voor onze bevindingen betrekking hebben op verworven aangeboren immuniteitsdefecten in de CF fretlong later in het leven die worden bevorderd door de overmatige ontstekingsreacties op minder belangrijke bacteriesoorten, zoals Pseudomonas. Bovendien missen de CF-luchtwegen van pasgeboren fretten SMG's en kunnen ze dus aspecten hebben van aangeboren immuniteitsdefecten die in de loop van de tijd naar voren komen naarmate deze structuren zich vormen. Lactoferrine wordt bijvoorbeeld geproduceerd in de pasgeboren CF-long door epitheelcellen van de oppervlakkige luchtwegen en wordt later vervangen door SMG's bij oudere CF-fretten (figuren 4C en 4D). Dus als lactoferrine een overheersend antimicrobieel middel is tegen StafylokokkenAls CF-fretten volwassen worden, zou je verwachten dat deze ziekteverwekker zou kunnen gaan domineren omdat er minder lactoferrine in de luchtwegen wordt uitgescheiden als gevolg van defecte klierafscheidingen.

Defecte P. aeruginosa antimicrobiële activiteit bij CF fret BALF was niet primair te wijten aan verschillen in pH of bicarbonaatconcentratie, omdat het veranderen hiervan in CF BALF geen invloed had op antimicrobiële activiteit. Interessant is dat het verhogen van de pH van niet-CF BALF selectief het doden van bacteriën verminderde en/of de groei bevorderde. Deze waarnemingen zijn in tegenstelling tot die waargenomen in luchtwegvloeistof van varkens (6), waarbij verhoging van de pH of toevoeging van bicarbonaat de antimicrobiële activiteit in luchtwegvloeistof versterkte, ongeacht de CFTR-activiteit. Er is dus voorgesteld dat een toename van de zuurgraad van de vloeistof aan het oppervlak van de luchtwegen, als gevolg van het ontbreken van CFTR-afhankelijke bicarbonaatsecretie, de oorzaak is van verminderde bacteriedoding in de CF-luchtweg (6). Verschillen in methodologie of mogelijke soortspecifieke verschillen in de manier waarop de pH van de luchtwegen wordt gereguleerd en verband houdt met het doden van bacteriën, kunnen verklaren waarom de resultaten in het CF-fretmodel dit mechanisme niet ondersteunden. Er is gesuggereerd dat SMG's, die bij de geboorte bij fretten ontbreken, een belangrijke bron zijn van CFTR-afhankelijke bicarbonaatsecretie in de luchtwegen (36). Het ontbreken van SMG-betrokkenheid bij de aangeboren immuniteit van de luchtwegen van pasgeboren fretten kan deze soortspecifieke verschillen dus gedeeltelijk verklaren, en kan relevant zijn voor alternatieve mechanismen van aangeboren immuniteit in de distale luchtwegen waar SMG's afwezig zijn. Hoewel onze studies concluderen dat noch pH noch bicarbonaat de antimicrobiële activiteit van CF fret BALF beïnvloedt, kunnen we niet concluderen dat CF-specifieke veranderingen in bicarbonaat of pH in vivo hebben geen invloed op de bacteriegroei vanwege hun invloed op cellulaire componenten.

Het gebrek aan aangeboren immuniteit bij pasgeboren CF-fretten lijkt niet te wijten te zijn aan de genotypespecifieke afwezigheid van de meeste belangrijke antimicrobiële factoren in de BALF, wat suggereert dat andere mechanismen van CFTR-afhankelijke aangeboren immuniteit de longen van pasgeboren fretten beschermen. Eén mechanisme kan een verstoring van de antimicrobiële activiteit inhouden als gevolg van de veranderde eigenschappen van geconcentreerde ASL of de pro-inflammatoire omgeving in afwezigheid van CFTR. De antimicrobiële activiteit van lactoferrine is bijvoorbeeld defect gebleken bij CF, ofwel vanwege de verhoogde viscositeit van CF-luchtwegsecreties (3), of mogelijk vanwege splitsing door cathepsines B, L en S (9) cathepsine S heeft er is aangetoond dat het SP-A splitst in humaan CF BALF (37). Hoewel we verschillende cathepsine-eiwitten hebben gedetecteerd in BALF van pasgeboren fretten, hebben we geen CF-specifieke afbraakproducten van lactoferrine of SP-A waargenomen in onze Western-blot-analyse, dus het valt nog te bezien of door ontsteking geïnduceerde proteolytische splitsing van andere antimicrobiële eiwitten speelt een rol bij CF-longziekte bij de fret.

