Informatie

Het eerste polymerase


Wetende dat polymerase-eiwit nodig is voor de transcriptie van genen, welk polymerase wordt dan gebruikt bij de transcriptie van polymerase-eiwit zelf?


In eukaryoten zijn RNA-polymerase II. In bacteriën is het de normale RNA-polymerase. Hoewel het waar is dat polymerasen nu nodig zijn voor transcriptie van meer polymerasen, is dit mechanisme misschien niet altijd aanwezig geweest. In de RNA-wereldhypothese codeerde RNA voor eiwitten en niet voor DNA, dus met de opkomst van DNA kunnen zich ook RNA-polymerasen hebben gevormd. Om eiwitten uit RNA te produceren, gebruiken organismen complexen die ribosomen worden genoemd, dit zijn ribozymen (RNA-enzymen), die vele evolutierondes hebben ondergaan van originele ribosomen, dus er was geen probleem met de productie van eiwitten uit RNA en in de loop van de evolutie, polymerasen werden toen ontwikkeld, maar ze waren alleen nodig met de opkomst van DNA.


Geschiedenis van de polymerasekettingreactie

De geschiedenis van de polymerasekettingreactie (PCR) is op verschillende manieren beschreven als een klassieke "Eureka!" moment, [1] of als voorbeeld van coöperatief teamwerk tussen verschillende onderzoekers. [2] Hieronder volgt een lijst van gebeurtenissen voor, tijdens en na de ontwikkeling ervan:


MtDNA-replicatie, onderhoud en nucleoïde organisatie

Mara Doimo, . Sjoerd Wanrooij, in Het menselijk mitochondriaal genoom, 2020

1.2.3 Verlenging van mtDNA-replicatie

Na priming van mtDNA-synthese, wordt verlenging van de replicatieprimer gekatalyseerd door de nucleair gecodeerde POL γ, de eerste polymerase geïsoleerd uit mitochondria van menselijke HeLa-cellen [71]. POL γ heeft de hulp nodig van de mtDNA-helicase Twinkle en mtSSB om mtDNA in menselijke cellen te repliceren. Samen vormen POL γ, Twinkle en mtSSB het minimale mtDNA-replisoom (Fig. 1.3) en zijn essentieel voor de reconstitutie van mitochondriale replicatie in vitro [72].

Figuur 1.3 . De kern mitochondriaal DNA (mtDNA) replicatievork eiwitten.

De TWINKLE-helicase (blauw) beweegt in een richting van 5 'naar 3' terwijl dsDNA wordt afgewikkeld. Het mtSSB-eiwit (donkergroen) stabiliseert de enkelstrengs conformatie van DNA en stimuleert de DNA-synthese door POLγ (rood (A) en grijs (B)). POLRMT (licht groen) synthetiseert de RNA-primer (gele lijn) nodig voor de synthese van achterblijvende streng-DNA.

1.2.3.1 De mitochondriale DNA-polymerase POL γ

POL γ werd voor het eerst beschreven als een RNA-afhankelijk DNA-polymerase [73]. Het holo-enzym bestaat uit een POL A-katalytische subeenheid van 140 kDa en twee POL B-accessoire-subeenheden van 55 kDa [74–76]. De katalytische subeenheid bezit DNA-polymerase en 3'-5'-exonuclease-activiteiten naast 5'-deoxyribosefosfaatlyase-activiteit [77,78]. Over het algemeen functioneert de intrinsieke exonuclease-activiteit van POL γ als een proefleesmechanisme tijdens replicatie, wat de betrouwbaarheid van het polymerase garandeert door hoge nucleotideselectiviteit en langzame verlenging van mismatches [79]. POL γ kan schakelen tussen polymerase- en exonuclease-activiteiten zonder te dissociëren van de DNA-matrijs, omdat het het ontluikende DNA van de polymeraseplaats naar de exonucleaseplaats en terug kan overbrengen via een mechanisme van intramoleculaire strengoverdracht [80]. Met een foutenpercentage van minder dan 1 × 10 −6 per nucleotide is POL γ een van de meest nauwkeurige polymerasen [79].

De accessoire subeenheid POL B is ook bekend als de processiviteitsfactor omdat het de processiviteit van POL γA verhoogt door de DNA-bindingsaffiniteit te verhogen. Bovendien stimuleert POL B zowel de exonuclease- als de polymerase-activiteiten en kan het ook de binding en opname van nucleotiden verbeteren, waardoor de polymerisatiesnelheid van het holo-enzym [81,82] wordt verhoogd. In oplossing vormen dimeren van POL B een heterotrimeer met de katalytische subeenheid POL γA door de sterke binding van het POL B-dimeer aan het POL γA-monomeer [75]. Elke POL B-eenheid in het holo-enzym heeft een specifieke functie: het monomeer proximaal van POL γA in het holo-enzym verhoogt de interactie met DNA, terwijl het distale POL B-monomeer verantwoordelijk is voor het verhogen van de reactiesnelheid [83]. Modellering van POL -binding aan DNA suggereert dat POL A ongeveer 10 bp template-DNA bindt en dat interactie met POL B de voetafdruk van POL γA op het DNA verhoogt tot 25 bp. Hoewel POL B dsDNA-bindende activiteit [84] heeft, heeft het geen interactie met het primer-template-DNA [85]. Hoewel het niet essentieel is voor de stimulatie van POL A, is de dsDNA-bindende activiteit van POL B vereist voor de functie van het mtDNA-replisoom op een dsDNA-sjabloon door coördinatie van POL γ en Twinkle bij de replicatievork [86].

