Informatie

Analyse van de resultaten van realtime PCR


Ik wil het niveau van genexpressie evalueren door real-time PCR. Ik heb vijf controles die "klinisch" hetzelfde zijn. Ik berekende de "fold change" van het doelgen met betrekking tot elke controle.

Wat als het resultaat van "fold change" voor mijn doelgen voor elke controle anders is? Ik bedoel, het is omhoog gereguleerd volgens drie van hen en omlaag gereguleerd volgens de andere twee.

Is de interventie bevooroordeeld? Of moet ik rekening houden met het gemiddelde?


Geef meer informatie: fold-change ten opzichte van wat?

Als je deed wat ik denk dat je deed (enkel controlegen waarvan je de vouwverandering van je gen van belang hebt berekend), zou ik zeggen dat dit de verkeerde benadering is. Wat u nodig hebt, is een set genen die vergelijkbare expressieniveaus hebben in al uw monsters (controles en gevallen) om uw gen van belang te kunnen vergelijken met een gemeenschappelijke basislijn. De selectie van dergelijke genen zou de eerste stap in het project moeten zijn, en het kan een goed idee zijn om een ​​van de gevestigde benaderingen te gebruiken - ik raad de GeNorm-methode (link naar de paper) van Jo Vandensompele aan. Het gaat als volgt: uit een panel van potentiële controlegenen selecteert u twee of drie die het meest stabiel tot expressie komen in uw experimentele omstandigheden, en gebruikt u deze twee-drie controlegenen samen met uw gen van belang in een qRT-PCR. Vervolgens normaliseert u het signaal van uw gen naar een gemiddelde van de controlegenen.

Het is herhaaldelijk aangetoond dat het gebruik van één enkel controlegen, zelfs een zogenaamd 'housekeeping-gen', misleidend is, omdat die genen onder bepaalde omstandigheden hun expressieniveau veranderen. Bovendien beschermt het gebruik van meerdere controlegenen u tegen mogelijke problemen als gevolg van ongelijke versterkingsefficiëntie in verschillende monsters/groepen. Als u echter meerdere genen van belang heeft, moeten ze allemaal een vergelijkbare amplificatie-efficiëntie hebben.


U moet waarschijnlijk ook controleren of uw monsters niet besmet zijn met PCR-reactieremmers, wat heel gebruikelijk is als u eerst uw mRNA extraheert, het resterende DNA verteren en vervolgens een PCR uitvoert met een minder dan 10-voudige verdunning. Je hebt minimaal 200 keer verdunning nodig om alle artefacten kwijt te raken.

Nadat u uw monsters hebt verdund, plaatst u herhalingen van opeenvolgende verdunningen van uw target- en baseline-mRNA (200x verdunning, 1000x verdunning, 5000x verdunning). Normaal gesproken ziet u een mooie regelmatige afstand tussen curven op uw rtPCR-plot. Als je dat niet doet, is er iets misgegaan met de reactie.

Meer in het algemeen is rtPCR een behoorlijk lastige ervaring, en als je wilt dat het 100% betrouwbaar is, moet je een bepaald aantal controles uitvoeren. Een goede en uitgebreide richtlijn vind je hier.


Aanname-vrije analyse van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (PCR)-gegevens

Kwantificering van mRNA's met behulp van realtime polymerasekettingreactie (PCR) door de productvorming te volgen met de fluorescerende kleurstof SYBR Green I wordt op grote schaal gebruikt in neurowetenschappen, ontwikkelingsbiologie en medische diagnostiek. De meeste procedures voor PCR-gegevensanalyse gaan ervan uit dat de PCR-efficiëntie voor het betreffende amplicon constant is of zelfs, in het geval van de vergelijkende Ct methode, gelijk aan 2. De laatste methode leidt al tot een 4-voudige fout wanneer de PCR-efficiënties variëren over slechts een bereik van 0,04. PCR-efficiëntie van amplicons wordt gewoonlijk berekend op basis van standaardcurven op basis van bekende RNA-invoer of op verdunningsreeksen van een referentie-cDNA-monster. In dit artikel laten we zien dat de eerste benadering kan leiden tot PCR-efficiënties die variëren over een bereik van 0,2, terwijl de tweede benadering 0,26 kan afwijken. Daarom stellen we lineaire regressie voor op de log (fluorescentie) per cyclusnummergegevens als een aannamevrije methode om startconcentraties van mRNA's en PCR-efficiëntie voor elk monster te berekenen. Een computerprogramma om deze berekening uit te voeren is op aanvraag beschikbaar (e-mail: [email protected] onderwerp: LinRegPCR).


1. Inleiding

De studie van genexpressie in een cel of weefsel op een bepaald moment geeft inzicht in het vermogen van de cel tot eiwitsynthese. Genexpressie-assays, bijvoorbeeld genprofilering, zijn een belangrijk hulpmiddel en worden veel gebruikt in nanotoxiciteitsstudies. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om genexpressie te bepalen, zoals Northern blot-analyse, ribonuclease-beschermingsassay (RPA), seriële analyse van genexpressie (SAGE), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), kwantitatieve realtime polymeraseketen reactie (qRT-PCR), PCR-arrays en microarrays. Van deze technieken blijft Northern-blot-analyse een standaardmethode voor detectie en kwantificering van mRNA-niveaus, ondanks de komst van meer robuuste technieken. Northern-blotting omvat het gebruik van elektroforese om RNA-monsters op grootte te scheiden en vervolgens het mRNA te detecteren met een hybridisatieprobe die complementair is aan een deel van de doelsequentie. RPA is een uiterst gevoelige techniek voor de kwantificering van specifieke RNA's in oplossing. Het kan worden uitgevoerd op totaal cellulair RNA of poly(A)-geselecteerd mRNA als doelwit. De SAGE-methode, evenals PCR-arrays en microarrays, wordt gebruikt om gedeeltelijke of globale genexpressie in cellen of weefsels in verschillende experimentele omstandigheden te bestuderen. In dit hoofdstuk zullen we de methoden beschrijven om genexpressie te bepalen met behulp van RT-PCR en real-time PCR. RT-PCR als een relatief eenvoudig, goedkoop, extreem gevoelig en specifiek hulpmiddel om het expressieniveau van doelgenen te bepalen. Realtime PCR is een kwantitatieve methode voor het bepalen van het aantal kopieën van PCR-templates, zoals DNA of cDNA, en bestaat uit twee typen: op probes en op intercalatoren. Probe-gebaseerde real-time PCR, ook bekend als TaqMan PCR, vereist een paar PCR-primers en een extra fluorogene oligonucleotide-probe met zowel een reporter-fluorescerende kleurstof als een quencher-kleurstof. De op intercalator gebaseerde (SYBR Green)-methode vereist een dubbelstrengs DNA-kleurstof in de PCR die bindt aan nieuw gesynthetiseerd dubbelstrengs DNA en fluorescentie genereert. Voor beide methoden is een speciale thermocycler nodig die is uitgerust met een gevoelige camera die de fluorescentie in elk monster met regelmatige tussenpozen tijdens de PCR bewaakt. De belangrijkste technieken die ten grondslag liggen aan zowel RT-PCR als real-time PCR zijn totale RNA-isolatie, reverse transcriptie (RT) en PCR. Omgekeerde transcriptie omvat de synthese van DNA uit RNA met behulp van een RNA-afhankelijk DNA-polymerase. PCR kan een enkele of enkele kopieën van een stuk DNA over verschillende ordes van grootte amplificeren, waardoor duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaalde DNA-sequentie worden gegenereerd. Hier zullen we gedetailleerde procedures introduceren voor RT-PCR en real-time PCR.


