Informatie

Hoe eiwitneerslag te voorkomen?


Ik probeer een eiwit te labelen met fluorescerende kleurstof (TMR-succinimidylester), maar ik heb problemen om het protocol te laten werken.

Het eiwit lijkt stabiel te zijn in gedestilleerd water bij een aanbevolen concentratie van ongeveer 2 mg/ml (bepaald door OD280 met een absorptiecoëfficiënt berekend uit de volgorde).

Het protocol vraagt ​​echter om de toevoeging van 1:10 1M natriumbicarbonaat om de pH te verhogen tot ~8,5. Wanneer ik deze stap uitvoer, wordt de oplossing onmiddellijk troebel. Ik ben dit neerslagprobleem ook tegengekomen bij het dialyseren tegen PBS.

Welke stappen kan ik nemen om dit te omzeilen? Ik neem aan dat een lagere eiwitconcentratie neerslag zou kunnen voorkomen, maar ik heb gelezen dat de labelingsreactie erg inefficiënt wordt onder 1 mg/ml.


Helaas, de grote problemen met de eiwitformulering. Ik neem aan dat de chemie van de etikettering je dwingt om de pH van 8,5 te gebruiken. (Ik denk niet dat dit noodzakelijkerwijs waar is, aangezien de succinimidylchemie werkt bij pH=7.2 en de NHS-ester redelijk onstabiel is boven pH=8.6)

We pakken dit probleem meestal volledig met brute kracht aan, dat wil zeggen. het testen van meerdere buffercondities met verschillende basen en verschillende zoutconcentraties. De eerste poging zou zijn om alle Good's Buffers uit te proberen, met name HEPES, TRIS, MOPS, Tricine. Misschien moet je kijken naar zowel zwitterionische buffers als niet-zwitterionische buffers. In jouw geval is de succinimidyl kwetsbaar voor primaire amines, dus vermijd dingen als Tris/Glycine.

Het tweede dat moet worden getest, zijn verschillende zoutconcentraties. Omdat je al natriumbicarb dumpt, zou NaCl geweldig moeten zijn. Helaas wordt dit hier waar het lastig wordt, omdat het moeilijk is om te weten of je eiwit neerslaat bij een laag zoutgehalte of een hoog zoutgehalte. Een test van 20 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 500 mM zou de meeste interessante regimes moeten dekken.

Als alternatief kan de plotselinge verandering in de ionische omgeving rond uw eiwit ervoor zorgen dat het neerslaat. U moet uw eiwit waarschijnlijk in PBS dialyseren of zuiveren om het op de juiste manier opnieuw te kunnen vouwen.


Eiwit precipitatie

Ammoniumsulfaat ppt verwijdert tot 50'37 verontreinigend eiwit en vermindert daarom de belasting voor daaropvolgende chromatografie. De meeste geprecipiteerde eiwitten behouden hun activiteit en natieve conformatie en kunnen gemakkelijk opnieuw worden opgelost. Ideaal voor ruwe en verdunde monsters.

Bij 0 o C is een verzadigde oplossing van ammoniumsulfaat 3,9 M. Dit wordt een 100&37 oplossing genoemd (omdat dit de maximale hoeveelheid ammoniumsulfaat is die je in een oplossing kunt hebben - niet omdat er 100 g/100 ml in zit). Over het algemeen zullen sommige eiwitten neerslaan bij 20'37, andere niet tot bijna 80'37, maar de meeste eiwitten zullen neerslaan bij 80'37 of minder ammoniumsulfaatconcentratie. Soms wordt vast ammoniumsulfaat toegevoegd, maar over het algemeen is er minder risico op denaturering van de eiwitten en een duidelijkere scheiding van neergeslagen eiwitten als een verzadigde oplossing van ammoniumsulfaat wordt toegevoegd.

Om 100% verzadigd ammoniumsulfaat te maken bij 25 o C:
Voeg aan 1000 ml dH 2 O 766,8 g (NH 4 ) 2 SO 4 toe. pH tot 6,8-7,0 met 5 of 10 M NaOH.
Er is dus 541,2 g ammoniumsulfaat per 1 verzadigde oplossing.

  • Koel 20 minuten in ijswater.
  • Centrifugeer 15 minuten in de kou met een minimum van 13.000 g (waarschijnlijk beter om de hogesnelheidscentrifuge te gebruiken bij 14.000 tpm, wat 23.600 g is).
  • Super verwijderen (en opslaan indien gewenst).
  • Resuspendeer pellet in relevant oplosmiddel.
  • Neem 300 µl supe + 1200 µl verzadigde ammoniumsulfaat en ijs 20 minuten.
  • Spin 15 minuten op maximale snelheid van microcentrifuge.
  • Superieur verwijderen. Resuspendeer pellet in relevant oplosmiddel. (Natuurlijk, als u weet dat u uw eiwit kunt neerslaan met minder dan 80 ° 37 ammoniumsulfaat, dan kunt u meer van het monster in de buis opnemen.)

Hier is een voorbeeld: stel dat je 3 ml van een oplossing hebt en er 20-inch ammoniumsulfaat van wilt maken. Het uiteindelijke volume is 3 ml + x ml, waarbij x de hoeveelheid ammoniumsulfaat is die u moet toevoegen.

Gebruik makend van:
(Final V) x (final C) = (V van concentraat toegevoegd) x (concentraat C).

Vervolgens:
(3 + x ) x (20'37) = ( x) x (100'37)
60 + 20x = 100x
60 = 80 x
x = 3/4 of 0,75 ml.
dus om een ​​volume van 3 ml op 20' ammoniumsulfaat te brengen, moet u 0,75 ml 100' concentraat toevoegen.

OM EEN OPLOSSING TE MAKEN 40'37 IN AMMONIUMSULFAAT (VAN 100' VOORRAAD) VOEG 0,67 VOLUMES VAN 100%' AMMONIUMSULFAAT TOE.
(3 + x ) x (40'37) = ( x) x (100'37)
120 + 40x = 100x
120 = 60 x
x = 2 ml (of 0,67 volumes).

OM EEN OPLOSSING TE MAKEN 67'37 IN AMMONIUMSULFAAT (VAN 100' VOORRAAD) VOEG 2 VOLUMES 100'' AMMONIUMSULFAAT TOE.
(3 + x ) x (67'37) = ( x) x (100'37)
200 + 67 x = 100 x
200 = 33 x
x = 6 ml (of 2,0 volumes).


Handboek voor farmaceutische analyse door HPLC

1 Eiwitprecipitatie

Eiwitprecipitatie wordt veel gebruikt bij het voorbereiden van LC/MS-monsters voor bioanalyse. 154-156 De plasmamonsters worden gewoonlijk gemengd met 3-5 keer hun volume aan organische oplosmiddelen zoals acetonitril en methanol of aangezuurde oplossingen zoals verdund trifluorazijnzuur en perchloorzuur. 157 Analisten moeten zich bewust zijn van de stabiliteit van de verbinding bij lage pH voordat zuren kunnen worden gebruikt voor eiwitprecipitatie. De mengsels worden bij 3000 rpm gecentrifugeerd of gefiltreerd om een ​​heldere supernatant of filtraatoplossing op te leveren. Het supernatant of filtraat kan direct in een LC/MS-systeem worden geïnjecteerd of gedroogd en opnieuw worden samengesteld in een mobiele HPLC-fase om uiteindelijk geconcentreerde monsters te genereren. 157 Als verdampings- en reconstitutiestappen worden weggelaten, zullen verdunde monsters worden verkregen, en als gevolg daarvan kan de limiet van kwantificering (LOQ) van de test in het gedrang komen. Bovendien zijn supernatant- en filtraatoplossingen die hoge percentages organisch oplosmiddel bevatten mogelijk niet geschikt voor directe injectie wanneer een snelle gradiënt wordt gebruikt. 158

Off-line monstervoorbereiding door middel van eiwitprecipitatie wordt vaak geautomatiseerd met een vloeistofbehandelingssysteem dat wordt gebruikt voor het overbrengen, mengen en filtreren van monsters. 154-156 De uiteindelijke monsters kunnen worden bereid in een plaatformaat met 96 putjes dat compatibel is met de meeste LC/MS-autosamplers. Eiwitprecipitatie vereist geen zeer uitgebreide methode-ontwikkeling en kan worden geïmplementeerd als een eenvoudige generieke methode om monsters te bereiden uit farmacokinetische ontdekkingsonderzoeken. 154–156 Een van de kanttekeningen bij eiwitprecipitatie is dat de procedure een relatief slechte monsteropruiming heeft. Daarom kunnen co-eluerende componenten het ionisatieproces van analyten verstoren door de ionenproductie te onderdrukken of te versterken. 154-158


Eiwitten en laboratoria komen samen om het Rett-syndroom te voorkomen

Nieuwe ontdekkingen over de verstoring van condensaten bij de neurologische ontwikkelingsstoornis Rett-syndroom bieden inzicht in hoe cellen chromosomen in compartimenten verdelen, evenals nieuwe potentiële paden voor therapieën.

Wetenschappers hebben de cel jarenlang geconceptualiseerd als een relatief vrij stromende ruimte, waar, afgezien van de organisatie die wordt geboden door specifieke cellulaire structuren, de moleculen vrij rondzweven en op de een of andere manier uiteindelijk op de juiste plaats op het juiste moment terechtkomen. In de afgelopen jaren hebben wetenschappers echter ontdekt dat cellen een veel ruimtelijkere organisatie hebben dan eerder werd gedacht dankzij een mechanisme genaamd fasescheiding, dat optreedt in cellen wanneer bepaalde moleculen grote druppelachtige structuren vormen die scheiden wat zich in de druppel bevindt van de rest van de cel. De druppeltjes, condensaten genaamd, helpen moleculen op specifieke locaties vast te houden en te concentreren, en lijken de efficiëntie van bepaalde cellulaire functies te verhogen.

Richard Young, lid van het Whitehead Institute, ook hoogleraar biologie aan het Massachusetts Institute of Technology (MIT), heeft de voorheen onbekende rol onderzocht die condensaten spelen bij het verzamelen van de moleculen die nodig zijn voor gentranscriptie, het proces waarbij DNA in RNA wordt gelezen. Om beter te begrijpen wanneer en hoe cellen fasescheiding gebruiken, ging Charles Li, een afgestudeerde student in het laboratorium van Young, op zoek naar meer eiwitten die condensaten kunnen vormen. Die zoektocht leidde hem naar MeCP2, een eiwit dat verband houdt met de ernstige neurologische ontwikkelingsstoornis Rett-syndroom, bestudeerd door Young's collega aan het Whitehead Institute, stichtend lid Rudolf Jaenisch, die ook hoogleraar biologie is aan het MIT. Er bestaat momenteel geen remedie voor het Rett-syndroom, en het laboratorium van Jaenisch heeft de biologie van de aandoening onderzocht in de hoop een medische therapie te vinden die neuronen kan redden die zijn aangetast door het Rett-syndroom.

