Informatie

Betekenis van een meeteenheid van kinase-activiteit


Ik heb hulp nodig om te weten wat $cpm imes 10^3$ betekent in figuur 4(C) van dit artikel (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022202X15323149#f0010). Het lijkt een eenheid van kinase-activiteit te zijn.


Het is geen specifieke eenheid van kinase-activiteit, maar eerder een algemene benadering voor het volgen van reacties waarbij er geen kleurverandering is. De afkorting cpm staat voor counts per minute en is een maat voor radioactiviteit. In dit specifieke voorbeeld is een radioactief fosfaat opgenomen in de ATP van de proteïnekinasetest. Als het eiwitkinase actief is met het substraat, zal het fosfaat worden overgedragen van het ATP naar het substraatpeptide/eiwit. Als het monstermengsel op een SDS-PAGE-gel wordt geladen, kan een scintillatieteller worden gebruikt om de radioactiviteit van elke band te meten en kan men laten zien hoe actief het eiwitkinase is geweest bij het fosforyleren van zijn substraat.


Betekenis van een meeteenheid van kinase-activiteit - Biologie

De half maximale remmende concentratie (IC50) is een maat voor de potentie van een stof bij het remmen van een specifieke biologische of biochemische functie. IC50 is een kwantitatieve maat die aangeeft hoeveel van een bepaalde remmende stof (bijv. geneesmiddel) nodig is om te remmen, in vitro, een bepaald biologisch proces of biologische component met 50%. [1] De biologische component kan een enzym, cel, celreceptor of micro-organisme zijn. IC50 waarden worden typisch uitgedrukt als molaire concentratie.

IC50 wordt vaak gebruikt als een maatstaf voor de potentie van antagonisten in farmacologisch onderzoek. IC50 is vergelijkbaar met andere maten van potentie, zoals EC50 voor prikkelende medicijnen. EC50 staat voor de dosis of plasmaconcentratie die nodig is om 50% van een maximaal effect te verkrijgen in vivo. [1] [ dode link ]

IC50 kan worden bepaald met functionele testen of met competitieve bindingstests.

Soms, IC50 waarden worden geconverteerd naar de pIC50 schaal.

Vanwege het minteken, hogere waarden van pIC50 wijzen op exponentieel krachtiger remmers. pIC50 wordt meestal gegeven in termen van molaire concentratie (mol/L of M), waardoor IC . vereist is50 in eenheden van M. [2]

de IC50 terminologie wordt ook gebruikt voor sommige gedragsmetingen in vivo, zoals een vloeistofverbruikstest met twee flessen. Wanneer dieren de consumptie van de met medicijnen geregen waterfles verminderen, wordt de concentratie van het medicijn die resulteert in een afname van 50% in de consumptie beschouwd als de IC50 voor vloeistofconsumptie van dat medicijn. [3]


Enzym eenheid

De gespecificeerde omstandigheden zullen gewoonlijk de optimale omstandigheden zijn, waaronder maar niet beperkt tot temperatuur, pH en substraatconcentratie, die de maximale substraatomzettingssnelheid voor dat specifieke enzym opleveren. Bij een bepaalde bepalingsmethode neemt men gewoonlijk een temperatuur van 25°C. [3]

De enzymeenheid werd in 1964 aangenomen door de International Union of Biochemistry. Aangezien de minuut geen SI-basiseenheid van tijd is, wordt de enzymeenheid afgeraden ten gunste van de katal, de eenheid aanbevolen door de Algemene Conferentie over maten en gewichten in 1978 en officieel goedgekeurd in 1999.

Eén katal is de enzymactiviteit die één mol substraat per seconde omzet onder gespecificeerde testomstandigheden, dus

1 E = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s ≈ 16,67 nmol/s 16,67 nkat = 16,67 nmol/s Dus 1 E = 16,67 nkat [4]

Het concept van enzymeenheid moet niet worden verward met dat van internationale eenheid (IU). Hoewel het waar is dat 1 U = 1 IU [5] (omdat voor veel enzymen de bestaande U werd aangenomen als de latere IU), kunnen internationale eenheden worden gedefinieerd voor de biologische activiteit van vele andere soorten stoffen dan enzymen (voor vitamines en hormonen).

  1. ^ Nomenclatuurcommissie van de International Union of Biochemistry (NC-IUB) (1979). "Eenheden van enzymactiviteit". EUR. J. Biochem. 97 (2): 319–20. doi:10.1111/j.1432-1033.1979.tb13116.x.
  2. ^
  3. "Terminologie van bioanalytische methoden (IUPAC-aanbevelingen 2018)". Chemie Internationaal. 40 (3): 34. 2018-07-01. doi: 10.1515/ci-2018-0319 . ISSN1365-2192.
  4. ^ Principes van biochemie, pagina 94, 4e editie, Lehninger
  5. ^
  6. Wharton, Christopher W. Eisenthal, Robert (2013), Moleculaire Enzymologie, Biologie op tertiair niveau, Springer Science and Business Media, p. 82, ISBN9781461585329 .
  7. ^
  8. Bommarius, Andreas S. Riebel-Bommarius, Bettina R. (2007), Biokatalyse: grondbeginselen en toepassingen, John Wiley en zonen, p. 30, ISBN9783527606054 .

Dit enzym-gerelateerde artikel is een stomp. Je kunt Wikipedia helpen door het uit te breiden.


Er is zeer weinig risico op een bloedonderzoek. U kunt lichte pijn of blauwe plekken hebben op de plek waar de naald is ingebracht, maar de meeste symptomen verdwijnen snel.

Als uit uw resultaten blijkt dat u een hoger dan normaal niveau van CK heeft, kan dit betekenen dat u een blessure of ziekte van de spieren, het hart of de hersenen heeft. Voor meer informatie kan uw leverancier tests bestellen om de niveaus van specifieke CK-enzymen te controleren:

  • Als u meer dan normale CK-MM-enzymen heeft, kan dit betekenen dat u een spierletsel of spierziekte heeft, zoals spierdystrofie of rabdomyolis.
  • Als u meer dan normale CK-MB-enzymen heeft, kan dit betekenen dat u een ontsteking van de hartspier heeft of een hartaanval heeft of onlangs heeft gehad.
  • Als u meer dan normale CK-BB-enzymen heeft, kan dit betekenen dat u een beroerte of hersenletsel heeft gehad.

Andere aandoeningen die hogere dan normale CK-niveaus kunnen veroorzaken, zijn onder meer:

Als u vragen heeft over uw resultaten, neem dan contact op met uw zorgverzekeraar.


Huidig ​​adres: Huidig ​​adres: Opper-Oostenrijkse Research GmbH, Centrum voor Biomedische Nanotechnologie (CBN), Scharitzerstraße 6-8, 4020 Linz, Oostenrijk.,

Celine I. Maeder en Mark A. Hink: Deze auteurs hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk.

