Informatie

Eiwitplooien: relatie tot splicing en post-translationele modificatie?


Is het secundaire structuurpatroon van eiwitvouwen op de een of andere manier gerelateerd aan alternatieve splicing en post-translationele modificatie?


Eiwitverwerking en vouwen

Alle nieuw gesynthetiseerde polypeptiden moeten in hun driedimensionale structuren worden gevouwen om functioneel te zijn. Veel eiwitten moeten andere bestemmingen bereiken dan het cytosol, de plaats waar eiwitsynthese plaatsvindt. Bovendien ondergaan de meeste eiwitten post-translationele modificatie als reactie op een grote verscheidenheid aan cellulaire signalen. Daarom is het begrijpen van het mechanisme en de regulatie van eiwitvouwing, eiwittranslocatie en eiwitverwerking een integraal onderdeel van de moderne moleculaire en celbiologie. Bovendien veroorzaken fouten in deze processen ziekten variërend van Alzheimer tot diabetes. Eiwitvouwing en -verwerking is een van de belangrijkste onderzoeksfocussen in onze afdeling. Faculteiten op dit gebied houden zich bezig met een aantal onderzoeksthema's, waaronder de ongevouwen eiwitrespons, het menselijke bloedstollingssysteem, de structuur en functie van moleculaire chaperonnes, de hitteschokrespons, verkeerde vouwing van eiwitten bij veroudering en ziekte, verwerking van gistferomonen, eiwittransport in de secretoire route, eiwittargeting, organelbiogenese en eiwitontwerp en -engineering.

Het Baldridge-lab bestudeert ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Degradation) van verkeerd gevouwen eiwitten.

Het Fuller-lab is geïnteresseerd in hoe Vps13p en andere eiwitten helpen bij het lokaliseren van eiwitverwerkende enzymen in de celcompartimenten waar ze functioneren.

De rol van de ESCRT-machines (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) bij membraanreparatie wordt onderzocht in het Hanson-lab.


Co- en post-translationele eiwitvouwing in de ER

De biofysische regels die het vouwen van kleine, enkel-domein eiwitten in verdunde oplossingen regelen, zijn nu vrij goed begrepen. De mechanismen die ten grondslag liggen aan co-translationele vouwing van multidomein- en membraanoverspannende eiwitten in complexe cellulaire omgevingen zijn vaak minder duidelijk. Het endoplasmatisch reticulum (ER) produceert een overvloed aan membraan- en secretoire eiwitten, die correct moeten vouwen en assembleren voordat ER wordt verlaten - als deze processen falen, hopen verkeerd gevouwen soorten zich op in het ER of worden ze afgebroken. Het ER verschilt van andere cellulaire organellen in termen van de fysisch-chemische omgeving en de verscheidenheid aan ER-specifieke eiwitmodificaties. Hier bekijken we chaperonne-geassisteerde co- en post-translationele vouwing en assemblage in de ER en onderstrepen we de invloed van eiwitmodificaties op deze processen. We benadrukken hoe de ontwikkeling van methoden het veld vooruit heeft geholpen door onderzoekers in staat te stellen de voortgang van het vouwen te volgen zoals het zich voordoet in levende cellen, terwijl ze tegelijkertijd de ingewikkelde relatie tussen eiwitmodificaties tijdens het vouwen onderzoeken.

trefwoorden: N-glycosylatie chaperonnes disulfide-binding vorming endoplasmatisch reticulum vouwende enzymen eiwitvouwing.


Eiwitplooien: relatie tot splicing en post-translationele modificatie? - Biologie

Post-translationele modificaties om de eiwitfunctie te reguleren

Hening Lin, Jintang Du en Hong Jiang, Afdeling Scheikunde en Chemische Biologie, Cornell University, Ithaca, New York

Eiwit post-translationele modificaties (PTM) zijn erg belangrijk om de eiwitfunctie te reguleren en om tal van belangrijke biologische processen te controleren. Hier wordt een kort overzicht gegeven van veel voorkomende enzym-gekatalyseerde PTM. Deze PTM omvatten modificaties die optreden op eiwitzijketens en die waarbij eiwitruggengraat betrokken is. De introductie van verschillende PTM wordt gevolgd door een samenvatting van de moleculaire basis voor de regulatie van eiwitfunctie door PTM. Vervolgens wordt de nadruk gelegd op enkele belangrijke PTM die een belangrijke rol spelen in eukaryoten, zoals fosforylering, methylering, acetylering, glycosylering, ubiquitylering en proteolyse. Voor elke modificatie zal een beschrijving worden gegeven van de gemodificeerde residuen, de enzymatische reactiemechanismen, de belangrijkste bekende biologische functies en de relevantie ervan voor menselijke ziekten. Aan het einde bespreken we uitdagingen bij het identificeren van nieuwe paden die worden gereguleerd door bekende PTM en het ontdekken van nieuwe PTM.

Het centrale dogma van de moleculaire biologie, DNA wordt getranscribeerd naar mRNA dat vervolgens wordt vertaald naar eiwitten, impliceert het belang van eiwitten. Het zijn immers de eiwitten die de meeste biologische functies van een cel uitvoeren. Het beheersen van transcriptie en translatie is dus erg belangrijk, omdat ze uiteindelijk bepalen welke eiwitten in cellen worden gesynthetiseerd en dus de eigenschappen van cellen regelen. Men mag echter niet over het hoofd zien wat er met eiwitten gebeurt nadat ze zijn gesynthetiseerd. Na translatie kunnen veel chemische modificaties aan eiwitten plaatsvinden. Gezamenlijk worden deze modificaties post-translationele modificaties (PTM) genoemd. PTM is erg belangrijk bij het reguleren van de eiwitfunctie, wat wordt weerspiegeld door het grote aantal genen dat is toegewijd aan het katalyseren van PTM. In het menselijk genoom (met in totaal minder dan 30.000 genen) katalyseren bijvoorbeeld meer dan 500 kinasen eiwitfosforylering (1) en katalyseren meer dan 500 proteasen de hydrolytische splitsing van eiwitten (2). Deregulering in PTM is de oorzaak van verschillende ziekten bij de mens, zoals later in specifieke PTM-secties zal worden uitgelegd. Hier wordt een korte bespreking gegeven over verschillende soorten PTM en over hoe PTM de eiwitfunctie reguleert. Enkele basisprincipes zullen worden benadrukt, zodat lezers die niet bekend zijn met PTM een snel maar uitgebreid begrip van PTM kunnen krijgen. Het recente boek over PTM van professor Walsh van de Harvard Medical School geeft een meer volledige beschrijving van PTM (3). Waar van toepassing zullen verwijzingen naar specifieke PTM's ook worden gegeven in verschillende secties voor aanvullende informatie. De gebruikte afkortingen zijn gecatalogiseerd in Tabel 1 om lezers die niet bekend zijn met de biologische taal te helpen.

Soorten post-translationele modificaties

PTM kan door enzymen worden gekatalyseerd en dus zorgvuldig worden gecontroleerd, of ze kunnen niet-enzymatisch zijn met minder controle. Eiwitglycatie tijdens hyperglycemie is bijvoorbeeld een niet-enzymatische PTM die verantwoordelijk is voor sommige symptomen van diabetes (4). Eiwitnitrosylering op Cys-residuen is een ander niet-enzymatisch PTM dat de eiwitfunctie kan beïnvloeden (5). Coördinatie door metaalionen kan ook worden beschouwd als een PTM. Voor veel eiwitten is metaalbinding cruciaal voor het in stand houden van de juiste structuur of de enzymatische activiteit (6). Hier zal de nadruk worden gelegd op enzym-gekatalyseerde PTM. Figuren 1 en 2 tonen veel algemeen gevonden enzym-gekatalyseerde PTM. (3)

Zoals kan worden waargenomen in Fig. 1, gebeuren de meeste PTM met eiwitzijketens. Typisch zijn de betrokken zijketens nucleofiel, zoals Cys (palmitoylering, isoprenylering, vorming van disulfidebindingen, ADP-ribosylering), Lys (acetylering, methylering, ubiquitinylering), Arg (methylering, ADP-ribosylering), Asp/Glu [methylering, poly(ADP-ribosyl)ation], Ser/Thr (fosforylering, O-glycosylation) en Tyr (fosforylering). Zwakkere nucleofielen worden ook gebruikt, zoals de zijketen-amidestikstof in Asn (in N-glycosylering), de C-2-positie van Trp (in C-glycosylering) en de C-2-positie van His (in diftamide). Bij amideringsreacties die worden gekatalyseerd door transglutaminasen en polyglutamylerings-/polyglycyleringsreacties die optreden bij Glu-residuen, wordt de ε-NH2 van Lys of α-NH2 van Glu/Gly fungeert als de neucleofiel, terwijl de zijketen van Gin of Glu als de elektrofiel dient. Bovendien kunnen verschillende aminozuurzijketens worden geoxideerd, zoals Pro, Lys, Asn, Tyr, Trp en Cys, om geoxideerde aminozuren te geven.

Een paar PTM-reacties omvatten ook veranderingen in de eiwitruggengraat. Deze reacties omvatten de hydrolytische splitsing van de peptideruggengraat door proteasen, de verankering van eiwitten aan glycosylfosfotidylinositol (GPI) of cholesterol, en de C-terminale amidevorming door oxidatieve splitsing van glycineresiduen. Sommige PTM omvatten veranderingen in zowel de zijketen als de hoofdketen, zoals de vorming van 4-methylideen-5-imiazol-5-on (MIO) prosthetische groep in deaminasen en aminomutasen, de vorming van de fluorofoor in GFP (groen fluorescerend eiwit), en de vorming van pyruvamide in decarboxylasen (Fig. 2).

Figuur 1. Belangrijkste enzym-gekatalyseerde PTM die eiwitzijketens wijzigen.

Figuur 2. Enkele PTM's waarbij de eiwitruggengraat betrokken is.

Tabel 1. Lijst met afkortingen

Een tyrosinekinase gecodeerd door het abl (Abelson)-gen, het fusie-eiwit ABL-BCR is betrokken bij de remming van apoptose in chronische myeloïde leukemiecellen

Adenylaatcyclase, zet ATP om in cyclisch AMP

Acyl-dragereiwit, gevonden in vetzuursynthasen en polyketidesynthasen, functioneert om de langwerpige vetacylketen te dragen

Een disintergrase en metalloprotease, een familie van proteasen die extracellulaire delen van transmembraaneiwitten hydrolyseren

Apoptotische protease-activeringsfactor-1, een cytosolisch eiwit dat betrokken is bij celdood of apoptose, interageert met cytochroom c om caspase 9 te activeren

Acyltransferase, gevonden in vetzuursyntheasen en polyketidesyntheasen, voegt een malonylgroep toe aan de holovorm van het ACP-domein

Genoemd naar B-cellymfoom 2, een anti-apoptotisch eiwit

Een eiwit dat wordt gecodeerd door het gen voor het breekpuntclustergebied, heeft serine/threoninekinase-activiteit. Fusie met abl-eiwit veroorzaakt leukemie

3'-5'-cyclisch adenosinemonofosfaat

Caspase-rekruteringsdomein, bemiddelt de vorming van grotere eiwitcomplexen via directe interacties tussen individuele kaarten, betrokken bij de regulatie van caspase-activering en apoptose

Coactivator-geassocieerde arginine (R) methyltransferase 1, methyleert Arg17- en Arg26-residuen op Histon H3

Algemeen tot expressie gebrachte homoloog van Cbl, een zoogdiereiwit dat betrokken is bij celsignalering en ubiquitinatie van eiwitten, genoemd naar Casitas B-lineage lymfoom

CREB-bindend eiwit, een transcriptioneel co-activerend eiwit

Cellulaire differentiatiemarker 2, een celadhesie-eiwit dat wordt aangetroffen op het oppervlak van T-cellen en natuurlijke killercellen

Celdelingskinasen, serine/threoninekinasen, geactiveerd door associatie met cyclinen en betrokken bij de regulatie van de celcyclus, transcriptie en mrna-verwerking

Chromodomein helicase DNA-bindend eiwit 1, interageert met gemethyleerd Lys4 op Histon H3

Een eiwit genoemd naar de circadiane locomotorische output cycli kaput-gen, dat het circadiane ritme reguleert

Chronische myeloïde leukemie, een vorm van leukemie die wordt gekenmerkt door de verhoogde en ongereguleerde groei van voornamelijk myeloïde cellen in het beenmerg en de ophoping van deze cellen in het bloed

Camp-responselement-bindende eiwitten, als transcriptiefactoren, binden aan bepaalde sequenties die camp-response-elementen (CRE) in DNA worden genoemd en daardoor de transcriptie van bepaalde genen verhogen of verlagen

Cytochroom c, een klein heemeiwit geassocieerd met het binnenmembraan van de mitochondriën en afgegeven als reactie op pro-apoptotische stimuli

Death effector-domein, een eiwitinteractiedomein dat wordt aangetroffen in inactieve procaspases en eiwitten die caspase-activering reguleren in de apoptose-cascade

Dehydratase, gevonden in vetzuursyntheasen en polyketidesyntheasen, dehydrateert de P-OH van acylthioester

Deoxyribonuclease, katalyseert de hydrolytische splitsing van fosfodiesterbindingen in de DNA-ruggengraat

Enoylreductase, gevonden in vetzuursyntheasen en polyketidesyntheasen, reduceert de enoyl van enoylthioester tot de verzadigde thioester

Extracellulair signaal-gereguleerd kinase, activeert veel transcriptiefactoren en sommige stroomafwaartse proteïnekinasen, betrokken bij functies zoals de regulatie van meiose, mitose en postmitotische functies in gedifferentieerde cellen

Een van de serineproteasen van het stollingssysteem

Flavine adenine dinucleotide

Fas-geassocieerd eiwit met doodsdomein, verbindt de Fas-receptor en andere doodsreceptoren met caspase-8 via zijn doodsdomein om het doodinducerende signaalcomplex te vormen tijdens apoptose

Forkhead-geassocieerd domein, een fosfospecifiek eiwit-eiwit-interactiemotief dat betrokken is bij controlepuntcontrole van de celcyclus

Een gisttranscriptieadapter met histonacetyltransferase-activiteit

Groen fluorescerend eiwit

G-eiwit-gekoppelde receptor, een transmembraanreceptor die moleculen buiten de cel waarneemt en binnen signaaltransductieroutes en cellulaire reacties activeert

Glycosylfosfatidylinositol, een glycolipide dat tijdens post-translationele modificatie aan het C-uiteinde van een eiwit kan worden bevestigd

Glycogeenfosforylasekinase, een serine/threonine-specifiek eiwitkinase dat glycogeenfosforylase activeert door fosforylering

Groeifactor-receptorgebonden eiwit 2, een adaptereiwit dat betrokken is bij signaaltransductie/celcommunicatie

Histondeacetylasen, verwijder acetylgroepen van een e-N-acetyllysineresten op histonen

Humaan DOTl-achtig eiwit, methyleert histon H3 op Lys79. (DOT1: Gistverstoorder van telomere silencing-1)

Homoloog aan E6-AP C-terminus, bemiddelt E2-binding en ubiquitinatie

Hypoxie-induceerbare factor, een transcriptiefactor die reageert op veranderingen in beschikbare zuurstof in de cellulaire omgeving, met name op afname van zuurstof of hypoxie

Hetergene nucleaire ribonucleoproteïnen, die een complex vormen met pre-MRNA en MRNA en pendelen tussen de kern en het cytoplasma

Heterochromatine-eiwit 1, bindt aan heterochromatine en interageert met tal van partnereiwitten om de hogere-ordestructuur van heterochromatine te organiseren

Immunoglobuline G, één antilichaamisotype

Remmer van NF-Kb-kinase, die remmer van NF-Kb fosforyleert voor de proteasomale afbraak om NF-Kb-dimeren vrij te maken om zich naar de kern te verplaatsen en transcriptie van doelgenen te activeren

Inositolpyrofosfaat, een voorgestelde fysiologische fosfaatdonor

Jmjc-domeinbevattende histondemethylase

Jumonji-domeinbevattend, een nieuw demethylase-signatuurmotief

Ketoreductase, gevonden in vetzuursyntheasen en polyketidesyntheasen, vermindert de β-ketoacylthioester

Ketosynthase, gevonden in vetzuursyntheasen en polyketidesyntheasen, voert CC-bindingsvormende ketenverlengingsstap uit

Lysine-specifieke demethylase 1, demethyleert histon H3 op lysine 9

Mitogeen-geactiveerde proteïnekinase, serine/threonine-specifieke proteïnekinasen die reageren op extracellulaire stimuli (mitogenen) en verschillende cellulaire activiteiten reguleren, zoals genexpressie, mitose, differentiatie en celoverleving/apoptose

MAPK/ERK-kinase, activeert een MAP-kinase of ERK door fosforylering

Monocytische leukemie zinkvingereiwit, een histonacetyltransferase dat betrokken is bij leukemogene en andere tumorverwekkende processen, reguleert de expressie van genen die nodig zijn voor proliferatie en herbevolking van potentieel van stamcellen in het hematopoëtische compartiment

Nicotinamide adenine dinucleotide

Zenuwgroeifactor P1, een uitgescheiden eiwit dat de differentiatie en overleving van bepaalde doelneuronen induceert, behorend tot de neurotrofinen-eiwitfamilie

Eiwit Arg-deiminasen, hydrolyseert de guanidine-zijketen van Arg-residuen tot citrulline-residuen in eiwitten

Poly(ADP-ribose) polymerase-1, katalyseert de overdracht van poly-ADP-ribose naar substraateiwitten door NAD als substraat te gebruiken, betrokken bij cellulaire respons op DNA-schade en DNA-metabolisme

Proteïnekinase A, een familie van kinasen waarvan de activiteit afhankelijk is van het niveau van cyclisch AMP, betrokken bij de regulatie van glycogeen-, suiker- en lipidemetabolisme

Proteïne Arg(R)-methyltransferase, katalyseert de overdracht van de methylgroep van S-adenosylmethionine naar de guanidino-stikstofatomen van arginineresiduen

RIP-geassocieerd ICH-1/CED-3 homoloog eiwit met een doodsdomein, functioneert als een adapter bij het rekruteren van het doodsprotease ICH-1 naar het TNFR-1-signaleringscomplex (ICH: Ice en ced-3 homoloog TNRF: tumornecrosefactor receptor)

Echt interessant nieuw gen. Ringeiwitten zijn componenten van ubiquitine e3-enzymcomplexen.

Vorinostat, suberoylanilide hydroxaminezuur, merknaam Zolinza, een klasse van middelen die histondeacetylaseremmers worden genoemd, als geneesmiddel voor de behandeling van cutaan T-cellymfoom (een type huidkanker)

Skp1-Cullin-F Box, een multi-eiwitcomplex dat de alomtegenwoordigheid van eiwitten katalyseert die bestemd zijn voor proteasomale afbraak

Onderdrukker van schakering-Enhanser van zeste-Trithorax. SET-domeinen hebben methyltranferase-activiteit.

Een nieuw humaan SET-domeinbevattend eiwit, dat specifiek H4 methyleert op Lys20

Een nieuw humaan SET-domeinbevattend eiwit, dat specifiek H3 methyleert op Lys4

Src-homologie 2, een fosfotyrosine-herkenningseiwitdomein van ongeveer 100 aminozuurresiduen dat voor het eerst werd geïdentificeerd als een geconserveerd sequentiegebied tussen de oncoproteïnen Src en Fps

Eiwithomologen van zowel het drosophila-eiwit, moeders tegen decapentaplegic (MAD) en het C. Elegans-eiwit SMA, als signaal-geactiveerde transcriptiefactoren die worden gereguleerd door de TGF-β-superfamilie

Eiwitten die het SET- en MYND-domein bevatten. MYND-gecodeerd mynd (myosine) gen, dat histonmethyltransferase-activiteit heeft

Kleine nucleaire ribonucleoproteïnen, gecombineerd met pre-MRNA en verschillende eiwitten om spliceosomen te vormen om introns uit het pre-MRNA-segment te verwijderen

Son of sevenless, een guanine-nucleotide-uitwisselingsfactor die Ras . activeert

Signaaltransducers en activatoren van transcriptie, eiwitten die betrokken zijn bij de ontwikkeling en functie van het immuunsysteem

Kleine ubiquitine-achtige modifier, een familie van kleine eiwitten die covalent zijn gehecht aan en losgekoppeld van andere eiwitten in cellen om hun functies te wijzigen

TATA box-bindend eiwit-geassocieerde factor 10, een component van het algemene transcriptiefactorcomplex TFIID en het TATA box-bindende eiwit (TBP)-vrije TAF-bevattende complex

Transcriptie-intermediaire factor 2, een transcriptioneel coregulerend eiwit dat verschillende domeinen met nucleaire receptor-interactie en een intrinsieke histonacetyltransferase-activiteit bevat

Transcriptiefactor, een eiwit dat bindt aan een specifiek DNA-gebied door DNA-bindende domeinen en de transcriptie van DNA naar RNA bemiddelt

Transformerende groeifactor |31, een uitgescheiden eiwit dat veel cellulaire functies vervult, waaronder de controle van celgroei, celproliferatie, celdifferentiatie en apoptose, behorend tot de transformerende groeifactor bèta-superfamilie van cytokinen

Trans Golgi-netwerk, een onderdeel van het golgi-apparaat in cellen

Tumornecrosefactor-receptor-geassocieerd eiwit met doodsdomein, een adapter-eiwit dat andere eiwitten rekruteert voor het cytoplasmatische TNF-receptorcomplex (tumornecrosefactor), betrokken bij apoptose

Ubiquitine activerend eiwit

Ubiquitine-bindend geassocieerd domein, een klasse van ubiquitine-bindende domeinen

Ubiquitine-bindend domein, dat mono- of poly-ubiqitine bindt

Ubiquitine-specifieke protease, hydrolyseert zowel lineaire als vertakte Ub-modificaties

Zoals bij alle andere chemische soorten, bepaalt de eiwitstructuur de eiwitfunctie. PTM kan de eiwitfunctie reguleren omdat ze de eiwitstructuur kunnen veranderen. De structuurverandering die door PTM wordt geïntroduceerd, kan lokaal en klein zijn.Methylering van Lys-residuen maakt de zijketen bijvoorbeeld meer hydrofoob zonder de conformatie van de eiwitskelet aanzienlijk te veranderen [tenminste gebaseerd op kristalstructuren waarin gemethyleerde en niet-gemethyleerde histonpeptiden zijn gebonden door een ander eiwit (7)], terwijl fosforylering de conformatie van de ruggengraat kan veranderen binnen een beperkt gebied van een eiwit door ladingsparing met nabijgelegen Arg-residuen of door interactie met hoofdketen NH en spiraalvormige dipool (8). Daarentegen kunnen sommige PTM de algehele structuur van eiwitten dramatischer veranderen, zoals de proteolytische splitsing van eiwitten in kleinere fragmenten of de toevoeging van eiwittags zoals ubiquitine. Deze structuurveranderingen, klein of groot, vormen de basis voor de biologische functies van verschillende PTM en leiden doorgaans tot een of meer van de hieronder beschreven gevolgen.

