Informatie

Vergeten antilichaam te vortexen voor kleuring


Ugh. Heb afgelopen weekend een immunofluorescentie-experiment gedaan, vergat zowel mijn primaire als mijn secundaire antilichaamoplossingen te vortexen.

En mijn eindresultaat ziet er minder goed uit dan het zou moeten zijn. Is het mogelijk dat niet vortexen hieraan heeft bijgedragen?

Ik denk dat de vraag is, is vortexen echt nodig? Het zou neerkomen op de vloeistofdynamica. Hoe lang duurt het voordat een druppel antilichaam een ​​evenwicht bereikt in een Eppendorf-buisje van 1000 µL? Is het echt meer dan een paar seconden? Is vortexen echt nodig?


Het hangt af van hoeveel tijd er is verstreken tussen het toevoegen van de geconcentreerde antilichamen aan de verdunningsoplossing en het toevoegen van de verdunde antilichamen aan het glaasje. Als het maar een paar seconden was, dan kan ik absoluut zien dat er een verschil is. Zelfs als het langer zou zijn - zeg 30-90 seconden, zelfs - zouden er mogelijk antilichaamgradiënten in de oplossing kunnen zijn zonder te vortexen. Er zijn een paar redenen waarom. Ten eerste, veel ongeconjugeerde primaire antilichamen die niet bedoeld zijn alleen maar voor immunokleuring worden geleverd in een glyceroloplossing, met concentraties variërend van 10% of zo tot 50% of meer, soms in aanvulling op een dragereiwit zoals BSA (ik werkte vroeger voor een bekend antilichaambedrijf, en die van hen zijn in 50% glycerol met 10 µg - 2 mg BSA per ml, afhankelijk van het type antilichaam). De glycerol voorkomt dat de oplossing vast bevriest bij -20°C, waardoor de vorming van ijskristallen wordt geëlimineerd, het antilichaameiwit wordt beschermd tegen afbraak en langere opslagtijden mogelijk zijn zonder verlies van activiteit. Als gevolg hiervan duurt het echter langer voordat de oplossing oplosbaar is in PBS of welk verdunningsmiddel u ook gebruikt, zonder extra mechanische activiteit.

Aan de andere kant, zelfs als het primaire (of secundaire) antilichaam eenvoudig in PBS is geformuleerd, zal de gelijke diffusie van de eiwitten naar alle delen van de buis kan enige tijd duren. Doe als experiment 1 ml PBS in een Eppendorf-buisje en voeg dan misschien 10-50 µl van een donkere kleurstof toe, zoals methyleenblauw, broomfenolblauw of trypanblauw. Kijk hoe het na verloop van tijd in de oplossing dissociëert tegen een effen witte achtergrond zoals een stuk papier. Hoewel geen van deze de exact hetzelfde oplosbaarheidsprofiel als antilichamen, is het goed genoeg om u te laten zien wat er gebeurt gedurende de eerste 30 seconden of zo totdat u de kleurstof niet meer kunt onderscheiden.

Draai dus altijd, ook al is het op een relatief lage snelheid, een paar seconden om ervoor te zorgen dat alles gelijkmatig wordt verdeeld.


Flowcytometrieprotocol voor celoppervlakmarkeringen

Immunofenotypering van gesuspendeerde cellen op basis van antigenen die op het celoppervlak aanwezig zijn, is een van de meest voorkomende toepassingen van flowcytometrie. Omdat celoppervlakte-eiwitten gemakkelijk toegankelijk zijn voor het antilichaam, is een permeabilisatiestap niet vereist. Door celoppervlaktemarkers te kleuren, kunnen onderzoekers specifieke celpopulaties identificeren en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) uitvoeren.

Het volgende flowcytometriekleuringsprotocol is ontwikkeld en geoptimaliseerd door R&D Systems Flowcytometry Laboratory. Dit protocol is ontworpen voor het kleuren van celoppervlakte-eiwitten. Het wordt aanbevolen dat experimentele omstandigheden, zoals antilichaamconcentratie, incubatietijd en temperatuur, worden geoptimaliseerd voor elk flowcytometrie-experiment.

Lees het volgende flowcytometrie-kleuringsprotocol in zijn geheel door voordat u begint.

Inhoud

Videoprotocol voor flowcytometrie

Vereiste reagentia

  • Fc-receptorblokkerende reagentia (deze omvatten Fc-receptorblokkerende antilichamen of IgG-oplossingen) of flowcytometrie Mouse Lyse Buffer (10X Catalog # FC003) of een gelijkwaardige of gelijkwaardige oplossing die BSA en natriumazide bevat, geschikt voor gebruik in flowcytometrie

Vereiste materialen

  • FACS™-buisjes (5 ml polystyreenbuisjes met ronde bodem)
  • Pipettips en pipetten
  • Centrifugeren
  • Vortex

Monstervoorbereiding:

Voor het kleuren van perifere bloedcellen moet volbloed worden verzameld in geëvacueerde buisjes die EDTA of heparine als anticoagulans bevatten. Verontreinigende serumcomponenten moeten worden verwijderd door de cellen driemaal te wassen in een isotone fosfaatbuffer (aangevuld met 0,5% BSA) door 5 minuten te centrifugeren bij 1250-1500 rpm/350-500 x g.

Voor het kleuren van cellijnen of cellen uit geactiveerde celculturen moeten de cellen 5 minuten worden gecentrifugeerd bij 1250-1500 rpm/350-500 xg en drie keer worden gewassen in een isotone PBS-buffer (aangevuld met 0,5% BSA) om eventuele resterende groei te verwijderen factoren die in het kweekmedium aanwezig kunnen zijn.

Aanhechtende cellijnen kunnen voorbehandeling met 0,5 mM EDTA nodig hebben om verwijdering van hun substraten te vergemakkelijken. Cellen die trypsinisatie nodig hebben om verwijdering van hun substraten mogelijk te maken, moeten gedurende 6-10 uur op een rockerplatform in medium verder worden geïncubeerd om regeneratie van de receptoren mogelijk te maken. Door het gebruik van het rockerplatform wordt herbevestiging aan de ondergrond voorkomen.

Procedure

  1. Oogst cellen en aliquot tot 1 x 106 cellen/100 L in FACS-buizen. Fc-block cellen met blokkerende IgG (1 μg IgG/10 6 cellen) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Was overtollig blokkerend IgG niet uit deze reactie.
  2. Voeg geconjugeerd primair antilichaam (5-10 L/106 cellen, of een eerder getitreerde hoeveelheid) en vortex toe. Incubeer cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  3. Verwijder eventueel ongebonden antilichaam door de cellen te wassen in 2 mL flowcytometrie kleurbuffer (catalogus # FC001). Centrifugeer de gesuspendeerde cellen bij 1250-1500 rpm/350-300 x g gedurende 5 minuten en decanteer de buffer. Resuspendeer de cellen door 2 mL flowcytometrie kleurbuffer toe te voegen. Herhaal deze wasstap twee keer.
    Opmerking: Als volbloed wordt gebruikt, moeten de monsters op dit punt door een lysisstap van rode bloedcellen gaan. Om rode bloedcellen te lyseren, voegt u 2 ml 1X flowcytometrie humane lysebuffer (catalogusnr. FC002) of 1x flowcytometrie muislysebuffer (catalogusnr. FC003) toe aan elk buisje. Vortex en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer en was cellen in Flow Cytometry Staining Buffer zoals beschreven in stap 3 hierboven.
    Opmerking: Als een ongeconjugeerd primair antilichaam wordt gebruikt, moet nu incubatie met een geschikt secundair antilichaam plaatsvinden. Verdun het secundaire antilichaam in Flowcytometry Staining Buffer (Catalogus # FC001) beginnend met de voorgestelde concentratie in het productgegevensblad. Incubeer gedurende 20-30 minuten in het donker en voer de was uit zoals beschreven in stap 3.
  4. Resuspendeer cellen in 200 – 400 L Flowcytometry Staining Buffer (Catalogus # FC001) voor uiteindelijke flowcytometrische analyse.

Het wordt aanbevolen om een ​​negatieve controle uit te voeren. Een afzonderlijke set cellen moet worden gekleurd met een Isotype Control Antibody met behulp van de hierboven beschreven stappen.


2. Hoge fluorescentie-intensiteit

Antilichaamconcentratie te hoog
Dit geeft een hoge, niet-specifieke binding of een zeer hoge intensiteit van de fluorescentie. Verminder de hoeveelheid antilichaam die aan elk monster wordt toegevoegd.

Overtollig antilichaam gevangen
Dit kan een bijzonder probleem zijn bij intracellulaire kleuring waarbij grote fluorochroommoleculen op het antilichaam kunnen worden gevangen. Zorg voor voldoende wasstappen en neem tween of triton op in wasbuffers.

Onvoldoende blokkering
Voeg 1% tot 3% blokkeermiddel toe met antilichaam en een blokkeerstap.


Vlek Lyse Geen Wassen

Gebruik deze methode om cellen te detecteren die specifieke membraanantigenen dragen. Begin met het toevoegen van volbloed aan fluorochroom-geconjugeerde monoklonale antilichamen die specifiek binden aan celoppervlakte-antigenen. Behandel vervolgens het gekleurde monster met FACS Lysing Solution om erytrocyten te lyseren onder zachte hypotone omstandigheden met behoud van de leukocyten. Analyseer ten slotte de cellen door flowcytometrie.

Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met MultiTEST- en TriTEST-reagentia en met TruCOUNT-buisjes om absolute tellingen uit te voeren.

Benodigde reagentia en apparatuur

Raadpleeg de juiste productetikettering voor het beoogde gebruik en de voorzorgsmaatregelen.

  1. K 3 EDTA VACUTAINER-bloedafnamebuisjes (BD Cat. No. 6457) of gelijkwaardig
  2. Falcon wegwerpbare polystyreen reageerbuisjes van 12 x 75 mm met dop (BD Cat. No. 2058) of gelijkwaardig
  3. Micropipet met tips (BD Electronic Pipet, BD Cat. No. 343246 of gelijkwaardig)
  4. BD fluorochroom-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen humane celoppervlakte-antigenen (bijvoorbeeld MultiTEST- of TriTEST-reagentia). Raadpleeg de bijsluiter van de betreffende reagensverpakking voor meer informatie.
  5. Vortex mixer
  6. FACS Lysing Solution (10X) (BD Cat. No. 349202). Raadpleeg voor verdunningsinstructies en waarschuwingen de bijsluiter van de FACS Lysing Solution.
  7. Flowcytometer van het merk FACS. Raadpleeg de gebruikershandleiding van het betreffende instrument voor informatie.

Procedure

Monsterafname en voorbereiding

Verzamel aseptisch bloed door venapunctie 1,2 in een steriel K3 EDTA VACUTAINER-bloedafnamebuisje. Volg de richtlijnen van de fabrikant van de afnamebuis voor het minimale volume bloed dat moet worden afgenomen. Bewaar ontstold bloed bij kamertemperatuur (20° tot 25°C) tot het klaar is voor kleuring en lysering. Raadpleeg de betreffende bijsluiter voor opslagbeperkingen voorafgaand aan het kleuren.

WAARSCHUWING: Alle biologische monsters en materialen waarmee ze in contact komen, moeten worden behandeld alsof ze een infectie kunnen overdragen en moeten met de juiste voorzorgsmaatregelen worden verwijderd in overeenstemming met de federale, staats- en lokale regelgeving. Pipetteer nooit met de mond. Vermijd contact van het monster met huid en slijmvliezen.


Resultaten

We wilden de B-celrespons op SARS-CoV-2-infectie evalueren. De onderzoeksgroep omvatte 42 patiënten met de matige vorm en 30 patiënten met de ernstige vorm van COVID-19, met een gemiddelde leeftijd van 63 jaar. Tien op leeftijd afgestemde gezonde donoren (HD's) werden ook opgenomen. De demografische en klinische kenmerken van de gevallen zijn samengevat in aanvullende tabellen 1 en 2. Het algehele onderzoeksontwerp wordt geïllustreerd in aanvullende afbeelding 1.

Verhoogde plasmablastfrequentie bij patiënten met acute COVID-19

Verse perifere bloedmonsters verzameld van de 72 patiënten werden immunofenotyperend. Flowcytometrische analyse onthulde dat de frequenties van totale CD19 + B-cellen niet significant veranderden bij patiënten in vergelijking met die in HD's (aanvullende figuur 2). Tegelijkertijd werden significante verstoringen waargenomen in specifieke B-celsubpopulaties.

We konden duidelijk plasmablasten (CD27 hi CD38 hi ) detecteren bij patiënten met COVID-19, terwijl ze praktisch afwezig waren in de ZvH (Figuur 1a). In 26,4% van de gevallen (N = 19), werd een massale inductie van plasmablasten waargenomen, waarbij het aandeel van de subpopulatie groter was dan 20% van de totale B-celpopulatie. Over het algemeen was het aandeel plasmablasten significant hoger bij patiënten dan bij HD's (ernstig vs. HD, P = 0,0002 matig vs. HD, P < 0,0001 Figuur 1b, linkerpaneel). We zagen een afname in het aandeel Bmem-cellen (CD27 + CD38 - ) bij patiënten vergeleken met die in HD's (ernstig vs. HD, P = 0,0058 matig vs. HD, P = 0,016 Figuur 1b, middelste paneel), wat waarschijnlijk het gevolg was van een toename van het aandeel plasmablasten. Er was geen significant verschil in het percentage naïeve B-cellen (CD19 + CD27-) tussen de twee groepen (Figuur 1b, rechterpaneel).

Onze studie was niet specifiek gericht op een gedetailleerd onderzoek van de plasmablastkinetiek. De analyse van de monsters verzameld van patiënten op verschillende tijdstippen na het begin van de ziekte leverde echter indirecte informatie op over de dynamiek van de plasmablastrespons (Figuur 1c). Het hoogste percentage plasmablasten werd waargenomen in monsters die werden verzameld binnen de eerste 20 dagen na het begin van de ziekte, waarna het percentage daalde tot baselineniveaus. Tegelijkertijd werd bij patiënten die gedurende een aanzienlijk lange periode tekenen van acute infectie vertoonden en die de behandeling op de intensive care bleven ondergaan, zelfs na 2 maanden van aanvang van de ziekte.

Een gedetailleerde longitudinale studie werd uitgevoerd bij een patiënt met de matige vorm van de ziekte (P24). De maximale plasmablastfrequentie werd 7 dagen na het begin van de symptomen waargenomen, waarna deze geleidelijk afnam en de basislijnniveaus op dag 23 naderde (Figuur 1d). De plasmablasten waren voornamelijk van het IgM + -isotype, maar er werd ook een klein deel van IgG + -plasmablasten gedetecteerd (Figuur 1e).

RBD-bindende B-celinductie bij patiënten met acute COVID-19

Om te bepalen of SARS-CoV-2-infectie de activering en expansie van coronavirus-specifieke B-cellen induceerde, hebben we de frequentie van RBD-bindende B-cellen gemeten met behulp van phycoerythrin- en allofycocyanine-gelabelde RBD (respectievelijk RBD-PE en RBD-APC) . RBD-bindende B-cellen werden duidelijk gedetecteerd in de plasmablast (CD19 + CD27 hi CD38 hi) populatie, terwijl ze niet werden gedetecteerd in de naïeve B-cel (CD19 + CD27-) populatie (Figuur 2a). RBD-specifieke lymfocyten werden ook gedetecteerd in de Bmem-cel (CD19+CD27+) populatie, maar deze cellen werden niet zo duidelijk gekleurd als die waargenomen in de plasmablast-subset. In de daaropvolgende experimenten hebben we gedetailleerde analyses uitgevoerd met alleen RBD-bindende plasmablasten.

Bij 19 patiënten ontdekten we een goed gescheiden RBD + -populatie (Figuur 2b, bovenste paneel). RBD-PE-kleuring was antigeen-specifiek, aangezien niet meer dan 2% van de cellen kon binden aan een irrelevant eiwit Betv1-PE. Bij sommige patiënten (N = 35), vertoonden de RBD + -cellen een lagere signaal-ruisverhouding (Figuur 2b, onderste paneel). We gebruikten het verschil tussen de RBD-PE- en Betv1-PE-monsters om RBD-bindende B-cellen te kwantificeren. Zoals eerder beschreven, 15, 16 geeft de hoeveelheid antigeen gebonden aan de B-celreceptor (BCR) de affiniteit van de overeenkomstige BCR aan.

De frequenties van RBD-bindende plasmablasten varieerden sterk en in sommige gevallen werden waarden tot 38% van de totale plasmablastpopulatie geregistreerd, met mediane waarden van 4,18% en een interkwartielbereik (IQR) van 1,16-6,29 in ernstige gevallen en 4,33 % (mediaan) en 1,23-13,62 (IQR) in gematigde gevallen (Figuur 2c). Dit gaf aan dat acute SARS-CoV-2-infectie de RBD-specifieke B-celproductie aanzienlijk zou kunnen stimuleren. Het percentage RBD-bindende cellen in de ZvH overschreed de basislijnniveaus niet.

In het monster verkregen van patiënt P24, die werd onderworpen aan de longitudinale studie, werd aangetoond dat de kinetiek van RBD-specifieke B-cellen (Figuur 2d) was vertraagd ten opzichte van de dynamiek van totale plasmablasten (Figuur 1d), en de piek-RBD -specifieke plasmablastfrequentie werd ongeveer op dag 23 na het begin van de symptomen waargenomen. Aanvankelijk waren de RBD + -plasmablasten voornamelijk van het IgM + -type, terwijl later voornamelijk het IgG + -type werd gedetecteerd (Figuur 2e). Deze bevindingen komen goed overeen met het klassieke schema, volgens welke de primaire respons voornamelijk wordt gemedieerd door IgM + B-cellen, terwijl de secundaire respons wordt gemedieerd door IgG + B-cellen. We suggereren dat de felgekleurde RBD+-plasmablasten overeenkwamen met de vroege plasmablasten die de BCR behielden. 17 Ondanks het feit dat in sommige gevallen de bepaling van RBD-bindende B-cellen vrij eenvoudig is, kan dit in het algemeen enkele problemen opleveren. Daarom werden RBD-specifieke B-cellen verder onderzocht door het meten van antilichaam-afscheidende cellen (ASC's) met behulp van een ELISpot-assay.