WAT IS PCR?

In de kern maakt real-time PCR-technologie gebruik van conventionele PCR. PCR is een procedure waarmee DNA kan worden gekopieerd en geamplificeerd (40). Zoals getoond in Fig. 2, maakt PCR gebruik van DNA-polymerasen om specifieke stukken DNA te amplificeren met behulp van korte, sequentiespecifieke oligonucleotiden die aan de reactie worden toegevoegd om als primers te werken. De eerste en meest gebruikte van deze enzymen is: Taq DNA-polymerase (van Thermus aquaticus), terwijl Pfu DNA-polymerase (van Pyrococcus furiosus) wordt veel gebruikt vanwege de hogere betrouwbaarheid bij het kopiëren van DNA. Hoewel deze enzymen subtiel verschillen, hebben ze allebei twee basismogelijkheden waardoor ze bruikbaar zijn voor PCR: 1) ze kunnen nieuwe DNA-strengen genereren met behulp van een DNA-sjabloon en primers, en 2) ze zijn hittebestendig. Dit laatste kenmerk is nodig omdat na elke ronde van DNA-kopie het resulterende dubbelstrengs DNA (dsDNA) moet worden "gesmolten" tot enkele strengen door hoge temperaturen in de reageerbuis (-95 ° C). De reactie wordt vervolgens afgekoeld om de oligonucleotide-primers te laten hechten aan het nu enkelstrengige matrijs-DNA en het DNA-polymerase-enzym te sturen om verlenging te initiëren door enkele complementaire nucleotiden toe te voegen om een ​​nieuwe complete DNA-streng te creëren. Zo ontstaat dsDNA. Dit nieuwe dsDNA moet dan uit elkaar worden gesmolten voordat de volgende kopieercyclus kan plaatsvinden. Daarom, als de reactie met perfecte efficiëntie werkt, zal er na elke PCR-cyclus twee keer zoveel specifiek dsDNA zijn. In werkelijkheid behouden reacties geen perfecte efficiëntie omdat reactanten in de PCR na vele cycli worden verbruikt en de reactie een plateau zal bereiken (Fig. 3). Bovendien kan het zelfgloeien van het accumulerende product ook bijdragen aan het “plateau-effect” (49). In feite is het juist dit kenmerk van PCR's dat real-time PCR-technologie zo noodzakelijk maakt. Omdat de reactie DNA slechts tot een bepaalde hoeveelheid vóór het plateau-effect efficiënt kan amplificeren, is er geen manier om op betrouwbare wijze de hoeveelheid uitgangs-DNA te berekenen door de hoeveelheid product aan het einde van de PCR te kwantificeren. Dat wil zeggen, ongeacht hoeveel van een specifieke doel-DNA-sequentie aanwezig is vóór PCR, er kunnen vergelijkbare hoeveelheden geamplificeerd DNA zijn na PCR en elke duidelijke correlatie tussen begin- en eindhoeveelheden gaat verloren. Real-time PCR lost dit probleem op door gebruik te maken van het feit dat DNA-amplificaties vroeg in het reactieproces efficiënt plaatsvinden en daarom de productvorming tijdens deze "exponentiële fase" meet (Fig. 3). Deze meting correleert met de hoeveelheid specifiek uitgangs-DNA, waardoor kwantificering mogelijk is.

Fig. 2.Enzymreacties die realtime PCR mogelijk maken. EEN: PCR is afgebeeld. Hoge temperaturen worden gebruikt om dubbelstrengs (ds)DNA te "smelten" in de bovenste en onderste strengen. Dit mengsel wordt gekoeld in de aanwezigheid van sequentiespecifieke primers (aangeduid als voorwaarts en achterwaarts) die aan hun doelen hechten, en vervolgens wordt een optimale temperatuur toegepast om verlenging van complementair DNA (pijlen) door de werking van DNA-polymerase mogelijk te maken om een fiets. Dit wordt vele malen herhaald en, als er geen reagentia zijn die beperkend zijn, N kopieën van het gewenste DNA-fragment kunnen worden verkregen. B: omdat DNA-polymerase geen RNA als sjabloon gebruikt, kan de omzetting van RNA naar DNA worden bereikt met behulp van het enzym reverse transcriptase. ssDNA, enkelstrengs DNA.


Afb. 3.Typische realtime PCR-resultaten. EEN: amplificatiegrafiek die de toename van het fluorescente reportersignaal illustreert (ja-as, noteer de logschaal) bij elke PCR-cyclus (x-as). De ja-as eenheden (ΔRN) weerspiegelen feitelijk het reportersignaal dat is genormaliseerd naar een passieve referentiekleurstof in de reactiebuffer. De curven die worden gezien met een controle zonder sjabloon (NTC), die geen toegevoegd DNA heeft, laten zien dat de primers alleen geen signaal genereren en dat de in deze test gebruikte reagentia geen DNA-verontreiniging vertoonden. B: dissociatiecurve voor deze analyse die een enkele scherpe piek toont, wat suggereert dat alleen een specifiek PCR-product werd gegenereerd met deze set primers.


Analyse van de resultaten van realtime PCR - Biologie

Real-time PCR-technologie (RT-PCR) is zeer flexibel en er zijn recentelijk veel alternatieve instrumenten en fluorescerende sondesystemen ontwikkeld. De verminderde praktische tijd, verhoogde betrouwbaarheid en verbeterde kwantitatieve nauwkeurigheid van RT-PCR-methoden hebben bijgedragen aan de acceptatie van RT-PCR voor een breed scala aan nieuwe toepassingen.

Deze essentiële handleiding biedt een uitgebreide gids voor de meest up-to-date technologieën en toepassingen en geeft een overzicht van de theorie van deze steeds belangrijker wordende techniek. Gerenommeerde experts in het veld beschrijven en bespreken de nieuwste PCR-platforms, fluorescerende chemicaliën, validatiesoftware, gegevensanalyse en interne en externe controles. Dit actuele en gezaghebbende volume bespreekt ook een breed scala aan RT-PCR-toepassingen, waaronder: klinische diagnostiek, biodefense, RNA-expressieonderzoeken, validatie van arraygegevens, mutatiedetectie, voedselauthenticiteit en wetgeving, NASBA, moleculaire halotypering en nog veel meer.

Een essentieel boek voor alle laboratoria die PCR gebruiken.

