Informatie

12.5: RNA's kunnen functioneren als enzymen - Biologie


Voorbeelden zijn het volgende:

  • RNase P
  • Groep I-introns (inclusief intron van pre-rRNA in Tetrahymena)
  • Groep II introns
  • RNA: vorming van peptidebindingen

Hammerhead ribozymen

Viroïden en virusoïden hebben een zelfsplitsende activiteit die gelokaliseerd is in een structuur van 58 nucleotiden, geïllustreerd in figuur 3.3.15. Het mechanisme verschilt in sommige opzichten van de fosfoesteroverdracht. Een tweewaardig metaalhydroxide bindt zich op de actieve plaats en abstraheert een proton van de 2'-OH van het nucleotide op de splitsingsplaats. Dit dient nu als een nucleofiel om het 3'-fosfaat aan te vallen en de fosfodiesterbinding te splitsen, waardoor een 2',3'-cyclisch fosfaat en een 5'-OH aan de uiteinden van het gesplitste RNA worden gegenereerd.

Een toepassing die momenteel wordt onderzocht, is het gebruik van ontworpen hamerhaaien om een ​​bepaald mRNA te splitsen, waardoor de expressie van een bepaald gen wordt uitgeschakeld. Als overexpressie of ectopische expressie van een bepaald gen de oorzaak zou zijn van een bepaalde pathologie (bijvoorbeeld een vorm van kanker), dan zou het verminderen van de expressie ervan therapeutische waarde kunnen hebben.

Andere RNA's die mogelijk betrokken zijn bij katalyse, zoals de snRNA's die betrokken zijn bij het splitsen van pre-mRNA.

Hoewel RNA's voldoende kunnen zijn voor katalyse, worden ze soms bijgestaan ​​door eiwitten om de efficiëntie te verbeteren. Groep I-introns zijn bijvoorbeeld in staat zelf introns te splitsen in een celvrije reactie. Sommige zijn echter niet erg efficiënt in dit proces, en in de cel worden ze bijgestaan ​​door eiwitten die zelf niet katalytisch zijn maar de reactie versterken. Voorbeelden zijn maturasen, dit zijn eiwitten die helpen bij de splitsing van sommige groep I-introns die worden aangetroffen in mitochondriën van gist.


12.5: RNA's kunnen functioneren als enzymen - Biologie

Onze redacteuren zullen beoordelen wat je hebt ingediend en bepalen of het artikel moet worden herzien.

RNA, afkorting van ribonucleïnezuur, complexe verbinding met een hoog molecuulgewicht die functioneert bij de cellulaire eiwitsynthese en DNA (deoxyribonucleïnezuur) vervangt als drager van genetische codes in sommige virussen. RNA bestaat uit ribose-nucleotiden (stikstofbasen die aan een ribosesuiker zijn bevestigd) bevestigd door fosfodiesterbindingen, waardoor strengen van verschillende lengtes worden gevormd. De stikstofbasen in RNA zijn adenine, guanine, cytosine en uracil, dat thymine in DNA vervangt.

De ribosesuiker van RNA is een cyclische structuur die bestaat uit vijf koolstofatomen en één zuurstof. De aanwezigheid van een chemisch reactieve hydroxylgroep (−OH) bevestigd aan de tweede koolstofgroep in het ribosesuikermolecuul maakt RNA vatbaar voor hydrolyse. Deze chemische labiliteit van RNA, vergeleken met DNA, dat geen reactieve −OH-groep op dezelfde positie op de suikergroep (deoxyribose) heeft, wordt beschouwd als een van de redenen waarom DNA evolueerde tot de geprefereerde drager van genetische informatie in de meeste organismen. De structuur van het RNA-molecuul werd in 1965 beschreven door R.W. Holley.


Een robuuste en veelzijdige methode voor de productie en zuivering van grootschalige RNA-monsters voor structurele biologie

Recente bevindingen in genoombrede transcriptomics onthulden dat RNA's betrokken zijn bij bijna elk biologisch proces, in alle domeinen van het leven. De karakterisering van natieve RNA's met onbekende functie en structuur is bijzonder uitdagend vanwege hun typische lage abundantie in de cel en de inherente gevoeligheid voor alomtegenwoordige RNA-afbrekende enzymen. Daarom zijn vaak robuuste in vitro synthese en uitgebreide opwerkmethoden nodig om monsters te verkrijgen die geschikt zijn voor biochemische, biofysische en structurele studies. Hier presenteren we een protocol dat de meest recente ontwikkelingen in T7 in vitro transcriptiemethodologie combineert met omgekeerde fase-ionenparing en ionenuitwisselings-HPLC-zuivering van RNA's voor de productie van voor de opbrengst geoptimaliseerde grootschalige monsters. De methode is eenvoudig te volgen, robuust en geschikt voor gebruikers met weinig of geen ervaring op het gebied van biochemie of chromatografie. De volledige uitvoering van deze methode, bijvoorbeeld voor de productie van isotopisch gelabelde NMR-monsters, kan in minder dan een week worden uitgevoerd.

trefwoorden: HPLC RNA in vitro transcriptie monster productie structurele biologie.

© 2020 Karlsson et al. Gepubliceerd door Cold Spring Harbor Laboratory Press voor de RNA Society.


Marraffini, L. A. CRISPR-Cas-immuniteit bij prokaryoten. Natuur 526, 55–61 (2015)

Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M. & Terns, M. P. Cas6 is een endoribonuclease dat gids-RNA's genereert voor de verdediging van indringers in prokaryoten. Genen Dev. 22, 3489–3496 (2008)

Ebihara, A. et al. Kristalstructuur van hypothetisch eiwit TTHB192 van Thermus thermophilus HB8 onthult een nieuwe eiwitfamilie met een RNA-herkenningsmotiefachtig domein. Eiwit Sc. 15, 1494–1499 (2006)

Charpentier, E., Richter, H., van der Oost, J. & White, M.F. Biogenese-routes van RNA-gidsen in archaeale en bacteriële CRISPR-Cas adaptieve immuniteit. FEMS Microbiol. ds. 39, 428–441 (2015)

Nam, K.H. et al. Cas5d-eiwit verwerkt pre-crRNA en assembleert tot een cascade-achtig interferentiecomplex in subtype I-C /Dvulg CRISPR-Cas-systeem. Structuur 20, 1574–1584 (2012)

Jore, M.M. et al. Structurele basis voor CRISPR RNA-geleide DNA-herkenning door Cascade. Natuur structuur. Mol. Biol. 18, 529–536 (2011)

Mulepati, S., Heroux, A. & Bailey, S. Kristalstructuur van een CRISPR RNA-geleid surveillancecomplex gebonden aan een ssDNA-doelwit. Wetenschap 345, 1479–1484 (2014)

Plagens, A., Richter, H., Charpentier, E. & Randau, L. DNA- en RNA-interferentiemechanismen door CRISPR-Cas-bewakingscomplexen. FEMS Microbiol. ds. 39, 442–463 (2015)

van der Oost, J., Westra, E.R., Jackson, R.N. & Wiedenheft, B. Het ontrafelen van de structurele en mechanistische basis van CRISPR-Cas-systemen. Natuur Rev. Microbiol. 12, 479–492 (2014)

Zhang, J. et al. Structuur en mechanisme van het CMR-complex voor CRISPR-gemedieerde antivirale immuniteit. Mol. Cel 45, 303–313 (2012)

Staals, R.H. et al. RNA-targeting door het type III-A CRISPR-Cas Csm-complex van Thermus thermophilus . Mol. Cel 56, 518–530 (2014)

Samai, P. et al. Co-transcriptionele DNA- en RNA-splitsing tijdens type III CRISPR-Cas-immuniteit. Cel 161, 1164–1174 (2015)

Chylinski, K., Le Rhun, A. & Charpentier, E. De tracrRNA- en Cas9-families van type II CRISPR-Cas-immuniteitssystemen. RNA Biol. 10, 726–737 (2013)

Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA rijping door trans-gecodeerd klein RNA en gastheerfactor RNase III. Natuur 471, 602–607 (2011)

Jinek, M. et al. Een programmeerbare dual-RNA-geleide DNA-endonuclease in adaptieve bacteriële immuniteit. Wetenschap 337, 816–821 (2012)

Zetsche, B. et al. Cpf1 is een enkel RNA-geleid endonuclease van een klasse 2 CRISPR-Cas-systeem. Cel 163, 759–771 (2015)

Schunder, E., Rydzewski, K., Grunow, R. & Heuner, K. Eerste indicatie voor een functioneel CRISPR/Cas-systeem in Francisella tularensis . Int. J. Med. microbiologisch. 303, 51–60 (2013)

Makarova, K.S. et al. Een bijgewerkte evolutionaire classificatie van CRISPR-Cas-systemen. Natuur Rev. Microbiol. 13, 722–736 (2015)

Shmakov, S. et al. Ontdekking en functionele karakterisering van diverse klasse 2 CRISPR-Cas-systemen. Mol. Cel 60, 385–397 (2015)

Haurwitz, R.E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K. & Doudna, J.A. Sequentie- en structuurspecifieke RNA-verwerking door een CRISPR-endonuclease. Wetenschap 329, 1355–1358 (2010)

Dong, D. et al. De kristalstructuur van Cpf1 in complex met CRISPR RNA. Natuurhttp://dx.doi.org/10.1038/nature17944 (20 april 2016)

Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S. & Doudna, J.A.A. Cas9-gids RNA-complex voorgeorganiseerd voor doel-DNA-herkenning. Wetenschap 348, 1477–1481 (2015)

Nishimasu, H. et al. Kristalstructuur van Cas9 in complex met gids-RNA en doel-DNA. Cel 156, 935–949 (2014)

