Informatie

Plasmide-gen knock-out


Hoe verwijder je een enkel gen gecodeerd in een operon op een plasmide met behulp van E. coli? Zou je hetzelfde principe kunnen gebruiken als bij het uitschakelen van een gen uit het bacteriële chromosoom dat b.v. van suïcidevector afgeleide allelische vervanging door homologe recombinatie?

Bedankt voor je reactie.


De eenvoudigste manier is om het gen aan beide uiteinden van het operon te knippen door middel van de juiste restrictie-enzymen, maar in het geval dat je meer dan één herkenningsplaats krijgt, dan kun je microRNA of de juiste oligo gebruiken om een ​​haarspeldlus te maken en dat deel te breken. je wilt alleen het operon het zwijgen opleggen, dan moet je het gewoon bijna in het midden van het gen knippen en het afbinden met een onzinreeks, dan verliest het zijn functionaliteit.


Knock-out Plasmid

Gids-RNA's richten zich op introns aan beide zijden van exon 2 en het aantal basen in exon 2 is geen veelvoud van 3, wat frame-shift-mutatie kan veroorzaken.

Guide RNA richt zich op het exon en het basegetal van deletie is geen veelvoud van 3. Na knock-out zou frame-shift-mutatie gen knock-out veroorzaken.

Volledige verwijdering van de coderende sequentie om gen-knock-out te bereiken.

YKO-serie Vector Reportergen Selectiemarker
Lentiviraal YKO-plasmide YKO-LV001-single-gRNA
YKO-LV001-dual-gRNA
EGFP/mCherry (Puro/Neo)
EGFP/mCherry (Puro/Neo)
Niet-viraal YKO-plasmide YKO-RP001-single-gRNA
YKO-RP001-dual-gRNA
EGFP/mCherry (Puro/Neo)
EGFP/mCherry (Puro/Neo)
AAV YKO-plasmide YKO-AAV001-single-gRNA
YKO-AAV001-dual-gRNA
EGFP/mCherry
EGFP/mCherry

001 800 3272 9252 (Telecom)
002 800 3272 9252 (Dacom)
008 800 3272 9252 (Ons)


Een gerichte gen-knockout-methode met behulp van een nieuw geconstrueerd temperatuurgevoelig plasmide gemedieerde homologe recombinatie in Bifidobacterium longum

Bifidobacteriën zijn het hoofdbestanddeel van de menselijke microflora. We construeerden een temperatuurgevoelig (Ts) plasmide door willekeurige mutagenese van de Bifidobacterium-Escherichia coli shuttle-vector pKKT427 met behulp van foutgevoelige PCR. Mutante plasmiden werden geïntroduceerd in Bifidobacterium longum 105-A en, na screening van ongeveer 3000 kolonies, werden kandidaatklonen geselecteerd die groeiden bij 30°C maar niet bij 42°C. Volgens DNA-sequentieanalyse van het Ts-plasmide werden vijf stille en één missense-mutaties gevonden in het repB-gebied. De plaatsgerichte mutagenese toonde aan dat alleen de missense-mutatie relevant was voor het Ts-fenotype. We noemden dit plasmide pKO403. Het Ts-fenotype werd ook waargenomen in B. longum NCC2705 en Bifidobacterium adolescentis ATCC15703. Er werden single-crossover homologe recombinatie-experimenten uitgevoerd om de relatie tussen de lengte van homologe sequenties die op het plasmide worden gecodeerd en de recombinatiefrequentie te bepalen: fragmenten groter dan 1 kb gaven een efficiëntie van meer dan 10 (3) integraties per cel. We hebben gen-knockout-experimenten uitgevoerd met behulp van dit Ts-plasmide. We hebben gen-knockout-mutanten van het pyrE-gebied van B. longum 105-A verkregen en vastgesteld dat homologe dubbele crossover-recombinatie optrad met een efficiëntie van 1,8%. Deze knock-outmethode werkte ook voor het BL0033-gen in B. longum NCC2705.


Knockout/Knock-in-plasmiden

Gentargeting-methoden maken het ook mogelijk om elk gen, label of gemuteerd exon in het genoom in te voegen of in te schakelen. Hiertoe wordt de in te voegen sequentie samen met de positieve selectiemarker in de vector tussen de homologe sequenties gekloond. Om zowel een bepaald gen uit te schakelen als GFP in het genoom in te voegen, zouden we een plasmide maken dat lijkt op het hieronder getoonde, waarbij de sequentie van GFP wordt gekloond samen met het Neomycine-resistentie (NeoR) gen tussen exon 1 en 3 van het beoogde gen. Bij recombinatie wordt de GFP/NeoR-cassette ingevoegd in plaats van exon 2. Het beoogde gen wordt dus verstoord (uitgeschakeld) maar de ingevoegde GFP wordt tot expressie gebracht (ingeschakeld). Zoals te zien is in het bovenstaande voorbeeld, kunt u een floxed-resistentiegen verwijderen met Cre-recombinase. Als GFP onder controle staat van een endogene promotor, kunt u expressie-GFP gebruiken om cellen te volgen die deelnemen aan ontwikkeling of andere fysiopathologische gebeurtenissen waarop de gekozen promotor reageert. Je kunt deze methode ook gebruiken om een ​​endogeen eiwit te taggen met GFP, zoals te zien is in blauwe vlamplasmide OCT4-eGFP-PGK-Puro van het Jaenisch-lab.