Veranderen van eiwitstructuur om katalytische activiteit van enzymen in/uit te schakelen

Het bekendste PTM dat veel wordt gebruikt om enzymatische activiteit te reguleren, is fosforylering. Fosforatie reguleert de activiteit van veel enzymen door verschillende mechanismen. Glycogeenfosforylase wordt bijvoorbeeld allosterisch geactiveerd door fosforylering op Ser14, terwijl isocitraatdehydrogenase van Escherichia coli wordt geremd door fosforylering vanwege de blokkering van de substraattoegang tot de actieve plaats (9). De meest interessante en zeer belangrijke katalytische activiteit die wordt gereguleerd door fosforylering is proteïnekinase-activiteit. De meeste eiwitkinasen worden geactiveerd door fosforylering van Thr/Tyr-residu(en) in het activeringssegment. De structurele veranderingen die worden geïnduceerd door fosforylering, die worden geïllustreerd in Fig. 3 met ERK (extracellulair signaal-gereguleerd kinase), zetten de inactieve kinasen om in actieve kinasen (8). De regulatie van eiwitkinase-activiteit door fosforylering heeft een enorme biologische betekenis omdat eiwitfosforylering belangrijk is bij signaaltransductie, en de controle van stroomafwaartse kinase-activiteit via fosforylering door stroomopwaartse kinase is een belangrijke methode om signalen naar stroomafwaartse partners te verspreiden, zoals later zal worden uitgewerkt.

Proteolyse is een andere manier om enzymatische activiteit te beheersen, hoewel de verandering in activiteit onomkeerbaar is, in tegenstelling tot fosforylering. Veel proteasen worden gesynthetiseerd als inactieve voorlopers (zymogenen) die door proteolyse moeten worden gesplitst om actief te worden. Deze voorlopers omvatten proteasen die worden uitgescheiden in spijsverteringskanalen of lysosomen, de katalytisch actieve P-subeenheden in het eukaryote 20S-proteosoom die worden geactiveerd door zelfsplitsing (10), en de effector-caspasen die betrokken zijn bij apoptose die worden geactiveerd door initiator-caspases-mediate decolleté (11).

Figuur 3. Structuur van ERK2 in zowel niet-gefosforyleerde (inactieve) als gefosforyleerde (actieve) toestand. (a) ERK2 in niet-gefosforyleerde staat (figuur gemaakt met PDB 1ERK) residuen Thr183 en Tyr185 in het activeringssegment zijn gelabeld (b) ERK2 in gefosforyleerde staat (ERK-P2, figuur gemaakt met PDB 2ERK). De twee gefosforyleerde resten, pThr183 en pTyr185, zijn gelabeld (c) Superpositie van ERK2 en ERK2-P2.

De eiwitstructuur wijzigen om herkenningsmotieven te creëren of te maskeren

Veel PTM oefenen hun biologische functies uit door herkenningsmotieven te creëren om bindingspartners te werven (12) of door herkenningsmotieven te maskeren om bestaande interacties te verstoren. Gefosforyleerde Ser/Thr-residuen kunnen worden herkend door eiwitten die 14-3-3 domeinen bevatten, FHA (forkhead-associated) domeinen, SMAD [eiwithomologen van zowel het drosophila-eiwit, moeders tegen decapentaplegic (MAD) en het Caenorhabditis elegans-eiwit SMA]-domeinen en verschillende andere domeinen (13). Gefosforyleerde Tyr-residuen kunnen eiwitten rekruteren die SH2 (Src homologie 2) domeinen en PTB (fosfotyrosine bindende) domeinen (14) bevatten. Acetyl Lys-residuen kunnen worden herkend door eiwitten met broomdomeinen (15, 16), en gemethyleerde Lys-residuen kunnen worden herkend door eiwitten met chromodomeinen en Tudor-domeinen (17). De ubiquitine en ubiquitine-achtige eiwittags kunnen ook worden herkend door verschillende eiwitdomeinen die de biologische functie van modificatie met deze eiwittags mediëren (18, 19). De structuren van een paar domeinen gewijd aan de herkenning van post-translationeel gemodificeerde residuen worden getoond in Fig. 4. Typisch hebben domeinen die post-translationeel gemodificeerde residuen herkennen specificiteiten in die zin dat ze niet alleen het gemodificeerde residu herkennen, maar ook de lokale structuur in waarin het residu zich bevindt. De specifieke herkenning van PTM in verschillende contexten is de sleutel om veel biologische gevolgen van PTM te begrijpen, zoals later in bepaalde PTM-secties in meer detail zal worden uitgelegd.

Naast het creëren van herkenningsmotieven om eiwitten te rekruteren, kunnen een paar PTM ook de interactie met andere soorten verhogen, zoals de lipide dubbellaag van verschillende celmembranen. Deze modificaties omvatten de vorming van GPI-verankerde eiwitten (20), eiwitmyristoylering op de a-aminogroep van de N-terminale Gly (21), eiwit C-terminale prennylering op Cys-residuen (22) en eiwitpalmitoylering op Cys-residuen die zich dicht bij het membraanoppervlak (23) bevinden. Deze lipide-modificaties komen voor bij veel signaaleiwitten, waaronder G-eiwit-gekoppelde receptoren en kleine G-eiwitten, en ze spelen een belangrijke rol bij signaaltransductie en membraantransport (24).

Figuur 4. Structuren van enkele speciale domeinen die post-translationeel gemodificeerde residuen herkennen. (a) SH2-domein van v-Src in complex met pTyr-peptide (pTyr-Val-Pro-Met-Leu). Residuen Arg12, Arg32, Ser34, Thr36 en Lys60 van het SH2-domein interageren met pTyr (figuur gemaakt met PDB 1SHA) (b) Bromodomain van gisthistonacetyltransferase Gcn5 in complex met AcLys-peptide (histon H4-residuen 15-29, AK(Ac) )RHRKILRNSIQGI). Broomdomeinresiduen Pro351, Gln354, Tyr364, Met372, Val399 en Asn407 hebben een interactie met AcLys (waarbij een deel van de interactie wordt gemedieerd door watermoleculen, figuur gemaakt met PDB 1 E6I) (c) Chromodomein van HP1 in het complex met histon H3 Me3Lys9 (figuur gemaakt met VOB 1KNE). Chromodomeinresiduen Tyr 24, Trp 45, Tyr 48 en Glu 52 binden Me3Lys(d) UBA-domein van Cbl-b in complex met ubiquitine (figuur gemaakt met PDB 2OOB). UBA-domeinresiduen Asp933, Ala937, Met940, Phe946 en Lys950 interageren met ubiquitineresiduen Leu8, Ile44, Ala46, Gly47, Gln49, His68 en Val70. UBA: ubiquitine binding geassocieerd.

Functionele groepen toevoegen om katalyse mogelijk te maken

Gewoonlijk worden eiwitten gevormd met de meest voorkomende 20 aminozuren, die slechts een beperkt aantal keuzes van functionele groepen bieden voor het katalyseren van verschillende reacties. De limiet in het aantal functionele groepen wordt aangevuld door het gebruik van verschillende co-enzymen of cofactoren, waarvan er vele covalent aan de overeenkomstige enzymen zijn bevestigd. Een klasse PTM met deze functie is de toevoeging van "swinging arm"-prothetische groepen (biotine, fosfopantetheïne en liponzuur) aan eiwitten (25). Biotine wordt gebruikt als drager van CO2 in carboxyleringsreacties, en de disulfidebinding in lipoylgroep wordt gebruikt als een elektronendrager en acyldrager in 2-ketozuurdehydrogenasen. De fosfopantetheïnegroep levert een thiolaat als drager van acylketens en wordt gebruikt in vetzurensynthasen, polyketidesynthasen en niet-ribosomale peptidesynthasen (26). Hoewel Cys ook een thiolaatzijketen kan leveren, kan het langere fosfopantetheïne de acylketens naar verschillende katalytische domeinen pendelen, waardoor meerdere reacties achter elkaar op de acylketens kunnen plaatsvinden (Fig. 5). Deze katalyse met een "swingende arm", die ook mogelijk wordt gemaakt door biotinylering en lipoylering, kan niet worden bereikt door natuurlijke proteïnogene aminozuren met kortere zijketens.

Een ander type PTM verschaft nieuwe functionele groepen voor enzymkatalyse door oxidatie van de zijketen. Deze omvatten TOPA (2,4,5-trihydroxyfenylalanine)-chinon in amine-oxidasen (Fig. 6), tryptofaan-tryptofanyl-chinon in methylaminedehydrogenase (27) en formylglycine in sulfatasen. (28) Modificaties van de hoofdketen kunnen ook prothetische groepen genereren voor enzymkatalyse, zoals de MIO-groep in His/Phe-ammoniaklyase (29, 30) en Tyr-aminomutasen, (31) en de pyruvoylgroep in decarboxylasen (Fig. 6) (32). De vorming van deze cofactoren door PTM vergroot de katalytische kracht van enzymen aanzienlijk, waardoor ze chemie kunnen katalyseren die moeilijk is met alleen de zijketens van de 20 aminozuren die gewoonlijk in eiwitten worden aangetroffen.

Figuur 5. Vetzuurbiosynthese gekatalyseerd door vetzuursynthasen. De groeiende acylketen is vastgemaakt aan het gefosfopeerde-theïnyleerde ACP-domein, waardoor het cycli van condensatie, ketonreductie, dehydratie en enolreductie kan ondergaan die door verschillende domeinen worden gekatalyseerd. AT, acyltransferase ACP, acyl-dragereiwit KS, ketosynthase KR, ketoreductase DH, dehydratase ER, enoylreductase.

Figuur 6. Post-translationeel gegenereerde cofactoren bieden functionele groepen om katalyse mogelijk te maken. De mechanismen van TOPA-chinon in amine-oxidasen, MIO in deaminasen en pyruvamide in decarboxylasen worden getoond.

Eiwitten opsluiten in de juiste structuren of de eiwitstabiliteit verhogen

Het belangrijkste type PTM dat deze functie heeft, is de vorming van eiwitdisulfidebindingen (33). Disulfidebindingen zijn thermodynamisch stabieler dan de gereduceerde thiolen in een oxiderende omgeving. In eukaryoten beginnen eiwitten die de secretieroute ondergaan disulfidebindingen te vormen zodra ze zijn verplaatst naar het endoplasmatisch recticulum (ER) lumen, dat een oxiderende omgeving is. Deze disulfidebindingen helpen de gewenste eiwitstructuur te stabiliseren door het eiwit in een bepaalde conformatie te vergrendelen, en misschien ook om eiwitvouwing te ondersteunen. Veel uitgescheiden eiwitten ondergaan later proteolyse in het Golgi om kleinere fragmenten te geven (zie de sectie over proteolyse hieronder). In dit geval dienen disulfidebindingen ook om de fragmenten covalent te verbinden om een ​​bepaalde structuur te behouden. Een schoolvoorbeeld is insuline, dat wordt geproduceerd als een enkele peptideketen die later verschillende proteolysestappen ondergaat, en de rijpe insuline bestaat uit twee ketens die zijn verbonden via twee disulfidebindingen (Fig. 7) (34). De lichte en zware ketens van antilichamen zijn verbonden door disulfidebindingen. Een ander PTM dat de eiwitstabiliteit kan verhogen, is glycosylering. Er is bijvoorbeeld gevonden dat erytropoëtine N-glycosylering de in vivo levensduur ervan verlengt (35), wat waarschijnlijk komt door de blokkering van de werking van weefselproteasen door koolhydraatmodificaties.

Figuur 7. Rijping van insuline. Insuline wordt gesynthetiseerd als prepro-insuline dat een N-terminale signaalsequentie bevat. Na translocatie naar het ER wordt de signaalsequentie afgesplitst door het signaalpeptidase en de resulterende pro-insuline vouwt zich in een stabiele conformatie. Drie disulfidebindingen worden gevormd tussen cysteïnezijketens. De verbindende sequentie (keten C) wordt in het Golgi afgesplitst door proproteïne-convertasen om het rijpe en actieve insulinemolecuul te vormen, dat vervolgens wordt uitgescheiden.

Verkenning van belangrijke PTM

In deze sectie zullen enkele belangrijke PTM's in meer detail worden onderzocht. Voor elk besproken PTM wordt een korte introductie gegeven over de PTM-reactie en de enzymen die de reactie katalyseren. Enkele biologische processen waarbij het PTM betrokken is, zullen worden uitgelegd om de belangrijke functie van het PTM in de biologie aan te tonen.

Eiwitfosforylering vindt typisch plaats op Ser-, Thr- en Tyr-residuen (Fig. 1), hoewel His- en Asp-residuen ook kunnen worden gefosforyleerd zoals in tweecomponentensignaaltransductiesystemen van bacteriën. De universele fosfaatdonor is adeninetrifosfaat (ATP, figuur 8) en de reactie wordt gekatalyseerd door meer dan 500 kinasen bij mensen. Veel kinasen zijn Ser/Thr-specifiek, sommige zijn Tyr-specifiek, terwijl sommige een dubbele specificiteit hebben. Er werd gemeld dat inositolpyrofosfaat (IP7) ook kan dienen als fosfaatdonor bij eiwitfosforylering (36). De reactie wordt echter niet door enzymen gekatalyseerd en de fysiologische relevantie is nog niet bewezen.

Het grote aantal proteïnekinasen in het menselijk genoom weerspiegelt dat dit PTM algemeen voorkomt en talrijke biologische processen reguleert. De meest goed begrepen functie is signaaltransductie, omdat fosforylering van eiwitten de katalytische activiteit AAN/UIT kan zetten of een herkenningsmotief kan creëren om andere eiwitpartners te rekruteren, waardoor het signaal zich kan voortplanten. In overeenstemming met zijn rol in signaaltransductie, is eiwitfosforylering omkeerbaar, zodat het signaleringsproces indien nodig kan worden beëindigd. De verwijdering van de fosfaatgroep wordt gekatalyseerd door fosfatasen (Fig. 8).

Figuur 8. Kinase-gekatalyseerde fosforylering en fosfatasen-gekatalyseerde defosforylering reacties. (a) Katalytisch mechanisme van eiwitkinasen. (b) Katalytisch mechanisme van bimetallische pSer/pThr of dubbele specificiteit eiwitfosfatasen. (c) Katalytisch mechanisme van pTyr-fosfatasen.

Twee signaleringsprocessen zullen hier worden besproken om te illustreren hoe eiwitfosforylering een cruciale rol kan spelen bij celsignalering. Een meer gedetailleerde beschrijving van deze twee signaalprocessen is te vinden in het leerboek Molecular Cell Biology van Lodish et al. (34). De eerste, die wordt getoond in Fig. 9, omvat proteïnekinase A (PKA), die kan worden geactiveerd door cyclisch AMP (cAMP) (37). PKA in rusttoestand bestaat als een inactief tetrameer dat bestaat uit twee kopieën van een regulerende subeenheid en twee kopieën van de katalytische subeenheid. Hormonen die signalen doorgeven via aan G-eiwit gekoppelde receptoren kunnen het trimere G-eiwit activeren, dat op zijn beurt een effector-enzym, adenylaatcyclase, kan activeren (38). Adenylaatcyclase katalyseert de vorming van cAMP uit ATP (39), wat resulteert in een toename van de cAMP-concentratie. Binding van cAMP aan de regulerende subeenheden van PKA dissociëren het inactieve tetrameer, dat de katalytische subeenheid van PKA vrijmaakt. De katalytische subeenheid kan vervolgens worden geactiveerd door fosforylering bij de activeringslus. Geactiveerde PKA kan veel verschillende substraten fosforyleren en zowel korte- als langetermijneffecten produceren. Kortetermijneffecten komen van de verandering van de katalytische activiteiten van substraateiwitten op fosforylering door PKA. De substraten van PKA omvatten eiwitten die betrokken zijn bij glycogeensynthese en -afbraak, zoals glycogeenfosforylasekinase en glycogeensynthase (40). Fosforylering van deze eiwitten door PKA leidt tot activering van glycogeenafbraak en remming van glycogeensynthese. Langetermijneffecten komen van de veranderingen in gentranscriptie. PKA kan de transcriptie beïnvloeden door CREB (cAMP-responselement-bindende eiwitten) en andere transcriptiefactoren te fosforyleren (41). Bij fosforylering kan CREB binden aan specifieke regio's van het chromosomale DNA en kan het de basale transcriptiemachinerie rekruteren via CBP (CREB bindend eiwit)/P300 om de transcriptie van bepaalde genen te activeren.

Figuur 9. Het signaleringsproces waarbij G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR) en PKA betrokken zijn. (1) Binging van hormoon produceert conformationele verandering in de GPCR (2) GPCR bindt aan Gs eiwit (3) BBP gebonden aan Gs wordt vervangen door GTP en de β en γ subeenheden van Gs dissociëren van de α-subeenheid (4) Gseen subeenheid bindt aan adenylaatcyclase (AC), dat de synthese van cAMP (4a) activeert, het hormoon heeft de neiging te dissociëren en hydrolyse van GTP tot GDP veroorzaakt Gsα dissociëren van adenylaatcyclase en binden aan Gβγ, dat een conformatie van G regenereerts dat kan worden geactiveerd door een GPCR-hormooncomplex (4b) (5) dissociatie van regulerende subeenheden (R) van PKA naarmate de cAMP-concentratie toeneemt (6) daaropvolgende activering van de katalytische subeenheden (C) door fosforylering in de activeringslus genereert de volledig actieve kinase (7) geactiveerd PKA kan glycogeenfosforylasekinase (GPK) en andere enzymen fosforyleren, wat leidt tot activering van glycogeenafbraak en remming van glycogeensynthese en (8) PKA kan transcriptie beïnvloeden door de transcriptiefactor CREB te fosforyleren.

Het tweede voorbeeld van een celsignaleringsproces waarbij eiwitfosforylering betrokken is, is receptortyrosinekinasesignalering (Fig. 10) (42). Receptortyrosinekinasen zijn transmembraaneiwitten met een extracellulair ligandbindend domein en een intracellulair tyrosinekinasedomein. Ligandbinding aan het extracellulaire domein triggert receptordimerisatie en/of activering, zodat de intracellulaire katalytische domeinen van twee receptoreiwitmoleculen elkaar kunnen fosforyleren bij het activeringssegment. Deze transfosforylering activeert het katalytische domein zodat het andere Tyr-residuen in de receptor en andere substraateiwitten kan fosforyleren. Deze gefosforyleerde Tyr-residuen werven vervolgens eiwitbindende partners die SH2- of PTB-domeinen bevatten die specifieke gefosforyleerde Tyr-residuen herkennen. Een van de gerekruteerde eiwitten is Grb2 (groeifactorreceptorgebonden eiwit 2), dat een SH2-domein bevat. Grb2 rekruteert op zijn beurt Sos (zoon van zevenloos), wat een guanine-nucleotide-uitwisselingsfactor is voor het G-eiwit Ras. Sos katalyseert de uitwisseling van Ras-gebonden GDP (guanosine-5'-difosfaat) voor GTP (guanosine-5'-tifosfaat), dat Ras omzet in de geactiveerde vorm. Geactiveerd Ras kan binden aan en activeren Raf, het meest stroomopwaartse kinase in de MAP-kinase (Mitogen-geactiveerde proteïnekinase)-cascade (43). Door fosforylering van MEK (MAPK/ERK-kinase, een MAP-kinasekinase met dubbele specificiteit) op het activeringssegment, activeert Raf MEK, dat op zijn beurt ERK fosforyleert en activeert. Geactiveerd ERK kan veel transcriptiefactoren fosforyleren, wat leidt tot veranderingen in gentranscriptie en uiteindelijk tot celdeling/differentiatie.

