Informatie

Hoe fibroblastkolonies uit enkele cellen te laten groeien?


Ik moet een cellijn maken uitgaande van enkele cellen die door een FACS-sorteerder op een plaat met 96 putjes zijn gezaaid. De cellen die ik gebruik zijn menselijke fibroblasten RPE-1 gekweekt in F12-medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica. Na 5x96 cellen te hebben gezaaid (één cel per putje in 5 platen) heb ik slechts 4 kolonies verkregen. Kent iemand een goed (bij voorkeur persoonlijk getest) protocol om efficiënt fibroblastkolonies uit afzonderlijke cellen te laten groeien?


Dit zou relatief rechttoe rechtaan moeten zijn. Sorteer de cellen in afzonderlijke putjes zodat alle nakomelingen klonen zijn van de gesorteerde cel en laat ze groeien totdat ze dicht genoeg zijn om te worden overgebracht naar een grotere plaat (waarschijnlijk 48 of 24 putjes). Ga door met dit proces totdat je in grote celcultuurkolven of platen kunt gaan en zorg ervoor dat je een aantal porties invriest als back-up als er iets misgaat. Vouw de cellen verder uit totdat je genoeg cellen hebt om een ​​analyse uit te voeren.

Keratinocyten hebben enige tijd nodig om zeer proliferatief te worden (ongeveer een week of zo) en als je ze niet op een laag voedingscellen laat groeien, hebben ze meestal ook een speciaal geconditioneerd medium nodig. Zie de referenties hieronder (laat het me weten als je problemen hebt om toegang te krijgen tot de papieren).

Wat vaak ook helpt is het gebruik van geconditioneerde media. Ik weet dit van andere cellen in de huid die vaak niet graag groeien (althans niet als primaire cellen) tenzij je geconditioneerde media gebruikt. Neem hiervoor de media van hetzelfde soort cellen (hier zouden het keratinocyten zijn) voordat het volledig is gebruikt (meestal geel als het medium pH-indicatoren bevat), centrifugeer het om celresten te verwijderen en meng het vervolgens met verse media om je cellen te laten groeien. Je moet misschien wat experimenteren met de mengverhouding tussen de "gebruikte" en de verse media, maar 50%:50% is meestal een goed uitgangspunt.

Referenties:

  1. Isolatie en kweek van menselijke keratinocyten uit huid of uitgetrokken haren voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen
  2. Kweektechnieken voor menselijke keratinocyten
  3. Verbetering van de isolatie en kweek van menselijke keratinocyten met behulp van thermolysine

Hoewel ik dat nog niet heb gedaan, zijn cellen over het algemeen gelukkiger in een conditioneringsmedium. Kweek de originele cellen in schalen van 10 cm en bewaar het medium en gebruik het om afzonderlijke kolonies te laten groeien. Misschien wilt u gebruikt en vers medium mengen (1:1 verhouding).

Groeifactoren zijn een andere optie. Insuline wordt soms gebruikt, maar het is ook afhankelijk van cellen.

Het bekleden van het oppervlak van de put met extracellulaire matrix zoals collageen zou effectief kunnen zijn.

Als uw cellen normale menselijke fibroblasten zijn, worden cellen verouderd en stoppen ze met groeien. Misschien wilt u vereeuwigde cellen zoals hTERT RPE-1 gebruiken, hoewel u voorzichtig moet zijn omdat onsterfelijkheid karakteristieke veranderingen kan veroorzaken.


Een artikel over celklonen (met diagram)

Bij de traditionele kweektechnieken zijn de cellen heterogeen van aard. Isolatie van zuivere celstammen is vaak nodig voor verschillende doeleinden.

Celklonering omvat in grote lijnen de processen die verband houden met de productie van een populatie cellen die is afgeleid van een enkele cel. Het klonen van continue cellijnen is veel gemakkelijker in vergelijking met die van de primaire culturen en eindige cellijnen.

Er zijn bepaalde beperkingen voor het klonen van kweekcellen die zijn afgeleid van normale weefsels. Deze cellen overleven een beperkt aantal generaties en daarom kan klonen niet resulteren in een significant aantal cellen. Aan de andere kant is het klonen van continue cellijnen vanwege hun getransformeerde status veel gemakkelijker. De getransformeerde cellen hebben dus een hogere kloneringsefficiëntie in vergelijking met normale cellen.

Klonen kan worden uitgevoerd door twee benaderingen: monolaag- en suspensieculturen:

Petrischalen, platen met meerdere putjes of kolven kunnen worden gebruikt voor klonering door middel van monolaagcultuur. Het is relatief eenvoudig om de afzonderlijke kolonies cellen te verwijderen van de oppervlakken waar ze zijn bevestigd.

Klonen kan in suspensie worden uitgevoerd door cellen te zaaien in viskeuze oplossingen (Methocel) of gels (agar). Omdat de dochtercellen in suspensie worden gevormd, blijven ze intact en vormen kolonies in suspensie.

