Informatie

Kan de TGF-bètafamilie alle somatische stamcellen induceren?


Ik denk dat dit niet mogelijk is. Conclusie over dit preview-artikel TGF-$eta$ familie signalering in stamcellen:

Hoewel TGF-$eta$-familiesignalering de stamheid van normale en kankerstamcellen reguleert, zijn de effecten ervan divers en hangen ze af van de celtypes en fysiologische toestand van de cellen.

Kan TGF-$eta$ alle somatische stamcellen induceren?


Signalering in de TGFβ-route remt normaal gesproken de voortgang van cellen door de celcyclus - het gaat bijvoorbeeld de werking van myc tegen, gedeeltelijk door de expressie van myc te reguleren. Bij Burkitt's lymfoom ontsnapt myc aan deze regulatie vanwege een chromosomale translocatie, waardoor het regulerende evenwicht overslaat naar ongecontroleerde celgroei.

Deze anti-proliferatieve werking van TGFβ-signalering is zo cruciaal dat je zou verwachten dat het alomtegenwoordig is in cellen, en de vermelding in de expressie-atlas voor de TGFβ-receptor komt hiermee overeen.


Transformatie van groeifactor bèta

Transformatie van groeifactor bèta (TGF-β) is een multifunctioneel cytokine dat behoort tot de transformerende groeifactor-superfamilie die drie [1] verschillende zoogdier-isovormen (TGF-β 1 tot 3, HGNC-symbolen TGFB1, TGFB2, TGFB3) en vele andere signaaleiwitten omvat. TGFB-eiwitten worden geproduceerd door alle witte bloedcellijnen.

Geactiveerde TGF-β-complexen met andere factoren om een ​​serine/threoninekinasecomplex te vormen dat bindt aan TGF-β-receptoren. TGF-β-receptoren zijn samengesteld uit zowel type 1- als type 2-receptorsubeenheden. Na de binding van TGF-β fosforyleert en activeert het type 2-receptorkinase het type 1-receptorkinase dat een signaalcascade activeert. [2] Dit leidt tot de activering van verschillende stroomafwaartse substraten en regulerende eiwitten, waardoor transcriptie wordt geïnduceerd van verschillende doelwitgenen die functioneren bij differentiatie, chemotaxis, proliferatie en activering van veel immuuncellen. [2] [3]

TGF-β wordt uitgescheiden door vele celtypen, waaronder macrofagen, in een latente vorm waarin het is gecomplexeerd met twee andere polypeptiden, latent TGF-bèta-bindend eiwit (LTBP) en latentie-geassocieerd peptide (LAP). Serumproteïnasen zoals plasmine katalyseren de afgifte van actief TGF-β uit het complex. Dit gebeurt vaak op het oppervlak van macrofagen waar het latente TGF-β-complex aan CD36 is gebonden via zijn ligand, trombospondine-1 (TSP-1). Ontstekingsstimuli die macrofagen activeren, versterken de afgifte van actief TGF-β door de activering van plasmine te bevorderen. Macrofagen kunnen ook IgG-gebonden latente TGF-β-complexen endocyteren die worden uitgescheiden door plasmacellen en vervolgens actief TGF-β afgeven in de extracellulaire vloeistof. [4] Een van de belangrijkste functies is de regulering van ontstekingsprocessen, met name in de darm. [5] TGF-β speelt ook een cruciale rol bij stamceldifferentiatie en T-celregulatie en differentiatie. [6] [7]

Vanwege zijn rol in immuun- en stamcelregulatie en differentiatie, is het een zeer onderzochte cytokine op het gebied van kanker, auto-immuunziekten en infectieziekten.

De TGF-β-superfamilie omvat endogene groeiremmende eiwitten. Een toename in expressie van TGF-β correleert vaak met de maligniteit van veel kankers en een defect in de cellulaire groeiremmingsrespons op TGF-β. De immunosuppressieve functies gaan dan domineren en dragen bij aan oncogenese. [8] De ontregeling van zijn immunosuppressieve functies is ook betrokken bij de pathogenese van auto-immuunziekten, hoewel hun effect wordt gemedieerd door de omgeving van andere aanwezige cytokinen. [5]


Granulosacellen als hormoondoelen: de rol van biologisch actief follikelstimulerend hormoon bij de voortplanting

4 TGFβ en de inhibine-gerelateerde eiwitten

TGF- β is een 25.000 mR homodimeer molecuul dat, bij reductie, twee identieke polypeptideketens oplevert die 112 aminozuren bevatten (Massague, 1985). Alleen het dimeer is biologisch actief. TGF β deelt sequentiehomologie met de β keten van inhibine en de Mullerian duct-remmende stof, deze moleculen worden verondersteld producten te zijn van dezelfde genfamilie (Sporn et al, 1986). Van andere peptiden, zoals een groeiremmer geïsoleerd uit niercellen van apen en een kraakbeen-inducerende stof geïsoleerd uit runderbot, is ook aangetoond dat ze sequentiehomologie hebben met TGF. . de TGF β receptor is gevonden op veel cellen en is een groot molecuul dat bestaat uit twee subeenheden. In tegenstelling tot receptoren voor de meeste andere groeifactoren, is de TGF β receptor lijkt geen tyrosinekinase-activiteit te hebben.

FSH-secretie door gekweekte hypofysecellen wordt differentieel gereguleerd door inhibine, activine en TGF . De mogelijke regulatie van aromatase-activiteit in granulosacellen door deze peptiden werd ook onderzocht. Basale oestrogeensecretie door granulosacellen wordt niet beïnvloed door behandeling met TGF β of alleen inhibine, terwijl door FSH gestimuleerde accumulatie van oestrogeen en progesteron dosisafhankelijk wordt versterkt door TGF β (Adashi en Resnick, 1986 Dahl et al, 1987) en onderdrukt door inhibine (Ying et al, 1986). Daarentegen versterkt inhibine, maar onderdrukt activine, de androgeenproductie door gekweekte ovariële theca-interstitiële cellen en explantaten van follikelwanden (Hsueh et al, 1987). Bovendien wordt de FSH-inductie van LH-receptoren in granulosacellen ook versterkt door TGF β (Dodson en Schomberg, 1987).

Thecacellen in kweek produceren TGF β, zoals bepaald door zowel radioreceptorassay als RIA's (Skinner et al, 1987a), en de TGF β gen wordt tot expressie gebracht in de eierstok van knaagdieren (Hernandez et al, 1987). Deze gegevens suggereren dat TGF β is een paracriene regulator van de productie van granulosacelsteroïden.

Het is duidelijk dat verschillende groeifactoren een belangrijke rol spelen bij de modulatie van granulosacel aromatase-inductie door FSH. Deze paracriene en autocriene acties zijn samengevat in Fig. 4 . EGF (of TGF α) en TGF β zijn vermoedelijk van theca-oorsprong en oefenen een ongelijksoortige regulering van de aromatase-activiteit van granulosacellen uit via paracriene mechanismen. IGF-I kan daarentegen worden geproduceerd door granulosacellen en kan de aromatase-activiteit versterken via autocriene mechanismen. Bovendien remt FGF (een van de angiogene factoren) de aromatase-activiteit van granulosacellen, terwijl inhibine van oorsprong uit granulosacellen de biosynthese van thecacel-androgeen verbetert via paracriene mechanismen.

Afb. 4 . Paracriene en autocriene regulerende rollen van verschillende groeifactoren in de eierstok. IGF-I geproduceerd door granulosacellen kan autocriene regulatie van granulosaceldifferentiatie uitoefenen, terwijl TGF α (of EGF) en TGF β van thecaceloorsprong hebben respectievelijk remmende en stimulerende effecten op de aromatase-activiteit van granulosacellen. FGF, een angiogene factor van luteale celoorsprong, remt de aromatase-activiteit van granulosacellen. Daarentegen verbetert inhibine van granulosaceloorsprong de biosynthese van thecacelandrogeen.

