Informatie

Ammoniumsulfaatprecipitatietest pH-afhankelijkheid


In het algemeen heeft de pH invloed op de precipitatie, b.v. zou een pH van 6 minder neerslag veroorzaken dan pH 7,5. Of zijn ze niet verwant?


Ik denk dat het sommige eiwitten zou aantasten, maar ammoniumsulfaatprecipitatie vereist meestal zulke grote hoeveelheden zout, dat je een kavel van base om de pH aan te passen.

Als ik ammoniumsulfaatprecipitatie heb gedaan, is het om een ​​ruwe snede van eiwitten uit een hele cel / heel orgaanlysaat te halen - het lijkt meer op een hamer dan op een pincet wat betreft eiwitzuivering. Ik zou liever een geladen plastic hars of een maatkolom gebruiken als ik me zorgen zou maken over de iso-elektrische zuivering.


Ammoniumsulfaatprecipitatie van recombinant adenovirus uit kweekmedium: een gemakkelijke methode om de totale virusopbrengst te verhogen

Bij de meeste methoden voor het zuiveren en concentreren van recombinante adenovirussen (rAds) wordt het virus dat met de helpercellen is geassocieerd, geoogst, terwijl het virus dat in het celkweekmedium aanwezig is, wordt weggegooid. Tijdens routinematige vermeerdering van adenovirus type-5 vectoren onder geoptimaliseerde omstandigheden merkten we op dat gemiddeld 47% van de totale hoeveelheid virus in het kweekmedium aanwezig is. Om deze rAds uit het medium terug te winnen en te concentreren, hebben we een methode bedacht die is gebaseerd op ammoniumsulfaat ((NH4)2DUS4) neerslag. Bij 40% (NH4)2DUS4 verzadiging slaat 95 ± 6% van het beschikbare virus neer uit het medium, terwijl het grootste deel van het eiwit (85%) in oplossing blijft. In tegenstelling tot adenovirusprecipitatie met polyethyleenglycol, is de (NH4)2DUS4precipitatietechniek maakt het mogelijk om geprecipiteerde rAds door filtratie te verzamelen. We laten hier zien dat (NH4)2DUS4 precipitatie van rAds uit celkweekmedium is een eenvoudige en snelle techniek die kan worden gebruikt in combinatie met standaard virusisolatiemethoden om de opbrengst van rAds te verhogen.

Zo'n 30 jaar geleden beschreven Winters en Russell1 een methode voor de zuivering van adenovirus die nog steeds veel wordt gebruikt. Het maakt gebruik van cesiumchloride (CsCl) dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie van de cel-geassocieerde adenovirusdeeltjes. Hoewel zuivere adenovirusbatches met een hoge titer kunnen worden verkregen, is de methode tijdrovend en moeilijk op te schalen. Met de komst van gentherapie zijn procedures voor grootschalige productie en zuivering van recombinant adenovirus noodzakelijk geworden.2 Wijzigingen van het oorspronkelijke protocol die hebben geleid tot vermindering van de totale voorbereidingstijd maken gebruik van CsCl-stapgradiënten in plaats van een hoge CsCl-dichtheid gradiënten3 of gewijzigde CsCl-gradiënten voor sucrosegradiënten.45 In latere studies werd kolomchromatografie op basis van grootte-uitsluiting, anionuitwisseling, hydrofobe interactie of metaalchelerende harsen toegepast.67 Gezien de volumebeperkingen van ultracentrifugatie, richtten de zuiveringsprotocollen zich op het adenovirus geassocieerd met de gastheercellen. Een significante hoeveelheid virus is echter niet geassocieerd met cellen, maar wordt gevonden in het kweekmedium. Analyses in onze Viral-Vector Facility in het LUMC lieten zien dat significante hoeveelheden (25-80%) van adenovirusvectoren aanwezig zijn in het celkweekmedium (Tabel 1), zelfs onder optimale productieomstandigheden. Hoewel de hoeveelheid virus in het medium varieert, is gemiddeld 47% (N = 19) van het virus wordt weggegooid als alleen de cel-geassocieerde fractie wordt geïsoleerd. Dit suggereert dat in feite vaak een lucratief deel van de totale opbrengst wordt verspild.

Om het virus uit het medium te concentreren, kan het worden geprecipiteerd met polyethyleenglycol 6000 (PEG-6000).89 In dat geval moet het virusprecipitaat echter worden opgevangen door centrifugeren. Daarom zochten we een methode waarmee het virus uit het medium kan worden teruggewonnen door filtratie, om de centrifugatie van relatief grote volumes medium te omzeilen. In dit rapport hebben we het gebruik van ammoniumsulfaat ((NH4)2DUS4) neerslag.1011 Bij de eerste poging is een bereik van 0–100% (NH4)2DUS4 verzadiging, met incrementele stappen van 10%, werd getest om Ad5CMVLuc, een recombinant adenovirus dat het luciferase-gen draagt, uit het kweekmedium te precipiteren. Bij concentraties tot 30% verzadiging bleef het virus in het medium, maar bij 40% verzadiging of hoger sloeg het virus vrijwel volledig neer (gegevens niet getoond). Om de omstandigheden te optimaliseren, werden verzadigingswaarden rond het 40%-punt getest. Kweekmedium was verzadigd over een verzadigingsbereik van 30-42% met stappen van 2%. De aanwezigheid van intact Ad5CMVLuc in de verschillende fracties werd beoordeeld via het expressieniveau van het luciferase-reportergen (Figuur 1). Adenovirusprecipitatie begon bij 36% (NH4)2DUS4 verzadiging en was compleet bij 40% verzadiging, met een relatieve luciferase-activiteit van 130%. Over dit verzadigingsbereik daalde de luciferase-activiteit die werd verkregen uit het resterende virus in het medium tot 11%. Opmerkelijk is dat de schijnbare terugwinning hoger is dan het verwachte maximum en kan worden verklaard door zuivering van de virusvoorraad. Soortgelijke waarnemingen zijn gemeld tijdens de isolatie van adenovirus uit cellysaten3 en de isolatie van retrovirus uit medium.12 In deze onderzoeken werd de verhoogde activiteit toegeschreven aan de verwijdering van remmers van virale infectie. Echter, de adenovirusbatches die neergeslagen waren bij 40% (NH4)2DUS4 verzadiging had een OD260/280-verhouding van 0,6 (gegevens niet getoond). In vergelijking met de verhouding van 1,2-1,3 voor pure adenovirus-batches7 duidt dit op de aanwezigheid van significante hoeveelheden eiwit.

Luciferase-activiteit als indicator voor de hoeveelheid geprecipiteerd Ad5CMVLuc uit kweekmedium bij een 30-42% (NH4)2DUS4 verzadiging. Een reeks van 4,4-6,4 g (NH4)2DUS4 (gekocht bij JT Baker, Deventer, Nederland) werd toegevoegd aan 25 ml kweekmedium om een ​​verzadiging van 30-42% te bereiken.11 De oplossing werd gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens werd het neerslag gesedimenteerd door 15 centrifugatie. min bij 1614 g. De pellet werd opgelost in 1 ml PBS dat 2% paardenserum bevatte. Overnacht dialyse van supernatant en opgeloste precipitaatmonsters werd uitgevoerd in 1 x TD-buffer (25 m M Tris, 137 m M NaCl, 5 m M KCl, 0,73 m M Na2HPO4, 0,9 m M CaCl2, 0,5 m M MgCl2 pH 7,45). Deze monsters werden gebruikt om HepG2-cellen te infecteren, die 48 uur na infectie werden gelyseerd en geanalyseerd op luciferase-activiteit, zoals eerder beschreven.9 De luciferase-activiteit werd omgezet in het totale monster en weergegeven als percentage van de luciferase-activiteit gevonden in 25 ml Ad5CMVLuc met kweek medium. Zwarte balken vertegenwoordigen de Ad5CMVLuc-fractie die in het precipitaat wordt gevonden, grijze balken de fractie in het supernatant.

Om meer inzicht te krijgen in de zuiveringscapaciteit van deze methode, bepaalden we de hoeveelheden eiwit, die werden neergeslagen uit kweekmedium met 10% FCS over een verzadigingsbereik van 0 tot 80% (NH4)2DUS4. Zoals weergegeven in figuur 2, werd bij 40% verzadiging 15% van het beschikbare eiwit geprecipiteerd. In wezen identieke resultaten werden verkregen met medium van met virus geïnfecteerde cellen. Dus onder deze omstandigheden wordt het grootste deel van de eiwitten die in het medium aanwezig zijn, gescheiden van het virus.

Eiwitfracties geprecipiteerd uit kweekmedium bij verschillende (NH4)2DUS4 concentraties. Monsters van 25 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS) werden verzadigd tot de aangegeven percentages: 10%: 1,4 g, 20%: 2,9 g, 30%: 4,4 g, 38%: 5,7 g , 40%: 6,1 g, 42%: 6,4 g, 50%: 7,8 g, 60%: 9,8 g, 70%: 11,8 g, 80%: 14 g (NH4)2DUS4.11 Na 2,5 uur incubatie bij kamertemperatuur werd het neerslag gesedimenteerd door centrifugeren (15 min bij 1614 g). De pellet werd opgelost in PBS en vervolgens werd de geïsoleerde hoeveelheid eiwit bepaald via de Bradford-eiwitassay. De totale hoeveelheid eiwit die in een monster van 25 ml aanwezig is, wordt als 100% beschouwd.

Bij grootschalige producties, waarbij meerdere liters virushoudend medium betrokken zijn, vormt de centrifugatiestap een beperking in de normale laboratoriumopstellingen. Filtratie kan een praktisch alternatief zijn voor de isolatie van het rAd-precipitaat uit grote middelgrote volumes. Daarom vergeleken we het herstel van (NH4)2DUS4- en PEG-6000-geprecipiteerd adenovirus na isolatie door centrifugatie of filtratie. Ad5CMVLacZ werd neergeslagen met 40% (NH4)2DUS4 verzadiging of 10% PEG-6000 en het resulterende precipitaat werd uit het medium geklaard door centrifugeren, door filtratie over een 0,45 m membraanfilter, of door filtratie over een Whatman 3MM filterpapier. Zoals weergegeven in figuur 3a, kon het beschikbare virus vrijwel volledig worden neergeslagen met (NH4)2DUS4. Een terugwinning van 90% werd verkregen wanneer het neerslag door centrifugeren werd gesedimenteerd. De terugwinning uit het PEG-6000-precipitaat door centrifugatie was slechts iets minder (84% terugwinning). Filtratie onthulde echter een meer uitgesproken verschil tussen de twee precipitatiemethoden. Het PEG-6000-precipitaat passeerde vrijwel ongehinderd de filters: het residu maakte slechts 3-4% van de startopbrengst uit. Echter, de (NH4)2DUS4 precipitaat werd met hoge efficiëntie op het filter vastgehouden. Hoewel de opbrengst van het residu lager was dan de opbrengst verkregen na centrifugeren, was de terugwinning nog steeds 46% en 61% van het uitgangsmateriaal, in het geval van respectievelijk het 3MM-filter en het 0,45 m-filter. De lagere terugwinning uit het medium door filtratie in vergelijking met centrifugatie wordt niet gecompenseerd door een toename van achtergebleven virus in het filtraat. Dit zou erop kunnen wijzen dat het verlies niet kan worden toegeschreven aan een onvoldoende filterafsluiting, maar eerder aan een suboptimaal virusherstel uit het filter.

