Informatie

Wat is de staat van geautomatiseerde kwantitatieve analyse?


Kwantitatieve analyse van microscoopbeelden is essentieel voor veel soorten onderzoeken, maar de meest gebruikte technieken zijn erg arbeidsintensief. Ik heb wel wat literatuur kunnen vinden over het gebruik van computers om de analyse uit te voeren, maar heb geen goed beeld van de stand van de techniek.

  • Is er een goede literatuurstudie over het onderwerp?

  • Is er veel nut in de praktijk wat ik nog niet heb gezien?


Nature Methods lijkt nogal wat methoden te publiceren die dit soort analyse mogelijk maken. bijv. http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n3/full/nmeth.1558.html

En een redactioneel commentaar van hen: http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n7/full/nmeth.2102.html Als onderdeel van een speciale uitgave over BioImage Informatics met enkele mooie voorbeelden. http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n7/index.html


Het woord om naar te zoeken is 'Afbeeldingssegmentatie'. Maar ook hier hangt het er heel erg vanaf waar je naar kijkt. Segmentatie en kwantificering van eenvoudige fluorescentiebeelden is relatief eenvoudig en wordt veel gebruikt. Het kan erg complex worden, afhankelijk van hoe complex de structuur is waar je naar kijkt. Er zijn machine learning-benaderingen die ingewikkelde structuren van elkaar kunnen onderscheiden, zoals verschillende mitosetoestanden.

Het segmenteren van met hematoxyline-eosine (HE) gekleurde specimens is onderwerp van intensief bio-informatisch onderzoek. Een doel is om pathologen te helpen bij het beoordelen van weefsellaesies, zoals bij prostaatkanker, maar dit is voor zover ik weet nog niet klinisch gebruikt. Hele dia-scans van histologische monsters worden steeds vaker klinisch gebruikt. Deze afbeeldingen zijn erg groot (1 GB per exemplaar), dus een onderzoeksfocus is ook om een ​​grootschalige analyse van deze hele dia-scans te bieden.

Kijk ook eens naar CellProfiler (http://www.cellprofiler.org), deze gratis open-source software heeft mijn PhD-project gered.

Literatuur die ik heb gevonden:

Tabesh, A., M. Teverovskiy, et al. (2007). "Multifunctionele diagnose van prostaatkanker en Gleason-classificatie van histologische beelden." IEEE Trans Med Imaging 26(10): 1366-1378.

Petushi, S., F.U. Garcia, et al. (2006). "Grootschalige berekeningen op histologische beelden onthullen graduele differentiërende parameters voor borstkanker." BMC Med Imaging 6: 14. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1634843/

Ik kan je echter geen recente recensie geven...


Een geautomatiseerd systeem voor kwantitatieve analyse van de voortbeweging van Drosophila-larven

Drosophila larven zijn gebruikt als een model om te bestuderen naar genetische en cellulaire circuits die gedrag moduleren. Een van de uitdagingen bij gedragsstudies is de kwantificering van complexe fenotypes zoals locomotiefgedrag. Experimentele mogelijkheden kunnen aanzienlijk worden verbeterd door een automatische tracker voor één dier die een dier gedurende een langere periode met een hoge resolutie registreert en meerdere gedragsparameters analyseert.

Resultaten

Hier presenteren we MaggotTracker, een volgsysteem voor één dier voor: Drosophila analyse van de voortbeweging van larven. Dit systeem bestuurt de gemotoriseerde microscooptafel tijdens het maken van een video, zodat het dier in het kijkcentrum blijft. Vervolgens reduceert het het dier tot 13 gelijkmatig verdeelde punten langs de middellijn en berekent het meer dan 20 parameters die de vorm, peristaltiekbeweging, uithoudingsvermogen en spoor van het dier evalueren.

Om het nut ervan aan te tonen, hebben we MaggotTracker toegepast om zowel wildtype als mutante dieren te analyseren om factoren te identificeren die van invloed zijn op locomotiefgedrag. Elk dier werd gedurende vier minuten gevolgd. Onze analyse van Canton-S larven in het derde stadium onthulde dat de afstand die een dier aflegde gecorreleerd was met zijn stapsnelheid in plaats van het percentage tijd dat het dier besteedde aan schrijden, en dat de stapsnelheid gecorreleerd was met zowel de afstand als de duur van één pas. Seksueel dimorfisme werd waargenomen in lichaamslengte, maar niet in locomotiefparameters zoals snelheid. Locomotiefparameters werden beïnvloed door het ontwikkelingsstadium van het dier en het kruipoppervlak. Er werden geen significante veranderingen in bewegingssnelheid gedetecteerd in mutanten van circadiane genen zoals: punt uit (per), time-out, en tijdloos (tim). De MaggotTracker-analyse toonde aan dat: ether een go-go (eag), Shaker (NS), slowpoke (slo), en domkop (dnc) Mutante larven hadden ernstige fenotypes in meerdere locomotiefparameters zoals stapafstand en snelheid, consistent met hun functie in neuromusculaire knooppunten. Verder zijn de fenotypische patronen van de K+-kanaalgenen eag, NS en slo zijn zeer vergelijkbaar.

Conclusies

Deze resultaten toonden aan dat MaggotTracker een efficiënt hulpmiddel is voor automatische fenotypering. De MaggotTracker-software en de hier gepresenteerde gegevens kunnen worden gedownload van onze open-access site www.WormLoco.org/Mag.