Sternberg, S.H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E.C. & Doudna, J.A. DNA-ondervraging door de CRISPR RNA-geleide endonuclease Cas9. Natuur 507, 62–67 (2014)

Szczelkun, M.D. et al. Directe observatie van R-lusvorming door enkele RNA-geleide Cas9- en Cascade-effectorcomplexen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 111, 9798–9803 (2014)

Zhang, Y., Rajan, R., Seifert, H.S., Mondragon, A. & Sontheimer, E.J. DNase H-activiteit van Neisseria meningitidis Cas9. Mol. Cel 60, 242–255 (2015)

Yang, W. Een equivalent metaalion in katalyse met één en twee metaalionen. Natuur structuur. Mol. Biol. 15, 1228–1231 (2008)

Vasu, K. et al. Toenemende splitsingsspecificiteit en activiteit van restrictie-endonuclease KpnL. Nucleïnezuren Res. 41, 9812–9824 (2013)

Nam, K.H. et al. Dubbelstrengs endonuclease-activiteit in Bacillus halodurans geclusterd regelmatig interspaced korte palindromic repeats (CRISPR)-geassocieerd Cas2-eiwit. J. Biol. Chem. 287, 35943–35952 (2012)

Punetha, A., Sivathanu, R. & Anand, B. Plasticiteit van actieve plaatsen maakt metaalafhankelijke afstemming van Cas5d-nuclease-activiteit in CRISPR-Cas type I-C-systeem mogelijk. Nucleïnezuren Res. 42, 3846–3856 (2014)

Quinlan, A.R. & Hall, I.M. BEDTools: een flexibele reeks hulpprogramma's voor het vergelijken van genomische kenmerken. Bio-informatica 26, 841–842 (2010)

Robinson, J.T. et al. Integratieve genomics-viewer. Natuur Biotechnologie. 29, 24–26 (2011)

Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J.T. & Mesirov, J.P. Integrative Genomics Viewer (IGV): krachtige genomics-gegevensvisualisatie en -exploratie. Kort. Bio-informeren. 14, 178–192 (2013)

Sampson, J.R. & Uhlenbeck, O.C. Biochemische en fysische karakterisering van een ongemodificeerde gist fenylalanine transfer RNA getranscribeerd in vitro . Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 85, 1033–1037 (1988)

McClelland, M., Hanish, J., Nelson, M. & Patel, Y. KGB: een enkele buffer voor alle restrictie-endonucleasen. Nucleïnezuren Res. 16, 364 (1988)

Herbert, S., Barry, P. & Novick, R. P. Subinhibitory clindamycine remt op differentiële wijze de transcriptie van exoproteïne-genen in Staphylococcus aureus . Infecteren. Immuun. 69, 2996–3003 (2001)

Urban, J.H. & Vogel, J. Translationele controle en doelherkenning door Escherichia coli kleine RNA's in vivo . Nucleïnezuren Res. 35, 1018–1037 (2007)

Pall, G. S. & Hamilton, A. J. Verbeterde Northern-blot-methode voor verbeterde detectie van klein RNA. Natuurprotocollen 3, 1077–1084 (2008)

Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST en PSI-BLAST: een nieuwe generatie zoekprogramma's voor eiwitdatabases. Nucleïnezuren Res. 25, 3389–3402 (1997)

Edgar, R. C. MUSCLE: een methode voor het uitlijnen van meerdere sequenties met verminderde complexiteit in tijd en ruimte. BMC Bio-informatica 5, 113 (2004)

Waterhouse, A.M., Procter, J.B., Martin, D.M., Clamp, M. & Barton, G.J. Jalview Versie 2 – een editor voor uitlijning van meerdere sequenties en een analysewerkbank. Bio-informatica 25, 1189–1191 (2009)

Robinson, J.T. et al. Integratieve genomics-viewer. Natuur Biotechnologie. 29, 24–26 (2011)

Gruber, A.R., Lorenz, R., Bernhart, S.H., Neubock, R. & Hofacker, I.L. De Vienna RNA-websuite. Nucleïnezuren Res. 36, 3429–3431 (2008)

Darty, K., Denise, A. & Ponty, Y. VARNA: Interactief tekenen en bewerken van de secundaire RNA-structuur. Bio-informatica 25, 1974–1975 (2009)


Referenties

Chess, A. Monoallele genexpressie bij zoogdieren. Ann. Rev. Genet. 50, 317–327 (2016).

Eckersley-Maslin, M. A. & Spector, D. L. Willekeurige monoallele expressie: genexpressie één allel tegelijk reguleren. Trends Genet. 30, 237–244 (2014).

Disteche, C. M. Doseringscompensatie van de geslachtschromosomen. Ann. Rev. Genet. 46, 537–560 (2012).

Starmer, J. & Magnuson, T. Een nieuw model voor willekeurige inactivatie van X-chromosoom. Ontwikkeling 136, 1–10 (2009).

Lee, J. T. Sierlijk ouder wordend op 50, X-chromosoom-inactivatie wordt een paradigma voor RNA- en chromatinecontrole. nat. ds. Mol. Cel Biol. 12, 815–826 (2011).

Wutz, A. Gen-uitschakeling bij inactivatie van X-chromosoom: vooruitgang in het begrijpen van facultatieve heterochromatine-vorming. nat. Rev. Genet. 12, 542–553 (2011).

Mira-Bontenbal, H. & Gribnau, J. Nieuwe Xist-interagerende eiwitten bij inactivatie van X-chromosoom. Curr. Biol. 26, R338–R342 (2016).

Lee, J. T. & Lu, N. Gerichte mutagenese van Tsix leidt tot niet-willekeurige X-inactivatie. Cel 99, 47–57 (1999).

Barakat, T.S. et al. De trans-activator RNF12 en cis-werkende elementen bewerkstelligen de inactivatie van het X-chromosoom, onafhankelijk van X-pairing. Mol. Cel 53, 965–978 (2014).

Monkhorst, K., Jonkers, I., Rentmeester, E., Grosveld, F. & Gribnau, J. X-inactivatie tellen en kiezen is een stochastisch proces: bewijs voor betrokkenheid van een X-gebonden activator. Cel 132, 410–421 (2008).

Gayen, S., Maclary, E., Buttigieg, E., Hinten, M. & Kalantry, S. Een primaire rol voor het Tsix lncRNA bij het handhaven van willekeurige X-chromosoom-inactivatie. Mobiele vertegenwoordiger. 11, 1251–1265 (2015).

Lee, J.T. Homozygoot Tsix gemuteerde muizen onthullen een sex-ratio vervorming en keren terug naar willekeurige X-inactivatie. nat. Genet. 32, 195–200 (2002).

Lee, J. T. Regulering van X-chromosoomtelling door: Tsix en Xite sequenties. Wetenschap 309, 768–771 (2005).

Xu, N., Tsai, C.L. & Lee, J.T. Voorbijgaande homologe chromosoomparing markeert het begin van X-inactivatie. Wetenschap 311, 1149–1152 (2006).

Brown, C.J. et al. De mens XIST gen: analyse van een 17 kb inactief X-specifiek RNA dat geconserveerde herhalingen bevat en zeer gelokaliseerd is in de kern. Cel 71, 527–542 (1992).

Penny, G., Kay, G., Sheardown, S., Rastan, S. & Brockdorff, N. Vereiste voor Xist bij X-chromosoominactivatie. Natuur 379, 131–138 (1996).

Sado, T., Wang, Z., Sasaki, H. & Li, E. Regulering van ingeprinte X-chromosoominactivatie bij muizen door Tsix. Ontwikkeling 128, 1275–1286 (2001).

Vigneau, S., Augui, S., Navarro, P., Avner, P. & Clerc, P. Een essentiële rol voor de DXPas34 tandem herhalen en Tsix transcriptie in het telproces van X-chromosoominactivatie. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 103, 7390–7395 (2006).

Masui, O. et al. Live-celchromosoomdynamiek en uitkomst van X-chromosoomparingsgebeurtenissen tijdens ES-celdifferentiatie. Cel 145, 447–458 (2011).

Sado, T., Hoki, Y. & Sasaki, H. Tsix stiltes Xist door modificatie van de chromatinestructuur. ontwikkelaar Cel 9, 159–165 (2005).

Ohhata, T., Senner, C.E., Hemberger, M. & Wutz, A. Lineage-specifieke functie van de niet-coderende Tsix RNA voor Xist repressie en Xi-reactivering bij muizen. Genen Dev. 25, 1702–1715 (2011).

Lee, J.T., Davidow, L.S. & Warshawsky, D. Tsix, een gen-antisense tegen Xist in het X-inactivatiecentrum. nat. Genet. 21, 400–404 (1999).

Bacher, C.P. et al. Voorbijgaande colokalisatie van X-inactivatiecentra gaat gepaard met de initiatie van X-inactivatie. nat. cel bio. 8, 293–299 (2006).

Xu, N., Donohoe, M.E., Silva, S.S. & Lee, J.T. Bewijs dat homologe X-chromosoomparing transcriptie en Ctcf-eiwit vereist. nat. Genet. 39, 1390–1396 (2007).

Chu, H.P. et al. PAR-TERRA stuurt homologe geslachtschromosoomparen aan. nat. structuur Mol. Biol. 24, 620–631 (2017).

Kung, J.T. et al. Locus-specifieke targeting op het X-chromosoom onthuld door het RNA-interactoom van CTCF. Mol. Cel 57, 361–375 (2015).

Scialdone, A. & Nicodemi, M. Mechanica en dynamiek van X-chromosoomparen bij X-inactivatie. PLoS-computer. Biol. 4, e1000244 (2008).

