Informatie

Waarom splitsen type II-restrictie-endonucleasen zich op palindroomsequenties?


Type II Restrictie-enzymen knippen meestal alleen op palindroomsequenties. Is daar een specifieke reden voor? Is er enig voordeel voor bacteriën als ze faag-DNA op dit type sequentie splitsen?


Ten eerste knippen niet alle restrictie-enzymen op palindroomsequenties. Veel van hen doen dat echter wel, simpelweg omdat het effectiever is. Door een palindroomsequentie te herkennen, kunnen ze beide DNA-strengen op de "dezelfde" plaats knippen, omdat de streng dezelfde sequentie alleen in verschillende richtingen op die plaats zal hebben.

Zie bijvoorbeeld Wikipedia.


Kort antwoord

Door de palindroomsymmetrie van de restrictieplaats kan een dimeer enzym het DNA binden op een manier die de dubbele helix buigt op een manier die de endonucleasereactie vergemakkelijkt.

Meer gedetailleerd antwoord:

De 'palindroom' aard van de herkennings-/splitsingsplaats van restrictie-endonucleasen, zoals EcoRV (hier afgebeeld) resulteert in een vorm van symmetrie (A) waardoor een dimeer enzym - dat een tunnel vormt - symmetrisch kan binden op die plaats in het DNA (B).
Deze binding zorgt ervoor dat het DNA kromming (C) een katalytisch magnesiumion in een positie brengen waarin het kan interageren met fosfaat van de fosfodiesterbinding die wordt gesplitst (D). (De dimere aard van het enzym maakt het mogelijk om op twee punten kracht uit te oefenen om de buiging te produceren. Vergelijk het buigen van een dunne pijp over de knie, waarbij met beide handen evenveel kracht wordt uitgeoefend.) Methylering van het adenine-nucleotide in de herkenningssequentie voorkomt waterstofbinding van het enzym aan het DNA. DNA dat de herkenningsplaats mist, wordt niet gesplitst door het restrictie-enzym omdat het niet specifiek aan het eiwit bindt, zodat het magnesiumion te ver weg blijft.

Verwijzing

Dit antwoord is gebaseerd op hoofdstuk paragrafen 9.3.2 en 9.3.3 van Berg et al., die online beschikbaar is op NCBI Bookshelf en de moeite waard is om volledig te lezen. Hierop staat ook een PDB Molecuul van de Maand item, al is de buiging van het DNA helaas niet te zien op de afbeeldingen daar.

Reageer op de laatste twee zinnen van de vraag

Er is geen specifiek "voordeel voor bacteriën" behalve "het werkt". Dus ik denk dat de laatste zin dingen vanuit het verkeerde perspectief bekijkt.


Deze RE's, die palindromen herkennen, zijn meestal homodimeren en daarom dezelfde sequenties (voor elk monomeer) voor herkenning, alleen zijn ze omgekeerd. Dit verklaart de palindromen.


Endonucleasen: functies, typen en voorbeelden

De endonucleasen het zijn enzymen die de fosfodiesterbindingen in de nucleotideketen doorknippen. Endonuclease-restrictieplaatsen zijn zeer gevarieerd. Sommige van deze enzymen knippen bijna overal DNA (desoxyribonucleïnezuur, ons genetisch materiaal), dat wil zeggen dat ze niet-specifiek zijn.

Daarentegen is er een andere groep endonucleasen die zeer specifiek is in het gebied of de sequentie die moet worden gesplitst. Deze groep enzymen staat bekend als restrictie-enzymen en ze zijn zeer nuttig in de moleculaire biologie. In deze groep hebben we de bekende enzymen Bam HI, Eco RI en Alu I.

In tegenstelling tot endonucleasen is er een ander type katalytische eiwitten - exonucleasen - die verantwoordelijk zijn voor het verbreken van de fosfodiesterbindingen aan het einde van de keten.


RESTRICTIE-ENDONUCLEASEN: MOLECULAIRE SCHAAR VOOR HET SPECIFIEK SNIJDEN VAN DNA

Tegenwoordig, in het tijdperk van de moleculaire biologie, is de studie van het genoom van een organisme (het volledige DNA) een centraal onderdeel van ons begrip van biologie. Toen wetenschappers voor het eerst overwogen om genomen te bestuderen, stonden ze voor een probleem: hoe het DNA van een genoom reproduceerbaar in fragmenten te knippen die klein genoeg waren om te hanteren? Het was een aanzienlijk probleem. Genomen zijn samengesteld uit grote DNA-brokken in de orde van miljoenen eenheden, terwijl een wetenschapper redelijkerwijs slechts stukken DNA van een paar duizend eenheden lang zou kunnen verwerken. Een discrepantie die veel te groot was om te overbruggen, dus een methode om DNA reproduceerbaar in hanteerbare stukken te knippen, was nodig om de genomische studies vooruit te helpen. Toen deze vraag in de jaren zeventig voor het eerst werd gesteld, werd het een relatief eenvoudige oefening om DNA te isoleren en het vervolgens willekeurig op te splitsen met behulp van chemische of mechanische middelen. Helaas was dit willekeurig knippen geen bevredigende manier om kleinere stukjes DNA te verkrijgen, omdat het onmogelijk was om te zeggen wat de oorspronkelijke volgorde van de DNA-fragmenten was, een belangrijk punt omdat de specifieke volgorde van DNA essentieel is voor zijn functie. De biologen zaten vast. Er was een doorbraak nodig.