De twee hierboven genoemde voorbeelden illustreren basisprincipes hoe eiwitfosforylering specifieke biologische doeleinden dient. Hoewel verschillende kinasen betrokken kunnen zijn bij verschillende routes, is het moleculaire mechanisme voor de regulatie van eiwitfunctie door fosforylering vergelijkbaar: door de eiwitstructuur te veranderen, kan fosforylering de katalytische activiteit van een eiwit AAN/UIT zetten of herkenningsmotief voor binding creëren/maskeren door andere moleculen.

De ongeveer 500 proteïnekinasen in het menselijk genoom reguleren tal van biologische processen. Dientengevolge kan deregulering van eiwitfosforylering leiden tot verschillende ziekten, waarvan kanker de meest prominente is. Dienovereenkomstig wordt gezocht naar kinaseremmers voor het behandelen van verschillende kankers. Een goed begrepen voorbeeld is chronische myeloïde leukemie, die wordt veroorzaakt door een chromosomale afwijking die een kinase ABL (gecodeerd door het Abelson-gen) fuseert met een ander BCR-eiwit (gecodeerd door het breekpuntclustergebied-gen) (44). Het BCR-ABL-fusie-eiwit bleek voldoende te zijn om chronische myeloïde leukemie bij muizen te veroorzaken. Imatinibmesylaat (Gleevec Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ) is een klinisch gebruikte BCR-ABL-remmer voor de behandeling van CML (chronische myeloïde leukemie). De hierboven genoemde receptortyrosinekinase en MAP-kinase-signaleringsroute zijn sleutelroutes die celproliferatie en differentiatie vaak reguleren, tumorcellen hebben mutaties in eiwitten die bij deze route zijn betrokken (45). Deze route is dus intensief bestudeerd voor het zoeken naar geneesmiddelen tegen kanker. Andere kinasen, zoals celdelingskinasen (CDK's), zijn ook het doelwit van therapieën (46).Bovendien, omdat fosfatasen de effecten van kinasen omkeren, zijn mutaties in fosfatasen geïndiceerd bij menselijke ziekten zoals kanker, diabetes en neurologische aandoeningen (47).

Figuur 10. Receptor tyrosinekinase signaleringsproces en de activering van MAP Kinase. (1) Binding van hormoon aan de receptor veroorzaakt activering van de kinase-activiteit van de receptor, wat leidt tot fosforylering van Tyr-residuen (2) pTyr-residuen rekruteren GRB2, die op zijn beurt Sos rekruteren (3) Sos bevordert de uitwisseling van GTP voor GDP in Ras, wat leidt tot het actieve Ras-GTP-complex. Vervolgens dissocieert Sos van de actieve Ras (4) actieve Ras bindt aan en activeert de kinase Raf (4a) en hormoon kan dissociëren van de receptor (4b) (5) geactiveerde Raf fosforyleert en activeert MEK (6) geactiveerde MEK fosforyleert en activeert van MAP-kinase (7) geactiveerd MAP-kinase kan transcriptiefactoren (TF) fosforyleren en (8) gefosforyleerde translatiefactoren binden aan DNA en leiden tot veranderingen in gentranscriptie en uiteindelijk celdeling/differentiatie.

Acetylering van Lys-residuen is een zeer bekende PTM vanwege histonacetylering, die betrokken is bij transcriptionele regulatie van genen. De acetylgroep komt van Acetyl-CoA en typisch is de acetylacceptor Lys-residuen (Fig. 11). Histonacetylering correleert met transcriptie-activering en dienovereenkomstig zijn histonacetyltransferasen (HAT's) normaal gesproken multidomein-eiwitten die zijn geassocieerd met transcriptieactivator/coactivator-complexen (48). De correlatie van histonacetylering met transcriptieactivering kan worden verklaard door de relaxatie van de chromatinestructuur op histonacetylering en de rekrutering van andere eiwitten via acetyl Lys. In eukaryote cellen bestond de chromosomale DNA-wikkel rond histonoctameren in de kern uit twee kopieën van elk histon H2A, H2B, H3 en H4 (49). Het complex gevormd tussen het histon-octameer en het bijbehorende DNA wordt een nucleosoom genoemd. Nucleosomen kunnen in een meer gecondenseerde structuur worden verpakt. Er zijn aanwijzingen dat de strakke pakking transcriptie onderdrukt, terwijl transcriptie-activering correleert met een ontspannen chromatinestructuur. De N-terminale staarten van de histonen hebben veel Lys- en Arg-residuen, naast andere residuen, die post-translationeel kunnen worden gemodificeerd. Er is geen gedetailleerde structuurinformatie beschikbaar om uit te leggen hoe histon-staartmodificatie de nucleosoomverpakking beïnvloedt. Intuïtief kan het maskeren van de positieve ladingen op histonen door Lys-acetylering echter de interactie met negatief geladen DNA verminderen, waardoor de chromatinestructuur losser wordt (50). Bovendien kunnen geacetyleerde Lys-residuen worden herkend door eiwitten die broomdomeinen bevatten (Fig. 4) (16, 51), die dienen om andere eiwitten te rekruteren (inclusief chromatine-remodelleringscomplexen) die helpen de transcriptie van het gen te activeren.

Histonacetylering beïnvloedt niet alleen de transcriptie, maar beïnvloedt ook andere processen waarbij DNA betrokken is, zoals nucleosoomassemblage, heterochromatievorming en DNA-reparatie (52). De acetylering/deacetylering van verschillende Lys-residuen kan verschillende biologische effecten hebben. Histon H4 Lys5, 8 en 12 acetylering zijn bijvoorbeeld betrokken bij nucleosoomassemblage, H4 Lys16-acetylering heeft geen invloed op nucleosoomassemblage maar is betrokken bij transcriptieactivering (52), terwijl recent is aangetoond dat H4 Lys56 genoomstabiliteit en DNA-herstel bevordert in gist (53, 54).

Andere eiwitten dan histonen kunnen ook worden gemodificeerd door Lys-acetylering. Veel transcriptiefactoren, cytoskeleteiwitten, metabole enzymen en signaaleiwitten zijn geacetyleerd (55). Van transcriptiefactoren is bekend dat ze substraten zijn van HAT's, terwijl de enzymen die verantwoordelijk zijn voor de acetylering van niet-nucleaire eiwitten in veel gevallen niet goed bekend zijn (55). Het aantal eiwitten dat wordt gereguleerd door acetylering zal blijven toenemen naarmate de methode om eiwitacetylering te detecteren verbetert. Acetylering van niet-histoneiwitten kan de eiwit-eiwitinteractie veranderen, de enzymatische activiteit reguleren en de eiwitstabiliteit verhogen door ubiquitinylering te onderdrukken (55).

Lys-acetylering kan worden omgekeerd door de werking van deacetylasen. Veel deacetylasen zijn Zn-afhankelijke enzymen die Zn2+ in de actieve plaats gebruiken om watermoleculen te activeren om de amidebinding te hydrolyseren (Fig. 11) (56). Onlangs is een ander type deacetylasen geïdentificeerd dat afhankelijk is van nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD), ook bekend als sirtuins (57, 58). Hun unieke vermogen om NAD-degradatie te koppelen aan Lys-deacetylering (Fig. 11) suggereert dat dit type enzym de metabolische toestand (bijvoorbeeld NAD-concentratie) van de cel kan detecteren en die informatie kan gebruiken om de acetyleringstoestand en dus de functie van de substraateiwitten.

Naast Lys-zijketenacetylering, kan eiwit N-terminaal ook worden geacetyleerd (59). In eukaryote cellen wordt het eerste residu Met in de meeste eiwitten gesplitst door N-terminaal methioninepeptidase. De nieuw vrijgekomen N-terminale aminogroep wordt vervolgens geacetyleerd. Deze modificatie kan co-translationeel gebeuren voordat de rijpe peptideketen uit het ribosoom wordt vrijgegeven. De functie van deze modificatie wordt in de meeste gevallen nog steeds niet begrepen, hoewel deletie van de genen die betrokken zijn bij deze modificatie duidelijke fenotypes heeft (59).

Vanwege de betrokkenheid van eiwit-Lys-acetylering bij de regulatie van transcriptie, eiwit-eiwitinteractie, enzymatische activiteit en eiwitstabiliteit, is de deregulatie van eiwitacetylering in verband gebracht met vele ziekten, zoals kanker en neurodegeneratie (60, 61). Bij kanker worden vaak mutaties in histonacetyltransferasen gevonden (60). Van chromosomale afwijkingen die fusies van acetyltranferasen genereren, is bekend dat ze leiden tot acute myeloïde leukemie. Deze afwijkingen omvatten de fusies van MOZ (monocytische leukemie-zinkvingerproteïne) met CBP (CREB-bindend eiwit) of p300, en fusie van MOZ met de transcriptiefactor TIF2 (transcriptie-intermediaire factor 2) (60). MOZ, CBP, p300 en TIF2 bevatten allemaal histonacetyltransferasedomeinen. Vermoedelijk verstoort het genereren van deze afwijkende fusie-eiwitten het normale gentranscriptieprofiel, wat leidt tot leukemie. Er wordt ook gesuggereerd dat deregulering van histondeacetylasen geassocieerd is met kanker (61). Een histondeacetylaseremmer, SAHA (Vorinostat, Merck & Co., Inc, Whitehous Station, NJ), werd onlangs goedgekeurd door de Food and Drug Administration voor de behandeling van cutaan T-cellymfoom (62).

Figuur 11. (a) Lys-acetylering gekatalyseerd door acetyltransferasen (b) mechanisme van Zn-afhankelijke HDACs-gekatalyseerde deacetylering (c) mechanisme van sirtuins-gekatalyseerde deacetylering.

Hoewel methylering kan plaatsvinden bij verschillende residuen (3, 63), is de meeste aandacht besteed aan proteïne Lys/Arg-methylering omdat de methylering van Lys/Arg in histonen de gentranscriptie regelt. Voor Lys- en Arg-methylering kunnen meerdere methylgroepen worden toegevoegd aan hetzelfde Lys- of Arg-residu (Fig. 12). De methylgroep is afkomstig van S-adenosylmethionine (SAM), een veelzijdig klein molecuul dat bij veel enzymatische transformaties wordt gebruikt (64). Bijna alle Lys-methyltransferasen behoren tot de SET-familie (Suppressor of Variegation-Enhanser of Zeste-Trithorax) van de methyltransferasen, terwijl de proteïne Arg-methyltransferasen tot een andere klasse behoren (65-67). Zowel histon Lys/Arg methylering en acetylering zijn geassocieerd met transcriptieregulatie. In tegenstelling tot histonacetylering, dat gewoonlijk correleert met transcriptieactivering, kan histonmethylering ofwel tot transcriptieactivering ofwel tot onderdrukking leiden (17, 68). Het effect van histonmethylering, dat gebaseerd is op de huidige inzichten, wordt gemedieerd door eiwitten die worden gerekruteerd door gemethyleerde Lys- of Arg-residuen. Van Tudor-domeinen en chromodomeinen is bekend dat ze gemethyleerde Lys/Arg-residuen herkennen via zowel ladingsinteractie als kation-n-interactie (69-73). Het gemethyleerde Lys/Arg-residu is meer hydrofoob en sterisch omvangrijker dan vrij Lys/Arg en kan worden onderscheiden door de domeinen die gemethyleerde Lys/Arg-residuen herkennen (69, 74). Sequenties die de methylaat Lys-residuen omringen, worden ook gelezen door de chromodomeinen en Tudor-domeinen (69-71). Deze bevinding verklaart waarom verschillende Lys-residuen verschillende eiwitten kunnen rekruteren bij methylering en dus verschillende biologische effecten hebben. H3K4-methylering activeert bijvoorbeeld transcriptie door chromodomein helicase DNA-bindend eiwit 1 (CHD1) specifiek in gist te rekruteren, terwijl H3K9-methylering transcriptie onderdrukt door heterochromatine-eiwit 1 (HP1) (75-77) te rekruteren.

Van niet-histoneiwitten is bekend dat ze worden gemethyleerd op Lys-residuen, waaronder transcriptiefactoren, zoals p53 (78-80), TAF10 (TATA-box-bindend eiwit-geassocieerde factor 10) (81) en translatiefactoren (63). Het p53-eiwit kan worden gemethyleerd door verschillende methyltransferasen [Set9, (78) Smyd2 (79) en Set8 (80)] op verschillende Lys-residuen (respectievelijk Lys372, 370 en 382). Deze verschillende methyleringsgebeurtenissen activeren of onderdrukken p53-activiteit. Arg-methylering is vaak gevonden in niet-histoneiwitten. Er is bijvoorbeeld gerapporteerd dat PRMT1 de transcriptiefactor STAT1 (signaaltransducers en activatoren van transcriptie) (82), PRMT4/CARM1 [coactivator-geassocieerde arginine(R)-methyltransferase 1] kan methyleren CBP/p300 (83), en heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen (hnRNP's) en kleine nucleaire ribonucleoproteïnen (snRNP's) die betrokken zijn bij pre-mRNA-splitsing zijn ook Arg-gemethyleerd (67). De biologische functies van deze Lys/Arg-methyleringen kunnen in de meeste gevallen ook worden verklaard door het effect van methylering om interactie met andere eiwitten of nucleïnezuren te blokkeren of te creëren.

In vergelijking met acetylering is methylering stabieler. Om deze reden werd gedacht dat methylering een permanent epigenetisch kenmerk zou kunnen zijn. De recente ontdekking van twee soorten Lys-demethylasen suggereert dat methylering ook een omkeerbare PTM is. Het eerste Lys-demethylase dat is ontdekt, is LSD1 (lysine-specifiek demethylase 1), dat een FAD (flavine-adenine-dinucleotide)-afhankelijk enzym is, vergelijkbaar met amine-oxidasen (Fig. 12) (84). Er wordt aangenomen dat LSD1 een twee-elektron oxidatiemechanisme gebruikt en dus geen tri-gemethyleerde Lys-residuen kan demethyleren (85). Het tweede type Lys-demethylase, dat het JmjC-domein (Jumonji-domeinbevattende) bevat, is een niet-heem Fe(II)-afhankelijk enzym dat in staat is tot oxidatie van één elektron, en dus kan het getrimethyleerde Lys-residuen demethyleren (86) . Er werd voorgesteld dat het effect van Arg-methylering wordt omgekeerd door eiwit Arg-deiminase 4 (PAD4), dat citrulline genereert via demethyliminatie (87, 88). Latere onderzoeken geven echter aan dat PAD4 en andere PAD-enzymen in vitro demethyliminatie niet met merkbare snelheden katalyseren (88-91). Een recent rapport toonde aan dat Arg-methylering echt kan worden teruggedraaid door het JmjC-domein dat demethylasen bevat, wat suggereert dat PAD's waarschijnlijk niet nodig zijn voor Arg-demethylering (92). Dus zowel Lys- als Arg-methylering zijn omkeerbare modificaties.

Net als bij Lys-acetylering, wordt een afwijking in de methylering van Lys beschouwd als een factor die bijdraagt ​​aan kanker (93, 94). Afname van H3 Lys9 en H4 Lys20 trimethyaltion wordt gevonden in kankercellen. Zowel H3 Lys9- als H4 Lys20-methylering zijn geassocieerd met heterochromatinevorming. Vermoedelijk leidt de afname van de methylatie tot defecten in heterochromatinevorming, wat op zijn beurt leidt tot chromosomale instabiliteit en tumorvorming (93). Histon-methyltransferase-fusie-eiwitten die worden gegenereerd door chromosomale translocatie worden vaak aangetroffen bij leukemie en men denkt dat ze bijdragen aan de ontwikkeling van leukemie. Bijvoorbeeld, de H3 Lys79 methyltransferase hDOT1L (humaan DOT1-achtig eiwit) fusie gevonden in gemengde afstammingsleukemie is voldoende om leukemische transformatie te veroorzaken (95). De nauwe associatie van methylering en kanker suggereert dat eiwit-methyltranferasen en demethylasen potentiële therapeutische doelen kunnen zijn.

Figuur 12. (a) Lys/Arg N-methylering (b) mechanisme van FAD-afhankelijke LSDI-gekatalyseerde Lys-demethylering (c) mechanisme van Fe-afhankelijke JHDM (JmjC-domein-bevattende histondemethylase)-gekatalyseerde demethylering.

In eukaryote cellen vindt glycosylering plaats met veel membraan- en uitgescheiden eiwitten (d.w.z. eiwitten die door de ER- en de Golgi-secretaresseroute gaan). Glycosylering kan plaatsvinden op Asn-residuen (N-glycosylering, Fig. 13), Ser/Thr en post-translationeel gehydroxyleerde Lys- en Pro-residuen (O-glycosylering, Fig. 14), of Trp-residuen (C-glycosylering, Fig. 14 ). N-glycosylering is een gecompliceerd proces en omvat drie fasen: 1) de vorming van donorsubstraat met 14 suikereenheden (GlC3Man9GlcNAc2-PP-dolichol), die zowel in de cytosolische als de luminale zijde van ER voorkomt (96) 2) de overdracht van de tetradecasaccharylgroep naar de Asn-residuen gevonden in de consensussequentie Asn-X-Ser/Thr, die voorkomt in de ER (97) en 3) de hydrolytische verwijdering van de terminale suikerresiduen op het tetradecasaccharide, de toevoeging van meer suikereenheden (Fig. 13) (98), en de sulfatering en fosforylering van de koolhydraatgroepen in het ER en Golgi (99). De latere trimstappen kunnen verschillende sets van N-gebonden koolhydraten genereren, zoals de glycanen van het hoge mannose-type, de glycanen van het complexe type en de glycanen van het hybride type (Fig. 13) (99). Elke fase wordt bereikt door de functie van meerdere eiwitten. Er zijn bijvoorbeeld tot negen eiwitten nodig voor de overdracht van de tetradecasaccharylgroep in gist (100).

Figuur 13. Eiwit N-glycosylering. (1) De vorming van het donorsubstraat met 14 suikereenheden (Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol) (2) het reactieschema dat de overdracht van de tetradecasaccharylgroep naar de Asn-residuen in de consensussequentie Asn-X-Ser/Thr in eiwitten laat zien (3) hydrolytische verwijdering van de terminale suikerresiduen op het tetradecasaccharide en toevoeging van meer suikereenheden in de ER en Golgi. OSTase, oligosacryltransferase.

Figuur 14. O- en C-glycosyleringsreacties. UDP, uridinedifosfaat.

Anders dan N-glycosylering, begint O-glycosylering met de toevoeging van een enkel suikerresidu, wat kan worden gevolgd door de toevoeging van meer suikers (101). Net als bij N-glycosylering, vindt de meeste O-glycosylering ook plaats bij eiwitten die door ER en Golgi gaan. De toevoeging van een enkel GlcNAc-residu aan Ser/Thr is echter een type O-glycosylering dat optreedt bij cytosolische eiwitten (102). Deze cytosolische O-glycosylering heeft de laatste tijd veel aandacht getrokken omdat het de activiteit van de substraateiwitten kan reguleren, vooral omdat het kan concurreren met eiwitfosforylering voor dezelfde Ser/Thr op substraateiwitten (103).

C-glycosylering is de toevoeging van een enkele mannosylgroep aan de indool C-2-positie van Trp-residuen van membraan en uitgescheiden eiwitten (104). Het Trp-residu dat C-gemannosyleerd is, bevindt zich in een consensus Trp-X-X-Trp-sequentie en het eerste Trp is C-gemannosyleerd. Ongeveer een dozijn eiwitten bij mensen zijn C-gemannosyleerd. Het enzym dat de modificatie katalyseert is nog niet gekloond en momenteel is de functie van deze modificatie niet duidelijk.

Het grote aantal enzymen dat betrokken is bij eiwitglycosylering en het feit dat deze gecompliceerde N-glycosyleringsroute door alle eukaryote soorten wordt geconserveerd, suggereert dat glycosylering belangrijke functies heeft. Een tekort aan eiwitglycosylatie veroorzaakt verschillende ziekten bij de mens, zoals lysosomale stapelingsziekten (105), aangeboren aandoeningen van glycosylering en leukocytenadhesiedeficiëntie II (106). Bovendien zijn veranderingen in glycosyleringspatronen geassocieerd met kanker en ontsteking (107). Eiwitglycosylering kan verschillende biologische doeleinden dienen. Eén doel is om eiwitten die door de secretieroute gaan, te helpen correct te vouwen. In het bijzonder is bekend dat de verwijdering van het glucoseresidu door glucosidase II en de reglucosylering in het ER de uitgescheiden eiwitten helpen vouwen en ervoor zorgen dat alleen correct gevouwen eiwitten worden uitgescheiden (Fig. 15) (108). Van proteïne O-fucosyltransferase I dat het Notch-eiwit modificeert, werd gerapporteerd dat het chaperon-activiteit heeft die de vouwing en secretie van Notch helpt, en deze chaperon-activiteit is onafhankelijk van zijn katalytische activiteit (109). Glycosylering is ook belangrijk voor het sorteren van uitgescheiden eiwitten. De fosforylering van de mens op N-glycan (Fig. 16) creëert bijvoorbeeld een herkenningssignaal voor het sorteren van lysosomale eiwitten naar lysosoom. Van glycosylering wordt ook aangenomen dat het de eiwitstabiliteit verhoogt, zoals is aangetoond voor het eerder genoemde erytropoëtine. Van glycosylering wordt ook voorgesteld dat het de interactie van de ligandreceptor beïnvloedt en zo de cel-celsignalering reguleert. Een gedetailleerd moleculair begrip van het effect van glycosylering op ligandreceptorinteractie is in de meeste gevallen echter moeilijk te verkrijgen. In twee goed bestudeerde gevallen, humaan CD2 (cellulaire differentiatiemarker 2) en IgG (immunoglobuline G), blijkt N-glycosylering de interactie met hun liganden of receptoren te beïnvloeden. Structurele gegevens laten zien dat het koolhydraatgedeelte niet rechtstreeks contact maakt met de bindingspartner. In plaats daarvan beïnvloedt glycosylering de binding door de conformatie van de geglycosyleerde eiwitten te veranderen (110-112).