Een correlatiealgoritme voor de geautomatiseerde kwantitatieve analyse van shotgun proteomics-gegevens

Kwantitatieve shotgun-proteomische analyses worden gefaciliteerd met behulp van chemische tags zoals ICAT en metabole labelstrategieën met stabiele isotopen. De snelle high-throughput productie van kwantitatieve "shotgun" proteomische gegevens vereist de ontwikkeling van software om automatisch massaspectrometrie-afgeleide gegevens van peptiden om te zetten in relatieve eiwit-abundanties. We beschrijven een computerprogramma genaamd RelEx, dat een kleinste-kwadratenregressie gebruikt voor de berekening van de peptide-ionenstroomverhoudingen van de massaspectrometrie-afgeleide ionchromatogrammen. RelEx is tolerant ten opzichte van slechte signaal-ruisgegevens en kan automatisch onbruikbare chromatogrammen en uitbijterverhoudingen verwijderen. We passen een eenvoudige correctie toe voor systematische fouten die de nauwkeurigheid van de kwantitatieve meting met 32 ​​+/- 4% verbetert. Onze geautomatiseerde aanpak werd gevalideerd met behulp van gelabelde mengsels bestaande uit bekende molaire verhoudingen en aangetoond in een echt monster door het effect van osmotische stress op eiwitexpressie in Saccharomyces cerevisiae te meten.


Abstract

Kwantitatieve shotgun-proteomische analyses worden gefaciliteerd met behulp van chemische tags zoals ICAT en metabole labelstrategieën met stabiele isotopen. De snelle high-throughput productie van kwantitatieve "shotgun" proteomische gegevens vereist de ontwikkeling van software om automatisch massaspectrometrie-afgeleide gegevens van peptiden om te zetten in relatieve eiwit-abundanties. We beschrijven een computerprogramma genaamd RelEx, dat een kleinste-kwadratenregressie gebruikt voor de berekening van de peptide-ionenstroomverhoudingen van de massaspectrometrie-afgeleide ionchromatogrammen. RelEx is tolerant ten opzichte van slechte signaal-ruisgegevens en kan automatisch onbruikbare chromatogrammen en uitbijterverhoudingen verwijderen. We passen een eenvoudige correctie toe voor systematische fouten die de nauwkeurigheid van de kwantitatieve meting met 32 ​​± 4% verbetert. Onze geautomatiseerde aanpak is gevalideerd met behulp van gelabelde mengsels die zijn samengesteld uit bekende molaire verhoudingen en gedemonstreerd in een echt monster door het effect van osmotische stress op eiwitexpressie in Saccharomyces cerevisiae.

Deze auteurs hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk.

Aan wie de correspondentie moet worden gericht. E-mail: [email protected] Telefoon: 858-784-8862. Fax: 858-784-8883.


DISCUSSIE

Kwantitatieve analyse van moleculaire en cellulaire dynamiek is cruciaal om hun onderliggende mechanismen te begrijpen. Kymografen zijn een zeer krachtige manier om de tijdsafhankelijkheid van deze processen weer te geven en kunnen in principe worden gebruikt om kwantitatief inzicht te krijgen in hun dynamiek. Het automatiseren van kymograafanalyse was echter moeilijk, met name voor complexe en lage SNR-gegevens. Als gevolg hiervan wordt de analyse in veel gevallen uitgevoerd door menselijke, visuele inspectie. Hier introduceerden we een nieuwe, betrouwbare set softwaretools voor de generatie (KymographClear) en analyse (KymographDirect) van kymografen.

Om de betrouwbaarheid van geautomatiseerde kymograafanalyse aan te tonen door: KymographDirect, hebben we deze tool uitgebreid getest met gesimuleerde kymografen die een breed scala aan dynamische processen en beeldvormingsomstandigheden vertegenwoordigen, zoals gevonden in de literatuur. Trajecten worden doorgaans geëxtraheerd met subpixelnauwkeurigheid, zelfs voor SNR dicht bij 1 (figuren 2B, 3, B en D, 5B, 7B en 8C). Zelfs voor kymografen met een lage SNR is de toepassing in staat om de meeste trajecten te extraheren. Bij SNR > 2 wordt ten minste 80% en meestal 90% van de trajecten betrouwbaar onthuld (Figuur 3, C en E, 5, C en E, 7, D en E, en 8, D en E). Het vermogen van het algoritme om snelheden nauwkeurig te bepalen, hangt in de meeste gevallen af ​​van de stochasticiteit van het bestudeerde proces, de aangetroffen onzekerheid is hooguit enkele procenten (Figuur 2C en 7, C en E).

We hebben de toepasbaarheid aangetoond van KymographDirect tot een verscheidenheid aan experimentele kymografen. KymographDirect werd gebruikt om trajecten te extraheren van afzonderlijke eiwitten die in vitro diffunderen en transloceren op DNA (Figuur 4), trajecten van de rand van groeiende microtubuli in vitro (Figuur 6) en trajecten van groepen moleculaire motoren in cilia en axonen in levende cellen (Figuur 9 en 10). Deze voorbeelden vertegenwoordigen een verscheidenheid aan experimentele omstandigheden die de toepasbaarheid van onze tools benadrukken om een ​​breed scala aan biologische processen in vivo en in vitro kwantitatief te beoordelen. Ze laten ook zien dat KymographDirect kan op een geautomatiseerde manier op betrouwbare wijze complexe trajecten extraheren, wat motiliteitsparameters oplevert zoals momentane snelheid, positieafhankelijke intensiteit en snelheid, en diffusieconstanten. Vergeleken met beschikbare volgroutines voor enkelvoudige deeltjes, KymographDirect vergelijkbaar of beter presteerden op de geteste datasets. Vergelijking met kymograph geautomatiseerde analysetools is moeilijker omdat, ondanks de hoeveelheid gepubliceerde algoritmen, slechts één semi-automatische tool publiekelijk beschikbaar is in vergelijking met deze tool, KymographDirect biedt een hogere mate van automatisering en precisie op de geteste dataset. Alle hier geanalyseerde toepassingen maakten gebruik van fluorescentiemicroscopie, maar in principe KymographDirect en KymographClear kan ook worden toegepast op gegevens die zijn verkregen met helderveldmicroscopie, inclusief fasecontrast- en differentiële interferentiecontrastmicroscopie.

