Informatie

6. 11: Microbiële groei in gemeenschappen - Biologie


6. 11: Microbiële groei in gemeenschappen

Op weg naar kwantitatief inzicht in de structuur en het functioneren van microbiële gemeenschappen: een modelgerichte benadering met als voorbeeld de afbraak van olielozingen in de zee

Moleculaire ecologiebenaderingen bevorderen snel onze inzichten in de micro-organismen die betrokken zijn bij de afbraak van olielozingen in de zee en hun metabolisch potentieel. Toch blijven er veel vragen open: hoe komen olie-afbrekende microbiële gemeenschappen samen in termen van functionele diversiteit, soortenrijkdom en organisatie en wat zijn de drijfveren? Hoe schalen de functionele eigenschappen van micro-organismen naar processen op ecosysteemniveau? Hoe stroomt massa tussen soorten, en welke factoren en soorten beheersen en reguleren fluxen, stabiliteit en andere ecosysteemfuncties? Zijn er generieke regels voor olieafbraak af te leiden en welke drijfveren liggen aan deze regels ten grondslag? Hoe kunnen we olie-afbrekende microbiële gemeenschappen zodanig ontwikkelen dat giftige polycyclische aromatische koolwaterstoffen sneller worden afgebroken? Dit soort vragen zijn van toepassing op het gebied van microbiële ecologie in het algemeen. We schetsen hoe recente ontwikkelingen in de systeembiologie van één soort kunnen worden uitgebreid om deze vragen te helpen beantwoorden. We stellen dat bottom-up mechanistische modellering het mogelijk maakt om de respectieve rollen en interacties tussen micro-organismen te ontcijferen. Met name op beperkingen gebaseerde, metagenoom afgeleide fluxbalansanalyse op gemeenschapsschaal lijkt geschikt voor dit doel, omdat het de mogelijkheid biedt om degradatiegerelateerde fluxen te berekenen op basis van fysiologische beperkingen en groeistrategieën, zonder dat gedetailleerde kinetische informatie nodig is. Vervolgens bespreken we wat nodig is om deze benaderingen succesvol te maken, en identificeren we de noodzaak om de microbiële fysiologie beter te begrijpen om de microbiële ecologie te bevorderen. Wij pleiten voor de ontwikkeling van databases met microbiële fysiologische gegevens. Het beantwoorden van de gestelde vragen is verre van triviaal. Olie-afbrekende gemeenschappen zijn echter een aantrekkelijke omgeving om te beginnen met het testen van uit systeembiologie afgeleide modellen en hypothesen, omdat ze relatief eenvoudig zijn in diversiteit en sleutelactiviteiten, waarbij verschillende belangrijke spelers geïsoleerd zijn en een hoge beschikbaarheid van experimentele gegevens en benaderingen.

trefwoorden: bottom-up modellering fluxbalansanalyse mariene olielozingen metagenomica microbiële gemeenschappen systeembiologie.


Aanpassing van microbiële bodemgemeenschappen aan temperatuur: vergelijking van schimmels en bacteriën in een laboratoriumexperiment

Temperatuur heeft niet alleen directe effecten op microbiële activiteit, maar kan ook indirect de activiteit beïnvloeden door de temperatuurafhankelijkheid van de gemeenschap te veranderen. Dit zou ertoe leiden dat gemeenschappen in de loop van de tijd beter gaan presteren als reactie op hogere temperaturen. We hebben voor het eerst het effect van bodemtemperatuur (5–50 °C) op de gemeenschapsadaptatie van zowel bacteriële (leucine-opname) als schimmelgroei (acetaat-in-ergosterol-opname) bestudeerd. De groei bij verschillende temperaturen werd geschat na ongeveer een maand met behulp van een kortetermijntest om te voorkomen dat de effecten van temperatuur op de beschikbaarheid van substraat worden verstoord. Voordat het experiment begon, was de groei van schimmels en bacteriën optimaal rond de 30°C. Het verhogen van de bodemtemperatuur daarboven resulteerde in een toename van het optimum voor bacteriegroei, gecorreleerd aan de bodemtemperatuur, met parallelle verschuivingen in de totale responscurve. Onder het optimum had de bodemtemperatuur slechts kleine effecten, hoewel lagere temperaturen werden geselecteerd voor gemeenschappen die beter groeiden bij de laagste temperatuur. Schimmels werden op dezelfde manier aangetast als bacteriën, met grote verschuivingen in temperatuurtolerantie bij bodemtemperaturen boven die van optimaal voor groei. Een vereenvoudigde techniek, waarbij alleen de groei bij twee contrasterende temperaturen werd vergeleken, gaf vergelijkbare resultaten als het gebruik van een volledige temperatuurcurve, waardoor grootschalige metingen ook in veldsituaties met kleine temperatuurverschillen mogelijk waren.


Resultaten

Inwonende microbiële gemeenschappen onderdrukten de groei van een focal E. coli deformatie

We hebben onze focus gecultiveerd E. coli stam in anaërobe microkosmos in aanwezigheid en afwezigheid van een antibioticum en drie verschillende monsters van gastro-intestinale microbiomen, elk van een andere menselijke donor, gedurende 7 dagen (S1 Fig). Gemiddeld verminderde antibioticabehandeling (ampicilline) de abundantie van de focale stam (effect van antibioticum in een gegeneraliseerd lineair gemengd model zonder inflatie, glmmadmb, χ 2 = 33.53, df = 1, P < 0,001 Afb. 1). Na 24 uur was bijvoorbeeld de overvloed aan focale stam verminderd in vergelijking met ampicilline-vrije behandelingen met 69% (SD = 6,02) in de basale mediumbehandeling, 78% -90% (afhankelijk van menselijke donor) in de gesteriliseerde slurrybehandelingen, en 84% -99,9% (afhankelijk van de menselijke donor) in de 'levende' slurrybehandelingen (Fig 1 S1-tabel). Opname van de residente microbiële gemeenschap van menselijke fecale monsters verminderde ook gemiddeld de hoeveelheid focale stam, wat we concludeerden door de gemeenschapsbehandelingen ('levende' fecale slurries, inclusief de residente microbiële gemeenschap) te vergelijken met de gemeenschapsvrije behandelingen (gesteriliseerde versies van hetzelfde fecale slurry-effect van gemeenschap in glmmadmb, χ 2 = 6,65, df = 1, P = 0,01 Afb. 1).