Figuur 15. N-glycosylering helpt uitgescheiden eiwit om correct te vouwen in het ER.

Figuur 16. Foforylering van de mens op N-glycaan. UMP, uridinemonofosfaat.

Ubiquitine is een overvloedig klein eiwit (76 aminozuren) dat in alle eukaryoten wordt aangetroffen. Het kan covalent aan veel eiwitten worden geconjugeerd en reguleert belangrijke biologische processen. De toevoeging van ubiquitine aan substraateiwitten gaat via een E1-E2-E3 enzymatische cascade (Fig. 17) (113). E1, ook wel ubiquitine-activerend eiwit (UAP) genoemd, gebruikt ATP om de C-terminale Gly van ubiquitine te adenyleren en vangt vervolgens het geactiveerde ubiquitine met een Cys-residu op de actieve plaats. De meeste eukaryote soorten hebben slechts één E1-enzym dat verantwoordelijk is voor het activeren van alle benodigde ubiquitine-moleculen. Het ubiquitine-E1-conjugaat wordt dan herkend door enkele tientallen E2-enzymen, die ubiquitine uit El vangen via een transthioleringsreactie. De ubiquitine-geconjugeerde E2-enzymen worden vervolgens herkend door veel verschillende E3-enzymen, die de substraateiwitten rekruteren en ubiquitine van E2 naar Lys-residuen van de substraateiwitten overbrengen, direct of indirect (Fig. 17). Er bestaan ​​twee grote families van E3-enzymen: de RING (echt interessant nieuw gen) E3's en HECT (homoloog aan E6AP C-terminus) E3's. De Pfam-database bevat meer dan 400 RING-eiwitten en 70 HECT-eiwitten. Veel E3's vormen complexen met andere eiwitten. Een goed begrepen E3-complex is de SCF (Skp1-Cullin-F Box) RING E3, waarvoor een kristalstructuur werd gerapporteerd (114). Bij mensen zijn er meerdere Cullins en meerdere F Box-eiwitten (115). Gezien de verschillende combinaties kan het aantal mogelijke E3-complexen veel meer zijn dan het aantal E3-enzymen (3). E3's beslissen welke substraateiwitten alomtegenwoordig worden, dus het grote aantal E3's en E3-complexen weerspiegelt de diverse substraateiwitten die moeten worden herkend.

Ubiquitine zelf heeft 7 Lys-residuen (Lys6, 11, 27, 29, 33, 48 en 63) die kunnen worden gebruikt voor ubiquitine-aanhechting, wat leidt tot polyubiquitylering van substraateiwitten. Polyubiquitineketens samengesteld via verschillende Lys-residuen hebben verschillende biologische functies (116), zoals later zal worden uitgelegd. Welk Lys-residu in de polyubiqutineketen wordt gebruikt, wordt gecontroleerd door de specifieke betrokken E3. E3 regelt vermoedelijk ook de lengte van de polyubiquitineketen, hoewel het gedetailleerde kettingassemblagemechanisme nog steeds niet duidelijk is (117). Ubiquitylering kan worden teruggedraaid door de werking van ubiquitine-specifieke proteasen (UBP's). Er bestaan ​​ongeveer 60 UBP's in het menselijk genoom, die vermoedelijk verschillende soorten ubiquitine-modificaties op verschillende cellulaire locaties herkennen (118).

De biologische functie van ubiquitylering werd oorspronkelijk erkend als het richten van eiwitten op het proteasoom voor afbraak. Het belang van deze functie kan aan de hand van vele voorbeelden worden geïllustreerd. Bij celdeling wordt de voortgang door de celcyclus aangedreven door celdelingskinasen, waarvan de activiteiten worden gecontroleerd door een groep eiwitten die cyclinen worden genoemd. Verschillende cyclinen functioneren alleen in bepaalde stadia van de celcyclus. Vervolgens moeten ze worden afgebroken, wat polyubiquitylering door specifieke E3-enzymen vereist (119). Aberratie in de alomtegenwoordigheid en afbraak van cyclinen wordt geassocieerd met kanker. Verkeerd gevouwen eiwitten moeten worden afgebroken door het ubiquitine- en proteasoomsysteem. Het is bekend dat aggregatie van verkeerd gevouwen eiwitten neurodegeneratie veroorzaakt, zoals de ziekte van Parkinson (116). Ubiquitylering en proteasoomafbraak van eiwitten zijn ook belangrijk voor andere biologische processen, zoals hypoxie en circadiane klok. Ubiquitylering is vereist voor de afbraak van hypoxia-induceerbare factor (HIF) bij hydroxylering bij hoge zuurstofniveaus (120). Het handhaven van de circadiane klok vereist de ubiquitylering en afbraak van eiwitten die de CLOCK-transcriptiefactor (een eiwit genoemd naar het kaput-gen van de circadiane locomotoroutputcycli) remmen (121).

Het wordt duidelijk dat de biologische functie van ubiquitylering niet beperkt is tot proteasoomafbraak. Er zijn andere functies ontdekt, zoals het bevorderen van endocytose van membraaneiwit, het richten van membraaneiwit op lysosoom voor afbraak en het reguleren van cytoplasma/nucleaire shuttle (116, 122). Er wordt nu algemeen aangenomen dat polyubiquitylering via Lys48 van ubiquitine een signaal is voor proteasomale afbraak, en deze actie vereist minimaal 4 ubiquitine-eenheden in de keten (123). Daarentegen signaleren monoubiquitylering, meervoudige monoubiquitylering op verschillende Lys-residuen van substraateiwitten en polyubiquitylering via Lys 63 van ubiquitine typisch proteasoomonafhankelijke routes (116). Hoe kunnen zoveel verschillende functies worden bereikt? De diverse sets van ubiquitine bindende domeinen (UBD's) bieden de moleculaire verklaring voor deze vraag (19). Vermoedelijk herkennen verschillende UBD's verschillende soorten ubiquitine-modificaties (monoubiquitylering versus polyubiquitylering en Lys48-gekoppelde versus Lys63-gekoppelde polyubiquitylering, bijvoorbeeld), en dus bemiddelen ze verschillende functionele gevolgen van ubiquitylering. UBD op gisteiwitten Rad23, Rpd10 en Dsk2 herkennen de Lys48-gekoppelde polyubiquitineketen en leveren de gemodificeerde substraateiwitten aan het 26S-proteasoom (124). De UBD op de vacuolaire eiwitten herkennen monoubiquitylering of Lys63-gekoppelde polyubiquitineketen op membraaneiwitten, die hun sortering in lysosoom of vacuole mediëren. Er is voorgesteld dat binding van de Lys63-gekoppelde polyubiqutine-keten aan een remmer van NF-KB-kinase (IKK) door andere eiwitten IKK activeert en zo NF-KB-signalering inschakelt (116). De herkenning van ubiquitine door UBD's kan ook enkele "ongewone" functies van ubiquitylering van eiwitten verklaren. Lys48-gekoppelde polyubiquitylering van een gisttranscriptiefactor Met4p signaleert bijvoorbeeld niet voor proteasoomafbraak, maar inactiveert in plaats daarvan de transcriptiefactor. Het inactiveert de transcriptiefactor omdat Met4p een in-cis UBD heeft die de ubiquitineketen bindt en dus zichzelf inactiveert en de proteasomale route blokkeert (125).

In generalisatie van de functie van ubiquitylering kunnen we zeggen dat ubiquitine een "informatierijke eiwittag" is die kan worden gelezen door verschillende eiwitten die UBD-domeinen bevatten (3), en het exacte gevolg van ubiquitylering wordt bepaald door hoe de tag is erkend. Naast ubiquitine hebben eukaryote cellen ook ongeveer een dozijn bekende ubiquitine-achtige eiwittags, waarbij SUMO de best bestudeerde is. Bovendien hebben veel eiwitten ingebouwde ubiquitine-achtige domeinen. De logica die ten grondslag ligt aan de biologische functies van deze ubiquitine-achtige eiwitten/domeinen zal waarschijnlijk dezelfde zijn als wat wordt geleerd van ubiquitine (3).

Afbeelding 17. Ubiquitylering gekatalyseerd door de E1, E2, E3-cascade.

Hydrolytische splitsing van eiwitten door proteasen is een onomkeerbare PTM. Het grote aantal (meer dan 500) proteasen in het menselijk genoom geeft aan dat proteolyse vaak voorkomt. Proteasen kunnen worden ingedeeld in vier typen op basis van katalytische mechanismen (Fig. 18): Ser/Thr-proteasen, Cys-proteasen, Asp-proteasen en metalloproteasen.

Figuur 18. Katalytisch mechanisme van verschillende proteasen.

Op het eerste gezicht lijkt proteolyse misschien een ongecontroleerd vernietigingsproces te zijn, zoals de vertering van voedseleiwitten in de darm. In feite wordt proteolyse in cellen streng gereguleerd. Zelfs proteasen die in het spijsverteringskanaal worden uitgescheiden, moeten worden gecontroleerd om zelfvernietiging te voorkomen. Gewoonlijk worden proteasen gemaakt in de inactieve vormen (zymogenen) die kunnen worden geactiveerd door proteolyse. Binnen eukaryote cellen bestaan ​​twee belangrijke locaties voor proteolytische afbraak van ongewenste eiwitten: het 26S-proteosoom en het lysosoom (126, 127). Toegang tot de twee afbraakorganellen wordt streng gecontroleerd. Het lysosoom is een zure membraanorganel die veel proteasen bevat en verantwoordelijk is voor de afbraak van endocytose-membraaneiwitten, zoals geactiveerde receptortyrosinekinasen en aan G-eiwit gekoppelde receptoren die alomtegenwoordig zijn en worden gesorteerd op het lysosoom (beschreven in de sectie ubiquitylering). Het lysosoom kan ook endocytose of gefagocyteerde bacteriële en virale eiwitten afbreken (128). Bij autofagie is het lysosoom verantwoordelijk voor het afbreken van cellulaire organellen en sommige cytosolische eiwitcomplexen (126). Het 26S-proteosoom (Fig. 19) heeft een 20S-degradatiekamer die uit vier ringen bestaat α β β α (129). In eukaryoten heeft elke a-ring zeven verschillende a-subeenheden, en elke α-ring heeft zeven verschillende β-subeenheden. Drie β-subeenheden zijn katalytisch actieve Thr-proteasen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van substraateiwitten. Door deze kamer te vormen, worden de actieve plaatsen van de proteasen in de kamer begraven om proteolyse van eiwitten die niet mogen worden verteerd te voorkomen. De toegang tot de degradatiekamer wordt geregeld door het 19S-regelgevingscomplex dat beide uiteinden van de degradatiekamer afdekt. Het regulerende complex bevat subeenheden die polyubiquity-substraten herkennen, subeenheden die de ubiquitine-tag recyclen en subeenheden die ATP-hydrolyse gebruiken om het eiwit te ontvouwen en naar de afbraakkamer te verplaatsen. Het tijdig afbreken van de ongewenste eiwitten door het 26S-proteasoom of lysosoom is erg belangrijk. cyclinen die celdelingskinasen activeren, moeten bijvoorbeeld op specifieke tijdstippen door het proteasoom worden gepolyubiquityleerd en afgebroken om de voortgang van de celcyclus te stimuleren (119). Afbraak van geactiveerde membraanreceptoren in het lysosoom is belangrijk om overstimulatie te voorkomen (130, 131). Verkeerd gevouwen eiwitten moeten worden afgebroken door het proteasoom of lysosoom (in autofagie). Als u dit niet doet, wordt gedacht dat het bijdraagt ​​aan neurodegeneratiestoornissen zoals de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer (126).

Figuur 19. Het eukaryote 26S-proteasoom. Subeenheidsamenstellingen van het 19S-regulerende deeltje van Saccharomyces cerevisiae worden aan de linkerkant getoond. De a- en p-ringen van het 20S-proteasoom, die elk uit zeven verschillende subeenheden bestaan, zijn opgenomen om aan te geven hoe het base 19S-complex is gekoppeld aan het kern 20S-proteasecomplex. De kristalstructuur van de degradatiekamer van de jaren 20 wordt zowel in zij- als bovenaanzicht getoond (figuur gemaakt met PDB 1RYP).

Naast de "destructieve" proteolyseprocessen in het proteasoom en lysosoom, vinden er veel "constructieve" proteolyseprocessen plaats in cellen. In zowel prokaryoten als eukaryoten bevatten uitgescheiden eiwitten een signaalpeptide aan de N-terminus die ze naar de secretieroute leidt. Dit signaalpeptide moet later worden gesplitst door signaalpeptidasen (typisch serineproteasen) zodat het eiwit verder kan gaan in de secretieroute (132). Veel uitgescheiden eiwitten, waaronder insuline, TGFβ1 (transformerende groeifactor β1), zenuwgroeifactor β1, albumine, Factor IX, insulinereceptor en Notch, bevatten ook een propeptide dat wordt gesplitst door proproteïneconvertasen in het Golgi (133). Selectieve proteolyse vindt ook plaats op het celmembraan in signaaltransductieprocessen. Notch-eiwit wordt bij binding aan zijn ligand Delta/Jagged (membraaneiwitten op aangrenzende cellen) gesplitst door een van de ADAM-eiwitten (een desintegrase en metallo-protease) op een plaats dicht bij het transmembraangebied. Deze splitsing activeert Notch voor gereguleerde intramembraan proteolyse, die snijdt in het membraan-overspannende gebied van Notch en het intracellulaire domein van Notch vrijmaakt van het cytoplasmamembraan. Vervolgens verplaatst het intracellulaire domein zich naar de kern waar het fungeert als een transcriptiefactor om genen aan te zetten die nodig zijn voor ontwikkeling (Fig. 20) (134). Gereguleerde intramembraanproteolyse wordt gekatalyseerd door het membraaneiwitcomplex dat preseniline wordt genoemd en dat Asp-proteasesubeenheden bevat. Preseniline is ook verantwoordelijk voor de splitsing van de amyloïde-p-precursoreiwitten bij de ziekte van Alzheimer. Deze door proteolyse veroorzaakte proteolysesignalering komt vaak voor. Soortgelijke signaalroutes zijn ook aanwezig in bacteriën. De afgifte van de transcriptiefactor σE wordt bijvoorbeeld bereikt via de opeenvolgende splitsing van het membraaneiwit RseA door DegS (een Ser-protease) en YaeL (een Zn-protease) (135).

Figuur 20. Vier proteolyse-gebeurtenissen voor Notch die leiden tot het vrijkomen van een actieve transcriptiefactor. TGN, trans Golgi-netwerk.

Figuur 21. (a) Domeinstructuren van zoogdiercaspases (b) de caspasecascades en de initiatie van apoptose. Apaf-1, apoptotische protease-activeringsfactor-1 Cyto c, cytochroom c FADD, Fas-geassocieerd eiwit met doodsdomein LS, grote subeenheid RAIDD, RIP-geassocieerd ICH-1/CED-3 homoloog eiwit met een doodsdomein RIP, receptor- interactie eiwit TRADD, tumornecrosefactorreceptor-geassocieerd eiwit met dood domein SS, kleine subeenheid.

Vergelijkbaar met de MAP-kinasecascades voor eiwitfosforylering, bestaan ​​er proteasecascades, waarin stroomafwaartse proteasen worden geactiveerd door de werking van stroomopwaartse proteasen (3). Een van de meest bekende cascades is de caspase-cascade die leidt tot apoptose (Fig. 22) (11, 136). Caspasen zijn Cys-proteasen die de amidebinding specifiek na een Asp-residu splitsen. Er bestaan ​​twee soorten caspases, initiatorcaspases (Caspase 2, 8, 9, 10) en effectorcaspases (Caspase 3, 6, 7). Zowel initiator- als effectorcaspasen worden geproduceerd in zymogene vormen. Initiator caspases gebruiken hun N-terminale DED (dood effector domein) en CARD (caspase rekrutering domein) domeinen om te interageren met andere eiwitten om apoptose signalen te ontvangen. De signalen veroorzaken de dimerisatie van de initiator-caspasen en activeren deze zodat ze zichzelf en de effector-caspasen kunnen splitsen na specifieke Asp-residuen. Splitsing door de initiator caspases activeert de effector caspases, die vervolgens hun substraateiwitten splitsen om celapoptose uit te voeren. De substraateiwitten van effectorcaspasen omvatten de remmer van door caspases geactiveerd DNAse (deoxyribonuclease), Bcl2 (genoemd naar B-cellymfoom 2, een anti-apoptotisch eiwit) en PARP-1 (poly (ADP-ribose) polymerase-1, een enzym katalyseren van eiwitpoly(ADP-ribosyl)ation en vereist voor DNA-herstel). Splitsing van de remmer van DNAse door effectorcaspasen activeert zijn katalytische activiteit, wat resulteert in de fragmentatie van chromosomaal DNA, wat een kenmerk is van apoptose. De caspases-cascade en apoptose is erg belangrijk voor de ontwikkeling en homeostase van metazoën. Verminderd vermogen van cellen om apoptose te ondergaan zal leiden tot kanker, terwijl te veel apoptose kan leiden tot auto-immuunziekten (137).

Figuur 22. Shokat's (144) ''bump and hole''-methode om substraten voor kinasen te identificeren.

Identificeren van nieuwe paden die worden gereguleerd door bekende PTM en ontdekken van nieuwe PTM

De korte beschrijving hierboven van enkele belangrijke PTM toont duidelijk aan dat PTM veel belangrijke biologische processen kan reguleren. Tot nu toe is een redelijk goed begrip verkregen van veel aspecten van PTM. Welke resterende uitdagingen moeten worden aangepakt?

Eén richting is het achterhalen van de moleculaire details van veel van de biologische processen die door PTM worden gereguleerd. Structurele biologie en biochemie zijn nodig om vragen te beantwoorden zoals welke structurele veranderingen worden veroorzaakt door een bepaald PTM en hoe de structuurveranderingen leiden tot veranderingen in activiteit of herkenning door bindende partners. Er is veel vooruitgang geboekt in deze richting, maar er moet nog meer worden uitgezocht. Bij eiwitubiquitylering bestaan ​​er bijvoorbeeld geen structurele details over El, is het niet duidelijk hoe de polyubiquitineketen wordt gemaakt (117) en is het niet duidelijk hoe specificiteiten van verschillende ubiquitine-bindende domeinen worden bereikt (19).

Een andere richting is het identificeren van het proteoom dat is gemodificeerd door een specifiek PTM. Vooruitgang in eiwitidentificatie door massaspectrometrie (MS) heeft studies in deze richting enorm vergemakkelijkt en er zijn veel inspanningen geleverd. Over het algemeen wordt een affiniteitszuiveringsmethode gebruikt om eiwitten te verrijken die zijn gemodificeerd door een specifiek PTM, en vervolgens worden deze eiwitten geïdentificeerd door MS. Er zijn bijvoorbeeld fosfotyrosine-specifieke antilichamen gebruikt om eiwitten te verrijken die op Tyr-residuen zijn gemodificeerd, en er zijn metaalaffiniteitskolommen gebruikt om alle fosfopeptiden te isoleren (138). Deze geïsoleerde fosfoproteïnen/peptiden kunnen vervolgens worden geïdentificeerd door MS. een His6 tag is gefuseerd aan de N-terminus van ubiquitine en gebruikt om alomtegenwoordige eiwitten te isoleren die vervolgens worden geïdentificeerd door MS (139). GlcNAc waaraan een azidegroep is bevestigd, is gebruikt om eiwitten te labelen die met O-GlcNAc zijn gemodificeerd, en vervolgens wordt een biotine-tag aan het gemodificeerde eiwit geconjugeerd via Staudinger-ligatie. O-GlcNAc gemodificeerde eiwitten kunnen worden uitgetrokken met behulp van streptavidine kralen en geïdentificeerd met behulp van MS. Met behulp van deze methode werden bijna 200 O-GlcNAc-gemodificeerde eiwitten geïdentificeerd (140). Een slimme methode om proteïne S-acylering te detecteren is recentelijk gerapporteerd (141).

Deze proteomische studies hebben veel informatie opgeleverd. Om de functie van een PTM in de celfysiologie volledig te begrijpen, is het echter wenselijk te weten welk enzym verantwoordelijk is voor de modificatie van een bepaald substraateiwit. Met de beschikbaarheid van bio-informatica-instrumenten en voltooide genoomsequenties, is het nu relatief eenvoudig om alle enzymen in een genoom te identificeren die een vergelijkbare biochemische functie delen. We weten nu bijvoorbeeld dat het menselijk genoom meer dan 500 proteïnekinasen, meer dan 500 proteasen en

400 ubiquitine E3s. Maar zonder te weten welke substraateiwitten ze modificeren, zal het heel moeilijk (zo niet onmogelijk) zijn om hun biologische functies op moleculair niveau te begrijpen. Momenteel bestaat er nog geen efficiënte en betrouwbare methode om de substraateiwitten voor een enzym te identificeren. Een eenvoudige methode is om een ​​bibliotheek van korte peptiden te maken en consensussequenties te identificeren die door een enzym worden herkend (142, 143). Het nadeel is dat de structuur van een kort peptide kan verschillen van de structuur van dezelfde sequentie die aanwezig is in een gevouwen eiwit. De betrouwbaarheid van deze methode moet dus worden gevalideerd door andere methoden. Shokat en collega's (144) hebben een slimme benadering gebruikt om kinasesubstraten te identificeren (Fig. 22). Deze benadering maakt gebruik van een omvangrijk ATP-analogon dat alleen door een kinasemutant als cosubstraat kan worden gebruikt. Door 32P-gelabeld ATP-analogon en de kinasemutant te incuberen met celextract, kunnen de substraateiwitten van het specifieke kinase worden gelabeld. Identificatie van de substraateiwitten kan echter moeilijk zijn omdat de radioactief gemerkte substraateiwitten niet gemakkelijk kunnen worden verrijkt/gezuiverd voor identificatie door MS. Het is niet duidelijk of deze methode gemakkelijk kan worden toegepast op andere PTM-enzymen.