1.2.3.2 De mitochondriale DNA-helicase Twinkle

Twinkle (T7 gp4-achtig eiwit met intramitochondriale nucleoïde lokalisatie) is de nucleair gecodeerde mitochondriale replicatieve helicase. Het deelt structurele gelijkenis met faag T7 primase/helicase en colokaliseert met mtDNA in nucleoproteïnecomplexen [87]. Twinkle is vereist voor het afwikkelen van het dubbelstrengs DNA-sjabloon vóór POL γ dat alleen ssDNA als sjabloon kan gebruiken [72]. Het is een NTP-afhankelijke DNA-helicase die DNA in een 5'3'-oriëntatie afwikkelt en een vorkachtige structuur nodig heeft met een enkelstrengs 5'-DNA-laadplaats en een korte 3'-staart om het afwikkelen te initiëren [88] . De helicase-activiteit van Twinkle wordt aanzienlijk gestimuleerd door mtSSB [88] , maar het kan alleen langere dsDNA-strekkingen afwikkelen in aanwezigheid van POL γ [72] . Eerdere rapporten suggereerden dat Twinkle hexameer is [87,89] , terwijl recentere analyse door elektronenmicroscopie bewijs onthulde van zowel hexamere als heptamere vormen [90,91] .

1.2.3.3 Het mitochondriale enkelstrengs DNA-bindende eiwit

Humaan mtSSB is een eiwit van 15 kDa dat sequentieovereenkomst deelt met Escherichia coli SSB [92] , en vormt een tetrameer dat 59 nt ssDNA [93] bindt. Enkelstrengs DNA wikkelt zich eenmaal rond het mtSSB-tetrameer [94,95]. MtSSB stimuleert zowel POL γ-polymerase-activiteit als Twinkle-helicase-activiteit [88,96,97]. Er is gesuggereerd dat het stimulerende effect op POL γ-polymerase-activiteit optreedt zonder enige directe interactie tussen de eiwitten, door het vermogen van mtSSB om de ssDNA-template te organiseren en eventuele secundaire DNA-structuren te verwijderen [98]. Studies over Drosophila mtSSB toonde aan dat mtSSB toeneemt Drosophila POL γ-synthese voornamelijk door de herkenning en binding van primers te verhogen en, als resultaat, de snelheid van initiatie van DNA-synthese [99.100] te verhogen. Naast het stimuleren van POL γ-polymerase-activiteit, Drosophila mtSSB kan zelfs de exonuclease-activiteit van POL γ [101] stimuleren.

1.2.3.4 Het mitochondriale DNA-replisome

In biochemische testen is POL γ alleen niet in staat dsDNA als sjabloon te gebruiken, maar de toevoeging van Twinkle verbetert de polymerisatie door POL γ op een geprimede minicirkelsjabloon dramatisch en maakt de synthese van uitgebreide stukken DNA in een rollende cirkelreplicatiemodus mogelijk [ 72] . De Twinkle-POL -interactie stelt Twinkle ook in staat om langere stukken dsDNA af te wikkelen, hoewel de eiwitten geen stabiel complex lijken te vormen [72]. De toevoeging van mtSSB verbetert de DNA-synthese verder, waardoor de vorming van DNA-producten tot genoomlengte [72] mogelijk is. Concluderend vormen de mtDNA-polymerase POL γ samen met Twinkle en mtSSB de kernmachinerie die nodig is om het mtDNA in menselijke cellen te repliceren. Het belang van deze eiwitten voor mtDNA-onderhoud in vivo wordt onderstreept door het feit dat defecten in deze kerncomponenten van het mtDNA-replisoom leiden tot mtDNA-instabiliteit en mitochondriale ziekte [87,102-106].


Transcriptieproces

Transcriptie begint met de binding van het RNAP-enzym aan een specifiek deel van het DNA, ook wel het promotorgebied genoemd. Deze binding vereist de aanwezigheid van een paar andere eiwitten - de sigmafactor in prokaryoten en verschillende transcriptiefactoren in eukaryoten. Eén set eiwitten, algemene transcriptiefactoren genaamd, is nodig voor alle eukaryote transcriptionele activiteit en omvat transcriptie-initiatiefactor II A, II B, II D, II E, II F en II H. Deze worden aangevuld met specifieke signaalmoleculen die genexpressie moduleren door middel van stroomopwaarts gelegen stukken niet-coderend DNA. Vaak wordt de initiatie meerdere keren afgebroken voordat een stuk van tien nucleotiden is gepolymeriseerd. Hierna gaat het polymerase voorbij de promotor en verliest het de meeste initiatiefactoren.