Reactie van circulerende RBD-specifieke ASC's bij patiënten met COVID-19

Vervolgens werden 24 personen uit de onderzoeksgroep willekeurig geselecteerd en onderworpen aan verdere gedetailleerde analyses. RBD-specifieke en totale Ig ASC's geïsoleerd uit vers bloedmonsters werden geanalyseerd met behulp van de ELISpot-assay. De demografische, klinische en virologische kenmerken van deze gevallen, de ziektestatus en de tijdstippen van bemonstering zijn samengevat in een zwemmerplot (aanvullende figuur 3).

Plasmablasten zijn de primaire ASC's die in het bloed aanwezig zijn. Om dit te testen werden plasmablasten (CD19 + CD27 hi CD38 hi) en Bmem-cellen (CD19 + CD27 + CD38-) gesorteerd met behulp van flowcytometrie, en hun vermogen om RBD-specifieke antilichamen uit te scheiden werd geanalyseerd met behulp van de ELISpot-assay. Zoals weergegeven in aanvullende figuur 4, werden talrijke totale IgG- of IgM-ASC's, samen met RBD-specifieke ASC's, gedetecteerd in de plasmablastpopulatie. Daarentegen produceerden de niet-gestimuleerde Bmem-cellen noch IgG- noch IgM-antilichamen. Daarom maakten de circulerende ASC's in de bloedmonsters deel uit van de plasmablastpopulatie en niet van de Bmem-celpopulatie. Om te voorkomen dat de cellen worden onderworpen aan onnodige manipulaties in daaropvolgende experimenten voor het meten van ASC-abundantie in vers bloedmonsters, gebruikten we de totale populatie van mononucleaire cellen van perifeer bloed (PBMC's), waarbij de verkregen resultaten werden toegeschreven aan plasmablasten.

PBMC's geïsoleerd uit monsters verkregen van 15 patiënten met COVID-19 werden beoordeeld op totale Ig- en RBD-specifieke ASC-responsen. Merk op dat vlekken die overeenkomen met IgG-afscheidende cellen over het algemeen groter waren dan die overeenkomen met IgM-afscheidende cellen (Figuur 3a), wat waarschijnlijk het verschil in Ig-secretiesnelheden weerspiegelt. 18, 19 De ELISpot-analyse gaf aan dat patiënten positieve RBD-specifieke ASC-responsen hadden, met een mediane frequentie van 170 IgM ASC's per 106 PBMC's (IQR, 8-1144) en 314 IgG ASC's per 106 PBMC's (IQR, 103-1320 ). Om de frequentie van antigeenspecifieke ASC's in de totale B-celpopulatie te berekenen, werd het aantal RBD-specifieke IgM- of IgG-ASC's gedeeld door het totale aantal IgM- of IgG-ASC's. Zoals aangegeven door de B-cel ELISpot-assay, varieerde het percentage RBD-specifieke IgM- en IgG-ASC's van 0,14 tot 80% van het totale aantal Ig-ASC's (aanvullende figuur 5).

Om de reacties van IgG- en IgM-ASC's te vergelijken, werd Spearman's rangcorrelatieanalyse uitgevoerd. Er werd een sterke correlatie waargenomen tussen de frequenties van RBD-specifieke IgG- en IgM-ASC's (Spearman's R = 0.95, P < 0,0001) (Figuur 3c). Gezien de resultaten van de ELISpot-assay voor de ZvH-groep, werd de drempel voor een positieve RBD-specifieke ASC-respons vastgesteld als 20 vlekvormende cellen per 106 invoercellen. In twee gevallen (P20 en P22) waren zowel IgG- als IgM-ASC-responsen onder de basislijnniveaus van ASC's waargenomen in de ZvH-groep. Deze patiënten kunnen als non-responders worden beschouwd (Figuur 3c). We observeerden nog twee gevallen met negatieve IgM en aanzienlijk zwakke IgG-responsen. Deze patiënten kunnen ook als low-responders worden beschouwd. We hebben geen correlatie waargenomen tussen de frequentie van RBD + plasmablasten en RBD-specifieke IgG/IgM ASC's (Figuur 3d). Monsters met de hoogste RBD-specifieke IgM- of IgG ASC-respons hadden slechts een klein deel van RBD-bindende plasmablasten en vice versa. Dit kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van vroege en late plasmablasten, waarbij de eerste voornamelijk oppervlakte-Ig heeft en de laatste cytoplasmatisch/uitgescheiden Ig. Er was ook geen significante correlatie tussen circulerende RBD-specifieke ASC's en plasma-RBD-specifieke Ig (Figuur 3e), wat consistent is met het feit dat er geen verband werd gevonden tussen plasma-RBD IgG en plasmablasten. 2 Dit kan het gevolg zijn van de smalle tijdelijke piek van circulerende ASC's, evenals de hoge afhankelijkheid van de detectieniveaus van de bemonsteringstijd.

Bewijs van RBD-specifieke Bmem-celrespons

Omdat we de niveaus van RBD+-plasmablasten en ASC's hebben bestudeerd, was de volgende stap om te controleren of Bmem-cellen werden gevormd in de acute fase van SARS-CoV-2-infectie. Hiertoe werden B-cellen gezuiverd uit PBMC's die waren verzameld van 24 patiënten met COVID-19 met behulp van immunomagnetische celscheiding. Om de differentiatie van Bmem-cellen in ASC's te vergemakkelijken, werden gezuiverde B-lymfocyten gestimuleerd met behulp van A549-CD40L-feedercellen in de aanwezigheid van 25 ng ml-1 IL-21 gedurende 7 dagen, zoals eerder beschreven door Kwakkenboss et al. 19

IL-21 / CD40L-stimulatie leidde tot de uitbreiding van B-cellen (Figuur 4a). In ZvH-monsters nam het aantal B-cellen gemiddeld 10 keer toe (mediane expansiefactor, 10,66 IQR, 4,27-14,99), wat overeenkomt met ongeveer één celdeling elke 1,7 dagen. Hoewel we geen verschil in vouwexpansie zagen tussen de ernstige ziekte (N = 13) en HD-groepen, werd een merkbare toename waargenomen in de stimulatie-index in de gematigde groep (mediaan, 10,66 IQR, 4,268-14,99 N = 11).

Vervolgens onderzochten we de fenotypische veranderingen in IL-21/CD40L-gestimuleerde B-cellen met behulp van flowcytometrie. Zoals hierboven opgemerkt, bevatte de populatie van vers gezuiverde PBMC's een groot aantal plasmablasten (Figuur 4b, linkerpaneel). Na negatieve magnetische scheiding was de gezuiverde B-celpopulatie volledig verstoken van plasmablasten (Figuur 4b, middelste paneel). Tijdens IL-21/CD40L-stimulatie gedurende 7 dagen werden B-cellen met een plasmablastfenotype (CD19 + CD20 low-neg CD27 + CD38+) geregenereerd, zoals weergegeven in de representatieve plot voor een enkel monster (Figuur 4b, rechterpaneel). De populatie gestimuleerde B-lymfocyten in monsters verkregen van patiënten met COVID-19 had een lage CD27 + CD38 + -celfrequentie vergeleken met die afgeleid van HD's (P = 0,0023) (mediaan percentage CD27+CD38+-cellen in totaal gestimuleerde B-cellen: 14,7% in de groep met ernstige ziekte, 3,7% in de groep met matige ziekte en 27,0% in de ZvH-groep Figuur 4c).

De gestimuleerde B-cellen werden ook getest op directe binding met RBD-PE. Een representatieve flowcytometrie plot van RBD + gestimuleerde B-cellen wordt weergegeven in figuur 4d. De mediane waarden van door RBD+ gestimuleerde B-cellen waren respectievelijk 9,27% en 6,52% in de groepen met ernstige en matige ziekte (ernstig n = 13, matige N = 7 P (ernstig vs. gezond) = 0,0011, P (matig versus gezond) = 0,015 Figuur 4e). Gezamenlijk toonden deze gegevens aan dat IL-21/CD40L-stimulatie gedurende 7 dagen de proliferatie en differentiatie van B-cellen tot plasmablasten induceerde.

Het vermogen van functionele Bmem-cellen om te differentiëren tot RBD-specifieke ASC's na IL-21 / CD40L-stimulatie werd verder aangetoond met behulp van de ELISpot-analyse (Figuur 4f). We observeerden vergelijkbare frequenties van RBD-specifieke Bmem-cel-afgeleide IgG- of IgM-ASC's in zowel matige als ernstige ziektegroepen (Figuur 4g). De mediane frequentie van RBD-specifieke Bmem-cellen varieerde van 2,2 tot 13,3% van de totale Ig-producerende Bmem-cellen, waarbij minimale reactiviteit werd waargenomen bij niet-geïnfecteerde individuen. Met uitzondering van twee gevallen (P21 en P23), was er een goede correlatie tussen RBD-specifieke Bmem-cel-afgeleide IgG- en IgM-ASC's (Spearman's R = 0.79, P < 0,0001 Figuur 4h). Daarentegen werd in het geval van P21 (patiënt met ernstige ziekte) een overheersende IgM-ASC-respons waargenomen, terwijl in het geval van P23 (patiënt met matige ziekte) een hoge IgG-ASC-respons werd waargenomen en bescheiden niveaus van IgM-ASC's werden gehandhaafd. Vijf gevallen uit de onderzoeksgroep vertoonden aanzienlijk lage maar duidelijk positieve frequenties van zowel IgM- als IgG-ASC's. Deze patiënten kunnen worden beschouwd als patiënten met een lage respons (Figuur 4g). Interessant is dat deze groep geen monsters bevatte die geen circulerende ASC's hadden (Figuur 3c).

