Informatie

Wat regelt de timing van de beweging van moleculaire machines tijdens DNA-replicatie?


Deze vraag gaat over deze video die ik op Youtube vond. Ik wil gewoon weten wat het mechanisme is dat de timing van de beweging van de onderdelen van deze moleculaire machines regelt.

Ik weet dat die grote moleculen bewegen met behulp van mechanische energie van ATP-moleculen en profiteren van de elektrische krachten, met name de waterstofbruggen, ze profiteren ook van de Brownse beweging van watermoleculen om hen heen.

Van wat te zien is, activeert het groene zwevende molecuul het hele proces door het paarse molecuul te bevestigen, waarna een elektrisch evenwicht wordt verstoord, zodat het {paars+groene} molecuul wordt aangetrokken door het horizontale cyaanmolecuul... enz.

Maar het probleem is: hecht het groene molecuul zich periodiek aan deze groep? of met andere woorden, hebben de Okazaki-fragmenten altijd dezelfde lengte?

Bij voorbaat dank !


Dat is een mooie video, ik zal je eerst wat achtergrondinformatie geven. Het is een illustratie van het 'trombonemodel' van DNA-replicatie. Het donkerblauwe molecuul is helicase, het wikkelt het DNA af en vergemakkelijkt translocatie (dit is een ATP-afhankelijk proces). De donkerpaarse moleculen zijn DNA-polymerase, ze katalyseren de synthese van de DNA-streng (een NTP-afhankelijk proces) met behulp van een ssDNA-template en een 3'-OH-primer (de primer:template-junctie). De groene cirkelvormige moleculen zijn schuifklemmen, ze verhogen de procesiviteit van DNA-polymerase. Het lichtpaarse molecuul is de schuifklemlader, het is niet verwonderlijk dat het de schuifklem op het DNA laadt (ATP-afhankelijk). Het lichtblauwe molecuul is een flexibele linker die alles met elkaar verbindt. Het andere groene molecuul (degene die in contact komt met helicase) is primase, het synthetiseert RNA-primers (die de 3'-OH bevat die aanvankelijk door DNA-polymerase werd gebruikt).

Zeker, intermoleculaire krachten spelen een belangrijke rol in dit (en elk) biochemische proces, maar ik weet niet precies waar je het over hebt als je elektrische krachten en Brownse beweging beschrijft.


Hoe dan ook, het antwoord op je vraag is nee, Okazaki-fragmenten hebben geen vaste lengte. DNA-synthese, zoals hierboven vermeld, vindt alleen plaats door NTP's toe te voegen aan een 3'-OH-primer. Dus de lengte van Okazaki-fragmenten is afhankelijk van de afstand tussen primers op de achterblijvende streng. Dit is afhankelijk van wanneer primase bindt, wat op zijn beurt afhankelijk is van de primase-concentratie en de bindingsaffiniteit met DNA en andere replicatievorkeiwitten (vooral helicase). Hoge concentratie en/of hoge affiniteit leidt tot een hogere bindingsfrequentie en dus tot kortere Okazaki-fragmenten. Het tegenovergestelde geldt voor lage concentratie en/of lage affiniteit. Merk op dat de meeste (of alle?) primasen een zekere mate van sequentiespecificiteit hebben, wat betekent dat specifieke DNA-motieven de bindingsaffiniteit zullen verhogen. Bijvoorbeeld, Escherichia coli primase (DnaG) herkent het trimeer GTA.

Dit proces vereist ook enige mate van coördinatie tussen leidende en achterblijvende strengsynthese. Primersynthese en DNA-polymerase-recycling op de achterblijvende streng is veel langzamer dan de continue synthese op de leidende streng. Er is gesuggereerd dat primase werkt als een "moleculaire rem" door de replicatievork te stoppen tijdens primersynthese om te voorkomen dat de polymerase van de leidende streng die op de achterblijvende streng snel overtreft (Lee JB, Hite RK, Hamdan SM, Xie XS, Richardson CC , van Oijen AM. 2006. DNA-primase werkt als een moleculaire rem in DNA-replicatie. Nature. 439 (7076):621-624.).


Hoe menselijke cellen het begin van DNA-replicatie coördineren?

Het Origin Recognition Complex (ORC) is een groep eiwitten die volledig moet worden geassembleerd voor de eerste stap in DNA-replicatie. Een onderdeel van de ORC, ORC1 (zichtbaar in deze afbeelding als felgroene stippen), wordt gesekwestreerd in druppeltjes in de kern van de cel, en mag kort bewegen en samenvoegen met andere eiwitten op het juiste moment in de celcyclus. Krediet: Manzar Hossain/Stillman lab/CSHL, 2021

Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) President en CEO Bruce Stillman ontleedt sinds de jaren tachtig DNA-replicatie, een cruciale stap in celdeling. Zijn laboratorium bestudeert hoe Origin Recognition Complexen - ORC's - DNA-duplicatie coördineren. Ze ontdekten hoe onze cellen ORC's assembleren en demonteren tijdens de celdelingscyclus. Eén ORC-eiwit wordt gesekwestreerd in kleine vloeistofdruppeltjes, waardoor het apart wordt gehouden tot het juiste moment om andere eiwitten te rekruteren en DNA-replicatie te initiëren.

De ORC herkent waar replicatie moet worden gestart op talrijke locaties langs de lange, lineaire stukken DNA in de chromosomen van onze cellen. Volledig geassembleerde ORC's rekruteren andere eiwitten om precieze kopieën van de chromosomen te maken. Dit mechanisme is nodig om DNA nauwkeurig te erven zonder fouten die kunnen leiden tot aandoeningen zoals kanker.

Wetenschappers hebben de structuur van ORC's bij verschillende soorten bestudeerd. Stillman legt uit:

"We hebben dit eerder onderzocht in bakkersgist, maar het blijkt dat menselijke cellen een andere manier van werken hebben."

In tegenstelling tot eencellige gist, hebben mensen een verscheidenheid aan cellen die zich op verschillende tijdstippen delen. Om dit te choreograferen, ontdekten de onderzoekers dat één menselijk ORC-eiwit, ORC1, bepaalde regio's heeft die ORC1 van gist mist. Wanneer ORC aan DNA bindt, rekruteert ORC1 CDC6, een eiwit dat andere DNA-replicatie-eiwitten assembleert. Sommige van de mensspecifieke regio's van ORC1 en CDC6 binden andere eiwitten die DNA-replicatie reguleren. Manzar Hossain, een onderzoeker in het laboratorium van Stillman, zegt:

"We ontdekten dat ORC1 en CDC6 op een zeer tangentiële manier interageren. We vonden een zeer korte tijdsperiode waarin ze kunnen interageren."

