Informatie

Hoe kan ik mijn huidige DNA-methylatiemarkeringen veilig bewaren?


Ik las het Wikipedia-artikel over DNA-methylatie

Laten we zeggen dat ik mijn huidige DNA-methylatiemarkeringen ergens wil extraheren en vervolgens ergens opslaan, zodat ik het in de toekomst veilig over 20 jaar kan gebruiken voor een medische procedure die nog niet bestaat.

Welke methode moet ik gebruiken?


Om de huidige methyleringstoestand van uw DNA vast te leggen, kunt u bisulfietsequencing gebruiken. Kortom, je neemt de helft van je DNA-monster en behandelt met bisulfiet, dat cytosines (C->U) deamineert, dus ze lezen als T in plaats van C. Gemethyleerde cytosines zijn beschermd, dus ze lezen nog steeds als C. Je voert twee sequentiereacties uit , een met met bisulfiet behandeld en de andere met onbehandeld DNA, zodat je kunt zien waar de echte C's in het genoom zitten. Zie onderstaand schema:

Wikimedia commons

Merk op dat als je overweegt dit te doen vanuit het oogpunt van een lange levensduur, er enorm verschillende methylatiepatronen zijn in verschillende celtypes; Ik weet niet zeker welk celtype je zou willen kiezen. Bovendien is methylering niet de enige covalente modificatie van DNA die bestaat, er is ook hydroxymethylering, en ik wed dat er meer zijn die we nog niet hebben ontdekt. Die zijn er zeker in bacteriën en fagen (glucosyl-hydroxymethylcytosine, bijvoorbeeld). Het moeilijke van dingen bewaren voor de toekomst is dat we echt niet het volledige beeld begrijpen van wat er nu epigenetisch gebeurt, en als zodanig hebben we geen tests om dingen te detecteren waarvan we niets weten.


Ik geloof dat het DNA in natuurlijke vorm zo stabiel zal zijn als het zou moeten zijn na behandeling met bisulfiet. U kunt commercieel beschikbare methoden gebruiken om DNA-monsters op te slaan en er veilig vanuit te gaan dat het over 20 jaar intact zal zijn.


Behoud en divergentie in eukaryote DNA-methylatie

Cytosinemethylering is een veel voorkomende DNA-modificatie die wordt aangetroffen in de meeste eukaryote organismen, waaronder planten, dieren en schimmels (1, 2). De toevoeging van een methylgroep aan cytosinenucleotiden in DNA verandert de primaire DNA-sequentie niet, maar de covalente modificatie van DNA door methylering kan genexpressie en activiteit op een erfelijke manier beïnvloeden. Dit type epigenetische regulatie door DNA-methylatie lijkt een kritisch proces te zijn, in evolutionaire zin, met sterk geconserveerde enzymen die het proces bemiddelen (3). Bij mensen is afwijkende DNA-methylatie in verband gebracht met ziekten, waaronder kanker (4). Om cytosine-methylatiepatronen in het hele genoom te bestuderen, hebben onderzoekers microarray-hybridisatie of directe sequencing van met bisulfiet behandeld DNA gebruikt (5). Het in kaart brengen van methylering van individuele cytosines in een bepaald genoom was echter een uitdagende taak en dienovereenkomstig is er geen vergelijkende analyse van genoommethyleringspatronen tussen soorten uitgevoerd. Verschillende nieuwe studies hebben deze lacune in ons begrip van de evolutie van cytosinemethylering aangepakt (6, 7). Feng et al. in PNAS (7) gebruikte sequencing van de volgende generatie om de DNA-methylatiepatronen in acht uiteenlopende soorten te onderzoeken, waaronder groene algen, bloeiende planten, insecten en gewervelde dieren. Hun gegevens maakten een uitgebreide vergelijking mogelijk van de methyleringsprofielen van het hele genoom in het planten- en dierenrijk, waarbij zowel geconserveerde als uiteenlopende kenmerken van DNA-methylering in eukaryoten werden onthuld.

Hoewel DNA-methylatie een wijdverbreid epigenetisch regulerend mechanisme lijkt te zijn, worden genomen in verschillende organismen op verschillende manieren gemethyleerd. Bij dieren vindt DNA-methylatie meestal symmetrisch (beide strengen) plaats aan de cytosines van een CG-dinucleotide. DNA-methylatie in plantengenomen kan symmetrisch plaatsvinden bij cytosines in zowel CG- als CHG-contexten (H = A, T of C), en ook asymmetrisch in een CHH-context, waarbij de laatste wordt gestuurd en onderhouden door kleine RNA's (1). In de modelfabriek Arabidopsis thaliana, niveaus van cytosinemethylering bij CG-, CHG- en CHH-nucleotiden zijn respectievelijk ongeveer 24%, 6,7% en 1,7% (8, 9). Ondanks de verschillende contexten van de methyleringssequentie, wordt cytosinemethylering vastgesteld en onderhouden door een familie van geconserveerde DNA-methyltransferasen (2, 3, 10). Het is niet verrassend dat de afwezigheid van DNA-methylatie in sommige eukaryoten zoals gist, rondworm en fruitvlieg geassocieerd is met het evolutionaire verlies van DNA-methyltransferase-homologen (3).

In de afgelopen jaren zijn er benaderingen ontwikkeld om cytosine-methylatie op het niveau van het hele genoom te analyseren, en dit heeft geweldige inzichten opgeleverd in de biologie van DNA-methylatie. Bij vroege benaderingen werden restrictie-enzymen gebruikt die gevoelig zijn voor gemethyleerde CG-plaatsen (11, 12). Het niveau van DNA-methylatie wordt bepaald door enzymatische digestie van gemethyleerd DNA, gevolgd door hybridisatie met oligonucleotide-arrays met hoge dichtheid. Een andere benadering vangt gemethyleerd genomisch DNA met behulp van immunoprecipitatie via een antilichaam dat 5-methylcytosine herkent, gevolgd door array-hybridisatie of sequencing (13, 14). Deze benaderingen waren in staat om chromosomale methylatieniveaus en -patronen te bepalen, maar hadden grote beperkingen in hun resolutieniveau, restrictie-enzymbias, moeilijkheid bij het karakteriseren van genoomregio's die rijk zijn aan herhalingen, en, belangrijker nog, een onvermogen om DNA-methylatie op een enkele manier te detecteren. nucleotide resolutie (5).