Om de plasmablast- en Bmem-celreacties te vergelijken, hebben we een correlatieanalyse uitgevoerd tussen de frequenties van spontane en van Bmem-cellen afgeleide ASC's. Spearman's correlatieanalyse toonde aan dat er geen verband was tussen de IgM- en IgG-responsen (Spearman's R = −0.35, P = 0,20 voor IgM R = −0.42, P = 0,12 voor IgG Figuur 4i). Dit gaf aan dat de plasmablastdynamiek niet overeenkwam met de kinetiek van Bmem-celgeneratie (aanvullende figuur 6).

Productie van RBD-bindende en virusneutraliserende antilichamen geïnduceerd door in vitro IL-21/CD40L-stimulatie van Bmem-cellen

De standaardtoepassing van de ELISpot-assay maakt evaluatie van de niveaus van uitgescheiden antilichamen niet mogelijk. Hiertoe werd de concentratie van uitgescheiden IgM of IgG in de kweeksupernatanten van IL-21/CD40L-gestimuleerde B-cellen gekwantificeerd met behulp van ELISA-platen bekleed met recombinant RBD. Totale IgG-secretie werd waargenomen in B-cellen verkregen van bijna alle patiënten (aanvullende figuur 7), maar supernatanten van slechts 3 (afgeleid van patiënten P5, P6 en P21) van de 23 monsters vertoonden een sterke reactiviteit in de RBD-bindingstest (Figuur 5a ). De door ELISA gedetecteerde concentratie van RBD-specifiek IgG in deze monsters varieerde van 30 tot 39 ng ml -1 . Het supernatant afgeleid van patiënt P5 vertoonde bovendien sterke RBD-specifieke IgA-binding (Figuur 5b). Bovendien vertoonde het supernatant van slechts één monster (verkregen van patiënt P2) een hoge RBD-specifieke IgM-activiteit (Figuur 5c).

Naast de synthese van RBD-specifieke antilichamen, wordt ook veel belang gehecht aan de uitscheiding van functionele virusneutraliserende antilichamen. De supernatanten van de kweken van gestimuleerde B-cellen werden verder geanalyseerd in een neutralisatietest met behulp van op HIV-1 gebaseerde virions, pseudogetypeerd met spike-eiwitten van SARS-CoV-2. De SARS-CoV-2-pseudogetypeerde virusachtige deeltjes (VLP's) infecteerden HEK293T-cellen die ACE2 tot expressie brengen, en ongeveer 50% van de doelcellen vertoonde een sterk GFP-signaal (aanvullende figuur 8). Het menselijke controle-monoklonale antilichaam 34B12 verhinderde op efficiënte wijze het binnendringen van pseudo-getypeerde VLP's in doelcellen, en in dit geval werden geen GFP+-cellen gevormd. Monsters van gestimuleerde B-celculturen werden direct zonder verdunning in de neutralisatietest gebruikt. Om onderscheid te maken tussen positieve en negatieve monsters, werd een afkapwaarde voor virusneutralisatie vastgesteld op 40%. Er werd gevonden dat supernatanten van 3 van de 23 monsters (verkregen van patiënten P5, P6 en P21) een sterke reactiviteit vertoonden in pseudotype HIV-1-neutralisatieassays (Figuur 5d). Bovendien vertoonden supernatanten van drie andere monsters (afkomstig van patiënten P14, P15 en P17) neutralisatie bij een waarde die marginaal boven de grenswaarde lag. Met name de monsters (afgeleid van P5, P6 en P21) die de hoogste activiteit vertoonden in de neutralisatietest, hadden ook de hoogste concentratie anti-RBD IgG, terwijl ze niet de hoogste concentratie anti-RBD IgM hadden. Dit suggereert dat RBD-specifieke IgG's, en mogelijk IgA's zijn, hebben bijgedragen aan de virusneutralisatie-activiteit van supernatanten die zijn afgeleid van de Bmem-celculturen. Daarom vertoonden van Bmem-cellen afgeleide antilichamen van patiënten zeer heterogene maar gecorreleerde RBD-bindings- en neutralisatie-activiteiten. Onze resultaten gaven aan dat slechts een klein percentage van de patiënten met acute COVID-19 Bmem-cellen bezat die antilichamen konden produceren die de epitopen van SARS-CoV-2 direct konden neutraliseren.

In tegenstelling tot het patroon van anti-RBD-activiteit waargenomen in supernatanten van celculturen, vertoonden bijna alle plasmamonsters (behalve die afkomstig van P20) hoge niveaus van RBD-specifiek IgG en IgM, wat correleerde met het virusneutraliserende vermogen (Spearman's R = 0.48, P = 0,025 voor IgG Figuur 5e Spearman's R = 0.84, P = 0,0001 voor IgM Figuur 5f). Er werd geen correlatie waargenomen tussen de plasma- en Bmem-cel-afgeleide RBD-specifieke IgG's (Figuur 5g). Alleen in monsters verzameld van patiënten P5, P6 en P21 werd een overeenkomst opgemerkt tussen de van plasma en kweeksupernatant afgeleide RBD-specifieke IgG's (Figuur 5g). Deze resultaten gaven aan dat de van plasma en Bmem-cellen afgeleide RBD-specifieke antilichamen afkomstig waren van verschillende en indirect verbonden B-celsubsets, die verschillende BCR-repertoires hadden.


Capsule kleuring

Bepaalde bacteriën en gisten hebben een beschermende buitenstructuur die een capsule wordt genoemd. Aangezien de aanwezigheid van een capsule rechtstreeks verband houdt met de virulentie van een microbe (het vermogen om ziekten te veroorzaken), is het vermogen om te bepalen of cellen in een monster capsules hebben een belangrijk diagnostisch hulpmiddel. Capsules absorberen de meeste basiskleurstoffen niet, daarom wordt meestal een negatieve kleuringstechniek (kleuring rond de cellen) gebruikt voor capsulekleuring. De kleurstof kleurt de achtergrond, maar dringt niet door in de capsules, die als halo's rond de randen van de cel verschijnen. Het monster hoeft niet met warmte te worden gefixeerd voorafgaand aan negatieve kleuring.

Een veelgebruikte techniek voor negatieve kleuring voor het identificeren van ingekapselde gist en bacteriën is het toevoegen van een paar druppels Oost-Indische inkt of nigrosine aan een monster. Andere capsulaire kleuringen kunnen ook worden gebruikt om ingekapselde cellen negatief te kleuren (Figuur (PageIndex<7>)). Als alternatief kunnen positieve en negatieve kleuringstechnieken worden gecombineerd om capsules zichtbaar te maken: de positieve vlek kleurt het lichaam van de cel en de negatieve vlek kleurt de achtergrond maar niet de capsule, waardoor er een halo rond elke cel achterblijft.

Afbeelding (PageIndex<7>): (a) Indië-inkt werd gebruikt om de achtergrond rond deze cellen van de gist Cryptococcus neoformans te kleuren. De halo's die de cellen omringen zijn de polysacharidecapsules. (b) Kristalviolet- en kopersulfaatkleurstoffen kunnen de ingekapselde Bacillus-cellen in dit negatief gekleurde monster niet binnendringen. Ingekapselde cellen lijken een lichtblauwe halo te hebben. (credit a: wijziging van werk door American Society for Microbiology credit b: wijziging van werk door American Society for Microbiology)

Hoe helpt negatieve kleuring ons om capsules te visualiseren?


Co-kleuring van bloedvaten en zenuwvezels in vetweefsel

De vorming van nieuwe bloedvaten en sympathische innervatie spelen een cruciale rol bij de remodellering van vetweefsel. Er blijven echter technische problemen bij het visualiseren en kwantitatief meten van vetweefsel. Hier presenteren we een protocol om de dichtheden van bloedvaten en zenuwvezels in verschillende vetweefsels met succes te labelen en kwantitatief te vergelijken.