Elk paneel toont overvloed van de focal E. coli stam (in cfu per ml) gedurende 7 dagen voor ofwel basaal medium (bovenste rij) of met fecale slurry van een van de drie menselijke donoren, in afwezigheid (linkerpanelen) of aanwezigheid (rechterpanelen) van ampicilline, dat werd aangebracht op de bemonsteringstijdstippen na 2 uur en daarna bij elke dagelijkse overdracht. Lege symbolen tonen behandelingen zonder gemeenschap. gevulde symbolen tonen behandelingen met de inwonende microbiële gemeenschap. Rode symbolen tonen microkosmos waarin we ampicilline-resistente kolonie-isolaten van de focale stam hebben gedetecteerd. De drie lijnen, elk met verschillende symbolen, in elke behandeling tonen drie replica's van microkosmos. Microkosmos waarin we geen focale stamkolonies hebben gedetecteerd, worden weergegeven bij 10 0 . Gegevens worden gedeponeerd in de Dryad-repository: https://doi.org/10.5061/dryad.t1g1jwszq [40]. cfu, kolonievormende eenheden.

Het onderdrukkende effect van residente microbiële gemeenschappen hing af van welk menselijk donormonster werd gebruikt om de microkosmos voor te bereiden (donor × gemeenschapsinteractie in glmmadmb, χ 2 = 10.23, df = 2, P = 0,006) en de aanwezigheid van ampicilline (antibioticum × gemeenschapsinteractie in glmmadmb, χ 2 = 5,2, df = 1, P = 0,02), wat het sterkst is voor populaties die zijn blootgesteld aan zowel de lokale microbiota als het antibioticum (figuur 1). Dit resulteerde in het uitsterven van de focale stam (onder onze detectielimiet) in populaties die waren blootgesteld aan ampicilline en de residente microbiële gemeenschappen van menselijke donoren 1 en 3. Dat wil zeggen, bij deze behandelingen slaagde de focale stam er niet in de gemeenschap te koloniseren. Voor de residente gemeenschap van menselijke donor 2 werd de focale stam tot een zeer lage abundantie gedreven in aanwezigheid van de gemeenschap en ampicilline samen, maar verdween niet volledig (figuur 1). Bij afwezigheid van ampicilline onderdrukten de ingezeten gemeenschappen de focale stam nog steeds gemiddeld (effect van de gemeenschap in glmmadmb voor alleen ampicilline-vrije behandelingen, χ 2 = 10,04, df = 1, P = 0,002). Net als in de aanwezigheid van ampicilline, varieerde de sterkte van dit effect afhankelijk van de menselijke donor, en was het het sterkst voor de residente microbiële gemeenschap van menselijke donor 1 (effect van de gemeenschap voor deze donor in de afwezigheid van ampicilline: glmmadmb, χ 2 = 11,28, df = 1, P = 0,0002 Fig 1 en S1 tabel), wat resulteert in uitsluiting van de focale stam. De residente gemeenschap van menselijke donor 3 onderdrukte de gemiddelde groei van de focale stam met ongeveer 54% gedurende het hele experiment (effect van gemeenschap voor menselijke donor 3 in afwezigheid van ampicilline: glmmadmb, χ 2 = 4,77, df = 1, P = 0,03 Fig 1 en S1 Tabel). Voor de ingezeten gemeenschap van menselijke donor 2 was de gemiddelde hoeveelheid focale stam lager in aanwezigheid van de gemeenschap (gemiddelde vermindering van 24% vergeleken met gemeenschapsvrije microkosmos Fig 1 en S1 tabel), hoewel dit niet statistisch significant was (effect van gemeenschap voor menselijke donor 2 in afwezigheid van ampicilline: glmmadmb, χ 2 = 0,66, df = 1, P = 0,41). We vonden geen bewijs dat abiotische factoren in de steriele fecale slurry onderdrukkend waren voor de focale stam: er was geen significante variatie in de gemiddelde focale stam-abundantie tussen de gemeenschapsvrije behandelingen en de controlebehandeling die alleen het basale groeimedium bevatte dat werd gebruikt om fecale slurries bereiden (lineair mixed-effects-model, glmer: χ 2 = 0,41, df = 3, P = 0,94). Samenvattend, de residente microbiële gemeenschappen die werden bemonsterd van drie menselijke donoren, onderdrukten elk de groei van een focale E. coli stam in anaërobe fermentoren gevuld met fecale slurry, maar in verschillende mate, en dit effect werd versterkt door toevoeging van ampicilline.