Parallel aan de inspanningen om substraateiwitten voor een bepaald enzym te identificeren, kunnen de op activiteit gebaseerde kleine-molecuulprobes die door Cravatt en collega's zijn gepionierd, de identificatie vergemakkelijken van de biologische functies van een enzym dat post-translationele eiwitmodificaties katalyseert (145). Het grote voordeel van dit type sondes is dat ze mogelijk enzymen kunnen detecteren die zich in de actieve toestand bevinden, en dus snapshots kunnen leveren van enzymen die zich in de actieve toestand bevinden in verschillende ontwikkelingsstadia of verschillende soorten cellen. Onder de enzymen die PTM katalyseren, zijn tot dusver sondes ontwikkeld voor het bestuderen van proteasen (145, 146), kinasen (147), pTyr-fosfatasen (148) en eiwit-Arg-deiminasen (149).

Misschien is een meer uitdagende vraag hoe we nieuwe PTM-reacties kunnen ontdekken. In principe zijn er analytische tools die gebruikt kunnen worden om dit onderwerp te onderzoeken. Een voorbeeld van zo'n tool is top-down FT-MS, dat het molecuulgewicht van het hele eiwit met hoge nauwkeurigheid bepaalt. Door het verkregen tandem-MS (MS/MS)-resultaat te vergelijken met het verwachte MS/MS-resultaat, kunnen post-translationele modificaties worden geïdentificeerd (150). Kristallografie kan ook nieuwe PTM ontdekken, als een eiwit dat tot expressie wordt gebracht in de juiste gastheer kan worden gekristalliseerd. Op deze manier werden enkele zeldzame modificaties of eiwitzijketens ontdekt (151). Het succes van het gebruik van deze methoden zou echter vereisen dat een aanzienlijk deel van de eiwitpopulatie wordt gemodificeerd en dat de modificatie stabiel is. Aan deze voorwaarde kan niet door alle PTM worden voldaan. Het ontdekken van nieuwe PTM vormt dus een grote uitdaging voor chemisch biologen. Ongetwijfeld wachten nieuwe PTM-reacties om ontdekt te worden en de identificatie van deze nieuwe PTM, samen met de identificatie van nieuwe routes die worden gereguleerd door bekend PTM, zal ons begrip over de moleculaire logica van levende systemen vergroten.

1. Internationaal Consortium voor de sequentiëring van het menselijk genoom. Initiële sequencing en analyse van het menselijk genoom. Natuur 2001 409:860-921.

2. Puente XS, Sanchez LM, Overall CM, Lopez-Otin C. Proteasen van mensen en muizen: een vergelijkende genomische benadering. nat. Rev. Genet. 2003 4:544-558.

3. Walsh-CT. Posttranslationele modificatie van eiwitten: uitbreiding van de inventaris van de natuur. 2005. Roberts and Company Publishers, Englewood, CO.

4. Ahmed N, Thornalley PJ. Geavanceerde glycatie-eindproducten: wat is hun relevantie voor diabetische complicaties? Diabetes Obesitas. Metab. 2007 9:233-245.

5. Hess DT, Matsumoto A, Kim SO, Marshall HE, Stamler JS.Proteïne S-nitrosylering: bevoegdheid en parameters. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2005 6:150-166.

6. Lippard SJ, Berg JM. Principes van bio-anorganische chemie. 1994. Universitaire wetenschappelijke boeken. Mill Valley, Californië.

7. Ruthenburg AJ, et al. Histone H3-herkenning en presentatie door de WDR5-module van het MLL1-complex. nat. structuur Mol. Biol. 2006 13:704-712.

8. Johnson LN, Lewis RJ. Structurele basis voor controle door fosforylering. Chem. Rev. 2001 101:2209-2242.

9. Johnson LN, Barford D. De effecten van fosforylering op de structuur en functie van eiwitten. Ann. Rev. Biophys. Biomol. structuur 1993 22: 199-232.

10. Chen P, Hochstrasser M. Autokatalytische subeenheidverwerking koppelt vorming van actieve plaatsen in het 20S-proteasoom aan voltooiing van assemblage. Cel 1996 86:961-972.

11. Riedl SJ, Shi Y. Moleculaire mechanismen van caspase-regulatie tijdens apoptose. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2004 5:897-907.

12. Pawson T, Nash P. Assemblage van celregulerende systemen via eiwitinteractiedomeinen. Wetenschap 2003 300:445-452.

13. Yaffe MB, Elia, AEH. Fosfoserine/threonine-bindende domeinen. Curr. Opin. Cel Biol. 2001 13:131-138.

14. Yaffe MB. Fosfotyrosine-bindende domeinen bij signaaltransductie. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2002 3:177-186.

15. Xiang-Jiao Y. Lysine-acetylering en het bromodomein: een nieuw partnerschap voor signalering. Bioessays 2004 26:1076-1087.

16. Mujtaba S, Zeng L, Zhou MM. Structuur en acetyl-lysine herkenning van het broomdomein. Oncogene 2007 26:5521-5527.

17. Daniel JA, Pray-Grant MG, Grant PA. Effector-eiwitten voor gemethyleerde histonen. Celcyclus 2005 4:919-926.

18. Hurley JH, Lee S, Prag G. Ubiquitine-bindende domeinen. Biochem. J. 2006 399:361-372.

19. Harper JW, Schulman BA. Structurele complexiteit in ubiquitine-herkenning. Cel 2006 1241133-1136.

20. Pittet M, Conzelmann A. Biosynthese en functie van GPI-eiwitten in de gist Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biofysica. Acta 2007 1771:405-420.

21. Farazi TA, Waksman G, Gordon JI. De biologie en enzymologie van eiwit N-myristoylatie. J. Biol. Chem. 2001 276:39501-39504.

22. McTaggart S. Geïsoprenyleerde eiwitten. Cel. Mol. Levenswetenschap. 2006 63:255-267.

23. Linder ME, Deschenes RJ. Palmitoylering: bewaking van eiwitstabiliteit en verkeer. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2007 8:74-84.

24. Herstel MD. Handel en signalering door vetgeacyleerde en geprenyleerde eiwitten. nat. Chem. Biol. 2006 2:584-590.

25. Perham RN. Swingende armen en swingende domeinen in multifunctionele enzymen: katalytische machines voor meerstapsreacties. Ann. ds. Biochem. 2000 69:961-1004.

26. Fischbach MA, Walsh CT. Assemblagelijn-enzymologie voor polyketide- en niet-ribosomale peptide-antibiotica: logica, machines en mechanismen. Chem. Rev. 2006 106:3468-3496.

27. Schwartz B, Klinman JP. Mechanismen van biosynthese van van eiwit afgeleide redox-cofactoren. Vitam. Horm. 2001 61:219-239.

28. Ghosh D. Menselijke sulfatasen: een structureel perspectief op katalyse. Cel. Mol. Levenswetenschap. 2007 64:2013-2022.

29. Schwede TF, Retey J, Schulz GE. Kristalstructuur van histidine-ammoniak-lyase die een nieuwe polypeptide-modificatie onthult als de katalytische elektrofiel. Biochemie 1999 38:5355-5361.

30. Calabrese JC, Jordan DB, Boodhoo A, Sariaslani S, Vannelli T. Kristalstructuur van fenylalanine-ammoniaklyase: meerdere helix-dipolen die betrokken zijn bij katalyse. Biochemie 2004 43:11403-11416.

31. Christenson SD, Liu W, Toney, MD, Shen B. Een nieuwe 4-methylideneimidazool-5-on-bevattende tyrosine-aminomutase in enediyne antitumor antibioticum C-1027 biosynthese. J. Ben. Chem. Soc. 2003 125:6062-6063.

32. Poelje PD, Snell EE. Pyruvoyl-afhankelijke enzymen. Ann. ds. Biochem. 1990 59:29-59.

33. Kadokura H, Katzen F, Beckwith J. Vorming van eiwitdisulfidebindingen in prokaryoten. Ann. ds. Biochem. 2003 72:111-135.

34. Lodish H, et al. Moleculaire celbiologie. 2007. W.H. Freeman & Co Ltd, New York.

35. Takeuchi M, Kobata A. Structuren en functionele rollen van de suikerketens van menselijke erytropoëtines. Glycobiologie 1991 1:337-346.

36. Saiardi A, Bhandari R, Resnick AC, Sneeuwman AM, Snyder SH. Fosforylering van eiwitten door inositolpyrofosfaten. Wetenschap 2004 306:2101-2105.

37. Skalhegg BS, Tasken K. Specificiteit in de cAMP/PKA-signaleringsroute. Differentiële expressie, regulering en subcellulaire lokalisatie van subeenheden van PKA. Voorkant. Biosc. 2000 5:678-693.

38. Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. Zeven-transmembraanreceptoren. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2002 3:639-650.

39. Hurley JH. Structuur, mechanisme en regulatie van adenylylcyclase van zoogdieren. J. Biol. Chem. 1999 274:7599-7602.

40. Krebs EG, Beavo JA. Fosforylering-defosforylering van enzymen. Ann. ds. Biochem. 1979 48:923-959.

41. Daniel PB, Walker WH, Habener JF. Cyclische versterkersignalering en genregulatie. Ann. Rev. Nutr. 1998 18:353-383.

42. Schlessinger J. Celsignalering door receptortyrosinekinasen. Cel 2000 103:211-225.

43. Avruch J. MAP-kinaseroutes: de eerste twintig jaar. Biochim. Biofysica. Acta 2007 1773: 1150-1160.

44. Melo JV, Barnes DJ. Chronische myeloïde leukemie als een model van ziekte-evolutie bij menselijke kanker. Oncogene 2007 7:441-453.

45. Roberts PJ, Der CJ. Gericht op de Raf-MEK-ERK mitogeen-geactiveerde eiwitkinasecascade voor de behandeling van kanker. Oncogene 2007 26:3291-3310.

46. ​​Shchemelinin I, Sefc L, Necas E. Eiwitkinaseremmers. Folia Biol. (Praag) 2006 52:137-148.

47. Laurent Bialy HW. Remmers van eiwittyrosinefosfatasen: medicijnen van de volgende generatie? Ange. Chem. Int. Ed. Engels 2005 44:3814-3839.

48. Roth SY, Denu JM, Allis-cd. Histonacetyltransferasen. Ann. ds. Biochem. 2001 70:81-120.

49. Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Kristalstructuur van het nucleosoomkerndeeltje met een resolutie van 2,8 A. Natuur 1997 389:251-260.

50. Verdone L, Caserta M, Mauro ED. De rol van histonacetylering bij de controle van genexpressie. Biochem. Cel Biol. 2005 83:344-353.

51. Yang XJ. Lysine-acetylering en het bromodomein: een nieuw partnerschap voor signalering. Bioessays 2004 26:1076-1087.

52. Shahbazian MD, Grunstein M. Functies van plaatsspecifieke histonacetylering en deacetylering. Ann. ds. Biochem. 2007 76:75-100.

53. HanJ, et al. Rtt109 acetyleert histon H3-lysine 56 en functioneert bij DNA-replicatie. Wetenschap 2007 15:653-655.

54. Driscoll R, Hudson A, Jackson SP. Gist Rtt109 bevordert de stabiliteit van het genoom door histon H3 op lysine 56 te acetyleren. Science 2007 315:649-652.

55. Yang XJ, Gregoire S. Metabolisme, cytoskelet en cellulaire signalering in de greep van eiwit Ne - en O-acetylering. EMBO-rep. 2007 8:556-562.

56. Grozinger CM, Schreiber SL. Deacetylase-enzymen: biologische functies en het gebruik van remmers van kleine moleculen. Chem. Biol. 2002 9:3-16.

57. Imai SI, Armstrong CM, Kaeberlein M, Guarente L Transcriptionele silencing- en levensduurproteïne Sir2 is een NAD-afhankelijk histondeacetylase. Natuur 2000 403:795-800.

58. Sauve AA, Wolberger C, Schramm VL, Boeke JD. De biochemie van sirtuïnes. Ann. ds. Biochem. 2006 75:435-465.

59. Polevoda B, Sherman F. N-terminale acetyltransferasen en sequentievereisten voor N-terminale acetylering van eukaryote eiwitten. J. Mol. Biol. 2003 325:595-622.

60. Timmermann S, Lehrmann H, Polesskaya A, Harel-Bellan A. Histonacetylering en ziekte. Cel. Mol. Levenswetenschap. 2001 58:728-736.

61. Varier RA, Swaminathan V, Balasubramanyam K, Kundu TK. Implicaties van activatoren van kleine moleculen en remmers van histonacetyltransferasen bij chromatinetherapie. Biochem. Pharmacol. 2004 68: 1215-1220.

62. Marks PA, Breslow R. Dimethylsulfoxide tot vorinostat: ontwikkeling van deze histondeacetylaseremmer als een geneesmiddel tegen kanker. nat. Biotechnologie. 2007 25:84-90.

63. Polevoda B, Sherman F. Methylering van eiwitten die betrokken zijn bij translatie. Mol. microbiologisch. 2007 65:590-606.

64. Fontecave M, Atta M, Mulliez E. S-adenosylmethionine: niets gaat verloren. TrendsBiochem. Wetenschap. 2004 29:243-249.

65. Kouzarides T. Histon-methylatie in transcriptionele controle. Curr. Opin. Genet. ontwikkelaar 2002 12:198-209.

66. Schubert HL, Blumenthal RM, Cheng X. Vele wegen naar methyltransfer: een kroniek van convergentie. TrendsBiochem. Wetenschap. 2003 28:329-335.

67. Bedford MT, Richard S. Arginine-methylatie: een opkomende regulator van de eiwitfunctie. Mol. Cel 18, 263-272 (2005).

68. Bannister AJ, Kouzarides T. Histonmethylering omkeren. Natuur 2005 436:1103-1106.

69. Jacobs SA, Khorasanizadeh S. Structuur van HP1-chromodomein gebonden aan een lysine 9-gemethyleerde histon H3-staart. Wetenschap 2002 295:2080-2083.

70. Huyen Y, et al. Gemethyleerd lysine 79 van histon H3 richt zich op 53BP1 op DNA-dubbelstrengsbreuken. Natuur 2004 432:406-411.

71. Flanagan JF, et al. Dubbele chromodomeinen werken samen om de gemethyleerde histon H3-staart te herkennen. Natuur 2005 438:1181-1185.

72. Cote J, Richard S. Tudor-domeinen binden symmetrische gedimethyleerde arginines. J. Biol. Chem. 2005 280:28476-28483.

73. Sprangers R, Groves MR, Sinning I, Sattler M. Röntgen- en NMR-structuren met hoge resolutie van het SMN-tudordomein: conformationele variatie in de bindingsplaats voor symmetrisch gedimethyleerde arginineresiduen. J. Mol. Biol. 2003 327:507-520.

74. Friesen WJ, Massenet S, Paushkin S, Wyce A, Dreyfuss G. SMN, het product van het spinale musculaire atrofie-gen, bindt bij voorkeur aan dimethylarginine-bevattende eiwitdoelen. Mol. Cel 2001 7:1111-1117.

75. Bannister AJ, et al. Selectieve herkenning van gemethyleerd lysine 9 op histon H3 door het HP1-chromodomein. Natuur 2001 410:120-124.

76. Nakayama J-I, Rice JC, Strahl BD, Allis CD, Grewal SIS. De rol van histon H3-lysine 9-methylatie bij epigenetische controle van heterochromatine-assemblage. Wetenschap 2001 292:110-113.

77. Lachner M, O'Carroll D, Rea S, Mechtler K, Jenuwein T. Methylering van histon H3-lysine 9 creëert een bindingsplaats voor HP1-eiwitten. Natuur 2001 410:116-120.

78. Chuikov S, et al. Regulering van p53-activiteit door lysinemethylering. Natuur 2004 432:353-360.

79. Huang J, et al. Onderdrukking van p53-activiteit door Smyd2-gemedieerde methylering. Natuur 2006 444:629-632.

80. Shi X, et al. Modulatie van p53-functie door SET8-gemedieerde methylering op lysine 382. Mol. Cel 2007 27:636-646.

81. Kouskouti A, Scheer E, Staub A, Tora L, Talianidis I. Genspecifieke modulatie van de TAF10-functie door SET9-gemedieerde methylering. Mol. Cel 2004 14:175-182.

82. Mowen KA, et al. Arginine-methylering van STAT1 moduleert IFN a/p-geïnduceerde transcriptie. Cel 2001 104:731-741.

83. XuW, et al. Een transcriptionele switch gemedieerd door cofactor-methylatie. Wetenschap 2001 294:2507-2511.

84. ShiY, et al. Histondemethylering gemedieerd door het nucleaire amine-oxidase Homolog LSD1. Cel 2004 119:941-953.

85. Stavropoulos P, Blobel G, Hoelz A. Kristalstructuur en mechanisme van humaan lysine-specifiek demethylase-1. nat. structuur Mol. Biol. 2006 13:626-632.

86. Whetstine JR, et al. Omkering van histon-lysinetrimethylering door de JMJD2-familie van histondemethylasen. Cel 2006 125:467-481.

87. Wang Y, et al. Human PAD4 reguleert histon-arginine-methylatieniveaus via demethylimination. Wetenschap 2004 306:279-283.

88. Thompson PR, Fast W. Histon-citrullinatie door eiwit-arginine-deiminase: is arginine-methylatie een groen licht of een wegversperring? ACS Chem. Biol. 2006 1:433-441.

89. Kearney PL, et al. Kinetische karakterisering van eiwit arginine deiminase 4: een transcriptionele corepressor die betrokken is bij het ontstaan ​​en de progressie van reumatoïde artritis. Biochemie 2005 44:10570-10582.

90. Raijmakers R, et al. Methylering van arginineresiduen interfereert in vitro met citrullinatie door peptidylargininedeiminasen. J. Mol. Biol. 2007 367: 1118-1129.

91. Hidaka Y, Hagiwara T, Yamada M. Methylering van de guanidinogroep van arginineresiduen voorkomt citrullinatie door peptidylarginine deiminase IV. FEBS Lett. 2005 579:4088-4092.

92. Chang B, Chen Y, Zhao Y, Bruick RK. JMJD6 is een histon-argininedemethylase. Wetenschap 2007 318:444-447.

93. Fraga MF, Esteller M. Op weg naar het epigenoom van kanker bij de mens: een eerste versie van histon-modificaties. Celcyclus 2005 4:1377-1381.

94. Shi Y, Whetstine Jr. Dynamische regulatie van histon-lysinemethylering door demethylasen. Mol. Cel 2007 25:1-14.

95. Okada, Y. et al. hDOT1L koppelt histonmethylering aan leukemogenese. Cel 2005 121: 167-178.

96. Burda P, Aebi M. De dolichol-route van N-gekoppelde glycosylering. Biochim. Biofysica. Acta 1999 1426:239-257.

97. Yan A, Lennarz WJ. Ontrafelen van het mechanisme van eiwit N-glycosylering. J. Biol. Chem. 2005 280:3121-3124.

98. Roth J. Proteïne N-glycosylering langs de secretoire route: relatie tot organeltopografie en functie, eiwitkwaliteitscontrole en celinteracties. Chem. Rev. 2002 102:285-304.

99. Kornfeld R, Kornfeld S. Assemblage van asparagine-gekoppelde oligosachariden. Ann. ds. Biochem. 1985 54:631-664.

100. Knauer R, Lehle L. Het oligosaccharyltransferase-complex van gist. Biochim. Biofysica. Acta 1999 1426:259-273.

101. PeterKatalinic J. Methoden in enzymologie: O-glycosylering van eiwitten. Methoden Enzymol. 2005 405:139-171.

102. Zachara NE, Hart GW. De opkomende betekenis van O-GlcNAc in cellulaire regulatie. Chem. Rev. 2002 102:431-438.

103. Liefde DC, Hannover JA. De hexosamine-signaleringsroute: de "O-GlcNAc-code" ontcijferen. Wetenschap. STKE 20051re13.

104. Furmanek A, Hofsteenge J. Eiwit C-mannosylering: feiten en vragen. Acta Biochim Pol. 2000 47:781-789.

105. Neufeld EF. Lysosomale stapelingsziekten. Ann. ds. Biochem. 1991 60:257-280.

106. Schachter H. Aangeboren aandoeningen waarbij sprake is van gebrekkige N-glycosylering van eiwitten. Cel. Mol. Levenswetenschap. 2001 58:1085-1104.

107. Dube DH, Bertozzi CR. Glycanen bij kanker en ontsteking - potentieel voor therapieën en diagnostiek. nat. Rev. Drugsontdek. 2005 4:477-488.

108. Trombetta ES, Parodi AJ. Kwaliteitscontrole en eiwitvouwing in de secretoire route. Ann. ds. Cel. ontwikkelaar Biol. 2003 19:649-676.

