Informatie

Zijn androgene-anabole steroïden een vorm van genbewerking?


Is het nemen van AAS een vorm van gen-editing? Steroïden veranderen genen op de een of andere manier, omdat ze mensen in staat stellen meer spieren op te bouwen dan wat van nature mogelijk is - dus ze "breken" de natuurlijke genetica op de een of andere manier.

Zou dit, gezien dit gegeven, worden beschouwd als een vorm van genetische manipulatie op levende mensen/etc.? Hoe zit het met relatieve zaken zoals myostatine-remming om spiergroeicelbeperking of HGH-gebruik te voorkomen?

Samengevat: doet het gebruik van AAS/prestatieverhogende middelen/etc. genbewerking inhouden? Zo niet, waarom - en zo ja, waarom en hoe is het vergelijkbaar met zaken als CRISPR en stamcel/etc. methoden?


Steroïden zijn geen vorm van genbewerking

Een gen is een opeenvolging van DNA. Genbewerking betekent het veranderen van deze DNA-sequentie, een beetje zoals het veranderen van de letters in een boek.

In wezen hebben alle medicijnen, inclusief steroïden, invloed op het lichaam zonder de DNA-sequentie te veranderen. Vaak binden ze aan een eiwit, dat het product is van een gen, en veranderen ze de functie ervan. Steroïden binden en veranderen de activiteit van transcriptiefactoren, wat een soort schakelaars zijn die bepaalde genen aan- en uitzetten.

Als het bewerken van genen is als het herschrijven van een boek, zou het nemen van een medicijn hetzelfde zijn als veranderen hoe, wanneer of waar iemand uit het boek leest, zonder de tekst zelf te veranderen.

Als je geïnteresseerd bent in hoe dit allemaal werkt, kun je een aantal geweldige gratis online cursussen zoals deze bekijken: https://www.khanacademy.org/science/biology#intro-to-biology


2. Steroïde hormonen

Steroïde hormonen omvatten de geslachtshormonen, glucocorticoïden en mineralocorticoïden. Binnen de familie van geslachtshormonen zijn de androgenen, oestrogenen en progestagenen. Alle steroïde hormonen binden aan hun eigen specifieke receptor, die cytosolisch of nucleair kan zijn, om veranderingen in een cel teweeg te brengen. Alle natuurlijke steroïde hormonen worden gesynthetiseerd uit cholesterol in de bijnieren en/of geslachtsklieren. Sommige steroïde hormonen worden verder gemetaboliseerd in de lever, perifere en/of doelweefsels. Omdat hun voorloper cholesterol is, zijn ze hydrofoob van aard waardoor ze gemakkelijk door celmembranen kunnen. Eenmaal gesynthetiseerd, worden de steroïde hormonen in de bloedstroom vervoerd en gebonden aan dragereiwitten zoals albumine, steroïde hormoonbindend globuline (SHBG) of corticosteroïd-bindend globuline naar doelweefsels.

Het androgeen dat in de hoogste concentratie in het lichaam wordt geproduceerd, is testosteron (T). Dit is een 19-C-steroïde die androgene en anabole effecten in het lichaam heeft. T wordt voornamelijk geproduceerd in de geslachtsklieren, maar een kleine hoeveelheid wordt geproduceerd in de bijnierschors of door de perifere omzetting van androstenedion. T-productie is veel groter bij mannen dan bij vrouwen (5.000-7.000 mg/dag versus 300 μmg/dag) [2]. Bij mannen wordt T voornamelijk geproduceerd door de Leydig-cellen in de teelballen, terwijl bij vrouwen de primaire productie van T plaatsvindt in de Theca-cellen van de eierstokken. Bij beide geslachten komen kleine hoeveelheden uit de bijnierschors en de perifere omzetting van androstenedion.

T werkt in het lichaam door direct via de AR of indirect via metabolisme naar andere geslachtssteroïden te werken. T kan worden gearomatiseerd tot estradiol (E2) die ER-α en/of ER-β activeert. Als alternatief kan T onomkeerbaar worden omgezet in het krachtigere 5α-dihydrostestosteron (5α-DHT) door het enzym 5α-reductase. T heeft veel fysiologische acties in het lichaam. Het werkt op spieren om groei en onderhoud te stimuleren, het bevordert de botontwikkeling en remt de botresorptie, het verhoogt de rode bloedcellen en het hemoglobinegehalte, verhoogt het libido en de erectiele functie, verbetert de stemming en cognitie en induceert lipolyse. Lage testosteronniveaus of een tekort aan androgeenwerking veroorzaakt kwetsbaarheid, sarcopenie, slechte spierkwaliteit, spierzwakte, hypertrofie van vetweefsel en verminderde neurotransmissie.