Terugwinning en opbrengst van rAd geprecipiteerd uit kweekmedium. (a) Herstelefficiëntie van Ad5CMVLacZ geprecipiteerd uit kweekmedium door (NH4)2DUS4 of PEG-6000 en geïsoleerd door centrifugatie of filtratie. 6,1 g (NH4)2DUS4 werd opgelost in 25 ml kweekmedium. Na een incubatie van 2,5 uur bij kamertemperatuur werd het precipitaat uit het mengsel gesedimenteerd door een centrifugatiestap van 15 minuten bij 1614 g, of door vacuümfiltratie met behulp van een membraanfilter van 0,45 m (Schleicher & Schuell, Dassel, Duitsland), of een 3MM papieren filter (Whatman International Ltd, Maidstone, VK). PEG-precipitatie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven met kleine wijzigingen. In het kort werd 25 ml van een 20% (w/v) PEG-6000 (BDH, Poole, VK) in 2,5 M NaCl-oplossing gemengd met 25 ml kweekmedium. Na een incubatie van 3 uur bij 4 ° C werd het neerslag gesedimenteerd door een centrifugatiestap van 15 minuten bij 16300 g of door vacuümfiltratie met behulp van een membraanfilter van 0,45 m of een filter van 3 MM. De residu- of pelletmonsters werden opgelost in 2 ml PBS met 2% HS. Alle monsters werden gedialyseerd en vervolgens werden hun titers bepaald door middel van plaque-assay op 911-cellen. Om de terugwinning te berekenen, werden de opbrengsten gerelateerd aan de hoeveelheid adenovirus die aanwezig was in 25 ml van het oorspronkelijke medium. Zwarte balken vertegenwoordigen de virale fractie in het residu of pellet grijze balken vertegenwoordigen de virale fractie die zich in het filtraat of supernatant bevindt. (b) Vergelijking van virusopbrengsten, uitgedrukt in virale deeltjes (vp), geïsoleerd uit de cel-geassocieerde fractie of geprecipiteerd uit kweekmedium. Verschillende monsters genoemd in figuur 3a werden geanalyseerd met HPLC, in principe zoals beschreven door Shabram et al.6 HPLC werd uitgevoerd met een Alliance Separation-module 2690 uitgerust met een fotodiode-arraydetector (PDA 996) (Waters, Milford, MA, VS). De viruspieken van alle monsters hadden OD260/280-verhoudingen tussen 1,15 en 1,34. Kwantificering werd gedaan door integratie van het viruspiekgebied bij 260 nm met behulp van Millennium 32 Software (Waters). De opbrengst verkregen uit 25 ml kweekmedium werd geëxtrapoleerd naar het gehele productievolume en als zodanig vergeleken met de opbrengst van de cel-geassocieerde fractie.

HPLC-analyse werd gebruikt om de deeltjesconcentraties van de bovengenoemde monsters te bepalen en de opbrengsten werden vergeleken met de totale opbrengst aan virusdeeltjes (vp) uit het cellysaat (Figuur 3b). De opbrengst van cellysaat was ongeveer hetzelfde als de opbrengst verkregen uit het medium na filtratie met 0,45 m filter, 52% versus 48%. Er moet echter worden opgemerkt dat slechts 61% van het virus uit het medium werd teruggewonnen. De opbrengst na centrifugeren was zelfs tweemaal de opbrengst van het cellysaat: voor (NH4)2DUS4 en PEG-6000 neerslag, respectievelijk 67% versus 33% en 68% versus 32%. In de bestudeerde isolaties is de vp tot p.f.u. verhouding was 6-17 tegen 1.

Afhankelijk van het rAd-type en de exacte productieomstandigheden kan de hoeveelheid virus die in het kweekmedium aanwezig is sterk variëren. Zelfs als de productieomstandigheden zijn geoptimaliseerd, kunnen kleine verschillen in bijvoorbeeld celstatus of inoculum variaties veroorzaken die kunnen leiden tot verlies van een lucratief deel van de virusopbrengst, als het medium wordt weggegooid (Tabel 1). Bij grootschalige rAd-producties (NH4)2DUS4 precipitatie gevolgd door filtratie over een 0,45 m membraanfilter lijkt een snelle en gemakkelijke methode om het virus uit het medium terug te winnen, vooral als de methode kan worden gecombineerd met standaard zuiveringsprotocollen. Daarom stellen we een rAd-oogstprotocol voor (Figuur 4) waarin het virus zowel uit de cellen als uit het kweekmedium wordt geïsoleerd. Eerst wordt de oogst verdeeld in twee fracties: een medium- en een celfractie. Tijdens de incubatietijd van het kweekmedium met (NH4)2DUS4, kunnen de cellen worden verstoord en CsCl-stapgradiënten worden bereid. Ten minste 2 uur na het begin van de incubatie kan het neerslag worden geïsoleerd door filtratie en kan het op een CsCl-gradiënt worden geladen, parallel aan het cellysaat. Hierna zal de tweede CsCl-gradiënt en dialyse de zuivering beëindigen. Om de haalbaarheid van de voorgestelde procedure te illustreren, werd Ad5CMVLacZ gekweekt op PER.C6-cellen en gezuiverd volgens het voorgestelde protocol. De op verschillende punten langs de zuivering verkregen opbrengsten zijn weergegeven in Tabel 2. Zoals uit deze gegevens kan worden afgeleid, omvat de middenfractie (A) 30% van de ruwe virusopbrengst (het totaal van fracties A en C). Na precipitatie kon 67% worden teruggewonnen uit het medium met een 33-voudige volumevermindering (B). Om de aangegeven directe belading van het precipitaat op de CsCl-gradiënt te evalueren, werd de zuivering van 50% van het teruggewonnen precipitaat (B) vergeleken met 50% van het ruwe cellysaat (C). De terugwinning van virus was voor het medium (D) minstens twee keer zo hoog (68%) als voor het cellysaat (E) (30%). Hierdoor steeg de bijdrage van de middenfractie aan de totale opbrengst tot 40%. De cumulatieve opbrengst van de afzonderlijk gezuiverde fracties (D en E) is vergelijkbaar met de opbrengsten van de gecombineerde zuivering van medium en cellysaat (F). Aangezien de gecombineerde zuivering even effectief is als de zuivering van de afzonderlijke fracties, is het het gemakkelijkst om het cellysaat en het precipitaat te combineren. Over het algemeen illustreren deze gegevens mooi de toepasbaarheid van het protocol afgebeeld in figuur 4. Het opgeloste neerslag kan ook worden gezuiverd via AE-kolomchromatografie zonder tussenliggende zuiveringsstappen. Dit werd aangetoond door HPLC-analyse van gedialyseerde en niet-gedialyseerde precipitaten, die duidelijke viruspieken aan het licht brachten zonder enige verstoring als gevolg van de aanwezigheid van (NH4)2DUS4 (data niet weergegeven).

Isolatieprotocol van recombinant adenovirus uit de helpercellen en hun kweekmedium in het geval van middelgrote tot grootschalige producties. Zuivering van de cel-geassocieerde virusfractie is zoals eerder beschreven.14 De verschillende fracties zijn aangegeven met de karakters A-F en komen overeen met de monsters genoemd in Tabel 2. RT, kamertemperatuur.


Zuivering en karakterisering van melanogeen enzym tyrosinase van paddenstoel

Melanogenese is een biosynthetische route voor de vorming van het pigment melanine in de menselijke huid. Een sleutelenzym, tyrosinase, katalyseert de eerste en enige snelheidsbeperkende stappen in melanogenese. Sinds de ontdekking van zijn melanogene eigenschappen staat tyrosinase centraal en wordt gezocht naar microbiële bronnen van het enzym. Agaricus bisporus algemeen bekend als de gewone eetbare paddenstoel, het vindt plaats in grote hoeveelheden eiwitten, enzymen, koolhydraten, vezels en een laag vetgehalte wordt vaak in de literatuur genoemd in verband met hun voedingswaarde. In de huidige studie tyrosinase van Agaricus bisporus werd gezuiverd door ammoniumsulfaatprecipitatie, dialyse gevolgd door gelfiltratiechromatografie op Sephadex G-100 en ionenuitwisselingschromatografie op DEAE-Cellulose. activiteit van 52,19 E/mg. De SDS-PAGE-elektroforese toonde een molecuulgewicht van de migrerende eiwitband van 95 kDa. Het gezuiverde tyrosinase werd geoptimaliseerd en de resultaten lieten zien dat de optimale waarden pH 7,0 en temperatuur 35°C zijn. De hoogste activiteit werd gerapporteerd tegen zijn natuurlijke substraat, L-DOPA, met een schijnbare Km-waarde van 0,933 mM. Dit gaf aan dat tyrosinase gezuiverd uit Agaricus bisporus is een potentiële bron voor medische toepassingen.

1. Inleiding

Tyrosinase (E.C. 1.14.18.1) is een alomtegenwoordig enzym dat betrokken is bij pigmentatie. Het katalyseert hydroxylering van monofenolen (cresolase-activiteit) en oxidatie van difenolen (catecholase-activiteit) in aanwezigheid van moleculaire zuurstof. De omzetting van fenolen naar O-difenolen door tyrosinase is een potentieel aantrekkelijk katalytisch vermogen en daarom heeft tyrosinase veel aandacht getrokken met betrekking tot zijn biotechnologische toepassing, aangezien de catecholproducten bruikbaar zijn als medicijnen of medicijnsynthons, bijvoorbeeld L-DOPA [1]. Het speelt ook een belangrijke rol bij de vorming van melaninepigment tijdens melanogenese in melanocyten die zich op de epidermale overgang bevinden en het is aanwezig in deze cellen die afkomstig zijn van de embryonale neurale lijst en verantwoordelijk is voor de synthese van melanine. [2] Het werd voor het eerst gekarakteriseerd bij zoogdieren vanwege zijn rol bij de ontwikkeling van melanomen en voor betrokkenheid bij pigmentatieproblemen zoals albinisme en vitiligo [3]. De fysiologische rol van tyrosinasen is gerelateerd aan de biosynthese van melanine en is geëxtraheerd uit verschillende bronnen zoals schimmels, fruit en melanoomtumoren bij zoogdieren [4, 5]. Bij schimmels zijn melanines betrokken bij afweermechanismen tegen stressfactoren zoals UV- of gammastraling, vrije radicalen, uitdroging en extreme temperaturen [6, 7]. De stabiliteit van schimmelsporen profiteert ook van de beschermende rol van melanine [8]. Bovendien worden tyrosinasen geassocieerd met wondgenezing, met de immuunrespons in planten [9, 10].Bij mensen is tyrosinase betrokken bij de pigmentatie in melanocyten [11–13], als marker bij melanoompatiënten [14] en als doelwit voor de activering van prodrugs [15]. In het huidige werk, als een eerste stap bij het evalueren van het farmaceutische potentieel van de tyrosinase van paddenstoelen Agaricus bisporus, hebben we een voorlopige karakterisering van het enzym uitgevoerd. Het gekarakteriseerde tyrosinase vertoonde zeer grote overeenkomsten in vergelijking met menselijk tyrosinase. Dit gaf aan dat gezuiverde en gekarakteriseerde paddenstoelen een welvarende bron van tyrosinase kunnen zijn voor therapeutisch gebruik bij melanogenese.

2. materialen en methoden

2.1. Bereiding van tyrosinase

Extractie van paddenstoelentyrosinase werd uitgevoerd volgens de methode van Kamahldin et al. [16], met enkele wijzigingen. De gesneden champignons werden gehomogeniseerd door een waring blender. Enzymextractie werd bereid met 500 ml koude 100 mM fosfaatbuffer (pH 5,8) voor 300 g paddenstoel. Het homogenaat werd gedurende 30 minuten bij 5000 rpm gecentrifugeerd en het supernatant werd verzameld. De sedimenten werden gemengd met koude fosfaatbuffer en men liet ze in koude toestand staan ​​met af en toe schudden. Vervolgens werd de sedimentbevattende buffer nogmaals onderworpen aan centrifugatie om supernatant te verzamelen. Het supernatant werd gebruikt als een bron van enzym.

2.2. Zuivering van het enzym uit het ruwe extract

De zuivering van tyrosinase werd uitgevoerd volgens de methode van Kamahldin et al. [16], met een kleine wijziging. Ruw enzymextract gezuiverd door zoutprecipitatie, dialyse, gelfiltratie, ionenuitwisselingschromatografie, enzovoort, is in serie gebruikt om het enzym in zijn zuiverste vorm te verkrijgen. Het aldus geproduceerde zuivere enzym kan voor de verdere analyse worden gebruikt.

2.3. Ammoniumsulfaatprecipitatie en dialyse

Ammoniumsulfaatprecipitatie werd uitgevoerd in een ijsbad met behulp van het fijngemalen ammoniumsulfaat. Het poeder werd gewogen en langzaam aan het extract toegevoegd door constant te roeren om volledige oplosbaarheid te verzekeren, en de oplossing werd 30 min bij 4°C bij 5000 rpm gecentrifugeerd. Er werden verschillende precipitatiestappen uitgevoerd voor tyrosinase-enzymprecipitatie (45-80%) en precipitaten werden verzameld. Het precipitaat werd 24 uur gedialyseerd tegen 100 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0) door de buffer driemaal te vervangen. De gedialyseerde fractie werd gebruikt voor tyrosinase-activiteit en eiwitgehalte.