Verdunning Klonen:

Klonen met verdunning is de meest gebruikte techniek voor het klonen van monolaagcellen en omvat de volgende fasen (Fig. 39.1).

1. Trypsinisatie van cellen (in de logfase) om suspensies van enkelvoudige cellen te produceren.

2. Verdunning van de cellen tot ongeveer 10-100 cellen/ml.

3. Zaai de cellen in schalen met meerdere putjes, petrischalen of plastic flessen.

4. Incubeer onder geschikte omstandigheden gedurende 1-3 weken.

5. Isoleer individuele kolonies.

De klonen kunnen direct worden geïsoleerd uit de multi-well schalen (door trypsinisatie), door ringtechniek uit petrischalen te klonen en door de plastic fles te bestralen.

Stimulatie van plating-efficiëntie:

Plating efficiëntie vertegenwoordigt het percentage cellen gezaaid bij subcultuur die aanleiding geeft tot kolonies. Er wordt gezegd dat de uitplaatefficiëntie en de kloneringsefficiëntie identiek zijn, als elke kolonie is afgeleid van een enkele cel. De efficiëntie van het plateren is ongeveer 10% voor continue cellijnen, terwijl het voor primaire culturen en eindige cellijnen vrij laag is - 0,5 tot 5% of soms zelfs nul. Er worden verschillende pogingen ondernomen om de efficiëntie van het plateren in de kweeklaboratoria te verbeteren. Deze benaderingen zijn gebaseerd op de aanname dat de cellen bij lage dichtheden meer voedingsstoffen en/of groeifactoren nodig hebben.

De stimulering van de uitplatingsefficiëntie met betrekking tot kweekfactoren, geconditioneerd medium en feederlagen wordt kort beschreven:

Een medium dat rijk is aan verschillende nutriënten is beter geschikt voor het verbeteren van de platingsefficiëntie.

Foetaal runderserum is beter dan paarden- of kalfserum, als toevoeging van serum vereist is.

Toevoeging van metabolieten:

Door het medium aan te vullen met intermediaire metabolieten (bijv. pyruvaat, α-ketoglutaraat) en nucleosiden wordt de efficiëntie van de uitplaten gestimuleerd.

Dexamethason, een synthetisch analoog van hydrocortison, verbetert de uitplatingsefficiëntie b.v. fibroblasten, melanoomcellen, kippenmyoblasten. Insuline stimuleert ook de uitplatingsefficiëntie van verschillende celtypen.

CO2 heeft een aanzienlijke invloed op de efficiëntie van de plating. De meeste cellen hebben 5% CO . nodig2 terwijl voor sommige cellen een lagere CO2 concentratie (ongeveer 2% CO2) is beter b.v. menselijke fibroblasten. HEPES wordt gebruikt om het medium te beschermen tegen pH-schommelingen.

Voorbehandeling van ondergrond:

De platen voorbehandeld met fibronectine of polylysine vertonen een verbeterde efficiëntie van de plaatvorming.

Gebruik van gezuiverde trypsine:

Sommige werknemers geven er de voorkeur aan gezuiverd trypsine te gebruiken in plaats van ruw trypsine voor trypsinisatie, zodat de efficiëntie van het plateren beter is.

Een medium dat al is gebruikt voor de groei van andere cellen bevat bepaalde metabolieten, groeifactoren en andere producten die de groei stimuleren. Een dergelijk medium, waarnaar wordt verwezen als geconditioneerd medium, verbetert, wanneer het wordt toegevoegd aan celkloneringsmedium, de efficiëntie van het uitplaten.

Een laaggroei-gestopte levende cellen, ook wel feederlaag genoemd, bevordert de efficiëntie van het uitplaten. Dit komt omdat de voedingscellen voedingsstoffen, groeifactoren en matrixbestanddelen leveren die de overleving, groei en proliferatie van cellen ondersteunen.

Opschorting Klonen:

Bepaalde cellen, in het bijzonder de getransformeerde fibroblasten en hematopoëtische stamcellen, kunnen gemakkelijker in suspensie worden gekloneerd dan in monolagen. Klonen in suspensie kan worden uitgevoerd met behulp van agar of Methocel, die de cellen van een bepaalde kolonie bij elkaar kan houden en vermenging van kolonies kan voorkomen. De techniek van het klonen in agarsuspensie wordt in de volgende fasen uitgevoerd (Fig. 39.2).

1. Er kunnen cellen uit suspensiekweek of monolagen worden gebruikt. De monolaagcellen moeten worden getrypsiniseerd, terwijl de suspensiecellen direct kunnen worden gebruikt.

