Informatie

Hoeveel invloed heeft de afstand tussen de bindingsplaats van een transcriptiefactor en een promotor op de transcriptie?


Neem aan dat we een synthetisch construct hebben met een minimale (induceerbare) promotor die activering vereist om significante transcriptie te laten plaatsvinden. Realistisch gezien, hoe belangrijk is de afstand tussen een activatorbindingsplaats en een promotor - zou het dichter bij de promotor plaatsen van de bindingsplaats leiden tot een aanzienlijk sterkere activering of robuuster systeemgedrag?

In sommige genomics-gerelateerde modellen zag ik dat auteurs gewichten toekenden aan bindingsplaatsen op basis van positie (oriëntatie en afstand tot de promotor); het algemene idee was dat verder weg gelegen bindingsplaatsen een zwakkere invloed op transcriptie zouden kunnen hebben. Dit kan worden gemodelleerd b.v. door de bindingsaffiniteit te verminderen. Maar dat was genomica, en ik weet niet zeker hoeveel daarvan relevant is in kleinschaligere plasmideconstructies.

Stel bijvoorbeeld dat we een zeer specifieke bindingsplaats hebben (bijvoorbeeld een TALE-bindingsplaats) stroomopwaarts van de promotor:

In Fig.1 is de bindingsplaats EEN is alleen b.v. 40 bp verwijderd van de promotor. In Fig.2 is het b.v. 5000-7000 bp verwijderd. Moet ik verwachten dat dit een merkbaar verschil gaat maken? Zou hetzelfde gelden als het een constitutieve promotor zou zijn, met een repressor in plaats van een activator? Hoe zit het met complexere netwerken, kan het antwoord veranderen?


Dat hangt echt van je systeem af. In ieder geval voor gist beïnvloedt het verschil de sterkte van de activering ("Analyse van transcriptieactivering op afstand in Saccharomyces cerevisiae").

Voor bacteriën zijn onlangs dergelijke regels voor lange afstanden vastgesteld. Daarvoor werd gedacht dat dit alleen bij eukaryoten gebeurt. Zie het artikel: "Langeafstandsrelaties: communicatie tussen versterker en promotor en dynamische gentranscriptie."

In eukariotische cellen kunnen de regulerende sequenties (transcriptiefactorbindingsplaatsen en versterkers evenals geluiddempers) heel ver weg zijn. Een voorbeeld hiervan is de rs12913832 in intron 86 van HERC2, die de expressie van het OCA2-gen beïnvloedt, dat ongeveer 21 kB verwijderd is. Beide genen zijn niet verwant in hun functies. Normaal gesproken werken hier drie transcriptiefactoren samen in de regulatie van OCA2, HLTF, LEF1 en MITF, wat leidt tot de vorming van een DNA-lus tussen de versterker in HERC2 en de promotor in OCA2. Het polymorfisme vermindert de binding van HLTF aan de versterker en belemmert de vorming van de lus, wat resulteert in verminderde expressie van OCA2 (het hele verhaal is hier te vinden: "HERC2 rs12913832 moduleert menselijke pigmentatie door de vorming van chromatine-lusvorming tussen een lange afstand versterker en de OCA2-promotor.")

Dit artikel ("Essentiële rol van microftalmie-transcriptiefactor voor DNA-replicatie, mitose en genomische stabiliteit bij melanoom.") analyseerde (onder andere) de bindingsplaatsen voor de microftalmie-geassocieerde transcriptiefactor (MITF) en hun afstand tot de startplaats van de transcriptie . Figuur 1 a/b van het papier wordt hieronder getoond. Interessant is dat veel van de bindingssites behoorlijk ver weg waren.

Om dieper op het onderwerp in te gaan, zijn de volgende recensies interessant om te lezen:


Hoeveel invloed heeft de afstand tussen de bindingsplaats van een transcriptiefactor en een promotor op de transcriptie? - Biologie

Het ophelderen van de globale functie van een transcriptiefactor impliceert de identificatie van zijn doelgenen en genomische bindingsplaatsen. De rol van chromatine in deze context is onduidelijk, maar de dominante opvatting is dat factoren bij voorkeur binden aan nucleosoom-verarmde regio's die worden geïdentificeerd als DNaseI-overgevoelige plaatsen (DHS). Hier laten we door ChIP-, MNase- en DNaseI-assays gevolgd door diepe sequencing zien dat de progesteronreceptor (PR) nucleosomen nodig heeft voor optimale binding en functie. In borstkankercellen die werden behandeld met progestagenen, identificeerden we 25.000 PR-bindingsplaatsen (PRbs). Het merendeel van deze sites omvatte verschillende kopieën van het hexanucleotide TGTYCY, dat zeer overvloedig in het genoom aanwezig is. We ontdekten dat functionele PRbs zich ophopen rond door progesteron geïnduceerde genen, voornamelijk in versterkers. De meeste van deze sites overlappen met DHS, maar vertonen een hoge nucleosoombezetting. Progestageenstimulatie resulteert in hermodellering van deze nucleosomen met verplaatsing van histonen H1- en H2A/H2B-dimeren. Onze resultaten suggereren sterk dat nucleosomen cruciaal zijn voor PR-binding en hormonale genregulatie.

Hoogtepunten

► Beschrijving van progesteronreceptorbindingsplaatsen (PRb's) in borstkankercellen ► Functionele PRb's zijn verrijkt in nucleosomen voorafgaand aan hormoonbehandeling ► Hormooninductie veroorzaakt nucleosoomremodellering met verlies van histonen H1 en H2A/H2B ► Nucleosomen bevorderen binding van PR/coregulatorcomplexen en gen inductie


Achtergrond

Transcriptie is de eerste vastgelegde stap van genexpressie in prokaryoten en is als zodanig sterk gereguleerd. Promotorsequenties sturen de transcriptie van zowel coderende als niet-coderende RNA's door te fungeren als doelwitplaatsen voor specifieke RNA-polymerasebinding en -activiteit [1-3]. Bacteriën gebruiken een ingenieus mechanisme om zich effectief en economisch aan te passen aan omstandigheden van stress of omgevingsveranderingen. Het initiële mechanisme van transcriptieregulatie is gebaseerd op rekrutering van bepaalde sigma (σ) factoren door RNA-polymerase-kernenzym (RNAP). Complexvorming met σ-factoren is essentieel voor RNAP-binding aan een bepaalde promotorsequentie en dus voor transcriptie-initiatie [3].