Behandeling met natriumbisulfiet zet ongemethyleerd cytosine om in uracil, dat wordt vervangen door thymine na PCR-amplificatie, terwijl 5-methylcytosine onveranderd blijft. Daarom kunnen niet-gemethyleerde of gemethyleerde cytosineresiduen in DNA worden gedifferentieerd door bisulfietbehandeling, DNA-sequentiebepaling en vergelijkingen met een referentiesequentie (15). Bij het combineren van bisulfietbehandeling en high-throughput-sequencing (Illumina of SBS, 454, SOLiD, enz.), Kan een methyleringskaart worden gegenereerd met een resolutie van één basenpaar over het hele genoom. Zoals onlangs gemeld van Arabidopsis genoombrede bisulfietsequencing-gegevens (BS-seq) (8, 9, 14), vindt cytosinemethylering niet alleen bij >90% van repetitieve sequenties en transposons plaats, maar ook in het lichaam van ∼20% van de tot expressie gebrachte, eiwitcoderende genen. Hoewel CG-, CHG- en CHH-methylering allemaal worden aangetroffen in herhalingsrijk pericentromeer heterochromatine, bevat gen-lichaam-methylering bijna uitsluitend CG-methylering. Deze studies onthulden ook een interessante, parabolische relatie tussen gen-lichaam-methylatie en transcriptieniveaus. Terwijl bescheiden tot expressie gebrachte genen meer kans hebben om gemethyleerd te worden, zijn genen die tot expressie worden gebracht in de twee uitersten (laagste en hoogste niveau) meestal minder gemethyleerd.

Feng et al. toegepast BS-seq breder dan de meeste, profilering van DNA-methylatiepatronen in acht verschillende eukaryoten (Fig. 1). Daarnaast Arabidopsis, analyseerden de auteurs rijst, groene algen en muizen, waarin eerder in verschillende mate DNA-methyleringsprofielen zijn onderzocht. Ze voegden profielen toe van populier (een boom), honingbij, zakpijp en zebravis, die een verzameling soorten vertegenwoordigen die de levensboom overspannen, van eencellige eukaryoten tot meercellige gewervelde dieren. Over het algemeen zijn de methyleringsprofielen van bloeiende planten (Arabidopsis, rijst en populier) vergelijkbare patronen vertoonden, waarbij alle drie de contexten (CG, CHG en CHH) sterk verrijkt waren in repetitief DNA, transposons en pericentromere regio's. Methylering vond bijna uitsluitend plaats in een CG-context over het genoom van gewervelde dieren, behalve de niet-gemethyleerde "CpG-eilanden" nabij de transcriptionele startplaatsen van actieve genen. Het meest interessante was dat CG-methylatie in eiwitcoderende genen bij voorkeur geconcentreerd was in de exons, wat een geconserveerd kenmerk lijkt te zijn in alle onderzochte eukaryoten. Gen-lichaam-methylering blijft duidelijk in het honingbijgenoom, ook al is het algehele niveau van genoommethylering erg laag (∼1% van CG-methylering). Alles bij elkaar genomen, hoewel de functie van genetische methylering niet volledig wordt begrepen, is dit geconserveerde methyleringspatroon waarschijnlijk een oud kenmerk, bewaard door evolutie.

Geconserveerde DNA-methylatiepatronen in eukaryoten. Hoewel verschillende methyleringscontexten worden gevonden bij dieren (CG) en planten (CG, CHG, CHH), is gen-lichaam-methylering bij eukaryoten geconserveerd. Transponeerbare elementen (TE's) worden gemethyleerd in bloeiende planten in CG-, CHG- en CHH-contexten, evenals in een CG-context in de genomen van groene algen en zeepijpen. In groene algen is niet-CG-methylering meer verrijkt in exons van genen in vergelijking met TE's en herhalingen (7). Schimmels, niet getoond in de figuur, hebben genomen die over het algemeen niet gemethyleerd zijn in actieve genen, maar sterk gemethyleerd bij TE's en herhalingen (6).

Gelijktijdig met de studie van Feng et al., rapporteerde het laboratorium van Daniel Zilberman ook hun gegevens van de vergelijkende DNA-methylatieprofilering door BS-seq van 17 verschillende eukaryoten, waaronder planten, dieren en schimmels (6). Ze voerden ook transcriptionele profilering uit door middel van RNA-sequencing om de functionele relatie tussen DNA-methylatie en genexpressie te onderzoeken. Ten slotte analyseerden ze de aanwezigheid van een histonvariant (H2A.Z) waarvan het distributiepatroon precies tegengesteld bleek aan dat van DNA-methylatie. Hun gegevens kwamen overeen met eerdere waarnemingen dat gen-lichaam-methylering en de uitputting van H2A.Z uit gemethyleerd DNA evolutionair geconserveerd zijn, oude kenmerken van het eukaryote koninkrijk, daterend van vóór de divergentie van planten en dieren (6). Methylering bij transposons en repetitieve sequenties wordt echter minder consistent gevonden tussen soorten: hoge niveaus van transposon-methylering worden gevonden in landplanten en gewervelde dieren, maar transposon-methylering is niet zichtbaar bij ongewervelde dieren zoals zijdemot en anemoon. Deze resultaten suggereerden dat het gebruik van DNA-methylatie om schadelijke transposons in genomen te onderdrukken mogelijk onafhankelijk is geëvolueerd in planten en gewervelde dieren, terwijl deze functie verloren was gegaan in de ongewervelde lijn (6).

Hoge niveaus van transposon-methylering worden aangetroffen in landplanten en gewervelde dieren.