Voorkeuren

Celbiologie en Biofysica Unit, EMBL-Heidelberg, Meyerhofstrasse 1, D-69117, Heidelberg, Duitsland

Celine I. Maeder, Reinhard Mayr & Michael Knop

Afdeling Systemische Celbiologie, Max Planck Instituut voor Moleculaire Fysiologie, Otto-Hahn-Str. 11, 44227, Dortmund, Duitsland


Conclusies

Door deze biosensoren te gebruiken om MAPK-activiteit in de parings- en celwandintegriteitsroutes te onderzoeken, zouden we een grote heterogeniteit in de respons tussen cellen binnen een isogene populatie kunnen onthullen. Voor de paringsroute kan deze variabiliteit worden verklaard door extrinsieke verschillen tussen cellen. Hoewel bekend was dat de reactie op paringsferomoon afhankelijk was van de celcyclus met een remming van de route tijdens de S-fase, konden we met deze sensoren aantonen dat er ook een andere kinetische activering van de route is tussen een fractie van G2/ M-cellen en cellen in de G1-fase. In de S-fase wordt het scaffold-eiwit Ste5 gefosforyleerd door het Cln2/Cdc28-complex om te voorkomen dat het via het PM-domein naar het plasmamembraan wordt gerekruteerd [28]. Het valt nog te bezien of hetzelfde mechanisme betrokken is bij het waargenomen verschil in de kinetiek tussen G1- en G2/M-cellen. In de CWI-route kan ook een heterogeniteit in de respons tussen individuele cellen worden waargenomen. Het kan niet worden toegeschreven aan celcyclusspecifieke signalen, maar eerder aan de algemene groei van cellen die min of meer basale activiteit van de Mpk1 MAPK induceren.

Deze twee voorbeelden bevestigen het idee dat MAPK-routes geen geïsoleerde signaaltransductiecascades zijn, maar zijn ingebed in het globale signaleringsnetwerk van de cel. MAPK-routes kunnen deze intracellulaire signalen integreren om hun output te moduleren, en op zijn beurt kan de MAPK-activiteit invloed hebben op cellulaire processen zoals de celcyclus, het metabolisme of de groei. Het vermogen om MAPK-activiteit in afzonderlijke cellen te meten die door de SKARS wordt geleverd, stelt ons in staat om deze voorschriften te ontdekken en biedt de mogelijkheid om de mechanistische verbindingen te identificeren die MAPK-routes verbinden met andere cellulaire processen. Over het algemeen maakt de SKARS-technologie directe metingen van enzymatische activiteit in levende cellen mogelijk en kan als zodanig een belangrijk hulpmiddel worden voor systeembiologie. Het gebruik ervan zal de identificatie mogelijk maken van nieuwe regulerende mechanismen die aanwezig zijn in deze signaalcascades en zal op zijn beurt het mogelijk maken om nauwkeurigere wiskundige modellen te bouwen van de dynamische gebeurtenissen die plaatsvinden in deze paden.


Opmerking van de uitgever Springer Nature blijft neutraal met betrekking tot jurisdictieclaims in gepubliceerde kaarten en institutionele voorkeuren.

Uitgebreide gegevens Fig. 1 Identificatie en karakterisering van ExRai-AKAR2.

een, Maximale veranderingen in de excitatieverhouding van 480 nm / 405 nm (ΔR / R) van ExRai-AKAR-linkervarianten in HeLa-cellen gestimuleerd met 50 M Fsk en 100 μM IBMX. De best presterende kandidaat werd aangeduid als ExRai-AKAR2 (P = 0,0002, ongepaarde tweezijdige Student's t-test met Welch's correctie). Van links naar rechts: n = 34, 27, 27, 31, 31, 49, 29, 27, 23, 30, 40, 30, 41, 24, 32, 43, 43, 40, 32, 45 en 30 cellen gecombineerd uit 3 onafhankelijke experimenten elk. B, Domeinstructuren van ExRai-AKAR1 en ExRai-AKAR2. C, ExRai-AKAR2 is bescheiden maar aanzienlijk helderder dan ExRai-AKAR1 in beide excitatiekanalen (**** P < 0,0001 ongepaarde tweezijdige Student's t-test met Welch's correctie). n = 227 (ExRai-AKAR1) en 136 cellen (ExRai-AKAR2) afgebeeld in meerdere velden in respectievelijk 4 en 5 afzonderlijke experimenten. Gegevens worden uitgezet als log-getransformeerde intensiteitswaarden. Helderheidstoenames voor elk kanaal werden berekend door de gemiddelde log-intensiteit van ExRai-AKAR1 af te trekken van die van ExRai-AKAR2 en vervolgens de log-transformatie om te keren (10 x ). De gemiddelde logintensiteiten bij 480 nm-excitatie voor ExRai-AKAR2 en ExRai-AKAR1 waren bijvoorbeeld respectievelijk 3,129 en 2,883. Gegeven dat 10 (3,129-2,883) = 1,762, concluderen we dat ExRai-AKAR2 heeft

76% hogere 480 nm-geëxciteerde intensiteit, gemiddeld, dan ExRai-AKAR1. NSExRai-AKAR2 vertoont significant grotere veranderingen in fluorescentie-intensiteit in beide excitatiekanalen versus ExRai-AKAR1 als reactie op PKA-stimulatie (**** P < 0,0001 ongepaarde tweezijdige Student's t-test met Welch's correctie). n = 68 (ExRai-AKAR1) en 70 (ExRai-AKAR2) cellen gecombineerd uit 3 onafhankelijke experimenten. e,F, ExRai-AKAR2 vertoont een dramatisch hogere (e) maximale verandering van de excitatieverhouding van 488 nm/405 nm (ΔR/R) en (F) signaal-ruisverhouding vergeleken met ExRai-AKAR1 in HeLa-cellen gestimuleerd met Fsk/IBMX (**** P < 0,0001 ongepaarde tweezijdige Student's t-test met Welch's correctie). Gegevens in f zijn samengevoegd van 3 (ExRai-AKAR2) en 4 (ExRai-AKAR1) experimenten. Foutbalken geven gemiddelde ± sem aan. ExRai-AKAR2 gegevens in NS, e worden gereproduceerd uit Fig. 1c-e.

Uitgebreide gegevens Afb. 2 ExRai-AKAR2-prestaties vergelijken met eerdere PKA-sensoren.