2. Tel de cellen en verdun serieel zodat uiteindelijk 10-200 cellen/ml aanwezig zijn.

3. Er wordt vers bereid agarmedium met geschikte verdunning gebruikt.

4. Het agarmedium wordt geënt met de verdunde cellen.

5. Incubatie gedurende 1-3 weken gegeven klonen in kweek.

Isolatie van klonen:

Nadat het klonen is voltooid, is selectie en isolatie van specifieke celstammen de volgende belangrijke stap. Dit is essentieel voor de voortplanting van cellen. Als de monolaagcellen direct in de multi-well platen worden gekloond, kunnen de kolonies worden geïsoleerd door trypsinisatie van de individuele wells. Wanneer het klonen echter in petrischalen wordt uitgevoerd, kunnen de kolonies van het medium worden gescheiden door roestvrijstalen of keramische ringen rond de kolonies te plaatsen.

De echtheid van een kolonie die de kolonie is, is afgeleid van een enkele cel en kan worden gedaan door micromanipulatie. Dit kan worden bereikt door de kolonievorming in de vroege stadia van celklonering te volgen. Micromanipulatie, indien correct uitgevoerd, wordt beschouwd als de afdoende methode om de echte klonaliteit van een kloon te bepalen.


Procedure

Verkrijg een LB-agarplaat met geschikt antibioticum.

Label de onderkant van de plaat met de naam van het plasmide en de datum. Het is ook een goed idee om de antibioticaresistentie en uw initialen toe te voegen. Etikettering binnen een laboratoriumomgeving is belangrijk voor de organisatie, en het is aan te raden om een ​​standaard labelsysteem te gebruiken voor al uw objecten/oplossingen.

Steriliseer uw laboratoriumbank door deze te besproeien met 70% ethanol en af ​​te vegen met een papieren handdoek. Handhaaf de steriliteit door in de buurt van een vlam of bunsenbrander te werken.

Zorg voor de juiste bacteriële steek of glycerolvoorraad.

Raak met een steriele lus, pipetpunt of tandenstoker de bacteriën aan die groeien in het doorboorde gebied van de steekcultuur of de bovenkant van de glycerolvoorraad.

Verspreid de bacteriën voorzichtig over een deel van de plaat, zoals weergegeven in het bovenstaande diagram, om streep #1 te creëren.

Gebruik een verse, steriele tandenstoker of een vers gesteriliseerde lus, sleep door streep #1 en verspreid de bacteriën over een tweede deel van de plaat om streep #2 te creëren.

Gebruik een derde steriele pipetpunt, tandenstoker of gesteriliseerde lus, sleep door streep #2 en verspreid de bacteriën over het laatste deel van de plaat om streep #3 te creëren.

Incubeer de plaat met nieuw vergulde bacteriën 's nachts (12-18 uur) bij 37 °C.

In de ochtend zouden enkele kolonies zichtbaar moeten zijn. Een enkele kolonie zou eruit moeten zien als een witte stip die op het vaste medium groeit. Deze stip is samengesteld uit miljoenen genetisch identieke bacteriën die zijn voortgekomen uit een enkele bacterie. Als de bacteriegroei te dicht is en u geen enkele kolonies ziet, strijk dan opnieuw op een nieuwe agarplaat om afzonderlijke kolonies te verkrijgen.

Als u eenmaal enkele kolonies heeft, kunt u doorgaan met Plasmide-DNA herstellen of de afzonderlijke kolonies gebruiken voor andere experimenten.


Richtlijnen voor kloonisolatie en validatie

Nadat u de splitsingsefficiëntie van de gepoolde celpopulatie hebt bepaald, isoleert u eencellige klonen voor verdere validatie en bankieren. U kunt eencellige klonen isoleren uit de geselecteerde pool met behulp van limiting dilution cloning (LDC) in platen met 96 putjes of door eencellige sortering met behulp van een flowcytometer.

Klonen met verdunning beperken (LDC)

  • Op basis van de bewerkingsefficiëntie en geschatte levensvatbaarheid van de cellen, kunt u het aantal afzonderlijke klonen schatten dat nodig is om een ​​gewenste knock-out (KO) klonale cellijn te verkrijgen.

Als u bijvoorbeeld een homozygote KO wenst met mutaties in beide kopieën van een gen en de resulterende GeneArt-splitsingsdetectie-efficiëntie was 50%, dan is de kans dat beide allelen in een cel worden uitgeschakeld 25% (0,5 × 0,5 = 0,25) .

Als de kans dat een indel tot frameverschuiving leidt 2/3 is, dan is de kans op een homozygote KO gelijk aan

  • Houd er rekening mee dat de overlevingskansen van een enkele cel per celtype verschillen. Sommige cellen die niet graag als afzonderlijke cellen blijven, moeten met een lage dichtheid worden uitgeplaat om goed gescheiden kolonies te krijgen, die vervolgens handmatig moeten worden geplukt voor verdere screening.

