Informatie

Zou intraveneuze insuline + glucose de glycogeensynthese significant versnellen?


Zou een intraveneuze injectie van insuline + glucose resulteren in een aanzienlijk snellere aanvulling van uitgeputte glycogeenvoorraden dan een injectie van alleen glucose?

Dit is een strikt theoretische vraag en ik ben me bewust van de ernstige gevaren van intraveneuze insuline (Diabetes Spectrum). Het is om te helpen bij het schrijven van een verhaal waarin een snel herstel van uitputting nodig is.

Na zware inspanning, waarbij de glycogeenvoorraden zijn uitgeput, kan het glycogeen in ongeveer een dag volledig worden aangevuld door te consumeren koolhydraatrijke maaltijden (PubMed).

Volgens een studie, intraveneuze glucose stimuleert de glycogeensynthese, maar er wordt geen timing genoemd.

Zou insuline toevoegen aan glucose-injectie glycogeensynthese verder versnellen en voor hoeveel? Is er een minimale tijd nodig voor glycogeensynthese, ongeacht de hoeveelheid glucose en insuline die beschikbaar is?

De toegevoegde insuline zou waarschijnlijk de natuurlijke secretie van insuline door de pancreas remmen, dus is intraveneuze insuline-injectie zelfs zinvol?


De conclusie van dit PubMed-artikel uit 1991 is dat intraveneuze (of subcutane) insuline de glycogeensynthese mogelijk niet meer stimuleert dan natuurlijk uitgescheiden insuline.

Experimenten die bij de mens zijn uitgevoerd, hebben gesuggereerd dat insuline slechts een permissieve rol kan spelen bij de bepaling van de splanchnische glucoseopname. In een studie van DeFronzo et al. (5), waarbij de plasmaglucose- en insulinespiegels via perifere intraveneuze infusie werden verhoogd tot 223 mg/dl en 55 U/ml, respectievelijk was de netto splanchnische glucoseopname 1,0 mg/kg per minuut. De snelheid van glucoseopname veranderde niet merkbaar wanneer de arteriële insulinespiegel verder werd verhoogd tot 191 U/ml.

Dus bij een insulineniveau van 191 U/ml was er geen grotere glucoseopname door de lever dan bij 55 μU/ml en dus geen verdere stimulering van de glycogeensynthese.

Volgens Emedicine kunnen de insulinespiegels stijgen tot: 276 μU/ml 1 uur na toediening van glucose.

Wat betekent dat zelfs natuurlijk uitgescheiden insuline niveaus kan bereiken die de glycogeensynthese niet langer stimuleren en het heeft geen zin om insuline door injectie te geven om het te stimuleren.


heeft intraveneuze insuline-injectie zelfs zin?

Nee, het is om twee redenen niet logisch:

  1. Halfwaardetijd van insuline: Insuline heeft een halfwaardetijd in de orde van minuten. Aan de andere kant duurt het veel langer om de bloedglucose te verwijderen en om te zetten in glycogeen. Dit is de reden waarom mensen met type 1-diabetes subcutaan injecties met microkristallijne insuline krijgen om depots te vormen die in een langzamer tempo in de bloedbaan worden afgegeven.
  2. Het lichaam is in staat om op tijd zijn eigen insuline aan te maken: we zijn gewend aan grote stijgingen van de glucosespiegels en de alvleesklier reageert snel met de afscheiding van insuline. Je probeert dus een oplossing te vinden voor een probleem dat niet bestaat. Uiteraard verhoogt het injecteren van glucose in plaats van het eten van koolhydraten de bloedsuikerspiegel sneller. De processen stroomafwaarts van insulinemobilisatie nemen echter ook enige tijd in beslag. Dus als de intraveneus toegediende glucoseconcentratie te hoog is in afwezigheid van extra insuline, zal extra insuline het probleem niet oplossen (en het probleem kan de dood zijn).

UTP-glucose-1-fosfaat-uridylyltransferase

UTP-glucose-1-fosfaat-uridylyltransferase ook gekend als glucose-1-fosfaat-uridylyltransferase (of UDP-glucosepyrofosforylase) is een enzym dat betrokken is bij het koolhydraatmetabolisme. Het synthetiseert UDP-glucose uit glucose-1-fosfaat en UTP, d.w.z.

UTP-glucose-1-fosfaat-uridylyltransferase is een enzym dat in alle drie de domeinen (bacteriën, eukarya en archaea) wordt aangetroffen, aangezien het een sleutelrol speelt bij glycogenese en celwandsynthese. De rol ervan in het suikermetabolisme is uitgebreid bestudeerd in planten om de plantengroei te begrijpen en de landbouwproductie te verhogen. Onlangs is humaan UTP-glucose-1-fosfaat-uridylyltransferase bestudeerd en gekristalliseerd, wat een ander type regulatie aan het licht bracht dan andere eerder bestudeerde organismen. De betekenis ervan is afgeleid van de vele toepassingen van UDP-glucose, waaronder galactosemetabolisme, glycogeensynthese, glycoproteïnesynthese en glycolipidesynthese. [1] [2]


ONDERZOEKSONTWERP EN METHODEN

Generatie van MGSKO-muizen.

Lexicon Genetics (The Woodlands, TX), met behulp van hun OmniBank-bibliotheek van gen-gevangen embryonale stamcelklonen van muizen, gegenereerd GYS1 heterozygote muizen. In het kort, embryonale stamcellen (129/SvEvBrd) werden geïnfecteerd met de retrovirale genetrap-vector VICTR25, die stroomopwaarts van exon 12 van het GYS1-gen integreerde. Embryonale stamcellen met een normaal karyotype werden geïnjecteerd in C57/BL/6J-blastocysten en geïmplanteerd in pseudo-zwangere vrouwelijke muizen. Pups werden gekruist met C57/BL/6J-dieren en genverstoring werd bevestigd door Southern-analyse. We hebben deze dieren gedekt om te genereren GYS1-null-muizen (75% C57), aangeduid als MGSKO-muizen, zoals eerder beschreven (7). Muizen werden onder temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde omstandigheden gehouden met een 12-uur licht 12-uur donkere cyclus en mochten voedsel en water ad libitum in de American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care-goedgekeurde faciliteit aan de Indiana University. Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Indiana University School of Medicine Animal Care and Use Committee.

Vetrijke voeding.

Muizen van 40 dagen oud werden gedurende 16 weken op een vetrijk dieet geplaatst. Lichaamsgewicht en bloedspiegels van triglyceride, glucose en lactaat werden wekelijks of tweewekelijks gevolgd. Het vetrijke dieet (cat. nr. F3282 Bio-Serv, Frenchtown, NJ) was 16% eiwit, 59% vet en 25% koolhydraten met 5,286 kcal/g calorische equivalenten. De vetzuursamenstelling was 161 g/kg oliezuur, 89 g/kg palmitinezuur, 44 g/kg stearinezuur, 35 g/kg linolzuur, 11 g/kg cis-9-hexadecaanzuur, 5 g/kg myristinezuur en 4,7 g/kg cis-11-eicosenoic, met alle anderen bij ≤1,5 ​​g/kg. Het calorieprofiel van het standaarddieet (Teklad cat. nr. 7017 Harlan, Indianapolis, IN) was 22% eiwit, 11% vet en 60% koolhydraten met 3,41 kcal/g metaboliseerbare energie.