DNA-gebonden ORC1 wordt gesekwestreerd in vloeibare druppeltjes die kort van vorm veranderen en brengt dan CDC6 binnen. Kuhulika Bhalla, een postdoc in het laboratorium van Stillman, legt uit:

"Dus als je je een lavalamp kunt voorstellen, alsof je vloeistof hebt, maar je hebt er een andere gekleurde vloeistof in. En ze slaagden er nog steeds in om gescheiden te blijven."

Gedurende het grootste deel van de celdelingscyclus oscilleren ORC1- en CDC6-hoeveelheden in de cel. Stillman legt uit dat "zowel hoge als lage hoeveelheden ORC1 leiden tot ernstige gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cellen. Je moet dus precies de juiste hoeveelheid" van elk eiwit hebben gedurende de celcyclus. Stillman en zijn collega's hebben aangetoond dat CDC6 andere regulerende eiwitten rekruteert die de activiteit en niveaus van ORC1 in zowel ruimte als tijd regelen. Ze publiceerden hun bevindingen in Moleculaire cel.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Materialen en methodes

GFP-PCNA-expressieplasmide

Expressie van het fusie-eiwit wordt aangedreven door de CMV-promoter en de translatiesignalen van het thymidinekinasegen, beide verschaft door de pEVRF-expressievector (Matthias et al. 1989). Het GFP-PCNAL2-fusie-eiwit bevat een SV40 nucleair lokalisatiesignaal op de NH2 terminus gevolgd door een verbeterd mutant GFP-gen dat is gefuseerd met het menselijke PCNA door een flexibele en hydrofiele linker (GEGQGQGQGPGRGYAYRS). Het GFP-gen maakt gebruik van een gehumaniseerd codongebruik voor betere expressie in zoogdiercellen en mutaties die verbeterde spectrale eigenschappen (enhanced GFP Clontech) en thermische stabiliteit verlenen (Siemering et al. 1996).

Generatie van zoogdiercellijnen die GFP-PCNA-fusie-eiwit tot expressie brengen

C2C12 muizenmyoblastcellen werden gekweekt in DME aangevuld met 20% FCS. Om cellijnen die GFP-PCNA tot expressie brengen te genereren, werd gelineariseerd plasmide-DNA dat codeert voor het fusie-eiwit GFP-PCNAL2 gecotransfecteerd met het plasmide pSV2neo (in een verhouding van 20:1) in C2C12-cellen door middel van de lipofectamine-methode (GIBCO BRL). 24 uur na transfectie werden de GFP tot expressie brengende cellen gesorteerd door middel van flowcytometrie (FACSort Becton Dickinson), opnieuw uitgeplaat bij klonale dichtheid en gedurende 9 dagen gekweekt in media die 600 g/ml G418 (Geneticin GIBCO BRL) bevatten. GFP-PCNA tot expressie brengende celklonen werden geselecteerd onder de fluorescentiemicroscoop, geëxpandeerd en verder gesubkloneerd door de beperkende verdunningsmethode om hun klonale aard te verzekeren.

Western Blot-analyse

Voor immunoblotanalyse werden 5 x 105 COS7-cellen, tijdelijk getransfecteerd door de DEAE-dextraanvoorbehandelingsmethode, en hetzelfde aantal muizenmyoblastcellen geëxtraheerd en werden immunoblots uitgevoerd, beide zoals eerder beschreven (Cardoso et al. 1997). Blots werden onderzocht met het monoklonale anti-PCNA-antilichaam van de muis (kloon PC10 Dako).

Flowcytometrie-analyse

Om het intracellulaire DNA-gehalte te analyseren, werden cellen getrypsiniseerd, gewassen in PBS en gefixeerd in 100% methanol. Gefixeerde cellen werden vervolgens gekleurd in een oplossing die 50 g/ml propidiumjodide, 0,1 mg/ml RNAse, 0,1% NP-40 en 0,1% trinatriumcitraat bevatte. Monsters werden vervolgens gewassen in PBS en het DNA-gehalte werd geschat door propidiumjodidefluorescentie te meten met een flowcytometer (FACSort Becton Dickinson) met behulp van het 600 nm lange doorlaatfilter. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van de ModFit LT-software (Becton Dickinson).

Immunofluorescentieanalyses

Indirecte immunofluorescentiekleuringen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Cardoso et al. 1997). De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: muis monoklonaal anti-PCNA antilichaam (kloon PC10 Dako), konijn polyklonaal anti-Dnmt1 antiserum (Leonhardt et al. 1992), en affiniteit-gezuiverd konijn polyklonaal anti-DNA ligase I antilichaam (Cardoso et al. 1997).

C2C12-cellen werden getransfecteerd met plasmide-DNA dat codeert voor het fusie-eiwit GFP-PCNAL2 door de calciumfosfaatprecipitatiemethode en 24 uur later gedurende 20 minuten gepulseerd met 10 μM 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU). Cellen werden vervolgens met formaldehyde gefixeerd, gevolgd door zuurdenaturatie van het DNA en kleuring met anti-BrdU-antilichaam (Becton Dickinson) zoals beschreven (Zink et al. 1998). Optische secties werden verkregen met een Leica TCS vierdimensionale (4D) confocale microscoop.

Levende celmicroscopie en beeldanalyse

Voor observatie van levende cellen werden cellen uitgeplaat op glazen dekglaasjes van 40 mm en men liet ze een nacht hechten. Ze werden vervolgens geassembleerd in een FCS2 levende celmicroscopiekamer (Bioptechs) ingesteld op 37 ° C die was gemonteerd op een Zeiss Axiovert omgekeerde microscoop. Voor de meeste waarnemingen werden een 63 × NA 1.4 Plan apochromat olie-immersie objectief verwarmd tot 37 ° C en een banddoorlaat fluoresceïnefilterset (excitatie 450-490 nm, dichroïsche 510 nm, emissie 515-565 nm Zeiss) gebruikt. Kortere excitatiegolflengten bleken fototoxisch te zijn voor de cellen. De belichtingstijd per afbeelding varieerde van 0,4 tot 4 s. In de meeste experimenten werden op elk tijdstip stapels van 21 afbeeldingen met stappen van 0,5 μm Z verzameld. Beelden werden verkregen met een gekoelde CCD-camera, Sensicam (1.280 × 1.024 pixels 6,7 m pixelgrootte) met behulp van de Quanticell-software (VisiTech) of, in het geval van Fig. 3 B, met een MicroMax-camera (1.317 × 1.035 pixels, 6,8 m pixelgrootte) met behulp van MetaMorph 3.0-software (Universal Imaging Corp.). Afbeeldingen werden samengesteld en geannoteerd met behulp van NIH Image 1.6, Adobe Photoshop 4.0 en Adobe Illustrator 7.0-software op Power MacIntosh-computers.

