Informatie

Kun je DNA seq doen met Microarray?


Is het mogelijk om de volledige DNA-sequencing met Microarray te doen of moet je daarvoor Sanger- of NGS-methoden gebruiken?


Microarrays vangen over het algemeen genen op producten, zoals mRNA (via cDNA), die uitgebreid zijn verwerkt. Hierdoor verlies je genetische informatie zoals introns of regulerende elementen. In feite, waar je uiteindelijk mee zou eindigen, is de transcriptoom van het organisme, en het zou onmogelijk zijn om het DNA hieruit te sequensen. NGS-methoden zijn hiervoor nog steeds superieur, en hier is bijvoorbeeld een goed overzicht van de voordelen van RNAseq ten opzichte van microarray. Om het DNA te sequencen zal je waarschijnlijk NGS gebruiken.

Bron: JCI


Het coderende en het niet-coderende transcriptoom

DNA-microarrays

DNA-microarrays (of DNA-chips) zijn de afgelopen twee decennia de meest gebruikte techniek geweest om de cellulaire abundanties van transcriptsoorten wereldwijd te volgen. Een DNA-microarray is een verzameling microscopisch kleine DNA-spots die aan een vast oppervlak zijn bevestigd. Elke DNA-plek bevat vele duizenden kopieën van een specifieke DNA-sequentie, ook wel probes genoemd. Deze komen meestal overeen met een korte sectie van een gen - meestal aan het 3'-uiteinde. Elke microarray omvat één of enkele probesets voor elk ondervraagd gen. Deze worden gebruikt om een ​​cDNA-monster (het doelwit) onder zeer stringente omstandigheden te hybridiseren. Probe-doelhybridisatie wordt meestal gedetecteerd en gekwantificeerd door detectie van met fluorofoor, zilver of chemiluminescentie gelabelde doelen om de relatieve overvloed aan transcripten in het doelmonster te bepalen. Gegevens over ongeveer 700.000 monsterhybridisaties uitgevoerd op DNA-microarrays zijn toegankelijk via de databases Gene Expression Omnibus (GEO) bij NCBI en ArrayExpress bij EBI.

Omdat DNA-microarrays het spotten van nucleotideprobes vereisen die overeenkomen met bekende transcripten, kunnen alleen de abundanties van deze transcripten worden gevolgd. Kwantificering van voorheen onbekende transcripten - vaak specifiek voor het specifieke celtype dat wordt ondervraagd, en daarom bijzonder relevant voor het fenotype van dit celtype - is onmogelijk. Bovendien worden probes gewoonlijk gedeeld tussen meerdere splitsingsvormen van hetzelfde gen, en tenzij specifieke array-ontwerpen worden gebruikt, is het onmogelijk om de abundanties van individuele alternatieve transcript-isovormen uit de algehele genexpressie te deconvolueren.


Kun je DNA seq doen met Microarray? - Biologie

In elk type cel, zoals een spiercel of een huidcel, worden verschillende genen tot expressie gebracht (aangezet) of tot zwijgen gebracht (uitgeschakeld). Als de cellen die aan staan ​​muteren, kunnen ze, afhankelijk van de rol die ze in de cel spelen, ervoor zorgen dat de cel abnormaal wordt en zich ongecontroleerd deelt, waardoor kanker ontstaat.

Door te identificeren welke genen in de kankercellen abnormaal werken, kunnen artsen kanker beter diagnosticeren en behandelen. Een manier waarop ze dit doen, is door een DNA-microarray te gebruiken om de expressieniveaus van genen te bepalen. Wanneer een gen in een cel tot expressie wordt gebracht, genereert het boodschapper-RNA (mRNA). Overexpressie genen genereren meer mRNA dan onderexpressie genen. Dit kan worden gedetecteerd op de microarray.

De eerste stap bij het gebruik van een microarray is het verzamelen van gezonde en kankerachtige weefselmonsters van de patiënt. Op deze manier kunnen artsen kijken welke genen in de gezonde cellen worden aan- en uitgeschakeld in vergelijking met de kankercellen. Zodra de weefselmonsters zijn verkregen, wordt het boodschapper-RNA (mRNA) uit de monsters geïsoleerd. Het mRNA is kleurgecodeerd met fluorescerende tags en wordt gebruikt om een ​​DNA-kopie te maken (het mRNA van de gezonde cellen is groen geverfd, het mRNA van de abnormale cellen is rood geverfd).

De DNA-kopie die wordt gemaakt, complementair DNA (cDNA) genoemd, wordt vervolgens op de microarray aangebracht. Het cDNA bindt aan complementaire basenparen op elk van de plekken op de array, een proces dat bekend staat als hybridisatie. Op basis van hoe het DNA aan elkaar bindt, zal elke vlek rood, groen of geel (een combinatie van rood en groen) lijken wanneer ze met een laser worden gescand.

• Een rode vlek geeft aan dat dat gen sterk tot expressie kwam in kankercellen. (In uw experiment zullen deze vlekken donkerroze zijn.)

• Een groene vlek geeft aan dat dat gen sterk onderdrukt werd in kankercellen. (In uw experiment zullen deze vlekken lichtroze zijn.)

• Als een vlek geel wordt, betekent dit dat dat gen niet sterk tot expressie werd gebracht en niet sterk werd onderdrukt in kankercellen. (In uw experiment zullen deze vlekken duidelijk zijn.)

• Een zwarte vlek geeft aan dat geen van het cDNA van de patiënt zich heeft gebonden aan het DNA in het gen dat zich op die plek bevindt. Dit geeft aan dat het gen inactief is. (Alle genen in uw experiment zijn actief.)