". een uitgebreid overzicht van de RT-PCR-technologie, die zo actueel is als een boek maar kan zijn." van J. Microbiological Methods.

"biedt een dubbele focus door in de eerste hoofdstukken te streven naar zowel de theorie als de praktische aspecten van deze diverse en oppervlakkig eenvoudige technologie, en dit in de latere hoofdstukken tegenwicht te bieden aan toepassingen in de echte wereld, waaronder infectieziekten, biodefensie, moleculaire haplotypering en voedselnormen." van Microbiologie Vandaag.

"een naslagwerk dat zowel in universiteitsbibliotheken als in de schappen van ervaren applicatiespecialisten te vinden zou moeten zijn." van Microbiologie Vandaag.

"een uitgebreide gids voor real-time PCR-technologie en zijn toepassingen" uit Food Science and Technology Abstracts (2009) Volume 41 Number 6.

"Dit boek zou van het grootste belang moeten zijn voor alle onderzoekers die geïnteresseerd zijn in en betrokken zijn bij het gebruik van RT-PCR. De RT-PCR-protocollen die in dit boek worden behandeld, zullen interessant zijn voor de meeste, zo niet alle onderzoekers die zich bezighouden met onderzoek waarbij deze belangrijke techniek wordt gebruikt. een goed uitgebalanceerd boek over de vele mogelijke toepassingen van real-time PCR, waardevol voor iedereen die geïnteresseerd is in RT-PCR." van Doodys-recensies (2009).

"voorzie de beginnende en ervaren gebruiker van begeleiding over de technologie, de instrumenten en de toepassingen" van SciTech Book News juni 2009 p. 64.

". geschreven door internationale auteurs die deskundig zijn op het gebied van specifieke technische principes en toepassingen. Een nuttig compendium van basis- en geavanceerde toepassingen voor laboratoriumwetenschappers. Het is een ideaal inleidend leerboek en zal dienen als een praktisch handboek in laboratoria waar de technologie wordt toegepast." van de Australische J. Med. Wetenschap. 2009. 30(2): 59-60.

(EAN: 9781904455394 9781913652067 Onderwerpen: [moleculaire microbiologie] [pcr] [moleculaire biologie])


Er zijn twee hoofdmethoden voor DNA-kwantificering in realtime PCR. Deze zijn weergegeven in onderstaande figuur. Men gebruikt DNA-intercalerende of kleine groef-gerichte kleurstoffen die verbeterde fluorescentie vertonen bij binding. Bij elke amplificatiecyclus neemt, naarmate de hoeveelheid matrijs-DNA toeneemt, het aantal gebonden fluoroforen en daarmee de intensiteit van het fluorescentiesignaal toe. Populaire fluorescerende intercalerende kleurstoffen zijn onder meer SYBR® Green I en SYBR® Gold. Hun belangrijkste voordeel is de kostprijs, maar ze zijn niet-specifiek en binden alle dsDNA en niet alleen het doelwit.

De tweede methode maakt gebruik van fluorofoor-gelabelde sequentiespecifieke DNA-probes. Voor de detectie worden verschillende chemicaliën gebruikt. Het meest populaire type gebruikt de 5'-3'-exonuclease-activiteit van Taq polymerase om een ​​oligonucleotide op te kauwen, dat respectievelijk een fluorofoor en een quencher heeft aan de 5'- en 3'-uiteinden. De exonuclease-activiteit van het polymerase helpt de fluorofoor te scheiden van de quencher, wat resulteert in verhoogde fluorescentie. Maar hoe bepaal je dan de hoeveelheid nucleïnezuur uit fluorescentie-intensiteiten?


Analyse van de resultaten van realtime PCR - Biologie

Nauwkeurigheid en kalibratie van commerciële oligonucleotide- en aangepaste cDNA-microarrays
Yuen T, Wurmbach E, Pfeffer RL, Ebersole BJ, Sealfon SC.
Afdeling Neurologie, Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, VS.
Nucleïnezuren Res. 2002 30(10): e48.

Wurmbach E, Yuen T, Sealfon SC.
Methoden. 2003 31 (4): 306-316.

Afdeling Neurologie, Mount Sinai School of Medicine, Box 1137, 1 Gustave L. Levy Place, New York, NY 10029, VS.

We beschrijven gedetailleerde protocollen en resultaten met een geïntegreerd platform voor het bestuderen van relatieve transcriptie-expressie, inclusief microarray-ontwerp en fabricage, analyse- en kalibratie-algoritmen, en kwantitatieve real-time PCR met hoge doorvoer. Deze aanpak optimaliseert de gevoeligheid en nauwkeurigheid en houdt tegelijkertijd de kosten van experimenten onder controle. Een cDNA-array van hoge kwaliteit werd gefabriceerd met behulp van een beperkt aantal zorgvuldig geselecteerde transcripten waarbij elke kloon in drievoud werd afgedrukt. Deze gerichte array vergemakkelijkte zowel herhaalde metingen als replicatie-experimenten. Na normalisatie en differentiële expressieanalyse, ontdekten we dat experimenten met deze array differentieel tot expressie gebrachte transcripten identificeerden met een hoge mate van nauwkeurigheid en met een hoge gevoeligheid voor lage niveaus van differentiële expressie. Het gebruik van een kalibratie-algoritme verbeterde de nauwkeurigheid van de array bij het kwantificeren van het relatieve niveau van transcriptexpressie. Alle differentieel tot expressie gebrachte transcripten die door de array werden geïdentificeerd, werden onafhankelijk getest met behulp van kwantitatieve real-time PCR-assays met hoge doorvoer. Deze benadering identificeerde op betrouwbare wijze transcripten met slechts 1,3-voudige verschillen in transcriptexpressie tussen RNA-monsters van behandelings- en controlegroepen en was toepasbaar op zeer heterogene weefselbronnen zoals hypothalamus en hersenschors.

Realtime RT-PCR-profilering van meer dan 1400 Arabidopsis-transcriptiefactoren:
ongekende gevoeligheid onthult nieuwe wortel- en scheut-specifieke genen.

Czechowski T, Bari RP, Stitt M, Scheible WR, Udvardi MK.
Fabriek J. 2004 april38(2):366-79.
Max-Planck Instituut voor Moleculaire Plantenfysiologie, Am Muhlenberg 1, 14476 Golm, Duitsland


Gonadotropine-releasing hormoonreceptor-gekoppelde gennetwerkorganisatie.