Zoals met veel van de belangrijke ontdekkingen in de biologie, was het de studie van bacteriën die deze doorbraak opleverde. Er werd ontdekt dat een type bacterieel enzym het vermogen bleek te hebben om DNA in een reageerbuis te knippen [1-2]. Deze restrictie-endonucleasen, zo genoemd omdat ze dubbelstrengs DNA op beperkte plaatsen knippen, werden ontdekt als een natuurlijk onderdeel van de bacteriële machinerie. In een bacteriële cel werken restrictie-endonucleasen (vaak restrictie-enzymen genoemd) als een soort immuunsysteem, dat de cel beschermt tegen de invasie van vreemd DNA, zoals zou gebeuren wanneer een virus zou proberen een bacteriële cel te infecteren. Deze restrictie-endonucleasen boden biologen een hulpmiddel om DNA te bestuderen en te manipuleren door het genereren van DNA-fragmenten van consistente grootte mogelijk te maken. Ze worden nu gebruikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder klonen, Southern-hybridisatie-analyse, DNA-sequencing en globale genexpressie-analyse (SAGE). Hun belang voor biotechnologie wordt duidelijk als we de catalogus doorbladeren van elk bedrijf dat reagentia levert voor moleculair biologisch werk - er zijn pagina's en pagina's gewijd aan het opsommen van verschillende restrictie-enzymen. Lijsten die blijven groeien naarmate er meer enzymen worden ontdekt. Eerlijk gezegd is het onwaarschijnlijk dat veel recombinant-DNA-technologieën, waar de biotechnologie sterk op vertrouwt, zijn ontwikkeld zonder de ontdekking van restrictie-enzymen.

De ontdekking van restrictie-enzymen

Restrictie-endonucleasen werden ontdekt tijdens experimenten om het vermogen te bepalen van een bacteriofaag (de naam die wordt gegeven aan virussen die bacteriën infecteren) om twee verschillende laboratoriumstammen van Escherichia coli genaamd stam B en stam K [2] te infecteren. In deze experimenten werden bacteriofagen geïncubeerd met de verschillende stammen van E. coli en werd het vermogen van de bacteriofaag om de E. coli-cellen te doden gevolgd. Een bacteriofaag zorgt er normaal gesproken voor dat een geïnfecteerde bacteriële cel openbreekt, de cel doodt, terwijl miljoenen bacteriofagen vrijkomen die zich in de cel hadden gerepliceerd. Toen bacteriofagen die uit E. coli-stam B-cellen lekten, werden geïsoleerd, bleken ze zeer succesvol te zijn in het opnieuw infecteren van E. coli-stam B-cellen. Maar toen deze bacteriofagen werden geïncubeerd met E. coli-stam K, bleek dat slechts enkele van de bacteriofagen konden repliceren. Dit was een merkwaardige observatie. Nog merkwaardiger was het feit dat na een reeks incubaties van de bacteriofaag met stam K, het vermogen van de bacteriofaag om stam K te infecteren en te doden toenam. Met een terugschakeling naar stam B vertoonden deze bacteriofagen, die nu in staat waren om stam K in hoge mate te infecteren, een vermindering van hun vermogen om stam B te infecteren (zie figuur 1). Het bleek dat deze bacteriofagen, die voorheen in staat waren om stam B in hoge mate te infecteren, in de loop van de groei in stam K-cellen waren overgegaan op stam K-infectieus.


Figuur 1. B- en K-infectieuze bacteriofagen.

Voor de onderzoekers suggereerden de resultaten van dit experiment twee dingen. De eerste was dat stam K en stam B elk een mechanisme hadden dat het infectieuze vermogen van bacteriofaag geïsoleerd uit de tegenovergestelde stam 'beperkte'. Dit werd ondersteund door de vermindering van de besmettelijkheid van de bacteriofaag toen deze aanvankelijk van de ene stam naar de andere werd overgeschakeld. De tweede was dat de beperking van de besmettelijkheid van de bacteriofaag verloren ging toen het DNA van de bacteriofaag in de bacteriële cel werd gerepliceerd. Dit werd bewezen door de terugkeer van de besmettelijkheid van de bacteriofaag na verschillende passages in de nieuwe gastheerstam van bacteriën.