Voorbereiding van monsters voor biochemische analyses.

Muizen werden gedood door cervicale dislocatie of onthoofding. Spieren en lever werden snel uitgesneden, diepgevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C. Bevroren weefsel werd verpoederd en monsters werden gehomogeniseerd zoals eerder beschreven (8). Glycogeensynthase (9) werd bepaald in homogenaten door de opname van glucose uit UDP-[U-14C]glucose in glycogeen te volgen, zoals eerder beschreven (7). Het glycogeengehalte in weefsels werd bepaald door het meten van door amyloglucosidase afgegeven glucose uit glycogeen, zoals eerder beschreven door Suzuki et al. (8).

Western-blot-analyse.

Weefselhomogenaten werden onderworpen aan SDS-PAGE. Eiwitten werden overgebracht naar nitrocellulosemembranen (Millipore, Bedford, MA) die vervolgens werden geïncubeerd met de antilichamen tegen AMP-geactiveerde proteïnekinase (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), fosfo-AMP-kinase (AMPK) (Cell Signaling Technology), of fosfo-acetyl-CoA-carboxylase (celsignaleringstechnologie). Het secundaire antilichaam was een konijnen-anti-muis/mierikswortelperoxidase (Sigma, St. Louis, MO). Binding van het antilichaam werd gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Niveaus van eiwitexpressie werden gekwantificeerd door densitometrische scanning van autoradiogrammen.

Spierdoorsnede en kleuring.

De gastrocnemius van zowel MGSKO- als controlemuizen was ingebed in een 3: 1-oplossing van 20% sucrose in 0, 1 mmol / l Sorrenson's buffer: OCT Polyfreeze Media (Polysciences, Warrington, PA). Bevroren spierweefsel werd bij -20 ° C in cryosecties gesneden en drie secties werden achtereenvolgens ontdooid op SuperFrost-Plus-glaasjes (Fisher Scientific, Hampton, NH). Typering van spiervezels door myosine ATPase-kleuring (10) werd uitgevoerd op 12 μm dikke cryosecties. Minimaal drie secties per spier werden in tweevoud onderzocht en gefotografeerd met behulp van een Nikon Microphot-FXA fluorescentiemicroscoop gekoppeld aan een camera met een geladen gekoppeld apparaat en een beeldverwerkingssysteem (Scion Image 1.62c National Institutes of Health). Op alle onderzochte secties werden ten minste drie velden, bestaande uit >100 verschillende vezels, willekeurig geselecteerd en onderzocht.

Glucose tolerantie testen.

Muizen lieten gedurende 16 uur een nacht vasten, gevolgd door een intraperitoneale injectie van glucose (2 mg/g lichaamsgewicht). Bloedmonsters werden op de aangegeven tijden uit de staart verzameld en bloedglucose en lactaat werden gemeten met respectievelijk een DEX-glucometer (Bayer, Mishiwaka, IN) en Lactate Pro (Arkray, Kyoto, Japan). Seruminsulineniveaus werden gemeten met behulp van de Sensitive Rat Insulin radioimmunoassay-kit (Linco Research, St. Charles, MO) in bloedmonsters (15 l) genomen uit de staartader tijdens de glucosetolerantietest (GTT) zoals beschreven (11).

Euglycemische klem.

Vijf maanden oude, bij bewustzijn zijnde mannelijke muizen, na vasten van 08.00 uur tot 14.00 uur. , werden onderworpen aan de euglycemische-hyperinsulinemische techniek, zoals beschreven door Halseth et al. (12), aan de Vanderbilt University School of Medicine Mouse Metabolic Phenotyping Center. Insuline werd toegediend met een snelheid van 2,5 mE · kg -1 · min -1 , en glucose-infusie werd gereguleerd om euglycemie te handhaven. Na 2 uur werd de glucose-infusiesnelheid constant gehouden en werd een bolus [2-3H]deoxyglucose gegeven. Muizen werden 25 minuten na toediening van deoxyglucose gedood en vastus lateralis, soleus, gastrocnemius, diafragma, hart, vetweefsel en hersenen werden uitgesneden en snel ingevroren in vloeibare stikstof. Weefselspecifieke glucoseopname werd in deze weefsels bepaald zoals beschreven door Kraegen et al. (13).

Lichaamssamenstelling.

Na weefselverwijdering voor het beoordelen van weefselspecifieke glucoseopname, werden karkassen gevriesdroogd aan het University of Cincinnati Medical Center Mouse Metabolic Mouse Phenotyping Center en onderworpen aan petroleumetherextractie om de vet-, water- en vetvrije lichaamsmassa te bepalen (14).

Voedsel Consumptie.

Voedselconsumptie werd gedurende 7 dagen gemeten bij mannelijke MGSKO-mannetjes van 11 tot 12 maanden en wildtype muizen. Om 17.00 uur werd vooraf gewogen voedsel aan muizen gegeven. , en het resterende voedsel werd de volgende middag (17.00 uur) bepaald. De totale hoeveelheid voedsel die gedurende de 7 dagen werd geconsumeerd, werd gebruikt om de gemiddelde voedselconsumptie per dag voor elk dier te berekenen.

Bloedketonen en triglyceriden werden gevolgd met een BioScanner 2000 (Polymer Technology Systems, Indianapolis, IN). Het eiwitgehalte werd bepaald met de methode van Bradford (15) waarbij BSA als standaard werd gebruikt. Resultaten worden weergegeven als gemiddelden ± SE. Ongepaarde studenten t test werd gebruikt om de statistische significantie te bepalen.


Receptor-isovorm-selectieve insuline-analogen geven weefselpreferentiële effecten

De relatieve expressiepatronen van de twee IR (insulinereceptor) isovormen, +/- exon 11 (respectievelijk IR-B/IR-A), zijn weefselafhankelijk. Daarom hebben we insuline-analogen ontwikkeld met verschillende bindingsaffiniteiten voor de twee isovormen om te testen of weefselpreferentiële biologische effecten kunnen worden bereikt. Bij ratten en muizen is IR-B de meest prominente isovorm in de lever (> 95%) en vet (> 90%), terwijl in spieren IR-A de dominante isovorm is (> 95%). Als gevolg daarvan had de insuline-analoog INS-A, die een hogere relatieve affiniteit heeft voor humaan IR-A, een hogere relatieve potentie [vergeleken met HI (humane insuline)] voor de glycogeensynthese in spierstrips van ratten (26%) dan voor glycogeenaccumulatie in rattenhepatocyten (5%) en voor lipogenese in rattenadipocyten (4%). Daarentegen had de INS-B-analoog, die een verhoogde affiniteit heeft voor humaan IR-B, hogere relatieve potenties (vergeleken met HI) voor het induceren van glycogeenaccumulatie (75%) en lipogenese (130%) dan voor het aantasten van spieren (45% ). Voor hetzelfde bloedglucoseverlagende effect bij acute intraveneuze toediening van muizen, gaf INS-B een significant hogere mate van IR-fosforylering in de lever dan HI. Deze in vitro en in vivo resultaten geven aan dat insuline-analogen met IR-isovorm-preferentiële bindingsaffiniteit in staat zijn om weefselselectieve biologische reacties op te wekken, afhankelijk van IR-A/IR-B-expressie.