Wurmbach E, Yuen T, Ebersole BJ, Sealfon SC.
Afdeling Neurologie, Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, VS
J Biol Chem. 2001 276(50): 47195-47201

Michael W. Pfaffl, B. Gerstmayer, A. Bosio, Wilhelm Windisch
Journal of Nutritional Biochemistry 14 (2003) 691'8211702

Instituut voor Fysiologie, Departement Dierwetenschappen, Centrum voor Levens- en Voedingswetenschappen, TUM, 85354 Freising, Duitsland
Memorec Biotech GmbH, Medisch Moleculair Onderzoek Keulen, 50829, Koeln, Duitsland
Afdeling Diervoeding en Productiefysiologie, Afdeling Dierwetenschappen, Centrum voor Levens- en Voedingswetenschappen, TUM, 85354, Freising, Duitsland

In de hier gepresenteerde studie werd het effect van zinkdeficiëntie op mRNA-expressieniveaus in lever en jejunum van volwassen ratten geanalyseerd. De voeropname werd beperkt tot 8 g/dag. Het semi-synthetische dieet was verrijkt met puur fytaat en bevatte ofwel 2 g Zn/g (Zn-deficiëntie, n 6) of 58 g Zn/g (controle, n 7). Na 29 dagen Zn-depletievoeding, werden het hele jejunum en de lever teruggewonnen en werd totaal RNA geëxtraheerd. Weefselspecifiek expressiepatroon werd gescreend en gekwantificeerd door microarray-analyse en afzonderlijk geverifieerd via realtime RT-PCR. Een relatieve kwantificering werd uitgevoerd met de nieuw ontwikkelde Relative Expression Software Tool © op talrijke kandidaatgenen die een differentiële expressie vertoonden. Deze studie biedt het eerste vergelijkende beeld van genexpressieregulatie en volledig kwantitatieve expressieanalyse van 35 kandidaatgenen in een niet-groeiend Zn-deficiënt volwassen rattenmodel. De expressieresultaten duiden op het bestaan ​​van een individueel expressiepatroon in lever en jejunum en hun weefselspecifieke regulatie onder Zn-deficiëntie. Bovendien kon worden aangetoond dat in het jejunum een ​​aantal B-cel-gerelateerde genen onderdrukt worden bij Zn-deficiëntie. In de lever kon worden aangetoond dat metallothioneïne subtype 1 en 2 (MT-1 en MT-2) genen dramatisch onderdrukt zijn en daarom vermeende markers voor Zn-deficiëntie vertegenwoordigen. Expressieresultaten impliceren dat sommige genen constitutief tot expressie worden gebracht, terwijl andere sterk worden gereguleerd in weefsels die verantwoordelijk zijn voor Zn-homeostase.

Identificatie van genen die reageren op intracellulaire zinkdepletie bij de mens
Colonadenocarcinoomcellijn HT-29.

Kindermann B, Doring F, Pfaffl M, Daniel H.
J Nutr. 2004 jan.134(1): 57-62.


Moleculaire Voedingseenheid en. Afdeling Dierwetenschappen, Technisch
Universiteit van München, D-85350 Freising-Weihenstephan, Duitsland.

Validatie van op arrays gebaseerde genexpressieprofielen door real-time (kinetische) RT-PCR.

Rajeevan MS, Vernon SD, Taysavang N, Unger ER. (2001)
J Mol Diag. 2001 februari3(1):26-31.

We evalueerden real-time (kinetische) reverse transcriptie-polymerase kettingreactie (RT-PCR) om differentieel tot expressie gebrachte genen te valideren die zijn geïdentificeerd door DNA-arrays. Genexpressie van twee keratinocytsubklonen die verschillen in de fysieke toestand van humaan papillomavirus (episomaal of geïntegreerd) werd gebruikt als een modelsysteem. Filterarrays met hoge dichtheid identificeerden 444 van 588 genen als ofwel negatief ofwel tot expressie gebracht met minder dan tweevoudig verschil, en de andere 144 genen als uniek tot expressie gebracht of met meer dan tweevoudig verschil tussen de twee subklonen. Realtime RT-PCR gebruikte LightCycler-gebaseerde SYBR Green I-kleurstofdetectie en smeltcurve-analyse om de relatieve verandering in genexpressie te valideren. Real-time RT-PCR bevestigde de verandering in expressie van 17 van de 24 (71%) genen geïdentificeerd door high-density filterarrays. Genen met sterke hybridisatiesignalen en ten minste tweevoudig verschil werden waarschijnlijk gevalideerd door real-time RT-PCR. Deze gegevens suggereren dat (i) zowel de hybridisatie-intensiteit als het niveau van differentiële expressie de waarschijnlijkheid bepalen van het valideren van high-density filterarrayresultaten en (ii) genen geïdentificeerd door DNA-arrays met een twee- tot viervoudig verschil in expressie niet kunnen worden geëlimineerd als vals noch als waar worden aanvaard zonder validatie. Real-time RT-PCR op basis van LightCycler-technologie is zeer geschikt om DNA-arrayresultaten te valideren, omdat het kwantitatief en snel is en 1000 keer minder RNA vereist dan conventionele tests.

Globale cDNA-amplificatie gecombineerd met realtime RT-PCR:

nauwkeurige kwantificering van meerdere menselijke kaliumkanaalgenen op eencellig niveau.
Al-Taher A, Bashein A, Nolan T, Hollingsworth M, Brady G. (2000)
Gist. 2000 september 3017(3):201-210.

We hebben een gevoelige kwantitatieve RT-PCR-procedure ontwikkeld die geschikt is voor de analyse van kleine monsters, inclusief afzonderlijke cellen, en hebben deze gebruikt om de niveaus van kaliumkanaal-mRNA's te meten in een panel van menselijke weefsels en kleine aantallen cellen die in kweek zijn gekweekt. De methode omvat een initiële globale amplificatie van cDNA afgeleid van al het toegevoegde gepolyadenyleerde mRNA, gevolgd door kwantitatieve RT-PCR van individuele genen met behulp van specifieke primers. Om een ​​snelle en nauwkeurige verwerking van monsters te vergemakkelijken, hebben we de aanpak aangepast om het gebruik van TaqMan realtime kwantitatieve PCR mogelijk te maken. We laten zien dat de aanpak een grote verbetering is ten opzichte van bestaande conventionele en real-time kwantitatieve PCR-benaderingen, aangezien deze kan worden toegepast op monsters die equivalent zijn aan een enkele cel, en in staat is om nauwkeurig expressieniveaus te meten die overeenkomen met minder dan 1/100ste kopie/cel (één specifiek cDNA-molecuul aanwezig onder 10(8) totale cDNA-moleculen). Bovendien, aangezien de eerste stap een globale amplificatie van alle tot expressie gebrachte genen omvat, wordt van elk monster een permanent cDNA-archief gegenereerd, dat voor onbepaalde tijd kan worden geregenereerd voor verdere expressie-analyse.

DNA-microarrays en meer: ​​de reis van weefsel naar cel voltooien.
Mills JC, Roth KA, Cagan RL, Gordon JI. (2001)
Nat Cell Biol 2001 Aug3(8):E175-178
Erratum in: Nat Cell Biol 2001 Oct3 (10): 943

Voor de celbioloog is het identificeren van veranderingen in genexpressie met behulp van DNA-microarrays slechts het begin van een lange reis van weefsel naar cel. We bespreken hoe chipgebruikers eerst ruis (false-positives) uit ontmoedigende microarray-datasets kunnen filteren. Het combineren van laser capture-microdissectie met real-time polymerasekettingreactie en reverse transcriptie is een nuttige vervolgstap waarmee de expressie van geselecteerde genen kan worden gekwantificeerd met behulp van gevoelige nieuwe in situ hybridisatie en immunohistochemische methoden op basis van tyramidesignaalamplificatie.