Dit wordt gevolgd door het afwikkelen van dubbelstrengs DNA, ook bekend als ‘melting’, om een ​​soort luchtbel te vormen waar actieve transcriptie plaatsvindt. Deze 'bubbel'8217 lijkt langs de DNA-streng te bewegen terwijl het RNA-polymeer langer wordt. Zodra de transcriptie is voltooid, wordt het proces beëindigd en wordt de RNA-streng verwerkt. Prokaryote RNAP en eukaryote RNA-polymerasen I en II vereisen extra transcriptieterminatie-eiwitten. RNAP III beëindigt de transcriptie wanneer er een stuk Thymine-basen is op de niet-matrijsstreng van DNA.


7.1: Overzicht polymerasekettingreactie

  • Bijgedragen door Clare M. O&rsquoConnor
  • Emeritus universitair hoofddocent (biologie) aan het Boston College

De polymerasekettingreactie (PCR) zorgde voor een revolutie in de moleculaire biologie. Met PCR hadden onderzoekers een hulpmiddel om DNA-sequenties van belang te amplificeren van extreem kleine hoeveelheden
van een DNA-sjabloon. In een typische PCR-reactie kunnen inderdaad miljarden kopieën worden gesynthetiseerd uit een enkel DNA-molecuul. De ontwikkeling van PCR kwam voort uit onderzoek naar DNA-polymerasen en de ontdekking van thermostabiele DNA-polymerasen die bestand zijn tegen langdurige hittebehandelingen die de meeste eiwitten denatureren (Sakai et al., 1988). Tegenwoordig is PCR een standaardtechniek die veel wordt gebruikt om DNA-moleculen te analyseren en om nieuwe recombinante moleculen te construeren.

Thermostabiele DNA-polymerasen staan ​​centraal in PCR. De eerste beschrijving van gebruikte PCR
een DNA-polymerase van E coli, die gedenatureerd was en moest worden vervangen na elke ronde van
DNA-synthese (Sakai et al., 1985). De procedure werd sterk verbeterd door het vervangen van de e.
coli
polymerase met een DNA-polymerase van Thermus aquaticus, een bacterie die gedijt
in thermale bronnen in Yellowstone National Park. De T. aquaticus DNA-polymerase, of Taqpolymerase, functioneert het beste bij temperaturen van 70-75 ̊C en is bestand tegen langdurige (maar niet onbeperkte) incubatie bij temperaturen boven 90 ̊C zonder denaturatie. Binnen een paar jaar is deTaq polymerase was gekloond en tot overexpressie gebracht in E coli, waardoor de beschikbaarheid aanzienlijk wordt uitgebreid. Tegenwoordig is de selectie van polymerasen die beschikbaar zijn voor PCR dramatisch toegenomen, aangezien nieuwe DNA-polymerasen zijn geïdentificeerd in andere thermofiele organismen en genetische modificaties zijn geïntroduceerd in Taq polymerase om zijn eigenschappen te verbeteren.

PCR omvat meerdere ronden van DNA-synthese van beide uiteinden van het DNA-segment dat wordt geamplificeerd. Bedenk wat er gebeurt tijdens DNA-synthese: een enkelstrengs oligonucleotide-primer bindt aan een complementaire sequentie in DNA. Deze dubbelstrengige regio biedt:
een anker voor DNA-polymerase, dat de primer verlengt, ALTIJDreizen in de richting 5&rsquo naar 3&rsquo. Onderzoekers controleren de startplaatsen voor DNA-replicatie door oligonucleotiden te leveren die als primers voor de reactie dienen (hieronder weergegeven voor Je favoriete gen Yfg). Om PCR-primers te ontwerpen, hebben onderzoekers nauwkeurige sequentie-informatie nodig voor de primerbindingsplaatsen in het doel-DNA. (Opmerking: sequentie-informatie is niet nodig voor de volledige sequentie die zal worden geamplificeerd. PCR wordt vaak gebruikt om sequenties te identificeren die voorkomen tussen twee bekende primerbindingsplaatsen.) Er zijn twee primers vereist voor PCR. Eén primer bindt aan elke streng van de DNA-helix.

PCR begint met een denaturatieperiode van enkele minuten, waarin het reactiemengsel wordt geïncubeerd bij een temperatuur die hoog genoeg is om de waterstofbruggen te verbreken die de twee strengen van de DNA-helix bij elkaar houden. Effectieve denaturatie is van cruciaal belang, omdat DNA-polymerase enkelstrengs DNA als sjabloon vereist. Het initiële denaturatiesegment is langer dan de daaropvolgende denaturatiestappen, omdat biologische templates voor PCR, zoals genomisch DNA, vaak lange, complexe moleculen zijn die bij elkaar worden gehouden door vele waterstofbruggen. In volgende PCR-cycli worden de (kortere) producten van eerdere cycli de overheersende sjablonen.