(een, B) Zij-aan-zij vergelijking van ExRai-AKAR2 met bestaande PKA-sensoren op basis van intensiteitsverhouding. een, Gemiddeld tijdsverloop met de verbeterde ratiorespons (ΔR/R0) van ExRai-AKAR2 (n = 18) versus ExRai-AKAR1 (n = 11), AKAR4 (n = 18) en AKAR3-EV (n = 18) in HeLa-cellen gestimuleerd met 50 M Fsk en 100 μM IBMX (Fsk /IBMX). Ononderbroken lijnen geven gemiddelde reacties in gearceerde gebieden aan, s.d. B, Samenvatting van de maximale verhoudingsveranderingen (ΔR/R) voor ExRai-AKAR2 (n = 44), ExRai-AKAR1 (n = 39), AKAR4 (n = 38) en AKAR3-EV (n = 36) na Fsk/ IBXM-stimulatie. Representatieve pseudocolor-afbeeldingen onder de grafiek tonen de ruwe emissie (AKAR4, AKAR3-EV) of excitatieverhouding (ExRai-AKAR1, ExRai-AKAR2) voor (bovenste) en na (lagere) Fsk/IBMX-stimulatie. Warmere kleuren geven hogere verhoudingen aan. Schaalbalken, 10 m. Gegevens zijn representatief voor (een) of gecombineerd van (B) 2 onafhankelijke experimenten. Foutbalken in B geef gemiddelde ± sem aan C, Fsk-dosisrespons van ExRai-AKAR2. HeLa-cellen die ExRai-AKAR2 tot expressie brengen (n = 48) werden achtereenvolgens gestimuleerd met de aangegeven concentraties Fsk, gevolgd door 100 M IBMX. Gegevens worden uitgezet als ΔR/ΔRmax = (R[Fsk]R0)/(RIBMX R0), waarbij R[Fsk] is de maximale verhouding geregistreerd na de toevoeging van een bepaalde Fsk-dosis, RIBMX is de maximale verhouding die is geregistreerd na toevoeging van IBMX aan het einde van het experiment, en R0 is de verhouding die direct voorafgaand aan de eerste medicijntoevoeging is geregistreerd (bijvoorbeeld t = 0). Gegevens zijn gecombineerd van 2 onafhankelijke experimenten. Vaste en onderbroken lijnen geven respectievelijk de mediaan en de kwartielen aan. ****P < 0,0001 vs. 0 tweezijdige Wilcoxon-test met ondertekende rangschikking.

Uitgebreide gegevens Fig. 3 Detectie van lokale PKA-signalering met subcellulair gerichte ExRai-AKAR2.

een, Domeinstructuren van ExRai-AKAR2-constructen die zijn gericht op het plasmamembraan, het buitenste mitochondriale membraan en het ER-membraan. B, Representatieve confocale fluorescentiebeelden die de plasmamembraan-, mitochondriale en ER-lokalisatie van respectievelijk pmExRai-AKAR2, mitoExRai-AKAR2 en erExRai-AKAR2 tonen in beide excitatiekanalen (Ex488, Ex405). Voor mito- en erExRai-AKAR2 worden ook afbeeldingen getoond van het rode fluorescentiesignaal (Ex561) van respectievelijk MitoTracker RED en ER-Tracker RED. Samengevoegde afbeeldingen (uiterst rechts) tonen de overlay van de Ex488 (geel), Ex405 (cyaan) en Ex561 (magenta) kanalen. Afbeeldingen zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten per conditie. Ce, Tijdsverloopplots die alle individuele sporen tonen die overeenkomen met de onbewerkte 480/405 excitatieverhoudingsreacties van pmExRai-AKAR2 (links), mitoExRai-AKAR2 (midden) en erExRai-AKAR2 (rechts), samen met representatieve epifluorescentiebeelden van beide excitatie kanalen (hieronder) die de ROI-selectie illustreren (gestippelde witte lijnen), voor de experimenten getoond in Fig. 2a-c. Dikke lijnen geven gemiddelde reacties aan en dunne lijnen geven individuele eencellige sporen weer. Schaalbalken in BC, 10 urn. F, Samenvatting van de veranderingen in de maximale excitatieverhouding (ΔR/R) voor pmExRai-AKAR2 (PM n = 46 cellen uit 3 experimenten), mitoExRai-AKAR2 (Mito n = 43 cellen uit 4 experimenten) en erExRai-AKAR2 (ER n = 35 cellen uit 3 experimenten) in HeLa-cellen gestimuleerd met Fsk/IBMX. Foutbalken in NS geef gemiddelde ± sem aan

Uitgebreide gegevens Fig. 4 ExRai-AKAR2 is een gevoeliger FACS-sonde dan ExRai-AKAR1.

HEK293T-cellen getransfecteerd met ExRai-AKAR1 werden geanalyseerd via flowcytometrie voor en na stimulatie met 50 M Fsk en 100 μM IBMX zoals beschreven in de methoden. een, Contourplot met de 488 nm- en 405 nm-opgewonden fluorescentie-intensiteiten van getransfecteerde cellen zonder (blauwgroen) en met (groen) Fsk/IBMX-stimulatie. B, Frequentieverdeling van de excitatieverhouding van 488 nm/405 nm die de populatieverschuiving illustreert die wordt veroorzaakt door Fsk/IBMX-stimulatie (****P < 0,0001 Kolmogorov-Smirnov-test). Gegevens zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Overlappende grijze en zwarte stippellijnen geven de frequentieverdelingen weer voor met ExRai-AKAR2 getransfecteerde celpopulaties voor respectievelijk na Fsk/IBMX-behandeling (opnieuw getekend uit Fig. 3a). C, Tabel met een samenvatting van de invoerwaarden en resultaten van de berekening van de gevoeligheidsindex (SI) (zie Methoden). ExRai-AKAR2 vertoont een 2-voudig hogere gevoeligheid in vergelijking met ExRai-AKAR1.


Dankbetuigingen

We danken R. Huber en alle leden van de Clausen-groep voor opmerkingen over het manuscript en discussies, J. Leodolter en M. Madalinski voor ondersteuning bij het voorbereiden van pArg-bevattende peptiden, A. Schleiffer voor hulp bij bio-informatische analyse, A. Sedivy en P Stolt-Bergner voor hulp bij CD-spectroscopiemetingen, N. Stanley-Wall (University of Dundee) voor pMAD-plasmide en advies over mutagenese in B. subtilis, en medewerkers van beamlines bij ESRF (Grenoble), SLS (Villigen) en DESY (Hamburg) voor uitstekende hulp bij het verzamelen van gegevens. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de European Research Council (AdG 694978, aan T.C.). Het IMP wordt ondersteund door Boehringer Ingelheim.


Resultaten

Sensorontwerp

Nucleaire lokalisatiesequenties (NLS's) bestaan ​​uit een reeks positief geladen residuen geassocieerd met importine, die vervolgens zijn lading naar de kern zal pendelen [14]. Harreman et al. [15] toonde aan dat extra negatieve ladingen rond de NLS de binding aan importine in gevaar brengen en daardoor de verrijking van de lading in de kern verminderen. Verder merkten ze op dat de NLS voor de Swi6-transcriptiecofactor werd geleid door een serine, wat een potentieel fosforyleringsdoelwit is. Mutatie van dit residu in een alanine resulteerde inderdaad in een constitutief nucleair Swi6-eiwit. Op basis van deze bevindingen hebben we de Swi6 NLS gebruikt als een fosforyleringsdoel voor onze sensor, met het idee dat fosforylering zou leiden tot een uitgang van de sensor uit de kern. Om de efficiëntie van verplaatsing te vergroten, hebben we een tweede fosforylatieplaats toegevoegd na het positieve stuk aminozuren en twee van dergelijke NLS's in onze sensor gecombineerd (figuur 1a).