Hoewel deze laatste onderzoeken ons begrip over evolutionaire aanpassingen en het behoud van DNA-methylatie enorm hebben vergroot, blijven onvermijdelijk vragen onbeantwoord. De functie van geconserveerde, genetische methylering is bijvoorbeeld nog steeds niet duidelijk, hoewel is voorgesteld om afwijkende transcriptie van cryptische promotors in de genen te onderdrukken (14). Bovendien begrijpen we nog steeds niet het mechanisme waarmee DNA-methylatie de gentranscriptieniveaus beïnvloedt, vooral met betrekking tot het fenomeen van zwaardere methylering van bescheiden getranscribeerde genen dan die tot expressie komen in de extremen. Er is gesuggereerd dat extreme transcriptiesnelheden de balans tussen chromatineverstoring en polymerase-associatie kunnen beïnvloeden, die beide het genereren van afwijkende transcripten zouden kunnen voorkomen die methylering via een kleine RNA-afhankelijke route zouden kunnen stimuleren (14). Zilberman et al. suggereren ook dat epigenetische modificaties zoals DNA-methylatie en histon-modificaties van invloed kunnen zijn op nucleosoomassociaties, en vervolgens de polymerasebinding en transcriptionele initiatie kunnen verstoren. Interessant is dat deze veronderstelling in overeenstemming is met de periodiciteit van gemethyleerde cytosines in DNA beschreven in Cokus et al. (8), waarin een patroon van 10 of 167 nucleotiden werd waargenomen, correleerde dit respectievelijk met de lengte van één spiraalvormige rotatie van DNA en de gemiddelde lengte van DNA dat rond een plantennucleosoom is gewikkeld. Meer uitgebreide studies in een breed scala van genomen zullen waarschijnlijk meer inzicht geven in de functie en evolutie van DNA-methylatie.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Inhoudsopgave (19 hoofdstukken)

Mechanismen en biologische rollen van DNA-methyltransferasen en DNA-methylatie: van eerdere prestaties tot toekomstige uitdagingen

DNA en RNA Pyrimidine Nucleobase-alkylering op de koolstof-5-positie

Bacteriële DNA-methylatie en methylomen

Domeinstructuur van de Dnmt1-, Dnmt3a- en Dnmt3b-DNA-methyltransferasen

Enzymologie van zoogdier-DNA-methyltransferasen

Genetische onderzoeken naar zoogdier-DNA-methyltransferasen

De rol van DNA-methylatie bij kanker

Lakshminarasimhan, Ranjani (et al.)

Structuur en mechanisme van planten-DNA-methyltransferasen

DNA-methylatie en genregulatie bij honingbijen: van genoombrede analyses tot verplichte epiallelen

N6-Methyladenine: een geconserveerd en dynamisch DNA-kenmerk

O'Brown, Zach Klapholz (et al.)

Wegen van DNA-demethylering

Structuur en functie van TET-enzymen

Eiwitten die DNA-methylatie lezen

DNA Base Flipping: een algemeen mechanisme voor het schrijven, lezen en wissen van DNA-modificaties

Huidige en opkomende technologieën voor de analyse van de genoombrede en locusspecifieke DNA-methyleringspatronen

DNA-methyltransferaseremmers: ontwikkeling en toepassingen

Herschrijven van DNA-methyleringshandtekeningen naar believen: het geneesbare genoom binnen handbereik?


Hoe kan ik mijn huidige DNA-methylatiemarkeringen veilig bewaren? - Biologie

DNA afgeleid van borstepitheelcellen kan worden geïdentificeerd door DNA-methylatie.

Borst-afgeleid DNA is verhoogd in de bloedsomloop van personen met borstkanker.

Niveaus van van de borst afgeleid circulerend DNA weerspiegelen de respons op de behandeling.

De aanwezigheid van uit de borst afkomstig circulerend DNA is indicatief voor resterende ziekte na behandeling.

Achtergrond

Van tumor afgeleid circulerend celvrij DNA (cfDNA) is aanwezig in het plasma van personen met kanker. Er worden tests ontwikkeld die gericht zijn op het detecteren van veelvoorkomende kankermutaties in cfDNA voor de detectie van verschillende soorten kanker. Bij borstkanker zijn dergelijke tests er echter niet in geslaagd de ziekte te detecteren bij een gevoeligheid die relevant is voor klinisch gebruik, deels vanwege de afwezigheid van meerdere veel voorkomende mutaties die samen in plasma kunnen worden gedetecteerd. In tegenstelling tot individuele mutaties die alleen in een subset van tumoren voorkomen, zijn unieke DNA-methylatiepatronen universeel aanwezig in cellen van een algemeen type en kunnen daarom ideale biomarkers zijn. Hier beschrijven we de detectie en kwantificering van van de borst afgeleid cfDNA met behulp van een borstspecifieke DNA-methyleringshandtekening.

Patienten en methodes

We verzamelden plasma van patiënten met gelokaliseerde borstkanker voor en tijdens de behandeling met neoadjuvante chemotherapie en chirurgie (N = 235 monsters).

Resultaten

Borst-cfDNA voor de behandeling werd gedetecteerd bij patiënten met gelokaliseerde ziekte met een sensitiviteit van 80% bij een specificiteit van 97%. Hoge borst-cfDNA-niveaus waren geassocieerd met agressieve moleculaire tumorprofielen en metabole activiteit van de ziekte. Tijdens neoadjuvante chemotherapie namen de cfDNA-spiegels in de borst dramatisch af. Belangrijk is dat de aanwezigheid van borst-cfDNA tegen het einde van het chemotherapieregime het bestaan ​​van resterende ziekte weerspiegelde.

Conclusie

We stellen voor dat borstspecifiek cfDNA een universele en krachtige marker is voor de detectie en monitoring van borstkanker.


Nanopore-sequencing identificeert methyleringsmarkeringen met behulp van nieuwe statistische methoden

NEW YORK (GenomeWeb) – Twee onderzoeksgroepen hebben onafhankelijk van elkaar methoden ontwikkeld om de MinIon nanopore-sequencer van Oxford Nanopore Technologies te gebruiken om gemethyleerde cytosinebasen te identificeren.

In twee papers die onlangs op de BioRxiv preprint-server zijn geplaatst - door een team van het Ontario Institute for Cancer Research en de Johns Hopkins University en een andere groep van de University of California, Santa Cruz - toonden de onderzoekers aan dat statistische modellen werden toegepast op de ionenstroom die wordt gegenereerd door het passeren van DNA door de MinIon nanoporie zou bepaalde methylatietekens kunnen onderscheiden zonder enige chemische behandeling van het DNA. [IP is eigenlijk geen chemische behandeling – het trekt gewoon DNA naar beneden met een antilichaam].