2.4. Bepaling van tyrosinase-activiteit

De tyrosinase-activiteitstest werd uitgevoerd zoals gerapporteerd door Sung en Cho [17] spectrofotometrisch, waarbij de omzetting van L-DOPA in roodgekleurd oxidatieproduct dopachroom werd gemeten. De initiële reactiesnelheid is evenredig met de concentratie van het enzym. Een aliquot dat tyrosinase bevatte werd gedurende 5 minuten bij 35°C op tijdstip nul geïncubeerd, 1 ml L-DOPA-oplossing (4 mg/ml) voor gemeten bij 475 nm. Na nog eens 5 min incubatie werd het mengsel opnieuw geschud en werd een tweede aflezing bepaald en gedurende 3 minuten gemeten. De verandering in absorptie was evenredig met de enzymconcentratie. Eén eenheid enzym kwam overeen met de hoeveelheid die de transformatie van 1 . katalyseerde μmol substraat tot product per minuut onder de bovenstaande omstandigheden en produceerde 1,35 veranderingen in absorptie. De specifieke activiteit werd uitgedrukt als enzymeenheid per milligram eiwit. Het eiwitgehalte van het enzym werd bepaald volgens de methode van Lowry [18], met standaard runderserumalbumine.

2.5. Sephadex G-100 gelfiltratie

De gedialyseerde ammoniumsulfaatfractie werd aangebracht op een Sephadex G-100 kolom die vooraf in evenwicht was gebracht met een 100 mM fosfaatbuffer met pH 7,0. De eiwitelutie werd uitgevoerd met dezelfde buffer bij een stroomsnelheid van 5 ml/min. De fracties werden verzameld bij 4°C. Het werd getest op eiwit bij 280 nm en op enzymactiviteit. De actieve fracties werden samengevoegd, gedialyseerd tegen de 100 mM fosfaatbuffer met pH 7,0 en geconcentreerd.

2.6. DEAE-cellulosekolomchromatografie

Gedialyseerd enzympreparaat verkregen na ammoniumsulfaatprecipitatie en Sephadex G-100-kolom werd onderworpen aan ionenuitwisselingschromatografie met behulp van DEAE-Cellulose-kolom (20 x 1 cm). Het gedialyseerde enzympreparaat werd geladen op een DEAE-Cellulose-kolom die vooraf in evenwicht was gebracht met kaliumfosfaatbuffer (100 mM, pH 7,0). De kolom werd eerst gewassen met geëquilibreerde buffer en vervolgens werden gebonden eiwitten geëlueerd met behulp van een lineaire gradiënt van 0-100 mM NaCl en 0-100 mM kaliumfosfaatbuffer met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut. De fracties (elk 2,5 ml) werden verzameld en getest op tyrosinase-activiteit en die met een hoge activiteit werden samengevoegd en gebruikt voor SDS-PAGE-analyse.

2.7. Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel (SDS-PAGE) Elektroforese van gezuiverde tyrosinase

SDS-PAGE werd uitgevoerd met een 12% scheidingsgel en 4% stapelgel. De monsters werden gedurende 5 minuten bij 100°C verwarmd in flesjes met dop met 1% (w/v) SDS in aanwezigheid van β-mercapto-ethanol. Elektroforese werd uitgevoerd bij 125 V gedurende 4 uur in Tris-HCl-buffer met pH 8,3. Na elektroforese werden eiwitten in de scheidingsgel zichtbaar gemaakt door te kleuren met Coomassie Brilliant Blue R-250. De standaarden die werden gebruikt om een ​​grafiek te maken van log molecuulgewicht versus mobiliteit van de eiwitband waren lysozym (20 kDa), myoglobine (26 kDa), koolzuuranhydrase (38 kDa), ovalbumine (46 kDa), glutamaat (62 kDa), runder serumalbumine (91 kDa), β-galactosidase (120 kDa) en myosine (200 kDa).

2.8. Effect van pH en temperatuur op enzymactiviteit

De activiteit van tyrosinase werd geëvalueerd bij verschillende pH-waarden in het bereik tussen pH 3 en 10 onder testomstandigheden en de hoeveelheid dopachroom werd bepaald. De gebruikte buffers waren citraatfosfaat (pH 3,0-5,0), kaliumfosfaat (pH 6,0-7,0), Tris-HCl (pH 8,0-9,0) en glycine-NaOH (pH 9,0-10). De optimale temperatuur voor enzymactiviteit werd bepaald door het standaard reactiemengsel te incuberen bij temperaturen variërend van 35 tot 65°C.

2.9. Kinetische analyse

De enzymkinetiek zoals gemeten door de Michaelis-constante (Km) wordt gedefinieerd als de substraatconcentratie bij de helft van de maximale snelheid, de snelheid van enzymatische reacties, door de reactiesnelheid te relateren aan de concentratie van een substraat. De Michaelis-constante (Km)-waarde van het gezuiverde enzym werd geschat in een reeks tyrosinaseconcentraties. De schijnbare Km-waarde van gezuiverd tyrosinase werd berekend uit de Lineweaver-Burk-grafieken met betrekking tot 1/V tot 1/[S].

3. Resultaten en discussie

3.1. Gedeeltelijke zuivering van tyrosinase

Paddestoel bevat een aanzienlijke hoeveelheid verschillende fenolische verbindingen, die gemakkelijk worden geoxideerd tijdens het homogenisatieproces. Bij oxidatie en opeenvolgende polymerisatie van het fenolgehalte van het paddenstoelenextract worden macromoleculen van melanines gevormd. De zuivering van tyrosinase uit paddenstoelen is matig moeilijker vanwege de kleinere hoeveelheid weefsel die beschikbaar is per vruchtlichaam van paddenstoel en grotere hoeveelheid melanine in deze weefsels. De begeleidende melaninen die gewoonlijk worden opgebouwd tijdens de bereiding van het gehomogeniseerde extract zouden verregaand uit het eiwitmengsel kunnen worden verwijderd met behulp van ionenuitwisselingsmateriaal. Aanvankelijk probeerden we adsorberende anionenwisselaars, evenals precipitatiemethoden met ammoniumsulfaatprecipitatie om gekleurd materiaal te verwijderen of om tyrosinase te concentreren. Geen van deze methoden was succesvol zonder een afname in het herstel van enzymactiviteit te veroorzaken of niet in staat te zijn een aanzienlijke hoeveelheid gekleurd materiaal te verwijderen.

In het kort werden ruwe extracten bereid door homogenisatie in 100 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 5,8) die 1 mM EDTA bevat. Na centrifugeren werd het supernatant aangebracht op ammoniumsulfaatprecipitatie. Gedeeltelijke zuivering van tyrosinase met behulp van ammoniumsulfaatprecipitatie toonde aan dat de beste fractie 70% was met betrekking tot het ruwe enzym en andere fracties. Het gaf de maximale waarden van totale activiteit, specifieke activiteit en opbrengst van het tyrosinase-enzym dat respectievelijk 11,09 E/mg, 83,5% bereikte. De -voudige zuivering van het gezuiverde enzym was 3,47 wanneer 70% ammoniumsulfaat werd gebruikt. De eerdere bevindingen waren identiek aan die gerapporteerd door Lee et al. [19], die ontdekte dat 70% ammoniumsulfaat de beste fractie was die de hoogste opbrengst aan tyrosinase-activiteit gaf van Solanum melongena. Het gedialyseerde ammoniumsulfaatprecipitaat dat werd aangebracht op Sephadex G-100 gelfiltratiekolomchromatografie vertoonde grote pieken van tyrosinase-activiteit die werden waargenomen in actieve fracties en resulteerde in een 9,22-voudige zuivering met een uiteindelijke specifieke activiteit van 29,42 U/mg. De totale opbrengst van de zuivering was 35,7% (Tabel 1). Deze actieve fractie werd aangebracht op een DEAE-Cellulose-kolom en geëlueerd met een stapsgewijs toenemende NaCl-gradiënt. Het enzym werd geëlueerd bij 0-100 mM NaCl (Figuur 1). De geëlueerde actieve fracties opnieuw gechromatografeerd op dezelfde kolom met een lineaire gradiënt van kaliumfosfaatbuffer (0-100 mM) werden door de kolom geleid (Figuur 2). Dit zuiveringsschema in twee stappen, ionenuitwisselingschromatografie, resulteerde in een gedeeltelijk gezuiverd tyrosinasepreparaat, verkregen door fracties 25, 26, 27 en 28 samen te voegen en het enzym werd gezuiverd door ongeveer 16,36-voudige zuivering met een uiteindelijke specifieke activiteit van 52,19 U /mg. De totale opbrengst van de zuivering was 26,6%. Horowitz et al. [20] rapporteerde dat tyrosinase dat in het vruchtlichaam wordt geproduceerd, kan worden gerecupereerd en gezuiverd door te homogeniseren in een blender en vervolgens door een Franse pers te gaan, gevolgd door aceton- of ammoniumsulfaatprecipitatie [21]. Het opnieuw gesuspendeerde precipitaat werd verder gezuiverd door een of meer chromatografiekolommen. De meest gebruikte kolommen zijn hydroxylapatiet [22], DEAE-Cellulose [23] of DEAE Sepharose [24], verschillende andere immunoaffiniteitsharsen [25] en Sephadex-grootte-uitsluitingsgel [21].


RESULTATEN

Identificatie van GRASP65-interagerende eiwitten in het interfase-cytosol

In onze eerdere onderzoeken hebben we een semi-kwantitatieve kralenaggregatietest gebruikt om GRASP65-oligomerisatie te visualiseren. We bekleedden Dynal M-500 magnetische korrels met gezuiverd GRASP65 en onderzochten de mate van korrelaggregatie onder verschillende omstandigheden (Wang et al., 2003, 2005 Tango et al., 2010b). Toen met GRASP65 gecoate korrels werden geïncubeerd in een fysiologische buffer bij 37ºC, vormden de korrels tot op zekere hoogte aggregaten, wat suggereert dat GRASP65 zich vormt. trans-oligomeren die voldoende zijn om aangrenzende oppervlakken met elkaar te verbinden (Wang et al., 2003). Van belang was dat wanneer de kralen werden geïncubeerd met interfase HeLa-celcytosol, de aggregatie sterk werd verbeterd in vergelijking met die met een buffer die dezelfde concentratie runderserumalbumine bevat (BSA 92,7 ± 3,5% versus 34,2 ± 2,8% kralen in aggregaten Figuur 1 , A en B), wat suggereert dat interfase-cytosol actieve componenten bevat die de GRASP65-oligomerisatie verbeteren.

AFBEELDING 1: Mena lokaliseert naar de cis-Golgi door interactie met GRASP65. (A) GRASP65-gekoppelde Dynal M-500-korrels werden geïncubeerd met ofwel buffer die BSA of HeLa-interfase-cytosol (IC) bevat. Na incubatie werden de kralen op glasplaatjes geplaatst en werden willekeurige velden gefotografeerd. Schaalbalk, 100 m. (B) Kwantificering van A voor het percentage kralen in aggregaten. Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Statistische significantie werd beoordeeld door vergelijking met met BSA behandelde kralen. De P waarde werd bepaald door Student's t toets ***P < 0,001. (C) Affiniteitszuivering van GRAS65-interagerende eiwitten. Interfase-cytosol gefractioneerd door 15-30% ammoniumsulfaatprecipitatie werd geïncubeerd met BSA of His-GRASP65-gekoppelde CNBr-korrels en gebonden eiwitten werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Coomassie-blauwkleuring. Pijlen geven de Mena- en β/γ-actinebanden aan die werden uitgesneden en geïdentificeerd door massaspectrometrie. (D) Kralen bekleed met BSA of GRASP65 werden geïncubeerd met 15-30% ammoniumsulfaat-geprecipiteerde eiwitten van interfase-cytosol (I, invoer), gewassen en geanalyseerd met Western-blot op Mena. (E) Immunoprecipitatie (IP) door ofwel niet-specifieke IgG (ctrl) of anti-Mena-antilichamen van lysaat van cellen die zijn getransfecteerd met controle (ctrl) of Mena-targeting siRNA. (F) WT HeLa-cellen werden immunologisch gekleurd met aangegeven antilichamen om de Golgi-lokalisatie van endogene Mena te tonen. (G) HeLa-cellen die GFP-Mena tot expressie brengen, werden immunologisch gekleurd voor GRASP65. (H) Cellen getransfecteerd met controle of GRASP65 siRNA werden immunologisch gekleurd voor de aangegeven eiwitten. GRASP65-uitputting schafte de Golgi-lokalisatie van Mena af. (I) Cellen getransfecteerd met GFP, GFP-Mena of GFP-VASP werden gelyseerd en geïmmunoprecipiteerd door GFP-antilichamen. (J) Kwantificering van de hoeveelheid GFP-Mena of GFP-VASP die werd geco-immunoprecipiteerd met GRASP65, met het niveau van GFP-Mena genormaliseerd tot 100%. ***P < 0,001. (K) Cellen die GFP-Mena of GFP-VASP tot expressie brengen, werden immunologisch gekleurd voor GRASP65. Mena maar niet VASP is geconcentreerd op de Golgi. Staaf, 20 m (F-H, J). (L) Gezuiverde Golgi (RLG) -membranen van rattenlever werden geïncubeerd met interfase (IC) of mitotisch (MC) cytosol of achtereenvolgens geïncubeerd met MC en vervolgens IC (MC → IC), opnieuw geïsoleerd en geblot op aangegeven eiwitten.