Genetische manipulatie in bakkersgist

de gist Saccharomyces cerevisiae is het meest geavanceerde eukaryote model voor recombinant-DNA-technologie geworden. Een van de belangrijkste redenen is dat de transmissiegenetica van gist buitengewoon goed wordt begrepen, en de voorraad van duizenden mutanten die honderden verschillende fenotypen beïnvloeden, is een waardevolle hulpbron bij het gebruik van gist als moleculair systeem. In gist is een ander belangrijk voordeel de beschikbaarheid van een circulair natuurlijk gistplasmide van 6,3 kb. Dit plasmide, met een omtrek van 2 μm, is bekend geworden als het 𠇂-micron” plasmide. Het vormt de basis voor verschillende geavanceerde kloonvectoren. Dit plasmide wordt doorgegeven aan de cellulaire producten van meiose en mitose.

De eenvoudigste gistvectoren zijn derivaten van bacteriële plasmiden waarin de gistlocus van belang is ingevoegd (Figuur 13-11a). Wanneer ze worden getransformeerd in gistcellen, worden deze plasmiden in het algemeen ingevoegd in gistchromosomen door homologe recombinatie met het residente gen en door een enkele of een dubbele crossover (Figuur 13-12). Dientengevolge wordt ofwel het gehele plasmide ingevoegd of wordt het beoogde allel vervangen door het allel op het plasmide. Dergelijke integraties kunnen worden gedetecteerd door cellen uit te platen op een medium dat selecteert op het allel op het plasmide. Omdat bacteriële plasmiden niet repliceren in gist, is integratie de enige manier om met behulp van deze vectoren een stabiel gemodificeerd genotype te genereren.

Afbeelding 13-11

Vereenvoudigde weergaven van vier verschillende soorten plasmiden die in gist worden gebruikt. Elk wordt getoond als een vector voor een bepaald genetisch gebied van belang, dat in de vector is ingevoegd. De functie van dergelijke segmenten kan worden bestudeerd door een (meer.)

Afbeelding 13-12

Twee manieren waarop een ontvangende giststam met een defect x − kan worden getransformeerd door een plasmide met een actief allel (gen x +). De gemuteerde plaats van gen x − wordt weergegeven als een verticale donkergroene balk. Enkele crossovers op positie (meer.)

Als het 2-μm-plasmide wordt gebruikt als de basisvector en andere bacteriële en gistsegmenten erin worden gesplitst (Figuur 13-11b), dan wordt een construct met verschillende bruikbare eigenschappen verkregen. Ten eerste geeft het 2-μm-segment het vermogen om autonoom in de gistcel te repliceren, en insertie is niet nodig voor een stabiele transformatie. Ten tweede kunnen genen in gist worden geïntroduceerd en hun effecten kunnen in dat organisme worden bestudeerd, waarna het plasmide kan worden teruggewonnen en teruggeplaatst in E coli, op voorwaarde dat een bacteriële replicatieoorsprong en een selecteerbare bacteriële marker zich op het plasmide bevinden. Zo een shuttle vectoren zijn zeer nuttig bij het routinematig klonen en manipuleren van gistgenen.

Bij elk autonoom replicerend plasmide bestaat de mogelijkheid dat een dochtercel geen kopie erft, omdat de verdeling van plasmidekopieën naar dochtercellen in wezen een willekeurig proces is, afhankelijk van waar de plasmiden zich in de cel bevinden wanneer de nieuwe celwand wordt gevormd . Als echter de sectie van gist-DNA met een centromeer aan het plasmide wordt toegevoegd (Figuur 13-11c), dan zal de nucleaire spoel die zorgt voor de juiste segregatie van chromosomen het plasmide op ongeveer dezelfde manier behandelen en het verdelen in dochtercellen bij celverdeling. De toevoeging van een centromeer is een stap in de richting van het creëren van een kunstmatig chromosoom. Een volgende stap is gezet door een plasmide dat een centromeer bevat te lineariseren en het DNA van gisttelomeren aan de uiteinden toe te voegen (Figuur 13-11d). Als dit construct gistreplicatieoorsprongen bevat (autonome replicatiesequenties, ARS's), dan vormt het a gist kunstmatig chromosoom (YAC), die zich in veel opzichten gedraagt ​​als een klein gistchromosoom bij mitose en meiose. Wanneer bijvoorbeeld twee haploïde cellen — één met a ura + YAC en een ander lager a ura − YAC — worden samengebracht om een ​​diploïde te vormen, veel tetrads zullen de zuivere 2:2 segregaties vertonen die verwacht worden als deze twee elementen zich gedragen als reguliere chromosomen.