Eerder hadden onderzoekers experimenteel aangetoond dat nanopore-sequencing base-modificaties kon identificeren, maar momenteel zijn er geen methoden beschikbaar om routinematig methylatiemarkeringen aan te roepen als onderdeel van het base-calling-proces voor sequencing op de MinIon.

In de pre-print studie gepubliceerd door het OICR/Johns Hopkins-team, gebruikten de onderzoekers een verborgen Markov-model om de kans te berekenen dat een cytosine in de context van een CpG-eiland zou worden gemethyleerd.

Het team valideerde eerst hun algoritme op PCR-amplicons van: Escherichia coli stammen zonder methyleringsgebeurtenissen, waarbij hun resultaten werden vergeleken met de referentieparameters van Oxford Nanopore. Vervolgens induceerden ze methylatie op hetzelfde E coli PCR-amplicons, waarbij cytosine in een CpG-context werd omgezet in 5-methylcytosine, en gevalideerd dat de sites in feite waren gemethyleerd met behulp van bisulfietsequencing. Vervolgens hebben ze de amplicons op de MinIon gesequenced en de gegevens op de referentieparameters afgestemd. Vanwege de methylering waren er veel k-meren die significant verschilden van de referentiemodellen.

Het team probeerde vervolgens een algoritme te ontwikkelen dat die verschillen zou kunnen identificeren. Ze deden dit door een nieuw "alfabet" te maken, waarin base-oproep niet alleen A, C, G en T identificeerde, maar ook 5-methylcytosine binnen CpG-eilanden, die ze classificeerden als M.

Ten slotte testte de groep zijn model op een menselijke lymfoblastcellijn met bekende methylering, samen met twee controles: een negatieve methylering en een positieve methylering.

Hoewel het model 5-mC kon detecteren in de context van CpG's, was het niet in staat om methylatie buiten die context te detecteren of k-meren te identificeren die een mix van gemethyleerde en niet-gemethyleerde CpG's hadden.

Om de nauwkeurigheid te bepalen, bemonsterden de onderzoekers willekeurig 100.000 singleton-sites uit zowel de positieve als de negatieve controledatasets, waarbij ze vaststelden dat hun resultaten een nauwkeurigheid van 82 procent hadden. Door de strengheid voor het maken van een oproep te vergroten, konden ze de nauwkeurigheid van die oproepen tot 95 procent verhogen, maar deden ze minder totale oproepen.

Evenzo gebruikte het UCSC-team ook een verborgen Markov-model (HMM) om methylatie te detecteren, maar combineerde het met een hiërarchisch Dirichlet-procesmengselmodel (HDM) - een methode die "statistische sterkte deelt om een ​​reeks complexe distributies robuust te schatten", de auteurs schreven. Ze ontdekten dat het opnemen van HDM "het vermogen van HMM om cytosinevarianten te detecteren verbetert." Daarnaast ontwikkelden ze hun tool om zowel 5-methylcyotosine als 5-hydroxymethylcytosine te kunnen onderscheiden.

Om hun model te testen, genereerde het UCSC-team synthetische DNA-strengen bestaande uit cytosine, 5-mC of 5-hmC. Na sequencing hebben ze de template uitgelijnd en de strengen aangevuld met een referentiesequentie en vervolgens hun HMM-HDM-model gebruikt om elke streng te classificeren. Bij het vergelijken van alle drie waren ze in staat om cytosines te classificeren met een gemiddelde nauwkeurigheid van 76 procent voor de matrijsstrengen en 70 procent voor de complementstreng. Wanneer alleen gemethyleerde versus niet-gemethyleerde cytosines werden genoemd, nam de mediane nauwkeurigheid toe tot respectievelijk 83 procent en 78 procent voor sjabloon- en complementaire strengen.

Beide groepen ontdekten dat de nauwkeurigheid varieerde op basis van de sequentiecontext. Het OICR/Johns Hopkins-team ontdekte dat methylatie het meest waarschijnlijk werd gedetecteerd wanneer het op de vijfde of zesde positie in de 6-meer plaats vond in plaats van op de eerste positie. Het UCSC-team merkte ook op dat "sommige gemodificeerde cytosines gemakkelijk worden opgevangen, terwijl andere niet waarneembaar zijn."

Beide groepen schreven ook dat hun methoden zouden kunnen worden uitgebreid om andere gemodificeerde basen te identificeren. "Het lijkt waarschijnlijk dat de algemene trend van detectie via modulatie van de nanoporiënstroom zal gelden in elk type poriegebaseerde sequencing", schreven de auteurs van de OICR/Johns Hopkins-studie. Bovendien kunnen met deze methode "algemene modellen van andere DNA-schade als gevolg van zware metalen, oxidatie, UV-schade of andere veranderingen in natuurlijk DNA worden gedetecteerd", schreven ze.


Discussie

Hierin rapporteren we veranderingen in sperma-DNA-methylatie geassocieerd met leeftijd. Interessant is dat onze gegevens in tegenstelling zijn met eerdere rapporten van leeftijdsgebonden methyleringsveranderingen in somatische cellen. Recente literatuur suggereert leeftijdsgebonden globale hypomethylering met regionale (gen-geassocieerde) hypermethylering in somatisch weefsel [20], [21]. Daarentegen onthullen onze gegevens leeftijdsgebonden hypermethylering wereldwijd met een sterke voorkeur voor regionaal hypomethylering. Dit is minder verrassend als we rekening houden met het feit dat het bekend is dat sperma andere leeftijdsgebonden modificaties heeft die de conventie tarten (d.w.z. telomeerlengte) [26]-[28]. Intrigerend is dat, hoewel de hierin gerapporteerde methyleringsveranderingen relatief subtiel zijn, ze opvallend significant zijn en veel voorkomen bij individuen op verschillende leeftijden en intervallen tussen collecties, wat suggereert dat deze regio's in de loop van de tijd op een lineaire manier constant veranderen. Belangrijk is dat het erop lijkt dat er veel significant veranderde regio's op loci zijn die kunnen bijdragen aan verschillende ziekten waarvan bekend is dat ze een verhoogde incidentie hebben bij het nageslacht van oudere vaders. Door deze te koppelen aan onze gegevens die aantonen dat geen enkele GO-term of -route in het sperma omhoog of omlaag wordt gereguleerd als gevolg van het verouderingsproces, suggereert dit dat de veranderingen die we hebben waargenomen het resultaat zijn van regionale genomische gevoeligheid voor methyleringsverandering en niet de activering of remming van een cellulair programma. Deze hypothese komt ook goed overeen met de lineaire aard van de veranderingen die we op de meeste loci hebben waargenomen. Hoewel de aard van deze gevoeligheid moeilijk te verklaren is, kan deze verband houden met de chromatine-architectuur.