Genoombrede identificatie van promotorsequenties vergemakkelijkt de identificatie van DNA-bindingsplaatsen voor regulerende eiwitten en biedt ook inzicht in de organisatie van transcriptionele eenheden. RNAseq-benaderingen hebben de grootschalige identificatie van transcriptiestartplaatsen (TSS) in de ε-proteobacterium mogelijk gemaakt Helicobacter pylori en de cyanobacteriën Synechocystis sp., Synechococcus elongatus, en Anabaena sp., waardoor de karakterisering van promotorsequentiemotieven stroomopwaarts van de TSS wordt vergemakkelijkt. Deze benaderingen onthulden een onverwachte overvloed aan cis-gecodeerde antisense RNA's (asRNA) en trans-gecodeerde sRNA's (sRNA), en verlichtte daarmee een voorheen onbekende dimensie van prokaryotische transcriptionele activiteit [4-7]. Dit beeld komt overeen met RNAseq-onderzoeken in diverse Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën [8-17].

De α-klasse van de Proteobacteria omvat diverse bacteriën met een complexe levensstijl, waaronder obligate en facultatieve plant- en diergerelateerde bacteriën (die betrokken zijn bij zowel mutualistische als pathogene interacties), fototrofen, chemo-organotrofen en chemolithotrofen [18]. Bovendien wordt verondersteld dat eukaryote mitochondriën zijn ontstaan ​​uit een oude α-proteobacterie [18]. Ondanks hun belang is er weinig bekend over de organisatie van α-proteobacteriële transcriptoom. Deze studie presenteert de eerste uitgebreide mapping van TSS en toewijzing van geïdentificeerde promotorsequenties aan -factoren in een α-proteobacterie. Sinorhizobium meliloti bestaat ofwel in een vrijlevende levensstijl in de bodem of in symbiose met een vlinderbloemige plantgastheer. In de symbiotische relatie wonen de bacteriën in wortelknobbeltjes, differentiëren ze in polyploïde bacteroïden en fixeren ze stikstof ten voordele van de gastheer [19]. Functies voor deze verschillende levensstijlen zijn gecodeerd in de tripartite S. melilot genoom: een enkel chromosoom (3,54 Mbp) en twee megaplasmiden, pSymA (1,35 Mbp) en pSymB (1,68 Mbp) [20-22].

Om zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving of stresssituaties, S. melilot kan putten uit een set van 15 σ factoren [20, 23]. RpoD (σ 70 ) voorziet in huishoudelijke functies, terwijl alternatieve σ-factoren meestal betrokken zijn bij aanpassing aan specifieke stress of groeiomstandigheden [24]. RpoN (σ 54 ​​) is essentieel voor transcriptie van stikstoffixatie-gerelateerde genen [25]. Twee RpoH σ-factoren, met sequentieovereenkomst met de Escherichia coli hitteschok σ 32 , werden geïdentificeerd in S. melilot[26] RpoH1 (σ H1 ) bleek grotendeels verantwoordelijk te zijn voor aanpassing aan hitteschok, oxidatieve stress en pH-veranderingen, terwijl de rol van RpoH2 (σ H2 ) grotendeels onbekend is [26]. Minstens 11 σ-factor genen (rpoE1-rpoE10, fecI) zijn geannoteerd in de S. melilot genoom als coderend voor extracytoplasmatische functie (ECF) σ-factoren, die gewoonlijk worden gereguleerd door anti-σ-factoren. De ECF σ-factor, RpoE2 (σ E2), werd gekarakteriseerd als de regulator van ten minste 44 genen, waaronder rpoH2 en rpoE5, en werd geconcludeerd als een globale regulator van algemene stressadaptatie en de hyperosmotische stressrespons [27, 28].

De RNAseq-aanpak die in deze studie werd gerapporteerd, leverde 17.001 experimenteel in kaart gebrachte TSS op, inclusief zowel eiwitcoderende als niet-coderende transcripten. We waren in staat om 2.847 σ-factorspecifieke promotorsequenties op geschikte afstand tot een TSS te voorspellen. Dit nieuw gedefinieerde landschap van TSS- en promotormotieven vergroot onze kennis van promotoreigenschappen en zal verdere analyses van transcriptionele en post-transcriptionele regulatieprocessen in S. melilot.


2. MATERIALEN EN METHODEN

Statistische analyse en verwerking van de gegevens werden uitgevoerd met behulp van R-versie 3.0.1 (www.r-project.org). Om de op beperkingen gebaseerde modellen voor de voorspelling van genexpressie op te lossen, werd de Gurobi Optimizer 5.5 gebruikt (www.gurobi.com).

2.1 Genexpressiegegevens

We hebben onze methode geïmplementeerd en geanalyseerd met behulp van de genexpressieprofielen van 59 kankercellijnen van het National Cancer Institute (NCI-60-paneel). Het NCI-60-panel bevat 60 kankercellijnen van negen verschillende oorsprong, borst, centraal zenuwstelsel, colon, nier, leukemie, long, melanoom, eierstok en prostaat (Liu et al., 2010 Schoenmaker, 2006). De gegevens zijn gedownload van CellMiner ( Reinhold et al., 2012) en gebaseerd op een integratie van vijf verschillende microarray-platforms (5-Platform, Affymetrix HG-U95, HG-U133, HG-U133 Plus 2.0, GH Exon 1.0 ST en Agilent WHG), wat een z-score oplevert voor elk gen van elk monster [details, zie ( Reinhold et al., 2012)]. Ontbrekende waarden werden vervangen door de gemiddelde expressiewaarden van de overeenkomstige genen. De cellijn SF 539 werd uitgesloten van onze analyse vanwege een groot aantal (10 404) niet-gedefinieerde vermeldingen. Als tweede, onafhankelijke dataset gebruikten we genexpressiegegevens van melanoomcellen uit de studie van Hoek et al. (2006). In het kort kwamen melanoomcellen vrij uit weefselcoupes van melanoommetastasen. Cellen werden gekweekt, totaal RNA werd geëxtraheerd, gelabeld en geprofileerd met behulp van Affymetrix HG-U133 plus 2.0 oligonucleotide microarrays. Het ruwe intensiteitssignaal werd genormaliseerd met behulp van Affymetrix MAS 5.0. Waarden onder 0,01 werden ingesteld op 0,01 en elke waarde werd gedeeld door het 50e percentiel van alle waarden in dat monster. Elke expressiewaarde werd gedeeld door de mediaan van de waarden in alle monsters. Ten slotte werden expressiewaarden voor elk gen z-genormaliseerd. Voor onze analyse gebruikten we expressiegegevens van 33 monsters uit het Mannheim-cohort [details, zie (Hoek et al., 2006)].