Centromere plasmiden kunnen worden gebruikt om de regulerende elementen stroomopwaarts van een gen te bestuderen (Figuur 13-13). Het relevante coderende gebied en het stroomopwaartse gebied kunnen worden gesplitst in een plasmide, dat kan worden geselecteerd door een afzonderlijke gistmarker zoals ura3 + . Het stroomopwaartse gebied kan worden gemanipuleerd door een reeks deleties te induceren, die worden bereikt door het DNA te knippen, met behulp van een speciaal exonuclease om het DNA in één richting in verschillende mate weg te kauwen en het vervolgens weer samen te voegen. Het experimentele doel is dan om te bepalen welke van deze deleties nog normaal functioneren van het gen mogelijk maakt. De juiste functie wordt getest door het plasmide te transformeren in een ontvanger waarin de chromosoomlocus een defect mutant allel draagt ​​en vervolgens te controleren op de terugkeer van de genfunctie in de ontvanger. De resultaten definiëren over het algemeen een specifiek gebied dat nodig is voor de normale functie en regulatie van het gen.

Afbeelding 13-13

De regulatie van het gistgen x + kan worden bestudeerd door het regulerende gebied te manipuleren door middel van deletie-analyse in vitro en vervolgens de constructen te transformeren in een giststam die een defect allel draagt x − . (CEN, centromeersequentie ARS, (meer.)

In dergelijke regulerende onderzoeken is het vaak handiger om een ​​reportergen te gebruiken in plaats van het gen van belang. Daarom, als de regulatie van gen x is van belang, het promotorgebied van gen x wordt gesplitst aan het reportergen. Een gen dat op grote schaal is gebruikt als reporter in gist, is de bacterie lacZ gen, dat codeert voor het enzym β-galactosidase. Dit enzym breekt normaal gesproken lactose af, maar het kan ook een analoog van lactose, X-Gal (5-broom-4-chloor-indolyl-β, d-galactoside), afbreken om 5-broom-4-chloorindigo te verkrijgen. , die helderblauw is. De blauwe kleur wordt uitgedrukt als een blauwe gistkolonie wanneer deze actief is. (In hoofdstuk 12 hebben we geleerd dat hetzelfde enzym wordt gebruikt om te selecteren op integranten in het pUC18-plasmide.) Over het algemeen worden de fusies zo geconstrueerd dat de promotor van het gen x plus een paar codons van het structurele gen x worden in het juiste leeskader gefuseerd met het gebied dat codeert voor het enzymatisch actieve deel van &#-galactosidase. Deze constructen kunnen worden getransformeerd op een niet-integratieve vector.

Kunstmatige gistchromosomen zijn op grote schaal gebruikt als kloneringsvectoren voor grote delen van eukaryotisch (vooral menselijk) DNA. Bedenk bijvoorbeeld dat bekend is dat de grootte van het gebied dat codeert voor bloedstollingsfactor VIII bij mensen ongeveer 190 kb beslaat en dat het gen voor spierdystrofie van Duchenne meer dan 1000 kb beslaat. Bovendien betekent de grote omvang van zoogdiergenomen in het algemeen dat bibliotheken die in bacteriële vectoren zijn gemaakt enorm zouden zijn. Kunstmatige gistchromosomen dragen veel langere inserts, wel 1000'x02005kb, en de bibliotheekgrootte is dienovereenkomstig kleiner. We komen op dit onderwerp terug in hoofdstuk 14.

BERICHT

Gistvectoren kunnen integratief zijn, autonoom repliceren of lijken op kunstmatige chromosomen, waardoor genen kunnen worden geïsoleerd, gemanipuleerd en opnieuw ingebracht in moleculair genetische analyse.


Effecten van profaagregio's in een plasmide met een carbapenemase-gen op overleving tegen antibioticastress