Methoden:

Deze systematische review is opgesteld volgens de PRISMA-richtlijn (Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses) [9]. Er werd literatuur gezocht in 7 relevante databases, waaronder Scopus, Medline, Embase, ISI Web of Knowledge, Cochrane central register of controlled trials, Cochrane database systematische reviews en Google Scholar. Om de consistentie en nauwkeurigheid van de resultaten te bevestigen, werden zoekopdrachten uitgevoerd door twee auteurs onafhankelijk van elkaar (DDD & IK). In 3 fasen werden titels, samenvattingen en volledige tekst van studies geëvalueerd. In de laatste fase werden de benodigde gegevens uit de geselecteerde artikelen gehaald. De volgende trefwoorden werden gebruikt als zoektermen: “anabole steroïden”, “androgene steroïden”, “anabole-androgene steroïden”, “androgenen”, “anabolen”, “groeihormoon”, “recombinant menselijk groeihormoon”, “somatropine”, “acute nierbeschadiging”, “chronische nierziekte”, “nierdisfunctie”, “nierfunctiestoornis”, “nierbeschadiging” en “nierinsufficiëntie”. Gerandomiseerde klinische onderzoeken, prospectieve of retrospectieve onderzoeken bij mensen, casusreeksen en casusrapporten en experimentele (in vivo) onderzoeken werden in deze review opgenomen. De referentielijsten van gepubliceerde artikelen zijn ook onderzocht om eventuele aanvullende relevante onderzoeken te identificeren. Wat de publicatiedatum betreft, zijn in deze review artikelen gepubliceerd van 1950 tot december 2017 in aanmerking genomen. Niet-Engelstalige artikelen, congresuittreksels, krantenartikelen en in vitro studies kwamen niet in aanmerking voor opname. De studies die in de systematische review zijn opgenomen, zijn door alle auteurs beoordeeld om ervoor te zorgen dat ze aan de inclusiecriteria voldeden. Eventuele afwijkingen werden door de auteurs besproken. Door rekening te houden met de bovenstaande in- en exclusiecriteria, werden 21 gepubliceerde artikelen in onze beoordeling overwogen. Deze artikelen bevatten experimentele studies (N = 8), casusrapport of casusreeks (n = 8), klinische proefstudie (N = 3), placebogecontroleerd, cross-over klinisch onderzoek (N = 1), en gerandomiseerde, cross-over klinische studie (n = 1). De kwaliteit van klinische onderzoeken werd geëvalueerd met behulp van de Jadad-score. Deze score voor de studies over groeihormoon (N = 5) varieerde van − 1 tot + 2. Figuur 1 toont het stroomschema van ons studieselectieproces. 1327 en 3341 studies die relevant waren voor respectievelijk anabole androgene steroïden en groeihormoon, werden uitgesloten van deze systematische review. Deze uitsluiting was voornamelijk te wijten aan duplicatie in verschillende databases.

Stroomdiagram van studiekeuze voor anabole androgene steroïden (een) en groeihormoon (B)


Resultaten

Kenmerken van deelnemers

In totaal hebben 37 huidige AAS-misbruikers, 33 voormalige AAS-misbruikers en 31 controledeelnemers vrijwillig deelgenomen aan het onderzoek. Eén deelnemer uit de controlegroep werd uitgesloten vanwege cryptorchidisme dat tijdens het onderzoek werd gediagnosticeerd, dus 30 controledeelnemers werden opgenomen in de uiteindelijke analyses. De deelnemers in de drie groepen verschilden niet significant met betrekking tot leeftijd, rookgeschiedenis, voorgeschiedenis van illegale drugs, inkomen of burgerlijke staat, maar huidige AAS-verslaafden voerden meer uren per week krachttraining uit dan deelnemers in de andere twee groepen (P < 0,05 ) (Tafel 1).