2.2 Vooraf gedefinieerde regelgevende interacties samenstellen

Als basis voor het afleiden van TF-regelgeving hebben we TF-bindende informatie uit verschillende bronnen gebruikt. Uit de database MetaCore TM (http://thomsonreuters.com/metacore/) werden menselijke TF-doelwitgeninteracties gebruikt, geannoteerd als activering en remming, van beide categorieën direct en indirect. Verder gebruikten we z-scores van de totale bindingsaffiniteit (TBA), die een TF-bindingsprofiel voor de hele promotor gebruikt op basis van positiegewichtmatrices (Molineris et al., 2011). Er werden menselijke ingangen van de CHIP Enrichment Analysis (ChEA) -database gebruikt, die een grote set gegevens bevat van ChIP-experimenten met hoge doorvoer (Lachmann et al., 2010). Op de datum van gebruik (juli 2013) omvatte de ChEA-database voor mensen 83 TF's, 20 035 genen en in totaal 131 996 inzendingen. Daarnaast gebruikten we ChIP-gegevens van het ENCODE-project (http://www.genome.gov/Encode/). We gebruikten bindingsinformatie van cellijnen waarvoor de meest uitgebreide set regulatie-informatie beschikbaar was (Tier 1), d.w.z. van de cellijnen Gm12878, H1 humane embryonale stamcellen, Hela3, HepG2 en K562. We leverden een bindingsmatrix op met waarden van enen als binding van een TF aan een doelgen was vermeld in Encode en anders nul. Als een doelgen meer dan eens voorkwam, werden de overeenkomstige rijen gecombineerd tot een enkele rij met consistente treffers. Als een TF meer dan eens voorkwam, werden de overeenkomstige kolommen gecombineerd tot één kolom met behulp van de samenvoeging van treffers. Met al deze databases hebben we regelgevingsinformatie verzameld voor 1120 TF's. Een regelgevende interactie-informatie tussen een TF en een doelgen werd als betrouwbaar beschouwd als (i) dit paar werd gevonden in Metacore met de annotatie 'direct' of als (ii) dit paar werd gevonden in ten minste twee van de datasets Metacore ' indirect', ChEA, Encode en TBA met een waarde ≥1. Voor deze paren werd hun vermeende regulerende interactie, randsterkte genoemd, in het volgende ingesteld op het aantal keren dat het specifieke TF-genenpaar van de datasets CheA, Metacore directe activering, Metacore directe remming, Metacore indirecte activering en Metacore indirecte remming voorkomt. Verder werd de TBA-waarde ≥1 opgeteld bij de randsterkte. Voor alle TF-genparen die niet aan de criteria (i) of (ii) voldeden, werd de randsterkte ingesteld op 0.

2.3 Regelmodel

Netwerk van genen en hun regulerende TF's. Genen en TF's zijn verbonden via de randsterkte esij

Netwerk van genen en hun regulerende TF's. Genen en TF's zijn verbonden via de randsterkte esij

2.4 Berekening van de geschatte effecten van TF's

2.5 De ​​modelschakelaar:


DISCUSSIE

In deze studie hebben we aangetoond dat de CCRA-methode een nuttig hulpmiddel is om veel verschillende aspecten van TF-binding te bestuderen in vivo. Met behulp van CCRA hebben we eerst de DNA-bindingsenergielandschappen voor Cbf1p en MAX gemeten, en we hebben aangetoond dat de vrije-energieverschillen gemeten door CCRA sterk gecorreleerd zijn met die gemeten door PBM en MITOMI, wat suggereert dat CCRA een kwantitatieve maat is voor evenwichtsbinding. Dit is waarschijnlijk omdat de snelheid van transposon-insertie traag is ten opzichte van de typische aan- en uit-snelheden voor TF-binding aan DNA. Daarentegen kunnen op crosslinking gebaseerde methoden tijdelijke TF-DNA-bindingsgebeurtenissen vastleggen als TF's zwakke bindingsplaatsen bemonsteren (68), en dus de gemeten bezettingen kunnen een combinatie van op-snelheid en evenwichtsbinding weerspiegelen. Vervolgens probeerden we TF-coöperativiteit te begrijpen door een paar paralogen bHLH TF's, Cbf1p en Tye7p te bestuderen. We hebben waargenomen dat Cbf1p-bindingsbezetting afhankelijk is van de DNA-helix-draaiing, wat de biofysische relaties tussen DNA-structuur en een homotypische coöperatieve TF onthult. karakteriseerde de moleculaire bindingslogica van Tye7p, dat wil zeggen dat Tye7p zijn doelen vindt via eiwit-eiwitinteractie met Gcr1 / 2p en Rap1p zonder dat zijn eigen motief nodig is, waardoor het collectieve bindingsmodel verder wordt afgebakend.

Transcriptiefactoren orkestreren de genexpressieveranderingen die de kern vormen van de meeste biologische processen, maar de principes waarmee TF's hun doelgenen lokaliseren en de functionele gevolgen van binding zijn niet goed begrepen. Gedetailleerd onderzoek naar de moleculaire mechanismen die TF-binding regelen, wordt traditioneel gebruikt in vitro methoden (30, 38-49), die beperkte inzichten bieden in TF-binding in vivo, of maak gebruik van genoombewerking (23, 52, 53), wat traag en kostbaar is. Vanwege deze moeilijkheden hebben veel onderzoeken die hebben geprobeerd de regels van binding en functie van TF's te begrijpen, zich gericht op een eindige reeks loci en een beperkt aantal genetische alteraties (23, 52, 53). Onlangs zijn krachtige high-throughput-methoden, zoals Sort-Seq (17, 18) en MPRA's met streepjescode (19, 20), ontwikkeld om uitgebreider onderzoek naar de regelgevende code mogelijk te maken, maar deze zijn uitsluitend afhankelijk van reportergenexpressie en moeten indirect TF-binding en de impact ervan op genexpressie afleiden. Twee recente onderzoeken hebben op ChIP gebaseerde bindingsmetingen gekoppeld aan parallelle reporter-assays om de correlaties tussen chromatine-markeringen en TF-binding te onthullen (21) en om de voorspellende kracht van thermodynamisch gemotiveerde modellen van genexpressie te onderzoeken (22). Deze studies toonden de parallelle meting van TF-binding aan synthetische promotors aan en vertegenwoordigen een belangrijke vooruitgang, maar toonden niet het vermogen aan om bindingsenergieën kwantitatief te meten of om coöperatieve interacties te analyseren, wat cruciale metingen zijn om te begrijpen hoe TF's functioneren. Methoden waarbij TF's transposon-insertie aansturen (24, 25, 69) of de enzymatische splitsing van DNA (70, 71) zijn veelbelovend om verder te gaan dan een kwalitatieve beschrijving van TF-binding. Hier laten we zien dat CCRA in staat is om TF-binding en reportergenexpressie op synthetische sequenties op een high-throughput manier kwantitatief te meten. Het is een gevoelige en nauwkeurige methode die geschikt is voor de analyse van complexen van TF's. Daarom zou CCRA een nuttig hulpmiddel moeten zijn om de regelgevende principes van de lokalisatie en functionaliteit van TF's beter te begrijpen.