Om het bestaan ​​van actieve componenten in interfase-cytosol verder te bevestigen, hebben we eerst met GRASP65 gecoate korrels geaggregeerd door interfase-cytosol en deze vervolgens gedesaggregeerd door behandeling met gezuiverde mitotische kinasen, cycline-afhankelijke kinase 1 (Cdk1) en Polo-achtige kinase 1 (Plk1), waarvan bekend is dat ze GRASP65 fosforyleren en de oligomerisatie ervan verstoren (Wang et al., 2003 2005), en behandelde de resulterende enkele kralen verder met ofwel interfase cytosol of gezuiverd eiwitfosfatase 2A (PP2A), dat GRASP65 defosforyleert (Tang et al., 2008). Zoals te zien is in aanvullende figuur S1A, veroorzaakten beide behandelingen parelreaggregatie, maar behandeling met interfase-cytosol resulteerde in een veel grotere aggregatie dan die met PP2A, wat sterk suggereert dat interfase-cytosol actieve componenten bevat voor GRASP65-oligomerisatie. Om de biochemische eigenschappen van deze factoren te karakteriseren, hebben we interfase-cytosol behandeld met veel zout, hitte of proteasen. Al deze behandelingen schaften de activiteit af, wat suggereert dat de cytosolische factoren eiwitten van aard zijn (supplementaire figuur S1B). Verdere experimenten met een verscheidenheid aan nucleotiden of hun analogen toonden aan dat deze activiteit ATP vereist, maar geen ATP-hydrolyse, omdat toevoeging van niet-hydrolyseerbare ATP-analogen zoals ATPγS de aggregatie vergelijkbaar met ATP aanzienlijk verhoogde (supplementaire figuur S1C).

Vervolgens probeerden we deze activiteit te verrijken met klassieke biochemische methoden. Met behulp van sequentiële ammoniumsulfaatprecipitatie ontdekten we dat de activiteit was verrijkt in 10-30% ammoniumsulfaatprecipitaat (aanvullende figuur S2A). We hebben vervolgens 15-30% ammoniumsulfaatprecipitant van cytosol gefractioneerd met een 10-35% glycerolgradiënt en ontdekten dat fractie 9, van in totaal 12 fracties, de meeste activiteit bevatte (aanvullende figuur S2B). Vergelijking met molecuulgewichtstandaarden toonde aan dat eiwitten in fractie 9 ∼ 1000 kDa waren, wat suggereert dat het een groot eiwitcomplex is.

Om de actieve componenten affiniteit te zuiveren, hebben we het 15-30% ammoniumsulfaatprecipitaat opgelost, het in een fysiologische buffer gedialyseerd en het door een kolom geleid die ofwel GRASP65 of BSA bevatte, verknoopt met CNBr-geactiveerde kralen, die een hogere capaciteit hebben dan Dynal kralen. Na uitgebreid wassen werden gebonden eiwitten geanalyseerd met SDS-PAGE en Coomassie-blauwkleuring. Eiwitten die specifiek binden aan GRASP65 maar niet aan BSA-korrels werden uitgesneden en geïdentificeerd door massaspectrometrie. Mena, de zoogdierhomoloog van Drosophila Ena waarvan bekend is dat het de verlenging van de actinefilamenten verbetert (Gertler et al., 1996), en β- en γ-actine werden in dit proces geïdentificeerd (Figuur 1C en aanvullende tabel S1).

Mena wordt gerekruteerd naar de Golgi-membranen door de interactie met GRASP65

Om de interactie tussen GRASP65 en Mena te bevestigen, hebben we de 15-30% ammoniumsulfaat-cut van interfase-cytosol geïncubeerd met BSA- of GRASP65-gecoate CNBr-geactiveerde kralen en gebonden eiwitten geanalyseerd met Western-blot. Zoals weergegeven in figuur 1D, trok GRASP65 Mena uit het cytosol, maar BSA deed dat niet. Om deze interactie in cellen te bevestigen, hebben we Mena van HeLa-cellysaat geïmmunoprecipiteerd en ontdekten dat GRASP65, maar niet zijn tegenhanger GRASP55, samen met Mena neersloeg (Figuur 1E). Om de specificiteit van deze interactie te garanderen, hebben we Mena uitgeschakeld met klein interfererend RNA (siRNA). Als gevolg hiervan was GRASP65 niet detecteerbaar in het neerslag met Mena-antilichamen wanneer Mena was uitgeput (Figuur 1E).

Vervolgens hebben we bepaald of Mena door GRASP65 naar de Golgi wordt gerekruteerd. Immunofluorescentiebeelden in eerdere rapporten suggereren een prominente verrijking van Mena in focale verklevingen, lamellipodia en filopodia. De meeste afbeeldingen tonen echter ook een perinucleaire lokalisatie van Mena in cellen (Bear et al., 2002 Loureiro et al., 2002 Joshi en Wang, 2015). Consequent is recentelijk aangetoond dat Ena- en actinefilamenten zich lokaliseren in de cis-Golgi om de fusie en splijting van Golgi-membraan te reguleren bij het ontwikkelen van fotoreceptorcellen in Drosophila (Kannan et al., 2014). Door immunofluorescentiemicroscopie vonden we dat endogene Mena is verrijkt op de Golgi en gecolokaliseerd met GRASP65 (Figuur 1F). Evenzo concentreerde exogeen tot expressie gebracht groen fluorescerend eiwit (GFP)-Mena zich ook op de Golgi (Figuur 1G). De Golgi-lokalisatie van Mena is afhankelijk van GRASP65, omdat uitputting van GRASP65 door RNA-interferentie (RNAi) Mena van het Golgi naar het cytosol verspreidde (Figuur 1H). Om te bepalen of de interactie tussen Mena en GRASP65 specifiek is, hebben we ook VASP onderzocht, een ander lid van de Ena/VASP-eiwitfamilie. GFP-Mena co-immunoprecipiteerde met endogeen GRASP65, maar GFP-VASP had een veel lagere affiniteit voor GRASP65 (8,2 ± 3,3% ten opzichte van GFP-Mena Figuur 1, I en J). Bovendien was GFP-VASP, in tegenstelling tot Mena, niet verrijkt op de Golgi (Figuur 1K), wat aangeeft dat de interactie met GRASP65 en Golgi-lokalisatie specifiek zijn voor Mena. Toen gezuiverde Golgi-membranen werden geïncubeerd met interfase- of mitotische HeLa-celcytosol en opnieuw geïsoleerd, werd cytosolische Mena co-gezuiverd met de Golgi-membranen onder zowel interfase- als mitotische omstandigheden (Figuur 1L), wat aantoont dat de interactie tussen GRASP65 en Mena celcyclusonafhankelijk is.

Mena is vereist voor de vorming van Golgi-lint op een actine-afhankelijke manier

Om de functie van Mena in de Golgi-organisatie te onderzoeken, hebben we Mena in HeLa-cellen neergehaald (Figuur 2). Transfectie met niet-specifiek controle-siRNA had geen significant effect op de Golgi-morfologie in de cel, zoals aangegeven door GRASP65-kleuring, terwijl uitputting van Mena Golgi-fragmentatie veroorzaakte, waarbij Golgi-elementen van elkaar werden losgemaakt en in het cytoplasma werden verspreid (Figuur 2, A-C ).Kwantificering van deze cellen toonde aan dat de Golgi was gefragmenteerd in 78,2 ± 1,5% van Mena-uitgeputte cellen, significant hoger dan in controle-siRNA-behandelde cellen (9,0 ± 0,2% Figuur 2C). Vervolgens hebben we de Golgi-structuur nader onderzocht met EM. In controle-siRNA-getransfecteerde cellen waren de Golgi-stapels goed georganiseerd en zijdelings verbonden in een lint (Figuur 2D). Daarentegen waren in Mena-uitgeputte cellen de Golgi-stapels losgekoppeld, verspreid over het cytoplasma en aanzienlijk korter dan in controlecellen (Figuur 2E). De gemiddelde lengte van Golgi-stapels werd verminderd van 1,23 ± 0,08 m in controlecellen tot 0,72 ± 0,05 m in Mena-verarmde cellen (Figuur 2E), terwijl Golgi-stapeling niet werd beïnvloed (Figuur 2F). Bovendien waren de Golgi-cisternae in mena-uitgeputte cellen licht verwijd, vergelijkbaar met het effect van actineverstoring, zoals eerder gemeld (Lazaro-Dieguez et al., 2006). Deze resultaten suggereren dat Mena-uitputting de connectiviteit tussen Golgi-stapels in het lint vermindert.

AFBEELDING 2: Mena reguleert de integriteit van Golgi door middel van actinepolymerisatie. (A) HeLa-cellen behandeld met aangegeven siRNA werden gekleurd voor Mena en GRASP65. (B) Immunoblot van HeLa-cellen van A. (C) Kwantificering van A voor het percentage cellen met gefragmenteerd Golgi. (D) representatieve EM-beelden van de cellen beschreven in A. pijlen, Golgi-stapels. Bar, 500 nm. (E) Kwantificering van D voor de gemiddelde cisternale lengte van Golgi-stapels. (F) Kwantificering van D voor het gemiddelde aantal cisternae per Golgi-stack. (G) Mena-verarmde HeLa-cellen werden getransfecteerd met een cDNA voor GFP of GFP-gelabelde, RNAi-resistente Mena WT of mutanten en gekleurd voor GRASP65. Staaf, 20 m (A, G). (H) Cellen werden eerst getransfecteerd met niet-specifiek (baan 1) of Mena-specifiek siRNA (baan 2-5) en vervolgens met plasmide van GFP (baan 2), GFP-gelabeld, RNAi-resistent Mena WT (baan 3), ΔFAB (baan 4) en ΔGAB (baan 5) mutanten en geanalyseerd door Western blot. endo. Mena, endogene Mena. (I) Kwantificering van het percentage GFP-positieve cellen met gefragmenteerde Golgi in G. ***P < 0,001.

Om ervoor te zorgen dat het Golgi-fragmentatiefenotype specifiek was voor Mena-uitputting, brachten we een RNAi-resistente vorm van GFP-Mena, of GFP als controle, tot expressie in cellen waarin endogene Mena werd uitgeschakeld. Zoals weergegeven in figuur 2, had G–I, GFP-expressie geen effect op de gefragmenteerde Golgi, terwijl in cellen die GFP-Mena tot expressie brengen, de Golgi intact en compact werd. Vervolgens vroegen we of de functie van Mena in Golgi-integriteit door actinefilamentvorming is. We brachten de Mena ΔFAB- of ΔGAB-mutanten tot expressie, die respectievelijk niet aan F-actine of G-actine kunnen binden (Loureiro et al., 2002 Breitsprecher et al., 2011), in Mena-uitgeputte cellen. Beide mutanten, hoewel gelokaliseerd op het Golgi, slaagden er niet in het Golgi-lint te redden van fragmentatie (Figuur 2, G-I). Deze resultaten geven aan dat Mena vereist is voor het handhaven van de Golgi-integriteit en dat de activiteit ervan afhangt van actine.