Een hoger percentage deelnemers in de controlegroep had een universitair diploma dan de deelnemers in de andere twee groepen (P < 0,01). De totale duur van geaccumuleerd AAS-misbruik (geometrisch gemiddelde (95% BI)) waargenomen onder huidige AAS-misbruikers (142,3 (99,7 203,1) weken) was niet significant verschillend van die waargenomen onder voormalige AAS-misbruikers (111,8 (81,3 153,7) weken), en het aantal gebruikte AAS-verbindingen verschilde ook niet tussen de twee groepen. De twee groepen rapporteerden eerdere en huidige ervaringen met verschillende doses van talrijke AAS-verbindingen, waarvan de testosteron-esters, trenbolon, nandrolon, stanozolol, sustanon en boldenon de meest gebruikte waren (S1-tabel). Hoge percentages van zowel huidige als voormalige AAS-misbruikers meldden dat ze regelmatig hCG- of aromataseremmers gebruikten na AAS-cycli. De verstreken tijd sinds het stoppen met AAS (geometrisch gemiddelde (95% BI)) was 2,5 (1,7 3,7) jaar onder voormalige AAS-misbruikers. Geen van deze deelnemers meldde binnen zes maanden AAS te hebben gebruikt en slechts 15,2% (95% BI) (3,0 27,4) meldde een verstreken tijdsinterval van 6-12 maanden sinds het stoppen met AAS. Elf voormalige AAS-misbruikers waren eerder doorverwezen naar een endocriene kliniek voor gynaecomastie, maar geen enkele was behandeld voor gynaecomastie, hypogonadisme of onvruchtbaarheid. Deze deelnemers verschilden niet van andere voormalige AAS-misbruikers in termen van demografische kenmerken, AAS-misbruik, laboratoriumresultaten of frequentie van hypogonadale symptomen.

Voortplantingshormonen

De grootte van de testikels verschilde significant tussen de drie groepen. Huidige AAS-misbruikers hadden het kleinste testiculaire volume (12,2 (0,7) ml) en voormalige AAS-misbruikers hadden een volume van 17,4 (0,8) ml, wat 4,8 (2,9 6,8) ml kleiner was dan dat van de controledeelnemers met het grootste testiculaire volume (tabel 2). De totale en vrije testosteronspiegels in het plasma waren significant lager bij voormalige AAS-misbruikers dan bij controledeelnemers en huidige AAS-misbruikers, van wie de laatste, zoals verwacht, significant verhoogde plasmatestosteronspiegels vertoonden. De 2,5 - 97,5 - percentielen voor totaal testosteron varieerden van 12,4-32,3 nmol/l onder de controledeelnemers en 5,7-31,4 nmol/l onder voormalige AAS-misbruikers.

Een hoog percentage deelnemers in de groep voormalige AAS-misbruikers (27,2% (13,3 45,5)) lag onder de ondergrens voor totaal testosteron in het plasma geschat bij niet-obese eugonadale gezonde jonge mannen (12,1 nmol/l), terwijl geen deelnemers in de controlegroep (0,0% (0,0 11,6)) waren onder deze limiet (P < 0,01). Verder bevond 3,3% (0,01 15,8) onder voormalige AAS-misbruikers zich onder de onderste referentielimiet voor totaal testosteron in plasma, geschat in een gepoold populatierepresentatief cohort (6,6 nmol/l). Plasmagonadotrofinen, SHBG, 17-hydroxyprogesteron, serum AMH en inhibine B verschilden niet significant tussen voormalige AAS-misbruikers en controledeelnemers, maar waren duidelijk verminderd onder huidige AAS-misbruikers (P < 0,01). Er waren hogere percentages deelnemers met seruminhibine B-spiegels onder de limiet van gestoorde spermatogenese (92 pg/ml) onder huidige AAS-misbruikers (56,8% (39,5 72,7)) en voormalige AAS-misbruikers (9,1% (1,9 24,3)) dan onder controle deelnemers (3,3% (0,01 17,2)) (trendanalyse: P < 0,01).

Geaccumuleerde duur van AAS-misbruik was geassocieerd met verminderde testikelgrootte bij voormalige misbruikers (log2-coëfficiënt (B) (95% BI): -1,3 (-2,4 -0,2), P = 0,02) en huidige AAS-misbruikers (gedurende de eerste 32 weken van AAS-misbruik, spline-functie, log2-coëfficiënt (B): -5,4 (-10,8 -0,02), P = 0,049) (Fig 1). We hebben geen significante associaties waargenomen tussen de totale plasmatestosteronspiegels en de geaccumuleerde duur van AAS-misbruik (log2-coëfficiënt (B): 0,09 (-0,04 0,22), P = 0,17) (Fig 2) of verstreken duur sinds AAS-beëindiging (log2-coëfficiënt ( B): 0,05 (-0,7 0,17), P = 0,42) (Fig 3) onder voormalige AAS-misbruikers.

Voetnoot: AAS, anabole androgene steroïden.

Voetnoot: AAS, anabole androgene steroïden.

Voetnoot: AAS, anabole androgene steroïden.

Onder de huidige AAS-misbruikers was een toenemende geaccumuleerde duur van AAS-misbruik geassocieerd met afnemende serum-inhibine B-spiegels, die een plateau bereikten na 64 weken geaccumuleerde AAS-misbruik (spline-functie, log2-coëfficiënt (B): -47,9 (-80,3 -15,6), P < 0,01) (Fig 4). Toenemende geaccumuleerde duur van AAS-misbruik was ook geassocieerd met afnemende AMH-niveaus onder huidige AAS-misbruikers (log2-coëfficiënt (B): -0,3 (-0,5 -0,04), P = 0,03) (figuur 5).