Opgemerkt moet worden dat hoewel we veel intrigerende veranderingen in het sperma-methyloom hebben geïdentificeerd, deze waarschijnlijk niet alle consistent veranderde regio's vertegenwoordigen die in de loop van de tijd in het sperma voorkomen. Onze aanpak was om wijzigingen te identificeren met behulp van een "promotorarray" die inherente vooroordelen heeft. In het bijzonder is de array betegeld met een hogere dichtheid van probes op promotor- of gen-dichte gebieden. Samen met het gebruik van een beperkte venstergrootte (1000 bps) voor het doorzoeken van het genoom, resulteert dit in een voorkeur voor het identificeren van regio's die goed bedekt zijn op de array. Hoewel deze bias reëel is, maakt het de regio's die we hebben geïdentificeerd niet ongeldig, maar het suggereert dat meer regio's kunnen worden beïnvloed die slecht worden gedekt op de array. Bovendien zijn er inherente problemen met het verzamelen van weefsels in de loop van de tijd. Een van die zorgen is het verschil in bevriezingsmethoden door de jaren heen en de rol die dit kan spelen in methyleringsprofielen. Hoewel het onwaarschijnlijk is dat dit alleen de methyleringsprofielen zou kunnen beïnvloeden, moeten de verschillen in de tijd toch worden gerapporteerd. Het protocol van ons laboratorium voor het invriezen van monsters is consistent geweest voor de tijden van verzameling van alle monsters die in deze studie zijn opgenomen. We hebben al die jaren hetzelfde cryomedium, testdooierbuffer, gebruikt. Het is dan ook onwaarschijnlijk dat de methylatiepatronen in deze monsters worden beïnvloed op basis van een van deze variabelen, en dus vertegenwoordigen de hierin geïdentificeerde verstoringen een echte biologische verandering in het sperma-epigenoom. Dit wordt ondersteund door onze replicatiedataset waarin jonge en oude monsters gelijktijdig werden verzameld.

Lokalisatie van gewijzigde regio's

Om de kenmerken te onderzoeken van regio's waarvan we hebben vastgesteld dat ze het meest vatbaar zijn voor methyleringsveranderingen, evalueerden we de co-lokalisatie van significant veranderde loci in onze studie met regio's met nucleosoomretentie in het volwassen sperma. Het lijkt erop dat hypomethyleringsgebeurtenissen meestal worden geassocieerd met plaatsen van nucleosoomretentie. Opgemerkt moet worden dat onze criteria voor plaatsen van nucleosoomretentie eenvoudigweg zijn dat onze wijzigingsplaatsen voorkomen binnen 1 kb van bekende retentieplaatsen en dat er dus een grotere mate van complexiteit kan zijn in de feitelijke plaatsen van methyleringsverandering dan we hebben geïdentificeerd. De werkelijke aard van methyleringspatronen met een hogere resolutie in deze regio's (of de getroffen regio's flankerend zijn of direct geassocieerd zijn met histonen) is moeilijk op te helderen vanwege de aard van array-betegeling in veel van de loci die we hebben geïdentificeerd. Interessant is dat dezelfde co-lokalisatie niet werd gezien bij hypermethyleringsgebeurtenissen. Hoewel co-lokalisatiepatronen significant verschillen tussen de hypomethylerings- en hypermethyleringsgebeurtenissen, moet worden opgemerkt dat de steekproefomvang vrij klein is in de hypermethyleringsgroep (8 significante vensters). Er moet ook worden opgemerkt dat hoewel de co-lokalisatie van histonen en de hypomethyleringsgebeurtenissen die we in onze studie hebben waargenomen significant zijn, de waargenomen methylatietekens waarschijnlijk eerder in de spermatogenese worden vastgesteld en dus mogelijk niet worden beïnvloed door de nucleosoomarchitectuur in het volledig gerijpte sperma . Bovendien zijn de veranderingen die in deze studie zijn geïdentificeerd niet overal gelokaliseerd waar histonen worden behouden, dus nucleosoomretentie alleen kan niet de onafhankelijke drijvende kracht zijn van regionale gevoeligheid voor methyleringsveranderingen. Verder moet worden opgemerkt dat onze aanpak niet gericht was op het observeren van veranderingen in co-lokalisatiepatronen van chromatine en als zodanig vertegenwoordigt dit een secundaire analyse van deze patronen met behulp van een "promotorarray". Als gevolg van het observeren van slechts een geselecteerd deel van het genoom, zijn er duidelijke vooroordelen die worden geïntroduceerd waarmee rekening moet worden gehouden bij het overwegen van deze bevindingen.

Recente literatuur suggereert een interessante hypothese van "egoïstische spermatogoniale selectie" die ook in deze studie van toepassing kan zijn [29]. Kort gezegd stelt de hypothese dat sommige genmutaties die afwijkingen in de nakomelingen veroorzaken gunstig zijn voor de spermatogenese en tijdens het verouderingsproces in spermatogoniale stamcellen verrijkt worden. Dus sperma dat deze mutaties draagt, komt vaker voor in de populatie ten nadele van het nageslacht. Evenzo is het mogelijk dat de leeftijdsgebonden methyleringsveranderingen die we hebben geïdentificeerd zich in regio's bevinden die belangrijk zijn voor spermatogenese en dus zouden worden geselecteerd. Hoewel de hierin geïdentificeerde genen geen bekende hotspots voor spermatogenese zijn, kunnen ze dicht bij andere genen liggen die belangrijk zijn in ontwikkeling en kunnen ze dus onderhevig zijn aan een lossere chromatinetoestand, waardoor deze genen vatbaarder zijn voor methyleringsverstoringen.