Carrel, L. "X" -rated chromosomale rendez-vous. Wetenschap 311, 1107–1109 (2006).

Donohoe, M.E., Silva, S.S., Pinter, S.F., Xu, N. & Lee, J.T. De pluripotentiefactor Oct4 interageert met Ctcf en regelt ook het koppelen en tellen van X-chromosoom. Natuur 460, 128–132 (2009).

Lee, J.T. & Bartolomei, M.S. X-inactivatie, imprinting en lange niet-coderende RNA's in gezondheid en ziekte. Cel 152, 1308–1323 (2013).

Meguro-Horike, M. et al. Neuronspecifieke verslechtering van interchromosomale paring en transcriptie in een nieuw model van humaan 15q-duplicatiesyndroom. Brommen. Mol. Genet. 20, 3798–3810 (2011).

Thatcher, K.N., Peddada, S., Yasui, D.H. & Lasalle, J.M. Homologe koppeling van met 15q11-13 ingeprente domeinen in de hersenen is ontwikkelingsgereguleerd maar heeft een tekort aan Rett- en autisme-monsters. Hum Mol Genet 14, 785–797 (2005).

Stathopoulou, C., Kapsetaki, M., Stratigi, K. & Spilianakis, C. Lang niet-coderend RNA Set en miR-155 regelen de Tnfα gen allelische expressie profiel. PLoS ONE 12, e0184788 (2017).

Stratigi, K. et al. Ruimtelijke nabijheid van homologe allelen en lange niet-coderende RNA's reguleren een omschakeling in allelische genexpressie. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 112, E1577–E1586 (2015).

Minajigi, A. et al. Een uitgebreid Xist-interactoom onthult cohesine-afstoting en een RNA-gerichte chromosoomconformatie. Wetenschap 349, aab2276 (2015).

Chu, C. et al. Systematische ontdekking van Xist RNA-bindende eiwitten. Cel 161, 404–416 (2015).

McHugh, C.A. et al. Het Xist lncRNA interageert direct met SHARP om transcriptie via HDAC3 tot zwijgen te brengen. Natuur 521, 232–236 (2015).

Roux, K.J., Kim, D.I., Raida, M. & Burke, B. Een promiscue biotine-ligase-fusie-eiwit identificeert proximale en interagerende eiwitten in zoogdiercellen. J. Cell Biol. 196, 801–810 (2012).

McAlister, G.C. et al. MultiNotch MS3 maakt nauwkeurige, gevoelige en gemultiplexte detectie van differentiële expressie over proteomen van kankercellijnen mogelijk. Anaal. Chem. 86, 7150–7158 (2014).

Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P. & Haas, W. MS3 elimineert verhoudingsvervorming in isobare gemultiplexte kwantitatieve proteomics. nat. Methoden: 8, 937–940 (2011).

Shibata, S. & Lee, J.T. Karakterisering en kwantificering van differentiaal Tsix transcripties: implicaties voor Tsix functie. Brommen. Mol. Genet. 12, 125–136 (2003).

Beelman, C.A. et al. Een essentieel onderdeel van het decapping-enzym dat nodig is voor normale snelheden van mRNA-omzet. Natuur 382, 642–646 (1996).

Wilusz, J.E., Freier, S.M. & Spector, D.L. 3'-eindverwerking van een lang nucleair behouden niet-coderend RNA levert een tRNA-achtig cytoplasmatisch RNA op. Cel 135, 919–932 (2008).

Jia, J. et al. Regulering van pluripotentie en zelfvernieuwing van ESC's door middel van epigenetische drempelmodulatie en mRNA-snoei. Cel 151, 576–589 (2012).

Brannan, K. et al. mRNA-decapping-factoren en het exonuclease Xrn2-functie bij wijdverbreide voortijdige beëindiging van RNA-polymerase II-transcriptie. Mol. Cel 46, 311–324 (2012).

Plessel, G., Fischer, U. & Luhrmann, R. m3G cap hypermethylering van U1 klein nucleair ribonucleoproteïne (snRNP) in vitro: bewijs dat het U1 kleine nucleaire RNA-(guanosine-N2)-methyltransferase een niet-snRNP cytoplasmatisch eiwit is waarvoor een bindingsplaats op het Sm-kerndomein vereist is. Mol. Cel. Biol. 14, 4160–4172 (1994).

Kalkan, T. et al. Het volgen van de embryonale stamceltransitie van grondtoestandpluripotentie. Ontwikkeling 144, 1221–1234 (2017).

Shibata, S. & Lee, J.T. Tsix transcriptie- versus RNA-gebaseerde mechanismen in Xist repressie en epigenetische keuze. Curr Biol 14, 1747–1754 (2004).

Lim, F., Downey, T. P. & Peabody, D. S. Translationele repressie en specifieke RNA-binding door het manteleiwit van de Pseudomonas faag PP7. J. Biol. Chem. 276, 22507–22513 (2001).

Peabody, D. S. De RNA-bindingsplaats van bacteriofaag MS2-manteleiwit. EMBO J. 12, 595–600 (1993).

Ohhata, T. et al. Histon H3 lysine 36 trimethylering wordt vastgesteld over de Xist promotor door antisense Tsix transcriptie en draagt ​​bij aan onderdrukking Xist uitdrukking. Mol. Cel. Biol. 35, 3909–3920 (2015).

Ogawa, Y., Sun, B.K. & Lee, J.T. Kruising van de RNA-interferentie en X-inactivatieroutes. Wetenschap 320, 1336–1341 (2008).

Sanz, L.A. et al. Prevalente, dynamische en geconserveerde R-lusstructuren associëren met specifieke epigenomische handtekeningen bij zoogdieren. Mol. Cel 63, 167–178 (2016).

Sun, Q., Csorba, T., Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N.J. & Dean, C. R-lusstabilisatie onderdrukt antisense-transcriptie aan de Arabidopsis FLC plaats. Wetenschap 340, 619–621 (2013).

Boguslawski, S.J. et al. Karakterisering van monoklonaal antilichaam tegen DNA·RNA en de toepassing ervan op immunodetectie van hybriden. J. Immunol. Methoden: 89, 123–130 (1986).

Chen, P.B., Chen, H.V., Acharya, D., Rando, O.J. & Fazzio, T.G.R-lussen reguleren promotor-proximale chromatine-architectuur en cellulaire differentiatie. nat. structuur Mol. Biol. 22, 999–1007 (2015).

Senner, C.E. et al. Verstoring van een geconserveerd gebied van Xist exon 1 verslechtert Xist RNA-lokalisatie en X-gebonden genuitschakeling tijdens willekeurige en ingeprinte X-chromosoominactivatie. Ontwikkeling 138, 1541–1550 (2011).

Betaler, B. et al. Tsix RNA en de kiemlijnfactor, PRDM14, koppelen X-reactivering en herprogrammering van stamcellen. Mol. Cel 52, 805–818 (2013).

Kuida, K. et al. Verminderde apoptose in de hersenen en vroegtijdige letaliteit bij muizen met CPP32-deficiëntie. Natuur 384, 368–372 (1996).

Pampfer, S. & Donnay, I. Apoptose op het moment van embryo-implantatie bij muis en rat. Celdood verschilt. 6, 533–545 (1999).

Gayen, S., Maclary, E., Hinten, M. & Kalantry, S. Geslachtsspecifieke silencing van X-gebonden genen door Xist RNA. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 113, E309–E318 (2016).

Froberg, J.E., Pinter, S.F., Kriz, A.J., Jegu, T. & Lee, J.T. Megadomains en superloops vormen dynamisch maar zijn overbodig voor X-chromosoominactivatie en genontsnapping. nat. gemeenschappelijk. 9, 5004 (2018).

Pollex, T. & Heard, E. Nucleaire positionering en koppeling van X-chromosoom-inactivatiecentra zijn geen primaire determinanten tijdens de start van willekeurige X-inactivatie. nat. Genet. 51, 285–295 (2019).

Chao, W., Huynh, K.D., Spencer, R.J., Davidow, L.S. & Lee, J.T. CTCF, een kandidaat-transacterende factor voor de keuze van X-inactivatie. Wetenschap 295, 345–347 (2002).

Nabet, B. et al. Het dTAG-systeem voor onmiddellijke en doelspecifieke eiwitafbraak. nat. Chem. Biol. 14, 431–441 (2018).

Cifuentes-Rojas, C., Hernandez, A.J., Sarma, K. & Lee, J.T. Regelgevende interacties tussen RNA en polycomb-repressief complex 2. Mol. Cel 55, 171–185 (2014).

Kaneko, S., Son, J., Bonasio, R., Shen, S. S. & Reinberg, D. Ontluikende RNA-interactie houdt PRC2-activiteit in evenwicht en onder controle. Genen Dev. 28, 1983–1988 (2014).

Wang, X. et al. Targeting van polycomb-repressief complex 2 op RNA door korte herhalingen van opeenvolgende guanines. Mol. Cel 65, 1056–1067 (2017).

Chu, H.P. et al. TERRA RNA antagoniseert ATRX en beschermt telomeren. Cel 170, 86–101 (2017).

Spencer, R.J. et al. Een grenselement tussen Tsix en Xist bindt de chromatine-isolator Ctcf en draagt ​​bij aan de initiatie van X-chromosoominactivatie. Genetica 189, 441–454 (2011).

Porro, A. et al. Functionele karakterisering van het TERRA-transcriptoom bij beschadigde telomeren. nat. gemeenschappelijk. 5, 5379 (2014).

Kwak, H., Fuda, N.J., Core, L.J. & Lis, J.T. Precieze kaarten van RNA-polymerase onthullen hoe promotors initiatie en pauzeren sturen. Wetenschap 339, 950–953 (2013).