Reeksen beeldstapels verzameld op verschillende tijdstippen werden eerst geanalyseerd op bewegingen van de kern zelf. Na correctie voor cellulaire bewegingen en focale drift, onderzochten we replicatiefoci in de loop van de tijd voor bewegingen, montage of demontage met behulp van de naburige foci en nucleoli als referentiepunten. Voor digitale deconvolutie (zie figuur 5, midden) werden Z-asreeksen van afbeeldingen in Image-Pro Plus 3.0-software geladen en werd het onscherpe licht verwijderd met het Microtome IP-algoritme voor naaste buren. De intensiteit van replicatiefoci werd gekwantificeerd met de ImageQuant 1.2-software (Molecular Dynamics) en staafdiagrammen werden gegenereerd met Microsoft Excel 5-software.


MATERIALEN EN METHODES

Experimenten met optische pincetten

Vastgelopen, binaire Phi29 DNAP-DNA-replicatiecomplexen werden in bulk gevormd door incubatie (5 min bij 22°C) van het biotine-gelabelde polymerase (0,3 ng) met een DNA-substraat met openingen gelabeld met digoxigenine (3 ng) in een reactiebuffer met: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM ammoniumsulfaat, 7 mM 2-mercapto-ethanol, 4% glycerol (w/v), 0,025% Tween20 (w/v), 0,1 mg/ml runderserumalbumine (BSA). De vastgelopen complexen werden geïmmobiliseerd tussen streptavidine en anti-digoxigenine-gecoate kralen (Spherotech) in het optische pincet en de reactie werd gestart door de dNTP's (2, 5, 10, 50, 100, 200 en 500 M) verdund in de reactie te laten stromen buffer aangevuld met 10 mM MgCl2 en 1 M of 1 mM PPi. Een gedetailleerde beschrijving van eiwitlabeling, in vitro replicatieassays en sjabloonvoorbereiding worden gegeven in aanvullende methoden en aanvullende figuren S1 en S2.

Gegevens werden verzameld in een optisch pincet met dubbele bundel bij 60 Hz bij 22 ± 1 ° C (45). Metingen werden op twee manieren uitgevoerd: 'constant force feedback', waarbij de afstand tussen de kralen werd aangepast om een ​​constante belasting in het polymerase-DNA te behouden, en 'no feedback', waarbij de afstand tussen de optische val en de pipet werd constant gehouden. In totaal werden 305 onafhankelijke replicatieactiviteiten geregistreerd en geanalyseerd.

Om het proces van productafgifte (PPi) te bestuderen, hebben we replicatieactiviteiten gemeten bij 2 M dNTP met 1 μM of 1 mM PPi-concentraties. Deze activiteiten werden verzameld in een optisch pincet met dubbele trap met een verbeterde positieresolutie bij 1 kHz en 28 ± 0, 5 ° C in de 'geen feedback'-bedieningsmodus, aanvullend figuur S3 (46).

Gegevensanalyse

Het aantal opgenomen nucleotiden als functie van de tijd bij een bepaalde tegengestelde belasting werd verkregen door de waargenomen afstandsafname tussen de kralen te delen door de gemiddelde afstand tussen enkelvoudige (voor primerverlengingsomstandigheden) of dubbelstrengige (voor strengverdringingsomstandigheden) nucleotiden bij die belasting (aanvullende methoden en aanvullende figuur S4). Bij een constante hulpbelasting verhoogt de replicatie-activiteit de lengte van het stroomafwaartse DNA, zowel tijdens primerverlenging als tijdens strengverplaatsing. In dit geval werd voor beide replicatieomstandigheden het aantal opgenomen nucleotiden als functie van de tijd verkregen door de afstandsverandering tussen de kralen te delen door de gemiddelde afstand tussen dubbelstrengs nucleotiden bij een bepaalde belasting (aanvullende methoden). De verwachte verandering in afstand die overeenkomt met replicatie van primerverlenging bij een bepaalde constante belasting, werd berekend door de lengte van de ssDNA-template (229 nt) te vermenigvuldigen met de gemiddelde afstand tussen enkelstrengs (tegengestelde belastingscondities) of dubbelstrengs (ondersteunende belastingscondities) nucleotiden bij die belasting.

De gemiddelde snelheden (met en zonder pauzes) werden bepaald door een lijn die bij de sporen paste en het aantal gerepliceerde nucleotiden versus de tijd liet zien. De uiteindelijke snelheid bij elke belasting werd verkregen door het gemiddelde te nemen van alle sporen bij vergelijkbare belastingswaarden (± 2,5 pN). Onmiddellijke replicatiesnelheden werden verkregen uit een lineaire aanpassing van het aantal gerepliceerde nucleotiden over een glijdend tijdvenster van 0,7 s (50 gegevenspunten) voor alle snelheden. Snelheidsverdelingen werden bepaald uit het histogram van de momentane replicatiesnelheid met behulp van een bin van vijf nucleotiden per seconde. Pauzegebeurtenissen werden geïdentificeerd met een resolutie van 0,4-0,8 s volgens de elders beschreven methode, aanvullend figuur S5 (42, 43).


Wetenschappers hebben een code van signalen ontdekt die genoomduplicatie reguleert

SUMO-eiwit met de gebieden gemarkeerd met ubiquitine in het groen. Krediet: CNIO

Drie jaar geleden behaalde het onderzoeksteam onder leiding van Óscar Fernández-Capetillo, hoofd van de Genomic Instability Group van het Spaanse National Cancer Research Center (CNIO), voor het eerst een panoramisch zicht van de eiwitten die ingrijpen in een van de belangrijkste en meest delicate cellulaire processen: het kopiëren van genetisch materiaal tijdens celdeling. Ze merkten op dat de delen van het genoom waar het DNA werd gekopieerd ook erg rijk waren aan de modificatie door een aantal zeer specifieke eiwitten, SUMOylations, en arm aan andere, ubiquitinaties, maar ze konden niet begrijpen waarom.

De voortzetting van het artikel, vandaag gepubliceerd in de Natuur Structurele en moleculaire biologie tijdschrift, onthult hoe de balans tussen deze chemische markers in deze regio's in feite de sleutel is voor de verdeling van genetisch materiaal. Tijdens dit proces reist het USP7-eiwit met een entourage van moleculen die deel uitmaken van het replisoom - een set eiwitten die betrokken zijn bij het kopiëren van het DNA - en elimineert het de alomtegenwoordige kenmerken van eiwitten in het complex, wat de lage concentratie van ubiquitine in deze gebieden.