CHO-inname via de voeding en synthese van spierglycogeen

Onder de meeste omstandigheden vertegenwoordigt CHO via de voeding het belangrijkste substraat voor spierglycogeensynthese, waarbij factoren zoals de hoeveelheid, timing en type CHO-inname de snelheid van spierglycogeenopslag aanzienlijk beïnvloeden.

Hoeveelheid CHO-inname.

Door het synthetiseren van gegevens uit een reeks onderzoeken die de glycogeenopslag gedurende 24 uur na door inspanning geïnduceerde uitputting hebben gevolgd, waaronder twee dosis-responsonderzoeken (19, 28), lijkt er een "glycogeenopslagdrempel" op te treden bij een dagelijkse CHO-inname van

7-10 g/kg lichaamsgewicht (24). Specifieke aandacht is gericht op de vroege (0-4 uur) herstelfase vanwege de iets hogere spierglycogeensynthese gedurende deze tijd, evenals de praktische problemen van de meerdaagse trainingsprogramma's die door atleten worden ondernomen. In de eerste richtlijnen werd aanbevolen dat atleten 50 g (

1 g/kg lichaamsgewicht) CHO elke 2 uur tijdens de vroege herstelperiode, gebaseerd op waarnemingen van vergelijkbare snelheden van glycogeenopslag na inspanning na CHO-inname van 0,7 en 1,4 g/kg lichaamsgewicht (15), of 1,5 g en 3,0 g/kg lichaamsgewicht (48) met dergelijke tussenpozen. Recenter werk (33, 82, 109, 111) heeft echter 30-50% hogere glycogeensynthesesnelheid (10-11 mmol·kg nat gew −1 ·h −1) gerapporteerd gedurende de eerste 4 uur van herstel met grotere CHO-inname (bijv. >1 g·kg −1 ·h −1 ), tenminste wanneer CHO wordt geconsumeerd als herhaalde kleine voedingen. Dus, wanneer onmiddellijk na het sporten tanken een prioriteit is, bevorderen de huidige richtlijnen grotere innames van CHO in patronen van frequente consumptie.

Timing van CHO-inname.

Het populaire concept van een "window of opportunity" voor tanken na de training werd gecreëerd door een goed gepubliceerde studie (47) die rapporteerde dat onmiddellijke inname van CHO na langdurige inspanning resulteerde in een hogere glycogeenopslag (7,7 mmol·kg nat wt −1 ·h −1 ) tijdens de eerste 2 uur van herstel dan wanneer dezelfde voeding werd uitgesteld na 2 uur (

4,4 mmol·kg nat gew. −1 ·h −1). Hoewel deze gegevens een effectievere glycogeensynthese laten zien tijdens vroeg herstel na inspanning, was de belangrijkste bevinding van die studie dat de glycogeensynthesesnelheid erg laag bleef totdat CHO-voeding werd gestart. Daarom moet de onmiddellijke levering van CHO aan de spiercel worden gezien als een strategie om effectief bij te tanken in plaats van eenvoudigweg te profiteren van een periode van matig verbeterde glycogeensynthese. Dit is van belang wanneer er slechts 4–8 uur herstel is tussen trainingssessies, maar een langere hersteltijd (>8 uur) (78) kan een vertraging in de eerste voeding compenseren. De negatieve feedbacklus van glycogeenconcentraties op zijn eigen synthese (116) kan inderdaad bijdragen aan de vereffening van het spierglycogeengehalte in de tijd.

De frequentie van inname van de aanbevolen hoeveelheden CHO (bijv. grote maaltijden versus een reeks snacks) heeft geen invloed op de glycogeenopslag bij herstel op de langere termijn, ondanks duidelijke verschillen in bloedglucose- en insulineresponsen (21, 28). Dit is duidelijk in tegenspraak met de waarnemingen van hogere snelheden van spierglycogeensynthese tijdens de eerste 4-6 uur van herstel wanneer grote hoeveelheden CHO worden toegediend met intervallen van 15 tot 30 minuten (51, 109, 111). Een theorie om deze "paradox" te verklaren, is dat het handhaven van de bloedglucose- en insulineprofielen het belangrijkst is tijdens de eerste uren van herstel en misschien wanneer de totale CHO-inname suboptimaal is. Tijdens langere perioden van herstel, of wanneer de totale CHO-inname boven deze "drempel" ligt, bieden manipulaties van plasmasubstraten en hormonen binnen fysiologische marges echter geen extra voordeel.

Type CHO-inname.

Vroege onderzoeken naar voeding met één enkele voedingsstof toonden aan dat glucose en sucrose effectiever waren dan fructose bij het herstellen van spierglycogeen na inspanning (15). Dit bevestigde de hypothese dat glycogeensynthese effectiever is met CHO-bronnen in de voeding die hogere bloedglucose- en insulineresponsen opwekken. De resultaten van de eerste onderzoeken naar van voedsel afgeleide CHO waren echter inconsistent (28, 88) vanwege het misbruik van de structurele classificatie van "eenvoudig" of "complex" om de glykemische impact van CHO-rijk voedsel te voorspellen. Het daaropvolgende gebruik van gepubliceerde voedingsmiddelen met een glycemische index (GI) om diëten na het sporten te construeren, toonde aan dat de glycogeenopslag gedurende 24 uur van herstel was toegenomen met een CHO-rijke maaltijd op basis van voedingsmiddelen met een hoge GI in vergelijking met een identieke hoeveelheid CHO die werd gegeten in de vorm van voedsel met een lage GI (22). Echter, de omvang van de toename in glycogeenopslag (