Voorbeeld LDC-procedure met 293FT-cellen

  1. Was de getransfecteerde cellen in elk putje van de 24-putjesplaat met 500 L PBS. Zuig de PBS voorzichtig op en gooi deze weg.
  2. Voeg 500 L TrypLE-celdissociatiereagens toe aan de cellen en incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C.
  3. Voeg 500 L volledig groeimedium toe aan de cellen om het dissociatiereagens te neutraliseren. Pipetteer de cellen meerdere keren op en neer om de celaggregaten op te breken. Zorg ervoor dat de cellen goed gescheiden zijn en niet samenklonteren.
  4. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g tot pellet.
  5. Zuig het supernatant op, resuspendeer de cellen in een geschikt volume voorverwarmd (37 ° C) groeimedium en voer vervolgens een celtelling uit.
  6. Verdun de cellen na het tellen tot een dichtheid van 8 cellen/mL volledig groeimedium. Bereid een totaal van 50 mL celsuspensie bij deze celdichtheid en breng over naar een steriel reservoir.
    Opmerking: U kunt ook een seriële verdunning uitvoeren om een ​​betere schatting van de celdichtheid te krijgen.
  7. Breng met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL van de celsuspensie over in elk putje van weefselkweekplaten met 96 putjes totdat het gewenste aantal platen is gezaaid. Zorg ervoor dat u de cellen mengt tussen het zaaien van de platen om de vorming van celaggregaten te voorkomen.
    Opmerking: Over het algemeen zaaien we tien platen met 96 putjes om een ​​groot aantal klonen te verkrijgen. Het aantal te zaaien platen hangt af van de bewerkingsefficiëntie van de gepoolde celpopulatie en de levensvatbaarheid van cellen na isolatie van een enkele cel.
  8. Incubeer de platen in een 37 ° C, 5% CO2 broedmachine.
  9. Scan de platen voor eencellige kolonies zodra kleine aggregaten van cellen zichtbaar zijn onder een 4X-microscoop (meestal na de eerste week, afhankelijk van de groeisnelheid van de cellijn).
  10. Ga door met het incuberen van de platen voor nog eens 2-3 weken om de klonale populaties uit te breiden voor verdere analyse en karakterisering.

Voorbeeld procedure voor het sorteren van één cel in een plaat met 96 putjes met behulp van flowcytometer

U kunt afzonderlijke cellen per putje sorteren in een plaat met 96 putjes met behulp van een flowcytometer met sorteermogelijkheid voor één cel. Na het sorteren en uitbreiden van de eencellige klonen, analyseer en karakteriseer je de klonale populaties met behulp van geschikte testen. Het volgende is een voorbeeld van eencellige sorteerprocedure met 293FT-cellen.

  1. Was de getransfecteerde 293FT-cellen in elk putje van de 24-putjesplaat met 500 L PBS. Zuig de PBS voorzichtig op en gooi deze weg.
  2. Voeg 500 L TrypLE-celdissociatiereagens toe aan de cellen en incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C.
  3. Voeg 500 L volledig groeimedium toe aan de cellen om het dissociatiereagens te neutraliseren. Pipetteer de cellen meerdere keren op en neer om de celaggregaten op te breken. Zorg ervoor dat de cellen goed gescheiden zijn en niet samenklonteren.
  4. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g tot pellet.
  5. Zuig het supernatant op en was de celpellet eenmaal met 500 μL PBS.
  6. Resuspendeer 1 × 106 cellen in 1 ml FACS-buffer en voeg vervolgens propidiumjodide (PI) toe aan de cellen met een eindconcentratie van 1 g/mL. Houd de geresuspendeerde cellen op ijs.
  7. Filter de cellen met behulp van geschikte filters voordat u ze analyseert op een flowcytometer met sorteermogelijkheid voor één cel.
  8. Sorteer PI-negatieve cellen in een 96-wells-plaat met 100 L volledig groeimedium. Indien gewenst kunt u 1X antibiotica gebruiken met het volledige groeimedium.
  9. Incubeer de platen in een 37 ° C, 5% CO2 broedmachine.
  10. Scan de platen voor eencellige kolonies zodra kleine aggregaten van cellen zichtbaar zijn onder een 4X-microscoop. Kolonies moeten groot genoeg zijn om zo snel als 7-14 dagen te zien (meestal na de eerste week, afhankelijk van de groeisnelheid van de cellijn). U kunt beeldanalyse uitvoeren om ervoor te zorgen dat de kolonies zijn afgeleid van afzonderlijke cellen.
  11. Ga na beeldanalyse door met het incuberen van de platen voor nog eens 2-3 weken om de klonale populaties uit te breiden voor verdere analyse en karakterisering.

Bewerkte klonen karakteriseren

U kunt de eencellige klonen analyseren op zuiverheid en het gewenste genotype (homozygoot of heterozygoot allel) door verschillende moleculair-biologische methoden zoals genotypering van PCR, qPCR, next-generation sequencing of western blotting.