"USP7 fungeert als verkeersbeambte die de markeringen of verkeersborden in de buurt van het replisoom regelt. Door ubiquitine te elimineren, wordt voorkomen dat de eiwitten bij het replisoom worden verdreven, waardoor hun concentratie en het DNA-kopieerproces worden bevorderd", legt Fernández-Capetillo uit.

Verkeersborden in dna-kopieergebieden

Zoals het team in het vorige artikel beschreef, bevatten replisomes tot 50 verschillende eiwitten die deelnemen aan het delicate proces van het kopiëren van genetisch materiaal. Sommige eiwitten openen de dubbele helix van DNA, andere verdraaien het om het kopiëren te bevorderen, andere stabiliseren het, enz. Ze bewegen allemaal samen door het genoom om een ​​volledige kopie te verzekeren.

Om de rol van USP7 en zijn snijdende actie op ubiquitine-tekens tijdens het DNA-kopieerproces, gebruikten de onderzoekers geavanceerde eiwittools.

"We wisten dat replisome-eiwitten beide modificaties tegelijkertijd [ubiquitinaties en SUMOylations] konden presenteren, maar we wisten niet hoe ze werkten", legt Fernández-Capetillo uit. "We weten nu dat USP7 de ubiquitine-markeringen op eiwitten elimineert die ook geSUMOyleerd zijn in replicatiegebieden, wat verklaart waarom er een lage concentratie ubiquitine en hoge niveaus van SUMO is."

Deze balans tussen SUMO en ubiquitine zorgt voor een code die de concentratie van eiwitten in het replisoom regelt. "Als een eiwit geSUMOyleerd is, wordt het verrijkt in het replisoom, maar als het ook alomtegenwoordig is, wordt het verdreven. Dit is een code van signalen of vlaggen die de concentratie van factoren in het DNA-replicatiegebied regelt", zeggen de onderzoekers.

USP7-remmers: overwegingen over antitumoractiviteit

Deze studies zijn niet alleen van academisch belang, maar ook relevant voor chemotherapie. USP7-remmers worden momenteel bestudeerd als mogelijke antikankermiddelen in preklinische tests.

"Het model dat was voorgesteld, is dat de verbindingen de p53-niveaus verhogen, wat resulteert in de zelfmoord van tumorcellen. Onze gegevens geven aan dat USP7 essentieel is voor genoomreplicatie in cellen met of zonder p53."

Met deze gegevens waarschuwen de auteurs van het artikel dat deze moleculen mogelijk niet specifiek anti-tumormiddelen zijn. "Wij geloven dat ze het celdelingsproces remmen, ongeacht of de cellen kankerachtig of gezond zijn, en daarom zal het gebruik ervan voor de behandeling van kanker in de toekomst moeten worden heroverwogen."


Hoe DNA uit elkaar wordt getrokken

Naast de jacht op meer van de individuele factoren die betrokken zijn bij DNA-replicatie, stelde de DNA-synthesetest onderzoekers in staat om de eigenschappen van DNA-synthese te bestuderen. Toen wetenschappers over de hele wereld DNA-polymerase en DNA-replicatie begonnen te bestuderen, wisten ze dat het semi-conservatieve model van DNA-replicatie, zoals bewezen door Meselson en Stahl, vereist dat de twee originele sjabloonstrengen van DNA uit elkaar worden getrokken om te kunnen worden gekopieerd afzonderlijk. Hoe dit komt, is echter niet bekend. Wetenschappers hadden waargenomen dat de twee DNA-strengen zeer stevig bij elkaar worden gehouden door de waterstofbruggen tussen complementaire nucleotide-basenparen van de twee strengen. In het laboratorium konden de twee strengen alleen worden gescheiden door het DNA te verhitten tot bijna kooktemperaturen. Het is duidelijk dat het niet waarschijnlijk is dat levende cellen hoge temperaturen genereren om de twee DNA-strengen uit elkaar te wrikken, dus bleef de vraag: "Wat trekt in een levende cel de twee originele DNA-strengen uit elkaar zodat ze kunnen worden gekopieerd? "

Figuur 3: DNA-synthese begint op veel plaatsen. DNA-replicatie begint op specifieke chromosomale locaties genaamd oorsprong van replicatie. Lineaire chromosomen hebben vele oorsprongen, waardoor DNA-synthese snel kan plaatsvinden.

Omdat dubbelstrengs DNA erg stabiel is, vermoedden wetenschappers dat er een ingewikkeld mechanisme moest zijn om de twee strengen uit elkaar te trekken. Twee onderzoeksgroepen, waaronder die van Arthur Kornberg, ontdekten het antwoord eind jaren zeventig: een enzym dat ze DNA-helicase noemden. Dit enzym is in staat om de twee DNA-strengen uit elkaar te wrikken, zodat de twee afzonderlijke strengen vervolgens kunnen dienen als templates voor DNA-polymerase, volgens het semi-conservatieve model.

Het blijkt echter dat wanneer helicase eerst een stukje DNA uit elkaar wringt, het bij lineair DNA niet aan het einde van het molecuul begint en ook niet willekeurig een plaats kiest. Het aanvankelijke "smelten" van DNA vindt plaats op specifieke locaties, die de oorsprong van DNA-replicatie worden genoemd. Elk van deze creëert een uitstulping in de dubbele DNA-helix die zichtbaar is door elektronenmicroscopie. Deze uitstulpingen heten replicatie bubbels en vertegenwoordigen plaatsen van DNA-synthese (Figuur 3).

Wanneer een replicatiebel opengaat en de DNA-synthese begint, verloopt de replicatie in beide richtingen, weg van de oorsprong. Een DNA-helicase-enzym loopt voorop en ritst het ouderlijke DNA open terwijl de replicatie in zijn kielzog voortgaat. Beide mobiele regio's van DNA-synthese worden aangeduid als: replicatievorken, wat de plaatsen zijn waarop de replicatie van DNA wordt uitgevoerd (Figuur 4).

Figuur 4: De replicatievork. Na de vorming van een replicatiebel, verloopt de DNA-synthese in beide richtingen, weg van de oorspronkelijke oorsprong. Een replicatievork is de plaats waar de twee ouderlijke DNA-strengen uit elkaar worden gehaald en DNA-replicatie plaatsvindt.