We hebben de interactiedomeinen op beide eiwitten verder in kaart gebracht met pull-down-assays. Net als andere leden in de Ena/VASP-eiwitfamilie, bevat Mena een N-terminaal Ena/VASP-homologie 1 (EVH1) domein, dat het proline-rijke motief van een aantal eiwitten bindt voor subcellulaire targeting, een midden proline-rijk domein, en een C-terminaal EVH2-domein dat interageert met zowel G-actine als F-actine en zo de verlenging van F-actine verbetert. Het EVH2-domein heeft ook een C-terminaal coiled-coil-domein dat de tetramerisatie van Mena bemiddelt (Bear en Gertler, 2009 Breitsprecher et al., 2011). GRASP65 daarentegen bevat een N-terminaal GRASP-domein en een C-terminaal serine/proline-rijk (SPR) domein (Wang et al., 2005). Om te bepalen of Mena interageert met het proline-rijke domein van GRASP65 via zijn EVH1-domein, hebben we een pulldown-assay uitgevoerd met behulp van gezuiverde recombinante menselijke Mena EVH1- en ratten-GRASP65-fragmenten. Het EVH1-domein van Mena co-gezuiverd met GRASP65 van volledige lengte (Figuur 3A), evenals met zijn C-terminale SPR-domein, maar niet met het N-terminale GRASP-domein (Figuur 3B), wat aantoont dat de interactie direct wordt gemedieerd door de EVH1 domein van Mena en het SPR-domein van GRASP65 en is actineonafhankelijk.

AFBEELDING 3: Mena-GRASP65-interactie is vereist voor de integriteit van Golgi. (A) BSA- of GRASP65-gecoate kralen werden geïncubeerd met gezuiverde GST-Mena EVH1, gewassen en geanalyseerd door Western blot voor GST. (B) Kralen gekoppeld aan BSA of gezuiverd GRASP65 aa 1-201 (p65N) of 202-446 (p65C) fragment werden geïncubeerd met gezuiverd His-Mena EVH1, gewassen en geanalyseerd met Western blot op His-tag. (C) Kralen gekoppeld aan GST of gezuiverde GST-gelabelde GRASP65-fragmenten werden geïncubeerd met HeLa-cellysaat, gewassen en geanalyseerd met Western-blot op Mena. (D) GRASP65-puntmutaties, met aangegeven aminozuren gemuteerd. (E) Uitlijning van GRASP65-aminozuursequenties van ratten, muizen en mensen in het aangegeven gebied. Vetgedrukte lijnen geven de plaatsen aan waar geconserveerde prolines werden gemuteerd in de mutanten (M1-M6) zoals in D. (F) Cellen getransfecteerd met GFP, GFP-gelabeld GRASP65 WT, of aangegeven mutanten werden geïmmunoprecipiteerd met anti-GFP-antilichamen en geanalyseerd door Western vlek. (G-J) GRASP65-uitgeputte cellen werden getransfecteerd met WT GRASP65 of de M2-mutant ervan en geanalyseerd met Western-blot (G) en microscopie (H, I). Staaf, 20 m. (J) Kwantificering van cellen in I met gefragmenteerde Golgi. ***P < 0,001.

Glutathion gebruiken S-transferase (GST) -gelabelde rat GRASP65-fragmenten om Mena van HeLa-cellysaat naar beneden te halen, we vonden aminozuren (aa) 202-320 als het minimale fragment van GRASP65 voor Mena-binding (Figuur 3C). Er zijn vier proline-rijke stukken in deze regio bewaard gebleven tussen soorten. Daarom hebben we de geconserveerde prolines gemuteerd in glycines (Breitsprecher et al., 2011 Figuur 3, D en E), brachten ze tot expressie in cellen en testten hun interacties met Mena door co-immunoprecipitatie. Zoals getoond in figuur 3F, maakte mutatie van P236/P237/P239/P241 tot glycines (mutant M2) in GRASP65 van ratten de interactie met Mena teniet, terwijl mutatie van andere prolines geen effect had. Deze Mena EVH1-bindingssequentie op GRASP65, L (mens)/P (rat en muis) PPxPxP, hoewel dicht bij de gemeenschappelijke F/LPPXP-sequentie die door verschillende Drosophila Ena en zoogdier Mena-interagerende eiwitten (Ball et al., 2002), is niet-traditioneel, vergelijkbaar met een ander Mena EVH1-bindend motief in menselijke Abi (Breitsprecher et al., 2011).

Om te bepalen of GRASP65-Mena-interactie vereist is voor Mena Golgi-lokalisatie en Golgi-lintintegriteit, transfecteerden we GFP-gelabelde wildtype (WT) rat GRASP65 of de Mena-interactie-deficiënte mutant M2 in GRASP65-uitgeputte HeLa-cellen (Figuur 3, G en J). In tegenstelling tot WT GRASP65 slaagde de M2-mutant er niet in om Mena naar de Golgi te rekruteren (Figuur 3H) of de gefragmenteerde Golgi te redden (Figuur 3, I en J).

Omdat Mena de Golgi-structuur reguleert door interactie met actinefilamenten, vroegen we ons vervolgens af of het verstoren van actinefilamenten door farmacologische behandeling de Golgi-structuur zou beïnvloeden. Van cytochalasine B is bekend dat het actinefilament afdekt en daarom de verlenging van het actinefilament remt, waardoor Mena wordt geantagoneerd bij het voorkomen van het aftoppen van actinefilamenten (Braet et al., 1996). Latrunculine B bindt actinemonomeer en depolymeriseert zo actinefilamenten (Wakatsuki et al., 2001). In deze experimenten hebben we geen duidelijk gecondenseerd Golgi waargenomen zoals eerder gemeld (Lazaro-Dieguez et al., 2006) ontdekten we in plaats daarvan dat cellen die waren behandeld met cytochalasine B of latrunculine B een fenotype van losse en niet-gekoppelde Golgi vertoonden in vergelijking met een intacte Golgi in met dimethylsulfoxide (DMSO) behandelde cellen (Figuur 4A). Bovendien resulteerde uitputting van cellulair - of γ-actine door siRNA in Golgi-fragmentatie (Figuur 4B), vergelijkbaar met Mena-uitputting. Door EM ontdekten we dat verstoring van actinefilamenten door medicamenteuze behandelingen (Figuur 4C) en uitputting van β- of γ-actine (Figuur 4D) beide resulteerden in verspreide ministacks, blijkbaar veroorzaakt door het loskoppelen van Golgi-lint. Samengevat onthulden deze resultaten dat mena- en actinefilamenten de integriteit van het Golgi-lint reguleren.

AFBEELDING 4: Actinefilamenten zijn vereist voor de integriteit van Golgi. (A) HeLa-cellen behandeld met DMSO, cytochalasine B (CytB, 40 M) of latrunculine B (LatB, 0,5 M) gedurende 2 uur werden gekleurd voor α-mannosidase II (ManII) en rhodamine-gelabeld phalloidin. (B) Cellen getransfecteerd met aangegeven siRNA werden gekleurd voor ManII en rhodamine-phalloidin. Staaf, 20 m (A, B). (C) Cellen behandeld met DMSO, cytochalasine B of latrunculine B gedurende 2 uur werden verwerkt voor EM en afgebeeld. Pijlen geven Golgi-stapels aan. De gemiddelde cisternale lengte van Golgi-stapels werd gekwantificeerd. Statistische significantie werd beoordeeld door vergelijking met met DMSO behandelde cellen. (D) Cellen getransfecteerd met controle-, β-actine- of γ-actine-siRNA gedurende 48 uur werden verwerkt voor EM en geanalyseerd zoals in C. Statistische significantie werd beoordeeld door vergelijking met de met controle-siRNA behandelde cellen. Bar, 500 nm (C, D). ***P < 0,001.

Actinefilamenten zijn betrokken bij intracellulaire handel (Campellone) et al., 2008 Miserey-Lenkei et al., 2010 Egea et al., 2013 Gurel et al., 2014), en daarom hebben we vastgesteld of Mena als een actinefilamentregulator ook de eiwithandel beïnvloedt, met behulp van het vesiculaire stomatitisvirus-glycoproteïne (VSV-G) als lading. Cellen die eerst waren getransfecteerd met controle of Mena-siRNA, werden geïnfecteerd door adenovirussen die waren voorverpakt met VSV-G-ts045-GFP-plasmiden (Xiang et al., 2013). Cellen werden 's nachts op een niet-permissieve temperatuur (40,5 C) gehouden om VSV-G-ts045 in het endoplasmatisch reticulum (ER) op te sluiten en vervolgens naar een permissieve temperatuur (32 C) verplaatst om VSV-G-export van het ER door de Golgi naar het plasmamembraan mogelijk te maken (Presley et al., 1997 Hirschberg et al., 1998). Zoals weergegeven in aanvullende figuur S3, had de uitputting van Mena geen significante invloed op de VSV-G-handel. Mena speelt dus een cruciale rol bij de vorming van Golgi-linten, maar niet bij het transport van eiwitten.

Mena- en actinefilamenten vergemakkelijken de vorming van Golgi-lint na uitspoeling van nocodazol

In zoogdiercellen vereist de vorming van Golgi-linten een intact netwerk van microtubuli. Depolymerisatie van microtubuli met nocodazol resulteert in Golgi-ministacks gedispergeerd in het cytoplasma (Minin, 1997 Thyberg en Moskalewski, 1999). Vervolgens spoelden we nocodazol weg om de reformatie van Golgi-lint mogelijk te maken om postmitotische Golgi-assemblage na te bootsen in de aanwezigheid of afwezigheid van Mena. Zoals weergegeven in figuur 5, was de reformatie van het Golgi-lint aanzienlijk vertraagd in mena-verarmde cellen vergeleken met controlecellen (Figuur 5A). Op elk tijdstip waren er meer vrije Golgi-elementen die niet waren gefuseerd met de Golgi-kern in door Mena uitgeputte cellen. 120 minuten na de verwijdering van nocodazol waren alle Golgi-elementen geconcentreerd in het celcentrum en het Golgi-lint werd intact in alle controlecellen, maar in Mena-uitgeputte cellen, hoewel de Golgi-elementen naar het celcentrum werden getransporteerd, waren de meeste ze bleven los van elkaar. Confocale beeldvormings- en kwantificeringsresultaten toonden aan dat Mena-uitputting het aantal Golgi-elementen per cel verhoogde, wat wijst op een defect in de fusie van de Golgi-elementen (Figuur 5B). Net als bij Mena-uitputting, vertraagde remming van actine-verlenging door cytochalasine B-behandeling ook Golgi-lintreformatie na verwijdering van nocodazol (Figuur 5C en Aanvullende Figuur S4). Verlenging van mena- en actinefilamenten is dus essentieel bij het verbinden van Golgi-stapels in het lint.

AFBEELDING 5: Mena-uitputting schaadt de hermontage van Golgi na uitspoeling van nocodazol. (A) HeLa-cellen getransfecteerd met controle of Mena siRNA werden 2 uur geïncubeerd met nocodazol. Na verwijdering van nocodazol gedurende aangegeven tijden (minuten), werden cellen gefixeerd en gekleurd door phalloidin en GRASP65-antilichamen. Staaf, 10 m. (B) Experimenten in A werden geanalyseerd door confocale microscopie en het aantal Golgi-deeltjes in de aangegeven cellen werd gekwantificeerd (gemiddelde ± SEM). *P < 0,05 ***P < 0,001. (C) Cellen werden eerst gedurende 2 uur met nocodazol geïncubeerd en vervolgens met de toevoeging van DMSO of cytochalasine B gedurende nog eens 30 minuten. Cellen werden gewassen en verder geïncubeerd in groeimedium dat DMSO of cytochalasine B bevat, maar geen nocodazol, gedurende de aangegeven tijden. Cellen werden gekleurd voor GRASP65 en door phalloidin (afbeeldingen getoond in aanvullende figuren S4 en S5) en geanalyseerd met confocale microscopie en gekwantificeerd zoals in B. Kwantificeringsresultaten.