Cohen, D.E. et al. De DXPas34 repeat reguleert willekeurige en ingeprinte X-inactivatie. ontwikkelaar Cel 12, 57–71 (2007).

Navarro, P., Pichard, S., Ciaudo, C., Avner, P. & Rougeulle, C. Tsix transcriptie over de Xist gen verandert de conformatie van chromatine zonder het te beïnvloeden Xist transcriptie: implicaties voor inactivatie van X-chromosoom. Genen Dev. 19, 1474–1484 (2005).

Sun, B.K., Deaton, A.M. & Lee, J.T. Een voorbijgaande heterochromatische toestand in Xist gaat vooraf aan de keuze voor X-inactivatie zonder RNA-stabilisatie. Mol. Cel 21, 617–628 (2006).

Tian, ​​D., Sun, S. & Lee, J.T. Het lange niet-coderende RNA, Jpx, is een moleculaire schakelaar voor inactivatie van X-chromosoom. Cel 143, 390–403 (2010).

Saldana-Meyer, R. et al. CTCF reguleert het menselijke p53-gen door directe interactie met zijn natuurlijke antisense-transcript, Wrap53. Genen Dev. 28, 723–734 (2014).

Ran, F.A. et al. Genoomengineering met behulp van het CRISPR-Cas9-systeem. nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).

Flemr, M. & Buhler, M. Single-step generatie van conditionele knock-out embryonale stamcellen van muizen. Mobiele vertegenwoordiger. 12, 709–716 (2015).

Sambrook, J. Moleculair klonen: een laboratoriumhandleiding (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Wiznerowicz, M. & Trono, D. Voorwaardelijke onderdrukking van cellulaire genen: door lentivirus vector gemedieerde, door geneesmiddelen induceerbare RNA-interferentie. J. Virol. 77, 8957–8961 (2003).

Grolimund, L. et al. Een kwantitatief telomerisch chromatine-isolatieprotocol identificeert verschillende telomere toestanden. nat. gemeenschappelijk. 4, 2848 (2013).

Roux, K.J., Kim, D.I. & Burke, D. BioID: een scherm voor eiwit-eiwit-interacties. Curr. Protoc. Eiwit Sc. 91, 19.23.1–19.23.15 (2018).

Edwards, A. & Haas, W. Multiplexed kwantitatieve proteomics voor uitgebreide proteoomvergelijkingen met hoge doorvoer van menselijke cellijnen. Methoden Mol. Biol. 1394, 1–13 (2016).

McAlister, G.C. et al. Verhoging van de multiplexcapaciteit van TMT's met behulp van reporterion-isotopologen met isobare massa's. Anaal. Chem. 84, 7469–7478 (2012).

Eng, J.K., McCormack, A.L. & Yates, J.R. Een benadering om tandem-massaspectrale gegevens van peptiden te correleren met aminozuursequenties in een eiwitdatabase. J. Ben. Soc. Massa spectrum. 5, 976–989 (1994).

Huttlin, E.L. et al. Een weefselspecifieke atlas van fosforylering en expressie van muizeneiwitten. Cel 143, 1174–1189 (2010).

Elias, J.E. & Gygi, S.P. Target-decoy-zoekstrategie voor meer vertrouwen in grootschalige eiwitidentificaties door massaspectrometrie. nat. Methoden: 4, 207–214 (2007).

Jeon, Y. & Lee, J.T. YY1 bindt Xist-RNA vast aan het inactieve X-kiemvormingscentrum. Cel 146, 119–133 (2011).

Yang, L., Kirby, J.E., Sunwoo, H. & Lee, J.T. Vrouwelijke muizen zonder Xist-RNA vertonen gedeeltelijke dosiscompensatie en overleven tot op de dag van vandaag. Genen Dev. 30, 1747–1760 (2016).

Mahat, D.B. et al. Base-pair-resolutie genoom-brede mapping van actieve RNA-polymerasen met behulp van precisie nucleaire run-on (PRO-seq). nat. Protoc. 11, 1455–1476 (2016).

Kim, D. et al. TopHat2: nauwkeurige uitlijning van transcriptomen in aanwezigheid van inserties, deleties en genfusies. Genoom Biol. 14, R36 (2013).

Langmead, B. & Salzberg, S. L. Snelle uitlijning met gapped-read met Bowtie 2. nat. Methoden: 9, 357–359 (2012).

Heinz, S. et al. Eenvoudige combinaties van afstammingsbepalende transcriptiefactoren prime cis-regulerende elementen die nodig zijn voor macrofaag- en B-celidentiteiten. Mol. Cel 38, 576–589 (2010).

Love, M.I., Huber, W. & Anders, S. Gemodereerde schatting van vouwverandering en dispersie voor RNA-seq-gegevens met DESeq2. Genoom Biol. 15, 550 (2014).

Pinter, S.F. et al. Verspreiding van X-chromosoominactivatie via een hiërarchie van gedefinieerde Polycomb-stations. Genoom onderzoek. 22, 1864–1876 (2012).

Ramirez, F. et al. deepTools2: een webserver van de volgende generatie voor diepgaande gegevensanalyse. Nucleïnezuren Res. 44, W160-W165 (2016).

Min, I.M. et al. Reguleren van pauzeren van RNA-polymerase en verlenging van de transcriptie in embryonale stamcellen. Genen Dev. 25, 742–754 (2011).

Sunwoo, H., Wu, J. Y. & Lee, J. T. Het Xist RNA-PRC2-complex met een resolutie van 20 nm onthult een lage Xist-stoichiometrie en suggereert een hit-and-run-mechanisme in muizencellen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 112, E4216–E4225 (2015).

Del Rosario, B.C. et al. Genetische kruising van Tsix- en Hedgehog-signalering tijdens de initiatie van X-chromosoominactivatie. ontwikkelaar Cel 43, 359–371 (2017).


In tegenstelling tot het prokaryotische polymerase dat op zichzelf kan binden aan een DNA-matrijs, hebben eukaryoten verschillende andere eiwitten, transcriptiefactoren genaamd, nodig om eerst aan het promotorgebied te binden en vervolgens te helpen bij het rekruteren van het juiste polymerase.

De drie eukaryote RNA-polymerasen

De kenmerken van eukaryote mRNA-synthese zijn opmerkelijk complexer dan die van prokaryoten. In plaats van een enkele polymerase die vijf subeenheden omvat, hebben de eukaryoten drie polymerasen die elk uit 10 of meer subeenheden bestaan. Elke eukaryote polymerase heeft ook een aparte set transcriptiefactoren nodig om het naar de DNA-template te brengen.

RNA-polymerase I bevindt zich in de nucleolus, een gespecialiseerde nucleaire substructuur waarin ribosomaal RNA (rRNA) wordt getranscribeerd, verwerkt en geassembleerd tot ribosomen (tabel 1). De rRNA-moleculen worden beschouwd als structurele RNA's omdat ze een cellulaire rol spelen, maar niet in eiwit worden vertaald. De rRNA's zijn componenten van het ribosoom en zijn essentieel voor het translatieproces. RNA-polymerase I synthetiseert alle rRNA's behalve het 5S-rRNA-molecuul. De aanduiding '8220S'8221 is van toepassing op '8220Svedberg'8221-eenheden, een niet-additieve waarde die de snelheid kenmerkt waarmee een deeltje bezinkt tijdens het centrifugeren.

Tabel 1. Locaties, producten en gevoeligheden van de drie eukaryote RNA-polymerasen
RNA-polymerase Mobiel compartiment Product van transcriptie α-Amanitine Gevoeligheid
l Nucleolus Alle rRNA's behalve 5S rRNA Ongevoelig
II Kern Alle eiwitcoderende nucleaire pre-mRNA's Extreem gevoelig
III Kern 5S rRNA, tRNA's en kleine nucleaire RNA's Matig gevoelig

RNA-polymerase II bevindt zich in de kern en synthetiseert alle eiwitcoderende nucleaire pre-mRNA's. Eukaryotische pre-mRNA's ondergaan uitgebreide verwerking na transcriptie maar vóór translatie (Figuur 1). Voor de duidelijkheid: de bespreking van transcriptie en translatie in eukaryoten in deze module zal de term '8220mRNA's'8221 gebruiken om alleen de rijpe, bewerkte moleculen te beschrijven die klaar zijn om te worden vertaald. RNA-polymerase II is verantwoordelijk voor het transcriberen van de overgrote meerderheid van eukaryote genen.

Figuur 1. Eukaryotisch mRNA bevat introns die moeten worden uitgesplitst. Een 5'8242 dop en 3'8242 poly-A staart zijn ook toegevoegd.

RNA-polymerase III bevindt zich ook in de kern. Deze polymerase transcribeert een verscheidenheid aan structurele RNA's, waaronder het 5S-pre-rRNA, transfer-pre-RNA's (pre-tRNA's) en kleine nucleaire pre-RNA's. De tRNA's spelen een cruciale rol bij de translatie, ze dienen als de adaptermoleculen tussen de mRNA-template en de groeiende polypeptideketen. Kleine nucleaire RNA's hebben een verscheidenheid aan functies, waaronder ''8220splicing''8221 pre-mRNA's en het reguleren van transcriptiefactoren.

