Informatie

Hoe de Ct van het doelgen te onderscheiden van de Ct van het huishoudgen? (zeer eenvoudige qPCR-vraag)


Ik zal voor de eerste keer een qPCR-experiment doen en ik heb een onderste vraag te stellen. Ik weet dat voor het normaliseren van de hoeveelheid van je doelgen je een endogene controle, zoals een huishoudgen, in je qPCR-monster moet toevoegen, en dan trek je de Ct van het huishoudgen af ​​van de Ct van je doelgen. Echter, aangezien dezelfde SYBR groene fluorofoor wordt gebruikt om zowel het doelgen als het huishoudgen in hetzelfde monster te kwantificeren, hoe weet u dan welke Ct van het doelgen is en welke van het huishoudgen?


U neemt geen metingen van dezelfde reactie, u splitst het monster. Je zou elk primerpaar in hun eigen reactie laten lopen. U wilt ook elke reactie in drievoud uitvoeren, zodat u een idee krijgt van de fout. Een algemene plaatopstelling kan er dus ongeveer zo uitzien:

A1: controlemonster, huishoudprimers; A2: controlemonster, doelgenprimers B1: controlemonster, huishoudprimers; B2: controlemonster, doelgenprimers C1: controlemonster, huishoudprimers; C2: controlemonster, doelgenprimers D1: behandelingsmonster, huishoudprimers; D2: Behandelingsmonster, doelgenprimers E1: Behandelingsmonster, huishoudprimers; E2: Behandelingsmonster, doelgenprimers F1: Behandelingsmonster, huishoudprimers; F2: Behandelingsmonster, doelgenprimers

Dus in dit scenario komt de delta-delta Ct-waarde van het volgende:

delta-delta Ct = ( Ct(behandeling, doel) - Ct(behandeling, huishouding) ) - ( (Ct(ctrl, doel) - Ct(ctrl, huishouding) )

Als de PCR-machine niet aanbiedt om de delta-delta Ct-analyse voor u uit te voeren, raad ik deze blog aan, die het zowel goed uitlegt als een Excel-spreadsheet biedt, zodat u uw Ct-waarden gewoon kunt invoeren.
HTH.


Bekijk de video: Understanding Reverse Transcriptase Effects on Ct value (November 2021).