We vonden een significant defect in MCC in CF-kits ouder dan 1 week oud, en een veranderde relatie tussen tracheale MCC en percentage ciliatie bij jonge CF-fretten. Deze veranderde relatie suggereert dat kenmerken van luchtwegvloeistof MCC in CF-kits kunnen aantasten. De verminderde ASL-hoogte die we hebben waargenomen bij de pasgeboren CF-fret kan bijdragen aan de verminderde MCC bij deze dieren tijdens de tweede levensweek. Een recente analyse van de diepte van de ASL bij CF-varkens bracht echter aan het licht dat deze niet verschilde van die bij niet-CF-varkens, en evenmin werd hyperactivatie van het epitheliale natriumkanaal (24) waargenomen, die typisch wordt waargenomen bij humaan CF-luchtwegepitheel en om uitdroging van de ASL te bevorderen (4, 25). Ondanks de afwezigheid van een verhoogde amiloride-gevoelige stroom bij jonge CF-fretten (21, 38), vonden we een significante afname van de tracheale ASL-hoogte bij de geboorte bij CF-fretten, wat suggereert dat chloridesecretie dominant is bij de fret op deze leeftijd, en zou kunnen zijn. compenseren voor de afwezigheid van SMG's, die typisch bijdragen aan de ASL-diepte en -inhoud.Deze discrepantie tussen varkens en fretten zou kunnen wijzen op een fundamenteel verschil in de regulering van de vloeistofdynamica tussen soorten, of gewoon op een verschil in de methoden die worden gebruikt om ASL-niveaus te beoordelen.

Proteomics-analyse van C-sectie BALF ondersteunt het idee dat CF-geassocieerde veranderingen in ontstekingsroutes en immuuncelfunctie bestaan ​​​​in de steriele CF-long (figuren E4B, E4D en E4F), en dat, na blootstelling aan pathogenen bij de geboorte, een hyperinflammatoire toestand bestaat in de CF fret long (figuren E4A, E4C en E4E). Interessant is dat veel van de meest significante biofunctieroutes die vóór de geboorte verhoogd of onderdrukt waren (door z-score) in de CF-long in vergelijking met de niet-CF-long significant veranderd waren in de tegenovergestelde richting na de geboorte (Figuur E4). In termen van specifieke routes weergegeven in BALF-eiwitsamenstelling voor en na natuurlijke geboorte (Figuur 3 en Figuur E1), vonden we interessante genotypische verschillen in significantie van de LXR/RXR-, eIF2- en mTOR-signaleringsroutes. Deze routes zijn opmerkelijk, omdat ze ontstekingsreacties reguleren en interageren met de NF-KB-route (29, 39-42), die op zijn beurt de expressie van CF-pro-inflammatoire cytokinen reguleert, zoals IL-8, TNF-α en IL-1β (27, 43, 44). Complementair aan deze proteomics-resultaten waren de veranderingen in BALF-cytokine tijdens de geboorteovergang (d.w.z. C-secties versus natuurlijk geboren dieren) uniek verschillend tussen genotypen (Figuur 5I), wat duidt op ontregeling van de CF-longontstekingsreactie op de eerste blootstelling van bacteriën. Deze bevindingen staan ​​in schril contrast met wat bekend is over het CF-varken, dat bij de geboorte geen longontsteking heeft (19, 45). Er is lang gedebatteerd of ongepaste ontstekingsreacties door de CF-long bijdragen aan bacteriële kolonisatie. Van verschillende signaalroutes, waaronder NF-KB, is aangetoond dat ze hypergeactiveerd zijn in CF-luchtwegcellen, en men denkt dat ze bijdragen aan hun abnormale cytokineresponsen (inclusief IL-8 en TNF-α) op bacteriële en LPS-uitdaging (31). Sommige van de ontstekingsmarkers verhoogd bij pasgeboren CF fret BALF zijn ook verhoogd bij zuigelingen met CF (46, 47). Onze bevinding, dat NO is verminderd bij pasgeboren CF-fret BALF, weerspiegelt observaties bij menselijke patiënten (32). NO heeft antimicrobiële activiteit en speelt ook een belangrijke rol bij het reguleren van ontstekingen via de NF-KB en signaaltransducer en activator van transcriptie 3-routes (32), dus dit molecuul zou een rol kunnen spelen in het waargenomen fenotype van de pasgeboren CF-fretlong.