Een wetenschapper die een nieuw gen karakteriseert, kan bepalen welk polymerase het transcribeert door te testen of het gen tot expressie wordt gebracht in aanwezigheid van een bepaald paddenstoelengif, -amanitine (Tabel 1). Interessant is dat α-amanitine geproduceerd door Amanita phalloides, de Death Cap-paddenstoel, beïnvloedt de drie polymerasen heel anders. RNA-polymerase I is volledig ongevoelig voor α-amanitine, wat betekent dat de polymerase in vitro DNA kan transcriberen in aanwezigheid van dit gif. Daarentegen is RNA-polymerase II extreem gevoelig voor α-amanitine en is RNA-polymerase III matig gevoelig. Het kennen van de transcriberende polymerase kan een onderzoeker een idee geven van de algemene functie van het gen dat wordt bestudeerd. Omdat RNA-polymerase II de overgrote meerderheid van genen transcribeert, zullen we ons op dit polymerase concentreren in onze volgende discussies over eukaryote transcriptiefactoren en promotors.

RNA-polymerase II-promotors en transcriptiefactoren

Eukaryote promoters zijn veel groter en ingewikkelder dan prokaryotische promoters. Beide hebben echter een sequentie die vergelijkbaar is met de -10-sequentie van prokaryoten. In eukaryoten wordt deze sequentie de TATA-box genoemd en heeft de consensussequentie TATAAA op de coderende streng. Het bevindt zich op -25 tot -35 basen ten opzichte van de initiatie (+1) plaats (Figuur 2). Deze volgorde is niet identiek aan de E coli -10 box, maar het behoudt het A–T-rijke element. De thermostabiliteit van A–T-bindingen is laag en dit helpt de DNA-matrijs zich lokaal af te wikkelen ter voorbereiding op transcriptie.

In plaats van de eenvoudige σ-factor die helpt het prokaryotische RNA-polymerase aan zijn promotor te binden, assembleren eukaryoten een complex van transcriptiefactoren die nodig zijn om RNA-polymerase II te rekruteren voor een eiwitcoderend gen. Transcriptiefactoren die binden aan de promotor worden genoemd basale transcriptiefactoren. Deze basale factoren heten allemaal TFII (voor transcriptiefactor/polymerase II) plus een extra letter (A-J). Het kerncomplex is TFIID, dat een TATA-bindend eiwit (TBP) bevat. De andere transcriptiefactoren vallen systematisch op hun plaats op de DNA-matrijs, waarbij elk het pre-initiatiecomplex verder stabiliseert en bijdraagt ​​​​aan de rekrutering van RNA-polymerase II.

Figuur 2. Een gegeneraliseerde promotor van een gen getranscribeerd door RNA-polymerase II wordt getoond. Transcriptiefactoren herkennen de promotor. RNA-polymerase II bindt dan en vormt het transcriptie-initiatiecomplex.

Oefenvraag

Een wetenschapper splitst een eukaryote promotor voor een bacterieel gen en voegt het gen in een bacterieel chromosoom in. Zou je verwachten dat de bacteriën het gen transcriberen?

Sommige eukaryote promotors hebben ook een geconserveerde CAAT-doos (GGCCAATCT) op ongeveer -80. Verder stroomopwaarts van de TATA-box kunnen eukaryote promotors ook een of meer GC-rijke dozen (GGCG) of octamer dozen (ATTTGCAT). Deze elementen binden cellulaire factoren die de efficiëntie van transcriptie-initiatie verhogen en worden vaak geïdentificeerd in meer "actieve" genen die constant door de cel tot expressie worden gebracht.

Basale transcriptiefactoren zijn cruciaal bij de vorming van een pre-initiatiecomplex op de DNA-template dat vervolgens RNA-polymerase II rekruteert voor transcriptie-initiatie. De complexiteit van eukaryote transcriptie eindigt niet bij de polymerasen en promotors. Een leger van andere transcriptiefactoren, die binden aan stroomopwaartse versterkers en geluiddempers, helpen ook om de frequentie te reguleren waarmee pre-mRNA wordt gesynthetiseerd uit een gen. Enhancers en geluiddempers beïnvloeden de efficiëntie van transcriptie, maar zijn niet nodig om de transcriptie te laten verlopen.

De evolutie van promotors

De evolutie van genen is misschien een bekend begrip. Mutaties kunnen optreden in genen tijdens DNA-replicatie, en het resultaat kan al dan niet gunstig zijn voor de cel. Door een enzym, structureel eiwit of een andere factor te veranderen, kan het mutatieproces functies of fysieke kenmerken transformeren. Eukaryote promotors en andere genregulerende sequenties kunnen echter ook evolueren. Denk bijvoorbeeld aan een gen dat gedurende vele generaties waardevoller wordt voor de cel. Misschien codeert het gen voor een structureel eiwit dat de cel in overvloed moet synthetiseren voor een bepaalde functie. Als dit het geval is, zou het gunstig zijn voor de cel als de promotor van dat gen transcriptiefactoren efficiënter zou rekruteren en de genexpressie zou verhogen.

Wetenschappers die de evolutie van promotorsequenties onderzoeken, hebben wisselende resultaten gerapporteerd. Voor een deel is dit omdat het moeilijk is om precies af te leiden waar een eukaryote promotor begint en eindigt. Sommige promotors komen voor binnen genen, andere bevinden zich zeer ver stroomopwaarts, of zelfs stroomafwaarts, van de genen die ze reguleren. Toen onderzoekers hun onderzoek echter beperkten tot menselijke kernpromotorsequenties die experimenteel werden gedefinieerd als sequenties die het pre-initiatiecomplex binden, ontdekten ze dat promoters zelfs sneller evolueren dan eiwitcoderende genen.

Het is nog steeds onduidelijk hoe de evolutie van de promotor zou kunnen overeenkomen met de evolutie van mensen of andere hogere organismen. De evolutie van een promotor om effectief meer of minder van een bepaald genproduct te maken, is echter een intrigerend alternatief voor de evolutie van de genen zelf. [1]

Promotorstructuren voor RNA-polymerasen I en III

De processen om RNA-polymerasen I en III naar de DNA-matrijs te brengen, omvatten iets minder complexe verzamelingen van transcriptiefactoren, maar het algemene thema is hetzelfde.

De geconserveerde promotorelementen voor genen die zijn getranscribeerd door polymerasen I en III verschillen van die getranscribeerd door RNA-polymerase II. RNA-polymerase I transcribeert genen die twee GC-rijke promotorsequenties hebben in het -45 tot +20-gebied. Deze sequenties alleen zijn voldoende om transcriptie-initiatie te laten plaatsvinden, maar promotors met extra sequenties in het gebied van -180 tot -105 stroomopwaarts van de initiatieplaats zullen de initiatie verder versterken. Genen die worden getranscribeerd door RNA-polymerase III hebben stroomopwaartse promoters of promoters die in de genen zelf voorkomen.

Eukaryotische transcriptie is een strak gereguleerd proces dat een verscheidenheid aan eiwitten vereist om met elkaar en met de DNA-streng te interageren. Hoewel het transcriptieproces in eukaryoten een grotere metabolische investering met zich meebrengt dan in prokaryoten, zorgt het ervoor dat de cel precies de pre-mRNA's transcribeert die het nodig heeft voor eiwitsynthese.

Verlenging en beëindiging

Na de vorming van het pre-initiatiecomplex wordt het polymerase vrijgemaakt van de andere transcriptiefactoren en laat men de elongatie verlopen zoals bij prokaryoten met het polymerase dat pre-mRNA synthetiseert in de richting 5'8242 naar 3'8242. Zoals eerder besproken, transcribeert RNA-polymerase II het grootste deel van eukaryote genen, dus deze sectie zal zich concentreren op hoe deze polymerase verlenging en beëindiging tot stand brengt.

Hoewel het enzymatische proces van verlenging in wezen hetzelfde is bij eukaryoten en prokaryoten, is de DNA-matrijs complexer. Wanneer eukaryote cellen zich niet delen, bestaan ​​hun genen als een diffuse massa van DNA en eiwitten die chromatine wordt genoemd. Het DNA is met herhaalde tussenpozen stevig verpakt rond geladen histon-eiwitten. These DNA–histone complexes, collectively called nucleosomes, are regularly spaced and include 146 nucleotides of DNA wound around eight histones like thread around a spool.

For polynucleotide synthesis to occur, the transcription machinery needs to move histones out of the way every time it encounters a nucleosome. This is accomplished by a special protein complex called FACT, which stands for “facilitates chromatin transcription.” This complex pulls histones away from the DNA template as the polymerase moves along it. Once the pre-mRNA is synthesized, the FACT complex replaces the histones to recreate the nucleosomes.

De beëindiging van transcriptie is verschillend voor de verschillende polymerasen. In tegenstelling tot prokaryoten vindt verlenging door RNA-polymerase II in eukaryoten plaats 1000-2000 nucleotiden voorbij het einde van het gen dat wordt getranscribeerd. Deze pre-mRNA-staart wordt vervolgens verwijderd door splitsing tijdens mRNA-verwerking. Aan de andere kant vereisen RNA-polymerasen I en III terminatiesignalen. Genen die zijn getranscribeerd door RNA-polymerase I bevatten een specifieke sequentie van 18 nucleotiden die wordt herkend door een terminatie-eiwit. Het proces van terminatie in RNA-polymerase III omvat een mRNA-haarspeld vergelijkbaar met rho-onafhankelijke terminatie van transcriptie in prokaryoten.


RNA: Definition, Types, Structure and Functions

Johannes Friedrich Miescher (a Swiss physician and biologist) first discovered the Nucleic acids as ‘nuclein’ from the nucleus in 1869. Severo Ochoa de Albornoz (a Spanish-American physician and biochemist) discovered the RNA synthesis mechanism in 1959. He won the Nobel Prize jointly with Arthur Kornberg in Physiology or Medicine for his discoveries. In 1965, Robert W. Holley sequences 77 nucleotides of yeast tRNA.