SKARS-verplaatsing is afhankelijk van een intacte aanlegplaats en fosforylering van NLS door MAPK. een Schematische voorstelling van de drie domeinen van de SKARS-sensor: de docking-site (DS), het nucleaire lokalisatiesignaal (NLS) en het fluorescerende eiwit (RFP). De Ste7DS-NLS-RFP SKARS bestaat uit de Ste7-dockingsite (Ste7DS, aminozuren 1-33), een dubbele NLS en het mCherry-eiwit. B Microscopiebeelden van cellen voor en na stimulatie met α-factor. In het rode kanaal kan men de nucleaire uitgang van de sensor na stimulus observeren terwijl het CFP-histontag-signaal stabiel blijft. c–f Na kwantificering van de time-lapse-films, wordt de verhouding van nucleaire tot cytoplasmatische fluorescentie uitgezet als functie van de tijd. De respons van cellen die de functionele sensor dragen en gestimuleerd met 1 μM α-factor (Nc = 170, dezelfde curve op panelen C tot F) wordt vergeleken met niet-gestimuleerde cellen (Nc = 550, C) of naar cellen die deficiënt zijn voor signaaltransductie (ste11∆, Nc = 360, NS), cellen met een niet-docking variant van de sensor (Ste7ND, Nc = 300, e), of een niet-fosforyleerbare (NLS-4A, Nc = 360, F) of fosfo-nabootsende variant van de sensor (NLS-4E, Nc = 750, F). Eenheidloze metingen, zoals de Nucl/Cyto-verhouding, worden aangegeven met het symbool [–] in de aslegenda. Voor alle vergelijkbare grafieken en tenzij anders vermeld, vertegenwoordigen de ononderbroken lijnen de mediaan van de celpopulatie en het gearceerde gebied het 25 en 75 percentiel van de populatie. Nc staat voor het aantal gemeten afzonderlijke cellen

Alle MAPK's delen hetzelfde consensusfosforyleringsmotief SP of TP. Specificiteit wordt bereikt via een interactie-oppervlak in het kinase dat de docking groove wordt genoemd. Dit motief associeert met een dockingsite (DS) met het consensusmotief (R/K)1-2-X4-6-LXL, dat is geïdentificeerd op MAPK-substraten en op MAPK-fosfatasen en stroomopwaartse activatoren (MAP2K) [16-18]. Deze interactiemotieven zijn aanwezig in eukaryoten, van gist tot zoogdieren. Het is aangetoond dat uitwisseling van deze DS de specificiteit voor een substraat dicteert of, in het geval van een MAP2K, de specificiteit van de geactiveerde MAPK regelt [19, 20]. De groep van Wendell Lim heeft verschillende DS's gekarakteriseerd die interageren met Fus3 en Kss1 [20]. We gebruikten de eerste 33 aminozuren van Ste7, dat de DS bevat met de sterkste affiniteit voor Fus3 en Kss1. De Ste7DS en dubbel-NLS-construct werd gefuseerd met mCherry (figuur 1a). Zoals getoond in Fig. 1b, is de sensor verrijkt in de kern onder vegetatieve groeiomstandigheden. Na stimulatie van de cellen met α-factor, verplaatst het fluorescerende eiwit zich snel naar het cytoplasma. Geautomatiseerde segmentatie van de afbeeldingen maakt de identificatie van de kern en het cytoplasma voor elke cel mogelijk (aanvullend bestand 1: figuur S2) [21]. De verhouding van de gemiddelde intensiteiten in de kern en in het cytoplasma wordt berekend als functie van de tijd voor elke cel. De mediane, 25- en 75-percentielen van de populatie worden uitgezet voor cellen die zijn behandeld met 1 M -factor of niet-gestimuleerde cellen (figuur 1c). Aan het begin van het experiment is de verhouding hoog, wat duidt op een verrijking van de sensor in de kern. Bij toevoeging van -factor daalt deze verhouding binnen enkele minuten. Dit resultaat suggereert dat de sensor wordt gefosforyleerd door Fus3 en Kss1 als reactie op behandeling met α-factor, wat leidt tot verplaatsing van de kern naar het cytoplasma.

Om de specificiteit van deze reactie aan te tonen, herhaalden we dit experiment in cellen die deficiënt zijn voor MAPK-activering (ste11∆), waarbij de sensor na stimulatie in de kern verrijkt bleef (figuur 1d). We kunnen verder aantonen dat deze reactie afhangt van een intacte DS. Inderdaad, mutatie van de DS van Ste7 heft de respons op (figuur 1e). Bovendien verandert mutatie van de vier serines in de twee NLS's naar fosfo-nabootsende residuen (glutaminezuur: NLS-4E) of naar niet-fosforyleerbare residuen (alanine: NLS-4A) de lokalisatie van het fluorescerende eiwit in de cel, maar geen van beide van deze constructen vertonen een verandering in nucleaire-naar-cytoplasmatische partitie na feromoonstimulatie (figuur 1f).

Ten slotte hebben we ook geverifieerd dat de directe remming van de MAPK met behulp van een analoog-gevoelig allel de fosforylering blokkeerde en daarmee de verplaatsing van de SKARS (fus3-as in fus3∆kss1∆, Afb. 2a) [22]. Interessant is dat toevoeging van de remmer na de activering van de route leidt tot een snelle terugkeer van de sensor naar zijn basale nucleaire verrijkingsniveau, wat ten grondslag ligt aan de dynamische aard van de biosensorfosforylering (figuur 2b). Alles bij elkaar genomen tonen deze resultaten duidelijk aan dat we een specifieke sensor hebben gegenereerd voor Fus3- en Kss1-activiteit. De verplaatsing is afhankelijk van een actief kinase dat via de specifieke DS aan de sensor bindt en de serines in de NLS's fosforyleert. Deze wijziging is omkeerbaar, waardoor een dynamische meting van de MAPK-activiteit mogelijk is.