Studies naar de rol van verschillende groeifactoren vormen ook de basis voor het formuleren van mediacondities om de respons van gekweekte granulosacellen op FSH te vergroten. In de volgende paragrafen wordt de historische ontwikkeling van de meting van de bioactiviteit van FSH met behulp van verschillende bioassays en de grondgedachte voor het ontwikkelen van een gevoelige in vitro granulosa cel aromatase bioassay voor FSH worden besproken.


Volwassen/somatische stamcellen

Volwassen stamcellen zijn ongedifferentieerde cellen die zich tussen gedifferentieerde cellen in een weefsel of orgaan bevinden. Ze hebben het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in gespecialiseerde celtypes. In tegenstelling tot embryonale stamcellen die alle celtypes kunnen worden, zijn volwassen stamcellen beperkt in het differentiëren in verschillende celtypes van hun weefsel van oorsprong, en ze zijn daarom multipotente of unipotente stamcellen. De primaire rol van volwassen stamcellen is het onderhouden en repareren van het weefsel waarin ze zich bevinden. Volwassen stamcellen zijn zeldzaam en over het algemeen klein in aantal, maar ze kunnen worden gevonden in een aantal verschillende weefsels van het volwassen organisme.

De meest bestudeerde zijn stamcelpopulaties die aanwezig zijn in beenmerg (hematopoëtisch en MSC's), darmen en huid, maar er zijn verschillende populaties die zich in veel andere organen bevinden, zoals in het centrale zenuwstelsel, lever, borstklier of tandweefsel. De diverse volwassen stamcelpopulaties vertonen verschillende markers en worden beïnvloed door verschillende signaalroutes (Wnt, Notch, Shh, enzovoort.). Stamcellen in individuele weefsels worden niet alleen beïnvloed door hun eigen signaalactiviteit, maar ze reageren ook op de specifieke omgeving die wordt gecreëerd door naburige cellen, de niche genaamd.

Soorten volwassen/somatische stamcellen

    Hematopoëtische stamcellen

Hematopoëtische stamcellen (HSC's) zijn zeldzame cellen van mesodermale oorsprong die zich in het beenmerg van volwassen zoogdieren bevinden en die bovenop een hiërarchie van voorlopers zitten die geleidelijk beperkt worden tot meerdere of enkele lijnen. Echte HSC's blijven meestal in de rusttoestand in het volwassen weefsel en geven aanleiding tot kortdurende HSC's die een beperkt zelfvernieuwend vermogen hebben (6-8 weken). Wanneer het HSC op korte termijn de ongedifferentieerde zelfvernieuwende toestand verlaat, kan het ofwel een gewone myeloïde progenitor (CMP) of een gewone lymfoïde progenitor (CLP) worden. De myeloïde lijn geeft verder aanleiding tot erytrocyten, monocyten en macrofagen, neutrofielen, basofielen, eosinofielen, megakaryocyten/bloedplaatjes en dendritische cellen. Osteoclasten ontstaan ​​ook uit hemopoëtische cellen van de monocyt/neutrofiele lijn. De lymfoïde lijn produceert T- en B-lymfocyten en Natural Killer-cellen.

Figuur 1. Vereenvoudigd diagram van differentiatie van hematopoëtische stamcellen

De meeste mesenchymale stamcellen (MSC's) bevinden zich in het beenmergstroma. De MSC's van beenmerg hebben het natuurlijke vermogen om te differentiëren tot mesodermale weefsels zoals spier-, pees-, adipocyt-, osteocyt- en chondrocyt-afstammingslijnen. MSC's zijn gevonden in vetweefsel, intestinaal stroma, limbale stroma van het ooghoornvlies, luchtpijp en tandpulp. In deze weefsels zijn MSC's voornamelijk gelokaliseerd in nissen die zich in het pericyte gebied van haarvaten bevinden. Een andere belangrijke medische bron van MSC's zijn neonatale weefsels zoals placenta, navelstrengbloed en Wharton's gelei. MSC's worden ingebouwd in de regeneratieve processen van volwassen weefsels, bijvoorbeeld in het hart na een infarct. MSC's kunnen vanuit beschadigde weefsels direct differentiëren in bepaalde cellen en ook dienen als paracriene regelaars van genezingsprocessen.

De intestinale stamcellen (ISC's) zijn multipotente stamcellen die allerlei gedifferentieerde celtypen van de dunne darm en de dikke darm kunnen genereren (inclusief de overheersende enterocyten (de absorberende cellen) de slijmafscheidende slijmbekercellen het peptidehormoon dat entero-endocriene uitscheidt cellen en de Paneth-cellen.).

De neurale stamcel of neurale voorlopercellen bevinden zich in twee verschillende hersengebieden. Eén populatie bevindt zich in de ventriculaire-subventriculaire zone in de laterale ventrikels. Het muismodel suggereerde dat deze populatie voornamelijk verantwoordelijk is voor de vernieuwing van neuronen in de bulbus olfactorius. De tweede populatie zit op het grensvlak van de hilus en de dentate gyrus van de hippocampus.

De huid is verdeeld in de dermis en de epidermis. De epidermis heeft stamcellen die verantwoordelijk zijn voor het herstel en het onderhoud van de epitheliale barrière, die elke 2-4 weken omslaat. De dermis bestaat uit bindweefsel en is de locatie van haarzakjes, zweetklieren en bloedvaten.

Epidermale stamcellen

De epidermis begint bij de meest basale laag van de dermis, de stratum basale genoemd. Deze laag bevat epidermale stamcellen die aanleiding geven tot de rest van de epidermis, die differentiëren als ze omhoog bewegen, weg van de dermis. De voortdurende turnover van de epidermis wordt gemedieerd door epidermale proliferatieve eenheden, die bestaan ​​uit een stamcel in het stratum basale en verschillende transit-versterkende cellen.

Stamcellen van haarzakjes

De haarfollikel produceert de haarschacht tijdens de groeifase, anagene genoemd, gevolgd door een periode van apoptose die catagene wordt genoemd, en blijft in rust tijdens de rustfase, genaamd telogene. Deze processen worden bewerkstelligd door een aantal haarfollikelstamcellen (HFSC).

Talgklierstamcellen

B-lymfoctye-geïnduceerde rijpingseiwit 1 (Blimp1) + cellen zijn unipotente stamcellen die aanleiding geven tot de talgklier.

dermale papil

De dermale papilla is een populatie van mesenchymale cellen die zich net onder de haarzakjes bevinden. Verschillende onderzoeken hebben gesuggereerd dat tijdens haargroei de stamcellen van de haarzakjes zich dicht bij de dermale papilla bevinden, en signaalmoleculen zoals Wnts, BMP's, noggin en FGF's van de dermale papilla activeren HFSC's om te beginnen met prolifereren.

6. Andere volwassen stamcelpopulaties

De lever heeft een opmerkelijk regenererend vermogen. Na acuut leverletsel wordt de weefselmassa hersteld door mitotische deling van rijpe hepatocyten. Tijdens massale of chronische beschadiging komt de proliferatie van hepatocyten echter in het gedrang en worden facultatieve levervoorlopers geactiveerd. Deze cellen zijn bipotent en kunnen aanleiding geven tot zowel hepatocyten als biliaire epithelia.

De borstklier is samengesteld uit epitheelcellen en mesenchymale cellen, waaronder fibroblasten, adipocyten, bloedvatcellen en immuuncellen. De borstkliercellen hebben het vermogen om klonaal uit te zetten tijdens de morfogenese en het volwassen leven, en om enorme expansie te ondergaan tijdens verschillende zwangerschapscycli.