Implementatie

MochiView is geschreven in Java en kan worden gebruikt met elk besturingssysteem dat Java versie 1.6 of hoger ondersteunt. Om soepel door het genoom bladeren (door gegevens in cache te plaatsen) en het importeren van grote bestanden te vergemakkelijken, heeft MochiView hardware nodig met minimaal 1 GB geheugen. Veel genoombrowsers introduceren een extra laag complexiteit door de gebruiker te verplichten een externe database te installeren of gegevens op een op afstand gehoste server op te slaan. MochiView omzeilt dit probleem door de Java DB-database transparant in de software op te nemen (specifieke kenmerken van het MochiView-softwareontwerp worden beschreven in de MochiView-handleiding). De database-architectuur is ontworpen om goed te schalen, zelfs met zeer grote hoeveelheden gegevens. De database wordt voornamelijk beperkt door de beschikbare ruimte op de harde schijf. In de praktijk kunnen databasegroottes variëren van enkele megabytes tot vele gigabytes, afhankelijk van de grootte van het genoom en de hoeveelheid gegevens. MochiView kan meerdere databases onderhouden en bevat een hulpprogramma voor het importeren/exporteren van databases om het delen van gecomprimeerde databases (en plotconfiguraties) tussen gebruikers te vergemakkelijken. Elke database kan door de gebruiker worden gevuld met een of meer genomen door de genoomsequentie te importeren als een of meer bestanden in FASTA-indeling. Aanvullende op genoomcoördinaten gebaseerde gegevens kunnen vervolgens worden geüpload in de veelgebruikte GFF-, BED- of WIG-indelingen of met behulp van MochiView's eigen aangepaste bestandsindelingen. Tips voor het opzetten van een database vindt u op de website van MochiView.


Wat hebben microarrays voor ons gedaan?

Microarray-technologie bracht functionele genomica, een discipline die ernaar streeft de rol van genen in cellulaire processen te identificeren, in de schijnwerpers omdat het functionele analyse van genoombrede differentiële RNA-expressie tussen verschillende monsters, toestanden en celtypen mogelijk maakte om inzicht te krijgen in moleculaire mechanismen die reguleren het lot van de cellen, ontwikkeling en ziekteprogressie. Microarray-gegevens worden gebruikt om een ​​profiel van genexpressie te genereren, dat dient als een determinant van eiwitniveaus en dus cellulaire functie tussen biologische monsters. Een enkel experiment kan informatie verschaffen over de expressie van duizenden genen, vrijwel het gehele menselijke genoom, om expressiepatronen tussen twee toestanden te vergelijken. Microarray-experimenten kunnen aangeven welke genen omhoog of omlaag worden gereguleerd tussen monsters van normaal en ziek weefsel, of twee monsters in afwezigheid en aanwezigheid of een bepaalde stimuli. Het is gemakkelijk in te zien waarom deze technologie aantrekkelijk zou kunnen zijn voor het begrijpen van complexe biologische systemen, evenals voor het ontdekken van geneesmiddelen, ziektediagnose en nieuwe genidentificatie.

In de volgende aflevering in deze serie Inleiding tot DNA-microarrays, bespreek ik verschillende soorten oligonucleotide-expressie-arrays, hoe ze worden gemaakt en hun algemene toepassingen. Blijf kijken…


Bloedplaatjesgenomica en Proteomics

Ángel Garcia, . Steve P. Watson, in Bloedplaatjes (tweede editie), 2007

Een DNA-microarray

DNA-microarrays vertegenwoordigen een relatief snelle en kosteneffectieve manier om genexpressie op genomische schaal te bestuderen. Expressiegegevens kunnen worden gegenereerd voor duizenden genen in veel verschillende celtypen en weefsels die worden blootgesteld aan een verscheidenheid aan stimuli. DNA-microarraytechnologie is gebaseerd op het principe dat elke DNA-streng in een complex monster het vermogen heeft om zijn complementaire sequentie die op een specifiek gebied van de DNA-microarray is geïmmobiliseerd, te herkennen en ermee te hybridiseren. Dergelijke DNA-microarrays worden over het algemeen op twee manieren op glasplaatjes gemaakt: door DNA (vaak polymerasekettingreactie [PCR]-producten of oligonucleotiden) af te drukken met behulp van een robotarrayer, zoals ontwikkeld in het laboratorium van Patrick Brown aan de Stanford University 2 of door ter plaatse synthese van oligonucleotiden met behulp van een proces genaamd fotolithografie, zoals ontwikkeld door Affymetrix. 3 Deze methoden kunnen microarrays produceren met duizenden afzonderlijke DNA-sequenties. Affymetrix GeneChips bevatten bijvoorbeeld 600.000 verschillende oligonucleotiden per vierkante centimeter (www.affymetrix.com).

Het grote voordeel van de door het Brown Laboratory ontwikkelde microarray-technologie is het relatieve gemak waarmee het hele systeem kan worden opgezet in een academisch laboratorium (voor instructies zie www.cmgm.stanford.edu/pbrown), waardoor onderzoekers hun eigen aangepaste microarrays op een kosteneffectieve manier. 9 Voor dergelijke microarrays is elk experiment in het algemeen ontworpen om de relatieve overvloed aan gensequenties tussen twee verschillende DNA- of RNA-monsters te vergelijken (Fig. 5-1A). De twee monsters worden aanvankelijk gelabeld met een andere fluorescerende kleurstof, zoals Cy3 (rood) of Cy5 (groen), en worden vervolgens gemengd en gehybridiseerd met de microarray. Een microscoop wordt gebruikt om de fluorescentie van de twee kleurstoffen voor elke plek te meten, en de rood-tot-groen-verhouding is een maat voor de relatieve abundantie van het gen in de twee nucleïnezuurmonsters. Meerdere experimentele monsters kunnen indirect worden vergeleken door het gebruik van meerdere microarrays, elk gehybridiseerd met één gemeenschappelijk referentiemonster, om normalisatie mogelijk te maken, en één experimenteel monster. 10

Figuur 5-1 . Schematische voorstelling van de twee belangrijkste typen DNA-microarray. A. De gedrukte complementaire DNA (cDNA) of oligonucleotide microarray. In dit voorbeeld tonen 60 dataspots de hybridisatie-efficiëntie aan 60 verschillende gedrukte cDNA's of oligonucleotiden die 60 genen vertegenwoordigen. Een groen signaal geeft een relatief hoge genexpressie in monster 1 aan, een rood signaal geeft een hoge genexpressie in monster 2 aan, een geel signaal geeft in beide monsters gelijkwaardige genexpressie aan en grijs geeft een gebrek aan genexpressie in beide aan. B. De synthetische oligonucleotide-microarray. In dit voorbeeld van het Affymetrix-type microarray wordt elk gen op de microarray weergegeven door een rij van 22 verschillende 25-meer-oligonucleotiden, elk met zijn eigen mismatch-controle in de onderstaande rij. De gegevens voor vier verschillende genen worden getoond, waarbij geel detecteerbare hybridisatie aangeeft en grijs geen hybridisatie. Computationele analyses bepalen of individuele genen "aanwezig" zijn in het mRNA-monster (bijvoorbeeld het gen bovenaan de microarray), "dubbelzinnig" of "afwezig" (bijvoorbeeld het gen onderaan de microarray).