We onderzochten het evolutionaire belang van cryptische profaagelementen in eenNDM-1-dragend plasmide door het effect van profaagregio's op overleving tegen antibioticastress te onderzoeken. Bij het analyseren van een plasmide dat een NDM-1-coderend gen herbergt in Klebsiella pneumoniae uit Zuid-Korea, vonden we een profaaggebied in het plasmide. We construeerden single-prophage knock-out (KO) mutanten door genvervanging. Het intacte plasmide en de plasmiden met verwijderde profagen werden geconjugeerd in Escherichia coli DH5a. De groeisnelheid en gevoeligheid voor antibiotica werden bepaald en de overlevingspercentages van stammen werden geëvalueerd in aanwezigheid van antibiotica, zoals imipenem, amikacine, gentamicine, cefotaxime en piperacilline/tazobactam. Een transcriptionele respons van sigma-factorcoderende genen (rpoS en rpoE) en reactieve zuurstofspecies (ROS)-gerelateerde genen van verschillende operons (soxS, fumC, oxyR en katE) op een sub-remmende concentratie van aminoglycosiden werd gevolgd door kwantitatieve reële -time polymerase kettingreactie (qRT-PCR). Het profaaggebied bestaat uit vier cryptische profagen van 16.795 bp en 19 coderende DNA-sequenties. Een transconjugant van Escherichia coli die het plasmide met intacte profagen droeg, vertoonde een verhoogde overleving tijdens behandeling met verschillende antibiotica, waaronder imipenem en amikacine, maar transconjuganten die dit plasmide met een enkelvoudige profaag KO droegen, deden dat niet. mRNA-expressieanalyses onthulden dat sigmafactor-eiwitten (rpoB en rpoE) sterk werden opgereguleerd door antibiotica. We stellen voor dat cryptische profagen in het antibioticumresistentieplasmide kunnen bijdragen aan de aanpassing van de bacteriële gastheer aan antibioticastress. We zijn bezorgd dat de combinatie van profagen met een medicijnresistentieplasmide medicijnresistente bacteriën in een vijandige omgeving helpt en hun verspreiding versnelt.

trefwoorden: New Delhi metallo-β-lactamase plasmide profaag.


Referenties

Kowalczyk DW, Ertl HCJ. Immuunreacties op DNA-vaccins Cell Mol Life Science 1999 55: 751–770

Conry RM et al. Een carcino-embryonaal antigeen-polynucleotidevaccin heeft: in vivo antitumoractiviteit Gentherapie 1995 2: 59–65

Conry RM, LoBuglio AF, Curiel DT. Polynucleotide-gemedieerde immunisatietherapie van kanker Semin Oncol 1996 23: 135–147

Conry RM. Fase Ia-studie van een polynucleotide-antitumorimmunisatie tegen humaan carcino-embryonaal antigeen bij patiënten met gemetastaseerde colorectale kanker Hum Gene Ther 1996 7: 755–772

Lied K, Chang Y, Prud'homme GJ. Regulering van T-helper-1 versus T-helper-2-activiteit en verbetering van tumorimmuniteit door gecombineerde op DNA gebaseerde vaccinatie en niet-virale cytokine-genoverdracht Gentherapie 2000 7: 481–492

Irvine KR, Rao RB, Rosenberg SA, Restifo NP. Cytokineversterking van DNA-immunisatie leidt tot effectieve behandeling van vastgestelde longmetastasen J Immunol 1996 156: 238–245

Schirmbeck R, Böhm W, Reimann J. DNA-vaccinatie stimuleert MHC klasse I-beperkt, apenvirus 40 antigeenspecifieke CTL's voor grote tumoren in H-2 d-muizen die syngene tumoren afwijzen J Immunol 1996 157: 3550–3558

Amici A, Venanzi FM, Concetti A. Genetische immunisatie tegen neu/erbB2 transgene borstkanker Kanker Immunol Immunother 1998 47: 183–190

Chen Yu et al. DNA-vaccins die coderen voor Neu met volledige lengte of verkorting, induceren beschermende immuniteit tegen borsttumoren die Neu tot expressie brengen kankeronderzoek 1998 58: 1965–1971

Weber LW et al. Tumorimmuniteit en auto-immuniteit geïnduceerd door immunisatie met homoloog DNA J Clin Invest 1998 102: 1258–1264

Cohen AD, Boyer JD, Weiner DB. Moduleren van de immuunrespons op genetische immunisatie FASEB J 1998 12: 1611–1626

Heath WR, Carbon FR . Cytotoxische T-lymfocytactivering door kruispriming Curr Opin Immunol 1999 11: 314–318

Vogel LA et al. Directe binding van IL-12 aan humane en muriene B-lymfocyten Int Immunol 1996 8: 1955–1962

Dubois B et al. Kritische rol van IL-12 in dendritische cel-geïnduceerde differentiatie van naïeve B-lymfocyten J Immunol 1998 161: 2223–2231

Martin RM, Lew AM. Is IgG2a een goede Th1-marker bij muizen? Immunol vandaag 1998 19: 49

Melief CJM. Tumoruitroeiing door adoptieve overdracht van cytotoxische T-lymfocyten Adv kankeronderzoek 1992 58: 143–175

Greengerg PD. Adoptieve T-celtherapie van tumoren: mechanismen die werkzaam zijn bij de herkenning en eliminatie van tumorcellen Adv Immunol 1991 49: 281–355

McLaughlin JP, Schlom J, Kantor JA, Greiner JW. Verbeterde immunotherapie van een recombinant carcino-embryonaal antigeen vacciniavaccin indien gegeven in combinatie met interleukine-2 kankeronderzoek 1996 56: 2361–2367