Met de ontdekking van het condensaatvormende vermogen van MeCP2 zagen Young en Jaenisch de kans voor een veelbelovende samenwerking tussen hun laboratoria. Onder leiding van co-eerste auteurs Li en Eliot Coffey, een andere afgestudeerde student in het laboratorium van Young's, onderzochten de twee laboratoria MeCP2 en of de verstoring van het condensaatvormende vermogen bijdraagt ​​aan het Rett-syndroom. Tijdens deze onderzoeken ontdekten de onderzoekers ook hoe cellen condensaten kunnen gebruiken om de actieve en inactieve delen van chromosomen te helpen organiseren. Hun bevindingen, gepubliceerd in het tijdschrift Natuur op 22 juni verslag uitbrengen over deze inzichten en nieuwe wegen voorstellen voor het ontwikkelen van therapieën voor het Rett-syndroom.

FASESCHEIDING EN RETT-SYNDROOM

Eiwitten die condensaten vormen, bevatten vaak intrinsiek ongeordende regio's (IDR's), lange spaghetti-achtige strengen die tijdelijk aan elkaar plakken om een ​​dynamisch netwerk te vormen. Onderzoek heeft zich van oudsher gericht op de gestructureerde regio's van eiwitten, die zeer specifiek binden aan andere moleculen, terwijl IDR's grotendeels over het hoofd zijn gezien. In dit geval waren de grote IDR's van MeCP2 precies wat Li aantrok.

'Wat me opviel was dat dit eiwit al tientallen jaren wordt bestudeerd en dat er zoveel functie is toegeschreven aan het eiwit als geheel, maar dat het maar één gestructureerd domein heeft met een erkende functie, het DNA-bindende domein. Verder is het hele eiwit ontregeld, en hoe de onderdelen functioneren was grotendeels onbekend', zegt Li.

De onderzoekers ontdekten dat MeCP2 zijn IDR's gebruikte om samen te smelten en condensaten te vormen. Daarna testten ze veel van de mutaties in het MECP2-gen die geassocieerd zijn met het Rett-syndroom en ontdekten dat ze allemaal het vermogen van MeCP2 om condensaten te vormen verstoren. Hun bevindingen suggereren dat therapieën die gericht zijn op condensaten die verband houden met het eiwit, in plaats van het eiwit zelf, veelbelovend kunnen zijn in de jacht op een behandeling van het Rett-syndroom.

'MeCP2 en het Rett-syndroom zijn jarenlang intensief bestudeerd in veel laboratoria en toch is er geen enkele therapie ontwikkeld. Toen het project begon, was ik meteen gefascineerd door het idee dat we een nieuw ziektemechanisme zouden kunnen vinden dat ons zou kunnen helpen eindelijk te begrijpen hoe het Rett-syndroom ontstaat en hoe het kan worden behandeld,'zegt Coffey.

“Rick [Young] heeft aangetoond dat condensaten een sleutelrol spelen bij het in stand houden van de normale celfunctie, en onze nieuwste samenwerking laat zien hoe hun verstoring ziekten zoals het Rett-syndroom kan veroorzaken,” Jaenisch. “Ik hoop dat de inzichten die we hebben opgedaan nuttig zullen zijn, zowel bij onze voortdurende zoektocht naar een behandeling voor het Rett-syndroom als in bredere zin bij onderzoek naar condensaten en ziekten.'

COMPARTMENTALISERENDE CHROMOSOMEN

Het onderzoek van de onderzoekers naar het condensaatvormende gedrag van MeCP2 werpt ook licht op hoe chromosomen zijn georganiseerd in regio's van actieve en inactieve genen. Wanneer MeCP2 normaal functioneert, helpt het om heterochromatine te behouden, de ruwweg de helft van onze chromosomen waar genen zijn 'uitgeschakeld', niet in staat zijn om in RNA te worden gelezen of verder te worden verwerkt om eiwitten te maken. MeCP2 bindt aan DNA-sequenties die zijn gemarkeerd met een bepaald type regulerende tag die typisch wordt aangetroffen in heterochromatine. Dit helpt MeCP2 naar de drempelconcentratie te brengen die nodig is om heterochromatinecondensaten te vormen. Deze condensaten helpen op hun beurt de moleculen af ​​te scheiden die nodig zijn om het gescheiden te houden van euchromatine, de helft van onze chromosomen gevuld met actieve genen. Verschillende eiwitten vormen condensaten in de buurt van euchromatine en concentreren de moleculaire machinerie die nodig is om daar actieve genen te transcriberen.

Aangezien condensaten worden gevormd wanneer eiwitten met grote spaghetti-achtige IDR's aan elkaar plakken, zou je kunnen verwachten dat elk eiwit dat IDR's bevat, zou kunnen interageren met elk ander IDR-bevattend eiwit om druppeltjes te vormen, en dat is wat de onderzoekers vaak hebben gezien. Wat ze echter hebben waargenomen met MeCP2, dat is geassocieerd met heterochromatine, is dat belangrijke condensaatvormende eiwitten geassocieerd met euchromatine weigerden te mengen.

Het is belangrijk voor de gezondheid van de cel dat de genen in heterochromatine niet per ongeluk worden aangezet. De onderzoekers redeneren dat discrete euchromatine- en heterochromatinecondensaten een sleutelrol kunnen spelen om ervoor te zorgen dat transcriptionele machinerie zich alleen naar euchromatine lokaliseert, terwijl repressieve machines, zoals MeCP2, lokaliseert naar heterochromatine. De onderzoekers zijn enthousiast om hun aandacht te richten op hoe eiwitten selectief condensaten kunnen binden, en wanneer en waar anders in de cel ze dat doen.

“Er ligt een chemische grammatica te wachten om te worden ontcijferd die dit verschil verklaart in het vermogen van sommige eiwitten om in het ene condensaat versus het andere te gaan,” Young. “Het ontdekken van die grammatica kan ons helpen begrijpen hoe cellen het cruciale evenwicht tussen de actieve en stille helft van ons genoom behouden, en het kan ons helpen te begrijpen hoe aandoeningen zoals het Rett-syndroom kunnen worden behandeld.'8221

De primaire band van Richard Young is bij het Whitehead Institute for Biomedical Research, waar zijn laboratorium is gevestigd en al zijn onderzoek wordt uitgevoerd. Hij is ook hoogleraar biologie aan het Massachusetts Institute of Technology.

Rudolf Jaenischs primaire band is met Whitehead Institute for Biomedical Research, waar zijn laboratorium is gevestigd en al zijn onderzoek wordt uitgevoerd. Hij is ook hoogleraar biologie aan het Massachusetts Institute of Technology.


AMMONIUMSULFAATTAFELS

De getoonde tabellen zijn ontleend aan Wood (1976). Tabel A.3F.2 geeft het gewicht van (NH4)2DUS4 toe te voegen aan een oplossing om de gewenste concentratie te verkrijgen. Tabel A.3F.3 geeft het volume van een 3,8 M oplossing die moet worden toegevoegd om een ​​gewenste concentratie te verkrijgen. Tabellen A.3F.4 en A.3F.5 geven de uiteindelijke volumes na toevoeging van respectievelijk het vaste zout of een 3,8 M oplossing. De concentratie van (NH4)2DUS4 wordt uitgedrukt in molariteit (overeenkomstige % verzadiging is aangegeven in tabel A.3F.2). De gegevens zijn geldig voor oplossingen bij 0ଌ en er wordt rekening gehouden met de variatie van het specifieke volume met de concentratie. Voor een tabel die verwijst naar oplossingen bij 25 ° C, zie Green en Hughes (1955).

Tabel A.3F.2

Gram ammoniumsulfaat om toe te voegen aan 1 liter oplossing bij 0ଌ

procent
verzadiging
Voorletter
molariteit
Laatste molariteit
0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.803.90
0.00.000.0026.754.081.9111140170202234267302338375413453495539585632682707
5.10.20 0.0027.054.783.0112142173205238272308344383422464507552599649673
10.30.40 0.0027.455.484.2114144176209243278314352391432475519566615639
15.40.60 0.0027.756.285.5116147179213247283321359400442486533581605
20.50.80 0.0028.157.187.0118150183217252289328368409453499546570
25.71.00 0.0028.658.188.5120153186221258296335376420465512535
30.81.20 0.0029.159.190.2122156190226264303343386430477499
35.91.40 0.0029.660.291.9125159194231270310351395441464
41.11.60 0.0030.261.493.7127162199236276317360405428
46.21.80 0.0030.762.695.7130166203242282325369391
51.32.00 0.0031.363.997.7133170208248290333355
56.52.20 0.0032.065.299.8136174213254297318
61.62.40 0.0032.766.7102139178218260281
66.82.60 0.0033.468.2104142182224244
71.92.80 0.0034.269.8107146187207
77.03.00 0.0035.071.5110150169
82.23.20 0.0035.873.2112132
87.33.40 0.0036.775.094.0
92.43.60 0.0037.656.1
97.63.80 0.0018.1
100.03.90 0.00

Tabel A.3.F.3

Milliliter van een 3,8 M ammoniumsulfaatoplossing om toe te voegen aan 1 liter oplossing bij 0ଌ

Voorletter
molariteit
Laatste molariteit
0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.40
0.000.0055.311718526335145257070987510771330165520882693360051118134
0.20 0.0058.41241972813774896217799721213152219332508337148097684
0.40 0.0061.91322113024085346838661094138717772322314045037228
0.60 0.0065.9141227327446587760975125216202135290741946768
0.80 0.0070.5152246357490652855111514621946267338846305
1.00 0.0075.916426839354573597813031756243735705837
1.20 0.0082.317929543761384011431565219932555366
1.40 0.0089.71973284927029811372195929364891
1.60 0.0098.72193695628191179171826164412
1.80 0.00110247423657984147522943931
2.00 0.00124282494789123219713447
2.20 0.0014133059398816452961
2.40 0.0016539674213192472
2.60 0.001984969911981
2.80 0.002486621489
3.00 0.00332994
3.20 0.00498
3.40 0.00