Zoals voorgesteld door Kondylis et al. (2007), wanneer gedispergeerd door behandeling met nocodazol, bestaan ​​Golgi-stacks als paren in zoogdiercellen, vergelijkbaar met die waargenomen in Drosophila S2-cellen en actinefilamenten zijn vereist voor de vorming van de Golgi-paren. Daarom zou depolymerisatie van actinefilamenten door latrunculine B in met nocodazol behandelde cellen moeten leiden tot de splitsing van Golgi-paren en verdubbeling van de Golgi-elementen. Om deze mogelijkheid te testen, hebben we cellen geïncubeerd met nocodazol in aanwezigheid van DMSO, cytochalasine B of latrunculine B. Confocale microscopie-analyse toonde aan dat behandeling met nocodazol het Golgi-lint in ministacks verspreidde, maar aanvullende behandeling met cytochalasine B verhoogde het aantal Golgi-elementen. Evenzo had de uitputting van Mena door siRNA geen invloed op het aantal Golgi-elementen in met nocodazol behandelde cellen (supplementaire figuur S5A). Onder EM waren de Golgi-stapels in met nocodazol behandelde cellen korter dan in normale interfasecellen en bevonden ze zich altijd naast ER-membranen, vermoedelijk ER-uitgangsplaatsen. Noch Mena-uitputting, noch behandeling met cytochalasine B en latrunculine B hadden verder invloed op de lengte en locatie van de Golgi-ministacks (aanvullende figuur S5B). Deze resultaten gaven aan dat het onwaarschijnlijk is dat Golgi-koppeling het mechanisme is van Mena en actine-gemedieerde lintkoppeling.

Mena en actinefilament zijn vereist voor Golgi-fusie

Tijdens de hervorming van het Golgi-lint na verwijdering van nocodazol, zagen we vaak actinepleisters gelokaliseerd rond en tussen Golgi-elementen in controlecellen (Figuur 6A), waardoor Golgi-stapels mogelijk met elkaar konden worden verbonden, terwijl in Mena-uitgeputte cellen deze actinepleisters waren zelden detecteerbaar (Figuur 6B). Omdat Golgi-lintkoppeling membraanfusie-activiteit vereist, hebben we bepaald of Mena-gemedieerde actine-verlenging Golgi-membraanfusie vergemakkelijkt, met behulp van een gevestigde in vitro Golgi-herassemblage-assay (Tang et al., 2010a). We hebben eerst gezuiverde Golgi-membranen behandeld met mitotisch HeLa-celcytosol om Golgi-fragmentatie te induceren. We hebben de resulterende mitotische Golgi-fragmenten (MGF's) opnieuw geïsoleerd en verder behandeld met interfase-cytosol om blaasjes te laten samensmelten. Vervolgens hebben we de fusie-activiteit van Golgi-membraan gemeten door lange cisternale membranen te kwantificeren die zijn gegenereerd uit blaasjes. Om te bepalen of Mena nodig is voor Golgi-membraanfusie, hebben we Mena immuundepletie van interfase-cytosol. Wanneer geïncubeerd met controle-immunoglobuline G (IgG) -behandeld cytosol, werden de mitotische Golgi-fragmenten (Figuur 6C) opnieuw samengesteld tot lange, gestapelde Golgi-cisternae (Figuur 6D). Toen Mena echter uitgeput was, waardoor 85,5% van Mena uit het cytosol werd verwijderd, werd de membraanfusie-activiteit verminderd tot 35,1 ± 7,7% van het controlecytosol (Figuur 6, E-G). Evenzo verminderde het depolymeriseren van actine door cytochalasine B toe te voegen aan de hermontagereactie de membraanfusie-efficiëntie tot 29,7 ± 7,1% ten opzichte van de DMSO-controle (Figuur 6H). Mena en actine zijn dus essentieel voor Golgi-membraanfusie.

FIGUUR 6: Mena reguleert Golgi-membraanfusie door verlenging van F-actine. (A, B) HeLa-cellen werden getransfecteerd met controle (A) of Mena (B) siRNA en 2 uur geïncubeerd met nocodazol. Op 15 minuten na verwijdering van nocodazol werden cellen gekleurd op actine (rood) en GRASP65 (wit) en geanalyseerd met confocale microscopie. Getoond zijn enkele scans, delen van de afbeeldingen zijn vergroot om de actine-patches tussen Golgi-membranen te tonen. Staven, 10 m. (C) Mena was efficiënt uitgeput van interfase-cytosol, zoals blijkt uit Western-blot. (D-F) In vitro Golgi-hermontagetest. Gezuiverde RLG-membranen werden gedemonteerd door mitotische cytosolbehandeling, opnieuw geïsoleerd (D) en verder geïncubeerd met interfase-cytosol dat immunologisch was uitgeput door controle-IgG (E) of door anti-Mena-antilichamen (F). Membranen werden verwerkt voor EM en afgebeeld. Staven, 500 nm. (G) Kwantificering van relatieve Golgi-membraanfusie-efficiëntie in E en F. ***P < 0,001. (H) Gezuiverde Golgi-membranen die eerst werden gedemonteerd door mitotische cytosolbehandeling en vervolgens werden geïncubeerd met interfase-cytosol in aanwezigheid van DMSO of 40 μM cytochalasine B (CytB). Membranen werden verwerkt voor EM en gekwantificeerd zoals in G.

Mena en langwerpig actinefilament verbeteren de oligomerisatie van GRASP65

Omdat Mena direct interageert met GRASP65 en Mena de verlenging van actine bevordert om Golgi-stacks tot een lint te verbinden, vroegen we of GRASP65 alleen functioneert als het membraananker voor Mena of Mena en actinefilamenten ook GRASP65-oligomerisatie reguleren. Deze vraag werd beantwoord met behulp van de bead-aggregatietest, waarin GRASP65-oligomerisatie direct kan worden gevisualiseerd (Wang et al., 2003 2005). Zoals getoond in figuur 7, A en B, vormden met GRASP65 gecoate korrels grote aggregaten wanneer ze werden behandeld met interfase-cytosol, terwijl uitputting van Mena uit het cytosol deze activiteit aanzienlijk verminderde, wat suggereert dat Mena ten minste een van de belangrijkste componenten in het interfase-cytosol is. die de GRASP65-oligomerisatie versterken (Figuur 7, A en B). Hyperpolymerisatie van GRASP65 vereist actinepolymerisatie, omdat het toevoegen van cytochalasine B aan de reactie de GRASP65-parelaggregatie aanzienlijk verminderde in vergelijking met de DMSO-controle (Figuur 7, C en D).

FIGUUR 7: Mena en F-actines versterken de oligomerisatie van GRASP65. (A, B) Met GRASP65 gecoate korrels werden geïncubeerd met interfase-cytosol (IC) dat immunologisch was uitgeput door niet-specifiek of anti-Mena IgG. Kralen werden afgebeeld door microscopie (A), en het percentage kralen in aggregaten werd gekwantificeerd (B). (C, D) GRASP65-gecoate kralen werden geïncubeerd met IC in aanwezigheid van DMSO of 40 M cytochalasine B en de resultaten werden gekwantificeerd. (E, F) GRASP65-gecoate kralen geïncubeerd met aangegeven gezuiverde eiwitten of IC werden afgebeeld en gekwantificeerd. (G, H) Met GRASP65 gecoate kralen geïncubeerd met interfase-cytosol of interfase-cytosol dat was voorgeïncubeerd met BSA, Mena EVH1-domein of Mena EVH2-domein, werden afgebeeld en gekwantificeerd. Staven, 50 m. ***P < 0,001.

Misschien is de beste manier om te testen hoe Mena en actine GRASP65-oligomerisatie reguleren, door met GRASP65 gecoate kralen te incuberen met gezuiverd Mena en actine, maar pogingen om Mena over de volledige lengte tot expressie te brengen en te zuiveren, mislukten en we waren in staat om alleen de fragmenten van Mena te zuiveren. Daarom hebben we eerst bepaald of Mena-fragmenten de oligomerisatie van GRASP65 konden verhogen.Zoals getoond in figuur 7, E en F, verhoogde het EVH1-domein, dat een interactie aangaat met GRASP65 (Figuur 3A) maar de actinepolymerisatie niet bevordert vanwege het ontbreken van het actine-polymerisatiedomein, de GRASP65-parelaggregatie niet. Evenzo verbeterde het EVH2-domein, dat actinepolymerisatie bevordert maar niet bindt aan GRASP65, ook de GRASP65-oligomerisatie niet. Vervolgens hebben we getest of het toevoegen van Mena-fragmenten aan interfase-cytosol de door Mena bevorderde GRASP65-oligomerisatie zou kunnen remmen. Inderdaad, het toevoegen van gezuiverd EVH1-domein aan de reactie, die concurreert met Mena in het cytosol voor GRASP65-binding, verminderde de activiteit in het interfase-cytosol aanzienlijk bij het bevorderen van GRASP65-gecoate korrelaggregatie. Het EVH2-domein, waarvan bekend is dat het concurreert om actinebinding, had een vergelijkbaar effect. Als negatieve controle had BSA geen effect op GRASP65-oligomerisatie (Figuur 7, G en H). Deze resultaten tonen aan dat zowel GRASP65-interactie als actine-verlengingsactiviteit vereist zijn voor Mena om GRASP65-oligomerisatie en Golgi-lintkoppeling te verbeteren.

Als we de resultaten samenvatten, hebben we Mena geïdentificeerd als een nieuwe GRASP65-bindende partner die een essentiële rol speelt bij de vorming van Golgi-lint. Dit verklaart hoe GRASP65 een dubbele rol speelt bij de vorming van de Golgi-structuur. Wanneer gelokaliseerd tussen Golgi cisternae, binden GRASP65-oligomeren aangrenzende cisternae direct in stapels. Wanneer GRASP65 zich aan de randen van Golgi-stapels bevindt, rekruteert het Mena op het Golgi door een directe interactie en activeert het lokale actinefilamentgroei. Vervolgens verknopen de actinevezels GRASP65 en bevorderen ze GRASP65-oligomerisatie. Zowel actinefilamenten als GRASP65-oligomeren genereren krachten om naburige Golgi-stapels tot een lint te verbinden (Figuur 8).

AFBEELDING 8: Model van Mena-GRASP65-interactie bij het koppelen van Golgi-linten. Golgi-ministacks worden langs microtubuli naar het celcentrum getransporteerd (1). GRASP65-oligomeren ritsen Golgi-cisternae in stapels (2) en binden nabijgelegen Golgi-stapels in een lint (3). Lintvorming vereist aanvankelijk Mena GRASP65 rekruteert Mena naar de Golgi, wat de verlenging van actinefilament bevordert (4). De actinevezels verbinden vervolgens verspreide Golgi-stapels en trekken ze naar elkaar toe om een ​​lint te vormen (5). op zowel de cis en de trans vlakken van de stapel kunnen Golgi-geassocieerde actinefilamenten membraanvervorming vergemakkelijken voor de vorming van blaasjes, splijting en fusie, en bewegingen op korte afstand (6).


Ammoniumsulfaatprecipitatietest pH-afhankelijkheid - Biologie

De gevoeligheid van de procedure van Lowry is matig constant van eiwit tot eiwit, en het is zo veel gebruikt dat Lowry-eiwitschattingen een volledig acceptabel alternatief zijn voor een rigoureuze absolute bepaling in bijna alle omstandigheden waar eiwitmengsels of ruwe extracten bij betrokken zijn.

De methode is gebaseerd op zowel de Biuret-reactie, waarbij de peptidebindingen van eiwitten reageren met koper onder alkalische omstandigheden waarbij Cu+ wordt geproduceerd, dat reageert met het Folin-reagens, als de Folin-Ciocalteau-reactie, die slecht wordt begrepen maar in wezen wordt fosfomolybdowolframaat gereduceerd tot heteropolymolybdeenblauw door de door koper gekatalyseerde oxidatie van aromatische aminozuren. De reacties resulteren in een sterke blauwe kleur, die mede afhankelijk is van het tyrosine- en tryptofaangehalte. De methode is gevoelig tot ongeveer 0,01 mg eiwit/ml en kan het beste worden gebruikt voor oplossingen met concentraties in het bereik van 0,01-1,0 mg/ml eiwit.