Abstract

Recente studies hebben de cruciale rol benadrukt van angiogenese en sympathische innervatie bij de remodellering van vetweefsel tijdens de ontwikkeling van obesitas. Daarom is het noodzakelijk om een ​​gemakkelijke en efficiënte methode te ontwikkelen om de dynamische veranderingen in vetweefsel te documenteren. Hier beschrijven we een gemodificeerde immunofluorescentiebenadering die efficiënt bloedvaten en zenuwvezels in vetweefsels co-kleurt. Vergeleken met traditionele en recent ontwikkelde methoden is onze aanpak relatief eenvoudig te volgen en efficiënter in het labelen van de bloedvaten en zenuwvezels met hogere dichtheden en minder achtergrond. Bovendien stelt de hogere resolutie van de afbeeldingen ons in staat om het gebied van de bloedvaten, de hoeveelheid vertakkingen en de lengte van de vezels nauwkeurig te meten met open source-software. Als demonstratie met onze methode laten we zien dat bruin vetweefsel (BAT) grotere hoeveelheden bloedvaten en zenuwvezels bevat in vergelijking met wit vetweefsel (WAT). We vinden verder dat onder de WAT's subcutane WAT (sWAT) meer bloedvaten en zenuwvezels heeft in vergelijking met epididymale WAT (eWAT). Onze methode biedt dus een handig hulpmiddel voor het onderzoeken van de remodellering van vetweefsel.

Invoering

Vetweefsel heeft belangrijke metabole en endocriene functies 1 . Het zet dynamisch uit of krimpt in reactie op verschillende voedingsspanningen 2 . Het proces van actieve weefselremodellering bestaat uit meerdere fysiologische paden/stappen, waaronder angiogenese, fibrose en vorming van lokale inflammatoire micro-omgevingen 2 , 3 , 4 . Sommige fysieke prikkels, zoals blootstelling aan koude en lichaamsbeweging, kunnen sympathische activering veroorzaken, wat uiteindelijk leidt tot de vorming van nieuwe bloedvaten en sympathische innervatie in vetweefsel 5 , 6 . Deze hermodelleringsprocessen zijn nauw verbonden met systemische metabole resultaten, waaronder insulinegevoeligheid, het kenmerk van type 2 diabetes 2 . Het visualiseren van deze pathologische veranderingen is dus erg belangrijk om de gezonde status van hele vetweefsels te begrijpen.

Angiogenese is het proces van de vorming van nieuwe bloedvaten. Omdat bloedvaten zuurstof, voedingsstoffen, hormonen en groeifactoren aan weefsel leveren, wordt angiogenese beschouwd als een belangrijke stap in de remodellering van vetweefsel, wat is gedocumenteerd met verschillende technieken 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 . Er blijven echter vragen over de resolutie van de afbeeldingen, de efficiëntie van immunokleuring en methoden voor het kwantificeren van de vaatdichtheid. In vergelijking met de vorming van nieuwe bloedvaten is de innervatie in vetweefsel lange tijd onderschat. Onlangs hebben Zeng et al. 14 gebruikten geavanceerde intravitale twee-fotonenmicroscopie en toonden aan dat adipocyten omgeven zijn door lagen zenuwvezels 14 . Sindsdien zijn onderzoekers de cruciale rol van sympathische innervatie bij de regulatie van de fysiologie van vetweefsel gaan waarderen. Het is dus belangrijk om een ​​gemakkelijke en praktische benadering te ontwikkelen om de innervatie van de vetzenuw te documenteren.

Hier rapporteren we een geoptimaliseerde methode voor de co-kleuring van bloedvaten en zenuwvezels op basis van onze eerdere protocollen. Met deze methode kunnen we heldere beelden van bloedvaten en zenuwvezels bereiken zonder lawaaierige achtergrond. Moreover, we obtain a resolution that is high enough for performing quantitative measurement of densities with open source software. By using this new approach, we can successfully compare the structures and densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose depots.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All procedures containing animal subjects have been approved by the Animal Welfare Committee of University of Texas Health Science Center at Houston (animal protocol number: AWC-18-0057).

  1. 1x phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4): to make 1 L of 1x PBS, dissolve 8 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.44 g of Na2HPO4, and 0.24 g of KH2PO4 in 800 mL of distilled water. Adjust the pH to 7.4 and fill with distilled water to achieve a final volume of 1 L.
  2. 1% paraformaldehyde in 1x PBS (1% PFA, wt/vol): to achieve a final volume of 50 mL, add 3.125 mL of 16% PFA (see Table of Materials) to 46.875 mL of 1x PBS. Mix well and store at 4 °C for later use.
    VOORZICHTIGHEID: Paraformaldehyde is toxic. All procedures should be carried out under a fume hood to avoid inhalation and skin contact.
  3. 0.1% polysorbate 20 (see Table of Materials) in 1x PBS (1x PBST, pH 7.4, vol/vol): to achieve a final volume of 50 mL, add 0.05 mL of polysorbate 20 to 49.95 mL of 1x PBS. Vortex and store at 4 °C for up to 1 month.
  4. 1% octoxynol-9 (see Table of Materials) in 1x PBS (1x PBS-TX, pH 7.4, vol/vol): to achieve a final volume of 10 mL, add 0.1 mL of octoxynol-9 to 9.9 mL of 1x PBS. Vortex and store at 4 °C for up to 1 month.
  5. 2% sodium azide (wt/vol): to produce 10 mL of 2% sodium azide, add 0.2 g of sodium azide to 10 mL of 1x PBS. Mix well and store at 4 °C for later use.
  6. 90% glycerol in 1x PBS (vol/vol): to achieve a final volume of 10 mL, add 1 mL of 1x PBS to 9 mL of glycerol. Vortex and store at room temperature (RT) for later use.

2. Animal Ddissection and Adipose Tissue Collection

  1. Use 6-week-old C57BL/6J male mice. Anesthetize the mice with isoflurane (4%𔃃% for induction then 1%𔃀% for maintenance). Once anesthetized, perform a toe-pinch reflex to determine the anesthetic depth, judging by the lack of pedal reflexes. Once the mice are deeply anesthetized, dissect the mice following the protocol as previously published 15 .
  2. Sterilize the blunt scissors and surgical area of the chest (no need to shave the hair). Open the chest by cutting the diaphragm and ribs along the lateral surface with a size of

  1. Cut the fixed tissue samples into approximately 2 mm 3 cubes with the sterilized scissors. For permeabilization, transfer the samples into a 1.5 mL tube containing 1 mL of 1x PBS-TX (1% octoxynol-9 in 1x PBS, see Table for Materials, pH 7.4) and gently rotate the tubes at RT for 1 h at 18 rpm.
  2. Carefully remove the 1x PBS-TX by aspiration. Wash the samples 3x by adding the 1x PBS directly into the same tubes (no need to change the tubes). During each wash, invert the tubes several times.
  3. For blocking, add 0.5 mL of blocking buffer (Table of Materials) to the samples and incubate at RT for 2 h with gentle rotation.
  4. To prepare 0.4 mL of primary antibody solution, dilute 2 μL of anti - endomucin (the marker of blood vessels) 5 (1:200) and 2 μL of anti — tyrosine hydroxylase (TH, the marker of nerve fibers) 5 (1:200, 1 µg/mL) antibodies (Table of Materials for antibody information) into 396 μL of blocking buffer. Vortex and spin down to recover the volume.
  5. For the first antibody incubation, carefully remove the blocking buffer from the tissue chunks. Add 100 μL of primary antibody solution prepared in step 3.4 into tubes and incubate at 4 °C overnight.
    OPMERKING: The antibody dilution and incubation time may vary among different antibodies. It is recommended to add 0.02% sodium azide to the antibody solution to prevent microbial growth. To prepare 0.4 mL of primary antibody solution with sodium azide, add 4 μL of antibodies (1 μL of each) and 4 μL of 2% sodium azide into 392 μL of blocking buffer.
  6. Carefully collect the primary antibody solution for reuse if desired. Wash the samples with 1x PBST (pH 7.4, 100 µL/wash) three times (30 min each) with gentle rotation at 18 rpm.
  7. For the preparation of secondary antibody solution, dilute 2 μL of fluorophore (wave length 495 nm) conjugated anti-goat IgG (1:200) and 2 μL of fluorophore (wave length 650 nm) conjugated anti-rabbit IgG (1:200) (see Table of Materials) into 396 μL of blocking buffer. Vortex and spin briefly to collect all the liquid.
    OPMERKING: Protect the samples from light during the following procedures.
  8. For the second antibody incubation, remove the last wash buffer from samples. Add 100 μL of secondary antibody solution into tubes and incubate at RT for 2 h with gentle rotation at 18 rpm.
  9. Carefully remove the secondary antibody solution. Wash the samples 3x with 1x PBST (pH 7.4, 30 min each) with gentle rotation at 18 rpm.
    OPMERKING: Do not reuse this secondary antibody solution, as it may be contaminated with the trace amounts of primary antibodies brought by the tissues.
  10. For optical clearance, immerse the samples in 1 mL of 90% glycerol and keep the samples at 4 °C in darkness until they become transparent.
    OPMERKING: The immersion duration depends on the tissue type and size. Typically, a 2 mm 3 cube of white adipose tissue needs overnight incubation, while the same size brown adipose tissue sample needs longer.
  11. Adhere a silicone isolator to the slide to create a well for volume imaging. Alternatively, attach several layers of transparent tape to the slides and cut a square out of the middle to create a well (Figuur 2).
    OPMERKING: Adjust the well depth to fit the sample size. In this protocol, a 1 mm well depth is used.
  12. Carefully transfer the samples into the well and fill it with the mounting medium (see Table of Materials). Lay a cover slip on the surface and seal the corners of the cover slip with high viscosity medium (see Table of Materials). Let the mounting medium cure for 24 h at RT in darkness.
    OPMERKING: Ensure that no space is left between the sample and cover slip. Avoid bubbles under the cover slip. Avoid placing excessive pressure on the samples.
  1. Acquire Z-stack images (refer to steps 4.2𔃂.7) with the 20x objective of a confocal microscope/software.
  2. Start the system. Click on the <Configuratie> tab and activate the argon laser and HeNe 633 laser. Click on the <Acquire> tab. In the <Visible> laser lines panel, move the corresponding intensity sliders up to choose the laser lines of 488 nm and 633 nm. Initially, the intensities can be set to 20%󈞊%. Select the 488/561/633 triple dichoric mirror. Activate the PMTs by clicking on the <Actief> checkboxes, choosing PMT1 for the emission excited by the 488 nm laser and PMT3 for that of the 633 nm laser. Set the wavelength range to 500� nm for PMT1 and 650-750nm for PMT3. Select the psudocolor to be used for image display by double clicking the colored rectangle beside each PMT and choosing a color from the pop-up menu.
  3. Click on <Live> to check the image of samples. Use the z-Position knob to select a plane of focus within the XY region of interest. Adjust the brightness of the images by tuning the laser intensity, smart gain and offset. For each fluorescence channel, perform this adjustment under the <QLUT> (Quick Look Up Table) display mode. Click on the <QLUT> button to enter the QLUT mode, in which saturated pixels are displayed in blue to aid the setting of appropriate brightness level. Click twice on the <QLUT> button to go back to the pseudocolor display mode.
    OPMERKING: The numerical values of the setting may vary among each experiment.
  4. While scanning, turn the Z-Position knob counterclockwise to move the plan of focus to one end of the volume of interest and then click on the <Einde> arrowhead to set the scanning end position. Then turn the Z-Position knob clockwise to move the plane of focus through the specimen to the other end of the volume of interest and then click on the <Beginnen> arrowhead to set the scanning begin position.
    OPMERKING: For the comparison between different samples, define the same Z-volume for different samples.
  5. Adjust the z-step size to 3 µm. Change the image quality by selecting a format of 1024 x 1024, speed of 100 Hz, and line average of 2.
  6. Select <Start> to initiate the z-stack image acquisition.
  7. For maximum projection of the acquired image stack, click on <Proces> tab and then <Tool>, select <3D Projection> and enter <Maximum> in the method list without changes to X, Y and Z. Set <Drempelwaarde> to 0. Click on <Apply>. The maximum intensity of the Z-volume will be stacked into a 2D image which will be shown (Afbeelding 4A).