Tabel A.3.F.4

Eindvolume in millimeters na toevoeging van vast ammoniumsulfaat aan 1 liter oplossing bij 0ଌ

Voorletter
molariteit
Laatste molariteit
0.000.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.803.90
0.00100010101023103310461060107410901106112311421161118112031225124912751301132913591373
0.20 10001011102310351049106310791095111211301149116911911213123712621288131613451359
0.40 1000101210241037105210671083110011181137115711781200122312481274130113301344
0.60 100010121025103910541070108711051124114311641186120912331259128613151329
0.80 10001013102710421057107410911110112911501172119412181244127112991313
1.00 1000101410281044106010771096111511351156117912031228125412821296
1.20 100010141030104610631081110011201141116311871211123712651278
1.40 10001015103110481065108411041125114711701194122012471260
1.60 1000101610321050106810881108113011521176120212281242
1.80 100010161033105210711091111211351158118312091222
2.00 10001017103510541073109411161140116411901203
2.20 1000101810361056107610981121114511701183
2.40 100010181037105810791101112511501162
2.60 10001019103910601082110511291142
2.80 1000101910401062108511091121
3.00 100010201041106410871099
3.20 10001021104310661077
3.40 1000102210441055
3.60 100010221033
3.80 10001011
3.90 1000

Tabel A.3.F.5

Eindvolume in millimeters na toevoeging van 3,8 M ammoniumsulfaatoplossing aan 1 liter oplossing bij 0ଌ


DNA-precipitatie en niet eiwitspecifiek.. heb het nu nodig!! (26 oktober 2006 )

Ik heb een onbekend monster.. dat eiwit of DNA of iets anders kan bevatten.. het heeft een hoge absorptie van 260 & 280.. verhouding van bijna 1. Ik moet vaststellen wat het is.

Ik wil proberen te precipiteren met iets dat DNA of eiwit kan neerslaan, niet beide. De meeste alcoholen en zouten werken op beide weet ik.

Hoi
doe een fenol chloroform.
kies de bovenste fase en precipiteer met IprOH of NaAcetate/100% EtOH.

Verwijdert vervolgens voorzichtig de waterige fase op de buis1.
laten we zeggen dat je 0,5 ml fenolische fase hebt.
Voeg 0,3 ml 100% EtOH . toe
homogeniseren
Laat zitten RT 2-3'
Spin 2000g 10' 4° : dat zal de resterende nucleïnezuren pelleteren.
Aan supernatant: 0,75 ml IprOH . toevoegen
homogeniseren
laat zitten 10' RT
centrifugeren 4500g 10' 4°
vortex de pellet met 1 ml ethanol, laat 20'RT staan, draai opnieuw 4500g 10'4°.
Droog
resuspendeer eiwitten in RIPA-buffer

bedankt Fred.. ik zal dat proberen en je vertellen of het heeft geholpen :)

iemand anders weet hoe we kunnen identificeren wat het monster is.. in principe.. lemme uitwerken.

ik heb dit cellysaat (de cellen zouden een cytoplasmatisch oplosbaar recombinant eiwit-nuclease produceren). we gebruiken rp-hplc om de productie van het eiwit te verifiëren. wat ik nu zie, is dat wanneer we de fermentatieschaal voor groei en inductie veranderen. bij deze verandering.. wat we zagen was een vreemde onzuiverheid die opdook in het cellysaat. deze onzuiverheid is aanwezig vanaf de 4e voeding (wat dan ook... ik bedoel... een vroeg stadium) vóór inductie... en neemt in de loop van de tijd toe. bij inductie neemt ons eiwit aanzienlijk toe.. onzuiverheid neemt li'l toe.

de onzuiverheid geeft een piek op rp-hplc.. verhouding van 260/280 voor dit is

1. terwijl dat voor het eiwit is

tussen de bovengenoemde verschillende stadia.. fermentatiemonsters.. de sds-pagina vertoont geen groot verschil in het profiel, behalve de duidelijke toename van het eiwit van belang bij inductie.

wanneer verzameld (de piek voor de onzuiverheid) en uitgevoerd op een sds-pagina.. er is absoluut geen eiwitband. (ik heb ervoor gezorgd dat er niets mis gaat in het experiment.. zoals gel%, laden van amt enz.. zoveel als ik wil) en heb de resultaten bevestigd).


Abstract

Achtergrond

Eierstokcellen van Chinese hamsters (CHO) zijn het werkpaard voor het verkrijgen van recombinante eiwitten. Proteomische studies van deze cellen zijn bedoeld om de celbiologie te begrijpen en om productievere en robuustere cellijnen te verkrijgen voor de productie van therapeutische eiwitten in de farmaceutische industrie. Vanwege het grote belang van precipitatiemethoden voor de verwerking van monsters in proteomics, werden de protocollen voor aceton, methanol-chloroform (M/C) en trichloorazijnzuur (TCA)-aceton vergeleken voor CHO-cellen in termen van eiwitterugwinning, bandpatroon resolutie en aanwezigheid op SDS-PAGE.

Resultaten

Hoger herstel en vergelijkbaar bandprofiel met cellulaire homogenaten werden verkregen met behulp van acetonprecipitatie met ultrasone badcycli (104,18 ± 2,67%) of NaOH-toevoeging (103,12 ± 5,74%), vergeleken met de andere twee geteste protocollen. TCA-acetonneerslagen waren moeilijk op te lossen, wat een negatief effect had op het terugwinningspercentage (77,91 ± 8,79%) en bandaanwezigheid. M/C met ultrasone homogenisatie toonde een tussentijds herstel tussen de andere twee protocollen (94,22 ± 4,86%) zonder het eiwitpatroon op SDS-PAGE te beïnvloeden. Deze precipitatiemethoden beïnvloedden de terugwinning van eiwitten met een laag MW (< 15 kDa).

Conclusies

Deze resultaten helpen bij de verwerking van monsters van CHO-cellen voor hun proteomische studie door middel van een gemakkelijk toegankelijk, snel protocol, met een bijna volledig herstel van cellulaire eiwitten en het vastleggen van de oorspronkelijke complexiteit van de cellulaire samenstelling. Acetonprotocol kan op een eenvoudige manier worden opgenomen in workflows voor monstervoorbereiding en kan waarschijnlijk ook worden toegepast op andere zoogdiercellijnen.


Op immunoprecipitatie gebaseerde technieken: zuivering van endogene eiwitten met behulp van agarosekorrels

Immunoprecipitatie (IP, ook bekend als een 'pull-down'-assay) is een veelgebruikte techniek die op verschillende gebieden wordt toegepast. Het werd voor het eerst bedacht in 1984 en werd in 1988 verfijnd (1, 2). Het fundamentele doel van IP is zuivering en isolatie van een specifiek eiwit met behulp van een antilichaam tegen dat eiwit. Het woord 'immuno'34 verwijst naar het gebruik van een antilichaam, terwijl het woord 'precipitatie' verwijst naar het naar beneden halen van een specifieke stof uit een oplossing. Het doeleiwit kan endogeen of recombinant zijn. De meeste recombinante eiwitten hebben een epitoop-tag (d.w.z. myc of vlag) eraan gehecht om daaropvolgende zuivering te vereenvoudigen. Gewoonlijk is het gemakkelijker om recombinant eiwit IP te optimaliseren omdat de antilichamen tegen recombinante epitoop-tags erg sterk en effectief zijn. Antilichamen tegen endogene eiwitten hebben een extreem variabele werkzaamheid, waardoor het veel moeilijker is om deze IP's te optimaliseren. Een noodzakelijke stap na immunoprecipitatie is verificatie van de zuivering. Het geïsoleerde eiwit wordt opgelost met behulp van SDS-PAGE en vervolgens onderzocht op zuiverheid door Western-blots (Figuur 1). Een belangrijke controle is het gebruik van een ander antilichaam tijdens de Western-blot om de pull-down van het juiste eiwit te verifiëren. De combinatie van IP met daarop volgende technieken is een krachtig analyse-instrument. Het doel na zuivering kan karakterisering van het eiwit zelf zijn door NMR, massaspectrometrie en in vitro testen of analyse van de interactiepartners van het eiwit (d.w.z. eiwit, DNA, RNA) (3, 4, 5).


Figuur 1: Overzicht van immunoprecipitatieprocedure. Immunoprecipitatie is de isolatie van een specifiek eiwit met behulp van een antilichaam. Na de productie van lysaat uit cellen zijn er twee belangrijke stappen: pre-clearing en pull-down. Tijdens de pre-clearing-stap worden de cellysaten vooraf gezuiverd van eiwitten die niet-specifiek aan antilichamen binden met behulp van een isotype-controle-antilichaam. In de pull-down-stap wordt het doeleiwit naar beneden getrokken met behulp van een eiwitspecifiek antilichaam. Het geïsoleerde eiwit wordt vervolgens geanalyseerd met Western-blot. Isotype-antilichamen en eiwitspecifieke antilichamen hebben hetzelfde constante domein, maar verschillende antigeenbindende domeinen. Een belangrijk onderdeel van dit protocol is eiwit A/G agarose kralen die het constante domein van antilichamen binden, waardoor immunoprecipitatie van het doeleiwit mogelijk is. Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Antilichamen zijn de belangrijkste component van een immunoprecipitatie die het onderscheidt van andere vormen van eiwitzuivering (d.w.z. zuivering van een nikkelaffiniteitskolom). Antilichamen zijn moleculen gemaakt door B-cellen die specifieke eiwitepitopen kunnen herkennen. Antilichamen hebben twee domeinen: constant (Fc) en antigeenbinding (Fab) (Figuur 1). Het constante domein identificeert het type antilichaam en bepaalt de functie in vivo. Gewoonlijk zijn de constante domeinen van antilichamen die voor IP worden gebruikt, IgG van muizen, ratten of konijnen. Het antigeenbindende deel van het antilichaam herkent een specifiek epitoop van een specifiek eiwit. Antilichamen kunnen epitopen op gevouwen eiwitten herkennen die mogelijk niet bestaan ​​wanneer het eiwit is gedenatureerd en vice versa. Daarom hangt de beschikbaarheid van het epitoop af van eiwitvouwing - het identificeren van een belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het kiezen van antilichamen en voorwaarden voor IP.