Kymografen worden veel gebruikt door de celbiologie en biofysische gemeenschappen om beweging te visualiseren. Geautomatiseerde kwantitatieve analysetools voor kymografen ontbraken, waardoor onderzoekers werden beperkt om motiliteitsparameters handmatig te extraheren. Hier hebben we een nieuwe toolset geïntroduceerd voor het genereren en geautomatiseerde analyse van kymografen die zelfs onder zeer drukke en lage SNR-omstandigheden betrouwbaar is. We voorzien dat de toolset microscopisten in staat zal stellen om hun afbeeldingen met hoge nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en doorvoer te analyseren, waardoor ontdekkingen in moleculaire en cellulaire dynamica worden versneld.


Resultaten

De kwaliteit van binaire afbeeldingen

Tomografische plakjes van het longweefsel van twee post mortem (intacte) dieren afgebeeld met zowel de 2.9 μm-pixelgrootte en de 1.1 μOptica van m-pixelgrootte is in figuur 7 uitgezet. De plakken zijn beide bijgesneden om een ​​gebied van 0,8 x 0,8 mm2 te bestrijken. In de onbewerkte afbeeldingen met een lagere resolutie in figuur 7a zijn de dunne wanden tussen de longblaasjes (septa) zichtbaar, maar gaan verloren in de segmentatiestap [zoals aangegeven door de groene pijlen in figuur 7b]. Met de optica met hoge resolutie kan de septa worden hersteld in het binaire gesegmenteerde beeld [zoals weergegeven in figuur 7d] door onze segmentatietechniek toe te passen. Er worden echter kleine artefacten geïntroduceerd bij het uitvoeren van de stap "geribbeld beeld" in de segmentatiemethode (stap C in figuur 3), die worden aangegeven met de rode pijlen in het gesegmenteerde beeld [zie figuur 7d]. Aangezien zowel de optica met hoge als met lage resolutie onder omstandigheden met lage blootstelling beeldsegmentatie-artefacten produceren, moeten we kort hun implicaties bespreken met het oog op de daaropvolgende kwantitatieve analyse.

Vergelijking tussen de optica met lage resolutie en hoge resolutie voor een gezichtsveld van 0,8 × 0,8 mm 2 op twee willekeurig gekozen regio's: (een) toont de tomografische plak van de 2.9 μoptica van m-pixelgrootte (B) de overeenkomstige binaire gesegmenteerde afbeelding (C) toont de tomografische plak van de 1.1 μoptica van m-pixelformaat en (NS) toont de bijbehorende gesegmenteerde afbeelding. De pijlen geven artefacten weer die door de segmentatie zijn geïntroduceerd.

Voor de afbeeldingen met een lagere resolutie [Fig 7a en 7b] leidt het bijna volledig verdwijnen van septumoppervlakken tijdens de segmentatiestap tot het feit dat voor een topologische analyse van het gasuitwisselingsoppervlak (de longblaasjes) cruciale gegevens ontbreken. De gegevens met een lage resolutie lijken dus ongeschikt voor een kwantitatieve krommingsanalyse. Voor de analyse van de luchtvolumediktekaart veronderstellen we echter dat de artefacten slechts een marginale rol zullen spelen, omdat wordt verwacht dat ze alleen wijzigingen van één pixel in de gelokaliseerde luchtruimvolumes zullen veroorzaken. Daarom is het enige resterende deel het vinden van een "voldoende" goed gesegmenteerd volume voordat de gegevens worden ingevoerd voor verdere analyse. Het onderscheid tussen een "goede" en "slechte" segmentering kan soms dubbelzinnig zijn, omdat het onderscheid kan worden gemaakt door verschillende criteria (biologische kenmerken, SNR, enz.). Om dit probleem op te lossen, produceerden we eerst een geautomatiseerde binaire 3D-dataset [38] en pasten we onafhankelijk een morfologische "opening" en "sluiting" -bewerking toe, resulterend in een totaal van drie datasets per piek-inspiratiedruk. Op deze manier worden de volgende kwantitatieve resultaten onafhankelijk van de segmentatiestap, omdat we alleen een reeks verschillende gesegmenteerde volumes hoeven te definiëren die we waardevol achten in termen van het behoud van de belangrijkste biologische kenmerken. Zoals we in de volgende paragraaf beschrijven, bevatten de resultaten van de kwantitatieve analyse dan kwantificeerbare onzekerheden die voortkomen uit mogelijke segmentatiefouten.