Wat was dit beperkende mechanisme? Het blijkt dat een bacterie zijn eigen DNA 'labelt' door het op speciale manieren te modificeren. In sommige bacteriën is aan het cytosine-nucleotide bijvoorbeeld een extra enkele koolstofgroep (aangeduid als een methylgroep) toegevoegd. Deze modificatie wordt methylering genoemd [3]. Elke keer dat een bacterie zijn DNA repliceert, worden deze modificaties toegevoegd aan het nieuw gesynthetiseerde DNA. Wanneer DNA van buiten de cel komt, zoals wanneer een bacteriofaag zijn DNA in een bacterie injecteert, heeft het deze modificaties niet en wordt het dus herkend als een vreemd object voor de cel. Zoals je je kunt voorstellen, wil een bacterie niet dat er vreemd en potentieel schadelijk DNA in ronddrijft en doet daarom elke poging om het af te breken wanneer het wordt gedetecteerd. Om deze functie uit te voeren, evolueerde een reeks enzymen om DNA te hakken dat geen gemethyleerde enzymen waren die later werden genoemd restrictie endonucleasen [2]. Het bestaan ​​van deze enzymen verklaart de verschillen in infectiesnelheid tussen E. coli B- en K-stammen hierboven. Als bacteriofaag-DNA erin zou slagen om aan vernietiging te ontsnappen, zou de replicatie van dit vreemde DNA door de bacterie in de loop van de tijd het bacteriofaag-DNA markeren met dezelfde modificaties als de gastheer, het zou dan niet langer als vreemd worden herkend en een bacterie kunnen infecteren op een veel grotere frequentie. De ontdekking van dit relatief eenvoudige systeem om het verschil tussen gastheer en vreemd DNA te detecteren, leverde biologen een nieuw moleculair hulpmiddel op: bacteriële enzymen die DNA konden knippen, net als met een schaar in papier.

Hoe restrictie-enzymen werken en worden gebruikt?

Er is al vermeld dat restrictie-endonucleasen vreemd DNA herkennen aan hun gebrek aan methylering3, maar de manier waarop deze enzymen DNA knippen verschilt. Sommigen knippen het vreemde DNA willekeurig door. Terwijl anderen een bepaalde DNA-herkenningssequentie herkennen en dan ofwel binnen deze DNA-sequentie knippen, ofwel meerdere nucleotiden er vanaf. Waar een restrictie-endonuclease in een DNA-molecuul snijdt, is een van de belangrijkste kenmerken waarmee het wordt geclassificeerd [2]. Type II restrictie-endonucleasen herkennen bijvoorbeeld een bepaalde sequentie en knippen binnen die sequentie, terwijl type III restrictie-endonucleasen buiten hun herkenningsplaats knippen, waarbij de geknipte plaats mogelijk een dozijn nucleotide basenparen verwijderd of enkele duizenden basen verwijderd is.

Met name Type II restrictie-endonucleasen zijn een uitzonderlijk hulpmiddel geworden voor de moleculair bioloog om specifiek DNA te knippen. Deze enzymen binden op elke positie aan DNA en reizen dan langs de DNA-streng totdat ze een herkenningssequentie bereiken [2]. Een sterke binding van het enzym op de herkenningsplaats zorgt ervoor dat de structuur verandert, waardoor de delen van het enzym die nodig zijn voor DNA-splitsing dicht bij de DNA-streng komen. Eenmaal bereikt kan de 'ruggengraat' van het DNA-molecuul worden gesneden om twee DNA-fragmenten uit één te produceren (zie figuur 2). Het zijn de herkenningsplaatsen die de sleutel vormen tot hoe één DNA-fragment op een specifieke manier in tweeën kan worden geknipt. Deze plaatsen kunnen in grootte variëren, waarbij sommige restrictie-endonucleasen sequentiemotieven in DNA herkennen die vier nucleotiden lang zijn, terwijl andere sequenties herkennen die twintig nucleotiden lang zijn. Het nucleotidepatroon dat door verschillende restrictie-enzymen wordt herkend, is behoorlijk variabel, hoewel het vaak palindroom is. Een palindroomsequentie is hetzelfde wanneer gelezen in de richting van 5'8242 tot 3'8242 op beide complementaire DNA-strengen, een voorbeeld is de palindroomsequentie die wordt herkend door het restrictie-enzym dat bekend staat als EcoRI (zie figuur 2).


Figuur 2. Een EcoRI-restrictie-enzym.

EcoRI herkent een patroon van zes nucleotiden dat GAATTC leest van het 5'8242 naar het 3'8242 uiteinde van het DNA-molecuul. Het complement van deze sequentie (op de tegenovergestelde DNA-streng) leest ook GAATTC als het wordt gelezen van 5'8242 tot 3'8242. In figuur 2 zie je een illustratie van een EcoRI-molecuul dat bindt aan en een DNA-streng splitst, hier kun je de palindroomherkenning voor het molecuul zien. In dit scenario is de splitsing van het DNA-molecuul door EcoRI symmetrisch - waarbij het enzym op hetzelfde punt in de sequentie (tussen de G en de A bij het lezen van 5'8242 tot 3'8242) op beide strengen snijdt. Een belangrijk kenmerk van deze splitsing zijn de '8220overhangende' uiteinden van het DNA-molecuul die worden geproduceerd. Deze uitsteeksels worden vaak “kleverige uiteinden genoemd, ”, omdat ze kunnen binden aan of kleven aan een complementaire sequentie van DNA (in dit geval 5′-AATT-3′). Deze plakkerigheid wordt vaak gebruikt in het proces van DNA-klonering om de adhesie van twee DNA-fragmenten te helpen. Over het algemeen zijn restrictie-endonucleasen behoorlijk variabel in de DNA-uiteinden die ze produceren bij splitsing, bijvoorbeeld overhangende delen op de 5'8242 (zoals in EcoRI in figuur 2), een overhang van 3'8242 of helemaal geen overhang (aangeduid als “blunt'8221 eindigt).