Zowel prokaryotische als eukaryote systemen hebben antilichaambindende eiwitten. In eukaryote systemen is het doel immuunbescherming tegen bacteriën, terwijl in prokaryotische systemen het doel is bescherming tegen het immuunsysteem. Antilichaambindende eiwitten beïnvloeden IP-methodologie op twee manieren. Ten eerste is er een noodzakelijke pre-clearingstap (Figuur 1) om het lysaat te ontdoen van eiwitten die antilichamen binden - waardoor niet-specifieke binding in het eindproduct wordt verminderd. Bij deze stap wordt een isotype antilichaam gebruikt dat hetzelfde constante domein heeft als een ander antilichaambindend domein dan uw eiwitspecifieke antilichaam. Bacteriële antilichaam-bindende eiwitten zijn het tweede belangrijke onderdeel van deze methode. Nadat het eiwitspecifieke antilichaam het doeleiwit bindt, moet het antilichaam: eiwitcomplex worden afgebroken (Figuur 1). Eiwitten A, G en L zijn bacteriële eiwitten die het constante domein van antilichamen binden. Terwijl bacteriën dit gebruiken om het immuunsysteem te ondermijnen, hebben onderzoekers dit systeem gecoöpteerd voor eenvoudige antilichaamzuivering, en het wordt gebruikt tijdens zowel de pre-clearing- als de pull-down-stappen. Deze eiwitten hebben verschillende bindingsaffiniteiten voor verschillende soorten en verschillende subtypes van constant domein - een andere factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het kiezen van voorwaarden voor IP. Veel bedrijven verkopen met eiwit A/G gelabelde agaroseparels (Figuur 1), kant-en-klare spinkolommen of harsen om kolommen te maken. Over het algemeen worden kralen en spinkolommen gebruikt voor kleinere monstergroottes, terwijl harsen worden gebruikt voor bulkzuivering.

In deze laboratoriumoefening laten we zien hoe we het endogene eiwit c-myc, van primaire muizenthymocyten, kunnen zuiveren met behulp van op Protein A/G Plus agarosekorrels gebaseerde basisimmunoprecipitatietechniek. Het protocol begint bij de voorbereiding van cellysaat en eindigt met de verificatie van succesvolle eiwit pull-down met behulp van Western Blot-analyse.

Procedure

1. Immunoprecipitatie met behulp van Protein A/G PLUS Agarose Beads

Cell Lysaat Voorbereiding

  1. Centrifugeer 108 thymocyten in een microcentrifuge bij 13.000 rpm gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
    Opmerking: Het aantal cellen zal variëren afhankelijk van de expressieniveaus van het gewenste eiwit en het gekozen celtype.
  2. Resuspendeer de cellen in 500 µL lysisbuffer RIPA met PMSF.
  3. Verstoren cellen met behulp van een paar snelle pulsen met een vortex en zuig vervolgens het lysaat een paar keer op met een 25 G-naald die aan een spuit is bevestigd.
    Opmerking: Vermijd het creëren van bubbels. Gebruik een grotere naald zoals een 21G naald voor grotere celtypes.
  4. Incubeer het cellysaat op ijs gedurende 10 minuten.
  5. Centrifugeer het lysaat bij 13.000 rpm gedurende 15 minuten bij 4'176C.
  6. Breng het supernatant over naar een verse, gelabelde microcentrifugebuis.

Pre-clearing

  1. Voeg 20 µL Protein A/G PLUS agarosekorrels en 1 µg van een isotype controle-antilichaam (hier wordt muis IgG1 isotype controle-antilichaam gebruikt) toe aan het lysaat.
    Opmerking: De keuze van het gebruikte isotype antilichaam zal afhangen van het eiwitspecifieke antilichaam dat later in de pull-down-stap wordt gebruikt.
  2. Incubeer de lysaatmix op een centrifugerotator in de koude kamer (4°C) gedurende 30 minuten.
  3. Centrifugeer het monster bij 3200 rpm gedurende 30 s bij 4'176C.
  4. Breng het vooraf gewiste supernatant over naar een verse, gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 mL. Gooi de korrel weg.

Bepaling van de eiwitconcentratie

  1. Bepaal de eiwitconcentratie van het cellysaat door een Bradford-assay uit te voeren.
  2. Aliquot 1000 µL Bradford-reagens in 7 microcentrifugebuisjes.
  3. Voeg de volgende hoeveelheden BSA-eiwitstandaard (2 mg/mL) toe aan 6 van de buizen (tabel 1).

Tafel 1: BSA eiwit standaard hoeveelheden

  1. Voeg in de 7e buis 1 µL van het voorgeklaarde lysaat toe.
    Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de monsterconcentratie binnen het detectiebereik van de test ligt, bereidt en analyseert u ook een 1:2 of 1:5 lysaatverdunning.
  2. Plaats 200 µL van elk van de 7 buizen in afzonderlijke putjes van een plaat met 96 putjes met vlakke bodem en herhaal elk monster in drievoud.
  3. Lees plaat op een plaatlezer bij 595 nm.
  4. Genereer de standaardcurve in Excel en bereken de eiwitconcentratie van het vooraf gewiste lysaat.
  1. Label twee verse 1,5 ml microcentrifugebuizen-een als 'controle' en andere als 'test', wat in dit voorbeeld c-myc is.
  2. Plaats 500 µg voorgeklaard lysaat in elk van deze buizen.
    Opmerking: De hoeveelheid eiwit die hier wordt gebruikt, zal afhangen van de hoeveelheid van het te zuiveren eiwit.
  3. Breng het totale volume voor elke buis tot 500 µL met behulp van lysisbuffer.
  4. Voeg 2 µg anti-c-myc antilichaam toe aan de testgroep buis en 2 µg muis IgG1 isotype controle antilichaam aan de controlegroep.
    Opmerking: De hoeveelheid antilichaam hangt af van de werkzaamheid van het antilichaam en de hoeveelheid van het doeleiwit.
  5. Incubeer de buizen op een rotator in de koude kamer (4°C) gedurende 2 uur.
  6. Voeg 20 µL Protein A/G PLUS agaroseparels toe aan elke buis.
    Opmerking: Het is raadzaam om pipettips te gebruiken met het uiteinde afgesneden om schade aan de kralen te voorkomen.
  7. Incubeer op een rotator in een koude kamer (4°C) 's nachts.
    Opmerking: Afhankelijk van het doeleiwit en de werkzaamheid van het antilichaam, kan deze stap variëren van 1 uur tot een nacht.
  8. Centrifugeer de buizen bij 3200 rpm gedurende 30 s 4°C om de kralen naar beneden te trekken.
  9. Zuig het supernatant uit elke buis.
    Opmerking: Het doeleiwit is nu aan de bolletjes gebonden.
  10. Was de kralen twee keer met 500 µL 1X Dulbecco's PBS.
  11. Centrifugeer de buizen bij 3200 rpm gedurende 30 s 4°C.
    Opmerking: Gebruik voor strenger wassen strengere buffers, zoals RIPA.
  12. Zuig de buffer uit elke buis. Gebruik gel-laadtips om eventuele overgebleven buffer van kralen te verwijderen en houd de kralen op ijs om het eiwit te elueren.
    Opmerking: In dit voorbeeld wordt het eiwit geëlueerd in SDS-PAGE-loopbuffer door de korrels te koken voor Western-blot-analyse. Deze aanpak is geschikt voor het verifiëren van IP-resultaten of om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken. Voor andere downstream-toepassingen, zoals zuivering van eiwitten voor structurele of enzymatische analyse, worden meer geavanceerde systemen, zoals epitoop-tags (flag-tag of myc-tag) gebruikt om elutie van het antilichaam met het eiwit van belang te voorkomen.

2. IP-verificatie via Western Blot-analyse

SDS-PAGE Elektroforese:

  1. Resuspendeer kralen in 20 µL SDS-PAGE laadkleurstof die β-mercapto-ethonol bevat.
  2. Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° 176 C.
  3. Centrifugeer de kralen bij 13.000 rpm gedurende 10 s bij kamertemperatuur.
  4. Pipetteer met behulp van gellaadtips voorzichtig de monsters die uit de kralen zijn verkregen en laad ze in putjes van 4-15% gradiënt SDS-PAGE-gel.
  5. Laad naast de monsters een rijstrook met een eiwitladder en een rijstrook met het vooraf gewiste lysaat om als laadcontrole te dienen.
  6. Draai op 100 V totdat de kleurstof de onderkant van de gel bereikt (

Western Blot-analyse:

  1. Maak een Western-blot-sandwich en zorg ervoor dat het PVDF-membraan zich tussen de gel en de rode kathode bevindt.
  2. Overdracht gedurende 1 uur bij 100 V.
  3. Plaats het membraan in 5 mL blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een rocker bij een lage instelling, om de niet-specifieke eiwitbindingsplaatsen te blokkeren.
    Opmerking: De volumes blokkerende buffer, primair antilichaam, secundair antilichaam en wassingen moeten mogelijk worden verhoogd voor grotere blots.
  4. Incubeer de vlek met 5 mL anti-c-myc antilichaam in de blokkerende buffer 's nachts bij 4'176C op rocker bij een lage instelling.
    Opmerking: Het antilichaam dat hier wordt gebruikt, moet anders zijn dan het antilichaam dat wordt gebruikt in de vervolgkeuzestap.
  5. Was de vlek 3-6 keer met 5 ml TBST, waarbij elke wasbeurt 5 minuten bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar op een lage stand is.
  6. Incubeer de vlek met HRP-gelabeld anti-konijn lichte keten secundair antilichaam in blokkerende buffer, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op rocker bij een lage instelling.
    Opmerking: De keuze van secundair antilichaam zal afhangen van het primaire antilichaam dat voor de Western-blot wordt gebruikt. Bovendien wordt in het protocol een specifieke secundaire lichte keten gebruikt omdat het doeleiwit qua molecuulgewicht dicht bij de zware keten van het antilichaam ligt. Als het doeleiwit dicht bij 50 kDa ligt, gebruik dan een lichte keten specifieke secundaire. Als het doeleiwit in de buurt van 25 kDa ligt, gebruik dan en zware keten specifieke secundaire.
  7. Was de vlek 3-6 keer met 5 ml TBST, waarbij elke wasbeurt 5 minuten bij kamertemperatuur op een tuimelschakelaar op een lage stand is.
  8. Verwijder de vloeistof van de vlek en dep de rand van de vlek op laboratoriumdoekjes om overtollige vloeistof te verwijderen.
  9. Bedek blot met 1x chemiluminescent detectiereagens en incubeer gedurende 1 minuut.
    Opmerking: De volgende stappen moeten snel achter elkaar worden uitgevoerd, aangezien het detectiereagens licht- en tijdgevoelig is.
  10. Dep de rand van de vlek op laboratoriumdoekjes om overtollig detectiereagens te verwijderen.
  11. Plaats de vlek op het afbeeldingsoppervlak van de Imager-lade.
    Opmerking: Chemiluminescente vlekken kunnen ook worden gevisualiseerd met behulp van film.
  12. Afbeelding met de 'Chemiluminescent programma' om meerdere tijdstippen vast te leggen van 10 s tot 5 min.
    Opmerking: De optimale tijd kan veranderen op basis van de hoeveelheid eiwit en de kwaliteit van het antilichaam.
  13. Kies een afbeelding met optimale bandzichtbaarheid en exporteer die afbeelding.
  14. Maak voordat u de vlek verplaatst een foto van de vlek met behulp van de imager om de locatie van de ladder vast te leggen. Exporteer vervolgens die afbeelding ook.
  15. Gebruik diavoorbereidingssoftware (zoals PowerPoint) om de banden en ladderafbeeldingen uit te lijnen om een ​​enkele afbeelding te vormen.