De hypomethyleringsgebeurtenissen die we hebben geïdentificeerd, kunnen optreden als gevolg van actieve of passieve demethylering. Regionale transcriptie-activiteit op loci die belangrijk zijn bij spermatogenese zou bijvoorbeeld waarschijnlijk gepaard gaan met een ontspannen chromatinestructuur die in de loop van de tijd zou kunnen resulteren in een verhoogde frequentie van DNA-schade. Gevestigde methylatiemarkeringen die zich in dit gebied bevinden, kunnen dan passief worden verwijderd door middel van reparatiemechanismen in het zich ontwikkelende sperma. Als het verwijderen van dit merkteken gunstig is of geen effect heeft op de spermatogenese, zal het blijven bestaan, en na verloop van tijd kunnen soortgelijke merktekens zich ophopen bij nabijgelegen CpG's, wat uiteindelijk leidt tot het profiel dat we in onze studie hebben geïdentificeerd. Er moet ook worden opgemerkt dat de accumulatie van de novo-mutaties kan leiden tot een vergelijkbaar profiel. Het is duidelijk dat het aantal mutaties in het sperma toeneemt met de leeftijd, en als deze mutaties deaminering van cytosineresiduen met zich meebrengen, zou de resulterende sequentie kunnen verschijnen als een verlies van methylering met de hierin gebruikte technologieën. De mutatiebelasting, en met name deze C naar T-overgangen, in sperma zijn echter stochastisch van aard en kunnen dus niet de primaire drijvende factor zijn voor de genomische hotspots van leeftijdsgebonden hypomethylering die worden waargenomen bij vrijwel alle gescreende personen [30]. Als alternatief kan actieve enzymatische verwijdering van methylatiemarkeringen in het sperma leeftijdsgebonden methyleringsveranderingen veroorzaken. Om dit mechanisch aannemelijk te maken, zouden we moeten aannemen dat hypomethylering in de vensters die we hebben geïdentificeerd altijd gunstig is voor de spermatogenese. Hoewel elk van deze mechanismen aannemelijk is, is het waarschijnlijk dat de effecten die we hebben geïdentificeerd een combinatie van beide omvatten.

De mechanica van hypermethyleringsgebeurtenissen met de leeftijd zijn moeilijker op te helderen, omdat dit per definitie een actief gericht proces moet zijn waarbij methyltransferase-enzymen betrokken zijn. Er zijn echter aanwijzingen uit deze studie dat de DNA-sequentie een belangrijke oorzaak kan zijn van leeftijdsgebonden hypermethylering. Van de 7 vensters die we hebben geïdentificeerd met gen-geassocieerde hypermethylering met de leeftijd, zijn er 4 geassocieerd met de FAM86-familie van genen die niet zijn gecategoriseerd op basis van eiwitfunctie of genomische locatie, maar op sequentieovereenkomst. Dit suggereert sterk dat, ten minste gedeeltelijk, leeftijdsgebonden hypermethyleringsgebeurtenissen op specifieke loci, direct of indirect, worden aangedreven door de DNA-sequentie. Interessant is dat deze familie van genen (FAM86) met onbekende functie recentelijk is gecategoriseerd met een grotere familie van methyltransferasegenen, hoewel het onduidelijk blijft wat het (de) FAM86-doelwit(en) is/zijn (DNA, Histon, andere eiwitten, enz.). Het is belangrijk op te merken dat naast deze regionale hypermethyaltiegebeurtenissen, globaal ook de DNA-methylering aanzienlijk is toegenomen. De mogelijke rol van chromatine-modificaties (histon-staart-modificaties, enz.) In dit proces is ook belangrijk om op te merken, aangezien wat we hebben geïdentificeerd verband kan houden met regionale histon-methylering, acetylering, enz. Dergelijke histon-modificaties kunnen onderliggende transcriptionele veranderingen tijdens spermatogenese weerspiegelen. Alles bij elkaar genomen blijven de mechanismen die leeftijdsgerelateerde methyleringsveranderingen in het sperma veroorzaken, ongrijpbaar, maar omvatten waarschijnlijk zowel actieve als passieve methyleringsmodificatie.

Biologische betekenis

Het is belangrijk om twee vragen in overweging te nemen bij het bepalen van de biologische effecten van de geïdentificeerde methyleringsveranderingen in deze studie. Ten eerste, zijn de hierin beschreven methyleringsveranderingen in staat tot transcriptieveranderingen? Ten tweede, zijn deze methyleringsveranderingen in staat om herprogrammering van embryonale methylering te voorkomen? Ongeacht het mechanisme waarmee deze methylatiemarkeringen in de loop van de tijd in het sperma worden veranderd, is het opvallend dat deze veranderingen met zo'n consistentie tussen individuen optreden en zo'n nauw verband hebben met de leeftijd dat werd gezien in zowel de gepaarde donoranalyse als het onafhankelijke cohort analyse. Dit staat in schril contrast met de relatieve stabiliteit van het sperma-methyloom die in de loop van de tijd bij elk individu in het grootste deel van het genoom wordt waargenomen. Een beperking van deze bevindingen is echter de omvang van de veranderingen die we hebben ontdekt. Zoals eerder beschreven was de gemiddelde fractie methylatie verandering per jaar ongeveer een verandering van 0.281%. Hoewel dit relatief klein lijkt, zou de verandering 10-12% zijn als het wordt uitgebreid met de mogelijke redelijke reproductieve jaren bij een man. De toegenomen mate van verandering met toenemende leeftijd wordt sterk ondersteund door onze onafhankelijke cohortstudie waarin een toename van het leeftijdsverschil tussen twee groepen direct gecorreleerd was met een toename in de omvang van methyleringsveranderingen op vrijwel elke locus die op een relatief lineaire manier werd gescreend. Belangrijk is dat op basis van onze analyse van complete nucleotidesequenties uit onze sequentiegegevens blijkt dat deze afname van 10-12% veranderingen in willekeurige CpG's binnen gevoeligheidsvensters in alle spermacellen weerspiegelt, die zich in een individueel sperma zouden manifesteren als een mozaïek gemethyleerd gebied. De resulterende verandering van 10-12% in methylering binnen elk afzonderlijk sperma (in feite is 1 op de 10 CpG's gedemethyleerd) suggereert dat elk sperma gemiddeld vergelijkbare, subtielere veranderingen in deze regio's met zich meebrengt.