Bij het ontwerpen van een CCRA-bibliotheek moet rekening worden gehouden met bepaalde overwegingen om de nauwkeurige kwantificering van TF-binding te garanderen. Het is belangrijk om in elk experiment voldoende transpositiegebeurtenissen te verzamelen in verhouding tot de grootte van de CCRA-bibliotheek. Hoewel op chip gebaseerde oligonucleotidesynthese het mogelijk maakt om zeer grote bibliotheken (tot 244.000 unieke oligo's) op een kosteneffectieve manier te synthetiseren, hebben we ontdekt dat het voordelig is om de bibliotheek zo te ontwerpen dat kleinere subsets (bijv. 100-1000 sequenties ) kan worden geamplificeerd met unieke primerparen. Aangezien we doorgaans 10 000–50 000 transposities verzamelen voor elk CCRA-experiment (met behulp van 10 gistplaten), zorgt het beperken van de subbibliotheken tot deze grootte voor een hoog statistisch vermogen voor elk experiment, terwijl de analyse van verschillende TF's of het testen van verschillende hypothesen in één experiment. Het optimale aantal transposities voor een bepaald CCRA-experiment zal ook afhangen van de transcriptiefactoren die moeten worden geanalyseerd en de specifieke kenmerken van het bibliotheekontwerp (bv. een bibliotheek die uit veel sequenties met hoge affiniteit bestaat, kan meer transposities opleveren dan een bibliotheek die uit veel sequenties met lage affiniteit bestaat) . In onze ervaring leveren CCRA-bibliotheken met 500 of minder unieke sequenties bindingsresultaten van hoge kwaliteit op, maar dit kan eenvoudig worden geschaald door meer platen te gebruiken of door toekomstige verbeteringen aan de methode. In de toekomst zou het mogelijk moeten zijn om meerdere TF's tegelijkertijd te analyseren met CCRA-technologie door verschillende TF-barcodes toe te voegen tijdens de eerste amplificatiestap en vervolgens de barcodebibliotheken om te zetten in verschillende giststammen, die elk een andere TF-Sir4p-fragmentfusie bevatten.

De CCRA-methode is in staat om een ​​aantal door de gebruiker gedefinieerde sequenties parallel te analyseren, waardoor kwantitatieve en goed gecontroleerde metingen worden verkregen die met genoombrede methoden moeilijk te verkrijgen zouden zijn. Het vrije-energiebindingslandschap dat we voor Cbf1p hebben beschreven, werd bijvoorbeeld gegenereerd door alle 1bp-substituties van het consensusmotief van deze factor te analyseren in exact dezelfde sequentiecontext, een ontwerp dat de detectie van kleine vrije-energieveranderingen mogelijk maakte. Daarentegen kunnen kleine veranderingen in bindingsenergie niet worden afgeleid uit genoombrede telefoonkaartmetingen van Cbf1 (aanvullende figuur S5), hoewel de brede trends over het algemeen hetzelfde zijn. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat, hoewel alle 1bp-substituties van de consensus-bindende sequentie van Cbf1p inderdaad in het genoom aanwezig zijn, ze in verschillende lokale sequentiecontexten voorkomen, dus de metingen zijn niet goed gecontroleerd. In het gistgenoom kan bijvoorbeeld een Cbf1p-bindingsplaats concurreren met een nucleosoom, terwijl een andere bindingsplaats dat niet kan, dus de verschillende lokale contexten verwarren de nauwkeurige meting van bindingsenergieën. We hebben inderdaad in onze CCRA-experimenten waargenomen dat wanneer een Cbf1p-bindingsplaats wordt geflankeerd door een nucleosoom ongunstige sequentie, de Cbf1p-binding consistent toeneemt (Figuur 2B). Het vermogen om goed gecontroleerde metingen uit te voeren heeft waarschijnlijk ook bijgedragen aan ons vermogen om de periodieke fase-afhankelijkheid van de coöperativiteit van Cbf1p te detecteren. Deze fase-afhankelijkheid is een interessant fenomeen en voor zover wij weten, is niet eerder aangetoond dat coöperatieve binding van een transcriptiefactorcomplex wordt beïnvloed door de helixfase. Een belangrijk gerelateerd resultaat werd echter gevonden door Kosuri en collega's, waar ze ontdekten dat de expressie-output van een reportergen afhing van de helixfase tussen de transcriptiestartplaats en de bindingsplaats van een transcriptionele activator (72).

We voorzien dat CCRA breed zal worden toegepast om drie verschillende aspecten van TF-binding te bestuderen: (i) kwantitatief onderzoek naar TF-DNA-interacties in de natuurlijke cellulaire omgeving, bijvoorbeeld het in kaart brengen van TF-bindende energielandschappen in vivo of evaluatie van het effect van flankerende sequenties op motiefherkenning (ii) studies naar de mechanismen waarmee TF's coöperatief binden, bijvoorbeeld evaluatie van de energetische bijdragen van verschillende TF-bindingsplaatsen aan de binding van een TF-complex (iii) ontleding van de relatie tussen TF bezetting en transcriptionele output. Bovendien is het waarschijnlijk dat CCRA in de toekomst kan worden uitgebreid tot meercellige eukaryote systemen met behulp van de juiste transposon-machines. De Calling Card-methode is toegepast om zoogdier-TF's zoals SP1 en BAP1 te bestuderen met PiggyBac-transposon (73, 74), dus dit transposonsysteem is een uitstekende kandidaat voor het uitvoeren van CCRA in zoogdiercellen. Dergelijk onderzoek zou uiteindelijk moeten leiden tot een beter begrip van de rollen die TF's spelen bij het orkestreren van de transcriptionele netwerken die cellen in staat stellen hun diverse functies uit te voeren.