Lee RK et al. Perforine, Fas-ligand en tumornecrosefactor zijn de belangrijkste cytotoxische moleculen die worden gebruikt door lymfokine-geactiveerde killercellen J Immunol 1996 157: 1919–1925

Buller RML et al. Inductie van cytotoxische T-celreacties in vivo bij afwezigheid van CD4-helpercellen Natuur 1987 328: 77–79

Thomson SA et al. Levering van meerdere CD8 cytotoxische T-celepitopen door DNA-vaccinatie J Immunol 1998 160: 1717–1723

Storkus WJ, Tahara H, Lotze M. Interleukine-12. In: Thomson A (ed) Het Cytokine-handboek, derde editie Academische pers: San Diego, CA 1998, blz. 391-425

Klinman DM et al. CpG-motieven die aanwezig zijn in bacterieel DNA, induceren lymfocyten snel om interleukine 6, interleukine 12 en interferon uit te scheiden. Proc Natl Acad Sci USA 1996 93: 2879–2883

Klinman DM, Yamshchikov G, Ishigatsubo Y. Bijdrage van CpG-motieven aan de immunogeniciteit van DNA-vaccins J Immunol 1997 158: 3635–3639

Sato Y et al. Immunostimulerende DNA-sequenties die nodig zijn voor effectieve intradermale genimmunisatie Wetenschap 1996 273: 352–354

Galanis E, Rubin J. Intratumorale genoverdracht van de HLA-B7 gen in coloncarcinoommetastasen. In: Walther W, Stein U (eds) Gentherapie van kanker Humana Press: Totowa 2000 pp 453-467

Heller L et al. Elektrisch gemedieerde plasmide-DNA-afgifte aan hepatocellulaire carcinomen in vivo Gentherapie 2000 7: 826–829

Hartikka J et al. Een verbeterde plasmide-DNA-expressievector voor directe injectie in skeletspier Hum Gene Ther 1996 7: 1205–1217


Gene Knockout van Beneficial Plant-geassocieerde Bacillus spp. Het CRISPR-Cas9 Double Plasmid-systeem gebruiken

Bacillus spp. hebben een groot landbouwpotentieel als plantengroeibevorderaar en biocontrolemiddel. Er is echter weinig bekend over de bacteriële moleculaire basis voor het verbeteren van de plantfitness. Het is dus zeer wenselijk om technieken te ontwikkelen die kunnen bijdragen aan de opheldering van de genetische basis voor de mechanismen die betrokken zijn bij gunstige bacterie-plant-interacties. In deze context is CRISPR (geclusterde regelmatige interspaced korte palindroomherhalingen)-Cas9 een krachtig hulpmiddel op basis van programmeerbare moleculaire scharen die nauwkeurige incisies in elke DNA-sequentie uitvoeren. CRISPR-Cas9 kan gensequenties veranderen en vormt een geavanceerd hulpmiddel om de rol en functie van bacteriële genen in verband met de voordelen van plantinteracties op te helderen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een haalbaar CRISPR-Cas9-systeem in een dubbel plasmide, één plasmide dat het Cas9-endonuclease herbergt en het andere het sgRNA, om gen-knock-out/-editing in het geslacht Bacillus te bevorderen. Deze benadering bevordert een hoge efficiëntie bij het genereren van mutanten voor een of meer genen in continue of multiplexbewerking. Bovendien kan het vanwege zijn universaliteit worden toegepast op andere geslachten dan Bacillus.

trefwoorden: Bacteriën-plant interacties Gene editing Gen knock-out Genetische manipulatie Gram-positieve bacteriën.


Vooruitgang in genoomengineering stelt onderzoekers in staat om ongekende doorbraken te bereiken, van het genezen van genetische aandoeningen tot het ontwikkelen van ziekteresistente gewassen. Sigma-Aldrich® Advanced Genomics biedt volledige ondersteuning voor elke stap van op CRISPR gebaseerd onderzoek naar genbewerking op elke schaal. Richt je op een enkel gen met behulp van zinkvingernucleasen of screen een heel genoom met volledig aanpasbare CRISPR-producten.

Met meer dan 350 jaar technisch leiderschap, worden Sigma-Aldrich® Advanced Genomics-producten geleverd met expertise die verder gaat dan de bank - van ontdekking tot therapeutische impact.

De Sigma-Aldrich® Advanced Genomics-portfolio levert de ultieme suite van genoomengineering-tools en -services om uw onderzoekspotentieel te ontsluiten. Of u nu op zoek bent naar knock-out, knock-in, knock-down of overexpressie van uw doelen, onze uitgebreide suite van CRISPR-tools en services voor het bewerken van genen zal uw onderzoek verder brengen dan de bank.