It is important to note that because we only investigated a portion of the regions of interest in our sequencing run (used for confirmation of array results) and the amplicons we probed made up only a portion of the regions of interest, we can not make a definitive overarching statement about the dynamics of methylation profile population shifts in sperm as a result of age. Despite this, the consistency of population shifts in the regions we were able to observe suggests that other regions of interest would likely follow similar patterns. Regardless, the resultant age-associated epigenetic landscape alterations may contribute to disease susceptibility in the offspring despite the small degree of change though the increased risk to the offspring may be relatively small. Figure 7 illustrates the alterations seen at two representative loci from our analysis, Dopamine receptor D4 (DRD4 ENSG00000170956) and tenascin XB (TNXB ENSG00000168477).


Если ваш хронологический возраст составляет 50 лет, а биологический – 35, отлично! Вам повезло!

Но если ваш хронологический возраст составляет 35 лет, а биологический – 50, это уже тревожный признак того, что нужно изменить образ жизни. Ускоренное старение связано с возможностью повышенного риска серьезной болезни.

Эпигенетика может и не быть Источником Молодости, но ее точно можно назвать Источником Жизни.

Так узнайте сколько же Вам лет на самом деле!

Наш биологический возраст – лучший параметр нашего здоровья и продолжительности жизни по сравнению с нашим хронологическим возрастом.

Но как мы узнаем наш “биологический возраст”?

Считалось, что если мы сможем определить истинный “биологический возраст”, то сможем протестировать и разработать меры, которые замедлят темпы биологического старения. В течение последних десятилетий были приложены огромные усилия для определения различных параметров, которые могли бы предсказать “биологическое старение” и продолжительность жизни, таких как показатели хрупкости, поседения волос, старения кожи, уровни различных видов лейкоцитов. Однако большинство из этих маркеров не дают никаких преимуществ по сравнению со знанием вашего хронологического возраста.

Эпигенетика открывает новые подходы к определению истинного возраста. В связи с этим возникают два важных вопроса: что такое ДНК и почему она важна?

Более 99% нашей ДНК идентична ДНК других людей. Тем не менее, небольшая часть ДНК, которая отличается у разных людей, делает нас уникальными.

После обширного анализа данных мы обнаружили одну область метилирования цитозина, достаточную для точного прогнозирования биологического возраста с использованием слюны.

Хотя до сих пор не ясно, как можно замедлить старение путем изменений образа жизни, рекомендованных большинством национальных медицинских ассоциаций, возможно, это только начало. Пожилой возраст – это “красный флаг”, который говорит о том, что, возможно, пришло время внести некоторые изменения в образ жизни.


Enkele recente bevindingen

  • Review - Germline epigenetic inheritance: Challenges and opportunities for linking human paternal experience with offspring biology and healthΒ] "Recently, novel experimental approaches and molecular techniques have demonstrated that a male's experiences can be transmitted through his germline via epigenetic processes. These findings suggest that paternal exposures influence phenotypic variation in unexposed progeny-a proposal that runs counter to canonical ideas about inheritance developed during the 20th century. Nevertheless, support for paternal germline epigenetic inheritance (GEI) in nonhuman mammals continues to grow and the mechanisms underlying this phenomenon are becoming clearer. To what extent do similar processes operate in humans, and if so, what are their implications for understanding human phenotypic variation, health, and evolution? Here, we review evidence for GEI in human and nonhuman mammals and evaluate these findings in relation to historical conceptions of heredity."
  • DNA methylation in Schwann cells and in oligodendrocytesΓ] "DNA methylation is one of many epigenetics marks, which directly modifies base residues, usually cytosines, in a multiple-step cycle. It has been linked to the regulation of gene expression and alternative splicing in several cell types, including during cell lineage specification and differentiation processes. DNA methylation changes have also been observed during aging, and aberrant methylation patterns have been reported in several neurological diseases. We here review the role of DNA methylation in Schwann cells and oligodendrocytes, the myelin-forming glia of the peripheral and central nervous systems, respectively. We first address how methylation and demethylation are regulating myelinating cells' differentiation during development and repair. We then mention how DNA methylation dysregulation in diseases and cancers could explain their pathogenesis by directly influencing myelinating cells' proliferation and differentiation capacities."
  • The role and mechanisms of DNA methylation in the oocyteΔ] "Epigenetic information in the mammalian oocyte has the potential to be transmitted to the next generation and influence gene expression this occurs naturally in the case of imprinted genes. Therefore, it is important to understand how epigenetic information is patterned during oocyte development and growth. Here, we review the current state of knowledge of de novo DNA methylation mechanisms in the oocyte: how a distinctive gene-body methylation pattern is created, and the extent to which the DNA methylation machinery reads chromatin states. Recent epigenomic studies building on advances in ultra-low input chromatin profiling methods, coupled with genetic studies, have started to allow a detailed interrogation of the interplay between DNA methylation establishment and chromatin states however, a full mechanistic description awaits."
  • Review - Reevaluation of FMR1 Hypermethylation Timing in Fragile X Syndromeΐ] "Fragile X syndrome (FXS) is one of the most common heritable forms of cognitive impairment. It results from a fragile X mental retardation protein (FMRP) protein deficiency caused by a CGG repeat expansion in the 5'-UTR of the X-linked FMR1 gene. Whereas in most individuals the number of CGGs is steady and ranges between 5 and 44 units, in patients it becomes extensively unstable and expands to a length exceeding 200 repeats (full mutation). Interestingly, this disease is exclusively transmitted by mothers who carry a premutation allele (55-200 CGG repeats). When the CGGs reach the FM range, they trigger the spread of abnormal DNA methylation, which coincides with a switch from active to repressive histone modifications. This results in epigenetic gene silencing of FMR1 presumably by a multi-stage, developmentally regulated process. The timing of FMR1 hypermethylation and transcription silencing is still hotly debated. There is evidence that hypermethylation varies considerably between and within the tissues of patients as well as during fetal development, thus supporting the view that FMR1 silencing is a post-zygotic event that is developmentally structured. On the other hand, it may be established in the female germ line and transmitted to the fetus as an integral part of the mutation. This short review summarizes the data collected to date concerning the timing of FMR1 epigenetic gene silencing and reassess the evidence in favor of the theory that gene inactivation takes place by a developmentally regulated process around the 10th week of gestation." Fragile X
  • Maintenance of Mest imprinted methylation in blastocyst-stage mouse embryos is less stable than other imprinted loci following superovulation or embryo cultureΕ] "Assisted reproductive technologies are fertility treatments used by subfertile couples to conceive their biological child. Although generally considered safe, these pregnancies have been linked to genomic imprinting disorders, including Beckwith-Wiedemann and Silver-Russell Syndromes. Silver-Russell Syndrome is a growth disorder characterized by pre- and post-natal growth retardation. The Mest imprinted domain is one candidate region on chromosome 7 implicated in Silver-Russell Syndrome. We have previously shown that maintenance of imprinted methylation was disrupted by superovulation or embryo culture during pre-implantation mouse development. For superovulation, this disruption did not originate in oogenesis as a methylation acquisition defect. However, in comparison to other genes, Mest exhibits late methylation acquisition kinetics, possibly making Mest more vulnerable to perturbation by environmental insult. In this study, we present a comprehensive evaluation of the effects of superovulation and in vitro culture on genomic imprinting at the Mest gene. Superovulation resulted in disruption of imprinted methylation at the maternal Mest allele in blastocysts with an equal frequency of embryos having methylation errors following low or high hormone treatment. This disruption was not due to a failure of imprinted methylation acquisition at Mest in oocytes. For cultured embryos, both the Fast and Slow culture groups experienced a significant loss of maternal Mest methylation compared to in vivo-derived controls. This loss of methylation was independent of development rates in culture. These results indicate that Mest is more susceptible to imprinted methylation maintenance errors compared to other imprinted genes." Chromosome 7