Conclusies

Transcriptie-initiatie en -regulatie is een complex proces met veel aanvullende relevante factoren waarmee rekening moet worden gehouden, zoals versterkerelementen, nucleosoomorganisatie, DNA-methylatie en nog veel meer. Hier hebben we ons gericht op de kwestie van de relevantie van cis-regulerende motieforiëntatie in stroomopwaartse promotorregio's van genen. Er werd geen bewijs gevonden dat motieforiëntaties de voorkeur hebben over alle motiefinstanties en die kunnen worden geassocieerd met detecteerbare, regulerende genexpressie-effecten. We concluderen dat, in het algemeen, motieforiëntatie-effecten ofwel geen significante rol spelen bij de regulatie van genexpressie in de plant Arabidopsis thaliana of worden alleen onthuld op het niveau van bepaalde loci in combinatie met genspecifieke aanvullende factoren die gerichte experimentele analyses nodig hebben.


Methoden:

Bacteriële stam, groei en ontwikkeling

M. xanthus wildtype stam DK1622 [123] werd gekweekt bij 32 °C in CTT (1% Casitone, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM KH2PO4-K2HPO4, 8 mM MgSO4 [uiteindelijke pH, 7,6]) bouillon [124] of op CTT-agar (1,5%) platen. Vruchtlichaamontwikkeling werd uitgevoerd op TPM (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM KH2PO4-K2HPO4, 8 mM MgSO4 [uiteindelijke pH, 7,6]) agar (1,5%) platen, zoals eerder beschreven [125]. Onder deze omstandigheden zijn er na 18 uur [126] heuvels gevormd, maar er zijn nog geen sporen verschenen (L. Kroos, niet-gepubliceerde waarnemingen).

Na 18 uur ontwikkeling van het vruchtlichaam werden cellen verzameld en onderworpen aan ChIP, zoals eerder beschreven [46, 127], met anti-MrpC-antilichamen (500 ng) [44] of controle-IgG (500 ng) (Santa Cruz Biotechnology). In het kort werden cellen behandeld met formaldehyde om eiwitten aan DNA te verknopen, de celsuspensie werd gesoniceerd, het lysaat werd gemicrocentrifugeerd, het supernatant werd voorbehandeld met proteïne A-Sepharose-parels om daaropvolgende niet-specifieke binding te minimaliseren, het supernatant werd geïncubeerd met antilichamen en vervolgens met proteïne A-Sepharose-korrels voor immunoprecipitatie, werden de korrels verzameld door microcentrifugatie en gewassen, de verknopingen werden omgekeerd, de eiwitten werden verteerd en het DNA werd gezuiverd [127]. Het resulterende DNA werd geanalyseerd door PCR met primers van -101 tot +25 van de fmgA (voorheen Ω4400) promotorgebied, zoals eerder beschreven [127], om verrijking in het monster met anti-MrpC IgG te bevestigen in vergelijking met controle-IgG.

DNA sequentie

10 ng) als gevolg van ChIP werden verwerkt met behulp van een ChIP-seq-monstervoorbereidingskit volgens de instructies van de fabrikant (Illumina). In het kort, de DNA-uiteinden werden gerepareerd om fragmenten met stompe uiteinden te produceren, het DNA werd behandeld met Klenow-fragment om 3'-dA-overhangen te genereren en oligonucleotide-adapters werden aan de DNA-uiteinden geligeerd. Elk monster werd op grootte geselecteerd door fragmenten van ongeveer 300 bp uit te snijden en te extraheren na elektroforese op een 2% agarosegel, de DNA-fragmenten werden verrijkt door PCR en de bibliotheek werd gevalideerd op een Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer. Sequencing werd uitgevoerd bij de Michigan State University Research Support Technology Facility met behulp van een kit die is ontworpen om metingen van 36 nucleotiden (Illumina) en een Solexa-instrument te produceren. De uitgelezen DNA-sequenties zijn gedeponeerd bij het NCBI Sequence Read Archive onder toegangsnummer SRP049504.

Detectie van ChIP-seq-pieken

De uitlezingen van de DNA-sequentie werden uitgelijnd met de M. xanthus genoom [10] met behulp van het short-read alignment softwarepakket Bowtie [128]. Genomische regio's met significante verrijking van uitgelijnde uitlezingen in het anti-MrpC ChIP-monster vergeleken met het controle-IgG ChIP-monster in elk van de twee experimenten werden gedetecteerd met behulp van het op kerneldichtheidsschatter gebaseerde analysepakket QuEST [52]. Een partitie van de uitlezingen van het IgG ChIP-monster werd in elk experiment apart gezet en behandeld alsof het een ChIP-verrijkt monster was om schatting van de fout-positieve snelheid van het piekdetectieproces mogelijk te maken.

Analyse van ChIP-seq pieklocaties

Aangepaste, interne Python-scripts werden geschreven om de nabijheid van ChIP-seq-pieken tot genomische kenmerken van belang te bepalen, zoals de voorspelde TSC van het dichtstbijzijnde gen, en om Monte-Carlo-simulaties van de gegevens te genereren ter vergelijking met willekeurig geplaatste pieken in het genoom. Functionele annotatie en categorisering van M. xanthus genen werd toegewezen door het J. Craig Venter Institute en gewijzigd zoals eerder beschreven [57]. De scripts en bijbehorende invoerbestanden (bijv. genoom en annotaties) waarop ze vertrouwen, zijn beschikbaar op https://github.com/blobbybirdman/MrpC_MXanthus. Lijsten met genen werden vergeleken met behulp van een op maat gemaakte Java-applicatie die in eigen huis was geschreven.