De afbeeldingen met een hogere resolutie, zoals te zien bij visuele inspectie van figuur 7c en 7d, lijken geschikt voor zowel de luchtvolumediktekaart als de krommingsanalyse. Nogmaals, de zichtbare artefacten zullen naar verwachting slechts een marginale rol spelen bij de analyse van de luchtvolumediktekaart, terwijl ze topologisch "scherpe" oppervlakken (met kleine radii) vertegenwoordigen die gemakkelijk kunnen worden gefilterd na topologische (kromming) evaluatie. Om de invloed van verschillende binaire beeldsegmentaties te onderzoeken, werden de parameters die gebruikersinteractie vereisen in onze segmentatiemethode (dwz degene die de detectie van lokale maxima specificeren in het lijnvormige profielalgoritme - stap "C" in Fig 3) handmatig gevarieerd om 9 datasets te produceren voor elke piekinspiratiedruk, wat resulteert in datasets met verschillende mate van zichtbare artefacten. Dit waren met name de minimale/maximale breedte voor het onderscheiden van alveolaire septa in het respectieve lijnprofiel, evenals de minimale grijswaardedrempel die alveolaire septa definieert met betrekking tot de achtergrond. Vervolgens werden alle datasets ingevoerd in de kwantitatieve analysealgoritmen.

Resultaten van de luchtvolumediktekaart

Zoals eerder vermeld, werden er voor beide optica meerdere binaire 3D-datasets per piekinspiratiedruk (3 verschillende segmentaties voor de optica met lage resolutie en 9 verschillende segmentaties voor de optica met hoge resolutie) gemaakt om de invloed van de segmentatiestap op de kwantitatieve resultaten. Dit wordt weerspiegeld in figuur 8 en tabel 1, terwijl de visualisaties van de luchtvolumediktekaart (zowel 2D als 3D) slechts werden uitgevoerd op één geselecteerde segmentatie per inflatiedruk. Een voorbeeld van zo'n voorbeeld wordt getoond in figuur 9 voor kleine interessegebieden, waar de kaarten van de luchtvolumedikte voor elke afzonderlijke piekinademingsdruk worden gesuperponeerd op de originele gegevens. De kleuren zijn in kaart gebracht met betrekking tot de structurele diameters. Zoals te zien is, is er bij toenemende druk een toename van oranje-naar-gele structuren die overeenkomen met structurele diameters van ongeveer 70 μm en een afname van rode structuren, overeenkomend met structurele diameters van ongeveer 40 μm.

Kansdichtheidsfuncties (PDF) van de lokale luchtvolumediktes voor de twee verschillende optieken: (een) toont de PDF van de luchtvolumedikte-kaart voor de 2,9 " μoptica van m-pixelgrootte (B) toont die voor de 1.1 μoptica van m-pixelformaat. De onzekerheidsintervallen komen voort uit de verschillende sets segmentaties.

De resultaten worden verkregen door de PDF-s uit figuur 8 te integreren volgens de overeenkomstige bereiken.

Structuurdiameters verkregen door berekening van de luchtvolumediktekaart met de 1.1 μm-pixelgrootte optica voor drie verschillende piekinspirerende drukken: (een) 5 cmH2o (B) 10 cmH2o (C) 25 cmH2O.

In figuur 8 zijn de kansdichtheidsfuncties (PDF) van de luchtvolumediktekaarten uitgezet in afhankelijkheid van de structuurdiameters voor de twee verschillende optieken. De plots zijn beperkt tot structurele luchtvolumediktes tot 170 μm vanwege het simpele feit dat grote volumes de resultaten kunnen veranderen wanneer de longen opblazen terwijl ze in/uit het interessegebied bewegen. De gekleurde gebieden achter elke functie tonen de standaarddeviaties van de kwantitatieve resultaten met betrekking tot de verschillende segmentatieparameters die voor de berekeningen zijn gebruikt. Vanuit de curven zien we een verschuiving van kleine diameters (ongeveer 40 μm) bij een piek-inademingsdruk van 10cmH2O naar grotere diameters (rond 70 μm) met toenemende druk. Dit resultaat is waarneembaar met beide optieken en er lijkt geen significante verandering te zijn in de berekende lokale luchtvolumedikteverdelingen tussen de twee optieken. De gegevens die zijn verkregen met de optica met een hogere vergroting [zie figuur 8b] leveren echter significant nauwkeurigere (met kleinere standaarddeviaties) resultaten op dan de resultaten met een lagere vergroting [zoals te zien in figuur 8a]. Verder is de toename van de interpulmonale druk van 10 cmH2O tot 20 cmH2O resulteert in een duidelijke vergroting van het parenchymale luchtruim, maar de verdere toename van 20 cmH2O tot 30 cmH2O toont slechts een minimale vergroting. Dit laatste zou erop kunnen wijzen dat de totale longcapaciteit wordt bereikt bij een interpulmonale druk van ongeveer 20 cmH2O.

In tabel 1 zijn de volumetrische verdelingen bij vier verschillende bereiken (20 − 50 μm, 50 − 80 μm, 80 − 110 μm en 110–rust μm) zijn samengevat. Ze worden verkregen door de respectieve verdelingen over de gegeven intervallen te integreren en tonen dezelfde trends op een kwantitatieve manier: bij toenemende piekinademingsdruk vindt de volumetrische toename plaats bij Bereik 2 met een gelijktijdige afname bij Bereik 1.

Zoals te zien is in zowel figuur 8 als tabel 1, vertonen de resultaten van beide optica overeenkomende trends voor de twee kleinere bereiken Bereik 1 en Bereik 2. De structurele diameters boven 80 μm, aan de andere kant, produceren waarschijnlijkheidsdichtheden die geen eenduidige trend volgen met toenemende piekinspiratiedruk. We leggen dit effect later in meer detail uit, maar merken op dat dit te wijten is aan de kleine volumetrische interessegebieden die extra vooroordelen introduceren. Structurele diameters van minder dan 20 μm worden niet in aanmerking genomen in het evaluatieproces omdat ze veel kleiner zijn dan de kleinste verwachte diameters van de longblaasjes.