Voetnoot: AAS, anabole androgene steroïden s-, serum.

Voetnoot: AAS, anabole androgene steroïden.

Symptomen die wijzen op hypogonadisme

Voormalige AAS-misbruikers vertoonden de hoogste frequenties van deelnemers met depressieve symptomen (24,2% (11,1 42,2)), erectiestoornissen (27,3% (13,3 45,6)) en verminderd libido (40,1% (23,2 57,0)) vergeleken met de andere twee groepen (trend analyses: P < 0,05 voor alle drie de parameters) (Fig 6, S2-tabel). Voormalige AAS-misbruikers hadden een lagere score op de SF-36-vragenlijst met betrekking tot 'energie/vermoeidheid' (58,9 (4,3)) dan de controlegroep (73,5 (2,6)) en huidige AAS-misbruikers (69,2 (4,5)) wijzend op voormalige AAS misbruikers vertoonden significant meer uitgesproken vermoeidheidssymptomen dan hun tegenhangers (P < 0,05). We hebben geen significante associaties waargenomen tussen symptomen en hormonale niveaus of mate van AAS-misbruik onder voormalige AAS-misbruikers.

Voetnoot: T-balken geven standaardfouten weer. Depressieve symptomen, erectiestoornissen en verminderd libido werden vergeleken tussen de groepen met trendanalyses en ze waren allemaal statistisch significant (P < 0,05). AAS, anabole androgene steroïden.


Hoe werkt de behandeling?

Het Hunter-syndroom is het gevolg van een mutatie in een gen voor een enzym dat cellen nodig hebben om bepaalde suikers af te breken. Wanneer het enzym defect is of ontbreekt, stapelen de suikers zich op en kunnen ontwikkelingsachterstanden, orgaanproblemen, hersenbeschadiging en vroege dood veroorzaken. Brian Madeux, de eerste patiënt in wat een kleine klinische proef zal zijn, heeft een milde vorm van de ziekte, maar heeft niettemin meer dan twee dozijn operaties ondergaan als resultaat, meldt AP.

Op een dag kunnen onderzoekers genbewerking gebruiken om het gebrekkige gen in cellen te repareren dat ziekten zoals het Hunter-syndroom veroorzaakt. Dat is echter niet het doel van de proef, gesponsord door Sangamo Therapeutics, een biotechbedrijf gevestigd in Richmond, Californië. In plaats daarvan voegt het bedrijf een vervangende kopie van het gen in, met behulp van genbewerking om de DNA-helix van levercellen op een specifieke plaats in de buurt van de promotor, of aan-uit-schakelaar, af te knippen voor het gen voor een eiwit dat albumine wordt genoemd. De cellen repareren de schade door het DNA voor het nieuwe gen in te brengen, geleverd door de onderzoekers samen met de DNA-schaar van de geneditor, en de activiteit van het gen wordt vervolgens gecontroleerd door de krachtige albumine-promotor. Het idee is om van deze gemodificeerde levercellen een fabriek te maken voor het ontbreken van het enzym bij het Hunter-syndroom.

De gerichte aanpak van Sangamo, bekend als 'veilige haven', moet de risico's vermijden van het gebruik van traditionele gentherapie om het genoom van een cel te veranderen, dat het nieuwe gen op een willekeurige plaats in het genoom plakt en mogelijk een kankergen kan activeren. En omdat het lichaam niet veel van het enzym nodig heeft, zou het aanpassen van slechts een klein deel van de levercellen voldoende moeten zijn om de ziekte te behandelen.

Hoewel patiënten met het Hunter-syndroom vaak wekelijkse infusies van het ontbrekende enzym krijgen, daalt hun bloedspiegel binnen een dag, zegt Sangamo-topman Sandy Macrae. De hoop is dat de eenmalige gene-editing-behandeling - gegeven als een intraveneuze infusie van 3 uur - de lever in staat zal stellen het enzym jarenlang met een constante snelheid te blijven maken. Er is echter een waarschuwing: het enzym dat Hunter-patiënten nu krijgen, passeert de bloed-hersenbarrière niet, het nauwe netwerk van cellen dat de hersenen beschermt tegen ziekteverwekkers, en het door de lever gemaakte enzym dat door de genbewerking wordt geproduceerd, misschien ook niet. Dus de nieuwe behandeling stopt mogelijk niet de hersenbeschadiging die kan optreden bij het Hunter-syndroom.