Stabiele totale bacteriële abundantie maar variabele samenstelling van de gemeenschap in de loop van de tijd

We gebruikten flowcytometrie om de totale bacteriële abundantie te schatten in microkosmos die residente microbiële gemeenschappen bevatten. In antibioticavrije microkosmos was de totale hoeveelheid bacteriën in de loop van de tijd ongeveer stabiel (>109 cellen/ml Fig. 2) en was gemiddeld hoger dan in microkosmos die aan ampicilline waren blootgesteld (effect van antibioticum in een lineair model met gemengde effecten, lmm: χ 2 = 10,37, df = 1, P = 0,001). Het onderdrukkende effect van het antibioticum varieerde echter in de tijd (antibioticum × tijdinteractie in lmm: χ 2 = 101,81, df = 7, P < 0,001), die het sterkst was aan het begin van het experiment. Het effect van het antibioticum varieerde ook tussen gemeenschappen van verschillende menselijke donoren (antibioticum × donorinteractie in lmm: χ 2 = 79,30, df = 2, P < 0,001), waarbij die van menselijke donoren 1 en 2 een sterker herstel laten zien na de eerste toediening van ampicilline (wat resulteerde in een afname in overvloed na 24 uur) dan de gemeenschap van menselijke donor 3. Deze resultaten laten zien dat onze experimentele opstelling hoog bleef aantal micro-organismen in de gemeenschap behandelingen in de tijd in zowel de aanwezigheid als de afwezigheid van ampicilline.

Elke rij panelen toont gegevens van een van de drie menselijke donoren en de rechter/linker panelen tonen behandelingen met/zonder ampicilline. De drie gerepliceerde gemeenschappen in elk paneel worden weergegeven door drie verschillende lijnen, elk met een ander symbool. De totale hoeveelheid bacteriën werd gemeten met flowcytometrie (zie materiaal en methoden). Gegevens worden gedeponeerd in de Dryad-repository: https://doi.org/10.5061/dryad.t1g1jwszq [40].

Om de samenstelling van de gemeenschap in deze microkosmos te onderzoeken, gebruikten we amplicon-sequencing van de variabele regio's 3 en 4 van het 16S rRNA-gen. Dit onthulde vergelijkbare niveaus van diversiteit binnen het monster (Shannon's alfadiversiteit Fig 3A) in microbioommonsters van de drie menselijke donoren aan het begin van het experiment. De diversiteit binnen de steekproef nam vervolgens iets af gedurende de eerste 24 uur van het experiment en significant tussen 24 uur en 168 uur (tijdseffect in een lineair model met gemengde effecten inclusief gegevens van 24 uur en 168 uur, lme: F 1, 14 = 481.43, P < 0,001). Dit gold voor de drie menselijke donoren (effect van menselijke donor, lme: F 2, 15 = 2.07, P = 0,16), die in de loop van de tijd ook vergelijkbare verschuivingen in taxonomische samenstelling vertoonde (figuur 3B). Gemeenschappen om 0 uur werden gedomineerd door de families Lachnospiraceae en Ruminococcaceae, plus Prevotellaceae voor menselijke donor 3. Na verloop van tijd werden deze groepen minder overvloedig in vergelijking met Enterobacteriaceae en Bacteroidaceae. Analyse van de waarden toegewezen aan Enterobacteriaceae aangegeven E. coli was altijd het meest voorkomende lid van deze groep (zie Materiaal en methoden), goed voor ongeveer 99% van de 16S rRNA-amplicon-waarden die in alle monsters aan Enterobacteriaceae werden toegewezen (S2-tabel), terwijl de resterende ongeveer 1% andere soorten omvat (bijv. Enterobacter sp., Citrobacter sp., en Klebsiella sp.). Vergeleken met veranderingen in de tijd had ampicilline een zwak effect op de diversiteit binnen de steekproef (effect van antibioticum: F1,14 = 11.37, P = 0,006). Deze interpretatie werd ondersteund door een alternatieve analyse (hoofdcoördinaatanalyse [PCoA] S2 Fig) op basis van Bray-Curtis-verschillen. Dus, ondanks een ongeveer stabiele totale abundantie, zagen we in de loop van de tijd veranderingen in de samenstelling van de gemeenschap die meer uitgesproken waren dan verschillen tussen gemeenschappen van verschillende menselijke donoren of antibioticabehandelingen. Ondanks deze veranderingen in relatieve abundantie van verschillende taxa, waren de identiteiten van de top 5-6 families stabiel in de tijd en tussen menselijke donoren (figuur 3B).

(A) Diversiteit wordt hier geschat met behulp van Shannon's diversiteitsindex voor monsters van drie tijdstippen (0 uur, 24 uur en 168 uur, bovenaan weergegeven) en drie menselijke donoren (zie legende), in de aanwezigheid en afwezigheid van ampicilline (' Amp', x-as). Elke doos toont gegevens van drie replica-microkosmos per behandelingsgroep en tijdstip (behalve om 0 uur, dat het enkele initiële monster van elke menselijke donor toont). (B) relatieve overvloed van de 15 meest voorkomende bacteriële families in elke microkosmos op drie tijdstippen (0 uur, 24 uur en 168 uur, bovenaan weergegeven) voor elke menselijke donor (rijen panelen, rechts gelabeld) in aanwezigheid en afwezigheid van ampicilline (drie herhalingen van elke behandeling x-as). Superscript 'a' in de legende duidt op verplicht anaërobe families. De gegevens zijn gedeponeerd in het European Nucleotide Archive onder het studietoelatingsnummer PRJEB33429.

We gebruikten kwantitatieve PCR (qPCR) om de bijdrage van ingezetenen beter te begrijpen E. coli en de focale stam tot de totale overvloed aan E. coli (zie S1-methoden). In overeenstemming met de amplicon-sequencinggegevens, onthulde dit een toenemende totale abundantie van E. coli sequenties in de tijd in zowel de aanwezigheid als afwezigheid van ampicilline (S3 Fig). Het aantal kopieën van focal-strain-reeksen ten opzichte van het totaal E. coli gaf aan dat de focale spanning zeldzaam was in vergelijking met andere E. coli na 24 uur (S3 Fig en S2 Table). Aan het einde van het experiment, in overeenstemming met onze schattingen van selectieve uitplating en kolonie-PCR, was de focale stam onder de detectielimiet in behandelingen die de gemeenschap van menselijke donor 1, zowel met als zonder ampicilline, en de menselijke donor 3-gemeenschap met ampicilline bevatten bij de andere behandelingen waren focal-strain-sequenties zeldzaam in vergelijking met totaal E. coli (S2-tabel).