Het belangrijkste voordeel van de synthetische oligonucleotide-arraymethode is de grotere betrouwbaarheid van de gegevens als gevolg van het gebruik van meerdere "oligo's" per gen, inclusief mismatch-controles voor elk. 11 Het nadeel is dat de fabricage van hightech microarrays in de academische setting niet zomaar kan worden gerealiseerd. In plaats daarvan worden DNA-microarrays gekocht van bedrijven zoals Affymetrix. Zoals vermeld, bevatten de Affymetrix GeneChips doorgaans 22 verschillende 25-meer-oligonucleotiden (genaamd sondes) voor elk gen. Voor elk van deze 22 probes wordt ook een mismatch-probe met een enkele centrale nucleotidesubstitutie gesynthetiseerd als controle voor niet-specifieke hybridisatie. Experimenten zijn ontworpen om een ​​enkel DNA- of RNA-monster te analyseren dat fluorescent is gelabeld, gehybridiseerd met de GeneChip en de signalen die worden gedetecteerd door laserconfocale fluorescentiescanning (Fig. 5-1B). De relatief hoge reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van synthetische oligonucleotide-arrays maakt directe vergelijking van gegevens tussen experimenten mogelijk, na normalisatie van de algehele mediaan of gemiddelde intensiteit van elke GeneChip tot een gemeenschappelijke standaard. 10


Nieuwe producten in Transcriptomics

Het uitgelichte product

MY-PCR-voorbereiding

MY-PCR Prep biedt de laboratoriumtechnicus van de moleculaire biologie een "persoonlijke cleanroom" voor gebruik bij de amplificatie van DNA en RNA. Tussen amplificaties kan My-PCR Prep geïrriteerd raken met kortegolf ultraviolette (UV) energie om potentiële verontreinigingen te denatureren en hun vermogen om te worden versterkt te elimineren. De hoofdkamer van MY-PCR Prep is gemaakt van een doorlopend stuk polycarbonaat om te voorkomen dat UV-licht uit de kamer ontsnapt tijdens irritatie. Toegang voor de operator wordt verkregen via de opvouwbare polycarbonaat vleugel aan de voorkant, die overlapt om gaten in de kamer te elimineren tijdens irritatie van UV-licht. Het werkoppervlak is van wit polypropyleen waardoor desinfectie en reiniging eenvoudig zijn. My-PCR Prep is een klasse 100 verticaal laminair flow-werkstation met getimed UV-licht, waardoor het een ideale persoonlijke schone zone is voor het voltooien van polymerasekettingreacties (PCR) en RNA-amplificaties. My-PCR Prep is beschikbaar in 24”, 32” en 48” brede modellen 110V AC.

PCR-voorbereidingswerkstations
Voor info: 877-328-3912
Mystaire

Nauwkeurige tests

De ultragevoelige Precise Assays zijn ontworpen voor gerichte RNA-seq-experimenten met behulp van enkele cellen. Gebaseerd op de gepatenteerde Molecular Indexing-technologie, onderzoeken de Precise Assays grote aantallen standaard- of low-input mRNA-monsters van kostbare monsters, of wanneer absolute kwantificering vereist is. De assays combineren moleculaire indexering en monsterindexering in 96- en 384-monsterformaten, waardoor klanten tot 4.608 monsters kunnen sequencen in één sequencing-run zonder te investeren in nieuwe apparatuur of uitgebreide training. Cellular Research werkt samen met Seven Bridges Genomics om klanten een complete analysepijplijn te bieden, die een geïntegreerd cloudgebaseerd dataplatform biedt voor beheer, uitvoering en samenwerking van de RNA-seq-experimenten in een robuust, gebruiksvriendelijk informaticaplatform. Het robuuste ontwerp en de pijplijnen voor gegevensanalyse bieden een eenvoudige kant-en-klare oplossing voor gerichte RNA-seq-experimenten.

RNA-Seq-assays
Voor info: 650-752-6144
Cellulair onderzoek

KAPA Stranded RNA-Seq Kit

Een nieuwe voorbereidingskit voor RNA-bibliotheken voor next-generation sequencing (NGS)-workflows stelt gebruikers in staat om een ​​vollediger beeld van het transcriptoom te genereren door meer zeldzame en unieke transcripten te detecteren. De KAPA Stranded RNA-Seq Kit met RiboErase gebruikt een gerichte enzymatische uitputtingsmethode om ribosomaal RNA (rRNA) te verwijderen en daardoor de efficiëntie van de sequentie te verbeteren. Bij de voorbereiding van RNA-bibliotheken kunnen zelfs kleine hoeveelheden resterend rRNA de sequencing-efficiëntie en gegevenskwaliteit drastisch verminderen. Door gebruik te maken van enzymatische uitputting, vermindert de KAPA Stranded RNA-Seq Kit met RiboErase rRNA met toonaangevende percentages van 99,98%. De kit biedt een alternatief voor mRNA-verrijking, aangezien rRNA-uitputting de analyse van exonische regio's, voorloper-mRNA's en lange niet-coderende RNA's mogelijk maakt. De KAPA Stranded RNA-Seq Kit met RiboErase is beschikbaar voor gebruik met monsters van mensen, muizen en ratten en is robuust en reproduceerbaar met flexibele invoerhoeveelheden. Kits bevatten ook een low-bias engineered enzym genaamd KAPA HiFi en bevatten een gestroomlijnd "with-bead"-protocol.