Achtergrond

Androgeenreceptor (AR)-gemedieerde transcriptie is de belangrijkste aanjager van de groei en proliferatie van prostaatkanker (PCa). Activering van deze kritieke signaalroute vindt plaats wanneer AR zich bindt aan androgenen zoals testosteron of dihydrotestosteron (DHT). Dit induceert de translocatie van de AR naar de kern, waar het interageert met DNA op AR-bindingsplaatsen (ARBS). Bijna al deze cis-regulerende elementen (CRE's) bevinden zich op distale intergene of intronische regio's [2, 3]. Het AR-cistrome wordt beïnvloed door verschillende transcriptiefactoren en pioniersfactoren, waaronder FOXA1, HOXB13 en GATA2 [2, 4, 5]. Eenmaal gebonden aan DNA, rekruteren de AR talrijke co-activators (CBP/p300, SRC/p160), chromatine-modifiers (SWI/SNF-BRG1) en co-repressors (HDAC, NCoR) op een zeer gecoördineerde manier [6]. Dit eiwitcomplex interageert fysiek met genpromotors via chromosomale lussen, waardoor basale transcriptionele machines worden geactiveerd om transcriptie aan te sturen. Maar vergelijkbaar met andere nucleaire receptoren, interageren de meeste AR-gereguleerde genen met meerdere ARBS [7]. Er zijn veel meer ARBS (tienduizenden) dan AR-gereguleerde genen (honderden) [8, 9]. We weten niet of deze ARBS-versterkers interageren in een additief, synergetisch of dominant mechanisme om gentranscriptie te induceren. Karakterisering van ARBS-enhancer-activiteit is van cruciaal belang om de onderliggende regelgevende logica van deze transcriptiefactor te interpreteren.

Enhancers zijn traditioneel geïdentificeerd door transcriptiefactorbindingsplaatsen te correleren met chromatinetoegankelijkheid, RNA-polymerase II, GROseq of met enhancer geassocieerde histon-modificaties zoals H3K27ac [10,11,12,13]. Deze kenmerken correleren allemaal in grote lijnen met actieve versterkers, maar ze zijn niet oorzakelijk en zijn daarom extreem vatbaar voor valse positieven [14]. Globaal verlies van het versterkermerk H3K27ac heeft bijvoorbeeld geen functionele invloed op gentranscriptie, toegankelijkheid van chromatine of histonmodificaties [15]. Daarom blijven ectopische reporter-assays, die de door enhancer geïnduceerde transcriptie van een gen kwantificeren, nog steeds de hoeksteen van de validatie van de enhancer [16]. Deze testen worden niet beïnvloed door endogene chromatineverdichting of epigenetische modificaties en kunnen het potentiële versterkervermogen van elke specifieke CRE testen [17]. Hoewel robuust, hebben conventionele benaderingen een zeer lage doorvoer. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn verschillende massaal parallelle reporter-assays (MPRA) ontwikkeld, waaronder Self-Transcribing Active Regulatory Regions sequencing (STARRseq) [18]. Bij deze methode wordt de versterkeractiviteit gekwantificeerd door het meten van de snelheid van zelftranscriptie van het genomische gebied dat stroomafwaarts van een minimale promotor is gekloond. Door zelf-getranscribeerd mRNA te kwantificeren, kan de enhancer-activiteit van vele duizenden potentiële regulerende sites tegelijkertijd worden gemeten en locus-specifieke resolutie bieden.

Er is toenemend klinisch bewijs dat niet-coderende mutaties kunnen fungeren als oncogene drivers in PCa [19,20,21]. Recente onderzoeken door ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat ARBS sterk gemuteerd is op een weefselspecifieke manier [22, 23]. Gezien de cruciale rol van AR in PCa-progressie en behandelingsresistentie, zouden eventuele veranderingen in het transcriptionele landschap de proliferatie van tumorcellen en de gevoeligheid voor AR-pathway-remmers kunnen veranderen. Het vaststellen van een causaal verband tussen niet-coderende mutaties en PCa-groei is echter buitengewoon uitdagend vanwege het ontbreken van functionele CRE-annotatie. Daarom blijft de overgrote meerderheid van deze niet-coderende mutaties onontgonnen in PCa. Een betere karakterisering van deze CRE in PCa is essentieel om mogelijke drivermutaties te stratificeren.