Immunoprecipitatie, of IP, is een veelgebruikte techniek om een ​​interessant eiwit te isoleren uit een cel- of weefsellysaat of een lichaamsvloeistof voor eiwitkarakterisering of om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken.

Het proces begint met een antilichaam, dat een hoge affiniteit en specificiteit heeft voor het doeleiwit. Dit antilichaam wordt gemengd met het monster, waardoor antilichaam-doelwitcomplexen kunnen worden gevormd. Elk eiwit dat aan het doeleiwit is gebonden, wordt tijdens het proces ook indirect aan het antilichaam gehecht. Vervolgens wordt de oplossing geïncubeerd met agarosekorrels, geconjugeerd aan een bacterieel eiwit, dat een sterke affiniteit heeft voor het constante gebied van antilichamen. Het bacteriële eiwit bindt aan het antilichaam en verbindt de antilichaam-doelwitcomplexen met de bolletjes. Vervolgens wordt de oplossing gecentrifugeerd om de korrels te precipiteren, waardoor het gehele complex dat het bindende antilichaam, het doeleiwit en alle interagerende eiwitten bevat, wordt geëxtraheerd. Ten slotte worden de gebonden eiwitten uit de bolletjes gehaald en van elkaar losgemaakt en gebruikt voor verdere analyse door technieken zoals Western blotting.

Verschillende variaties van verschillende onderdelen van deze techniek worden vaak gebruikt, zoals pre-clearing, het gebruik van peptide-tags of magnetische kralen, of het analyseren van andere niet-eiwitbindende partners. IP kan worden voorafgegaan door een pre-clearing stap, om niet-specifieke antilichaam-bindende eiwitten in het monster te verwijderen en de achtergrond te minimaliseren. Dit houdt in dat het monster eerst wordt geïncubeerd met isotype-controle-antilichamen, waardoor ze aan deze eiwitten kunnen binden en vervolgens agarosekorrels gebruiken om de complexen te precipiteren. Het monster is dan klaar om door te gaan naar het eigenlijke IP.

Peptidetags zijn nuttig als een specifiek antilichaam niet beschikbaar is voor IP. Hier kan het doeleiwit genetisch worden gemodificeerd om een ​​peptide-epitooplabel te bevatten en een antilichaam tegen het label kan het gewenste eiwit eruit halen. Magnetische kralen worden vaak gebruikt in plaats van agarose om het doelwit neer te slaan. Na binding aan het antilichaam-doelwitcomplex wordt de monsterbuis in een sterk magnetisch veld geplaatst, dat de korrels uit de oplossing haalt. Dit elimineert de noodzaak voor centrifugeren en verbetert de snelheid en het gemak.

Immunoprecipitatie wordt ook gebruikt voor het bestuderen van DNA- of RNA-bindende eiwitten en staat bekend als respectievelijk chromatine-immunoprecipitatie en RNA-immunoprecipitatie. Deze variaties zijn handig voor het oplossen van problemen en het aanpassen van de methode voor verschillende experimentele toepassingen. In deze video ziet u hoe u een cellysaat vooraf kunt wissen en immunoprecipitatie kunt uitvoeren om een ​​interessant eiwit te extraheren, gevolgd door Western-blot-analyse om het experiment te valideren.

Plaats om te beginnen de vooraf verzamelde cellen in een microcentrifuge en draai gedurende drie minuten bij 13.000 rpm. Na de spin, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen vervolgens in 500 microliter lysisbuffer RIPA met PMSF. Verbreek nu de cellen met behulp van een paar snelle pulsen met een vortex en zuig het lysaat een paar keer op met een naald van 25 gauge die aan een spuit is bevestigd, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de cellen gedurende 15 minuten op ijs. Nadat de monsters op ijs zijn geïncubeerd, centrifugeert u het lysaat gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Label een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Breng na de spin het supernatant over naar de vers gelabelde buis en gooi de pellet weg. Verwijder vervolgens het lysaat vooraf van verontreinigingen die niet-specifiek binden aan ofwel de agarosekorrels of het primaire antilichaam door 20 microliter van de Protein A/G PLUS-agarosekorrels en één microgram van een isotype controle-antilichaam aan het lysaat toe te voegen, dat in dit voorbeeld is een muis IgG1 isotype controle. Incubeer de buis gedurende 30 minuten op een rotator in een koude kamer. Nadat het lysaat gedurende 30 minuten in de koude kamer is gedraaid, centrifugeert u het monster gedurende 30 seconden bij 3200 rpm bij vier graden Celsius. Verwijder de buis uit de centrifuge en breng het vooraf gewiste supernatant over naar een vers gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Gooi de korrel weg.

Bepaal nu de eiwitconcentratie van het cellysaat door een Bradford-assay uit te voeren. Label zeven microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter van één tot zes en monster en verdeel 1000 microliter van het Bradford-reagens in elke buis. Zes van de buizen zullen worden gebruikt om een ​​standaardcurve te maken door verschillende hoeveelheden bekende hoeveelheden BSA aan elke buis toe te voegen. De toe te voegen bedragen staan ​​in deze tabel. Voeg in het zevende monsterbuisje één microliter van het vooraf geklaarde lysaat toe. Plaats 200 microliter van elk van de zeven buizen in afzonderlijke putjes van een plaat met 96 putjes met vlakke bodem, waarbij elk monster in drievoud wordt herhaald, zodat er drie kolommen van zeven monsters zijn. Lees de plaat af op een plaatlezer, met een golflengte van 595 nanometer. Bereken na het maken van een standaardcurve in Excel de eiwitconcentratie van het vooraf gewiste lysaat.

Label vervolgens twee microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter - één als controle en de andere als test, die in dit voorbeeld het c-myc-antilichaam zal zijn. Plaats 500 microgram van het vooraf geklaarde lysaat in elk van deze buisjes en breng vervolgens het totale volume voor elk buisje op 500 microliter met behulp van lysisbuffer. Voeg vervolgens twee microgram van het anti-c-myc-antilichaam toe aan de testgroepbuis. Voeg voor de controle twee microgram van het muis IgG1-isotype controle-antilichaam toe. Zodra de antilichamen aan de buizen zijn toegevoegd, plaatst u de monsters op een rotator in een koude kamer en incubeer gedurende twee uur. Voeg nu de agarose-kralen toe. Om dit te doen, wordt aanbevolen om het uiteinde van een pipetpunt af te snijden en vervolgens, met behulp van deze aangepaste punt, 200 microliter Protein A/G PLUS-agaroseparels aan elke buis toe te voegen. Incubeer de buizen op een rotator in de koude kamer 's nachts.

Verwijder na de incubatie de buizen van de rotator en draai de lysaten in de microcentrifuge om de kralen naar beneden te trekken. Nadat de spin is voltooid, verwijdert u de buizen uit de centrifuge en zuigt u het supernatant uit elke buis. Was vervolgens de kralen met 500 microliter 1X Dulbecco's PBS. Plaats de buisjes in een microcentrifuge en spin gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius. Hierna verwijdert u het supernatant. Herhaal de was- en centrifugeerstappen nog een keer voor een totaal van twee keer.Verwijder de buizen uit de microcentrifuge en zuig de buffer uit elke buis. Verwijder met behulp van gellaadtips eventuele overgebleven buffer van de kralen, waarbij u de kralen op ijs houdt om het gebonden eiwit te elueren.

In dit voorbeeld wordt het eiwit geëlueerd in SDS-PAGE-loopbuffer door te koken voor Western-blot-analyse. Om dit te doen, resuspendeer de kralen in 20 microliter SDS-PAGE laadkleurstof die bèta-mercapto-ethanol of BME bevat. Kook de monsters gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius om de immunocomplexen van de kralen te scheiden. Centrifugeer vervolgens de kralen gedurende 10 seconden op maximale snelheid bij kamertemperatuur. Verwijder de buisjes uit de microcentrifuge en bewaar ze in een rek bij kamertemperatuur. Gebruik gellaadtips om de monsters voorzichtig van de kralen te pipetteren en ze in putjes van een 4 tot 15% gradiënt SDS-PAGE-gel te laden. Laad naast de monsters een rijstrook met een eiwitladder en een rijstrook met het vooraf gewiste lysaat om als laadcontrole te dienen. Zodra de gel is geladen, voert u de gel uit op 100 volt.

Nadat het kleurstoffront de bodem van de gel heeft bereikt, wat ongeveer een uur zou duren, stopt u de gel en maakt u een Western-blot-sandwich, waarbij u ervoor zorgt dat het PVDF-membraan zich tussen de gel en de kathode bevindt. Plaats de Western blot-sandwich in het overdrachtsapparaat en breng de eiwitten op de gel gedurende één uur bij 100 volt over naar het membraan. Nadat de overdracht is voltooid, plaatst u het membraan in vijf milliliter blok om te voorkomen dat de antilichamen niet-specifiek aan het membraan binden. Rock op een lage stand gedurende een uur bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeerbuffer wanneer de timer klinkt. Voeg vijf milliliter van de blokkerende buffer met het detectie-antilichaam toe aan het membraan. Hier wordt een anti-c-myc-antilichaam gebruikt, dat anders is dan het antilichaam dat wordt gebruikt voor de pull-down.