30%) was aanzienlijk groter dan het verschil in 24-uurs bloedglucose- en insulineprofielen, vooral omdat de maaltijd onmiddellijk na de training een grote glycemische en insulinemische respons produceerde, onafhankelijk van de GI van de geconsumeerde CHO. Andere onderzoeken hebben een grotere afgifte van glucose in de darmen en een grotere glucoseafgifte door de lever bevestigd als reactie op maaltijden onmiddellijk na de inspanning, wat een toename van de spierglucoseopname en glycogeenopslag bevordert (91). De malabsorptie van sommige CHO-rijke voedingsmiddelen met een zeer lage GI werd gepostuleerd om rekening te houden met minder efficiënte glycogeenopslag door de effectieve hoeveelheid geconsumeerde CHO te verminderen. Dit wordt ondersteund door waarnemingen van lagere glycogeenopslag na inspanning van een slecht verteerbaar hoog-amylosezetmeelmengsel vergeleken met inname van glucose, maltodextrines en een hoog amylopectinezetmeel (53). Ten slotte bleek een drankje met een speciaal glucosepolymeer met een hoog molecuulgewicht en een lage osmolariteit de glycogeensynthese in de eerste 2 uur van herstel te verbeteren, hoewel dit effect daarna verdween (82). Dit voordeel werd toegeschreven aan een snellere maaglediging (58) en kan wijzen op de voordelen van voedsel dat snel wordt verteerd en geleegd wanneer sneller glycogeenherstel nodig is. Desalniettemin is in andere onderzoeken gevonden dat vaste en vloeibare vormen van CHO-rijk voedsel even effectief zijn in het leveren van substraat voor spierglycogeensynthese gedurende 2-24 uur (55, 84). Een directe vergelijking met intraveneuze toediening van gelijke concentraties glucose in één onderzoek toonde inderdaad aan dat maaglediging van voedsel/drank niet het snelheidsbeperkende proces was voor de glycogeensynthese. Een afzonderlijke studie, die aantoonde dat intraveneuze afgifte van suprafysiologische concentraties van glucose en insuline de snelheid van glycogeensynthese na inspanning gedurende 8 uur kan verhogen tot niveaus die worden bereikt door glycogeensupercompensatieprotocollen (37), is grotendeels alleen van theoretisch belang omdat het gebruik ervan in strijd is met de antidopingregels in sport.


Zwangerschapsverlies komt vaak voor tijdens de peri-implantatieperiode bij zoogdieren, wanneer glucose nodig is voor zowel embryonale ontwikkeling als decidualisatie van het endometrium. Omdat de baarmoeder geen glucose kan synthetiseren, moet alle glucose direct uit de maternale circulatie komen als dat nodig is of tijdelijk worden opgeslagen als het macromolecuul-glycogeen. Glycogeen fungeert als een glucosereservoir en slaat tot 55.000 glucose-eenheden per molecuul op. Endometriumglycogeenconcentraties zijn gecorreleerd met vruchtbaarheid bij mensen, wat aangeeft dat glycogeen een essentiële bron van glucose is tijdens de vroege zwangerschap. Bij mensen en primaten pieken endometriumglycogeenconcentraties tijdens de luteale fase als gevolg van progesteron. Daarentegen veroorzaakt estradiol bij ratten en nertsen een accumulatie van baarmoederglycogeen tijdens pro-oestrus en oestrus. Bij gepaarde ratten neemt het glycogeengehalte van het endometrium na implantatie weer toe vanwege de hoge glycogeenspiegels die in de decidua zijn opgeslagen. Bij nerts zijn endometriale glycogeenreserves gelokaliseerd in het baarmoederepitheel bij de oestrus. Deze reserves worden vóór implantatie gemobiliseerd, wat suggereert dat ze worden gebruikt om de embryonale groei te ondersteunen. Baarmoederglycogeenconcentraties blijven dalen na implantatie in nertsen, waarschijnlijk door een gebrek aan decidualisatie. Hoe ovariële steroïden de glycogenese in het endometrium stimuleren is onduidelijk, maar het huidige bewijs suggereert dat estradiol/progesteron interageert met insuline of insuline-achtige groeifactorsignalering. Samenvattend is endometriumglycogeen een essentiële bron van glucose tijdens de peri-implantatieperiode. Er is meer werk nodig om de verschillen tussen soorten te karakteriseren, het lot van de glucose die vrijkomt uit glycogeen op te helderen en te begrijpen hoe ovariële steroïden het glycogeenmetabolisme in de baarmoeder reguleren.

Bij eutherische zoogdieren gaan de meeste embryo's tijdens de vroege zwangerschap verloren. Op basis van hCG-niveaus in urine gaat 30-40% van de zwangerschappen bij mensen verloren, de meeste vóór klinische diagnose [1-3]. Hoewel het aantal zwangerschappen dat verloren gaat voordat hCG detecteerbaar wordt onbekend is, wordt het totale zwangerschapsverlies bij mensen geschat op meer dan 50% [4]. Bij vee variëren de schattingen van zwangerschapsverlies van 35 tot 50%, waarbij de meeste zich voordoen tijdens de vroege embryonale periode (besproken in [ 5]). Falen in het begin van de zwangerschap kan om verschillende redenen optreden, b.v. chromosomale defecten in het embryo, onjuiste afscheiding of werking van maternale hormonen, of onjuiste voedingsondersteuning van de embryo's of baarmoeder. Het identificeren van redenen voor deze verliezen is van vitaal belang om zwangerschapsverliezen in de veehouderij en de menselijke geneeskunde tot een minimum te beperken.

Embryo's hebben een smal bereik van glucoseconcentraties nodig

Van de voedingsstoffen die uit de maternale circulatie worden gehaald en door de baarmoeder worden gebruikt of in het baarmoederlumen worden uitgescheiden, is glucose het meest bestudeerd. Vroege studies naar embryocultuur gebruikten zoutoplossing aangevuld met eiwit en dooier [6]. In 1956 werden zoutoplossingen aangevuld met specifieke voedingsstoffen, waaronder glucose [7]. In de decennia daarna is er veel onderzoek gedaan naar de effecten van glucose op de embryonale ontwikkeling. Het optimaliseren van de glucoseconcentratie voor embryocultuur was echter moeilijk vanwege de interacties tussen glucose en andere voedingsstoffen in de media (besproken in [8]). Voor deze review is het voldoende om te benadrukken dat de aanwezigheid en concentraties van andere voedingsstoffen in de media de waargenomen effecten van glucose kunnen veranderen.

Van de zygote tot de morula-fase nemen embryo's heel weinig glucose op, en zijn ze voornamelijk afhankelijk van lactaat en pyruvaat voor energie [9, 10]. Dat gezegd hebbende, zijn kleine hoeveelheden glucose nodig om embryo's blastocysten te laten worden. Zygoten gekweekt zonder glucose degenereerden voordat ze blastocysten werden. Interessant is dat 64% van de embryo's die zijn verzameld in het tweecellige stadium (daardoor blootgesteld aan meer glucose in vivo) en vervolgens gekweekt zonder extra glucose, blastocysten worden [11]. Blootstelling van muizenembryo's aan een hoge concentratie glucose (27 mM) gedurende 1 minuut in het viercellige stadium zorgde ervoor dat 75% het blastocyststadium bereikte [12]. Door gebruik te maken van continue blootstelling aan verschillende glucoseconcentraties, hebben meerdere onderzoeken aangetoond dat concentraties van slechts 0,2 mM de maximale ontwikkeling naar het blastocyststadium in zowel muis als vee ondersteunen [13, 14]. Het is dus duidelijk dat pre-compactie-embryo's wat glucose nodig hebben om de groei te behouden.