Identificatie van een DNA-sequentiemotief op vermeende MrpC-bindingsplaatsen

Om de aanwezigheid van geconserveerde sequentiemotieven geassocieerd met ChIP-seq-pieken verrijkt in het anti-MrpC-monster te beoordelen, werd voor elke piek een flankerende sequentie (50 bp aan elke kant) geëxtraheerd om positionele onzekerheid van de piek mogelijk te maken en de mogelijkheid om motieven van andere factoren te detecteren die mogelijk een wisselwerking hebben met MrpC. De volledige dataset werd gerangschikt op piekverrijking en werd vervolgens verdeeld in sets van 50 sequenties om de discriminatie mogelijk te maken van motieven geassocieerd met sterke versus zwakke MrpC-bindingsplaatsen, indien aanwezig. De top 500 gerangschikte pieken en de kleinere datasetpartities werden doorzocht met MEME [76] om oververtegenwoordigde motieven te detecteren. Het van belang zijnde motief werd vergeleken met motieven in RegTransBase [78] met behulp van TOMTOM [76] om gelijkenis met bekende transcriptiefactor-bindende motieven te identificeren.

Eiwitzuivering

Zijn10-MrpC en zijn10-MrpC2 werd gezuiverd zoals eerder beschreven [18, 44] uit Escherichia coli stam BL21(DE3) [129] getransformeerd met respectievelijk pET-MrpC en pET-MrpC2. Echter, E coli getransformeerd met pET-MrpC groeide langzaam op Luria-Bertani (LB) [130] agar (1,5%) platen met ampicilline (50 μg/ml) bij 37°C, terwijl E coli getransformeerd met pET-MrpC2 groeide normaal. Door verse transformanten over te brengen in LB-bouillon met ampicilline (50 g/ml) en te groeien bij 37°C totdat de dichtheid 100 Klett-eenheden (ongeveer 5 x 108 cellen/ml) bereikte, en vervolgens te induceren met isopropyl-1-thio-β- D-galactopyranoside (IPTG) (1 mM) gedurende 1,5 uur, expressie van His10-MrpC kon worden waargenomen, hoewel niet zo hoog als die van His10-MrpC2, en elk eiwit kon worden gezuiverd. FruA-His6 werd gezuiverd zoals eerder beschreven [46] uit E coli BL21(DE3) getransformeerd met pET11km/FruA-His6.

EMSA's

DNA-fragmenten werden gegenereerd door PCR met behulp van primers die zijn vermeld in aanvullend bestand 12, gezuiverd met behulp van een PCR-zuiveringskit (Qiagen) en gelabeld met [a-32P]ATP met behulp van T4-polynucleotidekinase (New England BioLabs). Als alternatief werden oligonucleotiden eveneens 32P-gelabeld, in paren gemengd zoals vermeld in aanvullend bestand 12, en geanneald door ze te laten afkoelen tot kamertemperatuur na incubatie in een kokend waterbad gedurende 10 minuten. De met 32P gemerkte DNA-probes werden gezuiverd en gebruikt in EMSA's zoals eerder beschreven [127], behalve dat bindingsreactiemengsels gedurende 15 minuten bij 25°C werden geïncubeerd.


Wereldwijde regelgevende mechanismen

Regulerende factoren die de transcriptie-efficiëntie beïnvloeden, moeten direct of indirect interageren met de componenten van het basale transcriptieapparaat en hun activiteit moduleren. Hoewel het werk aan het basale archaeale transcriptieapparaat goed gevorderd is, staat de karakterisering van regulerende processen in Archaea nog in de kinderschoenen. Desalniettemin ontstaat er een grote verscheidenheid aan benaderingen en een samenvatting van het werk aan archaeale transcriptieregulatie - globaal of genspecifiek - valt buiten het bestek van deze review. Er moeten echter een paar punten worden gemaakt om de focus van het huidige onderzoek te benadrukken.

Er zijn een paar verschillende elementen ontdekt die mogelijk betrokken zijn bij wereldwijde regelgevingsprocessen, hoewel geen ervan in detail is bestudeerd. Zoals reeds vermeld, is duplicatie van een gen voor een basale transcriptiefactor en daaropvolgende specialisatie van een van de eiwitten voor een subset van genen een mogelijkheid die zou kunnen worden gebruikt door H. salinarum (TBP) en P. horikishii (TFB).

De invloed van DNA-topologie op transcriptie-efficiëntie zou een tweede manier van globale regulering kunnen zijn. Er zijn meer dan 20 Z-DNA-bevattende genoomfragmenten geïsoleerd uit H. salinarum gebruikmakend van een anti-Z-DNA-antilichaam (20). Als deze zich in promotorregio's bevonden, zou conditionele Z-DNA-vorming de transcriptie kunnen beïnvloeden. Voor één gen, het bacterioopsine-gen, is aangetoond dat transcriptie wordt beïnvloed door de superhelicity van het DNA, en dat een niet-B-DNA-conformatie, mogelijk Z-DNA, in de promotor betrokken is bij de regulatie (42).

Een derde mechanisme zou een differentiële verpakking van het chromosoom kunnen zijn. Voor H. salinarum, is aangetoond dat het chromosoom eiwitvrij is in de vroege exponentiële groeifase en dat het in de stationaire fase is verpakt in reguliere nucleosoomachtige structuren (39). Het is redelijk om te veronderstellen dat deze groeifase-afhankelijke DNA-verpakking een globale invloed zal hebben op transcriptie. Het hyperthermofiele archeon Methanothermus fervidus produceert histonachtige eiwitten tijdens de groeifase, en archaeale histonachtige eiwitten zijn het meest grondig bestudeerd in dit organisme (33). Er bestaan ​​echter twee varianten, HmfA en HmfB, waarvoor verschillen in DNA-binding en verdichting zijn aangetoond. Tijdens de exponentiële groeifase wordt voornamelijk HmfA geproduceerd, terwijl de HmfB-productie gelijk is aan de HmfA-productie tijdens de stationaire fase, opnieuw een mogelijk mechanisme voor globale transcriptionele regulatie (10).


De cel

De mechanismen van transcriptie

Genes, through expression of their protein products, regulate cellular homeostasis and responses to extracellular stimuli. A finely tuned mechanism is necessary for the intricate control of gene expression, given the vast diversity and number of gene-encoded proteins necessary for cellular survival at any given time. Evolution has provided an incredibly complex yet inventive set of mechanisms that control the process whereby the DNA sequence is “read” by specialized transcription factors and an RNA transcript is synthesized, which is subsequently translated into protein. The mechanisms which control which particular gene undergoes transcription, and when, are multifactorial in nature. The enzymes that assemble the transcript from the DNA sequence are regulated by sequence motif versterker elementen within the sequence, allowing specificity in binding transcriptional activators and repressors. This mechanism works in tandem, or is regulated by epigenetic alterations such as histone modifications, DNA methylation, and miRNAs. The interdependence of this transcriptional network allows for extreme selectivity and sensitivity in regulating gene expression.