Transcriptoomtests bij muizen en ratten - 1,0 (MTA 1,0)

Muis- en rattranscriptoomtesten 1.0 zijn krachtige en flexibele hulpmiddelen voor het meten van een breed scala aan expressieveranderingen in de coderende en lange niet-coderende gebieden van de muis- en rattranscriptomen. De Mouse Transcriptome Assay 1.0 (MTA 1.0) en Rat Transcriptome Assay 1.0 (RTA 1.0) bieden een rijke dataset die voldoende is om veranderingen op meerdere niveaus in een enkel experiment te ontcijferen uit verschillende soorten monsters. Met ongeveer tien detectieprobes per exon en vier probes per exon-exon splitsingspunt, genereren deze testen de meest complete, nauwkeurige en reproduceerbare volledige transcriptoomexpressiegegevens met de flexibiliteit om het analyseniveau te selecteren: genniveau, transcriptniveau, eiwitcoderend of lang niet-coderend RNA. Om eenvoudig, snel en naadloos tot biologische inzichten te komen, bevatten de complete muis- en rattentranscriptoomoplossingen intuïtieve analysesoftware die de hoogwaardige expressiegegevens die door de testen worden gegenereerd, in minuten omzet in biologisch betekenisvolle informatie.

Transcriptoomtesten
Voor info: 888-362-2447
Affymetrix

KingFisher Duo Prime-systeem

Laboratoria met een lage en gemiddelde doorvoer hebben nu een alternatief voor handmatige processen en spin-kolommethoden voor nucleïnezuurzuivering, dankzij een nieuw geautomatiseerd systeem. Het nieuwe KingFisher Duo Prime-systeem is ontworpen voor onderzoekslaboratoria en kleine biotechbedrijven die DNA-, RNA- en eiwitzuiveringsprocessen willen vereenvoudigen. Het bouwt voort op de bruikbaarheid van het bestaande KingFisher Duo-systeem om de reproduceerbaarheid te verbeteren en hoogwaardige monsters te leveren met minder tijd en inspanning dan traditionele handmatige methoden. Met de KingFisher Duo duurt het isoleren van DNA uit 12 bloedmonsters slechts 53 minuten en vereist het slechts 15 minuten hands-on tijd, vergeleken met handmatige spin-kolom methoden, die tot 90 minuten hands-on tijd in beslag nemen. Thermo Scientific KingFisher-systemen zijn ontworpen om DNA, RNA en eiwitten te isoleren uit een verscheidenheid aan uitgangsmaterialen, waaronder celvrije lichaamsvloeistoffen, bloed, bacteriën, celculturen, weefsel- en plantenmonsters.

Nucleïnezuur- en eiwitzuiveringssysteem
Voor info: 800-556-2323
Thermo Fisher Scientific

Dien uw persbericht/beschrijving van uw nieuwe product of informatie over productliteratuur in bij [email protected] Bezoek Science New Products voor meer informatie.

Nieuw aangeboden instrumentatie, apparaten en laboratoriummaterialen die van belang zijn voor onderzoekers in alle disciplines in academische, industriële en overheidsorganisaties zijn in deze ruimte te zien. De nadruk wordt gelegd op het doel, de belangrijkste kenmerken en de beschikbaarheid van producten en materialen. Goedkeuring door Science of AAAS van genoemde producten of materialen is niet impliciet. Aanvullende informatie kan worden verkregen bij de fabrikant of leverancier.


RESULTATEN

Transcriptoomgegevens werden verkregen van de twee wortelpuntzones (Fig. 1) via zowel microarray als RNA-Seq. In totaal werden ongeveer 33.500 en 22.700 genen gedetecteerd zoals uitgedrukt in de wortelzones van respectievelijk RNA-Seq en microarray (Gene Expression Omnibus [GEO] accession GSE115555).

Differentieel tot expressie gebrachte genen in de twee wortelzones

Microarray detecteerde in totaal 6351 genen die significant veranderd waren met een vouwverandering van 2 of meer, terwijl RNA-Seq in totaal 6403 genen detecteerde die differentieel tot expressie werden gebracht tussen de twee wortelzones. Van deze twee sets genen werden 4180 genen gewoonlijk geïdentificeerd door beide technieken (Fig. 2A). Van de 6403 genen die werden gedetecteerd door RNA-Seq, waren 2223 genen exclusief voor RNA-Seq bij een veelvoud van verandering van 2 of meer. Van deze 2223 genen waren er echter 771 echt uniek voor RNA-Seq en de overige 1452 genen werden gedetecteerd door microarray, maar passeerden niet de grenswaarde van vouwverandering 2 of hoger (log2 FC ≥1 of ≤1). Expressieniveaus van genen geschat door RNA-Seq waren hoger dan die geschat door microarray. Daarom voldeed een groter aantal genen aan de cut-off-criteria voor fold change in RNA-Seq dan in de microarray. Met verhoogde vereisten voor vouwverandering detecteerde RNA-Seq een groter aantal genen in vergelijking met de microarray (Fig. 2B, C). Bij vouwveranderingsniveaus van 4 en 8 identificeerde RNA-Seq 364 en 63 unieke genen in vergelijking met respectievelijk 41 en zes genen, geïdentificeerd door de microarray (binnenste cirkels in het Venn-diagram Fig. 2). Over het algemeen was RNA-Seq efficiënter in het detecteren van een groter aantal significant veranderde genen in vergelijking met de microarray.