Gebruik van realtime kwantitatieve PCR om de resultaten van cDNA-array te valideren
en differentiële display PCR-technologieën.

Rajeevan MS, Ranamukhaarachchi DG, Vernon SD, Unger ER. (2001)
Methoden. 2001 25 december (4):443-51.

Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) methoden die de productaccumulatie volgen, werden aangepast voor de validatie van differentieel tot expressie gebrachte genen. We beschrijven een realtime kwantitatieve PCR-test die gebruikmaakt van SYBR Green I-kleurstofgebaseerde detectie en productsmeltcurve-analyse om differentieel tot expressie gebrachte genen te valideren die zijn geïdentificeerd door genexpressieprofileringstechnologieën. Aangezien SYBR Green I-kleurstof een niet-specifieke intercalerende kleurstof is, wordt de reactie specifiek gemaakt door gebruik te maken van "hot-start" PCR en empirisch bepaalde annealing- en signaalacquisitietemperaturen voor elke genspecifieke primer. Relatieve expressieniveaus werden gekwantificeerd door een standaardcurve te construeren met behulp van cDNA-verdunningen van een sterk tot expressie gebracht gen. Met behulp van deze aanpak valideerde real-time PCR 17 van de 21 (71%) genen geïdentificeerd door DNA-arrays, en op 1 na alle 13 (91%) genen geïdentificeerd door differentiële display PCR (DD-PCR). Validatie van differentieel tot expressie gebrachte genen gedetecteerd door array-analyse was gerelateerd aan hybridisatie-intensiteit. Realtime RT-PCR-resultaten suggereren dat genen geïdentificeerd door DNA-arrays met een twee- tot viervoudig verschil in expressie niet als waar of onwaar kunnen worden geaccepteerd zonder validatie. Validatie van differentieel tot expressie gebrachte genen gedetecteerd door DD-PCR werd niet beïnvloed door bandintensiteiten. Ongeacht de genexpressieprofileringstechnologie (microarrays, DD-PCR, seriële analyse van genexpressie en subtractiehybridisatie), zodra de sequentie van het gen van belang bekend is, is de realtime RT-PCR-benadering zeer geschikt voor validatie van differentiële expressie omdat het kwantitatief en snel is en 1000 keer minder RNA vereist dan conventionele testen.

Het limit fold change-model: een praktische benadering voor het selecteren
differentieel tot expressie gebrachte genen uit microarray-gegevens.

Mutch DM, Berger A, Mansourian R, Rytz A, Roberts MA.
BMC Bioinformatica 2002 juni 213(1):17
Metabolische en genomische regulatie, Nestle Research Center, Vers-chez-les-Blanc,
CH-1000 Lausanne 26, Zwitserland

ACHTERGROND: De biomedische gemeenschap ontwikkelt nieuwe methoden voor data-analyse om de enorme datasets geproduceerd door microarray-experimenten efficiënter te verwerken. Systematische en globale wiskundige benaderingen die gemakkelijk kunnen worden toegepast op een groot aantal experimentele ontwerpen, worden fundamenteel om de anders overweldigende datasets correct te verwerken.

RESULTATEN: Het hierin gepresenteerde genselectiemodel is gebaseerd op de observatie dat:
(1) variantie van genexpressie is een functie van absolute expressie
(2) men kan deze relatie modelleren om een ​​geschikte lagere vouwveranderingslimiet van significantie in te stellen en
(3) deze relatie definieert een functie die kan worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen te selecteren.
Het model evalueert eerst de vouwverandering (FC) over het gehele bereik van absolute expressieniveaus voor een willekeurig aantal experimentele omstandigheden. Genen worden systematisch weggegooid en die genen binnen de bovenste X% van de hoogste FC's voor elke bak worden zowel met als zonder het gebruik van replica's geëvalueerd. Er wordt een functie aangebracht door de bovenste X% van elke bak, waardoor een limietvouwverandering wordt gedefinieerd. Alle genen die door het 5% FC-model zijn geselecteerd, liggen boven de meetvariabiliteit met een betrouwbaarheidsniveau binnen de standaarddeviatie (SDwithin) van 99,9%. Real-time-PCR (RT-PCR) analyse toonde 85,7% overeenstemming met microarray-gegevens geselecteerd door de limietfunctie.

CONCLUSIE: Het FC-model kan met vertrouwen differentieel tot expressie gebrachte genen selecteren, zoals bevestigd door variantiegegevens en RT-PCR. De eenvoud van het algehele proces maakt het mogelijk om modellimieten te selecteren die experimentele gegevens het beste beschrijven door informatie te extraheren over genexpressiepatronen over het bereik van expressieniveaus. Genen die door dit proces zijn geselecteerd, kunnen consistent worden vergeleken tussen experimenten en stellen de gebruiker in staat om wereldwijd informatie met een hoge mate van vertrouwen te extraheren.

De toepassing van de real-time (kinetische) PCR om cDNA-producten te amplificeren die omgekeerd zijn getranscribeerd van mRNA (RT) en microarray-technologie zijn op weg om routinematige hulpmiddelen te worden in de moleculaire biologie. Ze zijn allebei zeer geschikt om genexpressie te bestuderen, maar elke methodologie heeft zijn specifieke voor- en nadelen. Microarray-technologie is ideaal om veel genen in één stap te screenen (>10.000 gentranscripten) en kinetische RT-PCR is zeer gevoelig, zeer kwantitatief en vereist tot 1000 keer minder RNA. Beide maken een relatieve en nauwkeurige kwantificering van mRNA-moleculen mogelijk met een voldoende hoge herhaalbaarheid en lage variabiliteit.
Maar nauwkeurige kwantificering van nucleïnezuren vereist een reproduceerbare methodologie en een adequaat wiskundig model voor data-analyse. De specifieke onderwerpen van de relatieve kwantificering in microarray en kinetische PCR-technologie van een doelwitgentranscript in vergelijking met een referentiegentranscript of huishoudgen worden beschreven. Daarom wordt een nieuw wiskundig model en software gepresenteerd. De relatieve expressieverhouding (R) wordt berekend uit de kinetische PCR-efficiëntie (E) en de afwijking van het kruispunt (CP) (DCP) van een onbekend monster versus een controle. Dit model heeft geen kalibratiecurve nodig. Controleniveaus werden in het model opgenomen om elke reactierun te standaardiseren met betrekking tot RNA-integriteit, monsterbelading en inter-PCR-variaties. Hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid (<2.5% variatie) werden bereikt in LightCycler® RT-PCR met behulp van het gevestigde wiskundige model (Pfaffl, NAR 2001). R van een doelwitgen wordt uitgedrukt in een monster versus een controle in vergelijking met een referentiegen. Etarget = realtime PCR-efficiëntie van doelwitgentranscript Eref = realtime PCR-efficiëntie van referentiegentranscript ?CPtarget = CP-afwijking van controle - monster van doelwitgentranscript ?CPref = CP-afwijking van controle - monster van referentiegentranscript.
Er is nu een op Excel® gebaseerde Relative Expression Software Tool (REST ©) beschikbaar, die E en R van verschillende (<16) monsters en vier doelgenen berekent (Pfaffl et al., NAR 2002). De relatieve expressieverhouding wordt getest op significantie in vergelijking met controle op basis van een Pair Wise Fixed Reallocation Randomization Test ©.
Het gebruik van deze benadering om de weefselspecifieke expressieniveaus te screenen met microarray en de resultaten te bevestigen door kinetische RT-PCR en REST © is een krachtige en optimale combinatie. De voordelen van beide kwantificatiesystemen werden toegevoegd: hoge doorvoer van de microarray en gevoeligheid van de real-time RT-PCR.