5. Analysis of Blood Vessel and Nerve Fiber Networks

  1. Analysis of 2D images via open source software (see Table of Materials) 19
    1. Open the stacked images in the software. Adjust Vessel diameter and intensity until all the vessel structures can be properly selected (FigureلB).
    2. Selecteer Run analysis and export the data following guidance of the software.
    1. Open the raw data of images with the software. Adjust the threshold and other parameters until the vessel structures in each layer of the z-volume are properly selected (refer to the user guide for details in the software) (Figuur 4C).
    2. Analyze the selected segments characters and export the data following the guidance of the software.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representatieve resultaten

    The distal region of the epididymal white adipose tissue (eWAT), medial region of the dorsolumbar subcutaneous white adipose tissue (sWAT), and medial region of the interscapular brown adipose tissue (BAT) were collected. The locations for collecting these tissues are indicated in Figuur 1.


    Figure 1: Anatomy of subcutaneous white adipose tissue (sWAT), epididymal white adipose tissue (eWAT), and brown adipose tissue (BAT) indicates regions used for collecting the samples. (EEN) The regions outlined by white dashed lines represent sWAT, and the white asterisk highlighted location is the site for collecting sWAT. Regions outlined by black dashed lines are eWAT, and the black asterisk highlighted location is the site for collecting eWAT. (B) The regions outlined by black dashed lines are BAT, and the tissue collection region is highlighted by the asterisk. Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.

    After whole-mount staining, the tissue chunks were mounted in a well of 1 mm depth (Figuur 2)

    and imaged with the confocal microscope. We first tested the effect of the clearing step with 90% glycerol incubation on quality of the images. We found that more blood vessels were positively stained with α-endomucin antibody in the glycerol-incubated sWAT, suggesting that the clearing step is critical for complete staining of the blood vessels (figuur 3, compare panels A and B).


    Figure 2: Diagrams of the wells for volume imaging. (EEN) Diagram of a slide with a silicone isolator. (B) Diagram of a well with multiple layers of tape made by our lab. Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.


    Figure 3: Comparison of IF images of blood vessels acquiredwith or without optical clearing step with 90% glycerol. (EEN) Whole-mount immunofluorescence (IF) staining with anti-endomucin antibody (green) in sWAT. The sample was not subjected to the optical clearing step (step 3.10). (B) Whole-mount IF staining with anti-endomucin antibody in sWAT. The sample was subjected to the optical clearing step (step 3.10) before the mounting steps (steps 3.11 and 3.12). Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.

    However, the clearing step with glycerol did not affect the integrity or shape of the blood vessels (figuur 3). Given these beneficial effects, in the following experiments, the clearing step was performed.

    We further compared the results of 2D and 3D analyses using different software (see Table of Materials). We found that, while the 3D images apparently provided more detailed structural information, the two analytic methods eventually did not show significant differences in terms of the length and branch number of the vessels (Figuur 4).


    Figure 4: Comparison of 2D and 3D analyses on vessel structure. (EEN) The effect of maximum projection on the images. (B) The analytic results by the 2D software (see Table of Materials). Particularly, the red lines indicate selected skeleton, while the blue dots indicate branding points. (C) The analytic results by the 3D software (see Table of Materials). The gray area is the selected region for analysis. The green line indicates the measured segments and green dots indicate the measured nodes. (NS) The comparison of vessel length, segment numbers, branching node numbers, and terminal node numbers analyzed by 2D or 3D methods. Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.

    Previous publications have demonstrated that different adipose depots possess heterogeneous properties 1 , 18 . Here we sought to determine whether blood vessels and nerve fibers exhibit different patterns among the depots using our newly developed method. To achieve this, we performed co-IF staining with α-endomucin (for blood vessels) and α-TH (for nerve fibers) antibodies in adipose tissue. Interestingly, results showed that there were significantly more blood vessels and nerve fibers in BAT compared to WATs (Figuur 5, compare bottom lanes to top and middle lanes)


    Figure 5: Comparison of blood vessels and nerve fibers acquired from different adipose depots. Whole-mount IF staining with anti-endomucin (green) and anti-tyrosine hydroxylase (TH) (red) antibodies in eWAT (EEN, B, merged in C),sWAT (NS, E, merged in F) and BAT (G, H, merged in l). Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.

    Among the WATs, the sWAT exhibited higher blood vessel density than the eWAT (Figuur 5, compare the middle to top lane). Of note, while the nerve fibers expanded in parallel with the blood vessels, they did not show significant co-localization (Figuur 5, merged lanes). We further quantitatively measured the vessel area, number of junctions, and tube length with the 2D method and found similar results as described above (Figuur 6).


    Figure 6: Quantitative analysis of vascular and nerve fiber networks. (EEN) The percentage of blood vessel area in the samples of eWAT, sWAT, and BAT. (B) The number of junctions of the vascular networks in eWAT, sWAT, and BAT. (C) The total vessel length of vascular networks in eWAT, sWAT, and BAT. (NS) The percentage of neve fiber area in the samples of eWAT, sWAT and BAT. (E) The number of junctions of the nerve fibers in eWAT, sWAT, and BAT. (F) The total length of nerve fibers in eWAT, sWAT, and BAT. The analyses were performed with 2D software. The results were achieved from the images presented in Figuur 5. Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.

    In summary, this approach successfully co-stained blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussie

    Adipose tissue remodeling is directly linked to metabolic dysregulation during obesity development 1 , 2 . Angiogenesis and sympathetic innervation are both essential for the dynamic remodeling process 2 , 12 . Therefore, developing an applicable approach to visualize the new blood vessels as well as nerve fibers are of great importance. Previous methods have been reported for documenting angiogenesis in adipose tissue. However, some issues remain with these approaches, including low efficiency, fussy resolution, and noisy background. Meanwhile, sympathetic innervation has only been recognized recently as a critical step in adipose tissue pathology 14 . Even though the related findings are interesting, applied methods require advanced microscopy tools and are time-consuming. Here, we report an easy-to-follow approach modified from our previous protocol for co-staining blood vessels and sympathetic nerve fibers. Interestingly, we successfully stained the blood vessels and nerve fibers with high resolution, and the staining has qualities comparable to previously reported images 18 .

    We previously stained the blood vessels in adipose tissues by immunohistochemistry or immunofluorescence with the α-CD31 antibody, a marker of endothelial cells, on paraffin-embedded slides 8 , 13 , 20 . While the method allows us to distinguish blood vessel density between different groups, the microvascular vessels that were positively stained were not complete. Here, we chose a whole-mount method and performed IF staining with a α-endomucin antibody, another marker for blood vessels. With this optimized approach, we were able to achieve staining with more blood vessels, especially microblood vessels. Moreover, in this method, since we avoided steps such as paraffin embedding and formalin fixation, which have the potential to impair the integrity of blood vessels, we obtained images with higher resolution and more intact vessels. The unimpaired structure of the vessels further allowed us to measure and compare their lengths, branching, and areas. Of note, we added a clearing step with glycerol, so the tissue chunks could become more transparent, and this simple but critical step significantly enhanced efficiency of the staining 18 , 21 .