Replicatie bubbels zijn uitstulpingen in de DNA-helix die aangeven:


Geselecteerde lijst van moleculaire machines:

I. Moleculaire machines waarvan wetenschappers hebben beweerd dat ze een onherleidbare complexiteit vertonen

1. Bacteriële flagellum: Het flagellum is een roterende motor in bacteriën die een propeller aandrijft om te draaien, net als een buitenboordmotor, aangedreven door ionenstroom om roterende beweging aan te drijven. Kan draaien tot 100.000 tpm, 13 one paper in Trends in de microbiologie noemde het flagellum "een prachtig ontworpen chemisch-osmotische nanomachine, de krachtigste roterende motor van de natuur, die gebruikmaakt van een transmembraan ion-aandrijvende kracht om een ​​draadvormige propeller aan te drijven." 14 Vanwege zijn motorachtige structuur en interne onderdelen, schreef een moleculair bioloog in het tijdschrift: Cel, "[meer] dan andere motoren, het flagellum lijkt op een machine die is ontworpen door een mens." 15 Genetische knock-out-experimenten hebben aangetoond dat de E coli flagellum is onherleidbaar complex met betrekking tot zijn ongeveer 35 genen. 16 Ondanks het feit dat dit een van de best bestudeerde moleculaire machines is, is een overzichtsartikel uit 2006 in Natuurbeoordelingen Microbiologie gaf toe dat "de flagellaire onderzoeksgemeenschap nauwelijks is begonnen na te denken over hoe deze systemen zijn geëvolueerd." 17

2. Eukaryoot cilium: De cilium is een haarachtige of zweepachtige structuur die is gebouwd op een systeem van microtubuli, meestal met negen buitenste microtubuli-paren en twee binnenste microtubuli. De microtubuli zijn verbonden met nexin-armen en een peddelachtige beweging wordt op gang gebracht met dyneïne-motoren. 18 Deze machines vervullen veel functies in Eukaryoten, zoals het laten zwemmen van sperma of het verwijderen van vreemde deeltjes uit de keel. Michael Behe ​​merkt op dat de "peddel" -functie van de cilium zal mislukken als het microtubuli, verbindingsarmen of voldoende dyneïne-motoren mist, waardoor het onherleidbaar complex wordt. 19

3. Aminoacyl-tRNA-synthetasen (aaRS): aaRS-enzymen zijn verantwoordelijk voor het opladen van tRNA's met het juiste aminozuur, zodat ze nauwkeurig kunnen deelnemen aan het translatieproces. In deze functie zijn aaRSs een "aminoacyleringsmachine". 20 De meeste cellen hebben twintig verschillende aaRS-enzymen nodig, één voor elk aminozuur, zonder welke de transcriptie-/vertaalmachine niet goed zou kunnen functioneren. 21 Als een artikel in Celbiologie Internationaal verklaarde: "De nucleotidesequentie is ook zinloos zonder een conceptueel vertaalschema en fysieke 'hardware'-mogelijkheden. Ribosomen, tRNA's, aminoacyl-tRNA-synthetasen en aminozuren zijn allemaal hardwarecomponenten van de 'ontvanger' van het Shannon-bericht. Maar de instructies voor deze machine zijn zelf gecodeerd in het DNA en uitgevoerd door eiwit-‘arbeiders’ die door die machine worden geproduceerd. Zonder de machines en eiwitwerkers kan de boodschap niet worden ontvangen en begrepen. En zonder genetische instructie kan de machine niet worden geassembleerd.” 22 Ongetwijfeld vormen deze componenten een onherleidbaar complex systeem. 23

4. Bloedstollingscascade: Het bloedstollingssysteem "is een typisch voorbeeld van een moleculaire machine, waarbij de assemblage van substraten, enzymen, eiwitcofactoren en calciumionen op een fosfolipideoppervlak de stollingssnelheid aanzienlijk versnelt." 24 Volgens een paper in Bio-essays, "de moleculen werken samen met het celoppervlak (moleculen) en andere eiwitten om reactiecomplexen samen te stellen die als een moleculaire machine kunnen fungeren." 25 Michael Behe ​​stelt op basis van experimentele gegevens dat de bloedstollingscascade een onherleidbare kern heeft met betrekking tot zijn componenten nadat de initiatieroutes samenkomen. 26

5. Ribosoom: Het ribosoom is een "RNA-machine" 27 die "meer dan 300 eiwitten en RNA's omvat" 28 om een ​​complex te vormen waarin boodschapper-RNA wordt vertaald in eiwit, en speelt zo een cruciale rol bij de eiwitsynthese in de cel. Craig Venter, een leider in genomica en het Human Genome Project, heeft het ribosoom "een ongelooflijk mooie complexe entiteit" genoemd die een "minimum voor het ribosoom ongeveer 53 eiwitten en 3 polynucleotiden" vereist, waardoor sommige evolutionistische biologen vrezen dat het misschien onherleidbaar complex. 29

6. Antilichamen en het adaptieve immuunsysteem: Antilichamen zijn "de 'vingers' van het blinde immuunsysteem - ze stellen het in staat om een ​​vreemde indringer te onderscheiden van het lichaam zelf." 30 Maar de processen die antilichamen genereren, vereisen een reeks moleculaire machines. 31 Lymfocytcellen in het bloed produceren antilichamen door delen van speciale genen te mengen en te matchen om meer dan 100.000.000 soorten antilichamen te produceren. 32 Dit "adaptieve immuunsysteem" stelt het lichaam in staat de meeste indringers te taggen en te vernietigen. Michael Behe ​​stelt dat dit systeem onherleidbaar complex is omdat er veel componenten aanwezig moeten zijn om het te laten functioneren: “Een groot repertoire aan antilichamen zal niet veel goeds doen als er geen systeem is om indringers te doden. Een systeem om indringers te doden zal niet veel goeds doen als er geen manier is om ze te identificeren. Bij elke stap worden we niet alleen tegengehouden door lokale systeemproblemen, maar ook door eisen van het geïntegreerde systeem.” 33

II. Aanvullende moleculaire machines

7. Spliceosoom: Het spliceosoom verwijdert introns van RNA-transcripten voorafgaand aan translatie. Volgens een paper in Cel, "Om zowel nauwkeurigheid te bieden voor de herkenning van reactieve splitsingsplaatsen in het pre-mRNA als flexibiliteit voor de keuze van splitsingsplaatsen tijdens alternatieve splitsing, vertoont het spliceosoom een ​​uitzonderlijke compositorische en structurele dynamiek die wordt benut tijdens substraatafhankelijke complexe assemblage, katalytische activering en hermodellering van actieve plaatsen." 34 Een krant uit 2009 in PNAS merkte op dat "het spliceosoom een ​​enorme verzameling is van 5 RNA's en veel eiwitten" 35 - een ander artikel suggereert "300 verschillende eiwitten en vijf RNA's, waardoor het een van de meest complexe macromoleculaire machines is die bekend zijn." 36