Na de initiële denaturatie omvat PCR een reeks van 30-35 cycli met drie segmenten, uitgevoerd bij verschillende temperaturen. PCR-reacties worden geïncubeerd in thermocyclers die de temperatuur van een metalen reactieblok snel aanpassen. Een typische cyclus omvat:

  • een denaturatiestap - gewoonlijk 94 ̊C
  • een primer-gloeistap - gewoonlijk 55 ̊C
  • een uitbreidingsstap - gewoonlijk 72 ̊C

PCR-reacties omvatten meerdere cycli van denaturatie, annealing en verlenging.

de primersequentie. DNA-polymerasen worden actiever bij de verlengingstemperatuur, die dichter bij hun optimale temperatuur ligt. Onderzoekers passen de temperaturen en timing van de bovenstaande stappen aan om rekening te houden met verschillende primers, sjablonen en DNA-polymerasen.

PCR-producten van de beoogde grootte accumuleren exponentieel

PCR is inderdaad een kettingreactie, aangezien de DNA-sequentie van belang ruwweg verdubbelt
met elke cyclus. In tien cycli wordt een sequentie geamplificeerd

1000-voudig (2 10 = 1024). In twintig cycli wordt een sequentie geamplificeerd

miljoenvoudig. In dertig cycli kan een sequentie theoretisch worden geamplificeerd

miljard keer. PCR-reacties in het laboratorium omvatten doorgaans 30-35 cycli van denaturatie, annealing en verlenging. Om PCR te begrijpen, is het belangrijk om je te concentreren op de eerste paar cycli. PCR-producten van de beoogde grootte verschijnen eerst in de tweede cyclus. Exponentiële amplificatie van het beoogde PCR-product begint in de derde cyclus.

Tijdens de eerste cyclus synthetiseren de thermostabiele DNA-polymerasen DNA, waardoor de 3&rsquo-uiteinden van de primers worden verlengd. DNA-polymerasen zijn processieve enzymen die door zullen gaan met het synthetiseren van DNA totdat ze letterlijk van het DNA vallen. Dientengevolge hebben de complementaire DNA-moleculen die in de eerste cyclus worden gesynthetiseerd, een grote verscheidenheid aan lengtes. Elk van de producten heeft echter een gedefinieerde startpositie, aangezien het begint met de primersequentie. Deze "verankerde" sequenties zullen sjablonen worden voor DNA-synthese in de volgende cyclus, wanneer PCR-producten van de beoogde lengte voor het eerst verschijnen. Het startsjabloon voor PCR zal in elke volgende PCR-cyclus worden gekopieerd, wat bij elke cyclus twee nieuwe "verankerde" producten oplevert. Omdat de lengtes van de "verankerde" producten echter nogal variabel zijn, zullen ze niet detecteerbaar zijn in de eindproducten van de PCR-reactie.

DNA-strengen van de beoogde lengte verschijnen voor het eerst tijdens de tweede cyclus. Replicatie van de "verankerde" fragmenten genereert PCR-producten van de beoogde lengte. Het aantal van deze fragmenten met een gedefinieerde lengte zal in elke nieuwe cyclus verdubbelen en snel het overheersende product in de reactie worden.

De meeste PCR-protocollen omvatten 30-35 cycli van amplificatie. In de laatste paar cycli stapelen de gewenste PCR-producten zich om verschillende redenen niet meer exponentieel op. Zoals bij elke enzymatische reactie, zijn PCR-substraten uitgeput en beginnen de herhaalde incubatieronden bij 94 ° 778C te denatureren Taq polymerase.

Primer-gloeien is van cruciaal belang voor de specificiteit in PCR

Een goed primerontwerp is van cruciaal belang voor het succes van PCR. PCR werkt het beste wanneer de primers zeer specifiek zijn voor de doelsequentie in het matrijs-DNA. Mispriming treedt op wanneer primers binden aan sequenties die slechts gedeeltelijk complementair zijn, waardoor DNA-polymerase de verkeerde DNA-sequenties kopieert. Gelukkig zijn onderzoekers meestal in staat om experimentele parameters aan te passen om de kans te maximaliseren dat primers zullen hybridiseren met de juiste doelwitten.

PCR-primers zijn typisch synthetische oligonucleotiden tussen 18 en 25 basen lang. Bij het ontwerpen van een primer houden onderzoekers rekening met de Tm, de temperatuur waarbij de helft van de hybriden gevormd tussen de primer en de template zal smelten. In het algemeen neemt de thermische stabiliteit van een hybride toe met de lengte van de primer en zijn GC-gehalte. (Bedenk dat een GC-basenpaar wordt gestabiliseerd door drie H-bindingen, vergeleken met twee voor een AT-paar.) De volgende formule geeft een ruwe schatting van de Tm van oligonucleotide-hybriden. In deze formule is N verwijst naar het aantal nucleotiden en de concentratie van eenwaardige kationen wordt uitgedrukt in molaire (M) eenheden.