Menselijk tandweefsel heeft geen zelfvernieuwend vermogen, maar er zijn verschillende soorten waarvan de tanden continu kunnen groeien of voortdurend worden vervangen tijdens het volwassen leven. Bij zoogdieren zijn verschillende voorbeelden te vinden binnen de orde van knaagdieren, bijvoorbeeld bij muizen bevatten volwassen snijtanden een stamcelniche en kunnen daarom onbeperkt groeien, en bij andere, zoals woelmuizen, bevinden de stamcellen zich niet alleen in de snijtand, maar ook in de kiezen. De stamcellen van knaagdieren worden veel bestudeerd omdat ze een potentiële ingang zijn in de tandheelkundige regeneratieve geneeskunde.

Speciale typen stamcellen bevinden zich in het volwassen organisme, maar dekken niet alle klassieke kenmerken van volwassen stamcellen, inclusief kiemlijnstamcellen die worden aangetroffen in het ovariumepitheel en de testis. Mannelijke kiemlijncellen zijn een populatie van voorlopercellen (bekend als spermatogoniale voorlopercellen of SPC's) die nodig zijn voor de levenslange productie van differentiërende kiemcellen en spermatozoa. Deze kiemlijncellen kunnen worden omgezet in pluripotente stamcellen, bekend als kiembaan-afgeleide plu-ripotente stamcellen (gPS) of multipotente volwassen kiemlijnstamcellen (maGSC's). De eigenschappen van maGSC's zijn vergelijkbaar met ESC's. Ze zijn in staat om spontaan te differentiëren tot cellen die alle drie de kiemlagen vormen en kiemcellen, die bijdragen aan de ontwikkeling van verschillende organen wanneer ze in een vroege blastocyst worden geïnjecteerd.

Klinische betekenis van volwassen stamcellen

Bloedziekten

Volwassen stamcellen worden al tientallen jaren in de kliniek gebruikt bij de behandeling van bloedziekten. Transplantatie van hematopoëtische stamcellen is een gevestigde therapie, waaronder transplantaties van beenmerg, perifeer bloed en navelstrengbloed. Stamcellen worden typisch verkregen uit het iliacale deel van het bekken met een injectiespuit. Deze benadering wordt nu vervangen door het gebruik van perifeer bloed als bron. Slechts een klein aantal stam- en voorlopercellen circuleert normaal in de bloedbaan, maar grotere aantallen kunnen worden verkregen door de donor te injecteren met een hematopoëtische groeifactor, zoals granulocyt-koloniestimulerende factor (G-CSF), wat resulteert in een veel minder invasieve procedure voor de donor. Navelstrengbloed is een andere alternatieve bron van de HSC's die na de geboorte uit de navelstreng en de placenta kunnen worden verkregen.

Neurologische ziekten

Een ander type volwassen stamcel dat gunstig is voor klinisch gebruik, is de neurale stamcel. Dierstudies hebben het potentieel van neurale stamcellen om beschermend te werken bij de behandeling van amyotrofische laterale sclerose (ALS, ook bekend als de ziekte van Lou Gehrig) opnieuw aangetoond en deze toepassing wordt klinisch getest. Neurale stamcellen zijn ook veelbelovend voor ernstig ruggenmergletsel, omdat ze de functionele regeneratie van het ruggenmerg kunnen ondersteunen. Neurale stamceltransplantatie wordt ook overwogen voor toekomstig klinisch gebruik als regeneratieve strategie na een beroerte om verloren neuronen te vervangen. De combinatie van neurale stamcellen met hematopoëtische stamcellen kan de functionele uitkomst verbeteren na ischemische hersenlaesies.

T1DM, hartaanval, longziekte en mondziekte

MSC's kunnen menselijke eilandjes beschermen, wat mogelijk een therapie zou kunnen zijn voor type 1 diabetes mellitus (T1DM). Mogelijke toepassingen voor MSC's omvatten ook behandelingen voor hartaanvallen en longziekten. Omdat MSC's zijn geïdentificeerd in verschillende orale en maxillofaciale weefsels, vertegenwoordigen MSC's een veelbelovende bron op tandheelkundig gebied. Deze bevindingen ondersteunen de mogelijkheid om MSC's te gebruiken in innovatieve technologieën voor weefselmanipulatiestrategieën om beschadigde, zieke of ontbrekende orale weefsels te regenereren of te vervangen.

Prospect onderzoek van volwassen stamcellen

Volwassen stamcellen (ASC's) worden aangetroffen in veel van de belangrijkste volwassen organen en zijn essentieel voor weefselhomeostase en regeneratie als reactie op letsel. ASC's lijken te worden gereguleerd door intrinsieke en extrinsieke mechanismen. ASC's worden intrinsiek onderscheiden van hun nageslacht op basis van epigenetische, transcriptionele en potentieel metabole reguleringswijzen. Ontregeling van deze intrinsieke factoren, zoals de introductie van oncogene mutaties, kan leiden tot het ontstaan ​​van kanker. Bovendien reguleert de extrinsieke omgeving waarin ASC's zich bevinden ook hun identiteit en activiteit. ASC's leven in gespecialiseerde niches, die interageert met ASC's door het verzenden en ontvangen van signalen, zoals groeifactorsignalering, extracellulaire matrixassociatie en mechanische regulatie. Veel van deze routes die belangrijk zijn voor ASC naar niche-overspraak zijn routes die ook vaak afwijkend gereguleerd zijn bij menselijke kanker.

Geneesmiddelresistentie

Sommige onderzoekers vinden dat de micro-omgeving van de tumor een sleutelrol speelt bij de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen. En ze hebben aangetoond dat stromale cellen in de micro-omgeving belangrijk zijn voor het moduleren van een reactie op chemotherapie en vaak een indicator zijn van een slechte prognose van sommige soorten tumoren. Sommige signalen van volwassen stamcellen houden verband met de resistentie tegen geneesmiddelen en de werkzaamheid van chemotherapie.


Belangrijkste eigenschappen van CSC's

CSC's delen dezelfde cellulaire en moleculaire mechanismen die SSC's reguleren, maar CSC's missen het noodzakelijke controlesysteem om ongecontroleerde proliferatie te voorkomen [43]. Hoewel de specifieke oorsprong van CSC's nog steeds ter discussie staat, suggereert bewijs dat ze afkomstig zijn van stamcellen die de proliferatie onder abnormale omstandigheden niet konden beheersen [44, 45]. Andere voorgestelde oorzaken suggereren dat CSC's zouden kunnen ontstaan ​​​​door cel-celfusie tussen kankercellen en volwassen stamcellen, genoverdracht tussen somatische en kankercellen, of mutaties in stamcellen [46]. Bovendien zou transformatie kunnen optreden tijdens het proces van weefselregeneratie als reactie op ontsteking, infectie, blootstelling aan toxine en/of metabolische processen die mutaties zouden kunnen veroorzaken [47].

CSC's zijn geïdentificeerd in verschillende solide tumoren op basis van de expressie van bepaalde CSC-oppervlaktemarkers. Tot nu toe zijn CSC's geïdentificeerd door oppervlaktemarkers die veel voorkomen bij verschillende kankertypes: CD24, CD29, CD44 CD90, CD133, aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) en epitheliaal specifiek antigeen (ESA) [48,49,50]. Afhankelijk van het type weefsel waaruit ze afkomstig zijn, kunnen ze verschillende markers uitdrukken voor elk type CSC's. Het belangrijkste is dat de expressie van deze markers kan worden gebruikt voor specifieke therapeutische targeting van CSC's [51] (verder besproken in latere secties).