De frequentie waarmee een bepaalde restrictie-endonucleasen DNA knipt, hangt af van de herkenningsplaats van het enzym. Zoals eerder vermeld, herkennen sommige enzymen plaatsen die vier nucleotiden lang zijn (simpelweg ''8220four cutters'8221 genoemd). Met een snelle berekening en een paar uitgangspunten kan men met deze kennis inschatten hoe vaak een stukje DNA moet worden afgeknipt. Bijvoorbeeld, met de vier nucleotidebasen waaruit DNA bestaat, is de kans dat een nucleotide op een bepaalde locatie voorkomt ¼. In het geval van een “fourcutter” moet een specifieke sequentie van vier nucleotiden aanwezig zijn en aangenomen dat elk nucleotide een gelijke kans (dwz ¼) heeft om op een bepaalde plaats voor te komen, dan is ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = 1 /256, zou een four-cutter gemiddeld eens per 256 basenparen moeten knippen.

Een vergelijkbare berekening kan worden toegepast op elk restrictie-enzym zolang de grootte van de herkenningsplaats bekend is, waardoor het mogelijk wordt om de grootte en het aantal DNA-fragmenten te voorspellen die zouden worden verkregen door een DNA-molecuul van bekende grootte te knippen. Dit feit gaf moleculair biologen de methode die ze nodig hadden om DNA-fragmenten van bekende grootte te produceren voor hun experimenten, zoals bij het in kaart brengen van genen en genetische manipulatie.

Elke catalogus van moleculair biologische reagentia biedt een voorbeeld van de grote verscheidenheid aan restrictie-endonucleasen die beschikbaar zijn voor onderzoek, en hun namen zijn nogal vreemd: EcoRI, BamHI, BglII (uitgesproken als '8220Bagel two'8221) en de pittige SexAI. Hun ontdekking heeft de grenzen van de moleculaire biologie naar grotere dingen verlegd, waardoor de ontwikkeling van technieken mogelijk is om genetisch gemodificeerde eiwitten te creëren, genen te lokaliseren en mutaties te detecteren die ziekte veroorzaken. Wie had gedacht dat een heel klein schaartje zo handig kon zijn?

Geraadpleegde tekst en aanvullende lectuur

1. Old R.W., Primrose S.B., eds. (1994). Principes van genmanipulatie: een inleiding tot genetische manipulatie, 5e Ed. Blackwell Scientific Publications, V.S.
2. Burrell M.M., uitg. (1993). Enzymen van moleculaire biologie. Humana Press Inc., New York.
3. Kendrew J., ed. (1994). De encyclopedie van moleculaire biologie. Blackwell Scientific Publications, Oxford.

(Art by Jane Wang - let op: hoge resolutie-versies van afbeeldingsbestanden zijn hier beschikbaar)


Beperking Vertering van DNA en DNA-monsters | Moleculaire biologie

In dit artikel gaan we in op de restrictiedigestie van DNA en DNA-monsters.

Beperking Vertering van DNA:

Restrictie-endonucleasen knippen DNA-moleculen in kleinere stukjes. Ze knippen DNA op de specifieke herkenningsvolgorde, zodat het niet meer vatbaar is voor splitsing door de endonucleasen. Deze enzymen zijn in vivo aanwezig in bacteriën en zijn betrokken bij de herkenning en vernietiging van vreemd DNA zoals dat van de binnendringende faag. Ze herkennen specifieke sequenties die palindroomsequenties worden genoemd in het DNA-molecuul (wanneer die se­quence in DNA voorkomt) en splitsen symmetrisch beide strengen.

Er zijn drie hoofdtypen restrictie-enzymen, namelijk I, II en III. Type I & III bevatten de restrictie- en modificatiemogelijkheden in hetzelfde multi-subunit enzymcomplex. Ze hebben ATP nodig voor splitsing en klieven het DNA op aanzienlijke afstand van de herkenningssequentie. Daarentegen zijn type II endonucleasen niet fysiek geassocieerd met de overeenkomstige modificatie methylasen. Het vereist geen ATP voor splitsing en shyage en wordt over het algemeen binnen of heel dichtbij gesplitst
de herkenningsvolgorde. Daarom hebben type II endonucleasen de voorkeur bij het splitsen van specifieke plaatsen om gedefinieerde fragmenten te genereren. Er zijn meer dan 600 verschillende commercieel verkrijgbare Type II-enzymen geïsoleerd door molecu- en shylar-biologen. Ze knippen alleen dubbelstrengs DNA en elk van de specifieke sequenties is een palindroom. Deze eigenschappen maken deze enzymen uiterst nuttig bij RFLP- en DNA-vingerafdrukken.