Lane en Gardner [15] ontdekten dat de opname van aminozuren de glycolytische activiteit verminderde en de oxidatie van pyruvaat in in vitro gekweekte embryo's verhoogde. Interessant is dat de toevoeging van aminozuren de snelheid van beide processen terugbracht naar de niveaus die werden waargenomen in in vivo gekweekte embryo's. Media die glucose, glutamine of beide voedingsstoffen bevatten, waren allemaal even goed in staat om de ontwikkeling van varkensembryo's te ondersteunen [16]. Deze resultaten geven aan dat bij het bestuderen van glucose rekening moet worden gehouden met de aanwezigheid en concentraties van andere voedingsstoffen en dat het gebruik van meer fysiologische kweekmedia de embryo-ontwikkeling kan verbeteren.

Glucose en glucosamine kunnen beide worden gemetaboliseerd via de biosynthetische route van hexosamine, die substraten levert voor eiwitglycosylering. Bij muizen waren glucosamine en glucose even goed in staat om de ontwikkeling van embryo's naar het blastocyststadium te ondersteunen [17]. Remming van de biosyntheseroute van hexosamine in aanwezigheid van glucose resulteert in de afbraak van embryo's. Glucosamine (dat stroomafwaarts van de gebruikte remmer in de biosynthese van hexosamine terechtkomt) verhinderde dit effect [17]. Ter ondersteuning van een grotere rol voor glycoproteïnen naarmate het embryo zich ontwikkelt, is er een dramatische toename van glycoproteïnen op het embryo-oppervlak in het blastocyststadium [18]. Deze resultaten geven aan dat de glucose die nodig is voor verdichting nodig is om substraten te leveren voor de hexosamine-biosyntheseroute en daaropvolgende eiwitglycosylering.

Hoewel er wat glucose nodig is voor pre-implantatie-embryo-overleving, is te veel glucose embryotoxisch. Hoge concentraties glucose (24-52 mM) vertraagden de ontwikkeling van muizenembryo's ten opzichte van 6,1 mM. [ 19]. Evenzo verminderde 15-25 mM glucose het uitkomen en verhoogde apoptose in muizenembryo's [13]. Embryo's gekweekt in 28 mM glucose resulteerden in minder levendgeborenen na overdracht in het blastocyststadium vergeleken met embryo's gekweekt in 0,2 mM [20]. Zelfs een concentratie die meer lijkt op de serumconcentratie kan negatieve, zij het subtielere, effecten hebben op de embryonale ontwikkeling. Fraser et al. [13] toonde aan dat 5,5 mM glucose het aantal cellen per embryo bij muizen verminderde. Bij runderen verminderde 5 mM glucose het percentage embryo's dat het blastocyststadium bereikte [14], en 4 mM glucose scheef de geslachtsverhouding in de richting van mannen [21]. Pantaleon et al. vond dat gedeeltelijke remming van de biosyntheseroute van hexosamine de O-gebonden eiwitglycosylatie en embryonale dood als gevolg van hyperglykemie verminderde [22]. Glucoseconcentraties moeten dus binnen een nauw bereik worden gehouden om de embryo-ontwikkeling te optimaliseren. Te veel of te weinig glucose, en dus te veel of te weinig eiwitglycosylering, belemmert de ontwikkeling ernstig.

In kweek neemt de glucoseopname dramatisch toe naarmate het embryo het blastocyststadium nadert [9, 10], en in vivo verhoogt activering van embryo's in diapauze de glucoseopname [23, 24]. Glucoseopname en -metabolisme zijn moeilijk toegankelijk tegen het moment van implantatie, maar de processen van verlenging (bij herkauwers), hechting en implantatie vereisen waarschijnlijk grote hoeveelheden van glucose afgeleid ATP. De toename van de glucoseopname in blastocysten valt samen met een afname van de zuurstofspanning die wordt waargenomen in het lumen van de baarmoeder van ratten, konijnen en resusapen [25, 26]. Boviene blastocysten zijn relatief ongevoelig voor remmers van oxidatieve fosforylering, waarbij 86% van ATP afkomstig is van glycolyse [27]. Er wordt dus gedacht dat embryo's overschakelen naar Warburg-metabolisme in het blastocyststadium, sterk afhankelijk zijn van glycolyse om ATP te leveren en het resulterende pyruvaat en lactaat gebruiken in routes die nodig zijn voor celproliferatie [28-30].

Endometriale decidualisatie vereist glucose

Glucose is ook van cruciaal belang voor de decidualisatie van het endometrium. In kweek is ten minste 2,5 mM glucose vereist voor maximale decidualisatie van endometriumstromacellen, zoals gemeten met Prp en Prl uitdrukking. Slc2a1 (GLUT1) was de meest tot expressie gebrachte glucosetransporter in gekweekte endometriale stromale cellen, en knockdown van Slc2a1 verminderde decidualisatie [31]. In overeenstemming, decidualisatie resulteert in verhoogde expressie van Slc2a1 en een overeenkomstige toename van de glucoseopname in vivo [32]. Wereldwijde knock-out van Slc2a8 (GLUT8) verminderde worpgrootte, veranderde ovariële energiestofwisseling en verminderde decidualisatie van de baarmoeder, maar had geen invloed op de glucosehomeostase van het hele lichaam [33]. Eierstoktransplantatie-experimenten gaven aan dat de worpgrootte was verminderd als gevolg van zowel stoornissen van de eierstok/eicel als de baarmoeder.

Nadat de fibroblasten in de baarmoeder zijn binnengedrongen, wordt glucose via meerdere wegen in de baarmoeder gemetaboliseerd om decidualisatie te ondersteunen. Het Warburg-metabolisme is bijvoorbeeld verhoogd in decidua van muis, waardoor ATP en lactaat worden geleverd om celproliferatie te bevorderen [34]. Remming van het glucosemetabolisme via de pentosefosfaatroute met glucosamine of dehydroepiandrosteron verslechtert ook de decidualisatie bij muizen, wat resulteert in kleinere nesten [35, 36].

Bij vrouwen wordt obesitas geassocieerd met veranderingen in de micro-omgeving van het endometrium [37], en het is algemeen bekend dat diabetes de decidualisatie van het endometrium verslechtert in knaagdiermodellen [38, 39]. Hoge concentraties glucose (tot 17,5 mM) verminderden echter niet de decidualisatie van humane endometrium-stromacellen in kweek [31], wat aangeeft dat het effect van diabetes niet te wijten is aan directe effecten van hyperglykemie op uteriene fibroblasten of dat langdurige blootstelling aan hoge glucoseconcentraties. Gezamenlijk laten deze onderzoeken zien dat glucose ook ongeveer moet worden gereguleerd in endometriumcellen om een ​​goede decidualisatie van de baarmoeder te ondersteunen.