Differentieel tot expressie gebrachte genen in de twee wortelzones waren functioneel verschillend

Verdeling van transcripten in de meest prominente GO-categorieën is samengevat in tabel 1. Opgereguleerde functionele groepen die in tabel 1 worden vermeld, zijn die welke zijn verrijkt in zone 2, waaronder lipidenlokalisatie en -transport, wortelmorfogenese, wortelepidermale celdifferentiatie, celrijping, polypropenoïde biosynthetische proces, wortelhaarceldifferentiatie, trichoblastrijping en secundair metabolisch proces. De gedownreguleerde genen in Zone 2 zijn die genen die zijn verrijkt in wortel Zone 1 (tip). De GO-analyse van deze genen is voornamelijk geclusterd in functionele groepen: celcyclusregulatie, eiwit-DNA-complexassemblage, chromatine-assemblage, DNA-verpakking en metabolisch proces, cytoskeletorganisatie, celdeling, cellulaire componentbiogenese en organisatie (tabel 1).

opgereguleerd gedownreguleerd
GO-term Beschrijving FDR GO-term Beschrijving FDR
GO:0010876 Lipidenlokalisatie 4.00E-16 GO:0051726 Regulering van celcyclus 3.70E-06
GO:0006869 Lipidentransport 1.20E-07 GO:0007049 Celcyclus 3.90E-06
GO:0042221 Reactie op chemische stimulus 8.80E-07 GO:0065004 Eiwit-DNA-complex assemblage 7.50E-05
GO:0009698 Fenylpropanoïde stofwisseling 1.10E-05 GO:0031497 chromatine-assemblage 7.50E-05
GO:0010054 Trichoblast differentiatie 1.80E-05 GO:0006323 DNA-verpakking 0.0001
GO:0006810 Vervoer 2.10E-05 GO:0007166 Aan celoppervlak receptor gekoppelde signaalroute 0.00021
GO:0010015 Wortelmorfogenese 2.10E-05 GO:0006333 Chromatine montage of demontage 0.0003
GO:0051234 Vestiging van lokalisatie 2.20E-05 GO:0007167 Enzym-gekoppelde receptoreiwit-signaleringsroute 0.00046
GO:0010053 Wortel epidermale celdifferentiatie 3.70E-05 GO:007169 Transmembraanreceptoreiwit tyrosinekinase-signaleringsroute 0.00046
GO:0006725 Cellulaire aromatische verbinding metabolisch proces 4.30E-05 GO:022402 Celcyclus proces 0.00063
GO:051179 Lokalisatie 4.80E-05 GO:0051301 Celverdeling 0.00067
GO:050896 Reactie op stimulus 7.20E-05 GO:0006996 organel organisatie 0.0015
GO:0009699 Fenylpropanoïde biosynthetisch proces 8.80E-05 GO:0022607 Assemblage van mobiele componenten 0.0024
GO:0019748 Secundair metabolisch proces 0.0001 GO:0007010 Cytoskelet organisatie 0.0034
GO:0048469 celrijping 0.00011 GO:0048366 bladontwikkeling 0.0055
GO:0048765 Differentiatie van wortelhaarcellen 0.00011 GO:0044085 Biogenese van cellulaire componenten 0.0059
GO:0048764 Trichoblast rijping 0.00011 GO:0016043 Organisatie van mobiele componenten 0.0067
GO:0009664 Plantaardige celwandorganisatie 0.00015 GO:0006259 DNA metabolisch proces 0.0068
GO:0048468 cel ontwikkeling 0.00016 GO:0006325 chromatine-organisatie 0.0073
GO:0022622 Ontwikkeling van het wortelsysteem 0.00023 GO:0048827 Phyllome ontwikkeling 0.0088
  • FDR = valse ontdekkingssnelheid.
  • een Genontologie (GO) analyse van de significant veranderde genen tussen Zone 2 en Zone 1 uitgevoerd met agriGO (Du et al., 2010). Geüpreguleerde functionele groepen zijn die verrijkt in Zone 2 Gedownreguleerde groepen zijn die verrijkt in Zone 1.

Sommige van de genen komen differentieel tot expressie bij hoge vouwniveaus (Tabel 2) en hun functies zoals gedefinieerd in de Arabidopsis TAIR-database (Huala et al., 2001) worden hieronder beschreven.