Proteomics-analyse toonde ook verschillen aan in eiwitten binnen het complementsysteem in CF BALF voor en na de geboorte. Hoewel complementsysteemfactoren over het algemeen onderdrukt werden na een natuurlijke geboorte in de CF-long, waren veel van deze factoren verhoogd in de C-doorgesneden CF-long. Dit systeem speelt een belangrijke rol bij de aangeboren immuniteit, waardoor het direct doden of opsoniseren van vreemde microben in de long, zoals P. aeruginosa (44). Net als bij CF-fretten, toonde proteomics-analyse van humaan CF BALF verminderde niveaus of afwezigheid van verschillende complementeiwitten (48). Bovendien lijkt CFTR nodig te zijn voor de fagocytose van complement-opsonized P. aeruginosa door monocyten (49), wat interessant is, gezien de functionele stoornissen die zijn waargenomen in CF BALF waarbij monocyten en macrofagen betrokken zijn, evenals de specifieke in vivo defect voor P. aeruginosa doden in de CF fretlong. Bij muizen waren de alternatieve complementroute en complementcomponent C3 nodig voor een immuunrespons tegen P. aeruginosa (50), en de componenten van de alternatieve complementroute waren het meest verminderd in natuurlijk geboren CF-fret BALF.

Gezamenlijk laten onze resultaten zien dat meerdere takken van het aangeboren immuunsysteem van de luchtwegen en ontstekingsroutes voor en na de geboorte bij CF-fretten zijn veranderd. Bovendien functioneren deze routes op een CFTR-afhankelijke manier in afwezigheid van MCC en SMG's. Veranderde ontstekingssignalering, in combinatie met een verminderde functie van antimicrobiële componenten in de BALF, dragen waarschijnlijk bij aan het onvermogen van de pasgeboren CF-fretluchtweg om zich te verdedigen tegen vreemde pathogenen. Interessante verschillen in aangeboren immuniteit en ontsteking tussen CF-fretten en varkens werden ook ontdekt, en weerspiegelen waarschijnlijk biologische verschillen in hoe CFTR functioneert om luchtwegen met en zonder trilhaartjes en SMG's te beschermen. Het definiëren van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze verschillen kan nieuwe doelen aan het licht brengen voor therapie voor CF-longziekte.


Bidirectionele signalering

Een belangrijke eigenschap van interacties tussen Eph-receptoren en ephrin-liganden is de bidirectionele signalering die het gevolg is van activering van signaleringsroutes in zowel de receptor tot expressie brengende als de ligand tot expressie brengende cellen [4]. Voorwaartse signalering wordt geïnduceerd in de Eph-receptor tot expressie brengende cellen, terwijl de ephrine-Eph-receptor interactie ook omgekeerde signalering induceert in de ephrine tot expressie brengende cel [5]. De verschillende biologische functies van de Eph-efrine-interactie zijn het resultaat van zowel de multimerisatie van het Eph-efrine-complex als de bidirectionele signalering [6].