The Gene Landscape

Genes are divided into specific regions that play major roles in the transcriptional process ( Figure 11 ). De core promoter is the region where transcription is initiated. It contains the transcription start site (TSS) (+1 bp) which is the first nucleotide transcribed into RNA, and several sequence elements that regulate recruitment and positioning of the transcriptional machinery. The presence of each element varies from gene to gene depending upon the frequency at which a gene is activated the TATA box (−28 to −34 bp) is found on many frequently activated genes. Other sequence elements in the core promoter include the transcription factor IIB ( TFIIB) recognition element (BRE), de initiator element (Inr), en downstream promoter element (DPE) (+28 to +34 bp). The Inr element surrounds the TSS, though this sequence is not well-conserved. These elements aid in recognition of the TSS. Upstream of the core promoter is the proximal promoter region (−250 bp) that regulates transcription through the binding of transcription factors (TF). Scattered far upstream and downstream of the core promoter are distal enhancer and silencing elements that also bind transcription factors and promote either activation or repression of transcription. Downstream of the TSS is the gene body, or coding region. This region contains the sequence that is transcribed into RNA and is composed of intronen, regions removed during RNA splicing, and exonen that are spliced together to form the mature mRNA.

Figure 11 . The gene landscape.

A gene is composed of several regions which vary in function. The coding region contains the genetic information that encodes for proteins.

Enhancers, Silencers, and Transcription Factors

Enhancer and silencer elements regulate transcription through the binding of a multitude of TFs that activate or repress transcription. These transcription factor-binding elements influence transcription irrespective of location they may lie proximal to the core promoter or several hundreds of base pairs from the TSS, or even on other chromosomes. Given the limited number of transcription factors compared with the number of genes under transcriptional regulation, and the repetitious use of the same transcriptional machinery, it is the enhancer and silencing motifs found proximally and distally that provide much of the temporal and spatial regulation of transcription. Through the binding of transcription factors, enhancer elements direct which genes are to be transcribed, when transcription takes place, for how long, and at what level of intensity.

The sequence motif of enhancer elements determines the specificity of transcription factor binding, though these sequences are usually degenerate. Variants of consensus sequences may dictate the strength of association with a particular transcription factor, or preferential binding of specific dimerization partners. Sequences may also alter the conformation of a bound transcription factor, affecting its activity. Transcriptional activators may promote preinitiation complex (PIC) formation, regulate primary transcriptional events such as initiation and elongation, and recruit chromatin modifiers. Coactivators have similar functions, but do not bind directly to enhancer elements, instead associating with enhancer-bound activators.

Transcription factors aid in the recruitment of the RNAPII transcriptional complex and recruit chromatin remodelers. How do distal enhancers regulate transcriptional activity at the core promoter, several hundred base pairs away? The multisubunit coactivator Mediator complex binds to distal transcription factors and causes the DNA to loop so that Mediator is in proximity to RNAPII, to which it binds at the C-terminal domain (CTD). In addition to bridging the distance between distal enchancers and the TSS, Mediator also mediates the phosphorylation of RNAPII at serine 5 ( Figure 12 ).

Pre-initiatiecomplex (PIC)

De PIC is composed of several subunits, termed general transcription factors (GTF). These units are the first to assemble at the core promoter. They clear the way for RNA polymerase II (RNAPII) binding by specifying the location of transcription, the orientation of the transcriptional complex, and serve as a platform to which RNAPII locates and binds. They also aid in opening the DNA double strand into an open complex. While bacteria employ only one GTF, RNAPII-mediated transcription in eukaryotes involves several:

TFIID is composed of the TATA-binding protein (TBP) and several TBP-associated factors (TAF). TAFs recognize core promoter elements while TBP binds to the TATA box or in the case of TATAless promoters, the DPE or Inr. The binding of TBP to the TATA box partially unwinds and bends the DNA at the core promoter region.

TFIIA associates with TBP, stabilizing the TBP–DNA interaction.

TFIIB binds the BRE and recognizes the TSS, and links RNAPII with TFIID by binding to TBP and the recruited RNAPII.

TFIIE is involved in the melting of promoter DNA into an open complex.

TFIIF binds to RNAPII, stabilizing RNAPII within the PIC.

TFIIH subunits induce formation of the transcription bubble by promoter melting, in addition to phosphorylating RNAPII at the CTD at serine 5, inducing promoter clearance.

RNA Polymerase

Both prokaryotic and eukaryotic cells employ the multisubunit RNA polymerase (RNAP) complex as the main effector of transcription. Eukaryotic cells employ three types of RNAP (I, II, and III) for synthesizing three different classes of RNA. RNAPII, that synthesizes mRNA, is composed of 10–12 subunits. The RNAPII holoenzyme contains the polymerase associated with GTFs. Functionally, RNAPII is composed of four multisubunit mobile elements:

De kern contains the cleft that is surrounded by the other units the cleft holds the incoming single DNA strand at the active site.

De clamp is a mobile unit connected to the core that opens and closes access to the cleft, stabilizing the DNA–RNA hybrid with the polymerase.

De jaw lobe grips the DNA downstream of the active site.

RNAPII passes the template strand through the core cleft, adding base pairs complementary to the template strand to form an RNA strand which is an exact copy of the coding strand, except that RNA contains uracil in lieu of thymine. RNAPII transcribes 3 to 5′ along the template strand, producing a 5 to 3′ RNA strand. Several RNAPIIs can transcribe a single gene, increasing the amount of RNA produced. The transcription bubble is the unwound DNA structure that allows RNAPII to transcribe along the single template strand. As RNAPII progresses, the DNA downstream is unwound. Subunits of TFIIH have helicase and ATPase properties which facilitate bubble formation. Other functional elements of importance are the C-terminal domain (CTD), which is a repeating heptad sequence that is phosphorylated at specific residues (serine 2 and 5), which govern the initiation and elongation steps. Phosphorylation of this scaffold region regulates transcription by releasing inhibitory factors.

Briefly, GTFs bind to a core promoter sequence (TATA), located upstream of the TSS. This closed, multiunit PIC recruits and binds RNAPII. A small section of the DNA double strand separates, and the template strand lies in the active site of the RNA polymerase. Initial attempts at RNA synthesis may be unsuccessful due to the low stability of the short DNA–RNA strand in the active site once RNAPII synthesizes an RNA strand which is stable, it leaves behind the PIC, “clearing” the promoter. RNAPII proceeds to synthesize.