DISCUSSIE

In het verleden zijn genetische hulpmiddelen doorgaans individueel ontwikkeld voor specifieke cyanobacteriële stammen en voor specifieke functies. Over het algemeen zijn deze tools niet ontworpen om modulair te zijn of om in verschillende spanningen te werken, en er was een gebrek aan standaardisatie en karakterisering van hun samenstellende delen. Standaard biologische onderdelen (http://partsregistry.org) en assemblageschema's (bijv. BioBrick en BglBrick) zijn ontworpen voor de constructie van synthetische genetische systemen. Deze systemen zijn echter vaak gericht op eiwitexpressie en werken in slechts enkele veelgebruikte organismen zoals: E coli, B. subtilis, of gist. Het hier beschreven GC-adapterassemblagesysteem is daarentegen gebaseerd op een modulaire vectorruggengraat, inclusief onderdelen voor plasmide-replicatie in E coli, conjugale overdracht, antibioticaresistentie en plasmide-replicatie of chromosomale integratie in cyanobacteriën, en maakt de constructie van plasmiden voor een breed scala aan cyanobacteriën mogelijk. Het assemblageschema maakt de constructie van verschillende soorten vectoren mogelijk, waaronder zelfreplicerende vectoren met een breed gastheerbereik en vectoren die specifiek zijn voor bepaalde cyanobacteriële stammen, evenals integratievectoren (zelfmoord) voor genetische knockin en knock-out. Vanwege de modulariteit van dit systeem kunnen meerdere compatibele zelfreplicerende plasmiden en integratieplasmiden worden geconstrueerd voor een bepaalde stam, wat de productie mogelijk maakt van zwaar gemanipuleerde stammen die meerdere genetische modificaties bevatten. Veel experimentele ontwerpen vereisen het gebruik van meerdere integratieplaatsen of autonoom replicerende plasmiden en meerdere resistentiemarkers. Bijvoorbeeld de studie van circadiane ritmes in S. PCC7942 kan de engineering van een stam vereisen met een reporterapparaat om ritmiek te volgen, een gen knock-out, een WT-kopie van het gen voor het testen van complementatie en een gen dat is getagd met een reportersysteem voor het bepalen van eiwitlokalisatie (23). Een ander voorbeeld is de productie van isobutyraldehyde in S. PCC7942 werd bereikt door de heterologe expressie van vijf verschillende genen van drie verschillende integratieplaatsen in het chromosoom, waaronder twee neutrale plaatsen (64).

De constructie van gemanipuleerde cyanobacteriële stammen berust ofwel op chromosomale integratie door middel van homologe recombinatie of op autonoom replicerende plasmiden. Op basis van eerdere onderzoeken (23, 47-51), hebben we verschillende neutrale locaties ontworpen als apparaten die compatibel zijn met de GC-adapterassemblage voor S. PCC7942 en EEN. PCC7120. Homologe recombinatie wordt ook gebruikt om gen-knockouts of genmodificaties uit te voeren. Modules die een replicatieoorsprong bevatten voor E coli, een oorsprong van overdracht, en a sacB gen voor tegenselectie werden geproduceerd als apparaten om de constructie van knock-outplasmiden mogelijk te maken.

Chimere plasmiden opgebouwd uit an E coli plasmide en een endogeen cyanobacteriële plasmide zijn vaak gebruikt als cyanobacteriële shuttlevectoren (30-34, 35). We hebben verschillende cyanobacteriële replicons geconstrueerd als apparaten die compatibel zijn met de GC-adapterassemblage voor: EEN. PCC7120, F. diplosiphon UTEX481, N. ATCC29133 en S. PCC7942. Sommige stamspecifieke cyanobacteriële replicons hebben mogelijk een breder gastheerbereik dan momenteel bekend, omdat pDU1 bijvoorbeeld werd geïsoleerd uit Nostoc PCC7524 maar het is bekend dat het repliceert in verschillende fylogenetisch verre stammen, waaronder: EEN. PCC7120, Anabaena M-131 (65), Fischerella muscicola PCC7414, Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912 (66), Chroococcidiopsis spp. str. 029, 057 en 123 ( 67) en Oscillatoria MKU 277 ( 68).