Remming van de MAPK Fus3 voorkomt verplaatsing van de sensor. fus3∆kss1∆ cellen die de Ste7 . dragenDS-NLS-RFP SKARS en een geïntegreerde fus3-as werden gestimuleerd met feromoon in aanwezigheid of afwezigheid van de remmer NAPP1. een NAPP1 of DMSO werden 8 minuten voorafgaand aan de toevoeging van a-factor toegevoegd. De mediane kern-tot-cytoplasmatische verhouding is uitgezet als functie van de tijd (NAPP1: Nc = 343, DMSO: Nc = 230). B Tien minuten na a-factorstimulatie werden cellen behandeld met NAPP1 of DMSO. Merk op dat, na remming van Fus3-as, de sensor binnen 7 minuten terugkeert naar zijn basale nucleaire verrijkingsniveau (NAPP1: Nc = 177, DMSO: Nc = 123)

Om te beoordelen of de aanwezigheid van de SKARS de paringsreactie van de cellen verstoort, hebben we bevestigd dat cellen hun celcyclus kunnen stoppen en paringsprojecties kunnen vormen (aanvullend bestand 1: figuur S3A en B). Deze kwalitatieve tests brachten geen verschil aan het licht tussen cellen met docking- of niet-dockingversies van de sensor. We merkten echter een klein verschil op in de transcriptionele respons van cellen als gevolg van de aanwezigheid van de sensor door met flowcytometrie de expressie van de p te kwantificeren.FIGUUR 1-quadrupleVenus expressie reporter [23] (extra bestand 1: figuur S3C). Deze lichte toename in expressie kan mogelijk worden verklaard door een kleine verrijking van de MAPK's in de kern die wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van de sensor. Dit artefact mag echter een getrouwe meting van de dynamiek van MAPK-activiteit niet in de weg staan.

MAPK-activiteit afleiden

Om MAPK-activiteit uit sensorverplaatsingsmetingen te extraheren, hebben we een eenvoudig wiskundig model ontwikkeld dat de relatie beschrijft tussen de relatieve concentratie van de sensor in de kern en in het cytoplasma en de activiteit van MAPK. Figuur 3a is een schema van de verschillende reacties die in het model zijn opgenomen (aanvullend bestand 1: aanvullende tekst en tabel S1 en S2). Een MAPK en een fosfatase regelen het fosforyleringsniveau van de sensor. De werking van de fosfatase is constitutief. De concentratie van MAPK in de cel is constant, maar de verhouding van actief MAPK (MAPKWerkzaamheid gedefinieerd als de fractie van de totale MAPK-pool in de actieve toestand) verandert als functie van de tijd. Voor de eenvoud gaan we ervan uit dat deze reacties plaatsvinden met vergelijkbare snelheidsconstanten in de kern en in het cytoplasma. De sensor kan vrij diffunderen tussen de kern en het cytoplasma (kDiff), maar alleen het niet-gefosforyleerde SKARS wordt actief geïmporteerd in de kern (kImp). Het model kan voorwaarts worden gesimuleerd door een specifiek tijdsverloop van MAPK . te genererenWerkzaamheid (Fig. 3b) en het berekenen van de resulterende nucleaire-naar-cytoplasmatische verdeling van de sensor (Fig. 3c). Bij steady-state is er een bijna lineaire relatie tussen de MAPKWerkzaamheid en de nucleaire-tot-cytoplasmatische verhouding van de sensor (figuur 3d).

Bepaling van MAPK-activiteit uit biosensormetingen. een Schema van de reacties die in het model zijn geïmplementeerd. De SKARS wordt in de kern en in het cytoplasma gefosforyleerd door MAPK en gedefosforyleerd door fosfatase. De uitwisseling van SKARS tussen het cytoplasma en de kern kan plaatsvinden door passieve diffusie, terwijl alleen het niet-gefosforyleerde SKARS actief in de kern wordt geïmporteerd. b, c Tijdsverloop van activiteit van MAPK wordt berekend voor verschillende eindniveaus van MAPK-activiteit en gebruikt als invoer in het model (B). De resulterende nucleaire-naar-cytoplasmatische verdeling van de sensor voor deze verschillende MAPK-activiteitssporen wordt verkregen als uitvoer (C). NS Correlatie tussen MAPK-activiteit en de nucleair-tot-cytoplasmatische verhouding aan het einde van de simulatie. e Dosis-responscurve van de nucleaire verrijking van de sensor als functie van de concentratie na 15 minuten stimulatie met feromoon (blauwe cirkels). Het gemiddelde en de standaarddeviatie van drie metingen worden uitgezet. Het bijbehorende MAPK-activiteitsniveau wordt berekend (rode cirkels). Als referentie worden de nucleaire-tot-cytoplasmatische verhouding van de niet-gestimuleerde niet-docking sensor en het overeenkomstige niveau van MAPK-activiteit aangegeven door blauwe en rode vierkantjes. F Bepaling van MAPK-activiteit voor het experiment uit figuur 2b. De blauwe cirkels komen overeen met de experimentele gegevenspunten. De gestippelde blauwe lijn geeft de pasvorm van die punten door het model weer. De ononderbroken rode lijn is de geëxtrapoleerde MAPK-activiteit voor dit tijdsverloop

We kunnen het model ook gebruiken om de MAPK-activiteit te schatten op basis van een gemeten kern-tot-cytoplasmatische verhouding. We kwantificeerden de steady-state nucleaire verrijking van de sensor in een populatie van cellen 15 minuten na inductie met verschillende concentraties van α-factor (Fig. 3e). Op basis van deze gegevens kunnen we de dosis-responscurve van MAPK . verkrijgenWerkzaamheid, die zich uitstrekt van 0,2 voor een niet-gestimuleerd monster tot 1 voor verzadigende feromoonniveaus (1 M). een MAPKWerkzaamheid van 1 impliceert dat zowel Fus3 als Kss1 volledig gefosforyleerd zijn in verzadigende feromoonniveaus. Hoewel dit niveau hoog lijkt, suggereert een recent onderzoek naar de HOG-route dat bijna 100% van MAPK Hog1 wordt gefosforyleerd na hyperosmotische shock [24]. Een niet-dockende mutant wordt gebruikt als referentie en toont geen MAPKWerkzaamheid. Het is aangetoond dat HOG en de paringsroutes een bepaald basaal niveau van MAPK-activiteit hebben onder normale groeiomstandigheden [25]. Het exacte niveau van dit basale signaal is moeilijk in te schatten, maar we zien consequent een toename in nucleaire verrijking van de sensor bij het signaleren van dode cellen en in niet-dockingversies van de sensor.

Met behulp van een vergelijkbare strategie kan de dynamiek van MAPK-activiteit worden geschat op basis van tijdsverloopmetingen van sensorverplaatsing. Als bewijs van een concept gebruiken we de activering en remming van de route door α-factor en daaropvolgende toevoeging van de remmer gepresenteerd in Fig. 2b. Vóór stimulus, de MAPKWerkzaamheid laag was. Na toevoeging van -factor bereikte het 0,8 in minder dan 3 minuten na stimulus. Na remming, MAPKWerkzaamheid veel langzamer gedaald. Dit verval wordt gecontroleerd door meerdere factoren, zoals het tijdstip van binnenkomst van het medicijn in de cel, de defosforylering van de biosensor en het verlaten ervan door diffusie uit de kern. Dit wiskundige model toont aan dat er een nauw verband bestaat tussen SKARS-lokalisatie en MAPK-activiteit en dat het, met behulp van een paar eenvoudige aannames, mogelijk is om de gemiddelde MAPK-activiteit van de populatie uit de experimentele metingen te extraheren.