This event initiates RNA synthesis where the RNAPII complex is released from the promoter region. After this first step of recruitment and initiation, RNAPII undergoes phosphorylation at serine 2 in the CTD (RNAPIIS2), resulting in productive transcriptional elongation along the coding region. Transcription ends with a termination sequence motif (AAUAAA) that halts RNAPII. RNAPII is subsequently dephosphorylated and recycled into a new transcriptional cycle.

Chromatin remodeling. Transcriptional activators bind and induce chromatin remodeling at the promoter region to allow transcriptional machinery access to the transcription start site. Promoters of genes undergoing continual transcription are usually nucleosome-free.

Preinitiation complex assembly. GTFs assemble on the core promoter and recruits RNAPII. A.

TFIID binds to the core promoter through the TBP subunit binding may occur at specific elements such as the TATA or Inr. In promoters lacking specific elements, TAFs associate with the promoter and induce nonspecific binding of TBP. TBP binding to the TATA opens the minor groove, bending the DNA at an 80° angle.

TFIIA binds to TBP, stabilizing the interaction between TFIID and DNA.

TFIIB binds to the core promoter through BRE and positions the DNA for entry into the active site. This TFIID/A/B complex recruits RNAPII and TFIIF simultaneously.

TFIIE joins the complex and recruits TFIIH, aiding in opening the DNA double strand, called promoter melting. TFIIF induces torsional strain, forming the transcription bubble.

TFIIH contains a helicase subunit that unwinds the DNA into two strands it binds to the template strand to ensure transcription of the correct strand. The catalytic activity of TFIIH is dependent upon TFIIE activity, which it interacts with. TFIIH promotes formation of the transcriptional bubble. TFIIH also contains a kinase subunit that phosphorylates RNAPII at the CTD to initiate transcription.

The bridging protein mediator links distal transcriptional activators with the RNAPII complex.

Initiation and clearance. Phosphorylation of the CTD at serine 5 (RNAPIIS5) by TFIIH or a mediator subunit induces RNAPII to clear the PIC and begin transcribing RNA from the DNA template strand RNAPII may pause approximately 50 bp downstream.

Verlenging. Paused RNAPII is phosphorylated at serine 2 (RNAPIIS2) on the CTD by the positive transcription elongation factor b, causing dissociation of the negative elongation factor, allowing RNAPII to proceed into continuous, productive elongation. Chromatin remodeling of nucleosomes occurs as RNAPII transcribes through the coding region.

Beëindiging. Upon reaching the termination signal, the transcribed RNA is released and RNAPII is dephosphorylated, dissociating from the gene to be recycled for subsequent cycles of transcription.


Ondersteunende informatie

S1 Fig. Example of a CDF graphic produced by MAGIC.

Two cumulative functions are displayed: the black curve is the fractional cumulative of all genes in the background list against ChIP values, red is the same for query genes. A blue vertical line denotes the ChIP value at Dsup i.e. argDsup. Red ticks along the x-axis represent each gene in the query list and black ticks are all genes in the background. Red ticks with circles (‘lollipops’) are the n (n = 0.05X) best chiped genes. Black lollipops are genes in the background list with the n highest ChIP values.

S1 Tafel. Background and input list for MCF7(shCon_vs_shREST).

The first column contains 15445 genes in the background list. Second column contains 118 genes induced as described in Methods and Results.

S2 Tafel. Background and input list for TCGA(Lum_vs_Basal).

The first column contains 17815 genes in the background list. Second column contains 203 genes induced as described in Methods and Results.

S3 Tafel. Background and input list for Brain(WT_vs_CTCFko).

The first column contains 15509 genes in the background list. Second column contains 203 genes down-regulated as described in Methods and Results.

S4 Table. Background and input list for DGC(Quiet_vs_Reactive).

The first column contains 5305 genes in the background list. Second column contains 842 genes induced as described in Methods and Results.

S5 Table. REST interactors and rank-ordered algorithm outputs for MCF7(shCon_vs_shREST).

The first column contains proteins associated with REST extracted from the STRING database with a Combined Score>300. Subsequent columns contain ordered lists of Factors predicted to target the input list by the varous algorithms and associated libraries. If the same Factor appears multiple times, it is because there are multiple entries (e.g. ChIP-seq tracks in different cell lines) for that factor in the libraries mined by the algorithm.

S6 Table. Estrogen Receptor alpha (ESR1) interactors and rank-ordered algorithm outputs for TCGA(Lum_vs_Basal).

The first column contains proteins associated with ESR1 extracted from the STRING database with a Combined Score>300. Subsequent columns contain ordered lists of Factors predicted to target the input list by the varous algorithms and associated libraries.

S7 Table. CTCF interactors and rank-ordered algorithm outputs for Brain(WT_vs_CTCFko).

The first column contains proteins associated with CTCF extracted from the STRING database with a Combined Score>300. Subsequent columns contain ordered lists of Factors predicted to target the input list by the varous algorithms and associated libraries.

S8 Table. FOS interactors and rank-ordered algorithm outputs for DGC(Quiet_vs_Reactive).

The first column contains proteins associated with FOS extracted from the STRING database with a Combined Score>300. Subsequent columns contain ordered lists of Factors predicted to target the input list by the varous algorithms and associated libraries.

S9 Table. MAGIC Summary output for MCF7(shCon_vs_shREST).

The analysis statistics for the best scoring example of each Factor in the MAGIC matrix for MCF7(shCon_vs_shREST) are provided in the summary file.

S10 Table. MAGIC Summary output for TCGA(Lum_vs_Basal).

The analysis statistics for the best scoring example of each Factor in the MAGIC matrix for TCGA(Lum_vs_Basal) are provided in the summary file.

S11 Table. MAGIC Summary output for Brain(WT_vs_CTCFko).

The analysis statistics for the best scoring example of each Factor in the MAGIC matrix for Brain(WT_vs_CTCFko) are provided in the summary file.

S12 Table. MAGIC Summary output for DGC(Quiet_vs_Reactive).

The analysis statistics for the best scoring example of each Factor in the MAGIC matrix for DGC(Quiet_vs_Reactive) are provided in the summary file.


Bekijk de video: Dato Siti Nurhaliza - Bisakah Live - Pencalonan Muzik-Muzik AJL24 2007. SINGERS REACT (Januari- 2022).