Glucoseconcentraties in het lumen van de reproductieve tact

Het hoge niveau van lactaatmetabolisme en minimale glucosemetabolisme in het vroege embryo wordt weerspiegeld in de concentraties van lactaat en glucose in de vloeistoffen van het voortplantingsstelsel. De lactaatconcentraties gerapporteerd in het oviductale en uteriene lumen van verschillende soorten variëren tussen 3 en 10 mM, wat veel hoger is dan serumconcentraties (0,6-2 mM) [40-42]. Daarentegen zijn de glucoseconcentraties in het lumen van het voortplantingsstelsel consequent lager dan de serumconcentraties. Bij muizen is gemeld dat serumconcentraties 6-9 mM zijn, terwijl glucoseconcentraties in de eileider 1-5 mM en 0,6 mM in het baarmoederlumen waren [40, 43]. Interessant is dat beide studies bij muizen een lagere glucoseconcentratie in de eileider vonden wanneer een cumulus-eicelcomplex aanwezig was. Bij mensen waren de glucoseconcentraties in de eileider tussen 0,5 en 3,1 mM, afhankelijk van de dag van de cyclus, en de concentratie in de baarmoeder was 3,1 mM ongeacht de dag [42], vergeleken met de gevestigde concentratie van 5,5 mM in menselijk serum. Bij runderen waren de glucoseconcentraties in het plasma tussen 6 en 7 mM, de concentraties in de eileider waren 1-3 mM en de concentraties in de baarmoedervloeistof waren 3-4 mM [41]. En bij schapen varieerde de glucoseconcentratie in het baarmoederlumen tussen 0,05 en 0,23 mM [44], terwijl de serumconcentraties varieerden van 4 tot 5 mM [45]. Deze resultaten geven aan dat de concentraties van energiesubstraten in het lumen van het voortplantingsstelsel actief worden gereguleerd en niet het gevolg zijn van passieve diffusie uit serum.

Men zou kunnen verwachten dat de glucoseconcentraties in het lumen van de baarmoeder hoger zijn dan in de eileider, gezien de hogere hoeveelheden glucose die door de blastocysten worden gebruikt in vergelijking met embryo's in een vroeg stadium. Bij runderen, Hugentobler et al. [41] rapporteerde glucoseconcentraties van 1,8-3,1 mM in de eileider en 3,7-4,5 mM in het baarmoederlumen. Bij mensen varieerden de glucoseconcentraties in de eileider van 0,5 tot 3,1 mM, terwijl de concentraties in het lumen van de baarmoeder constant 3,15 mM waren [42]. These observations have led to the suggestion that embryos developed for human in vitro fertilization should be grown in sequential media that better reflects the changing environment they would be exposed to in vivo [ 46]. However, it should be noted that one study to report glucose concentrations from both locations in mice found higher concentration in the oviduct (1.1–1.6 mM) than in the uterus (0.61 mM) [ 40] and that some evidence has accumulated that two-step culture systems do not improve embryo or fetal development [ 47].

In vitro concentrations of glucose that approximate serum concentrations (5–6 mM) negatively impact embryo development [ 13, 14, 21], raising the possibility that too much glucose may result in impaired embryo development in vivo. In support of this contention, diabetic patients have higher glucose concentrations in amniotic fluid and are at a greater risk of pregnancy loss [ 48, 49], though the effect of diabetes on glucose concentrations in the luminal fluid has not been reported. Even in healthy nondiabetic patients, higher serum glucose concentrations are associated with a higher risk of pregnancy loss [ 50]. Similarly, cows with morphologically abnormal embryos on day 7 had twofold higher glucose concentrations in uterine flushings [ 51]. A recent study in dairy cows found that intravenous infusion of glucose from days 7–14 of pregnancy impaired embryo develop [ 52]. Highlighting the relationship between glucose regulation and fertility, several genes involved in glucose uptake/metabolism have been shown to affect fertility in murine knockout models (Table 1). Hence, the reproductive tract must not only maintain glucose concentrations within a narrow range, the optimal concentration of glucose changes in both a temporal and spatial manner as the embryo moves into the uterus.

Summary of genes related to glucose metabolism that have been knocked out in mice and the resulting phenotype relative to female fertility.


Sodium metavanadate treatment improves glycogen levels in multiple tissues in a model of metabolic syndrome caused by chronic cadmium exposure in Wistar rats

Cadmium, one of the more hazardous environmental contaminants, has been proposed as a metabolic disruptor. Vanadium has emerged as a possible treatment for metabolic diseases. Both metals are important in public health. We aimed to investigate whether vanadium treatment is effective against metabolic disturbances caused by chronic exposure to the lowest-observable adverse effect level of cadmium. Male Wistar rats were exposed to cadmium (32.5 ppm) in drinking water for 3 months. Metabolic complications such as overweight, visceral adipose gain, hyperglycemia, impaired glucose tolerance, and dyslipidemia were detected, and low glycogen levels and steatosis were observed in the tissues. Then, the control and treated animals were subdivided and treated with a solution of 5 μM NaVO3/kg/twice a week for 2 months. The control-NaVO3 group did not show zoometric or metabolic changes. A strong interaction of NaVO3 treatment over cadmium metabolic disruption was observed. The vanadium accumulation diminished cadmium concentration in tissues. Also, vanadium interaction improved glucose homeostasis. The major effect was observed on glycogen synthesis, which was fully recovered in all tissues analyzed. Additionally, vanadium treatment prevented overweight and visceral fat accumulation, improving BMI and the percentage of fat. However, NaVO3 treatment did not have an effect on dyslipidemia or steatosis. In conclusion, this work shows that vanadium administration has a strong effect against metabolic disturbances caused by chronic cadmium exposure, observing powerful interaction on glucose homeostasis.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Abstract

Acquired resistance to the action of insulin to stimulate glucose transport in skeletal muscle is associated with obesity and promotes the development of type 2 diabetes. In skeletal muscle, insulin resistance can result from high levels of circulating fatty acids that disrupt insulin signalling pathways. However, the severity of insulin resistance varies greatly among obese people. Here we postulate that this variability might reflect differences in levels of lipid-droplet proteins that promote the sequestration of fatty acids within adipocytes in the form of triglycerides, thereby lowering exposure of skeletal muscle to the inhibitory effects of fatty acids.


Conclusie

Previous research has successfully identified a large number of different GLUT isoforms in the liver, skeletal muscle, and adipose tissue (Fig. 1). However, the high degree of substrate variability, complex expressional regulation, and activity patterns of the distinct isoforms indicates that there is much more to unravel. In particular, the influence of different lifestyle factors such as high-fructose diets and exercise on GLUT function in energy metabolism may present a fascinating research area also in the future. GLUT4 remains to be the workhorse for the insulin-regulated glucose transport in adipose cells and for insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in skeletal muscle. Numerous studies have established the view that impaired GLUT4 translocation is a critical contributor in the etiology of insulin resistance and type 2 diabetes. The mechanistic framework for this process is exceedingly complex and will likely be a hot topic for years to come. Nevertheless, in addition to GLUT4, other non-classical GLUTs such as GLUT12 may also play roles in fine-tuning glucose uptake and substrate metabolism in insulin-sensitive tissues in response to different physiological cues and/or increased energy demand (Fig. 2, Table 1). Furthermore, other GLUTs such as GLUT8 may provide inducible glucose transport capacity during different stages in cellular development and thus could contribute to the development of insulin resistance at early stages of life. Despite their annotation, several glucose transporters such as GLUT6, GLUT10, and GLUT11 may not be relevant for hexose transport at all, as exemplified by the uric acid transporter GLUT9. Understanding the complex relationship of these metabolic networks and organ crosstalk will represent a fundamental component in the challenge to oppose metabolic diseases.