Ten slotte tonen we in figuur 10 3D-weergaven van de kaarten van de luchtvolumedikte voor de drie verschillende drukken en de twee optica. In de optica met lage resolutie (groter gezichtsveld) zijn de grote luchtwegen uitgesloten door transparant te zijn (zichtbaar door de gaten). De lijn die ruwweg van linksonder naar de rechterbovenhoek van het blok loopt, geeft de grens weer tussen de rechter middelste en rechter caudale kwab, en het lijkt erop dat de middelste kwab meer in volume toeneemt dan de caudale, de kleurweergave volgend. Dit is te merken aan het feit dat de middelste lob een meer "roodachtige" kleur aanneemt bij grotere inflatie. Daarom werd een heterogene inflatie waargenomen, zowel inter- als intralobulair.

Visualisatie van de luchtvolumediktekaarten in 3D: (een),(C) en (e) tonen de 10, 20 en 30 cmH2O-drukken voor de 2.9 μoptica van m-pixelgrootte (B),(NS) en (F) laat die zien voor de 1.1 μoptica van m-pixelformaat. RML: rechter middenkwab RCaL: rechter caudale kwab de rode cirkels geven gebieden aan die bij dezelfde luchtdruk een kleinere uitzetting van de afzonderlijke luchtruimten vertonen. Bij hogere drukken zijn meer oranje tot rood gekleurde volumes zichtbaar, d.w.z. e. luchtvolumes met structurele diktes van 50 − 80 μm.

Kromming resultaten

De interface-vormverdelingen (ISD) voor de drie verschillende drukken worden getoond in Fig 11. Aangezien voor elke piekinspiratiedruk meerdere ISD's worden berekend met betrekking tot de verschillende binaire datasets die zijn verkregen met behulp van negen verschillende sets parameters voor de segmentatie, hier de gemiddelde ISD-s zijn uitgezet. Zoals verwacht ligt de hoogste dichtheid in "regio 1", vergeleken met de ISD-definitiegrafiek in figuur 6 en geeft aan dat de longen grotendeels ellipsoïdaal van vorm zijn (dwz convex naar het longweefsel toe), vergelijkbaar met de ideale vorm van longblaasjes [58] . Verder is zichtbaar dat bij toenemende drukken een transformatie plaatsvindt van een diverse naar een meer uniforme verdeling van krommingen op het lucht-weefseloppervlak. Dit is zichtbaar met het verschijnen van de heldere (rode) piek na de verhoging van de interpulmonale druk van 10 naar 20 cmH2O. De laatste stap (vanaf 20cmH2O tot 30cmH2O) wordt nog meer gelokaliseerd in “regio 1”. Echter, de toename van 10cmH2O tot 20cmH2O levert een veel groter verschil op dan de stijging vanaf 20cmH2O tot 30cmH2O. Ook dit is te wijten aan het feit dat de totale longcapaciteit wordt bereikt bij ongeveer 20cmH2O. Tegelijkertijd verschuift de blauwe staart (dichtheid ∼ 90) van "regio 2" en "regio 3" (Fig 11) enigszins naar de centrale piek (rechts). In totaal beweegt de piek met de hoogste dichtheid echter naar respectievelijk kleinere hoofdkrommingen (zoals aangegeven door de pijl in figuur 11) of grotere stralen. Dit is enigszins zichtbaar door de beweging van de bovenste "blauwviolette staart" (dichtheid ∼ 70) naar het centrum.

Interface vormverdelingen (ISD) voor de vrije verschillende drukken: (een) 10 cmH2o (B) 20 cmH2o (C) 30 cmH2O. De pijlen geven de verschuiving aan naar kleinere principekrommingen (grotere radii).

Om deze resultaten beter te verduidelijken, zijn bovendien zowel de Gaussiaanse als de gemiddelde krommingen voor de verschillende drukken uitgezet in Fig. 12. Zoals eerder tonen de gekleurde gebieden achter elke functie de standaarddeviaties van de kwantitatieve resultaten met betrekking tot de verschillende segmentatieparameters. Zoals te zien is in figuur 12, zijn de foutmarges erg klein, wat aangeeft dat de verschillende segmentatieparameters zeer weinig invloed hebben op de algehele krommingsresultaten.

Kansdichtheidsfuncties (PDF) van Gauss (een) en bedoel (B) krommingen. Zoals eerder komen de onzekerheidsintervallen voort uit de verschillende segmentatieparameters.

De Gauss-kromming wordt het best geïllustreerd door een plat oppervlak, zoals een uitdijende schijf die isotroop groeit [48]: als de uitzetting uniform is (dwz de algehele vorm blijft hetzelfde) zal deze geen Gauss-kromming hebben als de marginale gebieden langzamer groeien dan de centrale, zal de schijf een parabolische vorm vertonen en zal de Gauss-kromming positief zijn en als het centrale gebied langzamer groeit dan de marginale, zal de schijf knikken en een vorm vormen met een golvende rand (bijv. een zadeloppervlak), waardoor een negatieve Gauss-kromming. In ons geval zien we een toename rond nul, wat aangeeft dat de bestaande oppervlakken in de long enkel en alleen platter worden, zoals te zien is in figuur 12a. Aan de andere kant is een iets hogere dichtheid zichtbaar voor positieve Gauss-krommingen, wat opnieuw wijst op de aanwezigheid van ellipsoïdale (convexe richting het longweefsel) oppervlakken.