Incubeer de vlek 's nachts, bij vier graden Celsius op een rocker op een lage stand. Verwijder na de incubatie het antilichaam en de blokkeerbuffer. Was de vlek met vijf milliliter TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een schudder op een lage stand. Deze wasstap moet twee tot vijf keer worden herhaald voor een totaal van drie tot zes wasbeurten, waarbij voor elke wasbeurt verse TBST wordt gebruikt. Voeg vijf milliliter van één tot 1000 secundair antilichaam en blokkeerbuffer toe aan de vlek. In dit geval is het secundaire antilichaam HRP-gelabelde anti-konijn lichte keten. Incubeer de vlek op een rocker op een lage stand voor een uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de buffer en was de vlek met vijf milliliter TBST. Incubeer deze wash op een rocker op een lage stand gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasbeurt voor in totaal zes tot twaalf wasbeurten, elk met een verse vijf milliliter TBST. Verwijder de laatste wasbeurt door eerst de vloeistof van de vlek te gieten. Dep vervolgens met een pincet de rand van de vlek op een laboratoriumdoekje om overtollige vloeistof te verwijderen en plaats de vlek vervolgens in een nieuwe container. Bedek vervolgens de vlek met 1X chemiluminescent detectiereagens en incubeer gedurende één minuut.

Werk snel en dep de rand van de vlek op een laboratoriumdoekje om overtollig detectiereagens te verwijderen en plaats de vlek vervolgens op het beeldoppervlak van de Imager-lade. Afbeelding met behulp van het Chemiluminescent-programma om meerdere tijdstippen van 10 tot 30 seconden vast te leggen. Nadat de vlek is afgebeeld, kiest u een afbeelding met optimale bandzichtbaarheid en exporteert u die afbeelding. Voordat u de vlek verplaatst, gebruikt u de Imager om een ​​foto van de vlek te maken om de locatie van de ladder vast te leggen. Exporteer vervolgens die afbeelding ook. Ten slotte, met behulp van een dia-voorbereidingssoftware, zoals PowerPoint, lijnt u de banden en ladderafbeeldingen uit om één afbeelding te vormen.

Deze afbeelding toont het Western-blot-resultaat voor immunoprecipitatie van het eiwit c-myc uit thymocytcellen. Van links naar rechts vertegenwoordigen de banen de isotypecontrole, de c-myc IP en de vooraf gewiste lysaatinvoer. De baan uiterst rechts is een samengevoegde afbeelding van de molecuulgewichtsladder. De sterke band van ongeveer 25 kilodalton is van de lichte keten en die van 50 kilodalton is van de zware keten van het bindende antilichaam en is niet specifiek voor het IP of de monsters. C-myc heeft een waarde van ongeveer 67 kilodalton op Western-blots en is meestal zichtbaar net onder de ladderband van 75 kilodalton. In deze blot is de c-myc-band zichtbaar in de tweede baan maar afwezig in de eerste baan, wat aangeeft dat het IP-antilichaam met succes c-myc heeft verwijderd. Er is geen zichtbare band in de vooraf geklaarde lysaatbaan, wat suggereert dat dit eiwit lage endogene expressieniveaus heeft.

Abonnement vereist. Beveel JoVE aan bij uw bibliothecaris.

Resultaten

De resultaten van de hierboven beschreven procedure worden weergegeven in figuur 2. Van links naar rechts bevatten de banen de controlegroep (isotype), de testgroep (c-myc), het vooraf geklaarde lysaat (lysaat) en het molecuulgewicht ladder (ladder). De ladderbanden van 25 en 75 kDa zijn gemarkeerd. De twee prominente bands van

25 kDa en 50 kDa zijn respectievelijk de lichte en zware keten van het bindende antilichaam en zijn niet-specifiek voor het IP of de monsters. c-myc-eiwit dat op Western-blots rond 67 kDa loopt en meestal net onder de ladderband van 75 kDa zichtbaar is. In deze blot is de c-myc-band zichtbaar in de tweede baan, maar afwezig in de eerste baan, wat aangeeft dat het IP-antilichaam met succes c-myc heeft verwijderd. Er is geen zichtbare band in de vooraf geklaarde lysaatbaan, wat suggereert dat dit eiwit lage endogene expressieniveaus heeft.


Figuur 2: Resultaten van een Western Blot-analyse, gebruikt om de zuivering van c-myc door immunoprecipitatie te beoordelen. Een band van 67 kDa, overeenkomend met c-myc, is zichtbaar in de anti-c-myc-baan, maar niet in de isotype-controlebaan. Merk op dat c-myc-niveaus niet hoog genoeg waren om te worden gevisualiseerd in de lysaatbaan. Klik hier om een ​​grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Abonnement vereist. Beveel JoVE aan bij uw bibliothecaris.

Toepassingen en samenvatting

Kortom, immunoprecipitatie is de isolatie van een specifiek eiwit met behulp van een antilichaam. In dit voorbeeld werden de resultaten van de immunoprecipitatie geanalyseerd met Western-blot om de zuiverheid te bepalen. Het geïsoleerde eiwit zou daarna in een aantal toepassingen kunnen worden gebruikt, waaronder: NMR voor eiwitstructuur, massaspectrometrie voor aminozuursequentie, of in vitro testen voor enzymatische karakterisering. IP's kunnen ook de interactiepartners van eiwitten karakteriseren. Na isolatie zou bijvoorbeeld DNA of RNA kunnen worden geïsoleerd voor sequentiebepaling. Co-immunoprecipitaties beoordelen eiwit-eiwit interacties. Wanneer het doeleiwit tijdens een IP naar beneden wordt getrokken, kunnen interagerende eiwitten ook naar beneden worden getrokken. Deze op elkaar inwerkende partners kunnen worden beoordeeld met massaspectrometrie en Western-blot. Immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor het bestuderen van eiwitbiologie.

Abonnement vereist. Beveel JoVE aan bij uw bibliothecaris.

Referenties

  1. Olliver, C.L. en Boyd, C.D. (1984). Immunoprecipitatie van in vitro translatieproducten met proteïne A gebonden aan sepharose. In J.M. Walker (eds), Nucleïnezuren. Methoden in moleculaire biologie (blz. 157-160). New Jersey: Humana Press.
  2. Thurston, C.F. en Henley, L.F. (1988). Directe immunoprecipitatie van eiwit. In J.M. Walker (eds), Nieuwe eiwittechnieken.Methoden in moleculaire biologie (blz. 149-158). New Jersey: Humana Press.
  3. Anderson, N.G. (1998). Co-immunoprecipitatie: identificatie van interagerende eiwitten. In R.A. Clegg (eds), Protocollen voor eiwittargeting.Methoden in moleculaire biologie (blz. 35-45). New Jersey: Humana Press.
  4. Jackson, D.I. en Dickson, C. (1999). Eiwittechnieken: immunoprecipitatie, in vitro kinase-assays en western blotting. in PT Sharpe en I. Mason (eds), Moleculaire Embryologie. Methoden in moleculaire biologie (blz. 699-708). New Jersey: Humana Press.
  5. Trieu, E.P. en Targoff, I.N. (2015). Immunoprecipitatie: Western Blot voor eiwitten met een lage overvloed. In B. Kurien en R. Scofield (eds), Western-blotting.Methoden in moleculaire biologie (blz. 327-342). New York, NY: Humana Press.

Vertaling

Immunoprecipitatie, of IP, is een veelgebruikte techniek om een ​​interessant eiwit te isoleren uit een cel- of weefsellysaat of een lichaamsvloeistof voor eiwitkarakterisering of om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken.

Het proces begint met een antilichaam, dat een hoge affiniteit en specificiteit heeft voor het doeleiwit. Dit antilichaam wordt gemengd met het monster, waardoor antilichaam-doelwitcomplexen kunnen worden gevormd. Elk eiwit dat aan het doeleiwit is gebonden, wordt tijdens het proces ook indirect aan het antilichaam gehecht. Vervolgens wordt de oplossing geïncubeerd met agarosekorrels, geconjugeerd aan een bacterieel eiwit, dat een sterke affiniteit heeft voor het constante gebied van antilichamen. Het bacteriële eiwit bindt aan het antilichaam en verbindt de antilichaam-doelwitcomplexen met de bolletjes. Vervolgens wordt de oplossing gecentrifugeerd om de korrels te precipiteren, waardoor het gehele complex dat het bindende antilichaam, het doeleiwit en alle interagerende eiwitten bevat, wordt geëxtraheerd. Ten slotte worden de gebonden eiwitten uit de bolletjes gehaald en van elkaar losgemaakt en gebruikt voor verdere analyse door technieken zoals Western blotting.

Verschillende variaties van verschillende onderdelen van deze techniek worden vaak gebruikt, zoals pre-clearing, het gebruik van peptide-tags of magnetische kralen, of het analyseren van andere niet-eiwitbindende partners. IP kan worden voorafgegaan door een pre-clearing stap, om niet-specifieke antilichaam-bindende eiwitten in het monster te verwijderen en de achtergrond te minimaliseren. Dit houdt in dat het monster eerst wordt geïncubeerd met isotype-controle-antilichamen, waardoor ze aan deze eiwitten kunnen binden en vervolgens agarosekorrels gebruiken om de complexen te precipiteren. Het monster is dan klaar om door te gaan naar het eigenlijke IP.

Peptidetags zijn nuttig als een specifiek antilichaam niet beschikbaar is voor IP. Hier kan het doeleiwit genetisch worden gemodificeerd om een ​​peptide-epitooplabel te bevatten en een antilichaam tegen het label kan het gewenste eiwit eruit halen. Magnetische kralen worden vaak gebruikt in plaats van agarose om het doelwit neer te slaan. Na binding aan het antilichaam-doelwitcomplex wordt de monsterbuis in een sterk magnetisch veld geplaatst, dat de korrels uit de oplossing haalt. Dit elimineert de noodzaak voor centrifugeren en verbetert de snelheid en het gemak.

Immunoprecipitatie wordt ook gebruikt voor het bestuderen van DNA- of RNA-bindende eiwitten en staat bekend als respectievelijk chromatine-immunoprecipitatie en RNA-immunoprecipitatie. Deze variaties zijn handig voor het oplossen van problemen en het aanpassen van de methode voor verschillende experimentele toepassingen. In deze video ziet u hoe u een cellysaat vooraf kunt wissen en immunoprecipitatie kunt uitvoeren om een ​​interessant eiwit te extraheren, gevolgd door Western-blot-analyse om het experiment te valideren.