Bewijs van een xenotransplantatie-experiment van menselijke hersentumoren naar niet-obese diabetische ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizenhersenen toonde de aanwezigheid van CSC's aan in de tumorfractie die verantwoordelijk is voor tumorregeneratie [52]. Andere studies melden ook dat bepaalde soorten kanker, zoals hepatocellulair carcinoom (HCC), kunnen worden afgeleid van SSC's [53]. HSC's zijn afkomstig van zelfvernieuwende voorlopers in het beenmerg waar ze zich meestal bevinden, maar ze kunnen ook worden gevonden in perifeer bloed. Klinisch en genetisch bewijs suggereert dat bepaalde soorten leukemie worden veroorzaakt door genetische mutatie in HSC's. Deze mutaties geven aanleiding tot leukemiestamcellen, ook wel CSC's van het bloed genoemd [54, 55]. Bovendien werden in een NOD/SCID-muizenmodel van leukemie fenotypische verschillen tussen leukemiestamcellen en HSC's aangetoond in afzonderlijke onderzoeken [56, 57]. Recente inspanningen hebben oppervlaktemarkers blootgelegd die exclusief zijn voor AML-stamcellen zoals CD123, TIM3, CD47, CD96, CLL-1 en IL-1-receptor-accessoire-eiwit. Aan de andere kant brengen AML-stamcellen zelden CD90 en CD117 tot expressie op hun oppervlak [58] en verschillende onderzoeken hebben gemeld dat CD123 voornamelijk tot expressie werd gebracht in een subset van AML-stamcellen die worden gekenmerkt door het CD34+/CD38−-fenotype [56]. Deze fundamentele verschillen in het fenotype van CSC's kunnen essentieel zijn voor het bieden van nieuwe wegen voor de ontwikkeling van gerichte kankertherapieën.

CSC's worden vaak verward met kanker-initiërende cellen vanwege hun stamcelachtige eigenschappen, waarbij beide worden gekenmerkt door verhoogde expressie van de stamceloppervlaktemarker CD133 [59]. Wanneer kankerverwekkende cellen de eerste kankerverwekkende mutatie ontvangen, wordt aangenomen dat ze verschillen van SSC's, maar ze vertonen verschillende overeenkomsten, zoals lage proliferatiesnelheden, hoge zelfvernieuwing en resistentie tegen chemotherapie en bestraling [60]. Momenteel is het niet duidelijk of CSC's afkomstig zijn van kankerverwekkende cellen of dat beide celtypen dezelfde oorsprong hebben. Beide cellen ondersteunen echter tumorinitiatie en -propagatie.

Omgevingsmilieu en chronische ontsteking ondersteunen CSC's

Celmicro-omgeving is fundamenteel voor celgroei, lot en interactie met andere cellen als reactie op een specifieke stimulus. Recente studies hebben bevestigd dat de micro-omgeving de vorming en groei van solide tumoren kan ondersteunen [61], en het is mogelijk dat veranderingen in paracriene signalen van nichecellen tumorvorming van SSC's kunnen initiëren of versterken. Deze signalen fungeren als een stimulus om activatie, differentiatie, proliferatie en/of celdood te induceren [62]. Bovendien maken deze omgevingsstimuli deel uit van een grotere structuur die "stamcelniche" wordt genoemd. Deze niche verwijst naar een specifieke micro-omgeving binnen een discrete anatomische locatie waar SSC's worden gevonden in een ongedifferentieerde en zelfvernieuwbare staat [63]. Deze niches zijn waargenomen in verschillende epitheelweefsels van zoogdieren, in het maagdarmkanaal en in het neurale en hematopoëtische systeem waar ze het lot van de stamcel reguleren door cel-celinteractie en secretiefactoren te sturen [64]. Oplosbare factoren die door primaire tumoren worden uitgescheiden, kunnen de rekrutering van cellen naar de niche stimuleren. Groeifactoren zoals VEGF, TGF-β en TNF-α zijn geïdentificeerd als de belangrijkste factoren die worden uitgescheiden door primaire tumoren die angiogenese bevorderen [65, 66].

Oplosbare factoren die vrijkomen in de micro-omgeving hebben een sterke invloed op de groei van een primaire tumor, waar de groei verder wordt versterkt door veranderingen in de niche-omgeving [64]. CSC's bevinden zich in deze niches die verantwoordelijk zijn voor het behoud van het zelfvernieuwende vermogen en de ongedifferentieerde toestand van CSC's [67]. Deze niches behouden de belangrijkste eigenschappen van CSC's door hun fenotypische plasticiteit te behouden, de cellen te beschermen tegen het immuunsysteem en de lage beschikbaarheid van voedingsstoffen, oxidatieve stress te weerstaan, geneesmiddelen te ontgiften via ATP-bindende cassettetransporters en metastase te bevorderen [68]. Deze niches bevorderen ook de rekrutering van meer cellen om ontstekingen te induceren door afscheidende factoren (cytokinen en chemokinen). De uitgescheiden factoren vergemakkelijken de vorming van secundaire en tertiaire tumoren [69], waarbij CSC's zich via het stroma in de bloedbaan verspreiden en metastase induceren [70].

Een andere belangrijke omgevingsfactor die tumorprogressie stimuleert, is chronische ontsteking. Er wordt verondersteld dat deze aandoening een van de belangrijkste factoren is bij de uitbreiding van CSC's en de verspreiding van tumoren [71]. Deze ontstekingsreactie kan worden geïnitieerd door de activering van toll-like receptors (TLR's), gestimuleerd door pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) van kankerverwekkende microben of door producten die vrijkomen uit kankercellen. Dientengevolge wordt nucleaire factor kappa B (NF-KB) geactiveerd, wat een ontstekingsreactie induceert die de zelfvernieuwende activiteit in kankercellen zou kunnen verhogen [72]. Er werd aangetoond dat in CD44+/MyD88+ epitheliale ovariële CSC's de TLR2/MyD88/NF-KB-signalering de groei en zelfvernieuwing ervan kan ondersteunen door de opregulatie van met stammen geassocieerde genen [73]. Een andere TLR die de expressie van met stammen geassocieerde genen lijkt te bevorderen, is TRL3. Jia et al. toonde aan dat poly (I: C) de stam in kankercellen verbetert door de wederzijdse activering van β-catenine en NF-KB-signaleringsroute. Ze toonden zowel in vitro als in vivo aan dat borst-CSC's, gekenmerkt door expressie van CD44high/CD24−/low-markers, stamcelachtige eigenschappen en tumor-initiërend vermogen bezitten. Ze stelden ook vast dat TLR3-activering in borstkankercellen bijdraagt ​​aan een verrijking van een subset van cellen met het CSC-fenotype [74].

Verder bewijs dat de rol van ontsteking bij kankerprogressie ondersteunt, komt voort uit observaties dat kwaadaardige tumoren zich vaak ontwikkelen op plaatsen van chronische ontsteking en weefselbeschadiging [75]. Chronische virale hepatitis [76], algemene maagontsteking [77], gastritis veroorzaakt door: Helicobacter pylori [78], inflammatoire darmaandoeningen en verschillende andere chronische ontstekingsaandoeningen blijken ook het risico op de ontwikkeling van kanker [79] en de inductie van CSC's [80] te verhogen. Tumorstroma bevat ook geactiveerde fibroblasten, ontstekingscellen en ontluikende bloedcapillairen. De vorming van dergelijke micro-omgevingen vergemakkelijkt de inductie van een ontstekingsreactie die celmigratie en epitheelcelproliferatie veroorzaakt. Dit resulteert in weefselherstel dat soms kan leiden tot ongecontroleerde celproliferatie en -verspreiding [81, 82]. O'Brien et al. toonde aan dat het vermogen van kankercellen om als CSC's te functioneren afhangt van hoe ze reageren op de signalen van zelfvernieuwing die vrijkomen in het milieu [83]. Er werd gesuggereerd dat veranderingen in het milieu kunnen leiden tot herprogrammering van SSC's, waardoor ze in kankerstamcellen veranderen na langdurige ontsteking, infectie, blootstelling aan toxines of auto-immuunziekten [84]. Sommige rapporten hebben aangetoond dat het omgevingsmilieu van de tumor de stimuli levert die nodig zijn voor de transformatie van SSC's door TGF-β uit te scheiden [85]. Dit cytokine zal de overgang van SSC's naar CSC's verbeteren door zinkvinger E-box-bindende homeobox1 (ZEB1) transcriptiefactorexpressie te induceren. ZEB1 draagt ​​bij aan de verspreiding van kanker en de activering van de epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), een proces dat in verband is gebracht met kankermetastase. Aanvullend bewijs suggereert dat ZEB1 verantwoordelijk is voor het behoud van CSC-achtige fenotypes [86, 87]. Een ander voorbeeld van ontstekingsaandoeningen die de ontwikkeling van CSC beïnvloeden, zijn hepatocellulaire progenitorkankercellen (HcPC's), die zijn waargenomen na chronische ontsteking in de lever. HcPC's vertonen een soortgelijk transcriptomisch profiel als de SSC's in de lever, maar deze cellen genereren geen tumoren. Bij chronische ontsteking stimuleert de secretie van interleukine-6 ​​(IL-6) echter de HcPC-groei in vivo en vergemakkelijkt het tumorprogressie [88]. De rol die chronische ontsteking speelt bij de inductie van verschillende soorten CSC's wordt nog onderzocht, maar cytokinen die worden uitgescheiden door tumor-geassocieerde immuuncellen lijken de noodzakelijke paden te activeren die kankercellen nodig hebben om kankerstamcelachtig te worden.