Vertering van DNA-monsters:

Een typische reactie op digestie met restrictie-enzymen omvat de incubatie van een restrictie-enzym met DNA in aanwezigheid van een geschikte buffer en ionenconcentraat bij een specifieke temperatuur en duur.

1. Pipetteer naar een schoon centrifugebuisje dat op ijs wordt bewaard:

5 ul geschikte 10x buffer.

5-10 g DNA-monster. (Maniatis beveelt 1 μg/20 l aan)

Water tot eindvolume van 50 ul.

2. Voeg 1-2 (meestal 3 tot 20 eenheden) van het gewenste enzym toe en meng voorzichtig door erop te tikken. Het volume van het toegevoegde restrictie-en­zyme mag niet groter zijn dan 10% van het totale volume. Als er meer enzym nodig is, moet de vertering in een groter volume worden gedaan.

3. Incubeer het reactiemengsel 's nachts bij de aanbevolen temperatuur (voor de meeste enzymen is dit 37°C).

4. Voer een aliquot onverteerd DNA (zonder enzym) en verteerd DNA uit op een mini-agarosegel om volledige vertering te verzekeren.

5. Als het DNA volledig is gesplitst, kan het monster worden gezuiverd met fenol: chloroform en het gesplitste DNA laten neerslaan.

6. Voeg 1/l0e volume 3(M) natriumac­etaat toe aan het reactiemengsel en tweemaal het volume gekoelde ethanol en houd het gedurende twee uur bij -20 °C.


EXPERIMENT ANALYSE

als de verklaring wordt ondersteund door de gegeven informatie

als de verklaring wordt tegengesproken door de verstrekte informatie

als de verklaring niet wordt ondersteund of tegengesproken door de verstrekte informatie.)

9. ___ Met behulp van menselijke genomische DNA-monsters die zijn geknipt met MboI of SstI, zouden de twee enzymen identieke fragmenten genereren.

10. ___ De twee enzymen genereren "kleverige" uiteinden die complementair zijn aan elkaar.

11. ___ Een door SstI gegenereerd DNA-fragment kan gemakkelijk worden geligeerd aan een met MboI geknipt fragment.


Invoering

Restrictie-enzymen worden ook wel "moleculaire schaar" genoemd omdat ze DNA op of nabij specifieke herkenningssequenties die bekend staan ​​als restrictieplaatsen, splitsen. Deze enzymen maken één incisie in elk van de twee DNA-strengen en worden ook restrictie-endonucleasen genoemd. 4

Virussen infecteren de gastheercellen door hun DNA in de cellen te injecteren. Dit virale DNA kaapt de machinerie van de gastheercel voor reproductie van viraal nageslacht, wat resulteert in de dood van de gastheercel. Om de virale infectie te overwinnen, hebben veel bacteriën en archaea verschillende mechanismen ontwikkeld. Een belangrijk beschermend mechanisme omvat het gebruik van restrictie-enzymen om het binnendringende virale DNA af te breken door het op specifieke restrictieplaatsen te splitsen. Tegelijkertijd beschermt de gastheercel zijn eigen DNA tegen splitsing door gebruik te maken van andere enzymen, methylasen genaamd, die adenine- of cytosinebasen in gastheerherkenningssequenties methyleren. Voor elk van de restrictie-enzymen produceert de gastheercel een overeenkomstige methylase die het gastheer-DNA methyleert en beschermt tegen afbraak. Deze enzymen vormen de restrictie-modificatie (R-M) systemen.

De restrictie-enzymen katalyseren de hydrolyse van de binding tussen het 3'-zuurstofatoom en het fosforatoom in de fosfodiësterruggengraat van DNA. De enzymen hebben Mg2+ of andere tweewaardige ionen nodig voor hun activiteit.


Beperking Spijsvertering en agarosegelelektroforese

Jeffrey M. Becker, . Eve Ann Zachgo, in biotechnologie (tweede editie), 1996

Invoering

Restrictie-endonucleasen zijn enzymen die specifieke nucleotidesequenties in dubbelstrengs DNA herkennen en zijn een belangrijk hulpmiddel voor de biotechnoloog. Voor prokaryotische cellen functioneren ze in de natuur als restrictie-modificatiesystemen en zullen ze vreemd DNA splitsen dat de bacteriële cel binnenkomt (bijv. bacteriofaag), maar zullen ze geen gastheer-DNA splitsen dat is "beschermd" of gemodificeerd door methylering. De meeste restrictie-endonucleasen zullen DNA reproduceerbaar splitsen op een nauwkeurig punt binnen een herkenningssequentie. Over het algemeen zullen verschillende enzymen verschillende sequenties herkennen die vier tot zes nucleotiden lang zijn. Deze precisie is essentieel voor moleculaire kloneringstechnieken, zoals het isoleren van genen uit genomisch DNA of het inbrengen van vreemd DNA in een plasmide. Veel enzymen maken reproduceerbare verspringende sneden met betrekking tot de dyade-symmetrie-as van hun herkenningssequentie. Splitsingen van dit type zullen DNA-fragmenten opleveren met overhangende 3'- en 5'-uiteinden of "kleverige uiteinden" die basenparen kunnen vormen met DNA-fragmenten die door hetzelfde enzym zijn gegenereerd en zo recombinante moleculen kunnen vormen. Andere enzymen zullen de herkenningsplaats afsnijden Bij de symmetrie-as om splitsingsproducten met stompe uiteinden op te leveren. Deze kunnen worden geligeerd aan andere fragmenten met stompe uiteinden, ongeacht het gebruikte restrictie-enzym.