8. F0F1 ATP-synthese: Volgens celbioloog en modelbouwer van moleculaire machines, David Goodsell, is "ATP-synthase een van de wonderen van de moleculaire wereld." 37 Deze op eiwitten gebaseerde moleculaire machine is eigenlijk samengesteld uit twee verschillende roterende motoren die zijn verbonden door een stator: als de F0 motor wordt aangedreven door protonen, het draait de F1 motor. Deze kinetische energie wordt gebruikt als een generator om adenosinetrifosfaat (ATP) te synthetiseren, het primaire energiedragende molecuul van cellen. 38

9. Bacteriorhdopsine: Bacteriorodopsine "is een compacte moleculaire machine" die die zonlichtenergie gebruikt om protonen door een membraan te pompen. 39 Het is ingebed in het celmembraan en bestaat uit zeven spiraalvormige structuren die het membraan overspannen. Het bevat ook retina, een molecuul dat van vorm verandert nadat het licht heeft geabsorbeerd. Fotonen die door het netvlies worden opgevangen, worden door de zeven helices naar de buitenkant van het membraan geperst. 40 Wanneer protonen terugstromen door het membraan, wordt ATP gevormd.

10. Myosine: Myosine is een moleculaire motor die langs een "spoor" beweegt - in dit geval actinefilamenten - om de basis te vormen voor spierbewegingen of om ladingen binnen de cel te vervoeren. 41 Spieren gebruiken moleculaire machines zoals myosine om "chemische energie om te zetten in mechanische energie tijdens spiercontractie." 42 In feite vereist spierbeweging de "gecombineerde actie van biljoenen myosinemotoren". 43

11. Kinesinemotor: Net als myosine is kinesine een eiwitmachine die zich bindt aan en ladingen vervoert door "hand-over-hand langs een microtubulus" in de cel te kruipen. 44 Kinesinen zijn krachtig genoeg om grote cellulaire organellen door de cel te slepen, evenals blaasjes of helpen bij de assemblage van bipolaire spindels of depolymerisatie van microtubuli. 45

12. Tim/Tom-systemen: Tim- of Tom-systemen zijn selectieve eiwitpompmachines die eiwitten door de binnenste (Tim) en buitenste (Tom) membranen van mitochondriën in de binnenste matrix van de mitochondriën importeren. 46

13. Calciumpomp: De calciumpomp is een "fantastische machine met verschillende bewegende delen" die calciumionen over het celmembraan transporteert. Het is een machine die tijdens het pompproces een 4-stappencyclus gebruikt. 47

14. Cytochroom C-oxidase: Cytochroom C-oxidase kwalificeert zich als een moleculaire machine "omdat een deel van de redoxvrije energie wordt omgezet in een elektrochemische proton-gradiënt." 48 De functie van het enzym is om de laatste stappen van voedseloxidatie zorgvuldig te controleren door elektronen te combineren met zuurstof en waterstof om water te vormen, waarbij energie vrijkomt. Het gebruikt koper- en ijzeratomen om dit proces te ondersteunen. 49

15. Proteosoom: Het proteosoom is een grote moleculaire machine waarvan de onderdelen zorgvuldig in een bepaalde volgorde moeten worden geassembleerd. Het 26S-proteosoom heeft bijvoorbeeld 33 verschillende subeenheden die het in staat stellen zijn functie uit te voeren om eiwitten af ​​te breken en te vernietigen die verkeerd zijn gevouwen in de cel of anderszins zijn gelabeld voor vernietiging. 50 Eén artikel suggereerde dat een bepaald eukaryoot proteasoom "het kerncomplex is van een energieafhankelijke eiwitafbraakmachinerie die in zijn complexiteit gelijk is aan de eiwitsynthesemachinerie." 51

16. Cohesine: Cohesin is een moleculaire machine "multisubunit eiwitcomplex" en "een macromoleculair complex dat zusterchromatiden tijdens mitose met elkaar verbindt op de metafaseplaat." 53

17. Condensine: Condensine is een moleculaire machine die helpt bij het condenseren en verpakken van chromosomen voor celreplicatie. Het is een complex van vijf subeenheden en is "de belangrijkste moleculaire machine van chromosoomcondensatie." 54

18. ClpX: ClpX is een moleculaire machine die ATP gebruikt om eiwitten te ontvouwen en vervolgens ongevouwen eiwitten naar een ander complex in de cel te transporteren. Het verplaatst deze eiwitten naar het ClpP-complex. 55

19. Immunologische synaps: The immunological synapse is a molecular machine that serves as an interface to activate of T cells. Once an immunological synapse is completely formed, T Cells are activated and proliferate, sparking key part of the immune response. 56

20. Glideosome: The glideosome is a “macromolecular complex” and an “elaborate machine” 57 whose function is to allow protozoa to rely on gliding motility over various substrates.

21. Kex2: Kex2 is a molecular machine that facilitates cell fusion during the mating of yeast it likely works by degrading cell walls. 58

22. Hsp70: Hsp70 is one of many molecular machines that serve as chaperones that not only assist other proteins in reaching a proper functional conformation (i.e. proper folding) but also helping them to be transported to the proper location in the cell. 59

23. Hsp60: Hsp60 is another chaperone machine – it is tailored to provide “an enclosed environment for folding proteins which totally protects them as they fold.” 60 It is composed of multiple proteins which form a barrel shaped structure with a cap. 61 Once an unfolded protein is inside, it can fold properly.

24. Protein Kinase C: Protein Kinase C is a molecular machine that is activated by certain calcium and diacylglycerol signals in the cell. It thus acts as an interpreter of electrical signals, as one paper in Cel wrote: “This decoding mechanism may explain how cPKC isoforms can selectively control different cellular processes by relying on selective patterns of calcium and diacylglycerol signals.” 62

25. SecYEG PreProtein Translocation Channel: The SecYE complex is vital to the operation of “translocation machinery” which works to move molecules across membranes in the cell. 63

26. Hemoglobin: Molecular machine modeller David Goodsell observes that “Hemoglobin is a remarkable molecular machine that uses motion and small structural changes to regulate its action.” 64 Hemoglobin uses iron within its protein structure to carry oxygen from the lungs to the rest of the body through the blood.