Als alternatief is bekend dat derivaten van het brede gastheerbereik-plasmide RSF1010 repliceren in talrijke cyanobacteriële stammen (24, 27, 38-41). RSF1010 is echter een slechte kloneringsvector, waarvan we vermoedden dat het te wijten was aan het vermogen om zichzelf te mobiliseren. Om dit probleem te omzeilen, voerden we een conservatieve substitutie uit in de actieve plaats van mobA, Y25F, waarvan bekend is dat het decolleté voorkomt bij oriT en onderdrukken de zelfmobiliteit van RSF1010 bijna volledig (43). Dit resulteerde in een variant van het plasmide, RSF1010(mobAY25F), dat 5-voudig bruikbaarder DNA produceert voor kloneringsexperimenten, een betere naadloze kloneringsefficiëntie heeft en zijn brede gastheerbereik-eigenschappen behield. Hoewel de conjugatie-efficiëntie met 2 tot 4 ordes van grootte was verminderd, was dit geen beperking in onze experimenten, en het is mogelijk dat een WT-kopie van mobA zou in trans op een helperplasmide kunnen worden geleverd om de conjugatie-efficiëntie te verbeteren voor experimenten die dit vereisen. Een tweede puntmutatie die vroeg in het leeskader van een stopcodon introduceerde mobC, waarvan bekend is dat het product de expressie van RSF1010-replicatiegenen mede onderdrukt (42), resulteerde in een plasmide dat iets meer bruikbaar DNA produceerde, maar deze variant had een drastisch verminderde conjugatie-efficiëntie voor EEN. PCC7120 en L. BL0902, en vervoegingen mislukt voor S. PCC6803. Onze resultaten toonden aan dat de RSF1010(mobAY25F)-plasmide is stabiel in de meeste stammen die zijn gekweekt onder selectie van antibiotica. Echter, na enkele maanden van selectieve groei, twee mariene Synechococcus stammen verloren het plasmide, vermoedelijk omdat ze spontaan resistent werden tegen het selectieve antibioticum.

De genetica van cyanobacteriën is grotendeels gebaseerd op de selectie van antibiotica van transformanten die een marker voor antibioticaresistentie dragen. Daarom vergemakkelijkt het hebben van een panel van antibioticamarkers om uit te kiezen de constructie van zwaar gemanipuleerde stammen. Zeventien variaties van antibioticummarkers voor zes antibioticaklassen werden geconstrueerd als apparaten die compatibel zijn met het GC-adapterassemblagesysteem en negen werden gekarakteriseerd in geselecteerde cyanobacteriële stammen. Het is niet verrassend dat we ontdekten dat de antibiotische markers verschillend presteerden in verschillende stammen. Sommige, zoals de aadA gen, dat zorgt voor selectie met spectinomycine en streptomycine, vertoonde grote bruikbaarheidsvensters in een breed scala aan gastheren. Andere markers voor antibioticaresistentie bleken ook in verschillende mate nuttig te zijn bij verschillende stammen, waaronder de kat genen en de twee nieuw gekarakteriseerde codon-geoptimaliseerde nat genen die nourseothricine (Nt)-resistentie verlenen.

In dit werk hebben we de expressie gekarakteriseerd van vier fluorescerende reportereiwitten, eCFP, GFPmut2, yemGFP en YFP, aangedreven door de PconII-promotor in verschillende stammen. Reporterfluorescentie was aanzienlijk verschillend van stam tot stam. De GFPmut2 werkte goed in alle bestudeerde stammen. In vergelijking met GFPmut2 was de fluorescentie van yemGFP significant hoger (4-5 maal) in L. BL0902 en met name hoger in S. PCC7942 maar aanzienlijk lager in S. PCC6803 en niet detecteerbaar in EEN. PCC7120. eCFP- en YFP-reporters geconstrueerd met dezelfde promotor en RBS als werd gebruikt voor GFPmut2 en yemGFP werkte niet in een van deze vier stammen. Zoals hieronder wordt besproken, zijn de eCFP- en YFP-reporters verbeterd door geoptimaliseerde RBS's en RiboJ-isolatorsequenties op te nemen.

Promoters zijn sleutelcomponenten in de synthetische biologie. Verschillende promoters, waaronder promoters die reageren op omgevingsstimuli, zijn gekarakteriseerd om fundamentele biologische processen te begrijpen en sommige hiervan zijn toegepast om de expressie van genen in natieve of heterologe routes aan te sturen. De meeste promotors zijn bestudeerd of gebruikt in hun oorspronkelijke organismen (1, 69), maar een paar heterologe promotors, conII, T7, tac, tet en trc, zijn gebruikt in cyanobacteriën. Gedetailleerde karakterisering van de trc en tet promotors in S. PCC6803 is uitgevoerd door Huang et al. (18) en Huang en Lindblad (70), respectievelijk. We hebben ons gericht op het karakteriseren van twee constitutieve promotors, PconII en PpsbAI en twee induceerbare promotors, PphoA en PisiA. De PpsbAI promotor wordt gereguleerd door licht ( 58), maar wordt constitutief tot expressie gebracht onder onze groeiomstandigheden. Reporter fluorescentieniveaus verkregen met PpsbAI waren significant lager dan bij PconII in alle stammen behalve EEN. PCC7120. Voor stammen die de P . dragenphoA promotor of de PisiA promotor, werden verschillende reacties tussen stammen waargenomen. Beide promotors kunnen worden gebruikt in: L. BL0902 en S. PCC7942 omdat ze meestal uit waren in vol medium en ze werden geïnduceerd in medium dat verarmd was aan voedingsstoffen. Deze twee promotors vertoonden echter geen regulering in A. PCC7120 of S. PCC6803 en PisiA was niet functioneel in S. PCC6803.