Voorkeuren

Afdeling Cel- en Ontwikkelingsbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Biogeneeskunde, Röntgenstrasse 20, Münster, 48149, Duitsland

Dong Wook Han, Boris Greber, Guangming Wu, Natalia Tapia, Marcos J. Araúzo-Bravo, Christof Bernemann, Martin Stehling & Hans R. Schöler

Centrum voor Stamcelonderzoek, Instituut voor Biomedische Wetenschappen en Technologie, Konkuk University, Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seoul, 143-701, Republiek Korea

Afdeling Neurowetenschappen, School of Medicine, Konkuk University, Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seoul, 143-701, Republiek Korea

Universiteit van Münster, Medische Faculteit, Domagkstrasse 3, Münster, 48149, Duitsland


Eencellige transcriptomische analyse van antivirale responsen en viraal antagonisme in met Chikungunya-virus geïnfecteerde synoviale fibroblasten

In de afgelopen jaren hebben (opnieuw) opkomende arbovirussen, waaronder het Chikungunya-virus (CHIKV) en het Mayaro-virus (MAYV), voor toenemende bezorgdheid gezorgd als gevolg van de uitbreiding van het bereik van insectenvectoren. Er zijn momenteel geen beschermend vaccin of specifieke antivirale strategieën beschikbaar. Langdurige morbiditeit na CHIKV-infectie omvat slopende chronische gewrichtspijn, die gepaard gaat met gezondheids- en economische gevolgen. Hier analyseerden we de vroege cel-intrinsieke respons op CHIKV- en MAYV-infectie in primaire menselijke synoviale fibroblasten. Dit interferon-competente celtype vertegenwoordigt een potentiële bron van polyartralgie veroorzaakt door CHIKV-infectie. Synoviale fibroblasten van gezonde en osteoartritische donoren waren even tolerant voor CHIKV- en MAYV-infectie ex vivo. Met behulp van RNA-seq definieerden we een door CHIKV-infectie geïnduceerd transcriptieprofiel met enkele honderden interferon-gestimuleerde en artralgie-medierende genen opgereguleerd. Type I interferon werd zowel uitgescheiden door geïnfecteerde fibroblasten als beschermend wanneer het exogeen werd toegediend. De secretie van IL-6, die chronische synovitis veroorzaakt, werd echter niet versterkt door infectie. Single-cell RNA-seq en flowcytometrische analyses onthulden een omgekeerde correlatie van activering van aangeboren immuniteit en productieve infectie op het niveau van individuele cellen. Samengevat dienen primaire menselijke synoviale fibroblasten als bonafide ex vivo primair celmodel van CHIKV-infectie en bieden een waardevol platform voor studies van gewrichtsweefsel-geassocieerde aspecten van CHIKV-immunopathogenese.


Conclusies

Het HTF-isolatieprotocol dat hier wordt gepresenteerd, is een eenvoudige, snelle methode om een ​​groot aantal cellen (1,3 × 106 vimentine-positieve fibroblasten) te verkrijgen uit een enkele trabeculectomiebiopsie van 2-3 mm × 1 mm binnen ongeveer. 25 dagen. Ons protocol kan zorgen voor een gemakkelijke instelling van celbanken onder laboratoriumomstandigheden en voor nieuwe oftalmologische drugtests in vitro. Er werd ook aangetoond dat 5% FGF-EMEM een betere keuze is dan 10% DMEM voor snelle vermeerdering van HTF's vóór de voorbereiding van de experimenten. In het geval van de onderzoeken die gericht zijn op het beoordelen van het effect van een getest middel op de proliferatiesnelheid of het vermogen tot collageenproductie van type I, moet 5% FGF-EMEM alleen worden gebruikt voor isolatie van HTF's, en vervolgens moet 10% DMEM worden toegepast voor experimentele opstelling, aangezien 5% FGF-EMEM de celdelingen en het ECM-vormende vermogen van fibroblasten aanzienlijk beïnvloedt.


Fundamentele fibroblastgroeifactor in de aanwezigheid van dexamethason stimuleert kolonievorming, expansie en osteoblastische differentiatie door beenmerg-stromacellen van ratten

Van basale fibroblastgroeifactor (bFGF) is bekend dat het de vorming van endosteaal bot stimuleert in vivo door een mechanisme dat mogelijk wordt gemedieerd via osteoblast-precursorcellen die aanwezig zijn in het beenmerg. In kweken van primaire beenmergcellen met hoge dichtheid en in aanwezigheid van glucocorticoïden stimuleert bFGF de vorming van een botachtige matrix, maar vanwege de dichte aard van deze kweken is het exacte werkingsmechanisme onduidelijk. In een aanpassing van de fibroblastische kolonievormingseenheidstest, waarbij de beenmergcellen worden gekweekt in aanwezigheid van dexamethason, β-glycerofosfaat en ascorbaat, worden gemineraliseerde kolonies gevormd die voortkomen uit enkele mesenchymale voorlopercellen en geïsoleerd van elkaar groeien . Met behulp van dit systeem hebben we het mechanisme kunnen onderzoeken waarmee bFGF de vorming van botachtig weefsel stimuleert in vitro. We hebben aangetoond dat bFGF de vorming van een verkalkte collageenmatrix verhoogt in vitro door (1) het verhogen van het totale aantal gevormde fibroblastische kolonies, (2) het verhogen van het aandeel gedifferentieerde kolonies die collageen synthetiseren en verkalken, en (3) het stimuleren van de proliferatie en collageenaccumulatie van de individuele kolonies. Een maximale toename van het totale en gedifferentieerde aantal kolonies werd waargenomen na slechts 5 dagen blootstelling aan bFGF, maar voortgezette blootstelling aan bFGF bleef de grootte en het collageengehalte van de individuele kolonies verhogen. Rekening houdend met de endostale locatie van nieuw gevormd bot dat wordt gezien na behandeling met bFGF, kunnen deze processen een actieve rol spelen bij dit effect.