Einleitung: DNA Microarrays sind großartige Werkzeuge um funktionelle Zusammenhänge auf der mRNA Ebene zwischen einer Vielzahl von Genen zu untersuchen. Aber aufgrund der sequenzabhängigen Hybridisierungseigenschaften und der Variationen die den Hybridisierungsreaktionen zugrunde liegen, müssen die Array Ergebnisse als semi-kwantitatieve angesehen werden. Als optimale ergänzung der signifikanten Array Ergebnisse bietet sich die sensitive Verifikation der Expressionsdaten mittels voll kwantitatiever real-time RT-PCR an.
Ziel dieses Projektes bestand darin mittels Northern-Blot, cDNA Array en real-time RT-PCR Techniken, einen Katalog an Genen zu ermitteln die im Menschen regional bzw. temporär beschränkte mRNA Expressionsmuster während der ersten Stunden der Wundheilung aufweisen.

Achterliggende: Die mechanische Verletzung der Gefäßwand, wie z.B. durch die Angioplastie, führt zur Aktivierung von Endothelzellen en zum endothelialen Wundverschluss durch derren Migration and Proliferation. Eine sehr schnelle Zellantwort auf die mechanische Endothelzellverletzung stellt die Expression von Early Response Genen, die eng mit dem Zellwachstum korreliert sind, dar. So induziert die mechanische Verletzung die Expression von c-FOS mRNA (Briski & Gillen, 2001) und EGR-1 mRNA (Yan et al., 2000) und bereits nach einer Stunde ist das Maximum der mRNA Expression erreicht.
Ziel unserer Untersuchungen war es in vitro weitere Early Response Gene zu identifizieren, die durch die mechanische Verletzung in kürzester Zeit in Endothelzellen aktiviert werden und dadurch einen besseren Einblick in die molekularen Mechanismen des Wundheilungsprozesses zu gewinnen. Um dieses Ziel zu erreichen, kamen unterschiedliche molekularbiologische Methoden zum Einsatz, wie etwa Northern-Blot (Ergebnisse werden nicht beschrieben), cDNA Mikroarray Technologie und als voll quantitative Bestätigungsmethode die real-time RT-PCR.

Methodik: Um neue durch die mechanische Verletzung induzierte Gene zu entdecken und zu identifizieren wurde ein Zeitfenster von bis zu 6 Stunden gewählt. Aus unverletzten und verletzten konfluent gewachsenen humanen Endothelzellen aus Umbilikalvenen (HUVEC) wurde Gesamt-RNA extrahiert und mittels des Atlas Pure Total Labeling Sytem (Clontech, CA, USA) [P32]-markierte cDNA Sonden hergestellt. Diese Sonden wurden getrennt voneinander auf zwei Atlas Human 1.2 I Array Membranen (Clontech) hybridisiert: unverletzt versus verletzt cDNA Sonden aus HUVEC Zellen. Auf diesen Nylon-Membranen sind cDNA Fragmente von 1176 verschiedene Genen immobilisiert, darunter auch Housekeeping Gene zur Normierung der Expressionsergebnisse, wie GAPDH, b-Actin, Ubiquitin.
Die Bestätigung dieser semi-quantitativen Array Ergebnisse erfolgte mittels voll quantitativer real-time RT-PCR Analyse. Hierfür wurde mit einem LightCycler (Roche Diagnostics, Penzberg) gearbeitet, der schnelles Thermocycling (rapid cycling) mit der Online SYBR Green I Fluoreszenzdetektion der RT-PCR Produkte kombiniert. Als Quantifizierungsstrategie wurde eine neu entwickelte normalisierte relative Quantifizierung gewählt (Pfaffl, 2001), wobei die mRNA Expressionsdaten eines Zielgens mit denen eines Referenzgens (House Keeping Gen) verglichen wurden. Die relative Expressionsratio ( R ) wird anhand der PCR Effizienzen (E) und der Differenz der „Crossing Points“ (CP) der zu vergleichenden Ansätze berechnet. In unserem Falle waren das einerseits unverletzte versus verletzte Endothelzellen Gesamt-RNA bzw. cDNA.

Ergebnisse: Die Bestimmung der CP Zyklenzahlen (n=3) der real-time RT-PCR für GAPDH und ATF-3 zeigen die geringe intra-Assay Varianzen (<2,8% VQ) und somit hohe Reproduzierbarkeit der LightCycler RT-PCR. Für die Zielgene ergaben sich folgenden minimale und maximale real-time PCR Effizienzen: Ec-FOS = 1,89 und EICAM-1 = 2,06. Es konnte mit Hilfe der beschriebenen Methoden neben schon bekannten durch Verletzung induzierte Early Response Gene, wie c-FOS, und EGR-1, auch weitere Gene nachgewiesen werden, wie ICAM-1, ATF-3, TTP, ADAMTS-1, ETR-101 und PAI-1 (Arnaoutis et al., 2000). Die Genexpression wurden im verletzten Zustand, im Vergleich zur unverletzten Kontrolle, extrem aufreguliert: c-FOS 264–fach, TTP 102-fach, ATF-3 43,5-fach, ADAMTS-1 25,3-fach, ETR-101 11,2-fach, ICAM-1 5,7-fach und PAI-1 2,2-fach (Mittelwert aus drei Wiederholungen). GAPDH wurde im Gegensatz nur marginal reguliert (

40%). Die Expressionsdaten weisen jedoch darauf hin, dass nicht nur Transkriptionsfaktoren, sondern auch Adhäsionsmoleküle und Plasminogen Inhibitoren in der Frühphase der mechanischen Verletzung von Endothelzellen vermehrt expremiert werden.
Schlussfolgerungen: Mit dem Northern-Blot und dem Atlas DNA Array System konnte die differentielle Expression von einer Vielzahl von „neuer“ Early Response Genen aufgezeigt und mittels relativer Quantifizierung in der real-time RT-PCR exakt quantifiziert werden.
Mit der Mikroarray Technik und als optimal Ergänzung die real-time RT-PCR wurden somit schnelle als auch hoch quantitative analytische Möglichkeiten geschaffen, den Funktionszusammenhang auf mRNA Ebene zu entdecken, was besonders in nächster Zukunft vor dem Hintergrund des komplett publizierten humanen Genoms von besonderen Interesse sein wird.