De gemiddelde kromming zoals weergegeven in figuur 12b geeft de bovengenoemde trend aan (met toenemende piekinspiratiedruk) naar kleinere hoofdkrommingen in "regio 1", wat betekent dat positieve gemiddelde krommingen in de buitenste rechtergebieden vlakker worden. Het feit dat de piek in figuur 12b een omgekeerde trend van 20cmH . laat zien2O tot 30cmH2O kan worden toegeschreven aan hetzelfde effect dat al werd waargenomen in de analyse van de luchtvolumediktekaart. Aangezien we namelijk alleen kleine gedeeltelijke volumes van intacte longen beschouwen, kunnen grote luchtwegen bij hogere piekinademingsdrukken buiten het volumetrische gezichtsveld komen, wat de reden is waarom de resultaten voor lage gemiddelde krommingen (dwz vlakke oppervlakken, grote luchtwegen ) moeten zorgvuldig worden overwogen.


Wat is de staat van geautomatiseerde kwantitatieve analyse? - Biologie

U heeft een machinevertaling aangevraagd van geselecteerde inhoud uit onze databases. Deze functionaliteit is uitsluitend bedoeld voor uw gemak en is op geen enkele manier bedoeld om menselijke vertaling te vervangen. Noch SPIE, noch de eigenaren en uitgevers van de inhoud doen, en wijzen uitdrukkelijk af, enige uitdrukkelijke of impliciete verklaringen of garanties van welke aard dan ook, inclusief, maar niet beperkt tot, verklaringen en garanties met betrekking tot de functionaliteit van de vertaalfunctie of de nauwkeurigheid of volledigheid van de vertalingen.

Vertalingen worden niet bewaard in ons systeem. Uw gebruik van deze functie en de vertalingen is onderworpen aan alle gebruiksbeperkingen die zijn opgenomen in de gebruiksvoorwaarden van de SPIE-website.

Automatische detectie en kwantitatieve analyse van cellen in de primaire motorcortex van de muis

Yunlong Meng, 1 Yong He, 1 Jingpeng Wu, 1 Shangbin Chen, 1 Anan Li, 1 Hui Gong 1

1 Huazhong Univ. van Wetenschap en Technologie (China)

ABONNEER OP DIGITALE BIBLIOTHEEK

50 downloads per abonnement van 1 jaar

25 downloads per 1-jarig abonnement

Inclusief PDF, HTML en video, indien beschikbaar

Neuronale cellen spelen een zeer belangrijke rol bij de regulering van het metabolisme en de controle van het mechanisme, dus het aantal cellen is een fundamentele determinant van de hersenfunctie. Gecombineerde geschikte cel-labeling benaderingen met recent voorgestelde driedimensionale optische beeldvormingstechnieken, kunnen coronale secties van hele muizenhersenen worden verkregen met een voxel-resolutie van 1 m. We hebben een volledig automatische pijplijn ontwikkeld om celcentroïden te detecteren en hebben driedimensionale kwantitatieve informatie verstrekt over cellen in de primaire motorcortex van de C57BL/6-muis. Het omvat vier hoofdstappen: i) voorbewerking ii) beeldbinarisatie iii) extractie van celcentroïden en contoursegmentatie iv) schatting van de laminaire dichtheid. Onderzoeken naar de gepresenteerde methode onthullen veelbelovende detectienauwkeurigheid in termen van recall en precisie, met een gemiddeld recall-percentage van 92,1% en een gemiddeld precisiepercentage van 86,2%. We analyseren ook de laminaire dichtheidsverdeling van cellen van het piale oppervlak tot het corpus callosum van de outputvectorisaties van gedetecteerde celcentroïden in de primaire motorcortex van de muis, en vinden significante variaties in de verdeling van de celdichtheid in verschillende lagen. Deze automatische detectiebenadering van celzwaartepunten zal gunstig zijn voor snelle celtelling en nauwkeurige schatting van de dichtheid, omdat tijdrovende en foutgevoelige handmatige identificatie wordt vermeden.

© (2014) COPYRIGHT Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers (SPIE). Het downloaden van de samenvatting is alleen toegestaan ​​voor persoonlijk gebruik.


  • De basis van MATLAB
  • Problemen met uw code oplossen
  • Basis biologische en medische toepassingen

Ben je een bioloog, gezondheidswerker of medisch student die moet leren programmeren? Ben jij een programmeur die een beter begrip van de medische wereld wil? Bent u op zoek naar een introductie tot MATLAB?

Voor beginners heeft Quantitative Methods for Biology een unieke benadering, waardoor je een kijkje krijgt in een cursus en de cursisten. Je studeert samen met studenten die ook leren coderen.

Voor ervaren programmeurs helpt deze cursus je om de MATLAB te leren die je nodig hebt, zonder dat je wordt afgeremd door inleidende concepten die je al kent. Of je nu al vertrouwd bent met Python, Javascript, r of een andere taal, wij helpen je die kennis te vertalen naar MATLAB.

Alle cursisten hebben gratis toegang tot een exemplaar van MATLAB dat ze tijdens de cursus kunnen gebruiken. Er zijn ook mogelijkheden om code rechtstreeks in opdrachten te verwerken, zodat je je vaardigheden kunt testen en aan authentieke projecten kunt werken.

Daarnaast hanteert deze cursus een adaptieve benadering van haar opdrachten. Hoe vaardiger u bent, hoe minder problemen u hoeft te voltooien om de cursus af te ronden. Als je het moeilijk hebt, zorgen we ervoor dat je de oefening krijgt die je nodig hebt om te slagen.


