Informatie

Activering van embryonaal genoom


Embryonale genactivering is een proces waarbij het embryo zijn nieuw gevormde genoom begint te transcriberen. Aangezien de embryonale genactivering in vroege stadia plaatsvindt, heeft het vaderlijke genoom in dat stadium mogelijk geen enkele invloed.

Nu, mijn vraag is waarom alleen het maternale genoom een ​​rol speelt bij embryonale genactivering? Speelt het vaderlijk genoom een ​​rol bij eerdere/post-embryonale genoomactivering?


De pronuclei fuseren en decondensatie vindt plaats en nu wordt de cel een zygote genoemd. Er is een stadium dat de midblastula-overgang (MBT) wordt genoemd, tot waar alleen de maternale producten (cytoplasmatische factoren zoals RNA's, eiwitten en ribosomen) worden gebruikt. Na MBT begint de zygote zijn eigen genen van zowel de vaderlijke als de moederlijke allelen tot expressie te brengen. Bepaalde genomische regio's zijn echter bedrukt wat betekent dat een van de allelen epigenetisch tot zwijgen wordt gebracht. Het kan zowel vaderlijk als moederlijk zijn.


Histon H3K27-acetylering is overbodig voor versterkeractiviteit in embryonale stamcellen van muizen

H3K27ac wordt algemeen erkend als een marker voor actieve versterkers en een goede indicator van versterkeractiviteit. De functionele impact op transcriptie is echter niet gekarakteriseerd. Door lysine 27 in histonvariant H3.3 te vervangen door arginine in embryonale stamcellen van muizen, verminderen we de overgrote meerderheid van H3K27ac bij versterkers. Het transcriptoom is echter grotendeels ongestoord in deze mutante cellen, waarschijnlijk omdat de andere enhancer-kenmerken grotendeels onveranderd blijven, waaronder de toegankelijkheid van chromatine, H3K4me1 en histonacetylering bij andere lysineresiduen. Onze resultaten laten duidelijk zien dat H3K27ac alleen niet in staat is om de versterkeractiviteit functioneel te bepalen.


De overgang van moeder naar zygote

Célia Baroux, Ueli Grossniklaus, in actuele onderwerpen in ontwikkelingsbiologie, 2015

Abstract

De maternale-naar-zygotische transitie (MZT) definieert een ontwikkelingsfase waarin het embryo zich geleidelijk emancipeert van een ontwikkelingscontrole die grotendeels afhankelijk is van maternale informatie. De MZT is een functionele uitlezing van twee processen: de klaring van moederlijk afgeleide informatie en de de novo expressie van de overgeërfde, ouderlijke allelen mogelijk gemaakt door zygotische genoomactivering (ZGA). In planten richtte de discussie over het bestaan ​​van de MZT zich jarenlang alleen op de ZGA. Verschillende recente onderzoeken leveren echter bewijs voor een progressieve verlichting van de maternale controle over embryogenese die gecorreleerd is met een geleidelijke ZGA, een proces dat zelf maternale controle heeft. Toch tonen verschillende voorbeelden van zygotische genen die vroeg in de embryogenese tot expressie worden gebracht en/of functioneel vereist zijn, een zekere flexibiliteit in de dynamiek en kinetiek van de MZT bij plantensoorten en ook bij intraspecifieke hybriden.


Histon-modificaties zijn de beïnvloeders van het ontwaken van het zygotische genoom

Op Fab gebaseerde beeldvorming om de dynamiek van actieve transcriptie en histon-modificaties tijdens ZGA in levende zebravisembryo's te volgen, onthulde spatiotemporele coördinatie binnen enkele kernen, waar H3K27-acetylering geconcentreerd was op verschillende foci op het miR-430-gencluster voorafgaand aan de transcriptie. Deze waarnemingen, samen met remmertesten, suggereren dat H3K27ac voorafgaat aan actieve transcriptie tijdens ZGA. Krediet: Tokyo Tech

De zebravis is een belangrijk modelorganisme in de biologie. Mensen en zebravissen delen 70 procent van hun genen, en van meer dan 80 procent van de menselijke genen die verband houden met ziekte is bekend dat ze een zebravis-tegenhanger hebben. Bovendien is hun volledige genoomsequentie geïdentificeerd en is het efficiënter om vissen te kweken dan muizen.

Hun ontwikkeling is echter een beetje anders dan die van zoogdieren. Hoewel vissen zich seksueel voortplanten, zoals alle gewervelde dieren, is de bevruchting van het ei extern, omdat zowel het ei als het sperma in het water worden vrijgegeven. Ondanks dit belangrijke verschil, is de meerderheid van de sequenties die betrokken zijn bij de eiwitsynthese, geassocieerd met embryonale ontwikkeling en regulatie, geconserveerd tussen soorten.