Om de eerste locusspecifieke AR-regulatiekaart te bieden, hebben we de enhancer-activiteit van alle vaak waargenomen klinische ARBS functioneel gekwantificeerd met STARRseq. We hebben aangetoond dat slechts 7% van ARBS androgeenafhankelijke versterkeractivering heeft, terwijl 11% versterkeractiviteit had die onafhankelijk was van AR-binding. Verrassend genoeg had de overgrote meerderheid van ARBS (81%) geen significante androgeenafhankelijke of constitutief actieve versterkeractiviteit. Deze in vitro annotaties correleerden sterk met met enhancer geassocieerde histon-modificaties in klinische PCa-monsters. Om het mechanisme van AR-versterkers te karakteriseren, hebben we vervolgens een machine learning-classificator getraind die met succes actieve versterkers voorspelde en de belangrijkste kenmerken van actieve versterkers identificeerde. Door zowel de lange-afstands-chromatine-interactoom- als transcriptomische gegevens te integreren, ontdekten we dat androgeen-induceerbare versterkers significant meer verrijkt waren als ankers voor gen-looping en fungeerden als "hubs" om AR-gereguleerde genen te activeren. Ten slotte hebben we, door deze resultaten te combineren met sequencing van het volledige genoom van primaire en metastatische PCa, een niet-coderende somatische mutatie geïdentificeerd en gekarakteriseerd die een significante invloed had op de AR-versterkeractiviteit van een kritieke tumorsuppressor.


INVOERING

Anabole androgene steroïden (AAS) zijn synthetische stoffen die zijn afgeleid van testosteron (Fig. ​ 1 1 ) die worden gebruikt vanwege hun trofische effect op spierweefsel, met een netto resultaat in verhoogde spiermassa en kracht. Deze effecten, in combinatie met de neurostimulerende effecten, kunnen de grote prevalentie van AAS onder atleten op alle niveaus verklaren [1-7]. Sporters, en met name bodybuilders en gewichtheffers, zijn de belangrijkste gebruikers van deze stoffen [1, 6]. Individuen die een slank uiterlijk en gespierd uiterlijk wensen, zijn hier ook bij betrokken [2, 3, 7, 8-18].

De drie belangrijkste klassen van anabole androgene steroïden (aangepast van Oberlander, J.G. Henderson, L.P, 2012, geciteerd sub 51).

Hoewel het gebruik van anabole steroïden voor cosmetische doeleinden ten onrechte als relatief onschadelijk wordt beschouwd, zijn anabole steroïden daarentegen schadelijk voor de gezondheid [4, 19-21]. In feite kan hun consumptie een reeks nadelige bijwerkingen op het lichaam veroorzaken. Algemeen wordt aangenomen dat bijwerkingen van AAS alleen kunnen optreden als gevolg van langdurig gebruik [22]. Er zijn echter ook acute bijwerkingen beschreven, voornamelijk bestaande uit hoofdpijn, vochtretentie, gastro-intestinale irritatie, diarree, buikpijn, geelzucht, menstruele afwijkingen en hypertensie. De chronische effecten van AAS-misbruik, naast de neuropsychiatrische en gedragseffecten, omvatten een breed scala aan somatische gevolgen. Veel organen en systemen zijn doelwit van AAS-actie. Bijgevolg kan AAS negatieve effecten uitoefenen op reproductieve, lever-, musculoskeletale, endocriene, renale, immunologische, cardiovasculaire, cerebrovasculaire en hematologische systemen [5, 23-27].

Neuropsychiatrische en gedragseffecten van AAS-misbruik zijn algemeen bekend en beschreven in de literatuur [9, 12, 28-52]. Bij knaagdieren veroorzaakt langdurige toediening van bepaalde AAS gedrags- en neurochemische veranderingen [44, 53-58], die kunnen lijken op vergelijkbare gedragsveranderingen die worden waargenomen bij AAS-misbruikers.

De neurodegeneratieve effecten van langdurig AAS-misbruik maken echter deel uit van een nog niet duidelijk fenomeen waarbij de negatieve effecten van deze medicijnen klinisch stil blijven tijdens de jonge leeftijd. De meeste illegale AAS-gebruikers in de wereld zijn nog steeds jonger dan 50 jaar, te vroeg voor duidelijke symptomatische manifestaties (cognitieve of motorische stoornissen) van mogelijke neurotoxische effecten. [59]. Onlangs heeft Kanayama et al. [59] rapporteerde dat het visio-ruimtelijke geheugen van langdurige AAS-gebruikers significant slechter was dan bij niet-AAS-gebruikers. Bovendien rapporteerden dezelfde auteurs dat de visueel-ruimtelijke prestaties een significante negatieve correlatie vertoonden met de totale levensduur van AAS-dosering [59]. Deze waarnemingen komen overeen met de experimentele gegevens die zijn gerapporteerd door Pierretti et al. [60] die aantoonden dat ratten die suprafysiologische AAS-doses kregen toegediend, ruimtelijke geheugenstoornissen vertoonden.

Er is groeiend bewijs dat niet-medisch gebruik van AAS een neurodegeneratief potentieel heeft. Hoewel de aard van dit effect nog grotendeels niet is opgehelderd, hebben recente dierstudies de herhaling van neurotoxische effecten van AAS aangetoond, variërend van neurotrofine-onbalans tot verhoogde neuronale gevoeligheid voor apoptotische stimuli [61].