De tweede techniek die in deze oefening wordt geïntroduceerd, is agarosegelelektroforese. Wanneer agarose wordt gesmolten en vervolgens afgekoeld in een waterige oplossing, vormt het een gel door waterstofbinding. De populatie DNA-fragmenten gegenereerd door restrictie-enzymen zal onder invloed van een elektrisch veld door een agarosegel bewegen, waar negatief geladen DNA-moleculen naar de anodes worden getrokken. Hun bewegingssnelheid is bijna volledig gebaseerd op grootte, waarbij de grootste moleculen de laagste mobiliteiten hebben. De concentratie van agarose in de gel bepaalt de poriegrootte en een DNA-fragment met een bepaalde grootte zal met verschillende snelheden migreren door gels met verschillende concentraties.

Er is een lineair verband tussen de log van mobiliteit en gelconcentratie over een bepaald bereik van fragmentgroottes, dus er moet een gelconcentratie worden gekozen die de moleculen in de DNA-populatie effectief zal scheiden. Gels van 0,8% (w/v) agarose zijn geschikt voor het scheiden van lineaire DNA-moleculen met een grootte van 0,5-10 kb. De log molecuulgewichten van de bekende markerfragmenten, zoals λ faag geknipt met de restrictie nuclease hihidIII, kan worden uitgezet tegen mobiliteit. De resulterende kalibratiecurve kan worden gebruikt om de molecuulgewichten van onbekende DNA-fragmenten te bepalen. Als een snelle maatstaf kan het molecuulgewicht van een onbekend fragment worden geschat door directe vergelijking op het oog met de positie van λ-fragmenten op de gel. De banden worden zichtbaar gemaakt door ultraviolet (UV) licht na kleuring met de fluorescerende kleurstof, ethidiumbromide. (De juiste hoeveelheid DNA die in een band aanwezig is, kan ook worden geschat door de fluorescentie-intensiteiten te vergelijken, zoals in oefening 5, deel C.)

Zuiverheid en eventuele afbraak van het DNA kunnen ook worden bepaald op agarosegels. Besmetting met RNA kan worden gedetecteerd als een breed uitstrijkje met een laag molecuulgewicht. RNA kan worden verwijderd door toevoeging van RNase aan restrictiedigesten. Besmetting met eiwit kan leiden tot gedeeltelijke remming van de activiteit van restrictie-enzymen of afbraak van het DNA. Eiwitverontreinigingen kunnen worden verwijderd door extractie met fenol-chloroform en daaropvolgende ethanolprecipitatie. Een overmaat aan zout in een plasmidebereiding zal vaak ook de enzymatische activiteit remmen. Zout kan worden verwijderd door ethanolprecipitatie gevolgd door wassen van een DNA-pellet met 70% (v/v) ethanol. De agarosegel zal laten zien of het verteerde plasmide de banden oplevert die worden verwacht van bekende restrictieplaatsen op de plasmidekaart. Als het DNA is afgebroken, bijvoorbeeld door DNasen te besmetten, zal het DNA als een uitstrijkje in de gekleurde gel verschijnen.

In deze oefening zullen we restrictie-enzymen en agarose-minigels gebruiken als een snel diagnostisch hulpmiddel om de grootte en zuiverheid van zowel maxi-prep als mini-prep pRY121-DNA te bepalen. Bovendien kan de geschatte hoeveelheid plasmide-DNA in de monsters worden bepaald door "bandhelderheid" -vergelijking (zie oefening 5 , deel C). Het succes van de PCR-amplificatie van a lacZ genfragment, zoals geprobeerd in Oefening 7 , zal ook in deze oefening worden geëvalueerd.


Wat is een type II restrictie-enzym?

Type II-restrictie-enzymen zijn het soort dat wordt gebruikt voor de meeste moleculaire biologietoepassingen zoals genklonering, DNA-fragmentatie en analyse.

Ze klieven DNA op vaste posities met betrekking tot hun herkenningssequenties. Meer dan 3.500 Type II-enzymen zijn gekarakteriseerd, waarbij meer dan 350 verschillende DNA-sequenties zijn herkend.

Restrictie-enzymen zijn genoemd naar het micro-organisme waaruit ze oorspronkelijk werden gezuiverd. HindIII was bijvoorbeeld het derde enzym dat werd gevonden in Haemophilus influenzae, serotype d.