DISCUSSIE

GSK-3 was first identified as a protein kinase that phosphorylated GS (Embi et al., 1980) but is now known to act at the core of many signalling pathways and is a master regulator of cell growth and death with wide-ranging effects in all cells and organs, including a key role in Xenopus embryonic development (Green, 2004). In its role in the control of glycogen metabolism, phosphorylation of GS by GSK-3 is inhibitory, thereby inactivating GS and halting glycogenesis (Rylatt et al., 1980 Grekinis et al., 1995). Akt was later shown to be a prominent kinase responsible for the insulin-induced inhibition of GSK-3 by phosphorylating it at Ser9 (Cross et al., 1995). With GSK-3 inhibited, protein substrates including GS could be dephosphorylated and activated by protein phosphatases. This mechanism is integral to the insulin-induced activation of glycogen synthesis and other pathways, such as protein synthesis (Ingebritsen and Cohen, 1983 Parker et al., 1983 Ali et al., 2001). In the absence of insulin and other stimuli, GSK-3 is constitutively active (Cohen and Frame, 2001 Doble and Woodget, 2003) and free to phosphorylate its downstream targets, maintaining GS in an inactive state and glucose in a free, non-polymerized form.

Mammalian GSK-3 is encoded by two highly homologous genes GSK-3α has a mass of 51 kDa and GSK-3β encodes a protein of 47 kDa (Doble and Woodgett, 2003). The difference in size is due to a glycine-rich extension in the amino terminus of GSK-3α this size difference is significant enough that the isozymes resolve separately under typical electrophoretic conditions. Our study used an anti-GSK3α/β antibody which was raised against full-length (420 amino acids) GSK-3β of Xenopus (anuran) origin, but has been shown to cross-react with both mammalian isozymes (α and β) indeed, GSK-3 isoforms from species as distant as flies and humans show over 90% homology within the kinase domain (Ali et al., 2001). However, this antibody detected only a single dense band of GSK-3 in all wood frog tissues tested, suggesting that only a single isoform is present. Similarly, in lysates of A6 cells (a cell line derived from epithelial cells of Xenopus kidney) this antibody, which was raised against an antigen from Xenopus, again cross-reacted with only a single band (Santa Cruz Biotechnology datasheet http://www.scbt.com/datasheet-7291-gsk-3alpha-beta-0011-a-antibody.html). In support of this, a GenBank search for GSK-3 in Xenopus laevis (whose genome is fully sequenced) found only a β isozyme (NCBI accession NP_001083752) furthermore, embryology studies using Xenopus as a model only discuss a β isozyme (Dominguez et al., 1995 Green 2004). Hence, no literature is available to support the existence of more than one GSK-3 isozyme in any anuran species. Therefore, the accumulated evidence indicates that the anti-GSK3α/β antibody detected only GSK-3β in wood frog tissues, and strongly supports the contention that a GSK-3α is not present.

GSK-3 protein levels did not change significantly during freezing, with the exception of the heart, which showed significantly reduced GSK-3 protein. Maintenance of GSK-3 at fairly constant levels during freezing exposure has two implications: (i) the enzyme is always present to respond when needed, and (ii) any regulation of its kinetic parameters (activity, substrate affinity) is likely to be derived from post-translational controls. Indeed, the amount of phospho-GSK-3 (Ser9) was significantly reduced in all five tested tissues of frozen frogs. As the amount of phosphorylated enzyme decreased during freezing, this implies that GSK-3 was activated in liver, kidney, muscle and brain. The situation in heart is complicated by the concomitant decrease in both total and phospho-GSK-3. However, total GSK-3 was reduced by ∼42% in heart, whereas the phospho-GSK-3 content was more strongly reduced by ∼73%. Overall, this could suggest a higher relative amount of dephosphorylated, active enzyme. Thus, GSK-3 phosphorylation state appears to be globally reduced in frozen frogs, implying a more active GSK-3 in tissues during freezing. A more active GSK-3 in frozen frogs correlates well with a previous study of wood frog liver GS activity showing that GS was strongly suppressed during freezing (a decrease from 34% to 8% activity), following an inverse pattern to that of GP, which was strongly activated to support glucose synthesis (Russell and Storey, 1995).

Analysis of the enzymatic properties of wood frog skeletal muscle GSK-3 showed that alternative mechanisms for controlling the activity of the enzyme also exist, including effects of temperature and glucose. For example, when assayed at 22°C, high glucose decreased GSK-3 substrate affinity (Km rose). Typically, a high glucose load must be catabolized or converted into glycogen for storage, and thus it is not surprising that high glucose or other glucose-derived metabolites decrease GSK-3 substrate affinity, an effect that would, in turn, help to keep GS active (Markuns et al., 1999 Halse et al., 2001). Notably, high G6P (the product of glucose phosphorylation by hexokinase) is also an allosteric activator of GS, so glucose and glucose derivatives affect GSK-3 and GS in a coordinated manner. However, at 4°C, the negative effect of high glucose on the affinity of control GSK-3 for its substrate peptide was no longer seen and the Km value was the same in the absence or presence of high glucose. By contrast, high glucose effects on GSK-3 kinetics in muscle extracts from frozen frogs resulted in increased substrate affinity at 22°C, in contrast to the decreased affinity of the enzyme from control frogs. This could potentially increase phosphorylation of GSK-3 targets, including GS. However, a low temperature assay of the enzyme from frozen frogs reversed these effects of all conditions tested, GSK-3 from frozen frogs assayed at 4°C without glucose exhibited the highest substrate affinity of all, which correlates with the increased amount of dephosphorylated active GSK-3 in this state (Fig. 3) and could lead to the greatest inactivation of GS. This is a particularly relevant finding as, traditionally, we would have expected that GSK-3 Vmax would increase in frozen frogs as a result of dephosphorylation-dependent activation surprisingly, we did not observe a significant Vmax increase in frozen frogs when assaying GSK-3 at 22°C or at 4°C. Thus, in frog muscle, the ‘activation’ of GSK-3 by dephosphorylation may instead manifest itself as a stronger substrate affinity, and one that is only detected by assaying at lower temperatures close to environmental temperatures encountered by frozen frogs. Interestingly, the addition of high glucose at low temperature reduced GSK-3 substrate affinity to a level similar to that observed at 4°C in control frogs.