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


Aseksuele reproductie

Schimmels planten zich ongeslachtelijk voort door fragmentatie, knopvorming of het produceren van sporen. Fragmenten van hyfen kunnen nieuwe kolonies vormen. Myceliumfragmentatie treedt op wanneer een schimmelmycelium in stukken uiteenvalt, waarbij elke component uitgroeit tot een afzonderlijk mycelium. Somatische cellen in gistvorm knoppen. Tijdens het ontluiken (een soort cytokinese), vormt zich een uitstulping aan de zijkant van de cel, de kern deelt zich mitotisch en de knop maakt zich uiteindelijk los van de moedercel.

De meest voorkomende vorm van ongeslachtelijke voortplanting is door de vorming van ongeslachtelijke sporen, die door slechts één ouder worden geproduceerd (via mitose) en die genetisch identiek zijn aan die ouder. Sporen zorgen ervoor dat schimmels hun verspreiding kunnen uitbreiden en nieuwe omgevingen kunnen koloniseren. Ze kunnen worden losgelaten uit de ouder-thallus, buiten of in een speciale voortplantingszak, een sporangium genaamd.

Afbeelding (PageIndex<1>): Soorten schimmelreproductie: Schimmels kunnen zowel ongeslachtelijke als seksuele voortplantingsstadia gebruiken. Seksuele voortplanting komt vaak voor als reactie op ongunstige omgevingscondities.

Er zijn veel soorten aseksuele sporen. Conidiosporen zijn eencellige of meercellige sporen die direct vanaf de punt of zijkant van de hypha vrijkomen. Andere ongeslachtelijke sporen vinden hun oorsprong in de fragmentatie van een hypha om afzonderlijke cellen te vormen die als sporen vrijkomen. Sommige hiervan hebben een dikke wand rond het fragment. Weer anderen ontluiken de vegetatieve oudercel. Sporangiosporen worden geproduceerd in een sporangium.

Afbeelding (PageIndex<1>): Vrijkomen van sporen uit een sporangium: Deze microfoto met helder veldlicht toont het vrijkomen van sporen van een sporangium aan het einde van een hypha die een sporangiofoor wordt genoemd. Het afgebeelde organisme is een Mucor sp. schimmel: een schimmel die vaak binnenshuis wordt aangetroffen.


Basisprotocol voor pluripotente stamcelcultuur

Stamcelonderzoek is een snel groeiend veld met het potentieel om therapeutische middelen te ontwikkelen om ziekten te behandelen en om de ontwikkeling van ziekten vanaf vroege stadia te bestuderen. De cultuur van menselijke pluripotente stamcellen deelt veel van dezelfde protocollen als de standaard celkweek van zoogdieren. De succesvolle kweek en het onderhoud van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in een ongedifferentieerde staat vereist echter aanvullende overwegingen om ervoor te zorgen dat cellen hun belangrijkste kenmerken van zelfvernieuwing en pluripotentie behouden. Er zijn verschillende basistechnieken nodig voor het kweken van zoogdiercellen, waaronder het ontdooien van bevroren voorraden, het uitplaten van cellen in kweekvaten, het veranderen van media, passage en cryopreservatie. De protocollen in dit document vertegenwoordigen een subset van de standaard operationele procedures die worden gebruikt voor het onderhouden en kweken van stamcellen bij de Massachusetts Human Stem Cell Bank, en zijn grondig getest en geverifieerd.

1. Overwegingen voor stamcelcultuur

Stamcelonderzoek is een snel groeiend veld met het potentieel om therapeutische middelen te ontwikkelen om ziekten te behandelen en om de ontwikkeling van ziekten vanaf vroege stadia te bestuderen. Om deze belofte waar te maken, moeten onderzoekers echter toegang hebben tot gestandaardiseerde protocollen voor de ontwikkeling, het onderhoud en de differentiatie van deze unieke cellen. Dergelijke "best practices" zullen vergelijkingen van verschillende studies mogelijk maken en de verfijning van deze technieken bespoedigen. Dergelijke standaardisatie kan worden aangedreven door bronnen zoals StemBook en door stamcelbanken. Naast de standaardisatie van deze best practices, dienen stamcelbanken ook als waardevolle bronnen van goed geïdentificeerde, op kwaliteit gecontroleerde en gekarakteriseerde cellijnen en helpen ze bij het navigeren door de juridische en IP-kwesties die vaak voorkomen bij het werken met stamcellen.