Ribonucleic acid or RNA is an essential biological macromolecule. Generally, it helps to exchange the hereditary information encoded by DNA into proteins. The nucleic acid of living cell having ribose sugar in its nucleotides and perform multiple vital roles in the coding, decoding, regulation and expression of genes is called Ribonucleic acid or RNA.

In prokaryotic cell these are found in cytoplasm, chromosome, ribosome, nucleolus, plastid and mitochondria. In eukaryotic cells, 90% RNA present in cytoplasm and 10% in other structures. In some virus, RNA exists as genetic material.

Physical Structure of RNA

Primarily RNA is single-stranded particle with an intra-strand pairing yet in their secondary structure there are a few U shaped loops. It can show a broad twofold helical structure and can also form different tertiary structures.

Chemical Structure of RNA

RNA molecule is a polymer of ribonucleotide. Each ribonucleotide consists of the following molecules:

Each nucleotide in a RNA molecule has one of four nitrogenous bases: adenine, guanine, cytosine and uracil. The first two are purine and the later two are pyrimidine bases.

Types of RNA

RNA is of two main types, such as:

1. Genetic RNA or gRNA: When RNA functions as genetic materials then it is known as genetic RNA, e.g. RNA of some viruses.

2. Non-genetic RNA: When RNA takes part in only protein synthesis, then it is called non-genetic RNA, e.g. RNA of eukaryotic and prokaryotic cells.

Non-genetic RNA is further divided into the following three types:

  1. Ribosomal RNA or rRNA
  2. Messenger RNA or mRNA
  3. Transfer RNA or tRNA

Ribosomal RNA or rRNA: It makes up about 80% of the total RNA in a cell. These are synthesized in nucleolus and occur in ribosome, the protein factories of the cells. Ribosomal RNA is composed of unbranhed, flexible polynucleotide chain. This chain remains coil in low ionic concentration but its nitrogen bases form helical part in high ionic concentration. In such case, adenine bound with uracil and guanine bound with cytosine.

Eukaryotic rRNA is of four types: 28S rRNA, 18S rRNA, 5.8S rRNA, and 5S rRNA.

Image showing Ribosomal RNA (rRNA)

Functions of rRNA

  • Ribosomal RNA gives a procedure for decoding mRNA into amino acids and interrelates with tRNAs during translation.
  • It comprises the predominant material within the ribosome. During protein synthesis.
  • It guarantees the proper alignment of tRNA, mRNA, and ribosome.
  • It catalyzes during peptide bond formation between amino acids.

Messenger RNA or mRNA

French scientists François Jacob and Jacques Monod coined the name mRNA in 1961. mRNA is a single-strand made of up to several thousand nucleotides. It is created as complementary strand of DNA hence it has base sequences as like as in DNA. In its linear structure, mRNA has two non-coding ends and middle coding zone. The two ends of mRNA recognized as 5´ leader and 3´ trailer end. mRNA makes up 3-5% of the total RNA in a cell.

mRNA is a copy of the hereditary information produced by transcription from the cell’s original blueprint, DNA. This hereditary information is brought to the protein factories of the cells, ribosome for using as instruction for the formation of proteins.

Functions of mRNA

  • mRNA is transcribed from the DNA template in the nucleus and carries coding information to the sites of protein synthesis in the ribosomes.

Transfer RNA or tRNA

Transfer RNA is also known as tRNA. It is a small and clover leaf shape RNA which helps transmission a specific amino acid to a new polypeptide chain. During translation, this transmission occurs at the ribosomal site of protein synthesis.

In this case, each of the 20 amino acids which have a specific tRNA that binds with it to form proteins. The tRNA is made up of 70 to 95 nucleotides. It is the essential component of translation and it performs to transfer of amino acids during protein synthesis as a main functions. Hence, it is called transfer RNA or tRNA. tRNA is also called adaptor molecules because it acts as adaptor in the transformation of the genetic sequence of mRNA into proteins. Sometimes tRNA ia also called soluble, or activator RNA.

Robert Willium Holley et al. (1965) proposed the clover leaf model structure of tRNA. He awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1968 with Har Gobind Khorana and Marshall Warren Nirenberg for describing this model. According to this model the single polynucleotide chain of tRNA is folded upon itself to form five arms. The arms are:

  1. Acceptor arm
  2. Dihydrouridine (DHU) arm or D arm
  3. Anticodon arm
  4. Variable arm and
  5. Thiamine psedocytosine or TΨC arm.

tRNA also have DHU loop, variable loop, anticodon loop, T-loop or TΨC loop and amino acid acceptor end. It has four normal bases A, G, U, C and some unknown bases like isonine (I), dihydouridine, psedouradine, etc. Both end of single chain of tRNA (5´-3´) exist aside.

Image showing Clover Leaf Model Structure of tRNA

Functions of tRNA

  1. It identifies and transports the correct amino acid molecules to the site of protein synthesis in the ribosome.
  2. It primarily is familiar for carrying amino acids.
  3. It also takes part in the process of building proteins.

RNAa can also be broadly divided into the following types:

Non-coding RNAs (ncRNA) are of the following two types, such as:

Non-coding RNA (ncRNA) is further divided into the following two types based on their size such as:

1. IncRNA or Long ncRANS: As a minimum, 200 nucleotides are present in IncRNA.

2. Small ncRNAS: Less than 200 nucleotides are present in ncRNAS.

Small ncRNAs are subdivided into the following five types:

1. miRNA: It is also called micro RNA

2. snoRNA: It is also known as small nucleolar RNA

3. snRNA: It is also known as small nuclear RNA

4. siRNA: It is also called small-interfering RNA

5. piRNA: It is also called PIWI-interacting RNA

The size of t he miRNAs is about twenty two (22) nucleotides long and have particular importance. In most eukaryotic cells, they perform to function in gene regulation. Some miRNAs can regulate target genes which lead to tumour progression and tumorigenesis. The size of piRNA is about 26-31 nucleotide long. They are present in most animals. They can regulate the expression of jumping genes or transposon that move from one location to another on a chromosome. These genes were first identified by Barbara McClintock.

Slotopmerkingen

Definitively, the RNA is as significant as DNA into molecular investigations as the evaluation of the gene expression is relies upon the complete mRNA present into the specific tissue. mRNA is fundamental to the procedure of transcription, while tRNA is essential to the procedure of translation, and rRNA makes up the ribosomes in which translation occurs. The amount of expression of gene can be estimated by utilizing the Reverse transcription polymerase chain reaction technique or RT-PCR technique through the evaluation of RNA.


Drug development

In the various jobs that AARSs have taken on above and beyond their traditional role, Schimmel and colleagues see a theme: they keep cells and bodies stable. “They seem to be something that’s playing a modulatory role, restoring more of a homeostasis,” says Leslie Nangle, a former Schimmel lab grad student who is now senior director for research at aTyr Pharma. Many researchers think it’s risky to mess with such essential enzymes, says Kim, but he and Schimmel see potential in targeting AARSs for treating disease. Schimmel’s company aTyr, of which Kim and Yang are also cofounders, hopes to turn the enzymes themselves into biologic therapeutics. In addition, in Seoul, Kim directs the nonprofit drug discovery organization Biocon, where researchers are developing several small molecules that interact with AARSs, as well as biologics based on natural AARS variants.

Biocon is currently testing molecules to treat cardiac fibrosis, alopecia areata (an autoimmune disease that causes hair loss), and inflammation. A fibrosis treatment now under Phase 1 study targets the site on the proline synthetase that links the amino acid to its tRNA. Fibrosis results from an accumulation of collagen, which is two-thirds proline. Biocon researchers have found that a drug can go after that active site, knocking down the canonical function by more than 90 percent in healthy cultured cells without greatly affecting the synthesis of other proteins or cell proliferation, says Kim. At first, he and his colleagues didn’t believe their results, but he’s come to see sense in them. “A normal cell is not necessarily doing high level protein synthesis all the time,” he says. “As long as it has a certain degree of residual activity going on, then a normal cell can be perfectly happy.”

For cancer and other conditions, Biocon is developing small molecule candidates that avoid the tRNA–amino acid linking site or target the extracellular activities of secreted AARSs, meaning that protein synthesis should not be affected. Similarly, aTyr researchers expect that the firm’s therapeutics, based on AARS derivatives themselves, to be relatively safe. “Coming from a world of natural physiology, you start to feel better about it,” says aTyr CEO Sanjay Shukla.

Nangle and colleagues, alongside aTyr’s subsidiary Pangu Biopharma in Hong Kong, began by cataloging natural AARS splice variants and then screening them for interesting biological activities in a variety of human cell–based assays. They looked for effects on cell proliferation and protection, immunomodulation and inflammation, cell differentiation, transcriptional regulation, and cholesterol transport. “We figured there’s got to be some therapeutic benefit there,” says Schimmel.

Currently, aTyr is pursuing an immuno-modulator based on the WHEP domain of the histidine enzyme HisRS. In human T cell cultures, full-length HisRS quieted activated cells and reduced cytokine production. In further experiments, aTyr researchers found that the WHEP domain hooks up with receptors on those immune cells to dampen activity. The company hopes that its modified version of the HisRS WHEP peptide, attached to a bit of antibody to help it last longer in the bloodstream, will have the same quieting effect in an inflammatory disease called sarcoidosis. This disease affects a variety of organs, most often the lungs, and can sometimes require lifelong treatment with immune-suppressing steroids. Those medications come with a list of misery-inducing and dangerous side effects ranging from insomnia to glaucoma to infection.

aTyr presented results from several animal models of inflammatory lung disease at the American Thoracic Society meeting in 2017, 2018, and 2019, and those findings suggest the company’s candidate 1923 looks promising. For example, the cancer drug bleomycin can cause lung damage, but HisRS or its WHEP domain reduced inflammation and fibrosis. 19 Rats treated with bleomycin breathe quickly to compensate for their damaged lungs, but those treated with 1923 recovered normal respiratory rates.

aTyr’s 1923 has already been through a Phase 1 trial for safety in healthy people without any red flags. Now, the company is running a Phase 1/2 study in people with sarcoidosis, looking to confirm safety, find the right dosage, and perhaps even see signs of efficacy. Patients enter the trial while taking steroids, and the aim is to taper down the steroid dosage during the study. Those receiving 1923, it’s hoped, will see their symptoms stay the same or improve, while those on placebo should see them worsen as the steroid doses are lowered.