Eencellige metingen

Terwijl een duidelijke uitgang van de sensor uit de kern kan worden gemeten op populatieniveau, wilden we vervolgens verifiëren of we ook kinase-activiteitsmetingen konden verkrijgen op het niveau van een enkele cel. We hebben gemerkt dat er een grote variabiliteit is in de nucleaire verrijking van de sensor tussen individuele cellen voorafgaand aan inductie (aanvullend bestand 1: figuur S4A). Dit grote verschil kan het gevolg zijn van variërende basale activiteit van de route [25] of van een intrinsiek vermogen van een bepaalde cel om de sensor in de kern te accumuleren. Om onderscheid te maken tussen deze twee mogelijkheden, hebben we een functionele (Ste7DS-NLS-YFP) en een niet-functionele sensor (Ste7ND-NLS-RFP) in dezelfde cel. We definiëren het basale niveau als de nucleair-tot-cytoplasmatische verhouding van de SKARS vóór inductie (aanvullend bestand 1: figuur S4A). Met behulp van deze meting nemen we een hoge correlatie waar tussen de nucleaire verrijking van de twee sensoren in een cel, wat aantoont dat elke cel een inherent vermogen heeft om de sensor te importeren (aanvullend bestand 1: figuur S4B). Het is duidelijk dat in cellen die een hogere nucleaire verrijking van de sensor vertonen, de verandering in de nucleaire-tot-cytoplasmatische verhouding bij stimulatie gemakkelijker te kwantificeren is (aanvullend bestand 1: figuur S4A). Om een ​​eerlijke vergelijking tussen elk afzonderlijk spoor van een enkele cel mogelijk te maken, werden ze genormaliseerd op basis van hun basale niveaus. Voor elk individueel spoor werden de initiële respons (3 tot 5 minuten na stimulus) en de uiteindelijke respons (laatste drie punten van de time-lapse) gekwantificeerd (aanvullend bestand 1: figuur S4C tot E).

De genormaliseerde nucleaire-tot-cytoplasmatische verhouding van ongeveer 300 afzonderlijke cellen werd gesorteerd op basis van hun uiteindelijke reacties en weergegeven in een hittekaart waarbij elke regel overeenkomt met een spoor van een enkele cel (figuur 4a). In het onderste deel van de kaart zijn cellen geclusterd die een grote verandering in nucleair-naar-cytoplasmatische verrijking vertonen na stimulatie (hoge eindrespons). Het bovenste deel van de kaart vertegenwoordigt een fractie van de populatie waar geen respons wordt gedetecteerd. Om de reagerende cellen te onderscheiden van de niet-reagerende cellen, vergeleken we de eencellige reacties van twee stammen die ofwel de docking- of de niet-docking-sensor droegen (Ste7DS-NLS-RFP en Ste7ND-NLS-RFP, respectievelijk). Met behulp van de niet-functionele sensor als referentie, hebben we een drempel ingesteld om onderscheid te maken tussen de reagerende cellen en niet-reagerende cellen die de functionele sensor dragen (aanvullend bestand 1: figuur S4F tot H). Ongeveer 17% van de gemeten cellen werd dus gekenmerkt als niet-reagerend (Fig. 4b).

Eencellige analyse van MAPK-activiteit na feromoonstimulatie. een Warmtekaart van de reactie van individuele cellen op 1 M α-factor. Elke lijn vertegenwoordigt de kern-tot-cytoplasmatische verhouding van één enkele cel, genormaliseerd door zijn basale niveau (Nc = 293). De celreacties werden gesorteerd op basis van het niveau van de uiteindelijke reactie (gemeten bij T = 12 min). De cellen werden geclassificeerd als reagerend (cyaan), niet-reagerend (groen) of traag reagerend (blauw). Het basale niveau van elk spoor wordt aangegeven in rode tinten (van zwart naar rood, toenemend basaal niveau). B Scatterplot van de initiële en uiteindelijke respons van de cellen. Elke stip komt overeen met een enkele celmeting. De kleur geeft aan tot welke subpopulatie de cellen behoren. C Temporele evolutie van de nucleaire-tot-cytoplasmatische verhouding na feromonenbehandeling. De ononderbroken lijn geeft de gemiddelde respons van elke subpopulatie weer. De stippellijnen zijn sporen van de drie enkele cellen omcirkeld in het paneel (B). NS, e, F Afbeeldingen van de geselecteerde cellen in het helderveld, CFP (histone-tag) en RFP (Ste7DS-NLS-RFP) kanalen op verschillende tijdstippen. De donkere lijn in het helderveldbeeld vertegenwoordigt de gesegmenteerde celcontour

In de groep reagerende cellen konden we ook twee soorten reacties onderscheiden. A small fraction (11 %) of the total cell population displayed a delayed response, characterized by an initial response weaker than the final response (arbitrarily defined as more than a 50 %-fold difference, Fig. 4b). Figure 4c represents the mean response of the cells in the defined categories (solid lines) as well as the response of one cell from each sub-population (dotted line), identified by a circle in panel B. Images of these same cells are also provided in panels D, E, and F. The heterogeneity in the dynamics of SKARS between these three populations of cells suggests that they have very different levels of MAPK activity, which may be linked to an intrinsic difference in their ability to respond to mating pheromone.

It is indeed well-established that the signaling activity in the mating pathway is dependent on the cell cycle stage [26–28]. Cells which are committed to division and have entered the S-phase become refractory to signal transduction. To correlate cell cycle stage with the dynamics of the SKARS, we tagged Whi5 and Yox1 with mCitrine in cells bearing the sensor. Whi5 is a repressor of G1 transcription and accumulates in the nucleus of the cells during G1 (Fig. 5a). It has been used previously as a marker for G1-entry and exit [29]. Yox1 is a transcription repressor that inhibits the expression of cell cycle regulated genes induced in the M and G1 phases [30]. It enters the nucleus upon S-phase entry and remains there until the beginning of G2 (Fig. 5b). As expected, cells with nuclear Whi5 were predominantly responding (Fig. 5c, dark blue dots). In contrast, a large fraction of the Yox1 positive cells were non-responding (Fig. 5d, light blue dots). Cells with cytoplasmic Whi5 were equally split between non-responding and responding cells. Based on the Yox1 data, we can assume that these non-responding cells are mainly S-phase cells (4C, light green dots) and, therefore, the responding ones are G2/M cells (4C, dark green dots). Similarly, we can assume that the Yox1-negative population, which displays a response, is dominated by G1 cells (4D, dark green dots), while responding cells with a Yox1-positive signal must be in the G2 phase (4D, dark blue dots).