UP Reg Gene ID Logboek2 FC RNA-Seq Logboek2 FC-microarray Toegangsnummer en korte beschrijving
AT4G40090 10.14 6.17 NM_120175. Arabidopsis thaliana AGP3 (arabinogalactan-proteïne 3) (AGP3) mRNA, complete cd's.
AT1G48750 9.01 5.21 NM_103770. Arabidopsis thaliana proteaseremmer / zaadopslag / lipide-overdrachtseiwit (LTP) familie-eiwit (AT1G48750) mRNA, complete cd's.
AT5G05960 8.93 5.76 NM_120678. Arabidopsis thaliana proteaseremmer / zaadopslag / lipide-overdrachtseiwit (LTP) familie-eiwit (AT5G05960) mRNA, complete cd's.
AT3G18280 8.82 4.93 NM_112712. Arabidopsis thaliana proteaseremmer / zaadopslag / lipide-overdrachtseiwit (LTP) familie-eiwit (AT3G18280) mRNA, complete cd's.
AT1G12040 8.53 7.29 NM_101076. Arabidopsis thaliana LRX1 (LEUCINE-RICH REPEAT/EXTENSIN 1) histidinefosfotransferkinase/eiwitbinding/structureel bestanddeel van celwand (LRX1) mRNA, complete cd's.
AT5G67400 8.46 7.98 NM_126140. Arabidopsis thaliana peroxidase 73 (PER73) (P73) (PRXR11) (AT5G67400) mRNA, complete cd's.
AT1G10380 8.31 5.16 NM_100912. Arabidopsis thaliana Vermeend membraanlipoproteïne-mRNA, complete cd's.
AT3G54590 8.21 5.49 NM_115316. Arabidopsis thaliana ATHRGP1 (HYDROXYPROLINE-RICH GLYCOPROTEIN) structureel bestanddeel van celwand (ATHRGP1) mRNA, complete cd's.
AT3G25930 8.08 5.96 NM_113497. Arabidopsis thaliana universeel stress-eiwit (USP) familie-eiwit (AT3G25930) mRNA, complete cd's.
AT5G65530 8.01 6.86 NM_125951. Arabidopsis thaliana eiwitkinase, vermoedelijk (AT5G65530) mRNA, complete cd's.
AT1G02900 7.84 6.83 NM_100171. Arabidopsis thaliana RALF1 (RAPID ALKALINISATION FACTOR 1) signaaltransducer (RALF1) mRNA, complete cd's.
AT1G30870 7.76 6.18 NM_102824. Arabidopsis thaliana kationisch peroxidase, vermoedelijk (AT1G30870) mRNA, complete cd's.
AT1G48930 7.68 7.19 NM_103786. Arabidopsis thaliana AtGH9C1 (Arabidopsis thaliana glycosyl hydrolase 9C1) katalytisch/hydrolase, hydrolyserende O-glycosyl verbindingen (AtGH9C1) mRNA, complete cd's.
AT5G58010 7.68 5.77 NM_125186. Arabidopsis thaliana basic helix-loop-helix (bHLH) familie eiwit (AT5G58010) mRNA, complete cd's.
AT1G75750 7.64 7.02 NM_106225. Arabidopsis thaliana GASA1 (GAST1 PROTEIN HOMOLOG 1) (GASA1) mRNA, complete cd's.
AT5G66815 7.54 5.29 NM_126080. Arabidopsis thaliana C-TERMINAAL GECODEERD PEPTIDE 5, CEP5 transmembraan-eiwit (AT5G66815) mRNA, complete cd's.
AT3G21550 7.51 3.09 NM_113050. Arabidopsis thaliana DUF679 DOMEIN MEMBRAAN EIWIT 2, ATDMP2, DMP2, DUF679 DOMEIN MEMBRAAN EIWIT 2 (AT3G21550) mRNA, complete cd's.
AT3G10340 7.40 5.17 NM_111869. Arabidopsis thaliana PAL4 (Fenylalanine ammoniak-lyase 4) ammoniak ligase/ammoniak-lyase/katalytisch (PAL4) mRNA, complete cd's.
AT4G02270 7.39 6.70 NM_116460. Arabidopsis thaliana pollen Ole e 1 allergeen en extensine familie eiwit (AT4G02270) mRNA, complete cd's.
AT5G44130 7.37 5.33 NM_123780. Arabidopsis thaliana FLA13 (FASCICLIN-LIKE ARABINOGALACTAN PROTEIN 13 PRECURSOR) (FLA13) mRNA, complete cd's.
AT5G19520 −5.59 −4.39 NM_121957. Arabidopsis thaliana MSL9 (MECHANOGEVOELIG KANAAL VAN KLEIN GELEIDING-LIKE 9) mechanisch-gated ionkanaal (MSL9) mRNA, complete cd's.
AT3G13175 −5.61 −3.43 NM_112157. Arabidopsis thaliana onbekend eiwit (AT3G13175) mRNA, complete cd's.
AT2G38810 −5.72 −5.54 NM_129438. Arabidopsis thaliana HTA8 (HISTONE H2A 8) DNA-bindend (HTA8) mRNA, complete cd's.
AT5G13870 −5.78 −4.06 NM_121390. Arabidopsis thaliana EXGT-A4 (ENDOXYLOGLUCAN TRANSFERASE A4) hydrolase, werkt op glycosylbindingen/hydrolase, hydrolyseert O-glycosylverbindingen / x> (EXGT-A4) mRNA, complete cd's.
AT1G57590 −5.79 −4.63 NM_104556. Arabidopsis thaliana carboxylesterase (AT1G57590) mRNA, complete cd's.
AT3G51280 −5.99 −3.91 NM_114987. Arabidopsis thaliana mannelijke steriliteit MS5, vermoedelijk (AT3G51280) mRNA, complete cd's.
AT2G23050 −6.26 −5.40 NM_127869. Arabidopsis thaliana NPY4 (NAAKTE PINS IN YUC MUTANTS 4) eiwitbinding/signaaltransducer (NPY4) mRNA, complete cd's.
AT2G22610 −6.30 −2.95 NM_127826. Arabidopsis thaliana kinesine motor eiwit-gerelateerd (AT2G22610) mRNA, complete cd's.
AT2G34020 −6.35 −3.11 NM_128953. Arabidopsis thaliana calciumionbinding (AT2G34020) mRNA, complete cd's.
AT5G48940 −6.38 −4.74 NM_124271. Arabidopsis thaliana leucine-rijke repeat transmembraanproteïnekinase, vermoedelijk (AT5G48940) mRNA, complete cd's.
AT2G20515 −6.48 −3.32 NM_127611. Arabidopsis thaliana pollen Ole e I familie allergeen eiwit (AT2G20515) mRNA, complete cd's.
AT2G25060 −6.51 −4.12 NM_128063. Arabidopsis thaliana plastocyanine-achtig domeinbevattend eiwit (AT2G25060) mRNA, complete cd's.
AT3G52910 −6.52 −2.97 Op 3g52910. 68416.t05420 tot expressie gebracht eiwit bijna identiek aan transcriptieactivator GRL4 [Arabidopsis thaliana] GI:21539886 (niet gepubliceerd)
AT2G45050 −6.81 −5.12 NM_130069. Arabidopsis thaliana zinkvinger (GATA type) familie eiwit (AT2G45050) mRNA, complete cd's.
AT5G60530 −6.88 −4.32 NM_125446. Arabidopsis thaliana late embryogenese overvloedig eiwit-gerelateerd/LEA-eiwit-gerelateerd (AT5G60530) mRNA, complete cd's.
AT5G10130 −7.22 −5.16 NM_121051. Arabidopsis thaliana pollen Ole e 1 allergeen en extensine familie eiwit (AT5G10130) mRNA, complete cd's.
AT1G18250 −7.39 −5.43 NM_001035987. Arabidopsis thaliana ATLP-1 (ATLP-1) mRNA, complete cd's.
AT5G28640 −7.86 −5.71 NM_122747. Arabidopsis thaliana AN3 (ANGUSTIFOLIA 3) eiwitbinding/transcriptie co-activator (AN3) mRNA, complete cd's.
AT2G28790 −7.93 −5.44 NM_128438. Arabidopsis thaliana osmotine-achtig eiwit, vermoedelijk (AT2G28790) mRNA, complete cd's.
AT1G52070 −9.15 −5.77 NM_104088. Arabidopsis thaliana jacaline lectine familie eiwit (AT1G52070) mRNA, complete cd's.