Antibioticaresistentie ontwikkelde zich alleen in afwezigheid van lokale microbiële gemeenschappen

We screenden op de opkomst van antibioticaresistente varianten van de focale stam (die resistent was geworden tegen ampicilline) na elke groeicyclus door elke populatie op antibiotica-selectieve platen uit te platen (8 g/ml ampicilline die de minimale remmende concentratie [MIC] van de focale spanning). We hebben nooit resistente varianten van de focale stam waargenomen in een van de gemeenschapsbehandelingen (populaties die zijn blootgesteld aan de residente microbiële gemeenschappen uit menselijke microbioommonsters). Daarentegen verschenen in gemeenschapsvrije behandelingen (basaal groeimedium en gesteriliseerde menselijke fecale slurries) resistente varianten tegen het einde van het experiment na 120 uur (slurry van menselijke donor 1) en 144 uur (basaal groeimedium en slurry van menselijke donor). 3), hoewel niet in gesteriliseerde monsters van menselijke donor 2 (Fig. 1). Zo onderdrukte de residente microbiële gemeenschap van menselijke microbioommonsters de evolutie van antibioticaresistentie in onze focale stam.

Om genetische mechanismen te onderzoeken die verband houden met resistentie-evolutie en algemene aanpassing aan onze experimentele omstandigheden, voerden we sequencing van het hele genoom uit voor twee sets focal-stam isolaten vanaf het laatste tijdstip: acht ampicilline-resistente kolonie-isolaten van ampicillineplaten (één van elk van de de acht populaties waarin we de opkomst van antibioticaresistentie hebben waargenomen tijdens het experiment) en 33 willekeurig geselecteerde kolonie-isolaten van ampicilline-vrije platen (elk uit een andere populatie en over alle behandelingen). In de antibioticaresistente isolaten waren alle SNP's en de deletie die we vonden (tabel 1) in genen gerelateerd aan membranen (ompR, ftsI, opgB), stressreacties (relA), of transcriptie (rpoC, rpoD). Twee genen werden onafhankelijk gemuteerd in isolaten van meerdere kolonies: rpoC en rpoD. We hebben ook een beweging van de insertiesequentie (IS) gedetecteerd tussen: perR en insN in twee kolonie-isolaten. Van genen waarin we mutaties hebben gedetecteerd in een enkel kolonie-isolaat, ftsI [41], relA [42], en ompR [43] zijn elk eerder geannoteerd als zijnde betrokken bij resistentie tegen bètalactamantibiotica. ompR werd ook gemuteerd in drie willekeurig geselecteerde kolonie-isolaten, allemaal van populaties die tijdens het experiment waren blootgesteld aan ampicilline (S3-tabel). We vonden zes andere genen die parallel waren gemuteerd tussen twee en vijf willekeurig geselecteerde kolonie-isolaten (S3-tabel). Vijf hiervan waren gemuteerd in isolaten van zowel antibiotica als antibioticavrije behandelingen. Dit was inclusief insN en gtrS, beide gemuteerd in vijf isolaten. Over de twee sets kolonie-isolaten (willekeurig geselecteerd en antibioticaresistent) waren drie andere loci gemuteerd in beide sets. Deze waren rpoD (alleen bij isolaten die waren blootgesteld aan antibiotica), opgB, en yaiO (zowel in isolaten van antibiotica en antibioticavrije behandelingen). Samenvattend vonden we enkele parallelle genetische veranderingen die specifiek zijn voor antibioticabehandelingen en consistent zijn met bekende resistentiemechanismen, plus andere genetische veranderingen die zich voordeden tijdens antibiotica en antibioticavrije behandelingen en die daarom waarschijnlijker betrokken zijn bij algemene aanpassing.

De gegevens zijn gedeponeerd in het European Nucleotide Archive onder het onderzoeksinschrijvingsnummer PRJEB36309.

Plasmide-acquisitie werd beperkt door een gebrek aan overdracht, niet door een gebrek aan fitnessvoordelen

Vervolgens probeerden we uit te leggen waarom we nooit de evolutie van antibioticaresistentie van de focale stam hebben waargenomen in de aanwezigheid van residente microbiële gemeenschappen, waarvan we hadden verwacht dat ze gunstige resistentiegenen bevatten [26,27,44-46]. We veronderstelden dat dit te wijten zou kunnen zijn aan een gebrek aan horizontaal overdraagbare resistentiegenen in de aanwezige microbiële gemeenschappen. We ontdekten echter ampicilline-resistent E. coli in de residente microbiële gemeenschappen van menselijke donoren 1 en 3 (door selectieve uitplating), en na het sequencen van hun genomen, identificeerden we verschillende antibioticaresistentiegenen die waren geassocieerd met plasmidegenen (Fig 4 en S4-tabel). In de hybride assemblage (met behulp van MinION- en Illumina-lezingen) van een representatief isolaat van menselijke donor 1 identificeerden we twee plasmiden. Het grotere plasmide had vier bekende resistentiegenen (Fig. 4A), waaronder één die resistentie verleent tegen bètalactamantibiotica. We identificeerden ook drie IncF-replicons op dit plasmide en een complete set van vervoer genen die betrokken zijn bij de overdracht van conjugatieve plasmiden. Het tweede plasmide droeg een bekend replicon (ColRNAI) en mobilisatiegenen (mbeA en mbeC), plus een compleet colicine E1-operon (cnl, imm, cea). Voor een representatief isolaat van menselijke donor 3 vonden we het plasmide-replicon en resistentiegenen geïntegreerd op het chromosoom (Fig 4B). Dit vermeende geïntegreerde plasmide van menselijke donor 3 droeg ook meerdere resistentiegenen, waaronder een bètalactamase en een IncQ-replicon, dat deel uitmaakt van de repA gen [47], maar we ontdekten geen vervoer genen. De andere vijf genoomassemblages (Illumina leest voor andere isolaten van dezelfde menselijke donor) bevatten dezelfde resistentiegenen en replicons over meerdere kleinere contigs (S4-tabel). Het in kaart brengen van de corresponderende sequencing-uitlezingen van alle Illumina-gesequentieerde isolaten aan de langgelezen data-enkele contig gevonden in de isolaten waarvan de sequentie op het MinION-platform is gesequenced, onthulde in alle 10 gevallen identieke toewijzing, consistent met deze genomen met dezelfde structuur voor elk van de isolaten ( S4-tabel).