Voorwaartse signalering

Het is bekend dat Eph-receptoren signaleren via een aantal verschillende routes en moleculen, waaronder kleine GTPasen van de Rho en Ras-familie, focale adhesiekinase (FAK), de Jak/Stat-route en de PI3K-route [7] [8]. Kleine GTPases van de Rho-familie mediëren het effect van Eph-receptoractivering op actinedynamiek. Rho GTPasen worden geactiveerd door EphA-receptoren en regelen de vorm en beweging van cellen door de vorming van lamellipodia, filopodia en stressvezels te bevorderen [9]. Deze GTPase-activering wordt gemedieerd door uitwisselingsfactoren en adapter-eiwitten zoals respectievelijk ephexine en Crk [9] [10]. EphB-receptoren kunnen ook Rho-familie GTPases activeren, gemedieerd door de uitwisselingsfactoren intersectine en kalirin [11] [12]. Deze activering speelt een rol bij de verlenging van actinefilamenten en morfogenese en rijping van dendritische stekels. Naast Rho GTPasen kunnen Eph-receptoren ook de activiteit van de Ras-familie van GTPasen reguleren, waaronder H-Ras en R-Ras [13, 14]. Activering van H-Ras leidt tot activering van de MAP-kinaseroute, wat resulteert in transcriptionele regulatie, proliferatie en celmigratie. In tegenstelling tot EphA-activering van Rho GTPasen, reguleren de meeste Eph-receptoren de Ras-MAP-kinaseroute negatief [14]. EphB-receptoren kunnen ook de R-Ras-MAP-kinaseroute negatief reguleren, wat resulteert in een vermindering van integrine-gemedieerde adhesie [13]. Van EphA-receptoren is ook aangetoond dat ze de Jak/Stat-route reguleren, terwijl EphB-receptoren proliferatie bevorderen via activering van de PI3-kinaseroute [8]. FAK is belangrijk bij het mediëren van Eph-receptoren en integrine-signalering [7].

Omgekeerde signalering

De interactie tussen ephrin-liganden en Eph-receptoren resulteert niet alleen in voorwaartse signalering via de Eph-receptor, maar ook in 'reverse' signalering via de ephrin-ligand zelf [15]. Eerste onderzoeken hebben aangetoond dat het extracellulaire domein van EphB-receptoren tyrosinefosforylering van ephrinB-liganden kan induceren [16]. Er is een aantal eiwitten geïdentificeerd die SH2- of PDZ-domeinen bevatten, die binden aan het gefosforyleerde ephrin-ligand en het signaal doorgeven [17, 18]. Het adapter-eiwit, Grb4, bevat een SH2-domein en het is bekend dat het ephrinB-activiteit koppelt aan celmorfologie [17]. De mechanismen van omgekeerde signalering van ephrinA-liganden zijn minder bekend, maar men denkt dat ze het resultaat zijn van ephrinA-clustering en rekrutering van regulerende eiwitten [19].


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Discussie

De macrofaagpopulatie van atherosclerotische plaques is heterogeen. Naast eerder gerapporteerde M1- en M2-macrofagen is ook de aanwezigheid van unieke macrofaagfenotypes aangetoond in atherosclerotische laesies [6, 7]. MR + macrofagen werden voor het eerst gerapporteerd door Bouhlel et al. in menselijke halsslagaderplaques [22]. Op basis van recente bevindingen die de overheersende expressie van MR in fibreuze kap van atherosclerotische plaques [23, 24] vertegenwoordigen, is MR voorgesteld als een potentiële doelwitbiomarker om boosdoeners te identificeren. De exacte rol van alternatieve macrofagen bij atherosclerose en hun bijdrage aan de kwetsbaarheid van plaques is echter nog steeds een punt van discussie [25, 26].

Chinetti-Gbaguidi et al. hebben gemeld dat IL-4-gepolariseerde CD68+MR+-macrofagen hoge niveaus van receptoren die betrokken zijn bij fagocytose tot expressie brengen, maar een laag vermogen vertonen om in vitro natuurlijke en geoxideerde lipoproteïnen op te nemen. Het vermogen van deze macrofaagpopulaties om apoptotische cellen te verwijderen zonder lipiden op te hopen, suggereert dat ze een gunstige rol kunnen spelen bij het stabiliseren van atherosclerotische laesies [12]. Aan de andere kant werd de aanwezigheid van M2 (CD68 + CD163 +) maar niet M1-macrofagen in de fibreuze kap nabij de breukplaats van de asymptomatische trombotische plaques in de menselijke halsslagader gerapporteerd door Mauriello et al., wat suggereert dat alternatieve macrofagen mogelijk ook moduleren het proces van plaqueruptuur [27]. Een hoge dichtheid van MR + macrofagen werd ook gerapporteerd door Tahara et al. in hoog-risico plaques verkregen van proefpersonen die plotselinge hartdood hadden ervaren [28]. Bovendien wordt matrix metalloproteinase-9 (MMP-9, het meest dominant aanwezige MMP in atherosclerotische plaques) geproduceerd door M2 in plaats van M1 macrofagen [29, 30]. Er is gemeld dat de breuk van carotisplaques significant geassocieerd is met MMP-9-expressie in de laesies [31]. Aangezien MMP-9 in staat is om type IV collageen [32] af te breken en plaqueruptuur teweeg te brengen, kan het M2-macrofaagfenotype een overheersende rol spelen bij plaque-instabiliteit. Bovendien werd gemeld dat de recent beschreven MR + M4-macrofagen potentiële pro-atherogene rollen hebben in kwetsbare plaques. Ze produceren MMP12, een enzym dat mogelijk ook betrokken is bij de afbraak van fibreuze caps en dus de destabilisatie van atherosclerotische laesies [33,34,35]. Gemotiveerd door de bovengenoemde bevindingen, wilden we de haalbaarheid onderzoeken van beeldvorming van MR-expressie in atherosclerotische laesies van een muizenmodel met behulp van radiogelabelde anti-MMR Nb-gebaseerde radiotracers.