Transcriptieregulatie van EMT

In overeenstemming met de belangrijke rollen van Smads, wordt het verlies van epitheliale markers en de verwerving van mesenchymale kenmerken bereikt door een goed georkestreerd transcriptieprogramma dat drie families van transcriptiefactoren omvat, de Snail-, ZEB- en bHLH-families (Figuur 2). Hun expressie wordt geïnduceerd als reactie op TGF-β, hetzij via een Smad-afhankelijk mechanisme (in het geval van slakeiwitten) of indirect door activering van andere transcriptiefactoren of verlichting van repressie. Na activering onderdrukken deze transcriptiefactoren op hun beurt de genexpressie van epitheliale markers en activeren ze tegelijkertijd de mesenchymale genexpressie. Bovendien werken deze factoren weefselspecifieke of ontwikkelingsstadiumspecifieke functies uit die verband houden met hun verschillende expressieprofielen 26 .

Transcriptiefactoren van de slakkenfamilie

De transcriptiefactoren van de slak delen een uitgebreide structurele overeenkomst, met een kenmerkend C-terminaal domein met vier tot zes zinkvingers dat sequentiespecifieke DNA-binding aan E-box-elementen C/A(CAGGTG) 67 bemiddelt. Er zijn drie eiwitten uit de Snail-familie geïdentificeerd bij gewervelde dieren: Snail1 (voor het eerst beschreven als Snail), Snail2 (ook bekend als Slug) en een meer recentelijk gekarakteriseerde Snail3. Slakeiwitten functioneren als transcriptierepressoren en hun activiteiten zijn afhankelijk van het zinkvingerdomein en een N-terminaal SNAG (Snail/Gfi) domein.

Inductie van Snail1-expressie is waargenomen in alle EMT-processen die zijn onderzocht 67, 68, en verhoogde Snail1-niveaus zijn gecorreleerd met meer invasieve tumortypen 15, 69. Snail2 wordt breder uitgedrukt dan Snail1 en de uitdrukking lijkt in sommige gevallen niet gerelateerd aan EMT 68, 70 . Beide genen worden geïnduceerd als reactie op TGF-β in cellen die TGF-β-geïnduceerde EMT ondergaan. Bovendien induceert TGF-β Snail1-expressie in de huid 71 en de ontwikkeling van het gehemelte 72 , in mesotheelcellen tijdens pathologische fibrose 73 , in gekweekte hepatocyten 59 , en in meerdere epitheelcellijnen 74 , evenals tijdens hartontwikkeling 75 . De inductie van Snail1-expressie als reactie op TGF-β wordt gemedieerd door Smad3. Smad3 bindt aan de Snail1-promoter en activeert de transcriptie ervan 55, 76. Niertubulaire epitheelcellen die deficiënt zijn in Smad3-expressie kunnen Snail1-expressie niet activeren na TGF-β-behandeling 53 en interferentie met Smad4-expressie verzwakt TGF-β1-geïnduceerde Snail1-expressie in epitheelcellijnen 22, 58, 59. Smad3 medieert ook TGF-β-geïnduceerde expressie van Snail2 in MDCK-cellen, waarbij Smad3 een complex vormt met myocardine-gerelateerde transcriptiefactoren en bindt aan de Snail2-promoter om transcriptie te activeren 77 .

Inductie van EMT door hepatocytgroeifactor (HGF) 78, fibroblastgroeifactor (FGF) of epidermale groeifactor (EGF), die allemaal werken via de Ras-MAPK- of PI3K-Akt-route, resulteert ook in de inductie van slakexpressie 68 . Verder werkt de TGF-β-Smad-route ook samen met Ras-, Notch- en Wnt-signalering bij het induceren van slakexpressie in ontwikkeling en bij tumormetastase 68 . Additionally, post-translational modification defines Snail subcellular localization, stability and transcription activity 26, 68 .

Several lines of evidence highlight the key roles of Snail transcription factors in the execution of the EMT program 15, 69 . Ectopic expression of Snail1 or Snail2 suppresses E-cadherin and plakoglobin expression and enhances vimentin and fibronectin expression, leading to a full EMT phenotype, whereas silencing of Snail expression reverses this process 15, 69, 79, 80, 81 . Snail1-deficient mouse embryos are unable to complete the EMT process and form a defective mesodermal layer that maintains E-cadherin expression, causing the mutant embryos to die at gastrulation 82 . Silencing of Snail2 expression in chick embryos results in mesodermal malformation and neural crest emigration failure 83 .

Substantial efforts have gone into defining the targets of the Snail transcription factors. Snail1 and 2 both repress the expression of the epithelial marker gene CDH1 that encodes E-cadherin. At the E-cadherin promoter, Snail1 binds to E-box elements, recruits a complex consisting of HDAC1, HDAC2 and mSin3A, and thus represses gene transcription 15, 69, 81 . Snail2 similarly represses E-cadherin through binding to the same E-box elements, but recruits a different combination of co-repressors, i.e. HDAC1/3 and CTBP 70, 80, 81 . The expression of Snail proteins appears to inversely correlate with E-cadherin expression, and silencing of the Snail1 gene can restore E-cadherin levels 69, 81 . However, forced expression of E-cadherin is unable to counteract Snail1-induced EMT 11, 12 , suggesting an involvement of additional Snail target genes in the elaboration of EMT. In fact, Snail proteins repress a spectrum of genes involved in maintaining epithelial structure and function, including genes encoding claudins and occludin, major transmembrane components of tight junctions. Snail1 represses the expression of claudin-3, -4 and -7 at their promoters 11, 84 , whereas Snail1 and Snail2 both repress the expression of claudin-1 and occludin 84, 85, 86 . In contrast, Snail1 expression does not dramatically decrease the levels of cytoplasmic components of tight junctions, such as ZO-1 and p120, but their distribution is altered from peripheral localization to a diffused cytoplasmic pattern 84 . Snail proteins regulate the expression of desmosome proteins as well. Ectopic expression of Snail1 results in decreased desmoplakin and plakophilin levels, and causes disorganized plakoglobin distribution 11, 15, 16, 87 . Furthermore, Snail1 disrupts epithelial polarity by repressing the expression of Crumbs3, which in complex with two other proteins, PALS1 and PATJ, is required for the maintenance of apical-basal polarity. Snail1 binds to the E-box element in the Crumbs3 promoter and inhibits Crumbs3 expression, leading to disassembly of the Crumbs complex 88 . However, Snail1 expression does not affect the Par complex, another important polarity complex 88 . Snail1 expression also results in decreased expression of a subset of cytokeratins, i.e. cytokeratin 17, 18, 19 and 20, thus affecting the epithelial cytoskeletal organization. Cytokeratins 17 and 18 have been identified as direct targets of Snail1 by chromatin immunoprecipitation 11, 84, 89 . Recent microarray analyses have unveiled additional genes encoding epithelial or basal lamina proteins that are downregulated by Snail1, suggesting an even broader range of regulation of the epithelial program by Snail proteins 90 .