Schematische kaarten van plasmiden en chromosomen voor representatieve resident E. coli isolaten van (A) menselijke donor 1 en (B) menselijke donor 3. Sequenties zijn geannoteerd met bekende plasmide-repliconsequenties (IncFIA, IncFIB, IncFIC op plasmide 1 en ColRNAI op plasmide 2 in [A] IncQ op het chromosoom in [B]), genen die betrokken zijn bij horizontale overdracht (vervoer en trb), bekende resistentiegenen (blaTEM, sul2, aph(3), aph(6), mdf), genen die betrokken zijn bij type VI-secretiesystemen (tss, vgrG), en genen die betrokken zijn bij de productie en immuniteit van colicine (cea, cnl, imm) en mobilisatie (mbeA en mbeC). Het genoom van het isolaat van menselijke donor 3 (B) is niet gesloten, zoals aangegeven met een gat. Kleuren geven coderende (zwart) en niet-coderende gebieden (groen) aan. Let op: de schaal varieert tussen chromosomen en plasmiden.

We veronderstelden dat het gebrek aan door plasmiden gestuurde resistentie-evolutie in onze focale stam zou kunnen zijn veroorzaakt door beperkingen op conjugatieve overdracht die deze plasmiden ontoegankelijk maakten. Met behulp van een conjugatieve paringstest op agar hebben we nooit transconjuganten van onze focale stam gevonden wanneer deze werd gemengd met een isolaat van menselijke donor 3 (hierboven geïdentificeerd als drager van een vermeend geïntegreerd plasmide). Dit komt overeen met het ontbreken van vervoer genen op dit plasmide en suggereert dat het niet door conjugatie in onze focale stam kon worden overgedragen in afwezigheid van andere aanjagers van horizontale genoverdracht (bijvoorbeeld fagen of andere plasmiden). Dit is ook consistent met eerder werk dat suggereert dat IncQ-plasmiden mobiliseerbaar zijn in plaats van conjugatief [48,49] en dat we geen andere plasmide-replicons in dezelfde isolaten hebben gedetecteerd. Voor het plasmide van menselijke donor 1 vonden we echter transconjuganten van onze focale stam aan het einde van de paringstest, die we bevestigden door kolonie-PCR (S4 Fig). Dit suggereert dat dit plasmide conjugatief was en kon worden overgebracht naar onze focale stam, consistent met de aanwezigheid van vervoer genen op dit plasmide (Fig 4A).

Gezien het feit dat het resistentieplasmide van menselijke donor 1 overdraagbaar was in onze focale stam, waarom verspreidde het zich dan niet in het hoofdexperiment hierboven? We veronderstelden dat dit het gevolg zou kunnen zijn van door plasmiden overgedragen resistentie die minder gunstig is dan resistentie verkregen door chromosomale mutatie (zoals we hebben waargenomen bij gemeenschapsvrije behandelingen in het hoofdexperiment). We zouden verwachten dat een nettovoordeel van resistentie resulteert in een verhoogde populatiegroei bij de antibioticumconcentratie die tijdens het experiment werd toegepast (7,2 g/ml). We ontdekten dat verwerving van het plasmide een veel grotere toename van de populatiegroei opleverde over alle antibiotische concentraties die niet nul waren dan die waargenomen voor geëvolueerde kolonie-isolaten die resistentie hadden verkregen via chromosomale mutatie tijdens het hoofdexperiment (Fig 5A en S5-tabel). Bovendien had in paarsgewijze competitie-experimenten het transconjugant dat dit plasmide droeg een sterk concurrentievoordeel ten opzichte van het wildtype in aanwezigheid van de residente microbiële gemeenschap van menselijke donor 1 (S5A Fig). Dit fitnessvoordeel werd vergroot door ampicilline toe te voegen in de concentratie die we in het hoofdexperiment gebruikten en nog verder door ampicilline toe te voegen aan driemaal de IC90 (concentratie vereist om de groei met 90% te verminderen) van de voorouderlijke focale stam (gemeenschap × ampicilline-interactie door permutatie toets P = 0,029 S5B Afb). Dit toont aan dat het zeer gunstig zou zijn geweest voor de focale stam om het plasmide in ons experiment te verwerven, vooral in de aanwezigheid van ampicilline.

(A) Antibioticagevoeligheid van de voorouderlijke focale stam, de versie van de focale stam die wordt gebruikt om transconjuganten te isoleren (zie Materiaal en methoden), de focale stam met het plasmide (transconjugant), de resident E. coli isolaat gebruikt als de plasmidedonor, en acht geëvolueerde focal-strain kolonie-isolaten die we op ampicilline ('amp') platen hebben geïsoleerd en die chromosomale mutaties hadden (S2-tabel). Gemiddelde OD-waarden ± SE worden getoond na 24-uurs groei bij elke ampicillineconcentratie. (B) Transconjugante frequentie (als percentage van de totale populatie van de ontvanger) na paringsexperimenten in verschillende omstandigheden. De ontvangende stam was een getagde versie van de voorouderlijke focale stam en de plasmidedonor was een resident E. coli isolaat van menselijke donor 1. Voor de behandeling van fecale slurry gebruikten we gesteriliseerde fecale slurry van menselijke donor 1. De gegevens zijn gedeponeerd in de Dryad-repository: https://doi.org/10.5061/dryad.t1g1jwszq [40]. LB, lysogeny bouillon OD, optische dichtheid rep, repliceren populatie.