27. T4 DNA Packaging Motor: The T4 DNA is one of various packaging motors that are “powerful molecular motors” which emplace viral genomes into capsules called procapsids. 65 Once viral genome packaging is complete, “the DNA packaging motor is released and the separately assembled tail is attached to produce the mature infectious viral particle.” 66

28. Smc5/Smc6: Smc5/Smc6 is a complex machine that is involved with the structural maintenance of chromosomes with regards to cohesions and condensins, 67 and works to remove cohesin from damaged chromosomes prior to chromosomal separation, 68 and may also work to repair and untangle DNA. 69

29. Cytplasmic Dynein: Cytplasmic dynein is a machine involved with cargo transport and movement cell that functions like a motor with a “power stroke.” 70 In particular, it transports nuclei in fungi and neurons in mammalian brains. 71

30. Mitotic Spindle Machine: The mitotic spindle is a highly dynamic self-assembling complex molecular machine composed of tubulin, motors, and other molecules which assembles around the chromosomes and segregates them into daughter cells during mitosis. 72

31. DNA Polymerase: The DNA polymerase is a multiprotein machine that creates a complementary strand of DNA from a template strand. 73 The DNA polymerase is not only the “central component of the DNA replication machinery,” 74 but it “plays the central role in the processes of life,” 75 since it is responsible for the copying of DNA from generation to generation. During the polymerization process, it remains tethered to the DNA using a protein-based sliding clamp. 76 It is extremely accurate, making less than one mistake per billion bases, aided by its ability to proofread and fix mistakes. 77

32. RNA Polymerase: Like its DNA polymerase counterpart, the function of the RNA polymerase is to create a messenger RNA strand from a DNA template strand. Called “a huge factory with many moving parts,” 78 it is a “directional machine and, indeed, as a molecular motor” where it functions “as a dynamic, fluctuating, molecular motor capable of producing force and torque.” 79

33. Kinetochore: The kinetochore is a “proteinaceous structure that assembles on centromeric chromatin and connects the centromere to spindle microtubules.” 80 Called a “macromolecular protein machine,” 81 it is composed of over 80 protein components 82 it aids in separating chromosomes during cell division.

34. MRX Complex: The MRX complex forms telomere length counting machinery that measures the integrity of telomeres, the structures that protect the ends of eukaryotic chromosomes. Properly measuring telomere length is vital to ensure proper cell lifetime and genome stability. 83 Yeast use the MRX complex via a “’protein-counting’ mechanism whereby higher numbers of proteins bound by a longer telomere repeat tract ultimately inhibit telomerase activity at that particular telomere.” 84

35. Apoptosome / Caspase: While many molecular machines keep a cell alive, there are even machines that are programmed to cause cell death, or apoptosis. Cell death must be carefully timed so that cells die when they need to be replaced. According to David Goodsell, “Caspases are the executioners of apoptosis,” and they work by destroying specific proteins in the right order so as to “disassemble the cell in an orderly manner.” 85 Caspases can be part of a “death machine” called the apoptosome, 86 a molecular machine which receives signals indicating cellular stress and then initiates cell death, including activity of caspases.

36. Type III Secretory System: This machine, often called the T3SS, is a toxin injection machine used by predatory bacteria to deliver deadly toxins into other cells. 87 It is composed of subunits that are machines, such as the injectisome nanomachine. 88

37. Type II Secretion Apparatus: The T2SS is a complex nanomachine that translocates proteins across the outer membrane of a bacterium. 89

38. Helicase/Topoisomerase Machine: The helicase and topoisomerase machines work together to properly unwrap or unzip DNA prior to transcription of DNA into mRNA or DNA replication. 90 Topoisomerase performs this function by cutting one DNA strand and then holding on to the other while the cut strand unwinds. 91

39. RNA degradasome: The RNA degradasome “multiprotein complex involved in the degradation of mRNA” 92 or trimming RNAs into their active forms 93 in E coli bacteria. Its large size “would readily qualify [it] as a supramolecular machine dedicated to RNA processing and turnover.” 94

40. Photosynthetic system: The processes that plants use to convert light into chemical energy a type of molecular machines. 95 For example, photosystem 1 contains over three dozen proteins and many chlorophyll and other molecules which convert light energy into useful energy in the cell. “Antenna” molecules help increase the amount of light aborbed. 96 Many complex molecules are necessary for this pathway to function properly.


Identification of the critical replication targets of CDK reveals direct regulation of replication initiation factors by the embryo polarity machinery in C. elegans

During metazoan development, the cell cycle is remodelled to coordinate proliferation with differentiation. Developmental cues cause dramatic changes in the number and timing of replication initiation events, but the mechanisms and physiological importance of such changes are poorly understood. Cyclin-dependent kinase (CDK) is important for regulating S-phase length in many metazoa, and here we show in the nematode Caenorhabditis elegans that an essential function of CDK during early embryogenesis is to regulate the interactions between three replication initiation factors SLD-3, SLD-2 and MUS-101 (Dpb11/TopBP1). Mutations that bypass the requirement for CDK to generate interactions between these factors is sufficient for viability in the absence of CyclinE/Cdk2, demonstrating that this is a critical embryonic function of this cyclin/CDK complex. Both SLD-2 and SLD-3 are asymmetrically localised in the early embryo and the levels of these proteins inversely correlate with S-phase length. We also show that SLD-2 asymmetry is determined by direct interaction with the polarity protein PKC-3. This study explains the essential function of CDK for replication initiation in a metazoan and provides the first direct molecular mechanism through which polarization of the embryo is coordinated with DNA replication initiation.

Author Summary How and when a cell divides changes as the cell assumes different fates. How these changes in cell division are brought about are poorly understood, but are critical to ensure that cells do not over-proliferate leading to cancer. The nematode C. elegans is an excellent system to study the role of cell cycle changes during animal development. Here we show that two factors SLD-2 and SLD-3 are critical to control the decision to begin genome duplication. We show that these factors are differently distributed to different cell lineages in the early embryo, which may be a key event in determining the cell cycle rate in these cells. For the first time we show that, PKC-3, a key component of the machinery that determines the front (anterior) from the back (posterior) of the embryo directly controls SLD-2 distribution, which might explain how the polarisation of the embryo causes changes in the proliferation of different cell lineages. As PKC-3 is frequently mutated in human cancers, how this factor controls cell proliferation may be important to understand tumour progression.


Just-in-time DNA replication

Complete and timely replication of the genome is a prerequisite to fulfilling the “dream” of every cell to become two cells . So far, biologists have been successful in identifying the processes involved in DNA replication, but they have not been able to explain a fundamental control problem that cells face, the “random-completion” or “random-gap” problem: how do cells ensure that every last piece of the genome is replicated on time ? In a paper in Physical Review E, Scott C.-H. Yang and John Bechhoefer of Simon Fraser University use insights from condensed-matter physics to answer this question . Using a physical model originally developed to describe the kinetics of first-order phase transitions, they show that, despite the intrinsic stochasticity of the initiation of DNA replication, cells can still control the amount of time it takes to replicate the genome. The authors thus provide a rigorous solution to a long-standing problem in cell biology. The elegance of their formal approach bridging physics and biology, and the depth of their analysis, should inspire scientists from both disciplines.