    Due to high levels of lipid contents in the adipose tissue, which might limit the accessibility of antibodies to the inner regions of the tissue, we cut the depots into small pieces to ensure adequate antibody binding to the target proteins. Therefore, our method successfully stains more blood vessels and nerve fibers than staining on whole tissues. However, it may lose spatial information and hence affect the integrity of the nerve fibers. To resolve this apparent issue and ensure the images are comparable among individual mice, it is suggested to collect the small chunks from the same regions in the adipose depots. If more spatial information is further needed, larger chunks should be obtained for staining. For larger samples, longer fixation times with higher doses of FPA, higher concentrations of detergents for permeabilization, and longer periods of antibody incubation may be needed.

    Adipose tissue innervation has been investigated recently. Multiple advanced techniques have been applied to visualize nerve fibers 14 , 17 . These methods are either expensive or time-consuming. Here, we simply performed an IF stain with α-TH (a sympathetic nerve marker) and successfully stained the sympathetic nerve fibers at a high quality. More importantly, we performed the co-staining with α-endomucin and α-TH to investigate how the blood vessels interplay with sympathetic nerve fibers during adipose tissue remodeling.

    Of note, we compared the results from 2D and 3D analyses using different software. It was found that, while the 3D images provided more detailed structural information, the two analytic methods did not show significant difference in terms of the length and branching of the vessels. Eventually, when analyzing with the 3D method, the software itself may detect some false signals that need to be manually adjusted. Given that the 2D software is purposely designed for vessel analysis, it is thus suggested to use this method for quantitatively measuring the structure of vessels.

    With this method, blood vessels and nerve fibers in different adipose tissue were co-stained, and their densities, branching, and lengths were compared 19 . It was found that both blood vessels and nerve fibers are much thicker in BAT compared to WAT, suggesting that BAT is a more metabolically active adipose depot. Moreover, the blood vessel and nerve densities in sWAT were higher than in the eWAT, indicating that different WATs have different remodeling profiles.

    In conclusion, this method efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissue 5 . Furthermore, it serves as a useful tool for studying the dynamic changes in adipose tissue during obesity development.


    Blocking in Immunofluorescence Microscopy - (Jun/21/2007 )

    Hi everyone,
    I have 2 questions about immunofluorescence microscopy preparations. In most of the protocols it is recommended to use the serum of the secondory antibody species. If the secondary antibody is goat antimouse, we should use the goat serum for blocking. But recently some one told me that they always use the serum of a different species. For example, if the secondary antibody is goat antimouse, they use donkey serum for blocking. It was very weird for me. Which method are you using and why?
    And the second question: Do you rinse your samples after blocking and before primary antibody incubation? Some protocols suggest not to rinse the samples between these two steps whereas others rinse 2-3 times before adding the primary antibody. Which method you use?
    Thanks a lot for the help

    We use NGS for blocking when using secondary antibodies made in goat. I don't think using a donkey serum for blocking and then using goat secondaries would be a problem. To answer your second question, I don't wash in between the primary antibody and blocking steps.

    This is from Jackson Product Catalog, technical information: "Never block with normal serum or IgG from the host species of the primary antibody when a labeled secondary antibody is used. If immunoglobulins in the serum bind nonspecifically to the specimen of interest, they will be recognized by the labeled secondary antibody, resulting in higher background. BSA and dry milk may contain bovine IgG. Secondary Ab directed tegen bovine, goat, horse, or sheep react with bovine IgG. Therefore, use of BSA or dry milk to block or dilute these antibodies may sinificantly increase background staining and reduce antibody titer. For blocking, normal serum (5%v/v) from the host species of the secondary antibody is recommended"

    As for us, since we mostly use mouse or rabbit primary Ab with goat secondary antibody, the antibody diluting buffer always have BSA and FBS, sometimes (the good ones) will also have goat serum. We have never done blocking step, though, always after permeablization we go straight to primary Ab incubation. No problem for us.

    We use FBS/NGS for blocking even if the secondary is rabbit or mouse or even goat or donkey.

    Don't you get nonspecific binding when you use NGS for the secondary antibody like rabbit anti goat? I was thinking that the goat IgG in the goat serum binds to the sticky sites and results in a higher background.

    Don't you get nonspecific binding when you use NGS for the secondary antibody like rabbit anti goat? I was thinking that the goat IgG in the goat serum binds to the sticky sites and results in a higher background.

    Somehow we didnt have a problem. No explanations though.

    avidin/biotin block when i use avidin biotin
    goat block when i use goat anti . ondergeschikt
    rabbit block when i use rabbit anti . ondergeschikt
    the same for donkey, horse etc

    and i do wash between every step (only short washes to prevent mixing of chemicals)

    we use ngs/bsa in pbs for block and ngs in pbst for diluting abs. our abs are mouse monos, rabbit polys and goat antimouse or rabbit for secondaries.

    we used to wash after blocking until we realized that it made no difference except to shorten the procedure if we didn't. so, now we don't.

    I have always blocked in 5% BSA/PBS and will briefly rinse my slides in PBS before starting primary antibody. Doesn't matter though since I dilute my antibodies in the blocking BSA/PBS. I've only worked with mouse and rabbit antibodies previously but am starting to work with a third stain with a goat antibody. I didn't think about the potential for cross-reactivity to the BSA. Any other ideas for blocking? Milk doesn't seem to do much good for IF and I've tried fish skin gelatin but it's even worse than milk.

    Actually I have used goat primary Ab before with the same FDB containing BSA and FBS and it still works for me. However, if you want to be careful, then use the serum of your secondary Ab to block.


    Western blot: I forgot to boil samples prior to loading on gel. Should i continue with transfer and antibody staining?

    I just loaded my Western blot lysates on a gel without boiling first. I'm wondering if the experiment is ruined now. The samble buffer contains SDS. Does the SDS denature most of the proteins anyway, and is the boiling just a step to ensure 100% denaturation? Or is the boiling absolutely required?

    Depends on the size, as well. The higher molecular weight products will require a longer boil for optimal denaturing. Boiling is not absolutely required, but the chances of seeing your band (and at the correct size) is definitely lower.

    I guess what it comes down to is how quickly you need the results and how precious your lysates & antibodies are.

    In your position, I would prep the lysates again and boil them, provided they aren't very scarce lysates. It's not impossible that youɽ be able to get a look at your protein(s) of interest without boiling, but it will likely be hard to trust what you see because you can't really know which proteins were denatured, so there's a good chance you'll end up repeating it anyway. We all make mistakes, it's part of the process. Veel geluk.

    Most procedures are created by experiment and the best ones are written down and passed on to be used again. So when a procedure is telling you to boil your sample, then the people who wrote the procedure got the best results from doing so. If you are doing a large number of trials and in this one you forgot to boil it first, then you defiantly should do the experiment again. This will ensure that your results from this trial will not unjustly differ from the results from the other trials. However if this is the only trial, then why not let it run. Your results may not be as defined or accurate but you will probably still get a readable result. Worst case you have to run it again, and you have used materials already, no sense wasting them.

    tl:dr If your only doing this one trial give it a shot and look at the results: multiple trials do it again to keep the procedure constant


    No SDS in gels - (Jun/25/2010 )

    Hi, i've just performed my first western blot with the help of a colleague at the lab. Unfortunately, things didn't go as smoothly as expected. I've ran into a few problems while performing my WB.

    1. My colleague forgot to add SDS while preparing the gels. How would this affect my bands and their separation?

    2. While incubating with my anti-mouse secondary antibody in an orbital shaker, a lab member turned up the temperature to 37 degrees celsius. The manufacturers instructions for incubation temperatures is at room temperature.

    With all these in mind, my samples showed a bit of diffuse signal across the entire lane with a darker, more concentrated band somewhere in the middle. This band isn't very well defined either with fuzzy edges. My negative controls however, did not show anything on the lanes.

    Also, would the lack of SDS in the gels affect my marker migration and separation? The bands seem a bit 'off'.

    Your advise/input is very much appreciated. Cheers

    Hoi. ya withough SDS in ur gel the technique is no longer SDS_PAGE. its more like a native gel with a SDS_PAGE sample buffer. tat is the precise reason for all the wierd observations.. just repeat the exp with proper gel preparation and i guess u will be fine with it!!!
    Now room temperature is a very controversial term.. here in india RT can be 37 degrees!!

    sds in the running (electrode) buffer will migrate through the gel so it is still sds-page (this is how the pharmacia phast gel system worked). the sds front will pass the proteins as they stack. in a small gel (like the phast gels) the defects may be negligible but may not be in larger gels (this is pure speculation on my part, i've never tried it).

    but, yes, try again with a properly prepared gel.

    so the best bet is running the gel again with properly prepared gel and samples!!!