Das lebensnotwendige Spurenelement Zink wirkt als Cofaktor von mehr als 300 Enzymen und ist ein Stabilisator biologischer Membranen. Zink ist außerdem Bestandteil von Transkriptionsfaktoren. Es greift somit in die Regulation der Genexpression ein1. Während in Modellorganismen wie z. B. Saccharomyces cerevisiae zahlreiche Zink-sensitive Gene identifiziert wurden2, sind beim Säuger bisher nur wenige Gene als Zink-abhängig beschrieben worden. Möglicherweise sind die genutzten Methoden wie z. B. differential display3 zu unempfindlich, um umfangreiche Daten zur Zink-abhängigen Expression einzelner Gene zu erhalten. Wir haben deshalb geprüft, ob die cDNA-Array-Technologie geeignet ist, Zink-abhängige Säugergene zu identifzieren. Als in-vitro Modellsystem dienten intestinale Epithelzellen (HT-29), die für 72 Std. in einem Medium mit normaler (0.25 ppm) bzw. erhöhter (10 ppm) Zinkkonzentration kultiviert wurden. Die gewählten Bedingungen führten zur drastischen Veränderung der Expression eines bereits bekannten Zink-sensitiven Gens (Metallothionein-1). Zum Screening dienten cDNA-Arrays (Clontech), die mit radioaktiv-markierten cDNAs aus den kultivierten Zellen (0.25 versus 10 ppm Zink) hybridisiert wurden. Die Arrays wurden mittels Phosphorimager ausgelesen und die Signale auf zwei Housekeeping-Gene (GAPDH, ß-Actin) bezogen. Die Auswertung zeigte, dass durch die erhöhte Zinkkonzentration

1% der repräsentativen Säugergene (1176) in ihrer Expression verändert (> 1.6-fach) sind. Mittels Northern Blot-Analyse und Real-time RT-PCR konnte für ausgewählte Gene die Modulation der Expression verifiziert werden. Die identifizierten Gene codieren u. A. für ein Oberflächenantigen und Proteasomproteine. Das Genprodukt und die Funktion eines Gens (Hypothetical 40 kDa Protein) sind bisher nicht bekannt. Das etablierte Reporterzellsystem und die cDNA-Array-Technologie sind somit prinzipiell geeignet, Zink-abhängige Säugergene zu identifizieren.

The essential trace element zinc acts as a cofactor in more than 300 enzymes, it stabilizes biological membranes and it is part of the transcriptional control of gene expression (J. Nutr. 130: 1500-1508). Zinc deficiency in mammals causes severe metabolic disturbances and this may in part be caused by changed expression of genes involved in processes such as growth and development. Whereas numerous zinc-dependent genes have been found in model organisms such as Saccharomyces cerevisiae (PNAS 97: 7957-7962), just a few genes are known in mammals that show zinc-dependent expression (PNAS 93: 6863-6868). We have tested the cDNA-array-technology to identify zinc-dependent genes in a mammalian cell system in vitro. We used the intestinal epithelial carcinoma cell line HT29, cultured for 72 hours in media containing either a normal zinc (0.25 ppm) or a high zinc (10 ppm) concentration. The selected conditions caused drastic alterations in the expression of metallothionein-1, already known as a zinc-sensitive gene. For screening purposes we employed cDNA-arrays (Clontech), hybridized with radioactive labeled cDNAs, which we derived from the cultured cells (0.25 versus 10 ppm zinc). Gene expression on the arrays was analyzed using a phosphorimager and the corresponding signals were standardized to the housekeeping genes GAPDH and ß-Actin. When compared to cells grown under normal conditions, the higher zinc concentration changed expression (> 1.6 fold) of approx. 1% of the represented mammalian genes (1176) on the array. Changes in the expression level of selected mRNA´s were verified by light-cycler PCR. Among others, a surface antigen and proteins of the proteasom complex showed significantly altered expression levels. Some genes have not yet been identified by function such as a putative 40 kDa protein. In summary, our reporter cell system and the cDNA-array-technology appear to be suitable for the identification of genes that show altered expression dependent of the zinc concentration in the cell.

Zink ist ein essentielles Spurenelement und besitzt vielfältige biochemische Funktionen im Intermediär- und Hormonstoffwechsel sowie in der Immunabwehr. Wenngleich es als Bestandteil von genregulatorischen Transkriptionsfaktoren bekannt ist, sind bisher nur wenige zink-sensitive Gene des Säugers identifiziert worden1. Wir haben geprüft, inwieweit DNA-Array-Technolgie2 geeignet ist die differentielle Genexpression im experimentellen Zinkmangel zu erfassen. Nach Erzeugung eines isolierten klinisch-biochemisch beschreibbaren Zinkmangels bei Ratten wurde deshalb für Lebergewebe eine vergleichende Transkriptomanalyse durchgeführt. Dazu wurden zwei DNA-Arraysysteme (Clontech, MWG-Biotech) auf der Basis von cDNA- bzw. Oligonukleotid-Sonden eingesetzt. Die Oligonukleotid-Arrays lieferten im Vergleich generell die reproduzierbareren Ergebnisse. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass die mRNA-Spiegel von

2500 untersuchten Gene im Zinkmangel verändert (³ 1.8-fach und £ 0.5-fach) waren. Mittels Northernblot-Analyse und Realtime-PCR wurden die Befunde der Arrays bei ausgewählten Transkripten verifiziert. Signifikante Änderungen in den Transkriptmengen ließen sich u.a. für Wachstumsfaktor-Rezeptoren, diverse Strukturproteine, Enzyme für Proteinmodifikationen, Enzyme des Xenobiotika-stoffwechsels und Proteine mit Beteiligung an Exocytose-Prozessen bestimmen. Die unterschiedlichen Funktionen der identifizierten Genprodukte bestätigen die Annahme, dass Zink auch beim Säuger eine Vielzahl von Genen in ihrer Expression beeinflußt. Die auffällige Symptomatik eines isolierten Zinkmangels mit ausgeprägter Wachtumsretardierung läßt sich also auch auf der Ebene des Transkriptoms an Schlüsselgenen abbilden. Die DNA-Array-Technologie könnte damit zum diagnostischen Werkzeug für die Beurteilung der Funktion und der Versorgungslage des Organismus mit essentiellen Mikronährstoffen werden.