Invoering

Kwantificering zal essentieel zijn aangezien biologen steeds complexere facetten van de ontwikkeling van organismen bestuderen [1]. Helaas blijft kwalitatieve analyse gebruikelijk omdat het vaak moeilijk is om cellulaire processen in hun oorspronkelijke context te meten. Moderne fluorescerende sondes en microscopietechnieken maken dergelijke metingen mogelijk [2-4], maar de daaruit voortvloeiende beeldanalyse vereist gespecialiseerde vaardigheden die buiten de expertise van de meeste experimentatoren vallen. Geautomatiseerde analysestrategieën hebben vergelijkbare uitdagingen aangepakt in cytometrie [5-7], genomica en transcriptomics [8-11] en andere subdisciplines van de biologie [12, 13]. Beeldanalyse is bijzonder geschikt gebleken voor automatisering, waarbij verschillende computervisietools aan populariteit hebben gewonnen bij biologen [14-17]. Deze platforms zijn populair omdat ze de productiviteit verhogen, de consistentie en gevoeligheid van metingen verbeteren en de noodzaak van gespecialiseerde rekenvaardigheid wegnemen [18-20]. Het ontwerpen van vergelijkbare hulpmiddelen om biologen te helpen bij het onderzoeken en meten van ontwikkelingsprocessen in vivo, zal studies van embryogenese en ontwikkeling verder transformeren in kwantitatieve inspanningen.

Ontwikkelingsbiologen bestuderen hoe de expressie en functie van individuele genen de opkomst van volwassen fenotypes coördineren. Ze vragen vaak hoe cellen reageren wanneer een specifiek gen, RNA of eiwit wordt verstoord tijdens een bepaald ontwikkelingsstadium. Celrespons kan worden gekenmerkt door veranderingen in morfologie of door veranderingen in de expressie van andere genen (Fig 1A). Experimentele pogingen om deze vraag te beantwoorden werden historisch verstikt door de moeilijkheid om verstoringen te isoleren tot een enkele ontwikkelingscontext, aangezien de meest interessante verstoringsdoelen vaak een pleiotrope functie verlenen over verschillende stadia van ontwikkeling en vroege embryonale letaliteit kunnen veroorzaken [21–23].

Experimenteel raamwerk dat mitotische klonen gebruikt om te testen of er al dan niet regulerende interacties optreden tussen een verstoringsdoelwit en een relevante reporter. Blauwe en groene markeringen vertegenwoordigen de respectievelijke genen die coderen voor het verstoringsdoel en de reporter. (A) Een door verstoring veroorzaakte afname van de reporterniveaus zou bevestigen dat regulering optreedt. (B) Mitotische recombinatie genereert klonale subpopulaties die nul, één of twee kopieën dragen van het gen dat codeert voor een verstoringsdoelwit. Zwarte lijnen geven een genetische locus weer. Alleen genen stroomafwaarts van de recombinatieplaats zijn onderhevig aan recombinatie. Rode markers vertegenwoordigen een gen dat codeert voor een klonale marker die wordt gebruikt om de resulterende klonen te identificeren. Rode arcering van groot ovaal weerspiegelt het relatieve fluorescentieniveau van de klonale marker.

Mozaïekanalyse loste deze uitdaging op in Drosophila door verstoringen te beperken tot een subset van cellen binnen de imaginaire schijven van de larve [24, 25]. De techniek levert een heterogeen weefsel op dat bestaat uit genetisch verschillende stukjes cellen die klonaal verwant zijn. Afgezien van zeldzame de novo-mutaties, zijn cellen binnen elke kloon genetisch identiek. Kloonvorming kan worden beperkt tot specifieke zich ontwikkelende organen door schijfspecifieke genpromoters te gebruiken om trans-chromosomale recombinatiegebeurtenissen in de overeenkomstige imaginaire schijven aan te sturen [26, 27]. De timing van deze gebeurtenissen bepaalt het aantal en de grootte van de resulterende klonen [28]. Perturbations are applied by engineering the dosage of a target gene to differ across clones (Fig 1B), resulting in clones whose cells are either homozygous mutant (−/−), heterozygous wildtype (+/−), or homozygous wildtype (+/+) for the particular gene. Labeling these clones with the presence or absence of fluorescent markers enables direct comparison of cells subject to control or perturbation conditions, while maintaining otherwise equivalent developmental and physiological histories between the two cell populations (Fig 2A). Additional reporters may be used to monitor differences in RNA or protein expression, morphology, or cell fate choice across clones (Fig 2B). Variants of this strategy led to seminal discoveries in both neural patterning [29–31] and morphogenesis [32, 33], and remain popular today [34–36].

(A,B) Conventional analysis of a mosaic eye imaginal disc. (A) Clones are identified by visual comparison of clonal marker fluorescence among nuclei. (B) Regions labeled homozygous mutant (−/−) or homozygous wildtype (+/+) for the clonal marker are compared with those labeled heterozygous wildtype (+/−) to assess whether reporter expression differs across clones. Fluorescence bleed-through is arbitrarily diagnosed. (C-H) Quantitative mosaic analysis. Panels depict a magnified view of the region enclosed by red rectangles in panels A and B. (C) Raw confocal image of the nuclear stain, clonal marker, and reporter of interest. (D) Segmentation identifies distinct nuclei. (E) Reporter expression is quantified by averaging the pixel intensities within each segment. Numbers reflect measured values. (F) Measurements may be corrected to mitigate fluorescence bleedthrough. (G) Individual nuclei are labeled homozygous mutant, heterozygous, or homozygous wildtype for the clonal marker. White arrows mark nuclei with ambiguous fluorescence levels. (H) Reporter levels are compared across clones to determine whether the perturbation affects reporter expression. Yellow region marks excluded clone borders. Comparison may exclude clone borders (yellow regions) and focus on a particular region of the image field (black arrows). In the eye imaginal disc, comparison is often limited to a narrow window near the MF (orange arrow).