Type II restrictie-enzymen variëren sterk in grootte, aminozuursequentie, domeinorganisatie en subeenheidsamenstelling, cofactorvereisten en werkingsmechanismen.

Ze zijn losjes gegroepeerd in subtypes op basis van hun enzymatische eigenschappen. De vier belangrijkste subtypen zijn Type IIP, IIS, IIC en IIT.

Type IIP-enzymen zijn goed voor meer dan 90% van de enzymen die in de moleculaire biologie worden gebruikt. Ze herkennen symmetrische of palindroom sequenties met een lengte van 4-8 basenparen en splitsen in het algemeen binnen die sequentie. De samenstelling van de subeenheid van Type IIP-enzymen hangt af van de lengte van de herkenningssequentie van het enzym.

Enzymen die korte sequenties van 4 bp herkennen, werken als monomeren, die enkelvoudige eiwitketens omvatten, terwijl enzymen die langere sequenties van 6-8 bp herkennen, typisch werken als homodimeren die twee identieke eiwitketens omvatten. Nog andere Type IIP-enzymen werken als dimeren van dimeren of homotetrameren. Deze laatste binden aan en splitsen twee of meer herkenningssequenties tegelijk.

Bij splitsing laten sommige Type IIP-enzymen enkelstrengs overhangen achter, terwijl andere stompe uiteinden achterlaten.

In tegenstelling tot Type IIP-enzymen, waarbij de aminozuren die splitsing katalyseren en die welke het DNA herkennen, zijn geïntegreerd in een enkel eiwitdomein, zijn in de grotere Type IIS-enzymen die aminozuren verdeeld in twee afzonderlijke domeinen, verbonden door een korte polypeptide-connector.

Door deze scheiding wordt het katalytische domein gepositioneerd aan één kant van, en meerdere basenparen verwijderd van, de sequentie gebonden door het herkenningsdomein, waardoor splitsing wordt verschoven naar één kant van de sequentie.

Type IIS-enzymen binden in het algemeen aan DNA als monomeren en herkennen asymmetrische sequenties, maar splitsen zich als dimeren.

In Type IIC-enzymen worden restrictie- en modificatieactiviteiten gecombineerd tot een samengesteld enzym met drie domeinen: één voor splitsing, één voor methylering en een derde voor sequentieherkenning. Type IIC-enzymen splitsen ook buiten hun herkenningssequenties.

Type IIT-enzymen gebruiken, in tegenstelling tot de vorige drie subtypes, twee verschillende katalytische plaatsen voor splitsing, elk specifiek voor één bepaalde DNA-streng. Verstoring van beide katalytische plaatsen resulteert in de creatie van een DNA-nicking-enzym dat slechts één DNA-streng klieft.


Restrictie endonucleasedigestie van DNA

Het vermogen om DNA op specifieke plaatsen te splitsen is een van de hoekstenen van de huidige methoden voor DNA-manipulatie. Restrictie-endonucleasen zijn bacteriële enzymen die duplex-DNA op specifieke doelsequenties klieven met de productie van gedefinieerde fragmenten. Deze enzymen kunnen worden gekocht bij de vele fabrikanten van biotechnologische producten. De nomenclatuur van enzymen is gebaseerd op een eenvoudig systeem, voorgesteld door Smith en Nathans. De naam van het enzym (zoals Bam HI, Eco RI, enzovoort) vertelt ons over de oorsprong van het enzym, maar geeft ons geen informatie over de specificiteit van splitsing. Dit moet voor elk afzonderlijk enzym worden bepaald. De herkenningsplaats voor de meeste van de algemeen gebruikte enzymen is een korte palindroomsequentie, gewoonlijk met een lengte van 4, 5 of 6 bp, zoals AGCT (voor Alu I), GAATTC (voor Eco RI), enzovoort. Elk enzym snijdt het palindroom op een bepaalde plaats door, en twee verschillende enzymen kunnen dezelfde herkenningssequentie hebben, maar het DNA op verschillende punten binnen die sequentie splitsen. De splitsingsplaatsen vallen in drie verschillende categorieën, ofwel flush (of stomp) waarbij de herkenningsplaats in het midden wordt doorgesneden, of ofwel met 5' of 3' overhangen, in welk geval ongepaarde basen aan beide uiteinden van het fragment worden geproduceerd . Voor een uitgebreid overzicht van restrictie-endonucleasen, zie Fuchs en Blakesley.


5 belangrijkste enzymen die betrokken zijn bij genetische manipulatie | Biotechnologie

De volgende punten belichten de vijf belangrijkste enzymen die betrokken zijn bij genetische manipulatie. De enzymen zijn: 1. Restrictie-endonuclease 2. DNA-ligase 3. Alkalische fosfatase 4. DNA-polymerase en het Klenow-fragment 5. Reverse transcriptase.

Genetische manipulatie werd mogelijk met de ontdekking van hoofdzakelijk twee soorten enzymen: de snij-enzymen die restrictie-endonucleasen worden genoemd en de verbindende enzymen die ligasen worden genoemd.