In de vorige studie waren we niet in staat om de relevantie van het met technetium-99m (99mTc)-gelabelde anti-MMR3.49 Nb voor atherosclerose te evalueren en er werd geen positieve correlatie gevonden tussen plaquebelasting en 99mTc-anti-MMR3.49 NB opname. Zoals bevestigd door immunofluorescentiekleuring, bevestigde de afwezigheid van 99mTc-anti-MMR3.49 Nb-opname in de plaques met de afwezigheid van MR-expressie in de laesies [36]. We waarschuwden echter voor MR-expressie in het adventitiële weefsel. In de huidige studie werd echter de aanwezigheid van MR + macrofagen, die zich voornamelijk in de fibreuze kap en in de schoudergebieden van de atherosclerotische plaques bevonden, bevestigd door immunofluorescentiekleuring. In overeenstemming met onze eerdere waarneming werd opmerkelijke MR-expressie waargenomen in de adventitia van de aorta's geïsoleerd uit zowel ApoE-KO- als controlemuizen. De aanwezigheid van macrofagen in de adventitia van normale slagaders is eerder gemeld [10, 24]. De adventitia die ten grondslag ligt aan atherosclerotische plaques vertoonden meer MR-expressie in vergelijking met plaque-vrije gebieden van aortasegmenten geïsoleerd uit ApoE-KO en controlemuizen, wat kan worden verklaard door de aanwezigheid van adventitiële cellulaire infiltratie gerelateerd aan atheroma [9, 37]. Vergeleken met 99mTc komt de korte halfwaardetijd van 68 Ga beter overeen met de snelle bloedklaring en doellokalisatie van het anti-MMR Nb. Bovendien kan PET, vanwege de inherent hogere gevoeligheid en aanzienlijk betere ruimtelijke resolutie, de beeldvorming van atherosclerotische laesies verbeteren in vergelijking met SPECT.

Ondanks de kleine afmeting van de laesies, werden ze met succes gevisualiseerd in de aorta's van ApoE-KO-muizen met behulp van een PET/CT-scanner voor kleine dieren, 1 uur p.i. van 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb. Om het specifieke signaal van MR-expressie in de atherosclerotische plaques te evalueren, werd het adventitiële weefsel op de aorta's verwijderd door zorgvuldige dissectie voor ex vivo autoradiografiestudies. De traceropname op ex vivo autoradiografische beelden was co-gelokaliseerd met Sudan-IV-positieve gebieden die overeenkomen met atherosclerotische plaques. Omdat de mate van atherosclerose die het intimale oppervlak langs de aorta's aantast niet bij alle dieren hetzelfde was, werden de autoradiografische signalen genormaliseerd naar het gebied van plaques, gemeten na Sudan-IV-kleuring.