In tegenstelling tot transconjuganten die het plasmide van resident . dragen E. coli, hadden twee geëvolueerde kolonie-isolaten van de focale stam die chromosomale resistentiemutaties droeg een fitnessvoordeel ten opzichte van het wildtype alleen in afwezigheid van de gemeenschap in aanwezigheid van de aanwezige microbiële gemeenschap, ze hadden een fitnessnadeel (effect van gemeenschap door permutatietest : P < 0,001 voor isolaten van menselijke donoren 1 en 3 S5B Fig). Dit suggereert dat de genetische veranderingen die gepaard gaan met verhoogde resistentie in deze isolaten bij afwezigheid van residente microbiota niet gunstig zouden zijn geweest in de Community + Ampicilline-behandelingen van het hoofdexperiment, in tegenstelling tot het plasmide dat we hebben geïsoleerd uit residente microbiota E. coli. Deze conclusie werd ondersteund door het vergelijken van transconjuganten die het resistentieplasmide dragen en geëvolueerde kolonie-isolaten van menselijke donoren 1 en 3 (S6 Fig). Verdere concurrentie-experimenten toonden het concurrentievoordeel van resident E. coli van menselijke donoren 1 en 3 die resistentiegenen dragen, was ook aanwezig in afwezigheid van andere residente microbiota (S7 Fig).

Een andere mogelijke verklaring voor het ontbreken van overdracht van het resistentieplasmide van menselijke donor 1 in het hoofdexperiment is dat conjugatieve overdracht specifiek kan zijn voor bepaalde omgevingscondities. Dit is waargenomen voor andere plasmiden in verschillende experimentele omstandigheden [50,51]. We hebben dit getest door middel van paringsassays zoals hierboven, maar in een reeks verschillende experimentele omstandigheden. We detecteerden transconjuganten die het plasmide hadden verworven met een uiteindelijke frequentie van ongeveer 0,2% (als een fractie van de totale populatie van de ontvangers) na het mengen van het plasmidedragende isolaat van menselijke donor 1 en de focale stam op een agaroppervlak, maar we vonden geen transconjuganten na het uitvoeren van hetzelfde experiment in drie verschillende soorten vloeibaar groeimedium (lysogeniebouillon [LB], anaërobe LB en anaërobe gemeenschapsvrije fecale slurry Fig 5B). Dit toont aan dat de overdracht van het conjugatieve plasmide dat we uit menselijke donor 1 hebben geïsoleerd, bepaalde abiotische omstandigheden vereist, wat kan verklaren waarom onze focale stam er niet in slaagde resistentie te ontwikkelen via horizontale genoverdracht in aanwezigheid van microbiële gemeenschappen. Dit werd ondersteund door simulaties van een hypothetisch plasmide met vergelijkbare eigenschappen, maar dat overdraagbaar is in ons darmmicrokosmossysteem (S1-model). Dit gaf aan dat, als het plasmide van menselijke donor 1 conjugatief overdraagbaar was geweest in ons darmmicrokosmossysteem, we transconjuganten zouden hebben gedetecteerd in ons hoofdexperiment (hoewel alleen met relatief hoge overdrachtssnelheden S1-model). Hetzelfde model toonde ook aan dat onderdrukking van de groei van binnendringende geslachten door residente microbiota de transconjugante abundantie kan verminderen, wat suggereert dat zelfs wanneer horizontale verwerving van gunstige resistentiegenen gebruikelijk is, interacties met residente microbiota hun verspreiding kunnen belemmeren.


Plantengenotype wijzigt sterk de structuur en groei van microbiële gemeenschappen in de rhizosfeer van maïs

We bestudeerden de microbiële gemeenschappen in maïs (Zea mays) rhizosfeer om te bepalen in hoeverre hun structuur, biomassa, activiteit en groei werden beïnvloed door het plantengenotype (su1 en sh2 genen) en het toevoegen van standaard en hoge doseringen van verschillende soorten meststoffen (anorganische, ruwe mest en vermicompost). Voor dit doel hebben we de rhizosfeer van maïsplanten bij de oogst bemonsterd en de microbiële gemeenschapsstructuur (PLFA-analyse) en activiteit (basale ademhaling en bacteriële en schimmelgroeisnelheden) geanalyseerd. Discriminerende analyse onderscheidde duidelijk de microbiële gemeenschappen van de rhizosfeer in relatie tot het plantengenotype. Hoewel micro-organismen duidelijk reageerden op de dosis bemesting, droegen de drie meststoffen ook bij aan het differentiëren van microbiële gemeenschappen in de rhizosfeer. Bovendien bevorderden grotere planten geen hogere biomassa- of microbiële groeisnelheden, wat wijst op complexe interacties tussen planten en meststoffen, waarschijnlijk als gevolg van de verschillende prestaties van plantgenotypes binnen mestbehandelingen, d.w.z. verschillen in de kwaliteit en/of samenstelling van wortelexudaten.

Onderzoekshoogtepunten

► Structuur van rhizosfeer-maïsmicrobiële gemeenschappen waren afhankelijk van het plantengenotype. ► Rhizosfeer microbiële gemeenschappen verschilden onder organische en anorganische bemesting. ► Interacties tussen plantengenotype en meststoffen bepalen rhizosfeermicro-organismen.