It’s a testament to the need for a new treatment that volunteers are willing to risk having their symptoms intensify if they end up in the placebo arm, says participating physician Daniel Culver, a pulmonologist at the Cleveland Clinic. “[Steroids are] very toxic,” says Culver, who notes that one of his patients calls his steroid prescription “the Devil’s drug” because it does almost as much harm as good. “People are very, very motivated to find something different.”

The study plans to enroll 36 participants, but has been delayed by the COVID-19 crisis. With such a small sample size, Culver doesn’t expect a “home run,” but he says he hopes the data will be good enough to embark on a larger, Phase 3 study. aTyr is also planning a Phase 2, 30-person trial of 1923 for respiratory complications associated with COVID-19.

If aTyr succeeds, it will be the first instance of a therapeutic built from an AARS—but probably not the last. As Kim sees it, AARSs are ready and waiting to respond to anything that challenges homeostasis, from cancer to the novel coronavirus. “I rename the synthetases ‘Molecular 911.’”

Correction (June 2, 2020): The original version of a table in this story stated that during HIV infection, the synthetase for lysine (LysRS) is packaged into new viral particles that use its UUU sequence to prime reverse transcription in newly infected cells. Rather, the viral particles use LysRS to deliver its cognate tRNA, which is used as a promoter for reverse transcription. De wetenschapper betreurt de fout.


Role of RNA Polymerase in Gene Transcription | Genetica

In this article we will discuss about the role of RNA polymerase in transcription.

RNA polymerase enzymes are complex enzyme which in E. coli is made up of 5 subunits or polypeptide chains designated β, β’, α, σ and ω with respective molecular weights of 160,000, 150,000, 90,000, 40,000 and 10,000. The α chain is present twice, others only once. The active form of the enzyme is called holoenzyme and has a total molecular weight of 500,000.

The polypeptide chains are held together by secondary non-covalent bonds. Chains β, β’, α and ω form the core enzyme σ (sigma factor) is weakly attached to the other chains and can easily become detached. The core enzyme catalyses the linkage of ribose nucleotides by phosphodiester bonds.

The sigma factor recognises start sequences in the promoter region of DNA where transcription begins. In the presence of the sigma factor the holoenzyme binds to those nucleotides in promoter region which initiate transcription. Soon thereafter, the double helix unwinds and one strand serves as the template for transcription.

The eukaryotic RNA polymerases I, II and III consist of 8 to 14 different subunits in each. They recognise different promoters and recognise different classes of genes.

The two largest subunits of all three eukaryotic RNA polymerases are related to the β and β’ subunits of the E. coli polymerase. Five subunits of the eukaryotic RNA polymerases are common to all the three enzymes. These structural similarities allow eukaryotic polymerases to share several common functional properties.

Site of Transcription, Promoter Recognition:

The DNA sequence to which RNA polymerase binds to initiate transcription of a gene is called the promoter. The promoter is a specific site at the beginning of genes where transcription is initiated.

The initiation process is important because this is the primary step at which transcription is regulated. Typical promoters are from 20 to 200 bases long. The base sequence among different promoters shows variation, and that relates with the strength in binding with the RNA polymerase.

Transcription raised the question as to whether one or both strands of DNA duplex are transcribed. In virus φ X 174 which has only single-stranded DNA (unlike most other DNA viruses), only one strand of DNA is transcribed into a complementary RNA sequence. In other viruses with duplex DNA, when we consider the entire genome, both strands of DNA duplex are transcribed, one strand serving as template for some genes, the other strand for remaining genes.

Transcription in Prokaryotes:

Promoters in bacteria are located in the region of a DNA strand just preceding the initiation site of RNA transcription. The nucleotide at which transcription is initiated is denoted as + 1 and the preceding nucleotide as -1. The portions of the DNA preceding the initiation site, toward the 3′ end of the template are said to be upstream of that site.

Those portions of the DNA succeeding it, toward the 5′ end of the template are said to be downstream of that site. Comparisons of promoter sequences of a series of different genes isolated from E. coli revealed that the region upstream of the transcription initiation site contains two sets of sequences that are similar in a variety of genes.

These two common sequences, referred to as consensus sequences, contain 6 nucleotides each. Each base in the consensus sequence is the base most often observed at that position among any number of observed sequences.

Consensus sequences are located approximately 10 and 35 base pairs upstream of the transcription start site. They are called the -10 and -35 elements, denoting their position in relation to the transcription initiation site, which is at + 1 position. (Fig. 15.6).

The consensus sequence in position 35 in E. coli has TTGACA and that in position 10 has TATAAT. The sequences at the – 10 and – 35 positions are not identical in different promoters, but similar enough to establish consensus sequences. The – 10 sequence which is called the TATA box or Pribnow box (after the name of its discoverer) is similar to sequences found at corresponding positions in many eukaryotic promoters.

The positions of the promoter sequences determine where and on which strand the RNA polymerase begins synthesis. Experimental evidence supports the functional importance of the – 10 and – 35 promoter elements.

First, genes with promoter elements that differ from the consensus sequences are transcribed less efficiently than genes whose promoters match the consensus sequence more closely.

Second, mutations induced in either the – 35 or – 10 consensus sequences have strong effects on promoter function.

Third, the sites at which RNA polymerase binds to promoters have been directly identified by foot-printing experiments, widely used to determine the sites at which proteins bind to DNA (Fig. 15.7).

In these experiments, a DNA fragment is radiolabeled at one end. The labelled DNA is incubated with the protein, for example RNA polymerase, and then subjected to partial digestion with DNase. The method is based on the principle that the regions of DNA to which the protein binds are protected from DNase digestion. A parallel sample of DNA that was not incubated with protein is digested with DNase.

The regions of DNA with bound protein can be identified by comparison of the digestion products from protein-bound DNA and DNA without protein. Such foot-printing analysis has shown that RNA polymerase generally binds to promoters over approximately a 60 base pair region, extending from – 40 to + 20, that is, from 40 nucleotides upstream to 20 nucleotides downstream of the transcription start site. The sigma (σ factor) subunit of RNA polymerase binds specifically to sequences in both the – 35 and – 10 promoter regions, indicating the importance of these regions in promoter function.

Initiatie van transcriptie:

In absence of sigma subunit, RNA polymerase can bind non-specifically to DNA with low affinity. Sigma plays a crucial role in directing the polymerase to promoters by binding specifically to both the – 35 and – 10 sequences, leading to initiation of transcription at the beginning of a gene. The initial binding between the polymerase and promoter is referred to as closed-promoter complex because the DNA is not unwound.

The polymerase then unwinds about 15 bases of DNA around the initiation site to form an open-promoter complex and single stranded DNA is made available for transcription. The first nucleoside triphosphate is placed at the site. The next nucleotide in line is joined to the 3′ carbon of the ribose, and so forth. Transcription is initiated by the joining of two free NTPs at the + 1 site.

Chain Elongation:

After addition of about the first ten nucleotides, sigma is released from the polymerase shown in Fig. 15.6. The polymerase then moves along the DNA template strand, adding nucleotides to the 3′ end of the growing RNA chain. Thus RNA chains grow in the 5′ to 3′ direction similar to what is observed in DNA synthesis.

As it moves, the polymerase unwinds the template DNA over about 17 base pairs (less than two turns of the double helix) in the region of transcription. After RNA polymerase has passed, the DNA strands reform the duplex.

Chain Termination:

The RNA chain continues to grow until the RNA polymerase encounters a termination signal. Then transcription stops, the RNA chain is released from the polymerase, and the enzyme dissociates from its DNA template. The most common type of termination signal in E. coli consists of a symmetrical inverted repeat of a GC-rich sequence followed by 4 or more A residues.

Transcription of the GC-rich inverted repeat produces a segment in the growing RNA chain that can form a stem loop structure by complementary base pairing (Fig. 15.8).

The formation of a self-complementary structure dissociates the chain from the DNA template and terminates transcription. There are other types of transcription termination signals in prokaryotes as well as eukaryotes that involve binding of proteins to specific DNA sequences for chain termination, instead of formation of the stem-loop structure in RNA.

Transcription in eukaryotisch:

There are two major differences between prokaryotic and eukaryotic transcription systems.

First, a single RNA polymerase is able to transcribe all genes in bacteria, whereas eukaryotic cells have multiple different RNA polymerases that transcribe distinct classes of genes.

Second, eukaryotic RNA polymerases do not bind directly to promoter sequences, but interact with a number of proteins to specifically initiate transcription. The complexity of the transcription process in eukaryotes is presumed to be related with the regulation of gene expression required to control activities of many different cell types in multicellular forms.

Three distinct nuclear RNA polymerases transcribe different classes of genes in eukaryotic cells (Table).

RNA polymerase II transcribes protein coding genes in nucleus to yield mRNAs RNA polymerases I and III transcribe ribosomal RNAs (rRNAs) and transfer RNAs (tRNAs). The three largest species of tRNAs are transcribed by RNA polymerase I.