Quantitative microscopy techniques are well suited to measuring differences in cell behavior across clones. One reporter (a clonal marker) labels the clones, while others quantitatively report properties of their constituent cells, such as the expression level of a gene product of interest (Fig 2C). The former then defines the stratification under which the latter are compared. We call this strategy Quantitative Mosaic Analysis (QMA) because it replaces subjective visual comparison with a rigorous statistical alternative. Although a few recent studies have deployed this approach [37–40], qualitative visual comparison remains pervasive in the literature.

We suspect the adoption of QMA has been hindered by demand for specialized computational skills or, in their stead, extensive manual labor. Researchers must first draw or detect boundaries around individual nuclei in a procedure known as segmentation (Fig 2D). Averaging the pixel intensities within each boundary then yields a fluorescence intensity measurement for each reporter in each identified nucleus (Fig 2E). The measurements should then be corrected to account for any fluorescence bleedthrough between reporter channels (Fig 2F). Correction often requires single-reporter calibration experiments to quantify any potential crosstalk between different fluorophores, followed by complex calculations to remedy the data [41, 42]. Researchers must then label, or annotate, each identified nucleus as mutant, heterozygous, or homozygous for the clonal marker. Annotation is typically achieved through visual inspection (Fig 2G). Cells carrying zero, one, or two copies of the clonal marker should exhibit low, medium, or high average levels of fluorescence, respectively. However, both measurement and biological noise introduce the possibility that some cells’ measured fluorescence levels may not reliably reflect their genetic identity. Annotation must therefore also consider the spatial context surrounding each nucleus. For instance, a nucleus whose neighbors express high levels of the clonal marker is likely to be homozygous for the clonal marker, even if its individual fluorescence level is comparable to that of heterozygous cells (Fig 2G, white arrows). Spatial context is particularly informative in developing tissues where cell migration is minimal, such as the fly imaginal discs. With many biological replicates containing thousands of cells each, annotation can quickly become insurmountably tedious. The corrected and labeled measurements are then curated for statistical comparison by excluding those on the border of each clone, and limiting their scope to particular regions of the image field (Fig 2H). Combined, all of these tasks ultimately burden researchers and raise the barrier for adoption of QMA.

Automation promises to alleviate this bottleneck, yet the literature bears surprisingly few computational resources designed to support QMA. The ClonalTools plugin for ImageJ deploys an image-based approach to measure macroscopic features of clone morphology, but is limited to binary classification of mutant versus non-mutant tissue and offers no functionality for comparing reporter expression across clones [43]. Alternatively, the MosaicSuite plugin for ImageJ deploys an array of image processing, segmentation, and analysis capabilities to automatically detect spatial interactions between objects found in separate fluorescence channels [44, 45]. While useful in many other settings, neither of these tools support automated labeling of individual cells or explicit comparison of clones with single-cell resolution. Most modern studies employing a quantitative mosaic analysis instead report using some form of ad hoc semi-automated pipeline built upon ImageJ [37, 39, 40]. We are therefore unaware of any platforms that offer comprehensive support for an automated QMA workflow.

Here, we introduce Fly-QMA, a computational framework for automated QMA of Drosophila denkbeeldige schijven. Fly-QMA supports segmentation, bleedthrough correction, and annotation of confocal microscopy data (Fig 2D–2H). We demonstrate each of these functions by applying them to real confocal images of clones in the eye imaginal disc, and find that our automated approach yields results consistent with manual analysis by a human expert. We then generate and use synthetic data to survey the performance of our framework across a broad range of biologically plausible conditions. Fly-QMA is freely available online (see Data and software availability), along with an interactive coding tutorial designed to acquaint users with the core software features by applying them to example data.


Dankbetuigingen

We thank Thomas R. Clandinin, Jürgen Knoblich, Kristin Scott and and Bruno Lemaitre for sharing fly stocks. We thank Célia Baltazar, Ana Paula Elias and Ana Sofia Valente for technical assistance in running experiments, Matthieu Pasquet and Ricardo Ribeiro for assistance in hardware and acquisition software development and the Instituto Gulbenkian de Ciência for providing us access to experimental setups. Thomas R. Clandinin, Rui Costa, Samuel Walker and all the members of the Behavior and Metabolism Laboratory for helpful discussions and comments on the manuscript. This project was supported by a Human Frontiers Program Project Grant RGP0022/2012 to M.H.D. and C.R., an Allen Distinguished Investigator award to M.H.D. and the BIAL Foundation grant #167/10 and the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) grant PTDC/BIA-BCM/118684/2010 to CR. P.M.I. is supported by the postdoctoral fellowship SFRH/BPD/79325/2011 from the Foundation for Science and Technology, E.V. by the fellowship 193-2012 from the BIAL Foundation and G.L. by the PhD Studentship SFRH/BD/51714/2011 from the Foundation for Science and Technology. The Champalimaud Neuroscience Programme is supported by the Champalimaud Foundation.


Bekijk de video: Video Kwantitatieve analyse (Januari- 2022).