Cell cycle dependent dynamics of signaling in the mating pathway. a, b Yeast cells expressing the Ste7DS-NLS-RFP sensor and Whi5 tagged with mCitrine (een) or Yox-1 tagged with mCitrine (B) imaged before and after stimulation with α-factor. C, NS Correlation between the measured Whi5 (Nc = 616, C) and Yox1 (Nc = 698, NS) nuclear enrichment (nuclear – cytoplasmic intensities) measured before stimulation and the sensor’s final response. The scatter plot is split in four quadrants. The blue dots represent cells with an enriched nuclear marker, while the green dots represent cells where no enrichment is detected. The dark and light coloured dots represent, respectively, responding and non-responding cells. e, f Average response of the four sub-populations of cells in the four quadrants delimited on panels C (Whi5, e) en NS (Yox1, F). The colour code is the same as in (C) en (NS)

Taken together, these results are in general agreement to what was previously known: G1, M, and G2 cells are permissive to α-factor signaling while S-phase cells are refractory to this stimulus. However, these data also offer some additional insights about this regulation. First of all, there is a clear kinetic difference in the activation of the sensor between G1 cells and G2/M cells. In G1 cells, the sensor exits the nucleus within 3 to 4 minutes after the stimulus, while the G2/M cells seem to display a slower response (Fig. 5e, dark blue vs. dark green curves). This sub-population of cells is clearly enriched for slow responding cells (Additional file 1: Figure S5). This suggests that Fus3/Kss1 activity in this phase of the cell cycle is reduced. The second interesting observation is the fact that almost all sub-populations display an early exit of the sensor, which subsequently returns to basal value for non-responding cells (Fig. 5e, light green curve and 5f light blue curve). This hints at a transient activation of the pathway at early time-points, which cannot be sustained if the cells are not in the proper cell cycle stage.

Combination of sensors

In the previous experiment, SKARS were associated with fluorescently tagged proteins to correlate kinase activity and cell cycle stage. In a similar manner, we can envision to combine multiple SKARS in the same cell to correlate the activity of different kinases. Indeed, the fluorescent protein in the sensor is an inert bystander of the relocation process and its exchange should not affect the response of the sensor. To verify this statement, we combined an RFP and a YFP version of the sensor (Ste7DS-NLS-RFP and Ste7DS-NLS-YFP) in the same strain. While there is a slight difference between the YFP and RFP ratio measured with the sensor, the dynamics of the response measured with both sensors are strikingly similar (Fig. 6a). At the single cell level, we measured a high correlation between the final responses measured with each sensor (Additional file 1: Figure S6A).

Generation of a Fus3-specific sensor based on the Far1 docking site. een Combination in the same cell of two sensors bearing the same Ste7DS but tagged with mCherry or mCitrine and stimulated at time 0 with 1 μM α-factor (Nc = 660). The ratios were plotted on two different y-axes (left: Ste7DS-NLS-YFP, right: Ste7DS-NLS-RFP) to allow a direct comparison of the dynamic response of both sensors. B Engineering of a Fus3-specific sensor by replacing the Ste7 docking site by the Far1 docking site sequence (Far1DS). C Response of cells of different background (WT (blue, Nc = 630), fus3∆ (green, Nc = 474), kss1∆ (red, Nc = 990), and fus3∆kss1∆ (cyan, Nc = 952)) bearing the Far1DS-NLS-RFP (left) and the Ste7DS-NLS-YFP (right) stimulated with α-factor 1 μM. NS Histograms of the final response of cells in the YFP and RFP channel. The asterisks designate distributions that are significantly different (t-toets, P <0.001) from the non-responding fus3∆kss1∆ controle

The Ste7 DS allows the sensing of the combined activity of Fus3 and Kss1. In their analysis of MAPKs DSs, Lim et al. [20] revealed the difference in structure between the DS of Ste7, which binds both Fus3 and Kss1, and the DS of Far1 that is specific for Fus3. The presence of two prolines in the Far1DS forces binding to MAPK via a different conformation that is not compatible with the Kss1 docking groove. To test whether we could confer Fus3 specificity to our sensor, we replaced the 11 amino acids in the Ste7DS by the 13 residues forming the Far1DS (Fig. 6b). To test the specificity of this sensor, we combined the Far1DS-NLS-RFP and Ste7DS-NLS-YFP sensors in the same cells and quantified their responses in wild-type (WT) and MAPK deletion strains (Fig. 6c and d). Both sensors relocate in WT and kss1∆ backgrounds. As expected, all relocation is abolished in the double MAPK deletions fus3∆kss1∆. Interessant, in fus3∆ cells, only the Ste7DS-NLS-YFP sensor exits the nucleus upon α-factor stimulation, demonstrating the specificity of the Far1DS for phosphorylation by the Fus3 MAPK. The histogram of the final response measured in individual cells is displayed in Fig. 6d. In fus3∆ cells, a weak but statistically significant activation of the pathway can be detected. Note also that the basal nuclear enrichment of the Ste7DS-NLS-YFP sensor in this strain is lower, which suggests that, in the absence of Fus3, there is a slightly higher level of MAPK activity. It is in agreement with previous observations showing that Kss1 is overexpressed and displays a higher basal activity in a fus3∆ background [31]. It is noteworthy to mention that both the dynamics and level of kinase activity in WT and kss1∆ cells are very similar, arguing for a predominant contribution of Fus3 to the response of the cells when stimulated with 1 μM α-factor.

Cell wall integrity pathway

Since the DS of the sensor dictates its specificity, we next tried to identify a DS for the MAPK of the CWI pathway, Mpk1. Molina et al. [32] identified a sequence in the N-terminus of the MAP2Ks Mkk1 and Mkk2 of S. cerevisiae that is conserved in other fungi and share some homology with the consensus DS of MAPKs (Fig. 7a). We therefore cloned the first 33 amino acids of Mkk2 in front of the NLS-RFP construct to generate an Mpk1-specific SKARS. When integrated in cells, this sensor turned out to be mostly cytoplasmic, suggesting that a high basal activity of the MAPK resulted in a constitutive phosphorylation of the sensor. Indeed, this localization was Mpk1 activity dependent since deletion of the MAP3K Bck1 leads to an enrichment of the sensor in the nucleus (Additional file 1: Figure S7A and B).

Mpk1 activity dynamics upon zymolyase or hypo-osmotic stresses. een Schematic of the Mpk1 sensor and alignment of the docking sites present in Mkk1 and Mkk2. B Scheme of the activation of Mpk1 by zymolyase or hypo-osmotic stress. C Dynamic localization of the Mkk2DS1-100-NLS-RFP sensor quantified by its change in nuclear-to-cytoplasmic ratio upon stimulation by zymolyase 3 U/mL at time 0 in WT (red, Nc = 313), ste11∆ (blue, Nc = 160), and bck1∆ (green, Nc = 80). NS Histograms of the final response after zymolyase stress measured in the WT and two deletion strains. e Mpk1 sensor relocation upon hypo-osmotic shock performed in microfluidic devices where the sorbitol concentration in the medium is lowered from 1 M to 0.5 M: WT (red, Nc = 168), ste11∆ (blue, Nc = 180), and bck1∆ (green, Nc = 217). F Histograms of the final response after hypo-osmotic stress measured in the WT and two deletion strains. In panels D and F the asterisks designate distributions that are significantly different (t-toets, P <0.001) from the bck1∆ controle

To modulate the sensitivity of the sensor, we changed the distance separating the DS and the NLS. Mkk2 N-terminal fragments of different lengths (from 1–27 to 1–150 amino acids) were cloned in front of the NLS hoping that the distance between the DS and the phosphorylation sites would tune the ability of Mpk1 to phosphorylate the sensor. While we did not detect a simple relationship between the length of the spacer and the basal level of nuclear localization of the SKARS (Additional file 1: Figure S7C to F), we could identify one construct, DS1-100, which displayed the highest enrichment in nuclear fluorescence. Nonetheless, the nuclear enrichment of this SKARS was still highly variable from cell to cell, suggesting that cells within a population can display a wide range of Mpk1 activities.