De protocollen in dit document vertegenwoordigen een subset van de standaard operationele procedures die worden gebruikt voor het onderhouden en kweken van stamcellen bij de Massachusetts Human Stem Cell Bank, en zijn grondig getest en geverifieerd.

1.1. A1 Succesvolle stamcelcultuur

De cultuur van menselijke pluripotente stamcellen deelt veel van dezelfde protocollen als de standaard celkweek van zoogdieren. De succesvolle kweek en het onderhoud van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in een ongedifferentieerde staat vereist echter aanvullende overwegingen om ervoor te zorgen dat cellen hun belangrijkste kenmerken van zelfvernieuwing en pluripotentie behouden.

Een succesvolle hPSC-cultuur vereist de recreatie van de in vivo stamcelmicro-omgeving, of "niche", die groeifactoren, cel-tot-cel interacties en cel-naar-matrix verklevingen omvat. In tegenstelling tot veel celtypen worden hPSC's gekweekt in aggregaten of kolonies, wat helpt bij het creëren van deze niche. Standaardcultuur van hPSC's omvat blootstelling aan media verrijkt met groeifactoren gevonden in foetaal runderserum (FBS) of gedefinieerde serumvervangingen. Bovendien gebruiken standaard hPSC-kweeksystemen ondersteuningscellen zoals een geïnactiveerde muisembryofibroblast (MEF) voedingslaag om de groei te ondersteunen en differentiatie te voorkomen. Deze cellen zorgen voor de nodige intercellulaire interacties, extracellulaire steigers en factoren die een robuuste en stabiele hPSC-cultuuromgeving creëren.

Er zijn verschillende basistechnieken nodig voor het kweken van zoogdiercellen, waaronder het ontdooien van bevroren voorraden, het uitplaten van cellen in kweekvaten, het veranderen van media, passage en cryopreservatie. Passage verwijst naar het verwijderen van cellen uit hun huidige kweekvat en overbrengen naar een of meer nieuwe kweekvaten. Passage is nodig om de schadelijke effecten van overbevolking te verminderen en voor uitbreiding van de cultuur. Protocollen in deze handleiding beschrijven de standaardcultuur van hPSC's. Van deze procedures is aangetoond dat ze betrouwbaar zijn en reproduceerbare experimentele gegevens genereren.

Hoewel de hier beschreven standaardcultuurprotocollen een verscheidenheid aan dierlijke producten gebruiken, vereist elk klinisch gebruik van hPSC's eliminatie van deze producten omdat ze een risico vormen op blootstelling aan retrovirussen en andere pathogenen uit de kweekomgeving. Er zijn veel benaderingen gepubliceerd voor het kweken van hPSC's in een volledig diervrije omgeving, waaronder het gebruik van menselijke fibroblasten en serum, het gebruik van gedefinieerde substraten en vervanging van serum door gedefinieerde groeifactoren.1 - 3

1.2. A2 Kwaliteitscontrole van celculturen

Het is essentieel dat onderzoekers de steriliteit, authenticiteit en genetische stabiliteit van cellijnen die in hun werk worden gebruikt, waarborgen om reproduceerbare en informatieve experimentele gegevens te publiceren en te verstrekken. Na ontvangst van een nieuwe cellijn wordt het ten zeerste aanbevolen dat cellen worden getest op de hieronder beschreven criteria en met regelmatige tussenpozen worden gecontroleerd om deze kenmerken te bevestigen.

1.2.1. Steriliteit van de cellijn

Cellen in continue kweek zijn over het algemeen kwetsbaar voor microbiële besmetting. Bacteriële en schimmelbesmetting kan celdood en uiteindelijk verlies van hele culturen veroorzaken. Menselijke stamcelculturen zijn bijzonder gevoelig omdat ze gewoonlijk worden gekweekt in verrijkte media zonder antibiotica. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat cellen die van een leverancier zijn ontvangen, vóór het eerste gebruik en met regelmatige tussenpozen tijdens routinematige kweek in het laboratorium op microbiële contaminatie worden getest. Aangezien microben overal in de kweekomgeving voorkomen, is een strikte toepassing van aseptische technieken essentieel om kweekbesmetting te voorkomen.

Naast bacteriën en schimmels is mycoplasma een andere veel voorkomende verontreiniging. Deze intracellulaire micro-organismen zijn over het algemeen kleiner dan bacteriën en kunnen de celgroei beïnvloeden, vooral bij hoge besmettingsniveaus. Aanhoudende infecties van cellen kunnen echter leiden tot genetische en fenotypische veranderingen. Veelvoorkomende bronnen van mycoplasma zijn verontreinigde materialen van dierlijke oorsprong zoals serum, trypsine en primaire voedingscelculturen. Het is dus belangrijk om regelmatig te testen op de aanwezigheid van mycoplasma en besmette culturen weg te gooien. Veelgebruikte methoden om mycoplasma te detecteren zijn onder meer enzymatische assays, polymerasekettingreactie (PCR), kweken in selectieve media en DNA-kleuring van testcellen om mycoplasma te visualiseren die in nauwe samenwerking met het celmembraan groeien. Hoewel de minst gevoelige, is DNA-kleuring met 4′6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), een fluorescerende kleurstof die sterk aan DNA bindt, een eenvoudige methode die in de meeste laboratoria kan worden gebruikt om mycoplasma te detecteren. In de handel verkrijgbare kits worden aangeboden door een aantal reagensbedrijven.