Toepassingen van PCR

Menselijke gezondheid en het menselijk genoomproject

PCR is een essentieel hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de menselijke gezondheid en het leven te verbeteren. In de medische wetenschap wordt PCR gebruikt voor de detectie van infectieuze organismen en de detectie van mutaties in verschillende genen. In het geval van de detectie van ziekten zoals aids, kan PCR worden gebruikt om het virus-DNA rechtstreeks te bestuderen en is het specifieker dan de gestandaardiseerde detectie door ELISA. Bovendien heeft PCR een groot potentieel bij de toepassing van detectie van ziekten zoals de ziekte van Lyme, waar het de aanwezigheid van bacterieel DNA bij gezamenlijke behandeling direct kan identificeren. PCR wordt ook gebruikt voor de detectie van Helicobacterium pylori en seksueel overdraagbare virusziekten. Het menselijk genoomproject verwijst naar de studie van alle menselijke genen. PCR speelt een belangrijke rol in dit project omdat het helpt bij het identificeren van specifieke genen, samen met mutaties en snelheden van mutaties in die genen.

Genetische vingerafdrukken

Dit is een techniek die in de forensische wetenschap wordt gebruikt om het DNA van een persoon te vergelijken met een bepaald monster, zoals een bloedmonster dat op een plaats delict is gevonden. Het monster kan een zeer kleine hoeveelheid DNA bevatten. De toepassing van PCR komt op dit punt om de kleine hoeveelheid DNA uit monsters zoals bloed, sperma, speeksel, haar, enz. te amplificeren. De geamplificeerde DNA-fragmenten worden vervolgens verder geanalyseerd door gelelektroforese.

Detectie van erfelijke ziekte

Het is moeilijk om erfelijke ziekten te begrijpen vanwege de directe verbinding met het genoom. Dit complexe en moeilijke proces kan eenvoudig worden geanalyseerd met behulp van PCR. De PCR kan het DNA amplificeren en door een specifieke marker te gebruiken, kan het specifieke gen worden gedetecteerd dat verantwoordelijk is voor de ziekte. Afgezien daarvan kan ook de mutatiesnelheid in dat specifieke gen worden geanalyseerd met behulp van PCR.

Het klonen van genen heeft verschillende toepassingen op zowel industriële als laboratoriumschaal en PCR kan worden gebruikt voor specifieke genklonering. Wanneer een bepaald gen van belang moet worden gekloond, wordt PCR gebruikt om het gen te amplificeren. Het wordt vervolgens in een vector ingevoegd en de vector wordt vervolgens het gen verder in een cel getransporteerd. Daarom is PCR vereist om de genkloneringsstudies te voltooien.

Analyse van oud DNA

PCR kan worden gebruikt bij de analyse van oud DNA. Het DNA dat is geïsoleerd uit Egyptische mummies kan bijvoorbeeld worden geamplificeerd in PCR voor verder onderzoek en identificatie van de persoon. Het gen kan worden gebruikt om te vergelijken met het gen van de afgelopen tijd en de evolutionaire analyse kan ook worden uitgevoerd.


Structuur van DNA-polymerase ζ: de ontsnappingsrijder vastleggen

Tijdens translesiesynthese voert eukaryotisch DNA-polymerase verlenging uit van een breed scala aan DNA-laesies. Opheldering van de cryo-EM-structuur van polymerase ζ onthult hoe het enzym de synthese van DNA-strengen buiten de laesie katalyseert.

Translesiesynthese (TLS) is een meestal foutgevoelige route die door cellen wordt gebruikt om DNA-schade te omzeilen die normale DNA-replicatie blokkeert 1,2,3,4,5,6. Tijdens TLS wordt het vastgelopen replicatieve DNA-polymerase vervangen door een of meer gespecialiseerde TLS-polymerasen, die replicatie door de DNA-laesie uitvoeren. In veel gevallen vereist TLS twee gespecialiseerde polymerasen: een 'inserter', om een ​​nucleotide op te nemen tegenover de DNA-laesie, en een 'extender', om verdere DNA-strengsynthese te katalyseren. De primaire 'extender'-polymerase in eukaryoten is DNA-polymerase (Pol) ζ 7 . Hoewel dit enzym bijna vijfentwintig jaar geleden voor het eerst werd gezuiverd 8 , zijn structurele studies niet succesvol geweest, gedeeltelijk vanwege het onvermogen om voldoende hoeveelheden van het eiwit te verkrijgen voor röntgenkristallografie. Nu, Malik et al. 9 rapporteer een cryo-EM-structuur van Pol ζ uit Saccharomyces cerevisiae en beschrijf de structurele kenmerken waarmee het de uitbreidingsstap van TLS kan katalyseren.


RNA-polymerasefunctie

RNA-polymerase is het belangrijkste enzym in het transcriptieproces. Onthoud dat transcriptie het proces is waarbij het dubbelstrengs DNA wordt gekopieerd naar een enkele RNA-streng. Ze zien er misschien iets anders uit, maar ze zijn allebei geschreven in de taal van nucleotiden. Om ervoor te zorgen dat RNA-polymerase zijn werk kan beginnen, moet het eerst een geschikte promotor regio. Deze regio kan worden getarget door: transcriptiefactoren bij eukaryoten. Deze eiwitten binden aan de plaats, waardoor een geschikte opstelling ontstaat voor RNA-polymerase om te binden en transcriptie te starten. In bacteriën is er maar één promotor, de sigma-initiatiefactor. Dit proces kan worden gezien met het gegeneraliseerde RNA-polymerisatiemolecuul dat hieronder wordt weergegeven bij het transcriberen van DNA. De transcriptiefactoren worden niet getoond.