Voor optimale genexpressie beïnvloedt het codongebruik de translatiesnelheid, maar in de meeste gevallen is de translatie-initiatie de snelheidsbeperkende stap. Initiatie hangt af van de hybridisatie van het 16S-rRNA aan de RBS, de binding van het tRNA-fMet aan het startcodon, de afstand tussen RBS en het startcodon en de aanwezigheid van secundaire RNA-structuren die ofwel de 16S-rRNA-bindingsplaats of de stand-by website ( 61). Typische werkwijzen voor heterologe eiwitexpressie in cyanobacteriën zijn vaak afhankelijk van ofwel de natieve RBS die is geassocieerd met de gebruikte promotor of de RBS die is geassocieerd met het open leesraam dat tot expressie moet worden gebracht. In beide gevallen kan het gebruik van identieke RBS-sequenties in verschillende genetische contexten resulteren in verschillende eiwitexpressieniveaus. Om te bepalen of de translatie-initiatie verantwoordelijk was voor de slechte expressie van eCFP en YFP, hebben we constructen getest die geoptimaliseerde RBS-sequenties bevatten, die in hun genetische context waren geoptimaliseerd met behulp van een RBS-calculator (61), en de geoptimaliseerde RBS-sequenties onder leiding van de op ribozym gebaseerde isolatorvolgorde RiboJ ( 62). Over het algemeen lieten onze resultaten een significant verbeterde expressie van eCFP en YFP zien in alle vier de geteste stammen, met de uitzondering dat RiboJ de expressie van eCFP en YFP in S. PCC7942 om onbekende redenen.

Bibliotheken van promoters, translatie-initiatie-elementen en transcriptieterminators zijn gekarakteriseerd in E coli en gecorreleerd met modellen om het kwantitatieve gedrag van nieuwe combinaties van genetische delen betrouwbaar te voorspellen (71, 72). Genetische circuits, inclusief logische poorten en apparaten die herschrijfbare gegevensopslag mogelijk maken, zijn ontwikkeld in E coli (73, 74). Het gebied van synthetische biologie voor cyanobacteriën is echter veel minder geavanceerd en we kunnen niet vertrouwen op voorspeld gedrag op basis van resultaten in E coli toe te passen op verschillende cyanobacteriële stammen. In feite vonden we grote variaties tussen cyanobacteriële stammen voor de bruikbaarheid van antibiotische resistentiemarkers, reportergenen en promotors. Daarom moeten onderdelen en apparaten in elke cyanobacteriële stam worden gekarakteriseerd en gevalideerd. De taak is niet triviaal, maar is vereist om één doel van synthetische biologie te bereiken: het vermogen om complexe circuits te engineeren op basis van voorspellende modellen.

Dit werk biedt een geïntegreerd en uitbreidbaar platform voor de efficiënte constructie van vectoren en afgewerkte plasmiden van in silico ontwerp naar laboratoriumprotocollen. Een assemblagestrategie, veel biologische apparaten, bioinformatica-tools en verbeterde protocollen werden bedacht om de nodige tools te bieden om een ​​breed scala aan plasmiden te construeren voor genetische experimenten en genetische manipulatie van een breed scala aan diverse cyanobacteriën. Tweeënveertig shuttle-plasmiden werden geassembleerd en geïntroduceerd in geselecteerde cyanobacteriën om 23 modules of apparaten te karakteriseren. Daarnaast hebben we 24 vectoren geconstrueerd met kloneringsplaatsen, verschillende markers voor antibioticaresistentie en verschillende neutrale plaatsen of de breed-host-range replicon-variant van RSF1010 (aanvullende spreadsheet S1, Shuttles). Tot nu toe zijn 53 verschillende apparaten getest.

De combinatorische constructie van shuttle-vectoren bleek zeer efficiënt te zijn en dit platform is gemakkelijk uitbreidbaar door toevoeging van nieuwe biologische apparaten die geschikte overlappende GC-adaptersequenties dragen die compatibel zijn met ons systeem. In dit werk werden apparaten en shuttle-vectoren geconstrueerd voor cyanobacteriën, maar veel van de apparaten en het constructieschema zijn van toepassing op andere organismen. Het is bijvoorbeeld bekend dat op RSF1010 gebaseerde plasmiden repliceren in een breed scala aan andere gastheren dan cyanobacteriën, en andere replicons en integratieapparaten kunnen aan het platform worden toegevoegd.

Up until a few years ago, cyanobacterial genetics and engineering have mostly been developed in a relatively small number of academic and research laboratories. However, over the past decade, cyanobacteria have become targeted organisms for synthetic biology and metabolic engineering by an increasing number of laboratories and companies that are developing cyanobacteria as photosynthetic production platforms. Our improved genetic toolbox for cyanobacteria, which includes a wide variety of parts and devices for genetic manipulations in a variety of cyanobacterial strains, will greatly benefit the research and industrial communities.