    Alrighty, i'll try that this week and get back to you guys! Thanks for the advise.

    Okay, i just ran a second experiment, essentially the same as the one mentioned previously but with SDS added into my gels. I still have the same problem of background staining all along the lanes. I think there might be a problem with unspecific antibody binding.

    The primary antibody used was a mouse anti-human polyclonal. Made up in 2.5% BSA and incubated at 4 celsius overnight.

    The secondary antibody was an anti-mouse HRP conjugated, raised in sheep. Incubated for 2 hours at room temperature (

    22 celcius) and made up in 2% milk/TBST.

    I've attached my result if any of you would care to have a look at. This was imaged with iQ350 imager with a 15 minute exposure using ECL. I should also note that the signal emitted was rather low.

    What could i have done wrong? Helps, suggestions are most welcome
    ' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=1789" target="_blank">

    why do you change blocking agent between antibodies? with what do you block the membrane?

    you may want to consider adding normal sheep serum to the block and antibody solutions.

    mdfenko on Jul 1 2010, 07ᛡ PM said:

    why do you change blocking agent between antibodies? with what do you block the membrane?

    you may want to consider adding normal sheep serum to the block and antibody solutions.


    yeah i agree.. sorry if i missed it but i dont see any blocking step!!!
    ideally its better to clok the blot before the addition of primary antibody!!! and u can use the same solution to prepare the primary and seconday!!! why switch from a BSA to a 2% milk!!!

    I blocked it with 2% milk in TBST.

    Good point, my boss asked me to make up my primary in BSA which is odd since i am blocking with milk. I am planning to re do the experiment next week.

    Btw, i am quite unfamiliar with WB, how would the use of BSA or milk affect my results? Some people in my department use milk, some use BSA.

    Leon_K on Jul 2 2010, 05ᚭ AM said:

    you use different blocking agents for different purposes (although most blocking agents are pretty general in use).

    for instance, i wouldn't use milk to block if i was probing for phosphoproteins (some do but their antibody may be more specific). milk contains casein which is highly phosphorylated.

    i also wouldn't use milk with a biotinylated system. it also contains biotin.

    bsa is a general use protein block which can be used where milk can't (and where it can).

    we also add normal serum from the species in which the secondary antibody is produced.


    COMMENTARY

    Achtergrond informatie

    The accurate quantification of infectious virus specimens is crucial for a multitude of applications in virology. Plaque assays were established in 1952 as an adaptation of phage assays, which were used to calculate bacteriophage titers in plant biology (Cooper, 1961 Dulbecco & Vogt, 1953 ). Although new techniques for viral titration continue to evolve, plaque assays continue to be the gold standard for the quantification of infectious virus (Baer & Kehn-Hall, 2014 ).

    The plaque assay using the double overlay method (Basic Protocol) described in this article has been adapted for SARS-CoV-2 from previously characterized procedures (Berry et al., 2004 Harcourt et al., 2020 Ströher et al., 2004 ). Noble agar, the solid matrix used in the overlay in the Basic Protocol, is considered a traditional overlay matrix for plaque assays. However, it comes with disadvantages. Heating is required to liquefy the matrix immediately prior to application, which warrants the need to work quickly when applying this type of overlay since it can re-solidify as it cools. The secondary overlay in this protocol uses neutral red to stain the monolayer and enhance the visualization of plaques. As a vital stain, neutral red has the advantage of being applied during incubation, enabling live monitoring of plaque formation. However, the contrast between plaques and viable cells stained with neutral red is not as distinct as that produced by crystal violet and fixation in the Alternate Protocol, and requires a light box to further enhance visualization.

    The plaque assay using the fixation and staining method (Alternate Protocol) described in this article has been adapted for SARS-CoV-2 from previously characterized procedures (Schneider et al., 2012 Vicenzi et al., 2004 Wang, Sakhatskyy, Chou, & Lu, 2005 ). In contrast to the Basic Protocol, this method uses a liquid overlay matrix, which confers benefits over solid/semi-solid overlay matrices, including the ease of removal prior to fixation. In addition, liquid overlays can be applied to cell monolayers at room temperature, eliminating issues of re-solidification during the application process. However, the disadvantage of the liquid overlay matrix is that disruption of the liquid overlays can result in smeared plaques, and thus great care must be taken to prevent movement of plates during the incubation period. The fixation and subsequent staining with crystal violet used to enhance plaque visualization in the protocol has several advantages, including increased contrast between plaques from the purple monolayers, as well as the inactivation of the virus. In addition, fixation enables plates to be stored and plaques to be enumerated at a later time. However, some disadvantages of this method includes the generation of formaldehyde waste and the additional need to properly inactivate that chemical.

    As summarized in Table 1, each protocol has advantages and disadvantages that can be assessed to select the method best suited to each laboratory's resources and preferences. A comparison conducted in our laboratory demonstrated that there were no significant differences in viral titers calculated using either method.

    Advantage: Liquid overlay easily applied

    Critical Parameters

    Since SARS-CoV-2 is a BSL-3 pathogen, procedures using SARS-CoV-2 specimens require BSL-3 facilities, equipment, and operational practices. Additional personal protective equipment (PPE), including respiratory protection, is required for working with SARS-CoV-2 (WHO, 2020b ). It is crucial to consult with on-site biosafety officers, occupational hygienists, and other related personnel to conduct risk assessments and provide guidance regarding protective equipment, effective disinfectants, and practices to mitigate risks when working with the pathogen.

    The monolayer is susceptible to damage from forceful pipetting, which can then be mistaken for plaques. Instead of adding medium directly on top of the monolayer, slowly add it by aiming for the walls of each well.

    Probleemoplossen

    See Table 2 for commonly encountered problems, causes, and solutions. A plaque assay plate exhibiting commonly encountered problems is depicted in Figure 5.

    Probleem Possible cause Oplossing
    Plaque numbers >100 at all dilutions Virus titers of the specimen may be greater than 10 7 PFU/ml Conduct another plaque assay with further serial dilutions of the specimen (i.e., 10 −7 , 10 −8 , 10 −9 , etc.)
    Improper technique for serial dilutions Make sure to change pipet tips, vortex well, and briefly centrifuge between dilutions
    Plaque numbers <5 at all dilutions Virus titers of the specimen may be less than 100 PFU/ml Conduct another plaque assay and infect cells with the undiluted sample, as well as the sample diluted 10 −1
    Heat from the S-OM (Basic Protocol) could possibly affect infectivity of SARS-CoV-2 Make sure S-OM cools slightly from 44°C before applying it to cell monolayer
    Plaques clustered around edges of wells Swirling the inoculum during the adsorption stage Use a rocking motion from front to back and side to side to distribute the inoculum evenly on the cell monolayer
    Large area of missing cells on monolayer Overlay medium or other reagents added quickly and directly on top of monolayer Add medium slowly and aim for edge of well
    Cells not confluent prior to start of assay Use a light microscope to check that cells are at least 95% confluence before starting assay
    “Shooting star” or smear-like appearance of plaques (Alternate Protocol) Liquid overlay disrupted during incubation Minimize movement of plates during incubation by leaving plates untouched throughout the incubation and reducing the number of times the incubator door is opened and closed.
    “Crescent moon” along edge of well Drying of cell monolayer (a) Leave ∼50-100 µl of liquid in each well when aspirating medium and DPBS (b) rock plates every 10-15 min during adsorption incubation (c) work in small batches of plates to prevent the monolayer from drying out between each aspiration and medium addition
    Large plaque-like spot Scratching of the monolayer by pipette tip during medium addition or removal Avoid making touching the monolayer with pipette tip by hovering above the well and aiming along the edges when adding medium. Minimize the force used when using a serological pipette tip to remove medium.
    Medium added directly to monolayer at high speed Aim medium along the edges at low speed

    Understanding Results

    Refer to Figure 3 for an example interpretation of a schematic 6-well SARS-CoV-2 plaque assay plate. In our laboratory, we have found that the titers of most of our SARS-CoV-2 stocks passaged in Vero E6 and titrated by plaque assays using Vero E6 range from 10 5 to 10 6 PFU/ml.

    Time Considerations

    The Basic Protocol and Alternate Protocol can both be completed in 5-7 days, including the time needed to seed plates for the plaque assay. However, if starting Vero E6 cells from cryostocks, it would be necessary to passage the cell line at least three times prior to use in either assay to remove excess cryopreservative and allow cells to return to normal growth, extending the duration by a few days this is not taken into account in the protocols. If plates are seeded as described in the protocols on a Monday, the plaque assay can begin on Tuesday and end with plaque enumeration on Friday. Using this schedule, the secondary overlay would be applied on Thursday for the Basic Protocol.

    Dankbetuigingen

    Development of this protocol was supported by the Public Health Agency of Canada. We thank Dr. Darwyn Kobasa, Dr. Amrit Boese, and Anders Leung for providing the SARS-CoV-2 stock, and for their constructive commentary (Public Health Agency of Canada). We would also like to thank Kristina Dimitrova (Public Health Agency of Canada) and Dr. Yohannes Berhane (Canadian Food Inspection Agency) for their constructive commentary regarding the optimization of the protocols.


    Bekijk de video: Nerdland maandoverzicht september 2021 (November 2021).