Als RNA-polymerase aan het DNA bindt, verandert het conformatie, of vorm. Dit start de enzymatische kettingreactie die een nieuwe keten van nucleotiden laat groeien tot een RNA-molecuul op basis van de gepresenteerde sjabloon. Nadat RNA-polymerase dit nieuwe molecuul heeft gemaakt, moet het RNA worden verwerkt en vrijgegeven uit de kern. Nu gebeld boodschapper RNA, of mRNA, zal het een ribosoom tegenkomen dat de juiste mechanismen heeft voor het proces van vertaling.

Net zoals het vertalen van Engels naar Spaans, moet het ribosoom de volgorde van het RNA "lezen" en de boodschap omzetten in de taal van aminozuren. Deze kleine moleculen vormen lange ketens, die zich in ingewikkelde vormen vouwen om biochemisch actieve eiwitten te worden. Deze eiwitten creëren en onderhouden op hun beurt delen van het DNA en repliceren het DNA. Delen van het DNA slaan de genetische informatie op voor het RNA-polymerase-eiwit zelf, dat eerst wordt gedecodeerd door een RNA-polymerasemolecuul. Deze situatie is eigenlijk de basis van de kip en het ei als je erover nadenkt.


Voltooiingsfase van replicatie: DNA-polymerase I

Zodra DNA-polymerase III de meerderheid van complementaire D-nucleotiden op de zich ontwikkelende leidende en achterblijvende streng koppelt, zijn de RNA-primers nog steeds aanwezig. Een ander DNA-polymerase-enzym, DNA-polymerase I leest zowel de leidende als de achterblijvende strengen van 5' naar 3' van de ouderstrengen en vervangt de R-nucleotiden door D-nucleotiden. Terwijl de leidende streng continu wordt gesynthetiseerd, is er nog steeds een RNA-primer aan de oorsprong van de replicatiebel. Het wordt ook vervangen door DNA-polymerase I.

Voltooiingsfase van replicatie: ligase

Nadat DNA Polymerase I de RNA-primers heeft vervangen, is er geen fosfodiesterbinding tussen Okazaki-fragmenten. Een ander enzym, ligase, reist langs de achterblijvende streng en creëert een fosfodiesterkoppeling die de Okazaki-fragmenten verbindt.

Ligase bindt Okazaki-fragmenten aan elkaar.

Voltooiingsfase van replicatie: telomerase

In prokaryoten, zodra ligase klaar is met het verbinden van de Okazaki-fragmenten, is het DNA met succes gerepliceerd. Dit komt door de ronde vorm van hun DNA. Eukaryoot DNA is echter lineair. In de lagging strand vormt dit een probleem. Aan het einde van de chromosomen, bekend als de telomeren, kan het DNA-polymerase III nergens worden aangesloten vanwege de afwezigheid van een RNA-primer. Als deze D-nucleotiden bij de telomeren niet gesynthetiseerd zouden blijven, zouden de DNA-strengen uiteindelijk bij elke replicatie korter worden. Men denkt dat veroudering een product is van slecht functionerende telomerase.

Telomerase verlengt de uiteinden (telomeren) van de lagging strand.

Telomerase is een enzym dat zich hecht aan het niet-gesynthetiseerde uiteinde van de achterblijvende streng en de synthese van DNA katalyseert vanuit zijn eigen RNA-sjabloon, vergelijkbaar met reverse engineering. Aan het ene uiteinde van de telomerase combineren een paar R-nucleotiden zich met het uiteinde van de niet-gerepliceerde streng. Telomerase voegt vervolgens D-nucleotiden toe aan het einde van de achterblijvende streng.

De tegenovergestelde uiteinden van telomerase zijn identiek. De andere kant van de telomerase (als je van links naar rechts leest) eindigt met dezelfde R-nucleotiden (AUU). Telomerase gebruikt dit fenomeen om los te maken zodra de achterblijvende streng is verlengd en vervolgens weer vast te maken aan het einde van de verlengde achterblijvende streng. De opnieuw bevestigde telomerase repliceert een andere exacte kopie naar de achterblijvende streng. Dit proces gebeurt meerdere keren en de telomerase wordt uiteindelijk verwijderd.

Zodra telomerase de ouderlijke achterblijvende streng verlengt, hecht primase zich aan de synthese van een RNA-primer, waardoor DNA-polymerase III de resterende D-nucleotiden op de niet-gerepliceerde streng kan repliceren. Ligase fuseert het laatst overgebleven segment door de uiteindelijke fosfodiesterbinding te creëren. Dit resulteert in twee exacte kopieën van het originele DNA met iets langere telomeren.