Wortelzone 2 was verrijkt met genen die betrokken zijn bij secundaire groeimetabolische processen zoals respons op stimulus, celverlenging, differentiatie en wortelhaarontwikkeling en rijping (tabel 1). Genen in deze categorieën omvatten arabinogalactan-eiwitten (AT4G40090, AT5G44130), basisch helix-loop-helix (bHLH) eiwit (AT5G58010) en de leucine-rijke herhalingen (LRX)/extensine-familie-eiwitten (AT1G12040, AT4G02270). Een andere reeks genen die sterk verrijkt zijn in Zone 2 zijn de eiwitten van het lipidemetabolisme: de proteaseremmer/zaadopslag/lipidetransfereiwit (LTP) familie-eiwitten (AT1G48750, AT5G05960, AT3G18280). Ook werden peroxidasen geïnduceerd die specifiek zijn voor wortelhaar (AT5G67400, AT1G30870) en het celsignaleringsgen (AT1G02900).

Root Zone 1 was verrijkt met genen die betrokken zijn bij primaire groeimetabolismes zoals cellulaire componenten, celcyclus en DNA-metabolisme. Genen verrijkt in wortelpunt Zone 1 omvatten: celwandbiogenese en organisatiegenen (AT5G13870, AT1G57590) regulatie van genexpressie (AT3G52910, AT2G45050) ATP/microtubuli-binding (AT2G22610, AT5G48940) celdeling/celcyclus (AT3G51280, AT2G28790) en respons aan mechanische, lichte en organismestimulus (AT2G23050 [gravitropisme], AT2G45050 [licht], AT5G19520 [mechanisch], AT1G18250 en AT2G28790 [pathogeen]). Andere genen verrijkt in Zone 1 omvatten die met voorspelde functie van ionenbinding en transport (AT5G19520, AT2G34020, AT2G25060), samen met late embryogenese overvloedig (LEA) eiwit (AT5G60530).

RNA-Seq-geïdentificeerde unieke/nieuwe genen niet geïdentificeerd door microarray

RNA-Seq detecteerde 771 genen die niet werden gedetecteerd door de microarray (bijlage S1). Driehonderd negenendertig genen werden verrijkt in wortelpunt Zone 2 (opgewaardeerd in Zone 2) en 432 genen werden verrijkt in wortelpunt Zone 1 (gedownreguleerd in Zone 2) (bijlage S1). GO-analyse van deze genen clusterde de genen in de volgende groepen: structureel bestanddeel van ribosoom, structurele moleculaire activiteit en translatie-verlengingsfactoractiviteit. De top 20 genen met de hoogste vouwverandering zijn weergegeven in Tabel 3. Deze omvatten het eiwit van de extensinefamilie (AT3G09925), fosfaattransporter 1 (AT5G43350), proteïne 17 van de eierstokfamilie (AT2G30395), pectinelyase-achtig superfamilie-eiwit (AT4G23500), cytokininerespons factor 4 (AT4G27950), eiwit-kinase-familie-eiwit (AT5G07140), transducine-familie-eiwit (AT4G33270) en defensine-achtig eiwit (AT4G22235).

Gen Logboek2 FC Symbool Korte beschrijving
AT5G07322 7.72 NA Ander RNA [Bron:TAAIRAcc:AT5G07322]
AT3G09925 7.35 NA Pollen Ole e 1 allergeen en extensine familie eiwit [Bron:TAIRAcc:AT3G09925]
AT1G28815 7.15 NA Onbekend eiwit heeft vijf BLAST-hits op vijf eiwitten in twee soorten: Archae - 0 Bacteriën - 0 Metazoa - 0 Fungi - 0 Plants - 5 Viruses - 0 Other Eukaryoten - 0 (bron: NCBI BLink). [Bron:TAAIRAcc:AT1G28815]
AT5G48920 7.06 TED7 Tracheair element differentiatie-gerelateerd 7 [Bron:TAAIRAcc:AT5G48920]
AT5G43350 6.94 ATPT1 Fosfaattransporter 11 [Bron: TAIRAcc: AT5G43350]
AT2G30395 6.92 ATOFP17 Eiwit 17 van de eierstokfamilie [Bron: TAIRAcc: AT2G30395]
AT3G24460 6.81 NA Serinc-domein dat serine en sfingolipide biosynthese-eiwit bevat [Bron: TAIRAcc: AT3G24460]
AT5G57887 6.63 NA Onbekend eiwit FUNCTIES IN: moleculaire_functie onbekend BETROKKEN BIJ: biologisch_proces onbekend GEVESTIGD IN: endomembraansysteem Heeft 30201 Blast hits tot 17322 eiwitten in 780 soorten: Archae - 12 Bacteriën - 1396 Metazoa - 17338 Schimmels - 3422 /…/ - 5037 Virussen - 0 Andere Eukaryoten - 2996 (bron: NCBI BLink). [Bron:TAAIRAcc:AT5G57887]
AT2G28671 6.50 NA Unknown protein FUNCTIONS IN: molecular_function unknown INVOLVED IN: biological_process unknown LOCATED IN: cellular_component unknown Has 30201 Blast hits to 17322 proteins in 780 species: Archae - 12 Bacteria - 1396 Metazoa - 17338 Fungi - /…/ Plants - 5037 Viruses - 0 Other Eukaryotes - 2996 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT2G28671]
AT1G77885 6.45 NA Unknown protein BEST Arabidopsis thaliana protein match is: unknown protein (TAIR:AT1G22065.1) Has 35333 Blast hits to 34131 proteins in 2444 species: Archae - 798 Bacteria - 22429 Metazoa - 974 Fungi - 991 Plants - 531 Viruses - 0 Other Euk /…/s - 9610 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT1G77885]
AT5G19230 6.17 NA Glycoprotein membrane precursor GPI-anchored [Source:TAIRAcc:AT5G19230]
AT4G23500 5.85 NA Pectin lyase-like superfamily protein [Source:TAIRAcc:AT4G23500]
AT4G27950 −4.04 CRF4 Cytokinin response factor 4 [Source:TAIRAcc:AT4G27950]
AT3G63430 −4.10 TRM5 TON1 RECRUITING MOTIF 5, TRM5 zinc finger CCCH domain protein(source:Araport11)
AT5G01445 −4.13 NA Unknown protein FUNCTIONS IN: molecular_function unknown INVOLVED IN: biological_process unknown LOCATED IN: mitochondrion Has 5 Blast hits to 5 proteins in 2 species: Archae - 0 Bacteria - 0 Metazoa - 0 Fungi - 0 Plants - 5 Viruses - 0 Ot /…/karyotes - 0 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT5G01445]
AT5G41071 −4.20 NA Unknown protein Has 30201 Blast hits to 17322 proteins in 780 species: Archae - 12 Bacteria - 1396 Metazoa - 17338 Fungi - 3422 Plants - 5037 Viruses - 0 Other Eukaryotes - 2996 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT5G41071]
AT5G07140 −4.50 NA Protein kinase superfamily protein [Source:TAIRAcc:AT5G07140]
AT4G33270 −4.74 CDC20.1 Transducin family protein / WD-40 repeat family protein [Source:TAIRAcc:AT4G33270]
AT4G22235 −5.24 NA Arabidopsis defensin-like protein [Source:TAIRAcc:AT4G22235]
AT2G22496 −5.56 MIR779A MIR779a miRNA [Source:TAIRAcc:AT2G22496]