1. Complexvormend reagens : Bereid onmiddellijk voor gebruik door de volgende drie voorraadoplossingen A, B en C te mengen in de verhouding 100:1:1 (v:v:v), respectievelijk.
Oplossing A: 2% (m/v) Na2CO3 in gedestilleerd water.
Oplossing B: 1% (m/v) CuSO4·5H2O in gedestilleerd water.
Oplossing C: 2% (w/v) natriumkaliumtartraat in gedestilleerd water.
2. 2N NaOH .
3. Foline-reagens (commercieel beschikbaar). Verdun 1:2 in H2O voor gebruik.
4. normen : Gebruik een stamoplossing van standaard eiwit (bijv. runderserumalbumine fractie V) met 4 mg/mL eiwit in gedestilleerd water, bevroren bewaard bij -20 & degC. Bereid standaarden voor door de stamoplossing als volgt te verdunnen met gedestilleerd water:

voorraadoplossing,ul 0 1,25 2,5 6,25 12,5 25 62,5 125 250
water, ul 500 499 498 494 488 475 438 375 250
Prot.conc., ug/ml 0 10 20 50 100 200 500 1000 2000

1. Voeg aan 0,2 ml monster of standaard 1 ml vers gemengd complexvormend reagens toe. Laat de oplossing 10 min . op kamertemperatuur staan

2. Voeg 0,1 ml verdund Folin-reagens toe met behulp van een vortexmixer en laat het mengsel 30-60 min bij kamertemperatuur staan ​​(niet langer dan 60 min)

3. Lees de absorptie af bij 750 nm als de eiwitconcentratie lager was dan 500 ug/ml of bij 550 nm als de eiwitconcentratie tussen 100 en 2000 ug/ml was.

4. Teken een standaard absorptiecurve als functie van de initiële eiwitconcentratie en gebruik deze om de onbekende eiwitconcentraties te bepalen.

1. Indien het monster als neerslag beschikbaar is, los het neerslag dan op in 2N NaOH.

2. Peterson heeft een precipitatiestap beschreven die de scheiding van het eiwitmonster van storende stoffen mogelijk maakt en bijgevolg ook het eiwitmonster concentreert, waardoor de bepaling van eiwitten in verdunde oplossing mogelijk is. De neerslagstap van Peterson is als volgt:
A. Voeg 0,1 ml 0,15% deoxycholaat toe aan 1,0 ml eiwitmonster.
B. Vortex, en sta gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
C. Voeg 0,1 ml 72% TCA toe, vortex en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 10000 rpm.
NS. Schenk het supernatant af en los de pellet vervolgens op in 2N NaOH.

3. De reactie is erg pH-afhankelijk en het is daarom belangrijk om de pH tussen 10 en 10,5 te houden. Wees daarom voorzichtig bij het analyseren van monsters die zich in een sterke buffer buiten dit bereik bevinden.

4. De incubatietijd is niet kritisch en kan variëren van 10 minuten tot enkele uren zonder de uiteindelijke absorptie te beïnvloeden.

5. De Vortex-stap is van cruciaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. Het Folin-reagens is slechts korte tijd reactief onder deze alkalische omstandigheden, omdat het onstabiel is in alkali, en daarom moet er zorgvuldig op worden gelet dat het grondig wordt gemengd.

6. De test is niet lineair bij hogere concentraties. Zorg er daarom voor dat u uw monster analyseert op het lineaire gedeelte van de kalibratiecurve.

7. Bij elke groep testen is een set standaarden nodig, bij voorkeur in duplo. Dubbele of drievoudige onbekenden worden aanbevolen.

8. Een nadeel van de Lowry-methode is het feit dat een reeks stoffen deze test verstoren, waaronder buffers, medicijnen, nucleïnezuren en suikers. In veel gevallen kunnen de effecten van deze middelen worden geminimaliseerd door ze te verdunnen, ervan uitgaande dat de eiwitconcentratie voldoende hoog is om na verdunning nog te worden gedetecteerd. Als het gaat om storende verbindingen, is het natuurlijk belangrijk om een ​​geschikte blanco te gebruiken. Interferentie veroorzaakt door detergenten, sucrose en EDTA kan worden geëlimineerd door toevoeging van SDS. Het beste alternatief is in dit geval om Lowry-TCA (zie Protein Precipitation Protocols) of Peterson te doen.

9. Er zijn wijzigingen in deze basistest gemeld die de gevoeligheid van de reactie verhogen. Als het Folin-reagens in twee porties wordt toegevoegd, waarbij tussen elke toevoeging wordt gevortexd, wordt een toename van 20% in gevoeligheid bereikt. De toevoeging van dithiothreitol 3 min na de toevoeging van het Folin-reagens verhoogt de gevoeligheid met 50%.

10. De hoeveelheid kleur die in deze test wordt geproduceerd door een bepaald eiwit (of mengsel van eiwitten) is afhankelijk van de aminozuursamenstelling van het eiwit (de eiwitten) (zie Inleiding). Daarom kunnen twee verschillende eiwitten, elk bijvoorbeeld in concentraties van 1 mg/ml, in deze test verschillende kleuropbrengsten geven. Het moet daarom duidelijk zijn dat het gebruik van BSA (of welk ander eiwit dan ook) als standaard slechts een benaderende maatstaf geeft voor de eiwitconcentratie. De enige keer dat deze methode een absolute waarde voor eiwitconcentratie geeft, is wanneer het eiwit dat wordt geanalyseerd ook wordt gebruikt om de standaardcurve te construeren. De meest nauwkeurige manier om de concentratie van een eiwitoplossing te bepalen, is aminozuuranalyse.

Interfererende reagentia voor Lowry

Veel detergenten, ureum, guanidine HCl, hoog sucrose, ammoniumsulfaat, >0.1M TrisHCl, >1MNa-acetaat of Na-fosfaat, EDTA, reductiemiddelen, enz.


Probleem met ammoniumsulfaatprecipitatie - Wat moet ik doen? (17 april 2004 )

Probeer misschien een simpele gelfiltratie (maat) om je eiwit te zuiveren.

ik werk met een multidomein eiwit. het bindt niet aan enige affiniteits-, ionenuitwisselings- of hydrofobe kolom. dus ik probeerde ammoniumsulfaat pptn. na de precipitatie wordt het eiwit onoplosbaar en kan ik het in geen enkele buffer opnieuw suspenderen en oplosbaar maken. dit was zelfs het geval met een 10-15% ammoniumsulfaat.
dus ik ben overgestapt op zinksulfaat in plaats van ammoniumsulfaat. nu krijg ik dit eiwit alleen in oplosbare fractie als ik het veel verdun. als ik dit probeer te concentreren, slaat het weer neer.
als ik het eiwit nu op een gelfiltratiekolom plaats, komt het heel dicht bij het lege volume uit. en bovendien is deze fractie helemaal niet zuiver.
kan om het even welk lichaam zo vriendelijk voorstellen hoe dit eiwit te zuiveren?

Ammoniumsulfaat zou tot 4,1 M moeten oplossen, dus een oplossing van 4 M in gedestilleerd water zou geen probleem moeten zijn. Maar normaal gesproken gebruik je een verzadigde oplossing om te mengen met je eiwitoplossing, om een ​​gewenst ammoniumsulfaatpercentage te krijgen (dwz 1 volume verzadigd ammoniumsulfaat + 1 volume van je eiwitoplossing -> 50% ammoniumsulfaatprecipitatie)

Ik probeerde 4M ammoniumsulfaatoplossing te bereiden voor mijn neerslag. Ik voeg er water aan toe, maar het lost niet volledig op na urenlang roeren. Kan iemand helpen met het verstrekken van enkele details over het bereiden van een ammoniumsulfaatoplossing van 4M?

beste allemaal
Ik heb alfa-amylase-enzym geproduceerd met: Bacillus licheniformis
in een volume van 2 liter. Test op alfa-amylase-activiteit is gedaan en ik ben er zeker van dat het amylase-activiteit heeft.
Nu wil ik mijn enzym concentreren met ammoniumsulfaatprecipitatie en het vergelijken met ultrafiltratie, maar in drie tests die tot nu toe zijn gedaan, heb ik geen neerslag in 85% van de verzadiging en ook geen pellets verkregen.
zoals ik veronderstel dat ik ten minste 1 milliliter neerslagmiddel uit mijn 10-2o ml van mijn monster zou moeten hebben, maar helaas heb ik geen neerslagmiddel.
ik ben erg nerveus omdat ik mijn praktische werk tot twee maanden later zou moeten afronden. wat moet ik doen voor dit probleem. Wat stel jij voor ?
bij voorbaat dank

Wat weet jij over je eiwit? Kent u bijvoorbeeld de pI? Kun je je lysaat op een ionenuitwisselingskolom plaatsen? Dit zou je in staat moeten stellen om veel andere eiwitten kwijt te raken en je eiwit te concentreren.

Wat betreft Aparna, heb je ionenuitwisseling geprobeerd bij de "verkeerde" pH? Onthoud dat de berekende pI alleen theoretisch is. Je eiwit kan geladen pleisters hebben, wat betekent dat het contra-intuïtief werkt ten opzichte van wat 'de teksten' zeggen. Je zou ook milde reverse-phase chromatografie kunnen proberen.

ik werk met een multidomein eiwit. het bindt niet aan enige affiniteits-, ionenuitwisselings- of hydrofobe kolom. dus ik probeerde ammoniumsulfaat pptn. na de precipitatie wordt het eiwit onoplosbaar en ik ben niet in staat het in een buffer te resuspenderen en oplosbaar te maken. dit was zelfs het geval met een 10-15% ammoniumsulfaat.
dus ik ben overgestapt op zinksulfaat in plaats van ammoniumsulfaat. nu krijg ik dit eiwit alleen in oplosbare fractie als ik het veel verdun. als ik dit probeer te concentreren, slaat het weer neer.
als ik het eiwit nu op een gelfiltratiekolom plaats, komt het heel dicht bij het lege volume uit. en bovendien is deze fractie helemaal niet zuiver.
kan om het even welk lichaam zo vriendelijk voorstellen hoe dit eiwit te zuiveren?

Heb je aceton-precipitatie geprobeerd? Werkte prima voor mij.

1. Voeg 4 volumes ijskoude aceton toe
2. Incubeer gedurende 30 min op ijs of bij -20°C
3. Centrifugeer 10 min bij maximale snelheid in een tafelcentrifuge. Gooi het supernatant weg en laat de pellet aan de lucht drogen.
4. Optioneel: Was de pellet met 100 mikrol ijskoude ethanol en laat de pellet aan de lucht drogen
5. Resuspendeer de pellet in buffer voor stroomafwaartse toepassing.

kylvalda welke buffer moeten we aan het einde gebruiken, voor het opnieuw suspenderen van de laatste pellet voor de stroomafwaartse toepassing? (door acetonprecipitatie zoals u hebt voorgesteld), bedankt.

ik wil je gewoon vragen, hoe weet je dat ammoniumsulfaatprecipitatie zal werken voor eiwitten met een MW van meer dan 20 kDa?
heb je hier literatuur over?
dat zou me helpen, want ik werk met een enzym met een MW van 5-10 kDa.


Vraag: Gebaseerd op tabelgegevens voor LDH-zuivering door ammoniumsulfaatprecipitatie Vraag beantwoorden Activiteit Concentratie van onverdund extract (umol/min*mL) Totale activiteit (umol/min) Hart Ruw 36 5600 40% Pellet 120 2900 40% Supernatant 13 1700 70% Pellet 97 1500 70% supernatant 1.5 200 Er wordt verwacht dat LDH naar buiten zal komen in 70% ammoniumsulfaatpellet. .

Naar verwachting zal LDH uitkomen in 70% ammoniumsulfaatpellet. Alle fracties (supernatant en pellets) zullen worden geanalyseerd. • Het werkelijke punt waar LDH neerslaat, kan variëren afhankelijk van de eiwitconcentratie en temperatuur. Sommige aliquots worden ingevroren, maar bevries geen monsters voor enzymanalyse: bewaar ze bij 4°C. Fracties met grote hoeveelheden LDH-activiteit worden gecombineerd en in een dialysezak geplaatst nadat de ammoniumsulfaatprecipitatie is voltooid.

Herstelde u het grootste deel van uw LDH-activiteit in de verwachte zoutverlaging (70% pellet)?

Als dat zo is, kom dan met een logische conclusie over een fout die je zou hebben gemaakt als bleek dat je eiwit in de 70% supernatant was achtergebleven.

Zo niet, waar heb je dan het grootste deel van je LDH gevonden en ben je tot een logische conclusie gekomen over een fout die je in de loop van het experiment hebt gemaakt.