Fouten herstellen

DNA Polymerase III is uiterst nauwkeurig. Een ander DNA-polymerase fungeert als proeflezer, DNA-polymerase II. Zodra de replicatie is voltooid, reist DNA-polymerase II door de hele link van de ouderlijke DNA-strengen op zoek naar niet-overeenkomende basenparen. Zodra het een mismatch detecteert, verwijdert DNA Polymerase II het D-nucleotide van de nieuwe DNA-streng en vervangt het door het D-nucleotide dat complementair is aan de ouderstreng.

Zelfs deze proefleesstap is echter niet helemaal nauwkeurig, het ontbreken van een niet-overeenkomend basenpaar komt ongeveer één op de miljard keer voor. Deze fouten leiden tot mutaties op nucleotideniveau. Dergelijke mutaties zijn de enige manier waarop nieuwe allelen worden gegenereerd en zijn meestal neutraal of schadelijk ten opzichte van fitness. Af en toe zullen deze mutaties gunstige fenotypes creëren, waardoor deze organismen een grotere kans hebben om te overleven en zich voort te planten. Dergelijke mutaties hebben de neiging om in toekomstige generaties te versterken als gevolg van natuurlijke selectie.


Polymerasekettingreactie

Onze redacteuren zullen beoordelen wat je hebt ingediend en bepalen of het artikel moet worden herzien.

Polymerasekettingreactie (PCR), een techniek die wordt gebruikt om snel en nauwkeurig talloze kopieën van een specifiek DNA-segment te maken. De polymerasekettingreactie stelt onderzoekers in staat om de grote hoeveelheden DNA te verkrijgen die nodig zijn voor verschillende experimenten en procedures in de moleculaire biologie, forensische analyse, evolutionaire biologie en medische diagnostiek.

PCR is in 1983 ontwikkeld door Kary B. Mullis, een Amerikaanse biochemicus die in 1993 de Nobelprijs voor Scheikunde won voor zijn uitvinding. Vóór de ontwikkeling van PCR waren de methoden die werden gebruikt om recombinante DNA-fragmenten te amplificeren of te genereren, tijdrovend en arbeidsintensief. Een machine die is ontworpen om PCR-reacties uit te voeren, kan daarentegen vele replicatierondes voltooien en miljarden kopieën van een DNA-fragment produceren in slechts een paar uur.

De PCR-techniek is gebaseerd op de natuurlijke processen die een cel gebruikt om een ​​nieuwe DNA-streng te repliceren. Voor PCR zijn slechts enkele biologische ingrediënten nodig. De integrale component is het matrijs-DNA, d.w.z. het DNA dat het te kopiëren gebied bevat, zoals een gen. Slechts één DNA-molecuul kan als sjabloon dienen. De enige informatie die nodig is om dit fragment te repliceren, is de sequentie van twee korte gebieden van nucleotiden (de subeenheden van DNA) aan beide uiteinden van het gebied van belang. Deze twee korte matrijssequenties moeten bekend zijn zodat twee primers - korte stukken nucleotiden die overeenkomen met de matrijssequenties - kunnen worden gesynthetiseerd. De primers binden of annealen aan de matrijs op hun complementaire plaatsen en dienen als startpunt voor het kopiëren. DNA-synthese bij de ene primer is gericht op de andere, wat resulteert in replicatie van de gewenste tussenliggende sequentie. Er zijn ook vrije nucleotiden nodig die worden gebruikt om de nieuwe DNA-strengen te bouwen en een DNA-polymerase, een enzym dat de opbouw doet door achtereenvolgens vrije nucleotiden toe te voegen volgens de instructies van de sjabloon.

PCR is een proces in drie stappen dat in herhaalde cycli wordt uitgevoerd. De eerste stap is de denaturatie of scheiding van de twee strengen van het DNA-molecuul. Dit wordt bereikt door het uitgangsmateriaal te verhitten tot temperaturen van ongeveer 95 ° C (203 ° F). Elke streng is een sjabloon waarop een nieuwe streng wordt gebouwd. In de tweede stap wordt de temperatuur verlaagd tot ongeveer 55 °C (131 °F) zodat de primers aan de template kunnen hechten. In de derde stap wordt de temperatuur verhoogd tot ongeveer 72 ° C (162 ° F), en het DNA-polymerase begint nucleotiden toe te voegen aan de uiteinden van de geannealde primers. Aan het einde van de cyclus, die ongeveer vijf minuten duurt, wordt de temperatuur verhoogd en begint het proces opnieuw. Het aantal exemplaren verdubbelt na elke cyclus. Gewoonlijk produceren 25 tot 30 cycli een voldoende hoeveelheid DNA.

In de oorspronkelijke PCR-procedure was een probleem dat het DNA-polymerase na elke cyclus moest worden aangevuld omdat het niet stabiel is bij de hoge temperaturen die nodig zijn voor denaturatie. Dit probleem werd in 1987 opgelost met de ontdekking van een hittestabiel DNA-polymerase genaamd Taq, een enzym geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermus aquaticus, die in warmwaterbronnen leeft. Taq polymerase leidde ook tot de uitvinding van de PCR-machine.