The genes for transfer RNA and the smallest species of ribosomal RNA (5S rRNA), as well as some small nuclear (snRNAs) and cytoplasmic RNAs (scRNAs) involved in splicing and protein transport are transcribed by RNA polymerase III. In addition, mitochondria and chloroplasts contain separate RNA polymerases similar to bacterial RNA polymerases that specifically transcribe DNA in these organelles.

Transcription by RNA Polymerase II:

The different mode of action of transcription in eukaryotic cells was noted in 1979 when it was found that RNA polymerase II is able to initiate transcription only if additional proteins are added to the reaction. In contrast with the bacterial sigma factors, transcription in eukaryotic cells requires distinct initiation factors that were not associated with the polymerase.

Specific proteins acting as transcription factors have now been identified that are required by RNA polymerase II to initiate transcription. Two types of transcription factors have been defined: general transcription factors involved in transcription from all polymerase II promoters additional transcription factors involved in control of expression of individual genes.

Experiments using in vitro systems have indicated that five general transcription factors are required for initiation of transcription by RNA polymerase II. The promoters of many genes transcribed by polymerase II contain a sequence similar to TATAA 25 to 30 nucleotides upstream of the transcription start site.

This sequence referred to as the TATA box is similar to the -10 sequence of bacterial promoters and is involved in initiation of transcription as follows: first, a general transcription factor called TFIID (TF indicates transcription factor, II denotes polymerase II) binds to the TATA box. TFIID has multiple subunits including the TATA-binding protein (TBP).

The TBP binds specifically to the TATAA consensus sequence and 10-12 other polypeptides called TBP-associated factors (TAFs). Second, TBP binds to a second general transcription factor (TFIIB) forming a TBP-TFIIB complex at the promoter. Following recruitment of RNA polymerase II to the promoter, two additional factors (TFIIE and TFIIH) are required for initiation of transcription.

Two subunits of TFIIH are helicase that unwind DNA around initiation site, while another subunit is a protein kinase that phosphorylates repeated sequences in the largest subunit of RNA polymerase II. In spite of the development of in vitro systems, much remains to be elucidated about polymerase II transcription in eukaryotic cells.

Transcription by RNA Polymerases I and III:

Like RNA polymerase II, the other two polymerases I and III also require additional transcription factors to associate with appropriate promoter sequences. Although the three eukaryotic polymerases recognise distinct types of promoters, a common transcription factor, the TATA- binding protein (TBP) seems to be required for initiation of transcription by all 3 polymerases.

RNA polymerase I transcribes ribosomal RNA genes which are present in tandem repeats, to yield a large 45S pre-rRNA, which is then processed to derive the 28S, 18S and 5.8S rRNAs (Fig. 15.9).

The promoter of rRNA genes consists of 150 base pairs just upstream of the transcription initiation site. These promoter sequences are recognised by two transcription factors, UBF (upstream binding factor) and SL1 (selectivity factor 1) which bind to the promoter and then recruit polymerase I to form an initiation complex.

One of the four protein subunits of the SL1 transcription factor is TBP. Thus, TBP is a common transcription factor required by all 3 types of eukaryotic RNA polymerases. The promoter of ribosomal RNA genes does not contain TATA box, therefore, TBP does not bind to specific promoter sequences. Thus TBP associates with ribosomal RNA genes through the binding of other proteins in the SL1 complex to the promoter.

The genes for tRNAs, 5S rRNA and some of the small RNAs involved in splicing and protein transport are transcribed by Polymerase III. These genes are characterised by promoters that lie within, and not upstream of the transcribed sequence.

The process of termination of transcription was found out from experiments in prokaryotes in which nucleus is not bound by a membrane. Therefore, synthesis of proteins on ribosomes occurs simultaneously with synthesis of mRNA on DNA.

Visualisation of Transcription:

The idea of visualizing gene transcription originally arose from light microscopic studies of lampbrush chromosomes in amphibian oocytes performed by Callan and Lloyd, and Gall in the 1960’s similar studies were done on the puffed polytene chromosomes of insects by Beermann and his colleagues. Oocyte-chromosomes are highly extended in the lampbrush state and contain thousands of chromosomal loci active in RNA synthesis.

Another favourable attribute of oocytes is that there is amplification (manifold increase) of rRNA genes during early oogenesis giving rise to hundreds of extra nucleoli in a nucleolus. In this system, transcription of ribosomal cistrons has been visualised.

During transcription on oocyte lampbrush chromosomes, the DNA in the condensed, bead­like chromomere unravels and is spun out into a loop and transcribed. The loop axis becomes covered by the transcribed RNA fibrils embedded in a protein matrix (Fig. 15.12). At the base of each RNP (ribonucleoprotein) fibril, an RNA polymerase molecule is attached. In male meiosis and somatic cells transcription produces fine hair-like outgrowths from the chromosomes (Fig. 15.13).

Puffing in the giant polytene chromosomes in the salivary glands of insects represents a direct way of correlating chromosome structure with gene transcription. Puff formation indicates genes that are actively transcribing RNA which would be translated into salivary proteins. Further work of Grossbach (1969) and others made it possible to relate the syn thesis of a specific protein with a specific puff.

In 1969 Miller and Beatty developed a spreading technique for chromatin by which nascent RNP transcripts could be visualised in the electron microscope. The technique has since been applied to various materials. It allows us to visualize the spatial relationships between DNA, RNA polymerase and the RNA transcripts in situ.

EM studies have confirmed that most of the DNP (de-oxy-ribonucleoprotein) fibrils are entangled in the chromomeric mass and only a small proportion is extended into lateral loops. The initiation and termination sites for transcription are located at the two ends of the loop i.e., the thick and thin insertion sites of the loop.

The lateral RNP fibrils which contain the nascent RNA transcripts are of increasing length. One loop is said to represent one transcriptional unit. Many times an active loop shows tandemly arranged transcription units separated by spacer regions (Fig. 15.14). The spacers represent non-transcribed regions. Up to 5 transcriptional units may be present on a loop the loop is therefore a multi-gene structure.

These authors also found initiation sites of two transcriptional units overlapping each other. The drug actinomycin-D which inhibits transcription removes RNP fibrils from the template and causes loops to collapse.

The initial products of transcription observed in EM are longer than the average hnRNA molecules isolated by biochemical techniques. Similar studies on transcription have also been conducted on interphase nuclei of somatic cells in some organisms.

Inhibitors of Transcription:

Several compounds can inhibit transcription of DNA by RNA polymerase. One group of compounds acts by binding non-covalently to the DNA template and modifying its structure the other group binds to the RNA polymerase and inhibits its catalytic function. The most important inhibitor is actinomycin-D (AMD), an antibiotic produced by streptomyces.

Its phenoxazene ring intercalates between two GC pairs, while its two peptide side chains form H-bonds with guanine bases and project into minor groove of the double helix.

AMD does not interfere with the binding of RNA polymerase to DNA but inhibits chain elongation by preventing movement of core enzyme along the template. AMD does not interfere with replication of DNA. Aflatoxin, ethidium bromide and 2- acetyl-amino-fluorine also inhibit transcription by binding to DNA.

A group of bacterial antibiotics called rifamycins act by inhibiting bacterial RNA polymerases. One such compound known as rifampicin binds non-covalently to the β subunit of RNA polymerase so that chain initiation is inhibited, but does not affect chain elongation, α- amanitin blocks one of the RNA polymerase enzymes present in eukaryotic cells but bacterial mitochondrial or chloroplast RNA polymerases are not affected by it.


Comprehensive analysis of translation from overexpressed circular RNAs reveals pervasive translation from linear transcripts

Circular RNAs (circRNAs) encompass a widespread and conserved class of RNAs, which are generated by back-splicing of downstream 5' to upstream 3' splice sites. CircRNAs are tissue-specific and have been implicated in diseases including cancer. They can function as sponges for microRNAs (miRNAs) or RNA binding proteins (RBPs), for example. Moreover, some contain open reading frames (ORFs) and might be translated. The functional relevance of such peptides, however, remains largely elusive. Here, we report that the ORF of circZNF609 is efficiently translated when expressed from a circZNF609 overexpression construct. However, endogenous proteins could not be detected. Moreover, initiation of circZNF609 translation is independent of m6A-generating enzyme METTL3 or RNA sequence elements such as internal ribosome entry sites (IRESs). Surprisingly, a comprehensive mutational analysis revealed that deletion constructs, which are deficient in producing circZNF609, still generate the observed protein products. This suggests that the apparent circZNF609 translation originates from trans-splicing by-products of the overexpression plasmids and underline that circRNA overexpression constructs need to be evaluated carefully, particularly when functional studies are performed.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.

Figuren

Overexpressed circZNF609 is translated. (…

Overexpressed circZNF609 is translated. ( EEN ) circZNF609 contains an ORF upon circularization.…

circZNF609 is translated independently of…

circZNF609 is translated independently of METTL3 activity. ( EEN ) Western blot of…

circZNF609 is not translated from…

circZNF609 is not translated from linear cis -splicing RNA products. ( EEN )…

Analysis of circZNF609 UTR and…

Analysis of circZNF609 UTR and ORF sequences. ( EEN ) Schematic overview of…

No evidence for exogenous in…

No evidence for exogenous in vitro transcribed (IVT) circZNF609 translation. ( EEN )…

circZNF609 protein products are most…

circZNF609 protein products are most likely generated from splicing by-products. ( EEN )…


Bekijk de video: Enzyme - Aufbau und Wirkungsweise Schlüssel-Schloss-Prinzip; Substrat- u. Wirkungsspezifität 25 (December 2021).