Plaats om te beginnen de vooraf verzamelde cellen in een microcentrifuge en draai gedurende drie minuten bij 13.000 rpm. Na de spin, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen vervolgens in 500 microliter lysisbuffer RIPA met PMSF. Verbreek nu de cellen met behulp van een paar snelle pulsen met een vortex en zuig het lysaat een paar keer op met een naald van 25 gauge die aan een spuit is bevestigd, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de cellen gedurende 15 minuten op ijs. Nadat de monsters op ijs zijn geïncubeerd, centrifugeert u het lysaat gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Label een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Breng na de spin het supernatant over naar de vers gelabelde buis en gooi de pellet weg. Verwijder vervolgens het lysaat vooraf van verontreinigingen die niet-specifiek binden aan ofwel de agarosekorrels of het primaire antilichaam door 20 microliter van de Protein A/G PLUS-agarosekorrels en één microgram van een isotype controle-antilichaam aan het lysaat toe te voegen, dat in dit voorbeeld is een muis IgG1 isotype controle. Incubeer de buis gedurende 30 minuten op een rotator in een koude kamer. Nadat het lysaat gedurende 30 minuten in de koude kamer is gedraaid, centrifugeert u het monster gedurende 30 seconden bij 3200 rpm bij vier graden Celsius. Verwijder de buis uit de centrifuge en breng het vooraf gewiste supernatant over naar een vers gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Gooi de korrel weg.

Bepaal nu de eiwitconcentratie van het cellysaat door een Bradford-assay uit te voeren. Label zeven microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter van één tot zes en monster en verdeel 1000 microliter van het Bradford-reagens in elke buis. Zes van de buizen zullen worden gebruikt om een ​​standaardcurve te maken door verschillende hoeveelheden bekende hoeveelheden BSA aan elke buis toe te voegen. De toe te voegen bedragen staan ​​in deze tabel. Voeg in het zevende monsterbuisje één microliter van het vooraf geklaarde lysaat toe. Plaats 200 microliter van elk van de zeven buizen in afzonderlijke putjes van een plaat met 96 putjes met vlakke bodem, waarbij elk monster in drievoud wordt herhaald, zodat er drie kolommen van zeven monsters zijn. Lees de plaat af op een plaatlezer, met een golflengte van 595 nanometer. Bereken na het maken van een standaardcurve in Excel de eiwitconcentratie van het vooraf gewiste lysaat.

Label vervolgens twee microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter - één als controle en de andere als test, die in dit voorbeeld het c-myc-antilichaam zal zijn. Plaats 500 microgram van het vooraf geklaarde lysaat in elk van deze buisjes en breng vervolgens het totale volume voor elk buisje op 500 microliter met behulp van lysisbuffer. Voeg vervolgens twee microgram van het anti-c-myc-antilichaam toe aan de testgroepbuis. Voeg voor de controle twee microgram van het muis IgG1-isotype controle-antilichaam toe. Zodra de antilichamen aan de buizen zijn toegevoegd, plaatst u de monsters op een rotator in een koude kamer en incubeer gedurende twee uur. Voeg nu de agarose-kralen toe. Om dit te doen, wordt aanbevolen om het uiteinde van een pipetpunt af te snijden en vervolgens, met behulp van deze aangepaste punt, 200 microliter Protein A/G PLUS-agaroseparels aan elke buis toe te voegen. Incubeer de buizen op een rotator in de koude kamer 's nachts.

Verwijder na de incubatie de buizen van de rotator en draai de lysaten in de microcentrifuge om de kralen naar beneden te trekken. Nadat de spin is voltooid, verwijdert u de buizen uit de centrifuge en zuigt u het supernatant uit elke buis. Was vervolgens de kralen met 500 microliter 1X Dulbecco's PBS. Plaats de buisjes in een microcentrifuge en spin gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius. Hierna verwijdert u het supernatant. Herhaal de was- en centrifugeerstappen nog een keer voor een totaal van twee keer. Verwijder de buizen uit de microcentrifuge en zuig de buffer uit elke buis. Verwijder met behulp van gellaadtips eventuele overgebleven buffer van de kralen, waarbij u de kralen op ijs houdt om het gebonden eiwit te elueren.

In dit voorbeeld wordt het eiwit geëlueerd in SDS-PAGE-loopbuffer door te koken voor Western-blot-analyse. Om dit te doen, resuspendeer de kralen in 20 microliter SDS-PAGE laadkleurstof die bèta-mercapto-ethanol of BME bevat. Kook de monsters gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius om de immunocomplexen van de kralen te scheiden. Centrifugeer vervolgens de kralen gedurende 10 seconden op maximale snelheid bij kamertemperatuur. Verwijder de buisjes uit de microcentrifuge en bewaar ze in een rek bij kamertemperatuur. Gebruik gellaadtips om de monsters voorzichtig van de kralen te pipetteren en ze in putjes van een 4 tot 15% gradiënt SDS-PAGE-gel te laden. Laad naast de monsters een rijstrook met een eiwitladder en een rijstrook met het vooraf gewiste lysaat om als laadcontrole te dienen. Zodra de gel is geladen, voert u de gel uit op 100 volt.

Nadat het kleurstoffront de bodem van de gel heeft bereikt, wat ongeveer een uur zou duren, stopt u de gel en maakt u een Western-blot-sandwich, waarbij u ervoor zorgt dat het PVDF-membraan zich tussen de gel en de kathode bevindt. Plaats de Western blot-sandwich in het overdrachtsapparaat en breng de eiwitten op de gel gedurende één uur bij 100 volt over naar het membraan. Nadat de overdracht is voltooid, plaatst u het membraan in vijf milliliter blok om te voorkomen dat de antilichamen niet-specifiek aan het membraan binden. Rock op een lage stand gedurende een uur bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeerbuffer wanneer de timer klinkt. Voeg vijf milliliter van de blokkerende buffer met het detectie-antilichaam toe aan het membraan. Hier wordt een anti-c-myc-antilichaam gebruikt, dat anders is dan het antilichaam dat wordt gebruikt voor de pull-down.

Incubeer de vlek 's nachts, bij vier graden Celsius op een rocker op een lage stand. Verwijder na de incubatie het antilichaam en de blokkeerbuffer. Was de vlek met vijf milliliter TBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een schudder op een lage stand. Deze wasstap moet twee tot vijf keer worden herhaald voor een totaal van drie tot zes wasbeurten, waarbij voor elke wasbeurt verse TBST wordt gebruikt. Voeg vijf milliliter van één tot 1000 secundair antilichaam en blokkeerbuffer toe aan de vlek. In dit geval is het secundaire antilichaam HRP-gelabelde anti-konijn lichte keten. Incubeer de vlek op een rocker op een lage stand voor een uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de buffer en was de vlek met vijf milliliter TBST. Incubeer deze wash op een rocker op een lage stand gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasbeurt voor in totaal zes tot twaalf wasbeurten, elk met een verse vijf milliliter TBST. Verwijder de laatste wasbeurt door eerst de vloeistof van de vlek te gieten. Dep vervolgens met een pincet de rand van de vlek op een laboratoriumdoekje om overtollige vloeistof te verwijderen en plaats de vlek vervolgens in een nieuwe container. Bedek vervolgens de vlek met 1X chemiluminescent detectiereagens en incubeer gedurende één minuut.

Werk snel en dep de rand van de vlek op een laboratoriumdoekje om overtollig detectiereagens te verwijderen en plaats de vlek vervolgens op het beeldoppervlak van de Imager-lade. Afbeelding met behulp van het Chemiluminescent-programma om meerdere tijdstippen van 10 tot 30 seconden vast te leggen. Nadat de vlek is afgebeeld, kiest u een afbeelding met optimale bandzichtbaarheid en exporteert u die afbeelding. Voordat u de vlek verplaatst, gebruikt u de Imager om een ​​foto van de vlek te maken om de locatie van de ladder vast te leggen. Exporteer vervolgens die afbeelding ook. Ten slotte, met behulp van een dia-voorbereidingssoftware, zoals PowerPoint, lijnt u de banden en ladderafbeeldingen uit om één afbeelding te vormen.

Deze afbeelding toont het Western-blot-resultaat voor immunoprecipitatie van het eiwit c-myc uit thymocytcellen. Van links naar rechts vertegenwoordigen de banen de isotypecontrole, de c-myc IP en de vooraf gewiste lysaatinvoer. De baan uiterst rechts is een samengevoegde afbeelding van de molecuulgewichtsladder. De sterke band van ongeveer 25 kilodalton is van de lichte keten en die van 50 kilodalton is van de zware keten van het bindende antilichaam en is niet specifiek voor het IP of de monsters. C-myc heeft een waarde van ongeveer 67 kilodalton op Western-blots en is meestal zichtbaar net onder de ladderband van 75 kilodalton. In deze blot is de c-myc-band zichtbaar in de tweede baan maar afwezig in de eerste baan, wat aangeeft dat het IP-antilichaam met succes c-myc heeft verwijderd. Er is geen zichtbare band in de vooraf geklaarde lysaatbaan, wat suggereert dat dit eiwit lage endogene expressieniveaus heeft.