109. Okajima T, Xu A, Lei L, Irvine KD. Chaperone-activiteit van proteïne O-fucosyltransferase 1 bevordert de vouwing van de notch-receptor. Wetenschap 2005 307:1599-1603.

110. Wyss DF, et al. Conformatie en functie van het N-gebonden glycaan in het adhesiedomein van humaan CD2. Wetenschap 1995 269:1273-1278.

111. Krapp S, Mimura Y, Jefferis R, Huber R, Sondermann P. Structurele analyse van menselijke IgG-Fc-glycovormen onthult een correlatie tussen glycosylering en structurele integriteit. J. Mol. Biol. 2003 325:979-989.

112. Sondermann P, Huber R, Oosthuizen V, Jacob U. De 3.2-A kristalstructuur van het menselijke IgG1 Fc-fragment-FcyRIII-complex. Natuur 2000 406:267-273.

113. Pickart CM. Mechanismen die ten grondslag liggen aan ubiquitinatie. Ann. ds. Biochem. 2001 70:503-533.

114. Zheng N, et al. Structuur van het Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitine-ligasecomplex. Natuur 2002 416:703-709.

115. Cardozo T, Pagano M. De SCF ubiquitine-ligase: inzichten in een moleculaire machine. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2004 5:739-751.

116. Mukhopadhyay D, Riezman H. Proteasoomonafhankelijke functies van ubiquitine bij endocytose en signalering. Wetenschap 2007 315:201-205.

117. Hochstrasser M. Aanhoudende mysteries van ubiquitine-ketenassemblage. Cel 2006 124:27-34.

118. Vleugel SS. Deubiquitinerende enzymen - het belang van achteruit rijden langs de ubiquitine-proteasoomroute. Int. J. Biochem. Cel Biol. 2003 35:590-605.

119. Riet SI. Ratels en klokken: de celcyclus, alomtegenwoordigheid en eiwitomzetting. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2003 4:855-864.

120. Schofield CJ, Ratcliffe PJ. Zuurstofdetectie door HIF-hydroxylasen. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2004 5:343-354.

121. Gallego M, Virshup DM. Post-translationele modificaties reguleren het tikken van de circadiane klok. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2007 8:139-148.

122. Salmena L, Pandolfi PP. Veranderende locaties voor tumoronderdrukking: het balanceren van vernietiging en lokalisatie door monoubiquitylation. nat. Rev. Kreeft 2007 7:409-413.

123. Werper JS, Hoffman L, Rechsteiner M, Pickart CM. Herkenning van het polyubiquitine proteolytische signaal. EMBO J. 2000 19:94-102.

124. Madura K. Rad23 en Rpn10: meerjarige muurbloempjes voegen zich bij de melee. TrendsBiochem. Wetenschap. 2004 29:637-640.

125. Flick K, Raasi S, Zhang H, Yen JL, Kaiser P. Een ubiquitine-interactief motief beschermt polyubiquitinated Met4 tegen afbraak door het 26S-proteasoom. nat. Cel Biol. 2006 8:509-515.

126. Rubinsztein DC. De rollen van intracellulaire eiwitafbraakroutes bij neurodegeneratie. Natuur 2006 443:780-786.

127. Aaron C. Intracellulaire eiwitafbraak: van een vaag idee, via het lysosoom en het ubiquitine-proteasoomsysteem, en naar menselijke ziekten en medicijntargeting (nobellezing). Ange. Chem. Int. Ed. 2005 44:5944-5967.

128. Luzio JP, Pryor PR, Bright NA. Lysosomen: fusie en functie. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2007: 8:622-632.

129. Voges D, Zwickl P, Baumeister W. Het 26S-proteasoom: een moleculaire machine ontworpen voor gecontroleerde proteolyse. Ann. ds. Biochem. 1999 68: 1015-1068.

130. Marmor MD, Yarden Y. De rol van eiwit-ubiquitylering bij het reguleren van endocytose van receptortyrosinekinasen. Oncogene 2004 23:2057-2070.

131. Shenoy SK. Zeven-transmembraanreceptoren en ubiquitinatie. Circa. Onderzoek 2007 100: 1142-1154.

132. Paetzel M, Karla A, Strynadka NCJ, Dalbey RE. Signaal peptidasen. Chem. Rev. 2002 102:4549-4580.

133. Rockwell NC, Krysan DJ, Komiyama T, Fuller RS. Precursorverwerking door Kex2/Furin-proteasen. Chem. Rev. 2002 102:4525-4548.

134. Fortini ME. [gamma]-Secretase-gemedieerde proteolyse in celoppervlak-receptorsignalering. nat. ds. Mol. Cel Biol. 2002 3:673-684.

135. Jonge JC, Hartl FU. Een stresssensor voor het bacteriële periplasma. Cel 2003 113:1-2.

136. Yan N, Shi Y. Mechanismen van apoptose door structurele biologie. Ann. ds. cel. ontwikkelaar Biol. 2005 21:35-56.

137. Thompson CB. Apoptose in de pathogenese en behandeling van ziekten. Wetenschap 1995 267:1456-1462.

138. Kalume DE, Molina H, Pandey A. Het fosfoproteoom aanpakken: hulpmiddelen en strategieën. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003 7:64-69.

139. Peng J, et al. Een proteomics-benadering om eiwit-ubiquitinatie te begrijpen. nat. Biotechnologie. 2003 21:921-926.

140. Nandi A, et al. Globale identificatie van O-GlcNAc-gemodificeerde eiwitten. Anaal. Chem. 2006 78:452-458.

141. Roth AF, et al. Globale analyse van eiwitpalmitoylering in gist. Celcyclus 2006 125:1003-1013.

142. Songyang Z, et al. Gebruik van een georiënteerde peptidebibliotheek om de optimale substraten van eiwitkinasen te bepalen. Curr. Biol. 1994 4:973-982.

143. Obata T, et al. Peptide- en eiwitbibliotheekscreening definieert optimale substraatmotieven voor AKT/PKB. J. Biol. Chem. 2000 275:36108-36115.

144. Ubersax JA, et al. Doelen van het cycline-afhankelijke kinase Cdk1. Natuur 2003 425:859-864.

145. Evans MJ, Cravatt BF. Op mechanisme gebaseerde profilering van enzymfamilies. Chem. Rev. 2006 106:3279-3301.

146. Liefde KR, Catic A, Schlieker C, Ploegh HL. Mechanismen, biologie en remmers van deubiquitinerende enzymen. nat. Chem. Biol. 2007 3:697-705.

147. Patricelli MP, et al. Functionele ondervraging van het kinoom met behulp van nucleotide-acylfosfaten. Biochemie 2007 46:350-358.

148. Kumar S, et al. Op activiteit gebaseerde sondes voor eiwittyrosinefosfatasen. Proc. nat. Acad.Wetenschap. V.S. 2004 101:7943-7948.

149. Luo Y, Knuckley B, Bhatia M, Pellechia PJ, Thompson PR. Op activiteit gebaseerde proteïneprofileringsreagentia voor proteïne-argininedeiminase 4 (PAD4): synthese en in vitro evaluatie van een fluorescent gelabelde sonde. J. Ben. Chem. Soc. 2006 128:14468-14469.

150. Sze SK, Ge Y, Oh H, McLafferty FW. Van de omslag: Top-down massaspectrometrie van een 29-kDa-eiwit voor karakterisering van elke posttranslationele modificatie tot binnen één residu. Proc. nat. Acad. Wetenschap. VS 2002 99:1774-1779.

151. Ermler U, Grabarse W, Shima S, Goubeaud M, Thauer RK. Kristalstructuur van methyl-co-enzym M-reductase: het belangrijkste enzym van biologische methaanvorming. Wetenschap 1997 278:1457-1462.

Als u de auteursrechthebbende bent van materiaal op onze site en van plan bent dit te verwijderen, neem dan contact op met onze sitebeheerder voor goedkeuring.


Discussie

Om de bijdrage van translationele regulatie aan verschillen in genexpressieniveau tussen mensen en nauw verwante soorten te bepalen, hebben we nieuwe gegevens gegenereerd met behulp van ribosoomprofilering om translatieniveaus te schatten. Deze dataset in combinatie met de data beschreven in Battle et al. [17] en Cenik et al. [27] bood een unieke kans om de recente evolutie van translationele regulatie bij mensen te onderzoeken. Door gezamenlijke analyse met RNA-seq-meting van transcriptniveaus en kwantitatieve massaspectrometriemeting van eiwitniveaus, hebben we een geïntegreerd beeld gegeven van divergentie in genregulatie tussen primaten. We vonden dat divergentie in translatie-efficiëntie zeldzaam is, wat betekent dat divergentie tussen primatensoorten op transcriptniveau zich vaak voortplant naar het niveau van eiwittranslatie (ribosoombezetting). Deze waarneming is in tegenstelling tot eerdere rapporten over doordringende translatiebuffering waargenomen in F1-hybriden tussen S. cerevisiae en S. paradoxus [24, 25]. Interessant is dat een rapport dat zich richt op hetzelfde proces in ontluikende gisthybriden tussen laboratorium- en wilde isolaatstammen [23] en een vervolgheranalyse van de Artieri-dataset [37] in tegenspraak is met het idee van een doordringende translationele buffering. In plaats daarvan waren hun resultaten meer in overeenstemming met onze waarnemingen bij primaten.

Translationele regelgeving wordt vaak gecontroleerd door regelgevende elementen die zich in de UTR-regio's bevinden. Varianten die in de UTR-regio's worden gevonden, hebben daarom meer kans om de vertaalefficiëntie te beïnvloeden. Gezien het niveau van sequentiedivergentie in de UTR-regio's [38], lijkt de mate van divergentie in translatie-efficiëntie die tussen primaten wordt gevonden onverwacht laag te zijn. Dat gezegd hebbende, of deze substituties in de UTR-regio's van invloed zijn op de vertaalsnelheid, blijft een open vraag. Het is mogelijk dat deze genetische varianten, hoewel ze impactvol zijn, cryptisch zijn in de omgeving die we hebben getest. Verdere studies die geschikte milieuverstoringen toepassen, zouden soortendivergentie in translationele regulatie kunnen onthullen [39]. Aan de andere kant identificeerden we enkele verschillen tussen soorten in vertaalefficiëntie. Interessant is echter dat van het beperkte aantal genen dat significante verschillen tussen soorten in translatie-efficiëntie vertoont, transcriptionele divergentie vaak het eiwitniveau voorspelt, evenals (of beter dan) translationele divergentie voor deze genen. Met andere woorden, divergentie tussen primaten in translationele regulatie lijkt een kleine invloed te hebben op genexpressieverschillen op eiwitniveau. Helaas verhinderde meetruis ons om een ​​nauwkeurige schatting te krijgen van het percentage translationele regulatie dat een aanhoudende invloed heeft op de steady-state eiwitniveaus. We konden echter aantonen dat in tegenstelling tot transcriptionele regulatie, divergentie in translatie-efficiëntie slechts een kleine invloed heeft op eiwitniveaus.

In tegenstelling tot genregulatie bij translatie, vonden we post-translationele genregulatie een veel bredere impact op eiwitniveaus. Regelgeving op deze laag dempt vaak de stroomopwaarts gecreëerde variatie. Een directe vergelijking tussen P waarden van het testen van effecten van buffering van translationele versus post-translationele mechanismen toonden duidelijk aan dat meer genen worden gereguleerd door de post-translationele mechanismen. Buffering van divergentie in genexpressieniveaus heeft brede implicaties, vooral in de context van evolutie. Voor de meeste genen voeren eiwitten vaak cellulaire functies uit. Variatie in genexpressie die het eiwitniveau niet heeft bereikt, heeft daarom minder waarschijnlijk invloed op organismale fenotypes. In overeenstemming met dit idee vonden we bewijs voor versoepeling van selectieve beperking op de mRNA-niveaus in de HapMap YRI-populatie voor gebufferde genen die zijn geïdentificeerd tussen primatensoorten. Verder onderzoek naar genexpressiebuffering in de context van populatiegenetica zou waarschijnlijk waardevolle inzichten opleveren over hoe selectie zou kunnen werken op de regulerende varianten die geassocieerd zijn met gebufferde genen. We vonden parallelle overeenkomsten tussen effecten van post-translationele buffering op genexpressiedivergentie en effecten van HSP90 chaperonne-actie op het corrigeren van verkeerde vouwing veroorzaakt door missense-mutaties [40, 41]. HSP90 verleent fenotypische robuustheid door de fitness-impact te bufferen die wordt veroorzaakt door niet-synonieme mutaties, waarschijnlijk door ofwel de eiwitstructuur te corrigeren of het afbraakproces te vergemakkelijken [42]. We speculeren dat parallel aan HSP90-buffering op structureel niveau, post-translationele buffering fenotypische robuustheid op genexpressieniveau zou kunnen verlenen door eiwitexpressieniveaus te stabiliseren tegen mutaties die de transcriptieregulatie beïnvloeden.

We identificeerden post-translationeel gebufferde genen in alle drie paarsgewijze soortvergelijkingen. Deze waarneming suggereert dat post-translationele buffering een geconserveerd mechanisme is dat waarschijnlijk is geëvolueerd onder stabiliserende selectie op eiwitniveaus bij primaten. Het blijft onduidelijk hoe post-translationele buffering wordt bereikt. We vonden verrijking van post-translationele modificaties onder deze groep genen zonder significante verrijking van coderende substituties. Het kan zijn dat divergentie in post-translationele modificaties in plaats van divergentie in coderende sequentie leidde tot differentiële omzettingssnelheden van eiwitten en daarom buffering stimuleert. Deze interpretatie geeft een verklaring voor hoe post-translationele buffering kan worden bereikt tussen mens en chimpansee, gezien het schijnbaar lage niveau van eiwitsequentiedivergentie.

Post-translationele buffering zou een gevolg kunnen zijn van een geconserveerd cellulair kwaliteitscontrolesysteem, zoals endoplasmatisch-reticulum-geassocieerde eiwitdegradatie (ERAD) [43]. Er zijn mechanismen voor kwaliteitscontrole van eiwitten aanwezig om ervoor te zorgen dat eiwitten op de juiste manier worden gevouwen en in voldoende hoeveelheden aanwezig zijn om biologische functies uit te voeren [44]. Adequate post-translationele modificaties zijn vereist om het juiste vouwen te laten plaatsvinden. Bovendien is ubiquitinatie een belangrijke stap in het richten van verkeerd gevouwen eiwitten op proteasoom voor afbraak [44, 45] verkeerd gevouwen eiwitten die voortkomen uit mutatie of een tekort aan chaperonnes worden gelabeld voor afbraak door ubiquitinatie. In overeenstemming met de rol van mechanismen voor kwaliteitscontrole van eiwitten, hebben we een significante verrijking waargenomen van gerapporteerde ubiquitineringsplaatsen in post-translationeel gebufferde genen (Fig. 3e). Bovendien worden veel eiwitten geassembleerd tot complexen met meerdere subeenheden met gedefinieerde stoichiometrie. Overtollige componenten van deze complexen worden gericht op proteasoom voor afbraak [46,47,48]. Actieve afbraak van overtollig product van translatie zou de schijnbare buffering van divergentie op eiwitniveau kunnen verklaren. In overeenstemming met dit idee, Chick et al. recent gerapporteerd bewijs dat een stoichiometrisch buffereffect ondersteunt [18]. Bovendien, Ishikawa et al. toonde aan dat effecten van kunstmatige verstoring van eiwitstoichiometrie door genetische manipulatie vaak post-translationeel worden gebufferd [49]. Meerdere routes voor de kwaliteitscontrole van eiwitten kunnen betrokken zijn bij post-translationele buffering. Door ribosomale eiwitten tot overexpressie te brengen, Sung et al. beschreef een nucleair eiwitafbraakmechanisme gemedieerd door ubiquitinatie bij het handhaven van ribosomale eiwitstoichiometrie [50]. Misschien niet toevallig, vond onze genontologie-analyse ook verrijking van genen die betrokken zijn bij het proces van eiwittranslatie voor post-translationeel gebufferde genen (Aanvullend bestand 1: Tabel S5). Verder onderzoek om factoren te identificeren die betrokken zijn bij het handhaven van post-translationele buffering zou inzichten verschaffen om ons begrip te vergroten van zowel hoe natuurlijke selectie inwerkt op genregulatie als hoe fenotypes beter kunnen worden voorspellen gegeven genetische varianten die van invloed zijn op genexpressie.

Samengevat leverde onze studie de eerste integrale kijk op de divergentie van genexpressie tussen primaten die een vergelijking tussen translationele en post-translationele gebeurtenissen mogelijk maakt. We vonden uitgebreide post-translationele genexpressiebuffering die leidde tot een stabiel eiwitniveau bij primatensoorten. We stellen een scenario voor waarin buffering evolueerde onder stabiliserende selectie van eiwitniveaus die negatieve effecten op de lichamelijke fitheid van eiwitniveauvariatie voorkomt, terwijl het transcriptniveau kan divergeren voor snelle aanpassing aan veranderingen in de omgeving. Gezien de energiekosten van eiwittranslatie [51], blijft het ons een raadsel dat stabiliserende selectie lijkt te werken op het post-translationele niveau in plaats van op het translationele niveau. We redeneren dat de evolutie van post-translationele buffering waarschijnlijk het meest spaarzame pad is en speculeren a trans-werkend mechanisme, waarbij post-translationele modificatie-enzymen betrokken zijn, zorgde voor buffering van genexpressie in een relatief korte periode van evolutionaire tijd.


Discussie

De modulatie van eiwitfunctie via verschillende soorten post-translationele modificaties (PTM's) en hun combinatorische wisselwerking heeft de afgelopen jaren veel aandacht getrokken [15�]. In deze studie hebben we de interactielaag toegevoegd aan de studie van PTM's door een systematisch onderzoek uit te voeren naar de netwerkeigenschappen van de verschillende PTM-types in de context van de fysieke interacties van PTM-dragende eiwitten. Voor twaalf verschillende PTM-types en over negen verschillende soorten hebben we karakteristieke en informatieve netwerkparameters bepaald met als doel te onderzoeken of bepaalde PTM-types geassocieerd zijn met specifieke en mogelijk 'strategische' plaatsingen in de context van alle eiwitinteracties, zodat hun individuele rol in de orkestratie van de gecombineerde werking van alle eiwitten wordt duidelijk.

Gegeneraliseerd over alle PTM-typen en soorten die hier zijn onderzocht, lijken PTM-dragende eiwitten meer fysieke contacten aan te gaan, met een verminderde clusteringcoëfficiënt tussen de eiwitten waarmee ze interageren, en een verhoogde nabijheidscentraliteit dan hun respectievelijke eiwitsets verstoken van de specifieke PTM- type ( Afb. 5 ) of die, voor zover we nu weten, geen PTM van welk type dan ook bevatten (S2 Afb.). De verschillen tussen de twaalf onderzochte PTM-types bleken minder uitgesproken, waarbij vrijwel alle soorten behalve glycosylering (zie hieronder) dezelfde trend volgden van hoge graad, lage clusteringcoëfficiënt en hoge nabijheid centraliteit met slechts subtiele verschillen in grootte tussen hen. Gezien de huidige gegevensdekking is het echter nog niet mogelijk om definitief te beslissen of deze verschillen statistisch significant en biologisch relevant zijn. Bij verdere onderverdeling in speciale typen PTM's (bijv. S / T / Y-fosforylering), waren er geen significante subtype-verschillen duidelijk (S3 Fig.). Zoals hierboven gemotiveerd, werden de drie geselecteerde netwerkeigenschappen specifiek geselecteerd om conclusies mogelijk te maken wat betreft de 'strategische' rollen van PTM in de context van interacties. Volgens deze logica zijn eiwitten met PTM's betrokken bij meer en andere processen dan niet-PTM-eiwitten en spelen ze centrale informatierelaisfuncties.

Gefocust op menselijke PIN- en PTM-gegevens vallen sumoylatie en proteolytische splitsing op als geassocieerd met de grootste relatieve toename van graad en nabijheid centraliteit ten opzichte van referentiesets. Proteolytische splitsing is in verband gebracht met activeringsprocessen en eiwittargeting-gebeurtenissen (splitsing van targeting N-terminaal peptide) en vormt een 'dramatische' modificatie omdat de relatieve verandering van de moleculaire samenstelling van een eiwit aanzienlijk kan zijn. Bovendien zal het transporteren van eiwitten naar verschillende compartimenten onvermijdelijk het mogelijke interactiebereik beïnvloeden. Het belang van sumoylatie in een reeks regulerende processen wordt steeds meer erkend [44]. Onze resultaten onderstrepen het belang van dit PTM-type.

Fosforylering, het PTM-type met de grootste gegevensondersteuning, werd geïdentificeerd als het PTM-type met het consequent centrale en met de grootste potentiële invloedsbereik (Fig. 5). Gefosforyleerde eiwitten bevinden zich op centrale netwerkposities (hoge nabijheidscentraliteit) en interageren met vele andere eiwitten (hoge mate), waaronder specifiek paarsgewijze interacties met eiwitten die een van de andere vier PTM-typen dragen, evenals andere gefosforyleerde eiwitten (Fig. paarsgewijze interactiefiguur). Voorbeelden van menselijke fosfo-eiwitten die een interactie aangaan met eiwitten die andere PTM-typen dragen, omvatten de kinasen: mitogeen-geactiveerd eiwitkinase 1 (MAPK1), interleukine-1-receptor-geassocieerd kinase 2 (IRAK2) en milttyrosinekinase (SYK). Die eiwitten interageren elk met andere eiwitten die vier verschillende PTM-types vertegenwoordigen. Deze bevindingen onderstrepen nogmaals het centrale belang van fosforylering als misschien wel het belangrijkste en meest centrale PTM-type dat tot nu toe is geïdentificeerd. Soortgelijke kenmerken werden gevonden voor acetylering, zij het dat de gedetecteerde omvang en statistische ondersteuning lager is.