Other Snail target genes show a more tissue-restricted distribution and are hence associated with tissue-specific EMT processes. One such target of Snail1 is HNF-1β, a transcription factor that is expressed in kidney epithelial cells and activates the expression of the kidney-specific epithelial marker cadherin-16. Through direct repression of HNF-1β transcription, Snail1 suppresses cadherin-16 expression and induces EMT in cell culture, reminiscent of the development of kidney fibrosis in vivo 91, 92 . In hepatocytes, Snail1 represses another HNF transcription factor, HNF-4α, resulting in loss of epithelial markers and expression of mesenchymal proteins 93 . Snail proteins also repress the expression of mucin-1, a transmembrane protein on the apical surface of pulmonary airway epithelium that serves to hydrate, lubricate and protect the epithelium 94 .

While repressing epithelial gene expression, Snail proteins activate the expression of the mesenchymal proteins fibronectin 15, 79 , vitronectin 15, 79 and N-cadherin 90 , the extracellular matrix proteins collagen type III and V 90 , and proteins involved in migration and invasion, such as RhoB, plasminogen activator inhibitor-1 and matrix metalloproteinases 68, 79 . These effects of Snail may be indirect and involve other transcription factors, such as Ets-1 which has been proposed to mediate the induction of MMP-2 expression 95 or Sp-1 and Ets-1 which are thought to be partially responsible for the upregulation of MMP-9 expression 96 . Snail1 also regulates the expression of multiple actin-modulating proteins to facilitate the rearrangement of actin filaments from cortical distribution to stress fibers anchored to focal adhesions 11 . Consistent with the indirect induction of gene expression by Snails, Snail transcription factors induce the expression of other EMT-related transcription factors, such as Twist and Ids in MDCK cells 90 , and ZEB1 and ZEB2 in squamous carcinoma cell lines 89, 95 .

In addition to regulating the expression of epithelial or mesenchymal genes, Snail also regulates genes required for cell survival 68 , which are frequently intertwined with EMT during embryonic development or in pathological conditions. Finally, in some cases Snail1 and Snail2 cooperate in the control of the transcription network that regulates EMT. For example, in breast tumors, Snail1 expression correlates with mesenchymal transition and metastasis, and Snail2 expression associates with the repression of tumor suppressor gene BRCA2 68 .

ZEB family transcription factors

Two ZEB family transcription factors are known in vertebrates: ZEB1, also known as δEF1 or AREB6, and ZEB2, also known as Smad-interacting protein 1 (SIP1). They have two zinc-finger clusters at each end, whose simultaneous binding to bipartite E-boxes mediates the interaction with regulatory DNA sequences. The central region contains a Smad-interaction domain, a homeodomain and a CTBP binding domain. Repression of gene transcription by ZEB1 or ZEB2 is mediated by repressor motifs in the central homeodomain and through recruitment of CTBP as a co-repressor. However, interaction of ZEB1 with co-activators PCAF and p300 switches ZEB1 function from repression to activation 26, 97 . ZEB proteins are expressed during development in various tissues, including the central nervous system, the heart, skeletal muscle and haematopoietic cells. They partially compensate for each other in these tissues, although in other cases, such as during neural crest emigration, and in lymphocytes, ZEB proteins exhibit distinct expression patterns and do not functionally compensate 26 .

TGF-β signaling induces the expression of ZEB proteins during EMT through an indirect mechanism mediated in part by Ets-1 21 . ZEB proteins then interact with Smad3 and directly repress the expression of epithelial marker genes, possibly by recruiting the co-repressor CTBP 97, 98 . ZEB1 is also induced by TGF-β during smooth muscle differentiation, in which it synergistically interacts with Smad3 and SRF to transactivate the genes encoding smooth muscle α-actin and smooth muscle myosin heavy chain 99 . As is in the case of the Snails, the expression of ZEB proteins is not only activated by TGF-β but also by other growth factors that activate Ras-MAPK signaling and by Wnt/β-catenin signaling 26 . The expression of ZEB factors is also post-transcriptionally repressed by microRNAs, miR-200 family and miR-205 100, 101, 102 . This group of microRNAs is dramatically downregulated in cells undergoing EMT, allowing expression of ZEB transcription factors. Thus, forced expression of miR-200 family is sufficient to block TGF-β-induced EMT 100, 101, 102 . In addition, ZEB2 is subject to post-translational regulation, whereby Pc2-mediated sumoylation impairs its repressor activity 103 .

The induction of ZEB proteins is necessary for the downregulation of E-cadherin expression and promotion of cell migration 21, 104, 105, 106 . ZEB proteins directly repress E-cadherin expression independently of the Snail transcription factors in mouse mammary epithelial cells 21, 106 . Concomitantly, they confer a delocalization of β-catenin in a cell context-dependent manner and promote cell migration 104, 107 . Besides its effects on adherens junctions, ZEB2 directly represses the expression of the tight junction proteins claudin-4 and ZO-3 107 . ZEB2 also suppresses the expression of the desmosome protein plakophilin-2 107 and induces the expression of the mesenchymal proteins vimentin 108 , N-cadherin 107 and matrix metalloproteinase-2 95 through as yet unknown mechanism(s). Both ZEB proteins promote cell migration and induce invasion 104, 107, 109 . ZEB1 has also been implicated in the downregulation of epithelial polarity through the direct repression of Crumbs3 expression depletion of ZEB1 restores the expression of Crumbs3 and PATJ, major components of the Crumbs3 polarity complex 109, 110 . ZEB1 also directly represses the expression of mucin-1 89 .

Helix-loop-helix family factors

The HLH family is a large family of transcription factors controlling a wide array of developmental and pathological processes. The basic structure of HLH family members includes two parallel α-helices linked by a loop required for dimerization. HLH factors are divided into seven categories based on their tissue distribution, dimerization capability and DNA-binding specificity 111 . Among these, the class I proteins E12 and E47, class II proteins Twists and class V proteins Ids are involved in the elaboration of EMT. The class I proteins E12 and E47 form homodimers or heterodimers with class II proteins, and the class II proteins Twists (Twist1 and Twist2) always heterodimerize with class I proteins. In contrast to these, the class V Id proteins (Id1, Id2, Id3 and Id4) lack the basic domain and thus are incapable of DNA binding. They function as dominant negative inhibitors through high affinity binding to class I proteins 26, 111 .

E12 and E47 are encoded by alternative splicing products of the E2A gene 26, 111 . They directly repress E-cadherin expression through DNA binding at the E-box element in the proximal promoter. Ectopic expression of E12 or E47 represses E-cadherin and plakoglobin expression, induces vimentin and fibronectin expression, and promotes migration and invasion 80, 112, 113 . It remains unclear whether E12 and E47 form homodimers or heterodimerize with other HLH factors for E-cadherin repression. However, their repression of E-cadherin transcription can be antagonized by Id factors, which interact with E2A proteins 113 . The expression of Id1, Id2 and Id3 is repressed in response to TGF-β, which in the case of Id1, occurs through the rapid activation of expression of the transcription repressor ATF3 by TGF-β and the subsequent binding of an ATF3/Smad3/Smad4 complex to the Id1 promoter 114, 115 . Consequently, loss of Id protein expression correlates with a decrease in E-cadherin expression, and ectopic expression of Id2 or Id3 dose-dependently blocks TGF-β-induced repression of E-cadherin expression, inhibits TGF-β-induced ZO-1 delocalization and represses TGF-β-induced smooth muscle actin expression 113, 114 . Besides E-cadherin, E47 also represses desmoplakin expression and induces the expression of N-cadherin, SPARC and α5-integrin 90 .