Het huidige artikel heeft tot doel de neurotoxiciteit te onderzoeken die verband houdt met AAS-misbruik en de onderliggende veronderstelde mechanismen.


Anemieën bewerken

De tweede proef met gentherapie was aanzienlijk kleiner en de therapie was veel complexer. Het concentreerde zich op twee soorten bloedarmoede waarbij de onderliggende mutaties enige bescherming bieden tegen malaria: sikkelcelanemie en een vorm van β-thalassemie. Deze veranderen de functie van rode bloedcellen en veroorzaken ernstige gezondheidsproblemen. β-thalassemie beschadigt een van de genen voor hemoglobine, wat resulteert in een ernstige onderproductie. Mensen met sikkelcelziekte produceren een hemoglobine dat polymeren vormt, wat resulteert in misvormde rode bloedcellen.

Hoewel het mogelijk is om β-thalassemie te behandelen met een gentherapie die vergelijkbaar is met degene die werkte voor hemofilie - geef gewoon een vervangende kopie van het defecte gen - die niet noodzakelijkerwijs zal werken voor sikkelcelanemie, die een veranderde vorm van hemoglobine produceert . Een van de ideeën die zijn overwogen voor de behandeling van deze bloedarmoede is het reactiveren van het foetale hemoglobinegen. Dit heeft een hogere affiniteit voor zuurstof, waardoor het zuurstof uit de volwassen vorm in de placenta kan opnemen. Maar het stopt binnen een paar jaar na de geboorte.

Deze uitschakeling wordt gedeeltelijk gemedieerd door een eiwit genaamd BCL11A. Dus, in theorie, als je BCL11A elimineert, kun je de foetale hemoglobinegenen reactiveren. Helaas is het niet eenvoudig om er vanaf te komen, omdat het essentiële functies vervult in andere cellen.

Om dit probleem te omzeilen, verkregen de onderzoekers achter het nieuwe werk bloedstamcellen van patiënten met β-thalassemie en sikkelcelziekte. Deze werden vervolgens onderworpen aan CRISPR-genediting, waarbij een stukje DNA werd verwijderd dat essentieel was voor het activeren van BCL11A in rode bloedcellen. Het was niet perfect efficiënt, zoals je zou verwachten, maar het bereikte een niveau waar ongeveer 80 procent van de exemplaren van BCL11A de bewerking had laten uitvoeren. En toen deze bewerkte stamcellen rode bloedcellen in kweek vormden, produceerden ze verhoogde niveaus van foetaal hemoglobine.

De eigenlijke klinische proef omvatte een riskante procedure: de bloedstamcellen van twee patiënten, één met β-thalassemie, één met sikkelcelziekte, werden geëlimineerd. De gen-bewerkte stamcellen werden vervolgens toegediend, waardoor de patiënten een nieuwe bloedtoevoer konden ontwikkelen met behulp van hen. Dit is een zeer agressieve procedure en vereist uitgebreide medische ondersteuning. Beiden hadden ernstige gebeurtenissen die behandeling tijdens het herstel vereisten. Een profiel van een van de deelnemers aan het onderzoek kan helpen verklaren waarom iemand het risico zou nemen.


Lentivirale vectoren beschikbaar

De GET iN Core heeft een verscheidenheid aan lentivirale expressievectoren getest en biedt momenteel aan voor eiwit- en shRNA-expressie en de levering van transcriptiefactorreporters. Deze vectoren zijn zowel commercieel als intern verkregen van kernmedewerkers en klanten. De DNA/RNA-afleveringskern biedt vectorkaarten en -sequenties en overlegt over benaderingen voor klonering in de beschikbare vectoren. Hieronder vindt u een korte bespreking van de vectoren die beschikbaar zijn in de GET iN Core.