Daarentegen werd glycosylering gevonden geassocieerd met eiwitten van lage graad, lage clusteringcoëfficiënt en lage nabijheidscentraliteit (Fig. 5). In het bijzonder kan de lage graad en lage nabijheid van geglycosyleerde eiwitten worden geïnterpreteerd als consistent met hun voorkeurslocatie in cytosolische membranen en om te werken als receptoren en cel-celcommunicatiemediatoren (Fig. 1, GO-term clustering) [45]. In tegenstelling tot de andere vier PTM-typen, kunnen de overgedragen glycosylgroepen groot zijn, wat leidt tot belemmerde eiwit-eiwitinteracties van geglycosyleerde eiwitten. Bovendien werken ze, vanwege hun frequente inbedding in membranen, in twee dimensies, niet drie zoals voor oplosbare cytosolische eiwitten, waardoor het interactiepotentieel effectief wordt verminderd.

Zoals getoond in Fig. 6, worden alle PTM-types gevonden op eiwitten die een neiging vertonen tot interactie met andere eiwitten die hetzelfde PTM-type dragen. In het geval van fosforylering kunnen dergelijke interacties worden geïnterpreteerd als de welbekende fosforylering/kinase-cascades [46, 47]. Het is ook mogelijk dat de gedetecteerde neiging van PTM-typen tot zelfinteractie afkomstig is van eiwitcomplexen, waarbij alle partners de PTM's van hetzelfde type ondergaan. In histoncomplexen worden bijvoorbeeld lysineresiduen op verschillende eiwitten geacetyleerd, waardoor de bindingsaffiniteit van histonen aan DNA wordt gewijzigd [48, 49]. Soortgelijke overwegingen gelden voor methyleringsgebeurtenissen in histon [50] en andere eiwitcomplexen [51].

Door negen soorten uit verschillende koninkrijken en geslachten op te nemen, wilden we zowel algemene als soort-/afstammingsspecifieke trends extraheren. De momenteel beschikbare datasets bleken echter uitgebreid genoeg voor slechts enkele soorten (mens, muis, rat). In het geval van fosforylering waren er voldoende gegevens beschikbaar over alle negen soorten en leverden een consistent resultaat op van verhoogde mate en nabijheid van centraliteit en een verminderde clusteringcoëfficiënt (Fig. 5).

De verhoogde kans op een functionele associatie van eiwitten met een hoge mate van interactie en hun betrokkenheid bij ziekten bij de mens is eerder gemeld [52, 53]. In geselecteerde gevallen is ook gemeld dat eiwitten die PTM's dragen waarschijnlijker gerelateerd zijn aan ziekteprocessen dan niet-PTM-eiwitten [54�]. Onze dataset stelde ons in staat om deze analyse uit te breiden naar het testen van specifieke PTM-types in combinatie met hun PIN-kenmerken. Onze resultaten suggereren dat niet alleen een PTM proteïnen waarschijnlijker met ziekte geassocieerd maakt, maar dat deze associatie kan afhangen van de PIN-context waarin het is ingebed. Hoge mate, lage clusteringcoëfficiënt en hoge centraliteitsproteïnen zijn waarschijnlijker met ziekte geassocieerd ( Tabel 3 ) dan hun respectievelijke tegenhangersets aan het respectieve andere uiteinde van het eigenschap-PIN-eigenschapsspectrum, vooral voor de fosforylering en glycosylering van het PTM-type, hoewel voor de laatste geen significante trend van clusteringcoëfficiënten werd gedetecteerd. Voorbeelden van ziekte-geassocieerde gefosforyleerde of geglycosyleerde eiwitten die gedetecteerd zijn met een hoge mate en nabijheid centraliteit of lage clustering coëfficiënt worden gegeven in Tabel 4 . Er kan worden gespeculeerd dat eiwitten met de eigenschappen die zijn geïdentificeerd als meer waarschijnlijke ziekte geassocieerd op basis van hun PIN-eigenschappen, veelbelovende kandidaten kunnen zijn voor geïntensiveerd onderzoek. Het is duidelijk dat de relevantie van het eiwit p53 bij de ontwikkeling van kanker bij de mens al lang wordt erkend [57]. In onze studie werd het geïdentificeerd als een met karakteristieke netwerkeigenschappen die typisch zijn voor ziekte-geassocieerde eiwitten in het algemeen.

Tabel 4

PTM-type PIN-kenmerken Eiwit Ensembl-ID Ziekte
Glycosyleringhoge graad, hoge nabijheid centraal;Pro-epidermale groeifactorENSP0000265171Hypomagnesiëmie 4 (HOMG4) [MIM:611718][67]
Transformatie van groeifactor bèta-1ENSP0000221930Ziekte van Camurati-Engelmann (CE) [MIM:131300][68]
Interleukine-6ENSP0000258743Systemische juveniele reumatoïde artritis (RASJ) [MIM:604302][69]
Fosforyleringhoge graad, hoge nabijheid centraalCellulair tumorantigeen p53ENSP00000269305Slokdarmkanker (ESCR) [MIM:133239] [70] Li-Fraumeni-syndroom (LFS) [MIM:151623][71]
RAC-alfa-serine/threonine-eiwitkinaseENSP00000270202Borstkanker (BC) [MIM:114480] Darmkanker (CRC) [MIM:114500] [72] Proteussyndroom (PROTEUSS) [MIM:176920] [73]
Histonacetyltransferase p300ENSP0000263253Rubinstein-Taybi-syndroom 2 (RSTS2) [MIM:613684][74]
Fosforyleringlage clusteringcoëfficiëntAuto-immuunregulatorENSP00000291582Auto-immuun polyendocrien syndroom 1, met of zonder reversibele metafysaire dysplasie (APS1) [MIM:240300] [75]
ALK-tyrosinekinasereceptorENSP00000373700Neuroblastoom 3 (NBLST3) [MIM:613014] [76]
Ataxine-2ENSP0000366843Spinocerebellaire ataxie 2 (SCA2) [MIM:183090] [77] Amyotrofische laterale sclerose 13 (ALS13) [MIM:183090] [78]

Uiteraard hangt dit onderzoek ook af van de volledigheid en nauwkeurigheid van de beschikbare PTM- en PIN-gegevens. Elke voorkeur voor een specifieke detectie van bepaalde eiwitklassen en hun geassocieerde PTM kan onze resultaten verder scheeftrekken. Door een hoge significantiegrens voor de PIN-gegevens op te leggen (betrouwbaarheidsscore van 0,9) en bovendien gebruik te maken van twee gegevensbronnen (STRING en IntAct), zijn we van mening dat we de juiste voorzorgsmaatregelen hebben genomen, hoewel er enkele discrepanties werden gedetecteerd (Fig. 5 ).Op dit moment kan echter niet worden besloten of de grootte van de dataset (relatief kleine IntAct dataset) of het type pincodes dat wordt vastgelegd deze verschillen veroorzaakt. Met betrekking tot PTM's hebben we alleen experimenteel geverifieerde PTM's gebruikt. Toekomstig onderzoek naar de PIN-kenmerken van PTM's zal profiteren van de verwachte significante toename van experimenteel geverifieerde locaties. Bovendien zal waarschijnlijk een grotere set van verschillende PTM's met voldoende aantallen beschikbaar komen, waardoor ook de PTM-typen die in dit onderzoek zijn gebruikt, nader kunnen worden gespecificeerd.

Een mogelijke selectiebias kan ook komen van het preferentieel profileren van die eiwitten voor PTM's die 'interessante' eigenschappen bezitten die een hoge mate hebben. Aangezien PTM's echter steeds vaker worden geïdentificeerd in massale, 'shotgun'-stijl omics-onderzoeken, is een dergelijke selectiebias misschien niet zo kritisch. In plaats daarvan kan overvloed een punt van zorg zijn. Voor fosforylering werd echter gemeld dat eiwitovervloed niet gecorreleerd is met netwerkeigenschappen [34, 35]. Verder vonden we ook dat netwerkeigenschappen grotendeels onafhankelijk zijn van het aantal PTM's op een bepaald eiwit (S6 Fig.). Hoewel significant vanwege het grote aantal waarnemingen, werd er geen relevante correlatie gevonden voor de graad en noch voor de clusteringcoëfficiënt met het aantal fosforylatieplaatsen dat werd genomen als het PTM-type met de grootste beschikbare dataset. Echter, voor nabijheid centraliteit, een grotere positieve correlatie (R = 0,164) werd gedetecteerd, wat suggereert dat zwaarder gefosforyleerde eiwitten meer centrale posities innemen in het netwerk van eiwit-eiwit-interacties.

Concluderend, eiwitten die verschillende soorten PTM's dragen, verschillen van gemiddelde niet-PTM-eiwitten en verschillen van elkaar met betrekking tot hun eiwitinteractiekenmerken. Hun locatie binnen het web van fysieke eiwit-eiwit-interacties is dus niet alleen niet-willekeurig, maar geeft zeer waarschijnlijk hun specifieke functionele rollen aan in de orkestratie van moleculaire processen die worden gemedieerd door de fysieke interacties tussen eiwitten.


1. Inleiding

Neurodegeneratieve ziekten die een breed spectrum van aandoeningen vertegenwoordigen, verschillen in moleculaire etiologie en progressie, zoals weergegeven door de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), dementie met Lewy-lichaampjes (DLB), de ziekte van Huntington (HD), frontotemporale lobaire dementie (FTLD) , amyotrofische laterale sclerose (ALS), en anderen. Dergelijke ziekten presenteren zich bij patiënten als progressief verslechterende symptomen, soms met overlap tussen diagnoses, zodat ze uiteindelijk en ondubbelzinnig alleen worden geïdentificeerd door kenmerkende moleculaire neuropathologie die bij autopsie wordt gevonden. Cognitieve stoornissen, gedragsstoornissen, motorische sensorische stoornissen en andere stoornissen kunnen elkaar bijvoorbeeld overlappen als gevolg van degeneratie van specifieke neurale circuits en onderliggende dood en/of disfunctie van neuronen, glia en/of vasculatuur. Het pathogene mechanisme dat leidt tot het ontstaan ​​en de progressie van elke ziekte wordt vaak geassocieerd met genetische varianten en mutaties en interacties met omgevingsinvloeden, levensstijlrisicofactoren en langzaam evoluerende moleculaire veranderingen als gevolg van veroudering [1, 2]. Ondanks het brede scala aan neurodegeneratieve klinische en pathologische fenotypes, zijn er verschillende gemeenschappelijke pathogene mechanismen. Een opkomend thema voor de meeste ziekten is de accumulatie van verkeerd gevouwen peptide- of eiwitaggregatie en aggregatieafzetting in gebieden van de hersenschors, basale ganglia en/of ruggenmerg, hoewel de relatie tussen klinisch fenotype en eiwitdisfunctie tot nu toe niet volledig is opgehelderd. [3, 4]. Eiwithomeostase en vouwcapaciteit, soms proteostase genoemd, is gesuggereerd als een mogelijke gemeenschappelijke route die progressief wordt ontregeld door veroudering en neurodegeneratieve pathogenese [5, 6]. Eiwitvormen die post-translationeel ontstaan ​​door modificatie van eiwitresiduen kunnen sterk verschillende eigenschappen hebben als gevolg van een enkele post-translationele modificatie (PTM), bijvoorbeeld fosforylering van Tau in neurofibrillaire tangles, of splitsing en PTM van amyloïde precursor-eiwit (APP) naar gemodificeerde amyloïde beta-peptiden opleveren.

Massaspectrometrie (MS) is een opkomend platform dat is ontwikkeld voor het identificeren en kwantificeren van eiwitten en exacte verschuivingen in massa/lading (m/z) als gevolg van PTM's, van intacte eiwitten of peptiden die afkomstig zijn van die eiwitten. Op MS gebaseerde proteomics hebben een krachtig middel opgeleverd om complexe eiwitmengsels te profileren als tien- tot honderdduizenden peptiden in bottom-up proteomics, en zal de deur openen naar de identificatie van een miljard geschatte proteovormen dankzij specifieke combinaties van PTM's op intacte eiwitten over verschillende celtypen [7], die ook toegankelijk zijn met top-down MS-benaderingen [8]. Een aantal onderzoeksrichtingen om neurodegeneratie op verschillende niveaus te onderzoeken [bijv. in weefsel, subcellulaire en biochemische fracties en biomarkers in het extracellulaire milieu, waaronder plasma of cerebrospinale vloeistof (CSF)] met een verscheidenheid aan specifieke proteomische methoden zijn in het verleden betrokken geweest bij succesvolle ontdekking van biomarkers, ontwikkeling van geneesmiddeldoelen en opheldering van pathogene mechanismen in het verleden 20 jaar [9–17]. Het doel van deze review is om eerst een overzicht te geven van algemene methodologieën die van toepassing zijn op de studie van post-translationele modificaties (PTM's) van eiwitten, en ten tweede bieden we referenties die het belang benadrukken, misschien wel centraal, van PTM's bij het karakteriseren van pathogene processen van neurodegeneratie en onevenwichtigheden in proteostase.


84 Eukaryotische translationele en post-translationele genregulatie

Aan het einde van dit gedeelte kunt u het volgende doen:

  • Begrijp het vertaalproces en bespreek de belangrijkste factoren
  • Beschrijf hoe het initiatiecomplex de vertaling regelt
  • Leg de verschillende manieren uit waarop de post-translationele controle van genexpressie plaatsvindt

Nadat RNA naar het cytoplasma is getransporteerd, wordt het vertaald in eiwit. Controle van dit proces is grotendeels afhankelijk van het RNA-molecuul. Zoals eerder besproken, zal de stabiliteit van het RNA een grote invloed hebben op de translatie ervan in een eiwit. Naarmate de stabiliteit verandert, verandert ook de hoeveelheid tijd die beschikbaar is voor vertaling.

Het initiatiecomplex en de vertaalsnelheid

Net als transcriptie wordt de translatie gecontroleerd door eiwitten die binden en het proces initiëren. Bij vertaling wordt het complex dat zich verzamelt om het proces te starten, het vertaalinitiatiecomplex genoemd. Bij eukaryoten wordt de translatie geïnitieerd door het initiërende met-tRNAi te binden aan het 40S-ribosoom. Dit tRNA wordt naar het 40S-ribosoom gebracht door een eiwit-initiatiefactor, eukaryote initiatiefactor-2 (eIF-2). Het eIF-2-eiwit bindt aan het hoogenergetische molecuul guanosinetrifosfaat (GTP). Het tRNA-eIF2-GTP-complex bindt vervolgens aan het 40S-ribosoom. Op het mRNA vormt zich een tweede complex. Verschillende verschillende initiatiefactoren herkennen de 5'8242 dop van het mRNA en eiwitten gebonden aan de poly-A-staart van hetzelfde mRNA, waardoor het mRNA in een lus wordt gevormd. Het cap-bindende eiwit eIF4F brengt het mRNA-complex samen met het 40S-ribosoomcomplex. Het ribosoom scant vervolgens langs het mRNA totdat het een startcodon AUG vindt. Wanneer het anticodon van het initiator-tRNA en het startcodon zijn uitgelijnd, wordt het GTP gehydrolyseerd, worden de initiatiefactoren vrijgegeven en bindt de grote 60S-ribosomale subeenheid om het translatiecomplex te vormen. De binding van eIF-2 aan het RNA wordt gecontroleerd door fosforylering. Als eIF-2 gefosforyleerd is, ondergaat het een conformationele verandering en kan het niet binden aan GTP. Daarom kan het initiatiecomplex zich niet goed vormen en wordt de vertaling belemmerd ((Figuur)). Wanneer eIF-2 ongefosforyleerd blijft, kan het initiatiecomplex zich normaal vormen en kan de translatie doorgaan.


Een verhoging van de fosforylering van eIF-2 is waargenomen bij patiënten met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington. Welke impact denkt u dat dit kan hebben op de eiwitsynthese?

Chemische modificaties, eiwitactiviteit en levensduur

Eiwitten kunnen chemisch worden gemodificeerd door toevoeging van groepen, waaronder methyl-, fosfaat-, acetyl- en ubiquitinegroepen. De toevoeging of verwijdering van deze groepen aan eiwitten regelt hun activiteit of de tijdsduur dat ze in de cel bestaan. Soms kunnen deze modificaties regelen waar een eiwit in de cel wordt gevonden, bijvoorbeeld in de kern, in het cytoplasma of gehecht aan het plasmamembraan.

Chemische modificaties treden op als reactie op externe stimuli zoals stress, het gebrek aan voedingsstoffen, hitte of blootstelling aan ultraviolet licht. Deze veranderingen kunnen de epigenetische toegankelijkheid, transcriptie, mRNA-stabiliteit of translatie veranderen, wat allemaal resulteert in veranderingen in de expressie van verschillende genen. Dit is een efficiënte manier voor de cel om de niveaus van specifieke eiwitten snel te veranderen als reactie op de omgeving. Omdat eiwitten betrokken zijn bij elk stadium van genregulatie, kan de fosforylering van een eiwit (afhankelijk van het eiwit dat wordt gemodificeerd) de toegankelijkheid tot het chromosoom veranderen, de translatie veranderen (door de binding of functie van de transcriptiefactor te veranderen), kan de nucleaire shuttle veranderen ( door modificaties aan het kernporiecomplex te beïnvloeden), kan de RNA-stabiliteit veranderen (door al dan niet te binden aan het RNA om de stabiliteit ervan te reguleren), kan de translatie wijzigen (verhogen of verlagen), of kan post-translationele modificaties veranderen (toevoegen of verwijderen van fosfaten of andere chemische modificaties).

De toevoeging van een ubiquitinegroep aan een eiwit markeert dat eiwit voor afbraak. Ubiquitine werkt als een vlag die aangeeft dat de eiwitlevensduur compleet is. Deze eiwitten worden verplaatst naar het proteasoom, een organel dat dient om eiwitten te verwijderen, om te worden afgebroken ((Figuur)). Een manier om genexpressie te beheersen, is daarom om de levensduur van het eiwit te veranderen.


Sectie Samenvatting

Het veranderen van de status van het RNA of het eiwit zelf kan invloed hebben op de hoeveelheid eiwit, de functie van het eiwit of hoe lang het in de cel wordt aangetroffen. Om het eiwit te vertalen, moet een eiwit-initiatorcomplex op het RNA worden geassembleerd. Modificaties (zoals fosforylering) van eiwitten in dit complex kunnen voorkomen dat een goede translatie optreedt. Zodra een eiwit is gesynthetiseerd, kan het worden gemodificeerd (gefosforyleerd, geacetyleerd, gemethyleerd of ubiquitinaat). Deze post-translationele modificaties kunnen een grote invloed hebben op de stabiliteit, afbraak of functie van het eiwit.

Vragen over visuele verbinding

(Figuur) Een toename van de fosforyleringsniveaus van eIF-2 is waargenomen bij patiënten met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington. Welke impact denkt u dat dit kan hebben op de eiwitsynthese?

(Figuur) Eiwitsynthese zou worden geremd.

Beoordelingsvragen

Welke van de volgende kunnen worden beïnvloed door post-translationele modificaties van eiwitten?

  1. eiwit functie
  2. transcriptionele regulatie
  3. chromatine modificatie
  4. alle bovenstaande

Een wetenschapper muteert eIF-2 om zijn GTP-hydrolysevermogen te elimineren. Hoe zou deze gemuteerde vorm van eIF-2 de vertaling veranderen?

  1. Initiatiefactoren zouden niet aan mRNA kunnen binden.
  2. De grote ribosomale subeenheid zou niet in staat zijn om te interageren met mRNA-transcripten.
  3. tRNAi-Met zou mRNA-transcripten niet scannen op het startcodon.
  4. eIF-2 zou niet in staat zijn om te interageren met de kleine ribosomale subeenheid.

Vragen over kritisch denken

Eiwitmodificatie kan genexpressie op vele manieren veranderen. Beschrijf hoe fosforylering van eiwitten genexpressie kan veranderen.

Omdat eiwitten betrokken zijn bij elk stadium van genregulatie, kan fosforylering van een eiwit (afhankelijk van het eiwit dat wordt gemodificeerd) de toegankelijkheid tot het chromosoom veranderen, kan de translatie veranderen (door de binding of functie van de transcriptiefactor te veranderen), kan het nucleair pendelen veranderen ( door modificaties aan het kernporiecomplex te beïnvloeden), kan de RNA-stabiliteit veranderen (door al dan niet te binden aan het RNA om de stabiliteit ervan te reguleren), kan de translatie wijzigen (verhogen of verlagen), of kan post-translationele modificaties veranderen (toevoegen of verwijderen van fosfaten of andere chemische modificaties).

Alternatieve vormen van een eiwit kunnen gunstig of schadelijk zijn voor een cel. Wat denk je dat er zou gebeuren als te veel van een alternatief eiwit zich zou binden aan de 3'8242 UTR van een RNA en ervoor zou zorgen dat het degradeerde?

Als het RNA zou worden afgebroken, zou minder van het eiwit waarvoor het RNA codeert, worden getranslateerd. Dit kan dramatische gevolgen hebben voor de cel.