Hoe eiwitneerslag te voorkomen? - Biologie

Immunoprecipitatie (IP) is de techniek om een ​​eiwitantigeen uit de oplossing te precipiteren met behulp van een antilichaam dat specifiek aan dat specifieke eiwit bindt. Dit proces kan worden gebruikt om een ​​bepaald eiwit te isoleren en te concentreren uit een monster dat er veel bevat.
Volledig artikel >>>

immunoprecipitatie Neerslag als gevolg van interactie van antilichaam en oplosbaar antigeen. . Immunoprecipitatie (IP) is de techniek van het neerslaan van een .
Volledig artikel >>>

Immunoprecipitatie omvat de interactie tussen een eiwit en zijn specifieke. Daarnaast kan men gebruik maken van immunoprecipitatie om de identiteit of het onderzoek te bevestigen.
Volledig artikel >>>

Protocollen voor immunoprecipitatie, ip en mede-immunoprecipitatie, co-ip. Pull-down-test. . Bovendien is de immunoprecipitatie procedure maakt het ook mogelijk de .
Volledig artikel >>>

Immunoprecipitatie is een procedure waarmee peptiden of eiwitten die reageren. Figuur 1. Schematische weergave van het principe van immunoprecipitatie. .
Volledig artikel >>>

Verse DTT moet gedurende de hele periode aanwezig zijn immunoprecipitatie. . Wanneer de achtergrond in een immunoprecipitatie hoog is, vinden sommige mensen het leuk om pre .
Volledig artikel >>>

Immunoprecipitatie en antilichaam-antigeenprecipitatie - Succes in een . Vangen en loslaten omkeerbaar Immunoprecipitatie systeem. Proteïne G Agarose Snelle stroom.
Volledig artikel >>>

Methoden, protocollen, technieken, tutorials en andere informatie voor biomedische studenten en onderzoekers van het Laboratorium van Prof. Pamela Stanley aan de Albert.
Volledig artikel >>>

Immunoprecipitatie Protocol / (Voor Native Protein) Dit protocol is bedoeld voor: immunoprecipitatie van inheemse eiwitten voor . C. Immunoprecipitatie .
Volledig artikel >>>

Immunoprecipitatie Protocol / (Voor analyse door Western Immunoblotting) A. . C. Immunoprecipitatie . Ga verder naar stap 1 van Immunoprecipitatie. .
Volledig artikel >>>

chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een experimentele methode die wordt gebruikt om te bepalen. Figuur 10. Overzicht van chromatine immunoprecipitatie antistoffen gebruiken. .
Volledig artikel >>>

Cross-linking en Immunoprecipitatie (CLIP) (Laboratorium van . Immunoprecipitatie Protocol. biedt een algemene richtlijn voor immunoprecipitatie. .
Volledig artikel >>>

chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtig hulpmiddel voor het analyseren van DNA. Undershearing van DNA zal resulteren in inefficiënte immunoprecipitatie. .
Volledig artikel >>>

chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) testen. siRNA-gemedieerde remming van . Met fosfo verrijkte weefselextracten voor Western Blotting en Immunoprecipitatie .
Volledig artikel >>>

Immunoassay Wikipedia - Immunoprecipitatie (IP) - GenWay Biotech Inc. Co-Immunoprecipitatie (Co-IP) is een krachtige methode die wordt gebruikt om eiwit/eiwit te bestuderen.
Volledig artikel >>>

Immunoprecipitatie Protocol. VORMEN EN ZUIVEREN VAN HET IMMUUNCOMPLEX: . 1. Ook beschikbaar: Immunoprecipitatie. Gids voor probleemoplossing .
Volledig artikel >>>

chromatine immunoprecipitatie, of ChIP, verwijst naar een procedure die wordt gebruikt om te bepalen. protocol van de chromatine immunoprecipitatie procedure staat op onze .
Volledig artikel >>>


Eiwitten - en laboratoria - komen samen om het Rett-syndroom te voorkomen

Nieuwe ontdekkingen over de verstoring van condensaten bij de neurologische ontwikkelingsstoornis Rett-syndroom bieden inzicht in hoe cellen chromosomen in compartimenten verdelen, evenals nieuwe potentiële paden voor therapieën.

Wetenschappers hebben de cel jarenlang geconceptualiseerd als een relatief vrij stromende ruimte, waar - afgezien van de organisatie die wordt geboden door specifieke cellulaire structuren - moleculen vrij rondzweven en op de een of andere manier uiteindelijk op de juiste plaats op het juiste moment terechtkomen. In de afgelopen jaren hebben wetenschappers echter ontdekt dat cellen een veel ruimtelijkere organisatie hebben dan eerder werd gedacht, dankzij een mechanisme genaamd fasescheiding, dat optreedt in cellen wanneer bepaalde moleculen grote druppelachtige structuren vormen die scheiden wat zich in de druppel bevindt van de rest van de cel. De druppeltjes, condensaten genaamd, helpen moleculen op specifieke locaties vast te houden en te concentreren, en lijken de efficiëntie van bepaalde cellulaire functies te verhogen.

Whitehead Institute-lid en MIT-professor biologie Richard Young heeft de voorheen onbekende rol onderzocht die condensaten spelen bij het verzamelen van de moleculen die nodig zijn voor gentranscriptie - het proces waarbij DNA in RNA wordt gelezen. Om beter te begrijpen wanneer en hoe cellen fasescheiding gebruiken, ging Charles Li, een afgestudeerde student in het lab van Young, op zoek naar meer eiwitten die condensaten kunnen vormen. Die zoektocht leidde hem naar MeCP2, een eiwit dat verband houdt met de ernstige neurologische ontwikkelingsstoornis Rett-syndroom, bestudeerd door Young's collega, oprichter van het Whitehead Institute, Rudolf Jaenisch, die ook hoogleraar biologie is aan het MIT. Er bestaat momenteel geen remedie voor het Rett-syndroom en het laboratorium van Jaenisch heeft de biologie van de aandoening onderzocht in de hoop een medische therapie te vinden die neuronen kan redden die zijn aangetast door het Rett-syndroom.

Met de ontdekking van het condensaatvormende vermogen van MeCP2 zagen Young en Jaenisch de kans voor een veelbelovende samenwerking tussen hun laboratoria. Onder leiding van co-eerste auteurs Li en Eliot Coffey, een andere afgestudeerde student in Young's lab, onderzochten de twee laboratoria MeCP2 en of de verstoring van het condensaatvormende vermogen bijdraagt ​​aan het Rett-syndroom. Tijdens deze onderzoeken ontdekten de onderzoekers ook hoe cellen condensaten kunnen gebruiken om de actieve en inactieve delen van chromosomen te helpen organiseren. Hun bevindingen, gepubliceerd in het tijdschrift Natuur op 22 juni verslag uitbrengen over deze inzichten en nieuwe wegen voorstellen voor het ontwikkelen van therapieën voor het Rett-syndroom.

Fasescheiding en Rett-syndroom

Eiwitten die condensaten vormen, bevatten vaak intrinsiek ongeordende regio's (IDR's), lange spaghetti-achtige strengen die tijdelijk aan elkaar plakken om een ​​dynamisch netwerk te vormen. Onderzoek heeft zich van oudsher gericht op de gestructureerde regio's van eiwitten, die zeer specifiek binden aan andere moleculen, terwijl IDR's grotendeels over het hoofd zijn gezien. In dit geval waren de grote IDR's van MeCP2 precies wat Li aantrok.

"Wat me opviel, was dat dit eiwit al tientallen jaren wordt bestudeerd en dat er zoveel functie is toegeschreven aan het eiwit als geheel, maar dat het maar één gestructureerd domein heeft met een erkende functie, het DNA-bindende domein. het hele eiwit is ontregeld en hoe de onderdelen functioneren was grotendeels onbekend", zegt Li.

De onderzoekers ontdekten dat MeCP2 zijn IDR's gebruikte om samen te smelten en condensaten te vormen. Daarna testten ze veel van de mutaties in het MECP2-gen die geassocieerd zijn met het Rett-syndroom en ontdekten dat ze allemaal het vermogen van MeCP2 om condensaten te vormen verstoren. Hun bevindingen suggereren dat therapieën die gericht zijn op condensaten die verband houden met het eiwit, in plaats van het eiwit zelf, veelbelovend kunnen zijn in de jacht op een behandeling van het Rett-syndroom.

"MeCP2 en het Rett-syndroom zijn jarenlang intensief bestudeerd in veel laboratoria, en toch is er geen enkele therapie ontwikkeld. Toen het project begon, was ik meteen gefascineerd door het idee dat we een nieuw ziektemechanisme zouden kunnen vinden dat ons zou kunnen helpen eindelijk begrijpen hoe het Rett-syndroom ontstaat en hoe het kan worden behandeld, "zegt Coffey.

"Rick [Young] heeft aangetoond dat condensaten een sleutelrol spelen bij het in stand houden van de normale cellulaire functie, en onze nieuwste samenwerking laat zien hoe hun verstoring ziekten zoals het Rett-syndroom kan veroorzaken", zegt Jaenisch. "Ik hoop dat de inzichten die we hebben opgedaan nuttig zullen zijn, zowel in onze voortdurende zoektocht naar een behandeling voor het Rett-syndroom als, meer in het algemeen, in onderzoek naar condensaten en ziekten."

Compartimentering van chromosomen

Het onderzoek van de onderzoekers naar het condensaatvormende gedrag van MeCP2 werpt ook licht op hoe chromosomen zijn georganiseerd in regio's van actieve en inactieve genen. Wanneer MeCP2 normaal functioneert, helpt het om heterochromatine te behouden, de ongeveer de helft van onze chromosomen waar genen zijn "uitgeschakeld", niet in staat om in RNA te worden gelezen of verder te worden verwerkt om eiwitten te maken. MeCP2 bindt aan DNA-sequenties die zijn gemarkeerd met een bepaald type regulerende tag die typisch wordt aangetroffen in heterochromatine. Dit helpt MeCP2 naar de drempelconcentratie te brengen die nodig is om heterochromatinecondensaten te vormen. Deze condensaten helpen op hun beurt de moleculen af ​​te scheiden die nodig zijn om het gescheiden te houden van euchromatine, de helft van onze chromosomen gevuld met actieve genen. Verschillende eiwitten vormen condensaten in de buurt van euchromatine en concentreren de moleculaire machinerie die nodig is om daar actieve genen te transcriberen.

Aangezien condensaten worden gevormd wanneer eiwitten met grote spaghetti-achtige IDR's aan elkaar plakken, zou je kunnen verwachten dat elk eiwit dat IDR's bevat, zou kunnen interageren met elk ander IDR-bevattend eiwit om druppeltjes te vormen, en dat is wat de onderzoekers vaak hebben gezien. Wat ze echter hebben waargenomen met MeCP2, dat is geassocieerd met heterochromatine, is dat belangrijke condensaatvormende eiwitten geassocieerd met euchromatine weigerden te mengen.

Het is belangrijk voor de gezondheid van de cel dat de genen in heterochromatine niet per ongeluk worden aangezet. De onderzoekers redeneren dat discrete euchromatine- en heterochromatinecondensaten een sleutelrol kunnen spelen om ervoor te zorgen dat transcriptionele machines zich alleen naar euchromatine lokaliseren, terwijl repressieve machines - zoals MeCP2 - lokaliseren naar heterochromatine. De onderzoekers zijn enthousiast om hun aandacht te richten op hoe eiwitten selectief condensaten kunnen binden, en wanneer en waar anders in de cel ze dat doen.

"Er wacht een chemische grammatica om te worden ontcijferd die dit verschil in het vermogen van sommige eiwitten om in het ene condensaat versus het andere te verplaatsen, verklaart", zegt Young. "Het ontdekken van die grammatica kan ons helpen begrijpen hoe cellen de cruciale balans tussen de actieve en stille helft van ons genoom behouden, en het zou ons kunnen helpen begrijpen hoe aandoeningen zoals het Rett-syndroom kunnen worden behandeld."