Furthermore, a total of 107 novel transcripts were identified that were mapped to the genome but did not have any gene annotation in the reference genome database. Out of these 107 transcripts, 19 were found to be significantly changed between the zones at FDR < 0.01 (Appendix S2).

Additional information from RNA-Seq on differentially expressed genes

In addition to the differential gene expression data, RNA-Seq provided information on isoforms, coding DNA sequences, and transcription start sites. Figure 3 provides examples of isoform information from four different genes in Zone 2 that were significantly altered between the two root zones to study their isoform information—two upregulated genes: AT5G05960 (protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein [LTP] family protein) and AT4G02270 (pollen Ole e 1 allergen and extensin family protein) and two downregulated genes: AT2G23050 (NPY4 [NAKED PINS IN YUC MUTANTS 4]) and protein binding/signal transducer (NPY4) and AT1G18250 (Arabidopsis thaumatin-like protein [ATLP-1]). The differential expression of these four genes in the two root zones from microarray and RNA-Seq are shown in Fig. 3A. Log2 FC values for these genes in RNA-Seq and microarray were comparable, and RNA-Seq estimated a higher level of fold change for all four genes (Fig. 3A). Expression levels of these genes (Fig. 3B) and isoforms (Fig. 3C) in root Zone 1 and 2 were plotted using FPKM values measured by RNA-Seq. Although all of these genes were significantly changed between Zone 1 and Zone 2 (Fig. 3B), the different FPKM values measured can be attributed to changes in alternative isoforms (Fig. 3C). For instance, the FPKM values of two isoforms of genes AT5G05960 and AT2G23050 are not significantly changed individually (Fig. 3C), but when the expression values are added up there is a significant change in gene expression (Fig. 3B). On the contrary, in genes AT4G02270 and AT1G18250, one isoform in each gene (TCONS_00025944 and TCONS_00005036, respectively) was significantly altered in expression, leading to a change in the total FPKM values (Fig. 3C).


Types of Microarrays

Depending upon the kind of immobilized sample used construct arrays and the information fetched, the Microarray experiments can be categorized in three ways:

1. Microarray Expression Analysis: In this experimental setup, the cDNA derived from the mRNA of known genes is immobilized. The sample has genes from both the normal as well as the diseased tissues. Spots with more intensity are obtained for diseased tissue gene if the gene is over expressed in the diseased condition. This expression pattern is then compared to the expression pattern of a gene responsible for a disease.

2. Microarray for Mutation Analysis: For this analysis, the researchers use gDNA. The genes might differ from each other by as less as a single nucleotide base.

A single base difference between two sequences is known as Single Nucleotide Polymorphism (SNP) and detecting them is known as SNP detection.

3. Comparative Genomic Hybridization: It is used for the identification in the increase or decrease of the important chromosomal fragments harboring genes involved in a disease.


Genomic and microarray approaches to coral reef conservation biology

New technologies based on DNA microarrays and comparative genomics hold great promise for providing the background biological information necessary for effective coral reef conservation and management. Microarray analysis has been used in a wide range of applications across the biological sciences, most frequently to examine simultaneous changes in the expression of large numbers of genes in response to experimental manipulation or environmental variation. Other applications of microarray methods include the assessment of divergence in gene sequences between species and the identification of fast-evolving genes. Arrays are presently available for only a limited range of species, but with appropriate controls they can be used for related species, thus avoiding the considerable costs associated with development of a system de novo. Arrays are in use or preparation to study stress responses, early development, and symbiosis in Acropora en Montastraea. Ongoing projects on several corals are making available large numbers of expressed gene sequences, enabling the identification of candidate genes for studies on gamete specificity, allorecognition and symbiont interactions. Over the next few years, microarray and comparative genomic approaches are likely to assume increasingly important and widespread use to study many aspects of the biology of coral reef organisms. Application of these genomic approaches to enhance our understanding of genetic and physiological correlates during stress, environmental disturbance and disease bears direct relevance to the conservation of coral reef ecosystems.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


CONCLUSIONS

We have shown proof-of-principle of a hybrid SBS/SBL biochemistry called CycLiC. Gel experiments show that the ligation and cleavage mechanism is effective and can lead to high reaction completion. Notably, we have also shown that a microarray probe can be used to capture a template which can then be subjected to CycLiC to read up to three contiguous bases. A range of further optimization studies should be conducted, including how to retain the template-primer duplex in place after capture in order to extend the sequence read further. CycLiC on microarrrays uses ‘generic’ commercially available enzymes, common oligonucleotide modifications and standard microarrays and because the read will be from a targeted genomic location, sequence re-assembly algorithms will not be necessary. The method will therefore be amenable to adaptation and improvement by a community of users for sequencing as much or as little as desired from any genome for which a reference sequence is available.


Bekijk de video: Gene Expression Analysis and DNA Microarray Assays (Januari- 2022).