The heart of the problem is that the sites at which replication initiates are randomly distributed along the chromosomes of Xenopus laevis embryos, a frog widely used in cell biology experiments. There are on the order of 10 5 so-called origins where replication can start in Xenopus embryos, and it was quickly realized that, if these origins were truly randomly activated, one would expect an exponential distribution of distances between origins. Such a distribution would include infrequent large gaps between origins, suggesting a total replication time longer than the 20 minutes observed in frog embryos. In fact, early workers concluded that origin distribution must not be random, for exactly that reason . However, over the years, experimental evidence for stochastic “firing” of origins has piled up. It is to this apparent conflict between stochastic origin firing and well-defined replication times that Yang and Bechhoefer bring analytical rigor.

Similar problems have confronted condensed-matter physicists. Consider a tray of water that is put into a freezer at time t = 0 . A short while later, the water is all frozen. What fraction f ( t ) of water is frozen at time t > 0 ? In the 1930s, several scientists independently derived a stochastic model that could predict the form of f ( t ) , and this “Kolmogorov-Johnson-Mehl-Avrami” (KJMA) model has since been widely used by metallurgists and other materials scientists to analyze phase-transition kinetics .

In the KJMA model, the kinetics of freezing results from three simultaneous processes: nucleation of solid domains, growth of existing domains, and coalescence, which occurs when two expanding domains merge (Fig. 1(a)). In the simplest form of KJMA, solid domains nucleate anywhere in the liquid, with equal probability I for all locations. Once a solid domain has been nucleated, it grows out as a sphere, typically at constant velocity v . When two growing domains impinge, growth ceases at the point of contact, while continuing elsewhere. Later workers revisited and refined KJMA’s methods to take into account various effects, such as finite system size and inhomogeneities in nucleation rates I ( x , t ) in space and time .

About ten years ago, Bechhoefer and colleagues, who have studied nonequilibrium processes such as the growth of snowflakes, made the connection that features of DNA replication can be mapped onto the basic assumptions of the KJMA model (Fig. 1(b)): (i) DNA replication starts at a large number of origins, where replication “forks” are created, (ii) DNA synthesis propagates at replication forks bidirectionally from each activated origin, with propagation speed or fork velocity v , and (iii) DNA synthesis stops when two replication forks meet. There is, however, one fundamental difference between the analysis of DNA replication and most other nucleation-and-growth systems. In crystal growth, for example, one is interested in f ( t ) and the size distribution of “solid” and “liquid” domains for a known I ( x , t ) , whereas in DNA replication, I ( x , t ) itself is the onbekend quantity that is important in understanding how the cell regulates the replication process in space and time. In other words, I ( x , t ) is the replication “program” that varies from organism to organism. For example, if all the origins are initiated at the beginning of replication, then I ( x , t ) = δ ( t - t 0 ) , where t 0 is the start time. Alternatively, if every origin has an equal probability of initiation at any time, then I ( x , t ) is a constant. The question becomes, given an observed f ( t ) , can one extract I ( x , t ) ?

In a series of papers since 2002, Bechhoefer and colleagues have shown how one can map the DNA replication process onto the basic assumptions of the KJMA model . Importantly, by reversing the KJMA formalism, they managed to recover a spatially averaged, “mean-field” I ( t ) from experimentally measured distributions of replicated and unreplicated domains of chromosome . To this end, they focused on the model system of Xenopus early embryo replication, in which data collection is relatively easy. It is also a perfect system to study the random-completion problem because, unlike cells of adult animals, which take many hours to replicate their genomes, these embryos finish everything in 20 minutes, making replication time a critical issue.

Biologists have proposed two solutions to the random-completion problem . The first is that replication avoids big gaps (Fig. 1(c)) altogether by using a nonrandom spacing mechanism. However, this model has received little experimental support. The second assumes there is an excess of potential origins that are randomly distributed and that origins that do not fire early in replication, but become more likely to fire as replication progresses, i.e., I(t) increases with time. The intuitive idea is that if a gap persists late in replication, it will be much more likely to have origins within it fire and thus get replicated in a timely manner. The drawback to this kind of model has been that it is not clear how robust a solution it would be.

Recently, various theoretical and experimental studies have strengthened the second view, and the emerging consensus is that there is a pool of potential origins present in Xenopus embryos and probably all other animal cells, much larger than the actual number of initiations during replication , and the probability of initiation increases steeply . However, these observations still did not completely solve the random-completion problem because the solution requires understanding the distribution (as opposed to the mean) of the replication timing for a given I ( t ) and spatial distribution of potential origins. That is, knowing the average time it takes for replication to complete does not help what one cares about is how often replication fails by taking longer than some threshold time T .

With this in mind, Bechhoefer and co-workers interpreted the time it takes to complete replication as a “first-passage” time t * of a stochastic process governed by probability I ( t ) , which concerns the distribution ρ ( t * ) of a probabilistic event of interest to occur for the first time at time t * or, equivalently, as the largest value t * of the timing of collisions between two growing replication bubbles. For biological success, t * does not have to be less than T for every cell, but the frequency of t * > T has to be less that some acceptable failure rate. This question belongs to the domain of extreme-value statistics (a branch of statistics that is also used to evaluate things like rare but catastrophic events), and the random-completion problem can be translated into finding conditions where I ( t , x ) results in the observed average time to complete replication and the observed failure rate .

Yang and Bechhoefer have provided the final, clear answer to the random-completion problem: For cells to achieve an acceptable distribution of replication completion times, the initiation rate I ( t ) should increase during replication (Fig. 1(d)), in agreement with extracted values of I ( t ) from experimental data . They show that this model can produce arbitrarily low failure rates, but more importantly, that it can produce the observed failure rate using plausible parameters that also produce reasonable mean completion times. And finally, Yang and Bechhoefer show that their result is robust the increasing I ( t ) produces timely replication regardless of whether the potential origins are randomly or nonrandomly distributed. This latter point should allay biologists’ fear that in this model the replication time would double if one or two origins fail to initiate and create a gap that is too large to finish replication within 20 minutes.

Given the strong theoretic foundation provided by Yang and Bechhoefer for the increasing I ( t ) model in frog embryos, the big question is whether this model is applicable to all animal cells. Much of this work will fall to the experimental biologists, but theoretical treatments that capture the more structured replication of adult cells will certainly be important.


Bekijk de video: De beste TDI is de versie met Common Rail. Wat is er mis met deze turbodiesel? Ondertitels! (Januari- 2022).