The HLH protein Twist1 is a major regulator of mesoderm formation in Drosophila and neural tube closure in mice, suggesting its involvement in developmental EMT 116 . Mutation of the gene encoding Twist1 in human has been associated with Saethre-Chotzen syndrome, which is characterized by cleft palate and possibly caused by an inhibition of EMT 117, 118 . Conversely, both Twist1 and Twist2 expression are upregulated in a large fraction of human tumors 119 . Ectopic expression of Twist1 or Twist2 decreases E-cadherin, occludin and claudin-7 expression, increases vimentin and N-cadherin expression, and enhances migration and invasion 9, 10 . In addition, Twist1 and Twist2 both synergize with H-Ras to induce a full EMT 10 .

HMGA2

HMGA2 (high mobility group A2) is another downstream effector of TGF-β during EMT. HMGA2 belongs to a group of transcription factors that bind AT-rich DNA sequences to form nucleoprotein complexes. HMGA2 is expressed at high levels during embryogenesis and at low levels in adulthood, and is expressed aberrantly in some transformed cells or cancer tissues. TGF-β induces a drastic increase in HMGA2 expression through a Smad3/Smad4-dependent mechanism, and ectopic HMGA2 expression is able to induce the expression of Snail1/2 and Twist1 120 .


Can TGF beta family induce all somatic stem cells? - Biologie

The continuous and steady supply of transient cell types such as skin, blood and gut depends crucially on the controlled proliferation of stem cells and their transit amplifying progeny. Although it is thought that signaling to and from support cells might play a key role in these processes, few signals that might mediate this interaction have been identified. During spermatogenesis in Drosophila, the asymmetric division of each germ line stem cell results in its self-renewal and the production of a committed progenitor that undergoes four mitotic divisions before differentiating while remaining in intimate contact with somatic support cells [1]. Previous data have suggested that TGF-β signaling pathway components punt en schnurri are required in the somatic support cells to restrict germ cell proliferation [2]. Here, by contrast, we show that the maintenance and proliferation of germ line stem cells and their progeny depends upon their ability to transduce the activity of a somatically expressed TGF-β ligand, the BMP5/8 ortholog Glass Bottom Boat. We further demonstrate that TGF-β signaling represses the expression of the Bam protein, which is both necessary and sufficient for germ cell differentiation, thereby maintaining germ line stem cells and spermatogonia in their proliferative state.


Materialen en methodes

Cells culture and reagents

HDLECs were purchased from Lonza (Basel, Switzerland). The cells were maintained in EBM TM -2MV Bullet Kit (cc-3202, Lonza) and used for study after extensive characterization. HEK-Blue TM TGF-β cells (HEK293 cell-derived TGF-β responsive reporter cells) were purchased from InvivoGen (San Diego, CA, USA) and maintained in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Nacalai Tesque: Kyoto, Japan) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS, SIGMA: St. Louis, MO, USA), 100 units/mL Penicillin-100 μg/mL Streptomycin (Nacalai Tesque). TGF-β2, TNF-α, and Activin A were purchased from Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Follistatin was purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). SB431542 and Y27632 were obtained from WAKO Chemicals (Saitama, Japan). Concentrations of TGF-β2 used were determined empirically, based on their ability to alter expression of various endothelial and mesenchymal markers.

RNA-interferentie

The siRNAs for human SMAD2 (#A: 5’- CAAGUACUCCUUGCUGGAUTT -3’ , #B: 5’- GUCCCAUGAAAAGACUUAATT -3’ ) and human MRTF-A (#A: 5’- GUGUCUUGGUGUAGUGUAATT -3’ , #B: 5’-CAGGUGAACUAUCCCAAAGUATT -3’ ) were synthesized by Hokkaido System Science (Sapporo, Japan). The target sequences for SMAD2 were designed as previously described [25]. Negative control was purchased from QIAGEN (Hilden, Germany). All siRNAs were introduced into the cells using Lipofectamine RNAi Max reagent (Invitrogen: Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 8.0×10 4 cells were mixed with siRNA-Lipofectamine complexes and seeded into 6-well plates. Medium was refreshed 6 h later and cells were allowed to grow for an indicated period.

RNA isolation and quantitative RT-PCR

Total RNA was prepared with Nucleospin RNA (TaKaRa Bio: Otsu, Japan) according to the protocol suggested by the manufacturer and reverse-transcribed by random priming using a PrimeScript II Kit (TaKaRa Bio). The quantitative RT-PCR (qRT-PCR) analysis was performed using StepOne Plus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). All expression data were normalized to that of β-actin. The primer sequences are available in Table 1.

Smad2/3-responsive reporter assay

Activation of Smad2/3 signals by TGF-β family members including TGF-β1, 2, 3, and Activin A was determined using reporter assay which employs HEK-Blue TM TGF-β cells allowing direct quantification of soluble alkaline phosphatase (SEAP) expressed under control of Smad3/4-inducible elements. HDLECs were treated with TGF-β2 or SB431542 for 48 h. The culture medium was then replaced with EGM-2MV medium with 0.5% FBS and HDLECs were incubated for additional 6 h. The conditioned medium was then collected and added to the pre-seeded HEK-Blue TM TGF-β reporter cells, followed by incubation for 24 h. Fraction of the medium obtained from incubation with HEK-Blue cells was then mixed with QUANTI-Blue substrate (InvivoGen) and incubated for 30 min. The released SEAP was quantified at 640 nm using spectrophotometer.

Chamber migration assay

The modified Boyden chamber migration assay was used for the measurements of migration of HDLECs. Briefly, the chambers were pre-coated with Cellmatrix Type I-C (Nitta Gelatin: Yao, Japan). HDLECs were cultured in the absence or presence of TGF-β2 for 72 h, harvested and suspended in EGM-2MV medium. The cells were then seeded (1.0×10 4 cells/chamber) in the upper chamber of a 24-well Transwell filter (8 μm pore filter, Merck Millipore) and allowed to migrate for 6 h. After indicated period, the filters were stained with DiffQuik (Sysmex: Kobe, Japan) followed by removal of non-migrated cells with a cotton swab. Migrated cells adhering to the bottom side of the filter were examined, photographed using a light microscope (BZ-X710, Keyence: Osaka, Japan) and counted.

Tube formation assay

A 12-well plate was pre-coated with Matrigel (BD Biosciences, San Jose, USA) (0.4 mL/well). After polymerization of Matrigel at 37°C for 1 h, HDLECs were seeded in each well at a density of 1.75×10 5 cells/400 μL/well. After 7 h of incubation in EGM-2MV medium supplemented with 5% FBS, tube-like structures were photographed under phase-contrast microscopy (BZ-X710, KEYENCE) with 10× objective lenses. Tube length was quantified using ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Immunocytochemistry

HDLECs were seeded on the cover glass pre-coated with Cellmatrix Type I-C (Nitta Gelatin) and cultured in the absence or presence of TGF-β2 and/or TNF-α for 72 h. The cells were then fixed with 4% paraformaldehyde, treated with 0.1% Triton X-100, blocked and incubated with primary anti-SM22α (ab14106, Abcam) and anti-Prox1 (AF2727, R&D systems) antibodies, followed by treatment with Alexa 488- and Alexa 594-conjugated secondary antibodies, respectively and Hoechst33342 for staining of the nuclei. Images were taken with All-in-One fluorescent microscope, BZ-X710 (Keyence).