Restrictie-endonucleasen of restrictie-enzymen, zoals ze in de volksmond worden genoemd, herkennen unieke basensequentiemotieven in een DNA-streng en splitsen de ruggengraat van het molecuul op een plaats binnen of op enige afstand van de herkenningsplaats. Terwijl ligase het enzym is dat een 5'8242-uiteinde van een DNA verbindt met een 3'8242-uiteinde van dezelfde of van een andere streng.

Enzym # 1. Beperking Endonuclease:

Gewone nucleasen zijn endonucleasen of exonucleasen. De eerste splitst de DNA-ruggengraat tussen twee nucleotiden, d.w.z. het splitst het dubbelstrengs DNA op elk punt behalve de uiteinden, maar het omvat slechts één streng van de duplex.

De laatste verwijderen of verteren één nucleotide per keer vanaf het 5'8242 of 3'8242 uiteinde van een DNA-streng. De restrictie-endonucleasen splitsen alleen op specifieke gebieden in een bepaald DNA, zodat discrete en gedefinieerde fragmenten worden verkregen aan het einde van de totale digestie. De naam 'restrictie' endonuclease is ontstaan ​​uit een observatie van een systeem van beperking van de groei van de faag lambda in bepaalde stammen van de E. coli gastheercel.

De meeste restrictie-enzymen herkennen slechts één korte basensequentie in een DNA-molecuul en maken twee enkelstrengige breuken, één in elke streng, waardoor op elke positie 3'8217OH- en 5'8217P-groepen worden gegenereerd. De sequenties die door restrictie-enzymen worden herkend, zijn vaak palindromen, d.w.z. omgekeerde herhalingssequenties die symmetrisch zijn.

Restrictie-enzymen kunnen DNA op twee manieren knippen om stompe uiteinden te genereren (precies op tegenovergestelde plaatsen gesneden, bijv. HpaI) en staggard-uiteinden (geknipt op asymmetrische positie, bijv. Eco RI) met korte enkelstrengs over­hangs aan elk uiteinde. Een groot aantal restrictie-enzymen is geïdentificeerd en ingedeeld in drie categorieën (type I, II, III) op basis van hun splitsingsplaats.

Restriction enzymes have three important features:

1. Restriction enzymes make breaks in palindromic sequences.

2. The breaks are usually not directly opposite to one another.

3. The enzymes generate DNA fragments with complementary ends.

The commonly employed restriction enzymes are listed in Table 22.1.

Enzyme # 2. DNA Ligase:

Ends of DNA strands may be joined by the enzyme polynucleotide ligase, called ‘glue’ of the recombinant DNA molecule. The enzyme catalyses the forma­tion of a phosphodiester bond between the 3’OH and 5’P terminals of two nucleotides. The enzyme is thus able to join unrelated DNA, repair nicks in single strand of DNA and join the sugar phosphate backbones of the newly repaired and resident region of a DNA strand.

The enzyme which is extensively used for covalently joining restriction fragments is the ligase from E. coli and that encoded by T4 phage. As the main source of DNA ligase is T4 phage, hence, the enzyme is known as T4 DNA ligase.

The ligation reaction is controlled by several factors, such as pH, temperature, concentration and kinds of sticky ends, etc. As ligase uses the ends of DNA molecules as substrates rather than the entire DNA, the kinetics of joining depend on the number of ends (concentration) available for joining.

Enzyme # 3. Alkaline Phosphatase:

The broken fragments of plasmids, instead of joining with foreign DNA, join the cohesive end of the same DNA molecules. The treatment with alkaline phosphatase prevents re-circularisation of plasmid vector and increases the frequency of production of recombinant DNA molecule.

Enzyme # 4. DNA Polymerase and the Klenow Fragment:

The DNA polymerase that is generally utilized is either the DNA Pol I from E. coli or the T4 DNA polymerase enco­ded by the phage gene. The E. coli enzyme is basically a proof-reading and repairing enzyme. It is composed of 3 subunits each with a specific activity. They are: 5′-3′ poly­merase, 3′-5′ exonuclease and 5′-3′ exonuclease.

The enzyme is useful for synthesizing short length of a DNA strand, especially by the nick translation method. The 5-3′ exo­nuclease activity may be deleted, this edited enzyme is referred to as the klenow frag­ment. The T4 DNA Pol possesses, like the klenow fragment, only the polymerase and proofreading (3′-5′ exonuclease) functions.

Enzyme # 5. Reverse Transcriptase:

Retroviruses (possessing RNA) contain RNA dependent DNA polymerase which is called reverse transcriptase. This produces single stranded DNA, which in turn functions as template for complemen­tary long chain of DNA.

This enzyme is used to synthesize the copy DNA or complemen­tary DNA (cDNA) by using mRNA as a template. The enzyme is very useful for the syn­thesis of cDNA and construction of cDNA clone bank and to make short labelled probes.


Bekijk de video: Deteksi dan Pengembangan Teknik Diagnostik SARS-CoV-2 Seri 2 (Januari- 2022).