Several metabolites that change in wood frog tissues during freezing also affected GSK-3 activity as assessed with the muscle enzyme from control frogs. Both AMP and PEP were allosteric activators and increased GSK-3 activity. AMP, the end-product of ATP hydrolysis, is particularly interesting. AMP is well known to act as an intracellular allosteric activator of glycogen phosphorylase and high AMP under low energy conditions helps to trigger glycogen hydrolysis. AMP allosteric activation of GSK-3 would further favour a net catabolic state of glycogen metabolism by promoting increased phosphorylation of GS and thereby inhibiting glycogen synthesis under metabolic situations where AMP is elevated. Notably, elevated AMP also activates the AMP-activated protein kinase (AMPK), which, in turn, triggers multiple other events that increase catabolism and decrease anabolism under energy stress conditions (Rider et al., 2006). Opmerkelijk, Keen values for AMP of GSK-3 (0.21–0.42 mmol l –1 ) were similar to in vivo AMP concentrations in wood frog muscle (0.11–0.15 μmol g –1 wet mass) (Storey, 1987a), indicating that changing AMP concentration could be a significant physiological regulatory mechanism.

Other metabolites inhibited GSK-3 activity. These included: G6P, a substrate for glycogen synthesis the glucogenic metabolites glutamate, glutamine, glycerol and pyruvate and several ionic salts including NaCl, KCl and NH4kl. Inhibition by each of these was found to be temperature sensitive and typically caused less inhibition at low temperature. G6P is particularly interesting because it is not only a substrate for glycogen synthesis but also an allosteric activator of GS, so it makes sense that it would inhibit GSK-3. Notably, the GSK-3 IC50 for G6P (0.8–1.5 mmol l –1 ) was well within the in vivo concentration in wood frog muscle (1.6 and 3.3 μmol g –1 wet mass in control and frozen frogs, respectively) (Storey and Storey, 1984), indicating that G6P could have a major physiological role in GSK-3 regulation in vivo. Four inhibitors behaved differently. Pyruvate showed significantly higher inhibition at low temperature and low peptide concentration, and inhibition by ATP (both an allosteric effector and a GSK-3 substrate) and Gln was dependent on both temperature and peptide concentration. Interestingly, glucose inhibited GSK-3 from control frogs only at low temperature within the concentration range tested for allosteric effects.

The freezing-induced changes in GSK-3 found in this study can be interpreted with respect to what is already known about glycogen metabolism and the freezing process in wood frogs. Freezing triggers a rapid increase in GP activity, mainly in liver but also in muscle, initiating glycogen breakdown and a sharp increase in glucose production within minutes that ultimately leads to glucose levels of ∼50 mmol l –1 in skeletal muscles and higher levels in core organs and blood (∼75 mmol l –1 in kidneys, ∼150 mmol l –1 in heart, ∼200 mmol l –1 in liver, and as high as 250–300 mmol l –1 in blood) (Storey and Storey, 1988 Storey and Storey, 2004). With GP and glycogenolysis fully active, it is important to inactivate GS to avoid a wasteful ATP-dependent recycling of glucose into glycogen. Previous studies of wood frog GS showed that it was indeed reduced to very low activity levels during freezing, showing an inverse pattern to that of GP activity (Russell and Storey, 1995). A more active GSK-3 during freezing is therefore consistent with an inactivation of GS and would help preserve a high free glucose pool in tissues for cryoprotection. The highest substrate affinity (lowest Km) of GSK-3 in this study was for the enzyme from frozen frogs assayed at low temperature in the absence of glucose. This is likely to be the consequence of the reduced level of GSK-3 phosphorylation in muscle of frozen frogs (Fig. 2) and would allow a more active GSK-3 to bind and phosphorylate GS to suppress its activity, particularly in the early stages of freezing when glucose cryoprotectant is being rapidly synthesized and accumulated. As energy stress increases over the long term under the ischaemic and anoxic conditions of the frozen state, ATP levels decrease and AMP accumulates in tissues (Storey, 1987b). This could have a further regulatory effect on GSK-3 by alleviating ATP inhibition and promoting AMP activation of GSK-3. At cold temperatures (4°C), high glucose was observed to inhibit GSK-3 activity from both control and frozen frogs and also decrease substrate affinity in frozen frogs (Table 2). Outwardly, this may seem counter-intuitive. However, glucose concentrations only reach high levels several hours after the onset of freezing (Storey and Storey, 2004) whereas the timescale of GS inhibition (and GP activation) is within minutes of the start of freezing (Russell and Storey, 1995 Storey and Storey, 2004). GSK-3 activation would presumably parallel GS inhibition and so during the initial stages of freezing GSK-3 would be unencumbered by inhibitory effects from high glucose. Furthermore, the inhibition of GSK-3 by high glucose may actually be advantageous when wood frogs thaw and glucose clearance is needed (Storey and Storey, 2004).

The activation of GSK-3 is probably an early event in freezing and potentially occurs in tandem with signals that activate GP. Previous studies have shown that glycogenoloysis is stimulated by peripheral freezing through hormone-based mechanisms, such as β-adrenergic signalling (Hemmings and Storey, 1994 Hemmings and Storey, 2001 Storey and Storey, 2004). It is possible that GSK-3 activation is mediated by similar hormonal action. Akt from the insulin signalling pathway is known to be a primary inhibitor of GSK-3 in vertebrates. Interestingly, wood frog insulin is structurally unique compared with that of other ranid frog species and could have impaired binding to the insulin receptor (especially at low temperature) that might contribute to allowing the anomalously high rise in glucose concentrations (Conlon et al., 1998). With reduced stimulation of the insulin receptor, intracellular signal transduction would be affected. Indeed, recent studies have shown reduced Akt phosphorylation in most tissues during freezing, with the exception of liver, where an increase was observed (J. Zhang and K.B.S., unpublished results). Another potential mediator of downstream Akt signalling is the AMPK pathway. AMPK signalling can antagonize Akt signalling in cancer cell proliferation (Rattan et al., 2005 Kim et al., 2009). In neuroblastoma cells, activators of AMPK caused the dephosphorylation of both Akt and GSK-3 (King et al., 2006). AMPK is activated by freezing in frog skeletal muscle and liver (Rider et al., 2006) in this study, the role of AMPK was postulated to be facilitation of cryoprotectant production by the inhibition of GS. The combined mechanisms of unique wood frog insulin structure and its downstream signalling, coupled with potential AMPK modulation of Akt targets, may constitute the proposed ‘override’ on normal glucose homeostasis that prevents the activation of glycogenesis that would normally be triggered under hyperglycaemia conditions.

In conclusion, GSK-3 is regulated in the transition to the frozen state by multiple mechanisms. The most prominent of these is the altered phosphorylation state GSK-3 is phosphorylated in control frogs and dephosphorylated in frozen frogs. This post-translational modification causes differential responses to temperature and high glucose that facilitate the production of high concentrations of glucose for use as a cryoprotectant. Wood frog muscle GSK-3 also displayed reduced inhibition by allosteric effectors at low temperatures, and activation by end-products of energy stress (AMP) and gluconeogenic metabolites.