Microvasculature preparation and permeability assay

The description and fabrication method of polydimethylsiloxane (PDMS)-based chips were previously reported [26]. Briefly, the PDMS chip (25 mm × 25 mm × 5 mm: width × length × height) comprised a central rectangular chamber framed on its left and right sides by two wells and crossed by a φ 300-μm PDMS channel. For building the micro-lymphatic vessels (micro-LVs), the PDMS chips were first treated with O2 plasma. For each chip, a φ 200-μm needle (acupuncture needle, No.02, 0.20 mm x 30 mm, J type, from Seirin: Shizuoka, Japan) was coated with PBS, 1% BSA. The chips and needles were then sterilized by UV-light exposure under a cell culture hood. A neutralized collagen solution was prepared by mixing on ice in a 8:1:1 volume ratio: Cellmatrix Type I-A collagen solution (3 mg/mL, pH 3, from Nitta Gelatin), 10× Hank’s buffer, and 10× collagen buffer (262 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 0.05N NaOH). Ice-cold collagen solution was introduced into the wells and rectangular chamber and the BSA-coated needle was inserted through the PDMS channel. After removal of the excessive collagen from the wells, the collagen was allowed to solidify by incubating the device in a cell culture incubator for one hour (37°C, 5% CO2). Withdrawal of the needle left a hollow channel within the collagen gel that served as a scaffold for building a tubular lymphatic endothelium. HDLECs, treated for 24 h with normal EBM TM -2MV or with EBM TM -2MV containing 5 μM SB431542 or 10 ng/mL TGF-β2, were harvested and resuspended in same media at a density of 1×10 7 cells/mL. 20,000 cells were loaded at each opening of the collagen tubular scaffold and allowed to attach for 15 minutes. Finally, 1 mL of drug-containing media was added and the micro-LVs were cultured in a cell culture incubator (37°C, 5% CO2) with media renewal every other day. Six days after micro-LVs fabrication, micro-LVs were imaged using a microscope Observer Z1 (Carl Zeiss: GmbH, Oberkochen, Germany) and permeability assay was performed as previously described [26] with minor changes. Briefly, the chips were set-up on a confocal microscope LSM700 (CLSM, Carl Zeiss, Jena, Germany). Medium was removed and 15 μL of a 100 μg/mL FITC-dextran (70 kDa) in EBM TM -2MV solution were introduced in both wells. The fluorescence of FITC was imaged with a 488-nm-wavelength laser and an optical section of 77.8 μm. For quantifying the microvessel permeability, CLSM images taken one minute after introduction of FITC-dextran were processed with the ZEN 2012 SP1 black edition software (version 8.1.0.484, 64 bit, Carl Zeiss). The mean fluorescence intensity of FITC detected in collagen gel was given by the Zen software for two regions of interest (50 μm × 2500 μm) drew close and aligned to each edge of a microvessel. The obtained values were averaged and considered as representative of a micro-LV’s permeability to 70 kDa molecules. The experiment was performed three times with five micro-LVs. After permeability assay, total RNA was extracted from three micro-LVs and processed for qRT-PCR analyses.

Immunohistochemie

Human skin samples were obtained from the eyelids of 16 healthy volunteers aged 20–80 years old and were snap-frozen. Skin samples were divided into 2 groups according to age of the donor: Group 1: 12–40 (N = 8) and Group 2: over 40 (N = 10). Double immunofluorescence staining for LYVE1 and SM22α was performed as previously described [27, 28]. Frozen skin sections were fixed with 4% PFA at 4ºC for 10 min and blocked with a blocking solution for 30 min. The sections were then incubated overnight with goat anti-LYVE1 IgG (AF2089, R&D systems) and rabbit anti-SM22α IgG (ab14106, abcam: Cambridge, UK). The next day the samples were incubated with Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-goat IgG (Invitrogen) diluted to 1:200 for 1 h. The pictures were captured under LSM 510 META microscope (Carl Zeiss). Images were analyzed using IP-Lab software (Scanalytics: Fairfax, VA, USA). Briefly, the relative area occupied by SM22α + LYVE1 + vessels to the one occupied by LYVE1 + vessels (total lymphatic vessel area) was defined as EndMT ratio. The analyzed areas were determined in the dermis, in an area within 500 μm distance from the epidermal-dermal junction. Then the ratio of SM22α + / LYVE1 + was calculated by dividing the area of SM22α + LYVE1 + vessels by that of LYVE1 + vessels per area unit (mm 2 ).

Statistische analyse

Values are presented as mean ± standard deviation (S.D.) or standard error of the mean (S.E.M.). Significant differences between means were determined using two-tailed unpaired Student's t-test or one/two-way ANOVA followed by Bonferroni multiple comparison post hoc analysis using EZR software [29]. Differences between means were considered statistically significant at *P < 0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 N.S., not significant.

Ethical standards

All the experiments were approved by “the Safety Control Committee for Experiments Using Genetically Modified Organisms, Etc.” and done according to the guideline of “Safety Control Regulations for Experiments Using Genetically Modified Organisms, Etc., Tokyo Medical and Dental University” (approved number: G2018-047C). Human skin samples were obtained by the Gakugeidai-Nishiguchi Clinic (Tokyo, Japan). All procedures involving human subjects were approved by the Institutional Review Board of the Shiseido Global Innovation Center, and all subjects provided written informed consent. Ethics Review Committee of Faculty of Dentistry at Tokyo Medical and Dental University (TMDU) has waived the requirement for this approval.


Conclusies

Advances in the TGFβ signaling field continue to expand the number of processes in which it is recognized as required, and clarify the mechanisms that underlie the exquisitely finely tuned transduction of its signals. As we consolidate our understanding of the flexibility within the pathway and of the interplay between TGFβ family signaling and other pathways, it has become clear that there are astounding similarities between its roles in different processes and organisms. Despite progress in the field, further insights into the context-dependent nature of the pathway will depend on continued in vivo studies in developmental and disease systems. Definitive measurements of the molecular properties that govern the expression, presentation and turnover of signaling components are needed to make full use of modeling and systems approaches that are aimed towards the successful development of therapeutics for the treatment of syndromes and diseases arising from the dysregulation of TGFβ family signaling. Much work remains to be done. The convergence of cell biologists, developmental biologists, biochemists and geneticists at future TGFβ FASEB meetings will continue to ensure success in these endeavors.


TGF-beta in neural stem cells and in tumors of the central nervous system

Mechanisms that regulate neural stem cell activity in the adult brain are tightly coordinated. They provide new neurons and glia in regions associated with high cellular and functional plasticity, after injury, or during neurodegeneration. Because of the proliferative and plastic potential of neural stem cells, they are currently thought to escape their physiological control mechanisms and transform to cancer stem cells. Signals provided by proteins of the transforming growth factor (TGF)-beta family might represent a system by which neural stem cells are controlled under physiological conditions but released from this control after transformation to cancer stem cells. TGF-beta is a multifunctional cytokine involved in various physiological and patho-physiological processes of the brain. It is induced in the adult brain after injury or hypoxia and during neurodegeneration when it modulates and dampens inflammatory responses. After injury, although TGF-beta is neuroprotective, it may limit the self-repair of the brain by inhibiting neural stem cell proliferation. Similar to its effect on neural stem cells, TGF-beta reveals anti-proliferative control on most cell types however, paradoxically, many brain tumors escape from TGF-beta control. Moreover, brain tumors develop mechanisms that change the anti-proliferative influence of TGF-beta into oncogenic cues, mainly by orchestrating a multitude of TGF-beta-mediated effects upon matrix, migration and invasion, angiogenesis, and, most importantly, immune escape mechanisms. Thus, TGF-beta is involved in tumor progression. This review focuses on TGF-beta and its role in the regulation and control of neural and of brain-cancer stem cells.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Bekijk de video: TGF-beta (November 2021).