Ethische verklaringen

Concurrerende belangen

JIG is mede-oprichter van Matatu, een bedrijf dat de rol van interacties tussen voeding per microbiota in de diergezondheid karakteriseert. Na afronding van zijn promotieonderzoek heeft M.R.C. sloot zich aan bij Matatu als onderzoekswetenschapper. CBL en D.A.M. zijn mede-oprichters van Evolve Biosystems, een bedrijf dat zich richt op de op voeding gebaseerde manipulatie van de darmmicrobiota. DAR is lid van de wetenschappelijke adviesraad van Seres Health. L.V.B. en D.B.D. verklaren geen concurrerende financiële belangen.


Veranderingen in koolstof- en stikstofeigenschappen in de bodem en microbiële gemeenschappen in relatie tot de groei van Pinus radiata en Nothofagus fusca bomen na 6 jaar bij omgevings- en verhoogde atmosferische CO2

1 Huidig ​​adres: Department of Forest Sciences, University of British Columbia, 2424 Main Mall, Vancouver, BC, Canada V6T 1Z4.

Landcare Research, PO Box 40, Lincoln 7640, Nieuw-Zeeland

Landcare Research, Private Bag 11052, Palmerston North, Nieuw-Zeeland,

Macaulay Institute, Craigiebuckler, Aberdeen AB15 8QH, VK,

1 Huidig ​​adres: Department of Forest Sciences, University of British Columbia, 2424 Main Mall, Vancouver, BC, Canada V6T 1Z4.

Landcare Research, PO Box 40, Lincoln 7640, Nieuw-Zeeland

Abstract

Toenemende atmosferische CO2 concentratie kan de groei en chemische samenstelling van veel plantensoorten beïnvloeden, en daardoor van invloed zijn op de bodem met organische stof en de nutriëntenfluxen. Hier onderzoeken we de effecten van ambient (aanvankelijk 362 L L −1) en verhoogde (654 μL L −1) CO2 in open kamers op de groei na 6 jaar van twee gematigde groenblijvende bossoorten: een exotische, Pinus radiata D. Don, en een inboorling, Nothofagus fusca (Haak. F.) Oerst. (rode beuk). We onderzoeken ook de bijbehorende effecten op geselecteerde koolstof (C) en stikstof (N) eigenschappen in strooisel en minerale bodem, en op microbiële eigenschappen in rhizosfeer en hyposfeer. De grond was een zwak ontwikkeld zand met een lage initiële C-concentratie van ongeveer 1,0 g kg −1 op zowel 0-100 als 100-300 mm diepte in de N. fusca systeem, werd het aanvankelijk bedekt met ongeveer 50 mm strooisel op de bosbodem (voornamelijk FH-materiaal) afkomstig van een Nothofagus Woud. Een meststof met langzame afgifte werd toegevoegd tijdens de vroege stadia van de plantengroei, daaropvolgende bladanalyses gaven aan dat N niet beperkend was. Na 6 jaar waren de stengeldiameters, de N-concentraties in het blad en de C/N-verhoudingen van beide soorten niet meer van elkaar te onderscheiden (P>0.10) in de twee CO2 behandelingen. Hoewel het totale C-gehalte in minerale bodem op 0-100 mm diepte significant was toegenomen (P<0.001) na 6 jaar groei van P. radiata, met een gemiddelde van 80±0,20 g m −2 jaar −1, werden ze niet significant beïnvloed door verhoogde CO2. Echter, CO2-C productie in zwerfvuil, en CO2-C productie, microbiële C, en microbiële C/N verhoudingen in minerale bodem (0-100 mm diepte) onder P. radiata waren significant hoger onder verhoogde dan omgevings-CO2. CO2-C productie, microbiële C en aantallen bacteriën (maar geen schimmels) waren ook significant hoger bij verhoogde CO2 in hyposfeergrond, maar niet in rhizosfeergrond. Onder N. fusca, was er waarschijnlijk enige inmenging van het bedekte strooisel in de minerale grond opgetreden, behalve voor CO2-C production and microbial C in hyphosphere soil, none of the biochemical properties or microbial counts increased significantly under elevated CO2. Net mineral-N production, and generally the potential utilization of different substrates by microbial communities, were not significantly influenced by elevated CO2 under either tree species. Physiological profiles of the microbial communities did, however, differ significantly between rhizosphere and hyphosphere samples and between samples under P. radiata en N. fusca. Overall, results support the concept that a major effect on soil properties after prolonged exposure of trees to elevated CO2 is an increase in the amounts, and mineralization rate, of labile organic components.


Synthetic microbial communities ☆

Microbial interactions and system function are two ways to study communities.

Natural microbial communities are difficult to define and to study.

Synthetic microbial communities are comprehensible systems of reduced complexity.

Synthetic communities keep key features of natural ones and are amenable to modelling.

Synthetic microbial communities are gaining importance in biotechnology.

While natural microbial communities are composed of a mix of microbes with often unknown functions, the construction of synthetic microbial communities allows for the generation of defined systems with reduced complexity. Used in a top-down approach, synthetic communities serve as model systems to ask questions about the performance and stability of microbial communities. In a second, bottom-up approach, synthetic microbial communities are used to study which conditions are necessary to generate interaction patterns like symbiosis or competition, and how higher order community structure can emerge from these. Besides their obvious value as model systems to understand the structure, function and evolution of microbial communities as complex dynamical systems, synthetic communities can also open up new avenues for biotechnological applications.

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.