Virussen zijn een andere vorm van besmetting. Virussen kunnen de kenmerken van een cellijn in verschillende mate veranderen door meerdere activiteiten. Deze omvatten het gebruik van cellulaire bronnen van de gastheer voor virale replicatie en integratie in het gastheergenoom. Virale infectie kan experimentele gegevens beïnvloeden en kan leiden tot misleidende interpretaties. Bovendien vormen culturen die besmet zijn met door bloed overgedragen virussen die in staat zijn tot menselijke infectie, een ernstig gezondheidsrisico. Veelvoorkomende bronnen van virale besmetting zijn onder meer dierlijke producten en preparaten zoals runderserum, antilichamen en embryonale fibroblasten van muizen.6, 7 Hoewel er regelmatig tests op virale besmetting worden uitgevoerd door stamcelbanken en opslagplaatsen, is dit testen niet gebruikelijk voor individuele patiënten. onderzoekslaboratoria. Het wordt aanbevolen dat laboratoria cellen testen op virale infectie voordat ze worden verspreid en dat ontvangende laboratoria documentatie van deze tests opvragen. Verschillende bedrijven bieden een breed scala aan virale testdiensten. Hun tarieven zijn afhankelijk van de omvang en het soort tests dat wordt uitgevoerd.

1.2.2. Cellijn authenticiteit

Cellen in kweek lopen een hoog risico op kruisbesmetting, aangezien de meeste laboratoria routinematig meerdere cellijnen tegelijk kweken. Studies hebben aangetoond dat tot 30% van de cellijnen die aan openbare opslagplaatsen worden geschonken, besmet zijn met snelgroeiende celtypen7,8 zoals het geval was met HeLa-cellen, die de oorspronkelijke cellijnen kunnen ontgroeien en vervangen. Deze kruisbesmetting kan subtieler zijn en leiden tot onjuiste gegevens en misleidende conclusies. Dit is van bijzonder belang in gereguleerde omgevingen waar authenticiteit of identiteit een belangrijk onderdeel is van kwaliteitscontrolesystemen voor klinische toepassingen.

Authenticatie van cellijnen die van externe bronnen zijn verkregen voordat ze in experimenten worden gebruikt, is essentieel en kan worden bereikt door de unieke kenmerken van ontvangen cellijnen te vergelijken met die van het oorspronkelijke isolaat. Verschillende benaderingen gebruikt om cellijnen te authenticeren. Genotypering maakt gebruik van de kleine genetische variaties tussen individuele cellijnen. Current DNA typing employs PCR-based techniques to analyze similar hypervariable satellite DNA sequences and single nucleotide polymorphisms. Multiple companies offer genotyping services for a small fee.

1.2.3. Cell line stability

Cells grown in culture have a tendency to accumulate genetic and/or phenotypic changes. Studies have shown that long-term culture of hPSCs result in genetic abnormalities including changes at the chromosomal level, which can be detected by karyotyping methods. The karyotypes of human pluripotent stem cell cultures should be frequently tested by a certified cytogenetics laboratory.

Multiple techniques are used to ensure that pluripotent stem cell lines retain their stem cell phenotype, and include expression of stem cell markers, both molecularly and as expressed intracellular or surface markers and the ability to form the three embryonic germ layers. It is highly recommended that several methods be used to monitor cell line stability. Teratoma formation, embryoid body formation, RT-PCR, immunocytochemistry staining and flow cytometry are some of the more common methods employed. While many of these methods are common laboratory techniques it is wise to consider periodic secondary testing through an independent laboratory or core facility when confirmation is required.

As previously stated, the protocols presented here have been thoroughly tested and verified. However, as stem cell research continues to evolve, new practices and protocols are emerging. For example, while feeder-free culture was once a new technology, there are now many standardized feeder-free protocols that can be found. As new techniques arise for more efficient and effective hPSC culture, they certainly should be evaluated and can be adopted after rigorous testing and standardization.

2. B Reagent preparation

Several reagents must be prepared prior to maintaining human pluripotent stem cells (hPSCs) in culture. It is important to have a firm grasp of the characteristics of each reagent, including components, appropriate preparation, storage and shelf life. This chapter details the preparation of the following reagents necessary for hPSC culture:

Inactivated MEF Medium

Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Solution

hPSC Pluripotent Culture Medium

Many reagents, especially Knockout Serum Replacer (KOSR), bFGF, and collagenase can have significant variation between lots. When working with a new lot, it is important to compare it directly to the lot that is currently in use, to ensure that the current culture quality and viability are maintained.


Bekijk de video: Metode Isolasi Mikroba Bakteri dan Jamur (Januari- 2022).