The effects of Zinc (Zn) deficieny have been established in both, humans and experimental animals, and are known to result in anorexia, impaired immunity, skin lesions, abnormal development und growth retardation. Although the specific genes involved in these clinical symptoms remains unclear. The essential trace element Zn is a constituent of hundreds of enzymes. It also is an important component of many transcription factors. This latter property suggests an involvement of Zn as a regulatory ion in gene expression. Indeed, recent studies have observed changes in transcript level of some genes induced by Zn deficiency. With the advent of DNA microarray technology, there is a tool which allows to study the expression of a large number of genes simultaneously and to identify previously unsuspected genes. In this study, we used two different array systems to compare the expression of more than 2500 different genes in the liver of Zn adequate and Zn deficient rats. 32Phosphor- or fluorescence-labeled cDNA from liver of control and Zn deficient animals were hybridized to microarrays. By comparing gene expression profile of both groups, the mRNA levels of 81 genes were altered in Zn deficient status. These include genes essential for protein modification, exocytosis, signaltransduction, extracellular transport, structural proteins, metabolic pathways and xenobiotic metabolism. The expression of 48 genes was reduced (< 0,5 fold), whereas the mRNA of 33 was elevated (> 1,8 fold). For 23 genes, the results were verified by northern blot analysis. 14 of these genes were detectable on northern blots, of which 9 were confirmed as regulated. The result indicates that Zn deficieny causes an aberrant regulation of genes important for growth. Further characterization of the identified genes will show whether they evoke the phenotype of Zn deficiency in-vivo.

Advanced quantitative real-time PCR in clinical diagnostics and cDNA microarray validation
1st European Conference in Functional Genomics and Diseases,
Prague, Czech Republic, May 14-17, 2003

Real-time PCR is the method of choice for quantitative studies of gene expression. The method has been an important tool in basic research for some years, and has now also started to replace more conventional methods in clinical diagnostics. Real-time PCR is characterized by a wide dynamic range of quantification, high sensitivity and high precision. One of the major problems in DNA quantification is to account for PCR inhibitions appropriately. We have developed an in situ calibration method based on either addition of known amount of target DNA or dilution of the test sample to determine sample specific PCR efficiencies. Relative gene expression in clinical samples and cDNA microarray validations are applications particular suitable for in situ calibration, resulting in high accuracy. In situ calibration is particular suitable for a few samples per gene investigations, for example: cDNA microarray validation and relative gene expression in clinical samples. Further, the efficiency and reproducibility of various reverse transcription assays has been carefully evaluated. Our results suggest that sample to sample variation in reverse transcription is significantly higher than in real-time PCR, except when quantifying very low copy numbers. The efficiency of reverse transcription differs significantly between genes and priming strategy. The reproducibility of reverse transcription and real-time PCR suggest that the least difference in mRNA that can be significantly measured is


Difference Between PCR and Real-time PCR

PCR or Polymerase chain reaction is a revolutionized discovery in modern molecular biology, which was first developed by the chemist Kary Mullis in 1983. It allows a single sequence in a complex DNA to be amplified for analysis. The basic idea of the PCR is that two primers, which are complementary to the opposite strands of a DNA sequence, are oriented toward each other the primers produce complementary strands, each containing the other primer. Hence, the result is a large quantity of a sequence corresponding to the DNA that lies between the two primers. DNA polymerase enzyme is used to extend the primers in PCR. DNA polymerase is a thermostable enzyme, and it has the ability to survive in high temperatures (94 to 95 °C) used for denaturation of template DNA.

The PCR involves three steps, namely, repeated rounds of denaturation, annealing of primers, and synthesis of DNA. A thermocycler machine is used to perform this reaction so that it can be programmed to change the temperatures quickly and accurately. Applications of the PCR are criminal investigations, DNA fingerprint, detection of pathogens, and analysis of DNA of early human species.

What is Conventional PCR?

There are three major stages of conventional PCR, namely DNA amplification stage, separation of PCR, and detection of products. Separation of DNA segments are typically done by agarose gel electrophoresis. The products are then stained with etheiduim bromide. Finally, detection is achieved by visualization of bands onto gels under UV light. Therefore, the final results of conventional PCR are not expressed as numbers. Normally the conventional PCR is only able to detect a single parameter.

What is Real-time PCR?

Real-time PCR can detect the amplification of products, as the products are synthesized. With the development of technology, PCR has become a very popular technique, especially for the detection and identification of bacteria in foods. The real-time PCR uses a florescent dye system and thermocycler equipped with fluorescent- detection capability.

What is the difference between Conventional PCR and Real-time PCR?

• Conventional PCR is more time consuming as it uses gel electrophoresis to analyze the amplified PCR products. In contrast, real-time PCR is less time consuming as it can detect amplifications during the early phases of the reaction.

• Real-time PCR collects data at the exponential growth phase of PCR while traditional PCR collects data at End-point of the reaction.

• The end point results of the conventional PCR may not be very precise, but the results of the real-time PCR are very precise.

• Real-time PCR is more sensitive than conventional PCR.

• Conventional PCR has very poor resolution while real-time PCR can detect very little changes due to the high resolution.

• End point detection of conventional PCR has short dynamic range while real-time PCR detection has wide dynamic range.

• Unlike conventional PCR, automated detection techniques are found in real-time PCR.

• Conventional PCR is highly sophisticated and labor intensive more than real-time PCR.

• Unlike real-time PCR, conventional PCR cannot discriminate between dead and live bacteria.

• Real-time PCR uses fluorescent dye system to detect the products while conventional PCR uses ethidium bromide and UV light to visualize bands in the agarose gel medium.


Abstract

Syphilis, a re-emerging public health problem worldwide caused by Treponema pallidum subsp pallidum (T. pallidum), usually induces systemic and chronic inflammation in hosts who do not receive timely therapy after exposing to high-risk factors such as leprous sexual contact. Before the treatment, rapid and accurate detection of syphilis is essential. However, the existing detection methods, which focus on the treponemal or non-treponemal antibody test, both have inherent limitations. For instance, both of them cannot distinguish the stage and severity of syphilis. Non-treponemal test such as RPR, which is generally deemed to be used for assessing treatment response, is influenced by biological false positives. Therefore, it is imperative to seek out a new and effective diagnostic test. With recent advancements in molecular biology and whole-genome sequencing, the molecular diagnosis has increased in popularity, especially the use of polymerase chain reaction (PCR). Here, we firstly present a mini-review on the research of PCR detection methods used for syphilis diagnosis over the past decade, and we then compare these methodologies to assess their potential and the challenges faced. This information can provide a fresh perspective to help researchers address the current challenges.


PCR Reagents & qPCR Reagents

Reagents optimized for reverse transcription, PCR, and real-time PCR to generate reproducible data.

Real-Time PCR Supermixes and Kits

Designed for superior qPCR performance with any detection chemistry on any instrument.

PCR Plastic Consumables

PCR tubes, plates, seals, and accessories precisely manufactured for various PCR applications.

PrimePCR PCR Primers, Assays, and Arrays

Experimentally validated PCR primer and probe assays for real-time PCR and Droplet Digital PCR.


Bekijk de video: Влог Сдали ПЦР тест на Короновирус (Januari- 2022).