Veranderingen in epigenetische modificaties veranderen de toegankelijkheid en transcriptie van DNA. Beschrijf hoe omgevingsstimuli, zoals blootstelling aan ultraviolet licht, genexpressie kunnen wijzigen.

Omgevingsstimuli, zoals blootstelling aan ultraviolet licht, kunnen de wijzigingen aan de histon-eiwitten of DNA veranderen. Dergelijke stimuli kunnen een actief getranscribeerd gen veranderen in een tot zwijgen gebracht gen door acetylgroepen uit histoneiwitten te verwijderen of door methylgroepen aan DNA toe te voegen.

Een wetenschapper ontdekt een virus dat codeert voor een Proteïne X dat een subeenheid van het eIF4F-complex afbreekt. Wetende dat dit virus zijn eigen mRNA's in het cytoplasma van menselijke cellen transcribeert, waarom zou Proteïne X dan een effectieve virulentiefactor zijn?

Het afbreken van het eIF4F-complex voorkomt dat het pre-initiatiecomplex (eIF-2-GTP, tRNAi-Met en 40S ribosomale subeenheid) wordt gerekruteerd naar de 5'-cap van rijpe mRNA's in de cel. Hierdoor kan het virus de vertaalmachinerie van de menselijke cel kapen om in plaats daarvan zijn eigen (niet-afgetopte) mRNA-transcripten te vertalen.

Woordenlijst


Eiwitplooien: relatie tot splicing en post-translationele modificatie? - Biologie

Post-transcriptionele modificaties Post-transcriptionele modificaties zijn afwezig in prokaryoten. In eukaryoten ondergaan de RNA-transcripten modificaties zoals splicing, capping en tailing. De boodschapper-ribonucleïnezuur (mRNA) sequentie gevormd na transcriptie is exact gelijk aan één van de DNA-streng in volgorde, behalve dat de base uracil wordt vervangen door thymine.

  1. RNA-terminale fosfatase (RTPase) verwijdert het terminale fosfaat van de 5'-trifosfaatgroep van het ontluikende RNA.
  2. RNA-guanylyltransferase (RGTase) voegt GMP toe aan het 5'-uiteinde met GTP als donor.
  3. RNA (guanine-7)-methyltransferase voegt een methylgroep toe aan de N7-positie van de cap-guanosine, met behulp van S-adenosylmethionine als donor, om Cap 0 te produceren.
  4. Methylgroepen kunnen achtereenvolgens worden toegevoegd aan de 2'-groepen van de eerste en tweede ribosegroepen (respectievelijk Cap 1 en 2). Als de eerste getemperde base A is, kan deze op de N6-positie worden gemethyleerd, maar alleen als deze eerst 2'-O-gemethyleerd is. De specificiteit van capping wordt voornamelijk bepaald door het RNA-polymerase. Bovendien zijn alleen RNA's met een di- of trifosfaat aan het 5'-uiteinde substraten voor capping. Daarom worden producten van RNA-polymerase I en III, of van endonuclease-splitsing, niet afgetopt.

3' eindverwerking

Beëindiging van transcriptie door RNA-polymerase II vindt gewoonlijk niet plaats op vaste posities en transcribeert vaak voorbij het 3'-uiteinde van het rijpe mRNA en het juiste 3'-uiteinde van mRNA's wordt gegenereerd door een specifieke endonuclease-splitsing gevolgd door niet-matrijstoevoeging van *250 adenosines om de poly (A) staart te vormen. Het doel van de toevoeging van poly(A)-staart is het verlenen van resistentie tegen exonucleasen tegen 30' en is ook essentieel voor een efficiënte translatie-initiatie. De poly (A)-staart wordt in twee stappen toegevoegd.

Eerst wordt het RNA gesplitst door een endonuclease, 15-30 nt stroomafwaarts van een sterk geconserveerde hexanucleotidesequentie AAUAAA. Poly (A) polymerase synthetiseert vervolgens de poly A-staart met ATP als substraat. De 3'-eindverwerkingsreactie vereist ten minste twee sequenties in het RNA. Het AAUAAA-element verschaft een bindingsplaats voor splitsingspolyadenyleringsspecificiteitsfactor (CPSF), terwijl een gebied stroomafwaarts van de splitsingsplaats verrijkt met U- of G- en U-residuen nodig is voor binding van splitsingsstimuleringsfactor (CstF). Poly(A)-polymerase alleen synthetiseert zeer lange poly A-staarten, maar de aanwezigheid van poly(A)-bindend eiwit II (PAB II) beperkt de lengte van de staart tot de fysiologische lengte van *250 nt. Histon 3'-uiteinden zijn niet gepolyadenyleerd maar aan hun 3'-uiteinden gesplitst door een mechanisme dat onduidelijk is.
Splitsen:
Introns zijn tussenliggende sequenties die de sequenties onderbreken die in het rijpe mRNA (exons) zullen verschijnen en zijn meestal niet-coderend. Introns zoals l-19 coderen echter wel. Deze zijn zeer reactief en worden gesplitst wanneer RNA de secundaire structuur aanneemt na transcriptie. Daarom zijn dit onvertaalbare sequenties omdat ze afwezig blijven in het rijpe transcript. Splicing is in wezen een proces waarbij de exons in een pre-mRNA-sequentie worden samengevoegd, waardoor de introns worden geëlimineerd. Introns zijn meestal aanwezig in eukaryoten en zijn zeldzaam in prokaryoten. De meeste eukaryote genen bevatten introns, maar genen die coderen voor histonen, heat shock-eiwitten, bevatten geen introns. Introns vertonen een grote variatie in lengte en aantal, met een gemiddelde grootte van 3,3 kilobasen bij mensen met een absolute minimumgrootte van 60 basen. Ook variëren ze in aantal van enkele introns tot 177 in het humane titine-gen. Afgezien van het genereren van functionele mRNA's, helpt splicing bij de daaropvolgende export van mRNA's naar het cytoplasma.

Mechanisme van splicing
Intron-splitsing van pre-mRNA vindt plaats in de kern volgens een nauwkeurige en complexe rangschikking van eiwitten en ribonucleaire deeltjes. Rijp mRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma voor translatie. Het is een complex proces waarbij ongeveer 70 eiwitten in hogere eukaryoten en vijf kleine ribonucleoproteïnedeeltjes (snRNP's) betrokken zijn. Uiteindelijk worden pre-mRNA's met coderende sequenties (exons) en tussenliggende sequenties (introns) verwerkt om een ​​continu mRNA te vormen dat alleen exons bevat. Dit proces is evolutionair geconserveerd.

Splicing aan 5'-uiteinde-introns vindt gelijktijdig plaats met transcriptie, terwijl 3'-introns grotendeels post-transcriptioneel worden gesplitst. De RNA-elementen die nodig zijn voor herkenning van de splitsingsplaats omvatten sequenties op de 5'- en 3'-splitsingsplaatsen en korte consensussequenties zoals invariante GU- en AG-dinucleotiden aan hun 5'- en 3'-uiteinden en de A op het 'vertakkingspunt'.

De 5'-splitsingsplaats (soms de 'donor'-plaats genoemd) heeft een 9 nucleotide (nt) consensus (A/C)AG/GURAGU, waarbij R een purine aangeeft en de verticale lijn de exon-intron-grens vertegenwoordigt. De consensussequentie is complementair aan een geconserveerd enkelstrengs gebied in de overvloedige U1 (snRNA), en deze basenparende interactie is van cruciaal belang bij de herkenning van de 5'-splitsingsplaats. De 3'-splitsingsplaats (soms de 'acceptor'-plaats genoemd) heeft de consensus CAGG en wordt voorafgegaan door een gebied dat is verrijkt met pyrimidinen (het polypyrimidine-kanaal). Stroomopwaarts van het polypyrimidine-kanaal bevindt zich de 'vertakkingspunt'-sequentie met consensus YNYURAY, waarbij R een purine is, Y een pyrimidine is, N een willekeurig nucleotide en A het vertakkingspuntresidu is. In gist is er een veel strakkere versie van deze consensus: UACUAAC. De gist-vertakkingspuntsequentie is precies complementair met een geconserveerd enkelstrengs gebied van U2-snRNA, waardoor een enkele mismatch mogelijk is waarbij het vertakkingspunt A uitpuilt.Deze U2-snRNA-branchpoint-interactie is ook belangrijk bij splitsing.

Er zijn twee soorten splitsing: zelfsplitsing en door spliceosoom gemedieerde splitsing
Groep I en II introns ondergaan zelfsplitsing.

Groep I-introns zijn voornamelijk zelfsplitsende introns, ook wel Ribozymen genoemd. Splitsing van groep I-introns wordt verwerkt door twee omesteringsreacties waarbij twee opeenvolgende overdrachtsreacties betrokken zijn. De eerste reactie wordt veroorzaakt door de aanval van een exogeen Guanosine of guanosine-nucleotide op de 3'-OH van de fosfodiëdterbinding op de 5'-splitsingsplaats, wat resulteert in een vrije 3/-OH-groep op het stroomopwaartse exon en de exogene G wordt gehecht naar het 5'-uiteinde van het intron. Vervolgens verwisselt de terminal G van het intron de exoG en bezet de G-bindingsplaats om de tweede esteroverdrachtsreactie te organiseren: de 3'-OH-groep van het stroomopwaartse exon valt de 3'-splitsingsplaats aan, wat leidt tot de ligatie van de aangrenzende stroomopwaartse en stroomafwaartse exons en afgifte van het katalytische intron.

Groep II-introns zijn een andere klasse van zelfsplitsende introns die fungeren als Ribozymen en als mobiele genetische elementen. Net als bij elk splitsingsmechanisme, omvat het ook twee transveresteringsreacties. Unilke groep I introns de eerste nucleofiele aanval wordt getriggerd door de 2' OH van de uitpuilende A om de 5'-splitsingsplaats aan te vallen, waardoor een intron lariat/3'-exon tussenproduct wordt geproduceerd. In de tweede stap is de 3'-OH van het gesplitste 5'-exon het nucleofiel en valt het de 3'-splitsingsplaats aan, wat resulteert in exon-ligatie en excisie van een intron-lariat-RNA. Sommige groep II-intronen splitsen zichzelf in vitro, maar de reactie is over het algemeen traag en vereist niet-fysiologische omstandigheden, bijvoorbeeld hoge concentraties eenwaardig zout en/of Mg++, wat erop wijst dat eiwitten nodig zijn om groep II-intron-RNA's te helpen vouwen in de katalytisch actieve structuur voor efficiënt splitsen.
Spliceosoom gemedieerde splicing:

De splitsingsreactie vindt alleen plaats nadat de consensus splitsingsplaatselementen zijn herkend door verschillende splitsingsfactoren die leiden tot assemblage van een 'Spliceosoom'. Het spliceosoom is een groot ribonucleo-eiwitcomplex dat 50-100 eiwitten en vijf snRNA-componenten (U1, 2, 4, 5 en 6) bevat. De snRNA's bevinden zich elk in voorgevormde kleine nucleaire ribonucleoproteïne (snRNP) -complexen (U1, U2, U4/6 en U5), die verschillende snRNP's bevatten, waarvan sommige gemeenschappelijk zijn voor alle spliceosomale snRNP's. U1- en U2-snRNA's zijn verantwoordelijk voor de herkenning van respectievelijk de 5'-splitsingsplaats en het vertakkingspunt door basenparing. In het volledig geassembleerde spliceosoom helpen U2- en U6-snRNA's om een ​​netwerk van RNA-RNA-interacties te vormen die de reactieve groepen in het pre-mRNA samenbrengen, die ver van elkaar gescheiden zijn in de primaire RNA-sequentie. Ze vormen ook de katalytische kern van het spliceosoom, gedeeltelijk door specifieke plaatsen te verschaffen voor het binden van de Mg2+-ionen die belangrijk zijn voor de katalyse van de splitsing.
Alternatieve mRNA-splitsing

Alternatieve splicing is het proces waarbij enkele genen meerdere boodschapper-RNA's (mRNA's), en dus meerdere eiwitten, tot expressie brengen door differentiële verwerking van het primaire transcript (pre-mRNA). De temporele en ruimtelijke regulatie van eiwitexpressie door alternatieve splicing is bepalend voor zulke diverse biologische processen zoals geslachtsspecificatie in Drosophila, toewijding aan apoptose en geluidsfrequentieherkenning van individuele haarcellen in het slakkenhuis van vogels. Het eerste voorbeeld van alternatieve splitsing werd in 1977 gedefinieerd in het adenovirus en toonde aan dat één pre-mRNA-molecuul op verschillende knooppunten kon worden gesplitst om te resulteren in een verscheidenheid aan rijpe mRNA-moleculen, die elk verschillende combinaties van exons bevatten. Kort daarna bleek alternatieve splicing ook in cellulaire genen voor te komen, waarbij het eerste voorbeeld werd geïdentificeerd in het IgM-gen, een lid van de immunoglobuline-superfamilie. Een ander voorbeeld van een gen met een indrukwekkend aantal alternatieve splitsingspatronen is het Dscam-gen van Drosophila, dat betrokken is bij het begeleiden van embryonale zenuwen naar hun doelwitten tijdens de vorming van het zenuwstelsel van de vlieg. Onderzoek van de Dscam-sequentie onthult zo'n groot aantal introns dat differentiële splitsing in theorie maar liefst 38.000 verschillende mRNA's zou kunnen creëren. Dit vermogen om zoveel mRNA's te creëren, kan de diversiteit bieden die nodig is voor het vormen van een complexe structuur zoals het zenuwstelsel. In feite kan het bestaan ​​van meerdere mRNA-transcripten binnen enkele genen de complexiteit verklaren van sommige organismen, zoals mensen, die relatief weinig genen hebben (ongeveer 20.000).
Trans-splitsing

Trans-splitsing omvat het samenvoegen van exons die afkomstig zijn van afzonderlijke transcripten. Aanvankelijk waren gesplitste groep II-introns in de organellen van planten en algen, en spliced-leader (SL)-afhankelijke trans-splitsing in veel lagere eukaryoten, de enige gedocumenteerde voorbeelden van trans-splitsing in de natuur. Sinds het begin van de jaren negentig is er bewijs verkregen dat suggereert dat trans-splitsing ook kan optreden bij hogere eukaryoten. Met het verrassend lage aantal geïdentificeerde genen bij mensen, is er interesse geweest om te bepalen of trans-splitsing optreedt bij zoogdieren, omdat dit proces mogelijk de codeercapaciteit van een genoom zou kunnen vergroten. . In deze reactie wordt het 5'-exon gedoneerd van een klein RNA-polymerase II-transcript - het SL-RNA. Trans-splitsing vindt plaats op een 3'-splitsingsplaats op een RNA-molecuul dat afzonderlijk wordt getranscribeerd. Toevoeging van SL-RNA aan een 3'-transacceptormolecuul is niet afhankelijk van de vorming van basenparen tussen de twee transcripten. De reactie zelf is analoog aan cis-splicing waarbij twee opeenvolgende transveresteringsreacties betrokken zijn.
RNA-bewerking:
RNA-editing is het enige mechanisme dat de nucleotidesequentie van RNA na transcriptie kan veranderen door toevoeging van nucleotiden waarvoor in de DNA-template niet wordt gecodeerd. RNA-editing omvat de deaminering van cytidinen om uracil te produceren, de deaminering van adenosines om inosines te produceren, of de insertie of deletie van uridinenucleotiden. De best gekarakteriseerde typen mRNA-bewerkingsgebeurtenissen in zoogdiersystemen zijn C tot U en A tot I-bewerking, die plaatsvinden door een chemisch vergelijkbaar deamineringsmechanisme

A naar I bewerken:

Adenosine kan worden omgezet in inosine door hydrolytische deaminering op de N6-positie). Aangezien I door de vertaalmachinerie wordt herkend als G, kan dit het aminozuur veranderen dat wordt gecodeerd door het bewerkte codon, hoewel het geen nieuwe stopcodons kan creëren. In GluRB, een ionkanaal-mRNA, wordt een CAG-glutaminecodon bijvoorbeeld bewerkt tot CIG, dat wordt herkend als een CGG-argininecodon. De sjabloon voor bewerking is in dit geval dubbelstrengs RNA, dat wordt gevormd als gevolg van een complementaire sequentie in het exon (rond de adenosine die moet worden bewerkt) en de stroomafwaartse intronsequentie. Alle RNA's die zijn geïdentificeerd om A naar I-bewerking te ondergaan, worden uitgedrukt in de centraal zenuwstelsel (bijv. door glutamaat gereguleerde ionkanaalreceptoren (GluR) en serotonine (5-HT2C)-receptoren). A tot I-bewerking wordt uitgevoerd door adenosinedeaminasen die inwerken op RNA (ADAR's).
C naar U bewerken:

C naar U-bewerking vindt plaats in apoB-mRNA. ApoB-100, gecodeerd door het onbewerkte mRNA in de lever, is een belangrijk bestanddeel van deeltjes met lage dichtheid lipoproteïne (LDL) en zeer lage dichtheid lipoproteïne (VLDL). In de darm verandert het bewerken van apoB-mRNA op een enkel cytidineresidu (C6666) in U een glutaminecodon (CAA) in een stopcodon (UAA). Het resulterende afgeknotte eiwit (apoB-48) mist het C-terminale LDL-receptorbindende domein van apoB-100 en is een component van chylomicronen.
C naar U-bewerking wordt gekatalyseerd door APOBEC-1 (apoB mRNA-bewerkingsenzym katalytisch polypeptide 1), een cytidinedeaminase, dat bij mensen alleen in de darm tot expressie wordt gebracht. In tegenstelling tot A tot I-bewerking is de primaire sequentie van apoB-mRNA belangrijk voor bewerking. Het minimale RNA dat nodig is voor specifieke bewerkingen omvat een 5'-regulatorelement (onmiddellijk stroomopwaarts van C6666), een 4 nt-spacerelement na de bewerkte site en een 11 nt 'afmeersequentie' onmiddellijk stroomafwaarts. De aanlegplaats is nodig voor binding met hoge affiniteit door ACF, die APOBEC-1 aan het mRNA koppelt voor specifieke bewerking op C6666. ApoB is de enige geïdentificeerde.


Abstract

Neuroligines 1−4 zijn postsynaptische transmembraaneiwitten die presynaptische rijping kunnen initiëren via interacties met β-neurexine. Zowel neuroligines als β-neurexines hebben alternatief gesplitste inserts in hun extracellulaire domeinen. Met behulp van analytische ultracentrifugatie hebben we vastgesteld dat de extracellulaire domeinen van de neuroligines sedimenteren als dimeren, terwijl de extracellulaire domeinen van de β-neurexines monomeer lijken. Sedimentatiesnelheidsexperimenten van getitreerde stoichiometrieverhoudingen van β-neurexine en neuroligine suggereerden een 2:2 complexvorming. De herkenningseigenschappen van individuele neuroligines in de richting van β-neurexin-1 (NX1β), samen met de invloed van hun splice-inserts, werden onderzocht door oppervlakteplasmonresonantie en affiniteitschromatografie. Verschillende neuroligines vertonen een reeks NX1β-affiniteiten die meer dan 2 ordes van grootte omspannen. Terwijl splice insert 4 in β-neurexine alleen lijkt te werken als een modulator van de neuroligine/β-neurexine associatie, is splice insert B in neuroligine-1 (NL1) het sleutelelement dat de NL1/NX1β binding reguleert. Onze gegevens geven aan dat genselectie, mRNA-splitsing en post-translationele modificaties samen leiden tot een gecontroleerde neuroligine-herkenningscode met een rangorde van affiniteiten voor bepaalde neurexines die is geconserveerd voor de neuroligines bij zoogdiersoorten.

Dit werk werd ondersteund door USPHS Grants P42-ES-10337 en R37 GM-18360 aan PT, Cure Autism Now Pilot Grant en National Alliance for Autism Research Grant 843 aan DC, Fonds de la Recherche en Santé du Québec aan AAB, R37 MH52804- 08 tot TCS en NSF DBI-9974819 tot BD

Universiteit van Californië San Diego.

Center for Basic Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center.

Het gezondheidswetenschappelijk centrum van de Universiteit van Texas.

Afdeling Moleculaire Genetica, University of Texas Southwestern Medical Center.

Howard Hughes Medical Institute, Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas.

Aan wie correspondentie moet worden gericht: Afdeling Farmacologie, Universiteit van Californië, San Diego, La Jolla, CA 92093-0636. Telefoon: 858-534-1366. Fax: 858-534-8248. E-mail: [e-mail protected]


We willen Jamie Purcell en Julia Oddo bedanken voor hun eerste concept van dit werk, evenals Jacob Gacke voor zijn voorbereidende werk aan het plasmide-doseringssysteem. We willen ook de leden van het Berglund Lab en Center for NeuroGenetics bedanken voor hun nuttige feedback en opmerkingen.

Universiteit van Florida (UF) [naar J.A.B. en E.T.W.] National Institutes of Health [GM121862 aan J.A.B., OD017865 aan E.T.W.] Rosaria Haugland Graduate Research Fellowship [aan M.A.H.] Belofte aan Kate Graduate Research Fellowship [aan M.A.H.]. Financiering voor open access kosten: UF startup funds.

Belangenconflict verklaring. De Universiteit van Florida, J. Andrew Berglund en Melissa A. Hale hebben een voorlopige octrooiaanvraag ingediend voor het gebruik van synthetische MBNL-eiwitten voor de behandeling van herhaalde expansieziekten.


Bekijk de video: mRNA Splicing (Januari- 2022).