Omdat DNA uit een breed scala aan bronnen kan worden geamplificeerd, is de techniek op veel gebieden toegepast. PCR wordt gebruikt om genetische ziekten te diagnosticeren en om lage niveaus van virale infectie te detecteren. In de forensische geneeskunde wordt het gebruikt om minuscule sporen van bloed en andere weefsels te analyseren om de donor te identificeren aan de hand van zijn genetische "vingerafdruk". De techniek is ook gebruikt om DNA-fragmenten te amplificeren die zijn gevonden in geconserveerde weefsels, zoals die van een 40.000 jaar oude bevroren wolharige mammoet of van een 7.500 jaar oude mens gevonden in een veenmoeras.

Dit artikel is voor het laatst herzien en bijgewerkt door Erik Gregersen, Senior Editor.


Wat is de functie van DNA-polymerase?

DNA-replicatie vereist het afwikkelen van de complementaire tweestrengige structuur van DNA. Dit proces wordt gemedieerd door het verbreken van de waterstofbruggen die de basen bij elkaar houden. Het resultaat is de vorming van twee enkele strengen.

Het resulterende Y-vormige uiterlijk in dit DNA-gebied wordt de replicatievork genoemd. De initiatie van replicatie vindt plaats op specifieke plaatsen die de oorsprong van replicatie (ori) worden genoemd. Na de oprichting van de replicatievork is het replisome, verschillende factoren die replicatie mogelijk maken.

DNA-polymerasen zijn zo'n cruciale factor. Het zijn enzymen met meerdere subeenheden die deelnemen aan het proces van DNA-replicatie in de cel. Ze katalyseren de toevoeging van nucleotiden aan bestaande DNA-strengen. Er zijn veel families van DNA-polymerase die een rol spelen bij DNA-replicatie. Er zijn er minstens 15 bij de mens en zijn op verschillende punten tijdens het proces nodig.

Polymerasefunctie tijdens DNA-replicatie

DNA-polymerase-enzymen werken typisch paarsgewijs, elk enzym repliceert een van de twee strengen die de dubbele DNA-helix vormen. Deze worden de leading strand en lagging strand genoemd en worden genoemd naar de relatieve snelheid waarmee ze worden gerepliceerd.

De gerepliceerde strengen worden gesynthetiseerd met behulp van de leidende en achterblijvende strengen als sjablonen. Dientengevolge bestaan ​​de twee nieuwe dubbelstrengs DNA-moleculen die worden geproduceerd uit één streng van de oorspronkelijke helix (ofwel de leidende of achterblijvende streng) en één nieuwe streng. Dit proces wordt semi-conservatieve replicatie genoemd en is essentieel omdat het de overdracht van genetische informatie van generatie op generatie mogelijk maakt.

De activiteiten van beide DNA-polymerasen worden gecoördineerd door twee structuren, de schuifklemlader en de schuifklem. The sliding clamp loader contacts single-stranded binding proteins that coat the separated helix as well as the sliding clamp.

Two sliding clamps encircle the two strands of DNA, and together with accessory proteins called the clamp loader complex, provide a stable binding site for the two DNA polymerases. The unwound single-stranded DNA templates move toward the complex the behavior of the clamp loader on the leading and lagging strand differ because of a property called directionality.

This is determined by the orientation of the phosphate bond and characterized by the conventions 5’ to 3’ and 3’ to 5’. Each of the two strands of the helix necessarily possess opposite directionality this is essential for base pairing to occur. Their pairing is also referred to as antiparallel.

DNA polymerase synthesizes only in a 5′ to 3′ direction. Consequently, the strand with the complementary 3’ to 5’ directionality, the leading strand, is synthesized as one continuous piece. Conversely, the strand with 5’ to 3’ directionality is synthesized as a series of small fragments called Okazaki fragments.

The lagging strand orientation of 5’ to 3’ is incompatible with DNA polymerase to accommodate this requirement, the clamp loader must continually release and reattach at a new location. This requires the lagging strand to bubble out from the replisome.

Polymerases for DNA repair

Several polymerases exist in both prokaryotes and eukaryotes. They provide polymerase activity under two broad categories normal replication and repair. Under conditions of normal replication, DNA polymerase corrects errors by 3′ → 5′ exonuclease activity.

Outside of normal replicative events, DNA repair is an ongoing process that is necessary to maintain the integrity of the genome. Both endogenous and exogenous insults result in damaged DNA for example, single-strand and double-strand breaks, strand cross-linking, base loss, and base modification.

Multiple pathways exist to repair these DNA damage events in a selective manner. These include mismatch repair, nucleotide excision repair, base excision repair, double-strand break repair, and inter-strand cross-link repair. The biochemical difference that exists between these polymerases allows them to fulfill distinct roles under these specific conditions of repair.


Bekijk de video: Nederland Zingt: God heeft het eerste woord (Januari- 2022).