Conclusie

A number of pure-culture studies have shown a correlation between growth rate and rRNA concentration. This relationship makes intuitive and biological sense, since rRNA is a critical component of ribosomes, and ribosomes are necessary to synthesize protein. However, the correlation between real-time activity and rRNA in environmental samples is inconsistent due to differences in life histories, life strategies and non-growth activities. Using rRNA analysis as a general indicator of currently active microbes in environmental samples is not valid under many circumstances, and may actually hinder progress connecting microbial activities to ecosystem functions. Considering rRNA measurements as indicators of protein synthesis potential provides microbial ecologists with a robust framework, facilitating a more prudent yet comprehensive understanding of the complex dynamics at play in microbial communities.


Balance between growth and adaptability shapes microbial success, evolution

Krediet: CC0 Publiek Domein

One of the foremost challenges in biology is the quest to uncover the underlying rules that determine how biological organisms behave in different situations. Even seemingly simple questions, such as why bacteria grow at a certain rate and why there is a tremendous variation in growth rate across species in different environments, have remained unclear.

A new study published in Natuur in July by scientists from Harvard Medical School, ETH Zurich and the University of California, San Diego now sheds light on these long-standing mysteries.

Their findings reveal that the success and evolution of microbes in different ecosystems are shaped by a fundamental trade-off between two traits: rate of growth under constant environments and the ability to adapt to changing environments.

The researchers found that bacteria growing exceptionally fast struggled as environmental conditions changed, experiencing lag time in which they were unable to grow for many hours and only eventually adapted. In comparison, when the same bacteria grew slowly, they quickly adapted to changing conditions.

"Bacteria cannot simultaneously excel at growing fast and at switching quickly between conditions when the environment suddenly changes," said study lead author Markus Basan, assistant professor of systems biology in the Blavatnik Institute at HMS.

The results may explain why microbes such as E. coli grow at vastly different rates in different environments, often much more slowly than would be expected, the authors said.

"As an analogy, one can think of a person training to become an elite long-distance runner and also an elite weight lifter at the same time," Basan added. "The weight of the muscle mass required to excel at weightlifting will undoubtedly hamper the ability of energy efficient long-distance running, at least to some degree. This is what constitutes a trade-off."

Strikingly, this effect was not specific to a few isolated conditions. In E. Coli, the team found that this trade-off is conserved across dozens of growth conditions, involving different nutrients and changing environments. They also observed the same trade-off in different microbial species separated by millions of years of evolution, including single-celled eukaryotes, all described by the same mathematical equation.

The team's experiments suggest the observed universality of the trade-off between growth and adaptability is because it emerges directly from metabolic mechanisms that are fundamental to life on earth.

The element carbon is a primary component of much of the material that makes up every living cell, such as proteins. Through diet, animals can acquire preformed building blocks like amino acids that comprise proteins. Bacteria, on the other hand, are able to convert a single source of carbon, such as a sugar, into all carbon-based building blocks using biochemistry.

However, the metabolic reactions that bacteria use to convert different sugars into biomolecules can move in opposing directions. For example, when E. coli breaks down glucose, the bacteria's carbon source of choice, they produce a molecule called acetate, which is its primary fermentation product. Under certain conditions, such as when glucose runs dry, the opposite reaction can occur, and acetate can be used for growth.

Therefore, when a preferred carbon source like glucose is depleted, bacteria must transition from one reaction direction to the opposite direction. This can wreak havoc on its metabolism, especially if the bacteria were growing quickly before the transition.

To support high growth rates, bacteria must contain a large number of enzymes that facilitate reactions in one direction. As a result, if the environment changes suddenly, only a small number of enzymes are present that can facilitate reactions in the new, correct direction. Even worse, the bacteria still contain a large number of enzymes running the reaction in the wrong direction, which actually burns energy.

"This leaves the cell trapped in a terrible situation, where most of its own enzymes are suddenly working in the wrong direction, preventing the enzymes operating in the correct direction from being produced," Basan said. "It resembles the task of Sisyphus, where despite a lot of effort the metabolites are just not getting anywhere."

After uncovering this underlying problem, the researchers were able to formulate a theoretical model that precisely captures the mathematical relationship of the trade-off between the rate of growth and the rate of adaptability. The model also made a number of precise quantitative predictions of genetic changes that affect the trade-off, which were validated experimentally.

The trade-off uncovered in this study potentially explains why microbes grow at different rates in different environments, sometimes much more slowly than expected based on other experimental evidence such as protein composition, Basan said.

Slower-than-expected growth was thought to be due to poor-quality nutrients, but the new findings suggest that it may instead arise because some nutrients signal unstable, highly fluctuating ecological environments to the microbe, where a more careful growth strategy is advantageous.

This is illustrated by a number of simple mutations in the E. coli genome that allow for much faster growth in specific conditions but also cause deficiency in adaptability.

"The study illustrates how hard-wired trade-offs between competing objectives may have shaped microbial evolution and the phenotypes that we see in different bacterial species today," Basan said. "Understanding such trade-offs gives us a rare glimpse into the complex ecological choices made by different bacterial species and helps us model these choices in a quantitative and predictive way."

The trade-off between fast growth and adaptability uncovered in this work, may help to understand the interactions in complex microbial communities like in the microbiota.

"Such trade-offs can give rise to the coexistence of bacteria with different strategies in the same ecological niche," Basan said.

Because central metabolism is highly conserved between species from bacteria to humans, a better understanding of central metabolism and its intrinsic limitations may help to understand complex human diseases.

Mathematical models that can quantitatively predict the behavior of complex biological systems like one developed in this work can also have practical relevance for synthetic biology and bioengineering applications, the authors said.

"Hopefully, quantitative and predictive models can someday transform the process for building things in biology from tedious trial and error to something more like a modern engineering discipline," Basan said. "For example, it's pretty useful for engineers to be able to calculate that something like the Golden Gate Bridge is not going to collapse, without needing build it first to try it out."


Bekijk de video: MICROORGANISMS Size Comparison - 3D (December 2021).