To test whether the Mkk2DS1-100 sensor could report on Mpk1 activation by acute cell wall stress, cells were subjected to zymolyase treatment. It has been previously reported that in order to activate Mpk1 upon zymolyase stress, activity of the HOG pathway via Ste11 and Pbs2 is required (Fig. 7b) [6]. Due to the very large difference in basal value between bck1∆ cells on one side and WT and ste11∆ on the other, the latter strain offered a better comparison for the response measured in WT cells (Fig. 7c). When measured at the population level, the WT cells stressed with zymolyase displayed a slow gradual relocation of the sensor out of the nucleus. As expected, this translocation was blocked in bck1∆ as well as in ste11∆, implying that Mpk1 was not activated in these mutants (Fig. 7d).

In order to verify that the response of the SKARS was specific to the Mpk1 pathway, we also stressed cells with hypo-osmotic shock, where CWI activation is independent of the HOG pathway (Fig. 7b). To perform this experiment, cells were grown in medium complemented with 1 M sorbitol. The cells were loaded in a microfluidic chip and the medium was exchanged within seconds by medium containing 0.5 M sorbitol. The sensor transiently exited the nucleus and returned to a stable value slightly lower than the original basal value. Ste11 was not required for this response, as the ste11∆ cells displayed a response comparable to the WT cells. In bck1∆ cells, only a small drop in the nuclear-to-cytoplasmic ratio was detected corresponding to the expansion of the cell in the lower osmolarity medium (Fig. 7e,f). Note also that the sensor was more nuclear in cells grown in 1 M sorbitol, implying that the basal activity of the pathway decreased under these conditions and that the deletion of Ste11 also influenced this basal activity in hyper-osmotic medium.

Single cell response to cell wall damage

Because of the wide variety in basal activity of Mpk1 observed in the cell population, we wondered how individual cells responded to zymolyase treatment. Figure 8a represents a 2D-map of the normalized response of more than 300 single cells sorted based on their final response. Using a threshold of 0.2 for the final response, we can split the population in a group of responding (58 %, blue) and non-responding cells (green). Figure 8b displays the average nuclear-to-cytoplasmic ratio of the sensor as function of time for these two populations. The non-responding cells have a strikingly lower level of sensor nuclear enrichment at the onset of the experiment denoting a higher basal activity of the pathway in these cells (Fig. 8c).

Single cell responses upon zymolyase-induced cell wall damage. een Heat map of the response of individual cells bearing the SKARS Mkk2DS1-100-NLS-RFP to zymolyase (3 U/mL). Each line represents the normalized response of one single cell (Nc = 313). The cell traces were sorted based on the level of final response. This measurement was used to classify the cells in a group of responding cells (blue) and a group of non-responding cells (green). The basal level of each trace is indicated in shades of red (from black to red, increasing basal level). These cells also bear the cell cycle marker Whi5 and its level of nuclear enrichment is indicated in shades of yellow (from black to yellow, increasing nuclear Whi5). B Average nuclear-to-cytoplasmic ratio as function of time for the responding and non-responding cells. C Histogram of the basal level in responding and non-responding cells. d, e Histogram of the final response measured in cells with or without nuclear enrichment of the cell-cycle marker Whi5 (NS) or Yox1 (e).

Since it has been reported that the activity of the Mpk1 pathway fluctuates during the cell cycle and is higher in phases of polarized growth, we wondered whether the heterogeneity observed in the response to zymolyase was dependent on cell cycle stage [33]. G1 cells in the population were identified with a Whi5-mCitrine tag. The level of nuclear accumulation of Whi5 for each cell is shown in Figure 8a cells with nuclear Whi5 can be found in both the responding and non-responding cells. Figure 8d compares the final response of cells with nuclear and cytoplasmic Whi5. A similar analysis was performed with Yox1-mCitrine cells, where the presence of the fluorescent protein in the nucleus identifies S-phase and early G2-phase cells. There was a tendency for G1 cells to respond stronger to the stimulus while dividing cells displayed a decreased tendency to respond. However, there was no apparent inhibition of CWI signaling in a cell cycle-dependent manner.

To modulate the basal activity of the pathway, we grew cells in low glucose (0.01 %, Additional file 1: Figure S8). In this medium, the growth rate was slower, thus remodelling of the cell wall occurred on longer time-scales, resulting in a lower constitutive basal activity of Mpk1. Indeed, we observed a global increase in the basal nuclear enrichment of the sensor, resulting from the decreased activity of Mpk1 (Additional file 1: Figure S8B). A larger fraction of the cells stressed with zymolyase under these conditions displayed an export of the sensor (Additional file 1: Figure S8C). Together, these results indicate that basal activity of the CWI pathway is linked with cell growth rather than the cell cycle. Moreover, in cells where Mpk1 is already activated by growth, we do not detect an additional effect due to the cell wall stress induced by zymolyase within the time-frame of the experiment.


Protein and Enzyme Activity Assays

Glycosidase enzymes exhibit high selectivity for hydrolysis of their preferred sugars. We offer assays for a wide range of glycosidases and related enzymes including amylase, cellulase, neuraminidase and many more.

Producten

We offer the widest and most comprehensive breadth of technologies available to screen for kinase enzyme activity. This portfolio consists of technologies that range from homogenous assays utilizing peptide substrates to antibody specific assays.

Producten

Producten

Phopholipases play an important part in cellular signaling processes via the generation of second messengers such as diacylglycerols, arachidonate, and inositol 1,4,5-triphosphate. Lipases generally include glycerol ester hydrolases and cholesterol esterases. We offer fluorogenic and fluorescent substrates and kits for detecting phospholipase-A, -C, and -D, as well as phosphatidyl inositol.

Producten

Oxidases, the most useful of which is undoubtedly horseradish peroxidase (HRP), are important enzymes that are used in a wide variety of bioassays. Peroxidase activity is also present in many cells. We offer reagents for quantitating peroxidase and the activity of a variety of other oxidases.

Producten

Enzymes play an important role in almost all cellular processes, including signaling pathways, metabolism, and gene expression, making them significant targets in drug and therapeutic development. We offer a broad range of reagents and assays for detecting enzyme activity by absorbance, fluorescence, or chemiluminescence.


Bekijk de video: Cikgu bodoh (December 2021).