Discussie

GAD-activiteit in celvrije extracten van appelfruit werd gereguleerd door zowel pH als Ca2+ /CaM

GAD-enzymen zijn alomtegenwoordig in alle koninkrijken, en in planten kunnen zowel transcriptaccumulatie als activiteit worden geïnduceerd tijdens de ontwikkeling en als reactie op abiotische en biotische stressverstoringen [2, 4]. In planten die worden blootgesteld aan temperatuurstress, droogte, zoutgehalte of mechanische behandeling, is er een toename van de intracellulaire Ca 2+-concentratie [19], wat de stimulatie van GAD door Ca 2+ /CaM zou bevorderen, terwijl blootstelling aan verhoogde CO2, O2 deficiëntie en verwonding zouden de GAD-activiteit beïnvloeden door cytosolverzuring in tal van plantenweefsels en soorten [19, 20]. Aangezien is aangetoond dat GABA zich ophoopt in appelfruit tijdens opslag onder gecontroleerde atmosfeer, en dit niveau hoger is tijdens langdurige behandeling met verhoogde CO2[12-14], veronderstelden we dat de GAD-activiteit van appelfruit wordt gestimuleerd door cytosolverzuring en/of Ca 2+ /CaM. GAD-activiteit van celvrije extracten van appelfruit vertoonde optimale activiteit bij pH 5,5 in aanwezigheid van PLP en verzadigend glutamaat (Tabel 1) de uiteindelijke specifieke activiteit is vergelijkbaar met in vitro activiteiten van vegetatieve weefsels van petunia, sojabonen, Arabidopsis en Maritieme pijnboomzaailingen [1]. GAD-activiteit van appelfruit werd dramatischer gestimuleerd door Ca2+ /CaM bij bijna fysiologische pH dan bij zure pH (Tabel 1), wat aangeeft dat het gereguleerd kan worden in planta door zowel Ca2+/CaM als pH. Aangezien er geen effect was van de CaM-antagonist, TFP, op in vitro GAD-activiteit, wordt gesuggereerd dat GAD niet was gebonden aan endogeen CaM en dat de binding van Ca2+/CaM aan GAD strak wordt gecontroleerd door specifieke stressparameters in de gecontroleerde atmosfeer. Over het algemeen bieden de biochemische eigenschappen van GAD-activiteit in celvrije extracten van appelfruit ondersteuning voor het bestaan ​​van een Ca 2+ /CaM-gereguleerd GAD, zoals typisch is voor de meeste planten [1]. Met name drie homologe GAD genen (Aanvullend bestand 1: Figuur S1), aangeduid als MdGAD1, MdGAD2 en MdGAD3, waren aanwezig in de appelplant (Figuur 2). MdGAD1, Leuk vinden BijGAD2, was overvloedig en alomtegenwoordig, terwijl MdGAD2 en MdGAD3, Leuk vinden BijGAD3 en bijGAD4, werden uitgedrukt op veel lagere niveaus en kunnen kandidaten zijn voor inductie in fruit door de stress (d.w.z. koelen, O2 tekort en verhoogde CO2) opgelegd tijdens opslag onder gecontroleerde atmosfeer (Figuur 2) [2, 3].

Recombinante GAD's van appelfruit waren zowel CaM-afhankelijk als CaM-onafhankelijk

Met onze tagging/zuiveringsstrategieën konden we bevestigen dat recombinant BijGAD1 wordt geactiveerd bij fysiologische pH door Ca2+/CaM, ongeacht of de 6-His-tag werd behouden tijdens de bepaling van activiteit en spectrale eigenschappen (figuren 3 en 4). De mate van activering bleek echter het grootst te zijn met de recombinante vorm van het natieve eiwit, wat kon worden toegeschreven aan de zeer lage activiteit die werd gevonden in de afwezigheid van Ca2+/CaM. Hoewel deze interpretatie enigszins gecompliceerd wordt door de variabele hoeveelheid van een kleiner vervuilend eiwit, waarschijnlijk een afbraakproduct, in de uiteindelijke eiwitbereiding, suggereren deze bevindingen dat interpretatie van de impact van Ca2+/CaM op de conformatie en biologische activiteit van gelabelde recombinante planten-GAD's moeten met voorzichtigheid worden gedaan [11].

Hier werden His-getagde of niet-getagde versies van de drie appel-GAD's uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd tot homogeniteit of bijna homogeniteit (aanvullend bestand 2: figuur S2). De voorspelde subeenheid m R van de drie recombinante appeleiwitten (56,6-57 kDa) is vergelijkbaar met de meeste plantaardige GAD's, die bestaan ​​als hexameren van subeenheden van 43-62 kDa [1]. De recombinante appel-GAD's vertoonden een vergelijkbaar pH-profiel als getoond voor GAD-activiteit in de celvrije extracten van appelfruit (tabel 1, figuur 3), evenals een vergelijkbaar pH-optimum met de meeste planten-GAD's, en activiteiten met Ca2. + /CaM bij fysiologische pH die even hoog of hoger zijn dan hun maximale activiteiten in de literatuur [1]. In tegenstelling tot de meeste plantaardige GAD's, MdGAD3 werd niet geactiveerd door Ca2+/CaM bij bijna fysiologische pH's, hoewel de in deze studie gebruikte techniek/assay duidelijk een dergelijk verband kon aantonen (Tabel 1, Figuren 3 en 4). Historisch gezien werd de binding van CaM aan het geconserveerde C-terminale domein noodzakelijk geacht om auto-inhibitie van GAD bij fysiologische pH te verlichten [1]. Echter, OsGAD2 (Figuur 1) bleek CaM-onafhankelijk te zijn en een C-terminaal gebied te bezitten dat auto-remmend is [5]. MdGAD3 is pas het tweede gerapporteerde planten-GAD dat niet kan worden gezuiverd door CaM-affiniteitschromatografie en waarvan de activiteit en spectrale eigenschappen niet worden beïnvloed door Ca2+/CaM. Opmerkelijk, MdGAD3 is de eerste plant-GAD die een C-terminaal gebied bezit dat niet auto-remmend is (Figuur 3).

Uitlijning van het C-terminale gebied van MdGAD1 en MdGAD2 met biochemisch gekarakteriseerde plant-GAD's toonde aan dat de belangrijkste CaMBD-residuen geconserveerd zijn in de appel-enzymen, en dat deze afwezig zijn in OsGAD2 (Figuur 1). Het goed geconserveerde tryptofaan en een paar lysineresiduen aan het C-terminale uiteinde zijn cruciaal voor interacties met CaM en de vorming van oligomeren met hoog molecuulgewicht in PhGAD en BijGAD1 [9, 16, 21, 22]. In vergelijking met plantaardige GAD's waarvan bekend is dat ze worden gestimuleerd door Ca 2+ /CaM, MdGAD3 mist twee positief geladen flankerende gebieden (Lys474-Lys475 en Lys496-Lys497) en het Trp488-Lys489-Lys490-Phe491-Tyr492-motief (Figuur 1). Hun substitutie door niet-geconserveerde residuen kan het ontbreken van Ca2+/CaM-stimulatie van de recombinant verklaren MdGAD3. Interessant is dat bijna alle CaM-bindende residuen in GAD's van planten worden geconserveerd in MdGAD1 en MdGAD2 de belangrijkste uitzonderingen waarbij lading niet behouden blijft, zijn substituties bij Lys474 en Lys 490 in MdGAD1 en Lys497 in MdGAD2 (Figuur 1).


J64419 Ammoniumsulfaat, ultrazuiver, 99+%

Ammoniumsulfaat is een veelgebruikt reagens in de moleculaire biologie en chromatografie. Het is nuttig bij de isolatie en zuivering van enzymen en eiwitten. Het wordt gebruikt voor de precipitatie of fractionering van eiwitten of voor de zuivering van antilichamen. Het is ook nuttig voor kristallografische analyse van nucleïnezuren en eiwitten. Ammoniumsulfaat wordt ook veel gebruikt in HPLC van eiwitten, zoals bij hydrofobe interactiechromatografie. Ammoniumsulfaat wordt gebruikt in lange PCR-buffer, in PCR-lysisoplossing en in tweedestrengs-cDNA-synthese. Het wordt ook gebruikt voor de HPLC-analyse van fosfolipiden.

Имечания

Сылки а итературу

Gilad Haran. Rivka Cohen. Liliana K Bar. Yechezkel Barenholz. Transmembraan-ammoniumsulfaatgradiënten in liposomen produceren een efficiënte en stabiele insluiting van amfipathische zwakke basen. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranen. 1993, 1151 (2), 201-215.

Tage Astrup. Sten Müllertz. De fibrineplaatmethode voor het schatten van de fibrinolytische activiteit. Archieven van biochemie en biofysica. 1952, 40 (2), 346-351.

Азы опасности en предосторожности СГС

азы опасности (ЕС): H303

Kan schadelijk zijn bij inslikken.

едосторожности: P270-P301+P312-P403-P501c

Eet, drink of rook niet tijdens het gebruik van dit product. NA INSLIKKEN: Bel een ANTIGIFCENTRUM of een arts/arts als u zich onwel voelt. Op een goed geventileerde plaats bewaren. Inhoud/verpakking afvoeren naar een erkend afvalverwerkingsbedrijf


Discussie

Recente studies hebben aangetoond dat type III interferonen (IFN's) vergelijkbare biologische activiteiten hebben als type I IFN's. IFN-λ kan hepatitis B-replicatie in menselijke cellen remmen [13] en heeft een vergelijkbaar effect als IFN-α bij patiënten met het hepatitis C-virus (HCV) [14]. Type III IFN kan veel andere soorten virussen remmen, waaronder herpes simplex virus (HSV) [15] en cytomegalovirus (CMV) [16], vergelijkbaar met type I IFN. Type III IFN neemt ook deel aan de verworven immuunrespons [17] en kan kankercellen remmen met potentieel voor klinische toepassing [15].

IFN-λR1, een type III IFN dat strikt tot expressie wordt gebracht door bepaalde soorten epitheelcellen en specifieke subsets van immuuncellen, heeft een andere receptorsubeenheid dan zijn type I IFN-tegenhangers [18]. Dit betekent dat IFN-λ-therapie minder bijwerkingen kan veroorzaken dan IFN-α-therapie, die meestal ondraaglijke bijwerkingen veroorzaakt. Een HCV-therapiestudie gaf aan dat gepegyleerd IFN-λ1 vergelijkbare antivirale activiteit bezat als gepegyleerd IFN-α2b, maar met minder bijwerkingen [19]. Bovendien maakt het kenmerk van weefselbeperkte expressie van de IFN-λ-receptor IFN-λ1 een veelbelovende kandidaat voor klinische toepassing, vooral voor sommige ziekten van epitheelweefsel in de luchtwegen, het maagdarmkanaal en de voortplantingsorganen. Zo zijn er aanwijzingen dat het type III IFN-systeem een ​​belangrijke rol speelt bij de behandeling van astma [20].

Ons expressiesysteem in CHO-cellen bracht rhIFN-λ1 stabiel en continu tot expressie. Flp-In-CHO-cellen bevatten dezelfde chromosomale FRT-plaats als de vector, dus wanneer het recombinante pDF-IFN-λ1 en helperplasmide pOG44 worden gecotransfecteerd in Flp-In-CHO-cellen, kan het door pOG44 gecodeerde flp-recombinase homologe mediëren. recombinatie tussen het exogene gen en gastheer-DNA, wat resulteert in stabiele expressie. Hier werden ammoniumsulfaatprecipitatie en drie chromatografiestappen gebruikt om het doeleiwit te zuiveren omdat rhIFN-λ1 niet aan een tag was gefuseerd voor zuivering. Dit komt omdat geneesmiddelen met recombinant eiwit voor klinisch gebruik geen label mogen hebben. Het gezuiverde eiwit had een hoge antivirale activiteit. Bovendien biedt het CHO-expressiesysteem een ​​vergelijkbare post-translationele glycosylering als die gevonden op het endogene humane eiwit [21]. Deze resultaten leggen de basis voor de ontwikkeling van een rhIFN-λ1 die klinisch kan worden toegepast.


Bekijk de video: Uji coba Pupuk ZA Amunium Sulfat + Calnit Kalsium Nitrat Bisakah di Campur??? (Januari- 2022).