MR is geadopteerd als een biomarker om atherosclerotische plaques te identificeren die vatbaar zijn voor scheuren, en er zijn verschillende gerichte sondes voor nucleaire beeldvorming ontwikkeld met als doel de MR-expressie in de laesies te visualiseren. De haalbaarheid van 18F-gelabelde D-mannose (2-deoxy-2-[18F]fluoro-d-mannose, 18F-FDM) voor beeldvorming van atherosclerotische laesies werd gerapporteerd door Tahara et al. [28]. Ze toonden aan dat de opname van 18F-FDM niet inferieur is aan die van 18F-FDG voor beeldvorming van plaque-ontsteking [28]. Het met 68 Ga gelabelde NOTA-gekoppelde gemannosyleerde humaan serumalbumine werd gerapporteerd door Kim et al. als een radiotracer voor niet-invasieve detectie van M2-macrofagen in kwetsbare atherosclerotische plaques [38]. Onlangs hebben we de haalbaarheid aangetoond van 111 In-tilmanocept voor niet-invasieve in vivo targeting van plaque-ontsteking in ApoE-KO-muismodel [39]. Hoewel het succes van deze radiotracers voor in vivo visualisatie van atherosclerotische plaques goed is gedocumenteerd - vanwege het feit dat mannose een isomeer van glucose is, kunnen 18F-FDM evenals andere bovengenoemde gemannosyleerde radiotracers worden opgenomen door alle macrofagen ( vergelijkbaar met 18 F-FDG) en kan dus ongeschikt zijn voor onderscheid tussen verschillende fenotypen. In de huidige studie was ons doel echter om het potentieel van een anti-MMR Nb voor specifieke targeting van MR + macrofagen en in vivo beeldvorming van atherosclerotische plaques in ApoE-KO-muizen te beoordelen.

Radiotracers op basis van anti-MMR Nbs zijn goed geëvalueerd voor beeldvorming van tumor-infiltrerende macrofagen [13, 14] en gewrichtsontsteking in diermodellen voor reumatoïde artritis [15]. De specificiteit van de tracers voor MR is ook bevestigd in MR-KO-muizen [13, 14]. 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb is ook grondig onderzocht in een konijnenmodel van atherosclerose [40]. Met behulp van een klinische PET/MR-scanner werd een geleidelijke toename van de signaalintensiteit waargenomen in de aorta's van atherosclerotische konijnen naarmate de ziekte vorderde, wat de vertaalbaarheid naar andere diersoorten bevestigt.

Deze studie heeft enkele beperkingen. Ongeacht de voldoende expressie ervan door macrofagen in atherosclerotische plaques voor in vivo beeldvorming, wordt MR ook tot expressie gebracht door sommige cellen in adventitia, wat een niet te verwaarlozen achtergrondsignaal veroorzaakt bij gebruik van 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb. De aanwezigheid van MR+-cellen in verschillende organen in het buikgebied zou ook de in vivo detectie van opname van radiotracers in de abdominale aorta kunnen hebben belemmerd, vanwege de kleine omvang van het muizenlichaam. Hoewel we de relevantie van MR-targeting met 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb in ApoE-KO-muismodel van atherosclerose konden evalueren, moet worden onderzocht of 68 Ga-NOTA-anti-MMR Nb zich ook ophoopt in complexe menselijke atherosclerotische plaques. gevalideerd in toekomstige studies.


Voorkeuren

Afdeling Pathologie, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland, VS

Yuexing Zhang, Hua Zhou & Anne W Hamburger

Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland, VS

Yuexing Zhang, Hua Zhou, Myounghee Lee, Bret A Hassel & Anne W Hamburger

Afdeling Kaak- en Kaakchirurgie, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai, PR China

Afdeling Epidemiologie, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland, VS

Afdeling Microbiologie en Immunologie, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland, VS

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Corresponderende auteur


Auteurs informatie

Huidig ​​adres: Huidig ​​adres: Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, CA, 90095, VS

Huidig ​​adres: Huidig ​​adres: Afdeling Biotechnologie, Alagappa University, Karaikudi, 630 003, India

Voorkeuren

Afdeling Biologische Wetenschappen, California State University Pomona, CA, 91768, VS

Misa U Austin, Wei-Siang Liau & Craig W LaMunyon

Veterans Affairs Medical Center, Long Beach, CA, 90822, VS

Krishnaswamy Balamurugan, Balasubramaniem Ashokkumar & Hamid M Said

Afdelingen Geneeskunde en Fysiologie/Biofysica, Universiteit van Californië, Irvine, CA, 92697, VS


Bekijk de video: Masterclass 2019: Psychopathologische gevolgen van druggebruik - Paul van Deun 1 (Januari- 2022).