Deze tabel maakt een geautomatiseerde computerzoekopdracht van de externe PubMed-database mogelijk met behulp van de vermelde tekstlink "Zoekterm".

  • Deze zoekopdracht vereist nu een handmatige link omdat de oorspronkelijke PubMed-extensie is uitgeschakeld.
  • De weergegeven lijst met referenties weerspiegelen geen redactionele selectie van materiaal op basis van inhoud of relevantie.
  • Referenties verschijnen ook in deze lijst op basis van de datum van de daadwerkelijke paginaweergave.


Referenties vermeld op de rest van de inhoudspagina en de bijbehorende discussiepagina (vermeld onder de subrubrieken van het publicatiejaar) bevatten enige redactionele selectie op basis van zowel relevantie als beschikbaarheid.

Zie ook de Discussiepagina voor andere referenties per jaar en Referenties op deze huidige pagina.

  • The DNA methylation landscape of human early embryosΖ] "DNA methylation is a crucial element in the epigenetic regulation of mammalian embryonic development.We show that the major wave of genome-wide demethylation is complete at the 2-cell stage, contrary to previous observations in mice. Moreover, the demethylation of the paternal genome is much faster than that of the maternal genome, and by the end of the zygotic stage the genome-wide methylation level in male pronuclei is already lower than that in female pronuclei.
  • DNA methylation dynamics of the human preimplantation embryoΗ] "In mammals, cytosine methylation is predominantly restricted to CpG dinucleotides and stably distributed across the genome, with local, cell-type-specific regulation directed by DNA binding factors. . We present genome-scale DNA methylation maps of human preimplantation development and embryonic stem cell derivation, confirming a transient state of global hypomethylation that includes most CpGs, while sites of residual maintenance are primarily restricted to gene bodies. Together, our data confirm that paternal genome demethylation is a general attribute of early mammalian development that is characterized by distinct modes of epigenetic regulation."
  • moederlijk genome-wide DNA methylation patterns and congenital heart defects⎖] "The majority of congenital heart defects (CHDs) are thought to result from the interaction between multiple genetic, epigenetic, environmental, and lifestyle factors. Epigenetic mechanisms are attractive targets in the study of complex diseases because they may be altered by environmental factors and dietary interventions. . We present preliminary evidence that alterations in maternal DNA methylation may be associated with CHDs. Our results suggest that further studies involving maternal epigenetic patterns and CHDs are warranted. Multiple candidate processes and pathways for future study have been identified."
  • Epigenetics 2010⎗] "This collection brings together twenty Research Articles published in five PLoS journals in the area of epigenetics during 2010, along with a Research in Translation article and two Primers. They reflect a range of model systems and organisms, and variously offer phenotypic, mechanistic, and chromatin-based insights."
  • Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.⎘] "Our data indicate that nuclear transfer is more effective at establishing the ground state of pluripotency than factor-based reprogramming, which can leave an epigenetic memory of the tissue of origin that may influence efforts at directed differentiation for applications in disease modelling or treatment." (More? Stem Cells)

Programming of DNA Methylation Patterns

DNA methylation represents a form of genome annotation that mediates gene repression by serving as a maintainable mark that can be used to reconstruct silent chromatin following each round of replication. During development, germline DNA methylation is erased in the blastocyst, and a bimodal pattern is established anew at the time of implantation when the entire genome gets methylated while CpG islands are protected. This brings about global repression and allows housekeeping genes to be expressed in all cells of the body. Postimplantation development is characterized by stage- and tissue-specific changes in methylation that ultimately mold the epigenetic patterns that define each individual cell type. This is directed by sequence information in DNA and represents a secondary event that provides long-term expression stability. Abnormal methylation changes play a role in diseases, such as cancer or fragile X syndrome, and may also occur as a function of aging or as a result of environmental influences.


Bekijk de video: DNA Update Jaarrede 2018 - begroting 2019 (December 2021).