 Lentivirale vectoren voor eiwitexpressie

  1. pLVX   familie van vectoren (Clontech) die een CMV-promotor bevatten die de expressie van een cDNA aanstuurt, PGK-promotor die de expressie van het puromycine-resistentiegen regelt. Deze vectoren bevatten GFP om tot expressie te worden gebracht als eiwitfusielabel op ofwel het C- of het N-uiteinde.
  2. pCDH De familie van expressievectoren (System Biosciences) zijn de populairste eiwitexpressievectoren van de Core vanwege het handige ontwerp van hun meerdere kloneringsplaatsen en de geoptimaliseerde keuze van promotors voor de controle van eiwitexpressie (CMV) en expressie van het antibioticumresistentiegen (EF- 1alfa). CMV- en EF1alpah-promoters lijken het meest op het expressiepotentieel, hoewel EF-1alpha iets zwakker is dan CMV, dat zorgt voor hoge expressieniveaus van zowel het transgen- als het antibioticumresistentiegen.
  3. pLU   lentivirale vector (Wistar Institute) geïmpliceerd door de Core voor expressie van uitgescheiden eiwitten zoals cytokines en groeifactoren. De vector herbergt een PGK-promoter die de expressie van een van belang zijnd eiwit controleert dat via de IRES-sequentie aan RFP is gekoppeld. De PGK-promoter zorgt voor robuuste expressie in verschillende celtypen van mensen en muizen met expressieniveaus die dicht bij fysiologisch liggen.
  4. Eiwitexpressievectoren met vooraf gekloond ORF/cDNA dat codeert voor menselijke en muizeneiwitten, zoals ''160' pLV   (Genecopee) en   pLOC   (Open Biosystemen). Omdat het typische lentivirale expressievectoren zijn, zijn dit een goede keuze om vectoren te verwerven die al een ORF/cDNA bevatten voor een interessant eiwit dat klaar is om te worden gebruikt voor het genereren van virussen door de Core.
  5. Vectoren voor stabiele en robuuste cellabeling met fluorescerende eiwitten (GFP, RFP, Tomato) en Luciferase voor in vivo experimenten op cellen die in de dieren zijn geïnjecteerd. Vector pFULT-vector brengt Luciferase gekoppeld aan Tamato tot expressie onder de controle van de menselijke PGK1-promoter. Vector pGreenFire brengt GFP en Luciferase tot expressie, gescheiden door een T2A-link onder controle van de CMV-promoter.

De kern draagt ​​ook lentivirale expressievectoren die verschillende antibioticaresistentiegenen tot expressie brengen, zoals neomycine, blactocidine en puromycine. Daarom kan de kern, indien beschikbaar, het genereren van cellijnen en primaire cellen bieden die stabiel zijn geïnfecteerd met twee en drie eiwitten.

 Lentivirale vectoren voor expressie van shRNA/miR

De kern heeft met succes shRNA tot expressie brengende vector gebruikt van verschillende grote bedrijven zoals Sigma, Open Biosceinces en Capital Biosciences, die op zichzelf staande bibliotheken van shRNA-klonen aanbieden die vooraf zijn gekloond in hun eigen vectoren.

  1. pGIPZ   en zijn analoge   pTRIPZ '160 voor induceerbare expressie (Open Biosystems) brengt RNA tot expressie onder polymerase type II CMV-promoter in een vorm van onrijp shRNA in de microRNA-expressiecassette. Deze vectoren bieden het volgen van de shRNA-expressie door GFP en selectie van positieve klonen met puromycine. De pGIPZ-bibliotheek is tegen een gereduceerde prijs verkrijgbaar via de RNAi/Throughput Core van de Northwestern University, die samenwerkt met DNA/RNA Delivery Core om shRNA tot expressie brengende virussen voor de NU-gemeenschap te genereren.
  2. pLKO   familie van vectoren (Sigma) die RNA-expressie bieden in een vorm van het onrijpe shRNA onder polymerase type III-promotor U6. PLKO-vector maakt ook selectie van de geïnfecteerde cellen met puromycine mogelijk.
  3. pLV  -vectoren (Capital Biosciences) voor expressie van rijp RNAi waarvoor geen nabewerking door DICER- en DROSHA-eiwitten nodig is. Deze vectoren brengen rijpe RNAi-duplex tot expressie onder controle van U6- en H1-promotors in een tegenrichting vanaf 5'- en 3'-uiteinden van de RNAi-sequentie. Bovendien bieden deze vectoren expressie van de GFP-tracker en een antibioticum of resistentiegen. Het bovenstaande bidirectionele dubbele promotorontwerp stelt de gebruiker in staat om de functie van een specifieke RNAi / miR tot expressie te brengen en te bestuderen in cel- en diermodellen die expressie van DICER en / of DROSHA missen, en daarom worden ze geacht geen endogene miR's te hebben.

 Lentivirale vectoren voor afgifte van transcriptiefactor Luciferase-reporters

Lentivirale expressievectoren die DNA-bindende elementen leveren voor transcriptiefactoren stroomopwaarts van Luciferase en GFP. Deze vectoren zijn analogen van bekende Luciferase-reporters die overal worden gebruikt voor transiënte transfecties van doelcellen om de activiteit van transcriptiefactoren te bestuderen. Tot op heden heeft de Core reporters verworven voor de volgende transcriptiefactoren: NF-kappaB, AP1, p53, HIF1alpha, TCF/LEF, NOTCH1, steroïde responselement, humane Involucrin-promoter, endoplasmatisch stressresponselement.