Dit betekent dat sommige van de basisbouwstenen die cellen de instructies geven voor het bouwen van een levend organisme, behouden blijven voor alle soorten. In plaats van deze sequenties kwijt te raken, reguleert evolutie hun expressie door modificaties van genomisch DNA en histon-eiwitten, waar het DNA omheen is gebonden. Deze 'epigenetische factoren', zoals wetenschappers ze noemen, bepalen of genen functioneel worden of niet omdat ze de chemische en/of structurele samenstelling van DNA veranderen. Deze regulering van wat wordt wat vooral belangrijk is wanneer een organisme zich ontwikkelt.

Een groep wetenschappers van Tokyo Tech, onder leiding van professor Hiroshi Kimura, ging op zoek naar epigenetische veranderingen tijdens de ontwikkeling van zebravissen. Professor Kimura zegt: "Het structurele behoud van histonen en cruciale enzymen voor transcriptie (dwz RNA-polymerasen II), evenals het feit dat zebravisembryo's transparant zijn, maakt ze een perfect model om de rol van deze modificaties in de ontwikkeling van levende organismen."

(A) Schema van experimenten. Fluorescerend gelabelde Fabs bereid uit modificatie-specifieke antilichamen worden geïnjecteerd in 1-celstadium zebravisembryo's, die vervolgens worden gemonteerd voor een lightsheet (SiMView) of een confocale (FV1000) microscoop. (B) Representatieve afbeeldingen genomen met een SiMView-microscoop. Fabs die specifiek zijn voor actieve, gefosforyleerde RNA-polymerase II (RNAP2 Ser2ph) en histon H3 geacetyleerd op de 9e lysine (H3K9ac) werden gelijktijdig geïnjecteerd en afgebeeld. RNAP2 Ser2ph Fabs waren duidelijk geconcentreerd in kernen rond het 1k-celstadium, terwijl H3K9ac Fabs waren verrijkt in kernen van het 8-cellige stadium. Schaalbalk: 100 m. Krediet: Tokyo Tech, ontwikkeling

Met behulp van fab-gebaseerde live endogene modificatie-labeling, of FabLEM, een techniek om de dynamiek van post-translationele modificaties te visualiseren met behulp van specifieke antilichamen in levende cellen (Figuur 2), observeerde het team actieve RNA-polymerase II tijdens zygotische genoomactivering (ZGA), of het proces waarbij de ontwikkeling van het embryo onder controle komt van de zygote of het zich ontwikkelende embryo zelf in plaats van het moederlijk gedeponeerde materiaal. Hoewel de timing van deze overgang soortspecifiek is, komt het ook voor bij zoogdieren.

In de embryo's van het 512-celstadium wordt H3K27-acetylering geaccumuleerd (H3K27ac-pijl in magenta) vóór het begin van transcriptie, zoals aangegeven door actieve gefosforyleerde RNA-polymerase II (RNAP2 Ser2ph-pijl in groen). Vergrote afbeeldingen van miR-430 locus worden ook getoond. Schaalbalk: 10 m. Krediet: Tokyo Tech, ontwikkeling

Vervolgens vergeleek het team de veranderingen in histonmodificatie met de timing van genoomactivering. Een van de belangrijkste bevindingen van hun studies was dat acetylering die plaatsvindt op de 27e lysine in histon H3, of H3K27, geconcentreerd wordt voorafgaand aan actieve transcriptie (Figuur 3). Het visualiseren van transcripten van het vroegst geactiveerde gen miR-430 samen met H3K27-acetylering, bevestigde de bevindingen en transcriptieremmer verhinderde de accumulatie van H3K27-acetylering niet. Wat de resultaten suggereren, is dat H3K27-acetylering een epigenetische factor is die het genoom wakker maakt voor transcriptie.

Omdat RNA-polymerase II in alle soorten aanwezig is, kan de methode ook worden toegepast om de ontwikkeling in andere levende organismen te bestuderen. "Dit opent de mogelijkheid voor verder onderzoek naar het verband tussen transcriptieregulatie en nucleaire organisatie", merkt professor Kimura op.


Regulatie van zygotische genactivering in het pre-implantatie muizenembryo: globale activering en onderdrukking van genexpressie

Gesuperponeerd op de activering van het embryonale genoom in het pre-implantatie muizenembryo is de vorming van een transcriptioneel repressieve toestand tijdens het tweecellige stadium. Deze onderdrukking lijkt gemedieerd op het niveau van de chromatinestructuur, omdat het wordt omgekeerd door histonhyperacetylering te induceren of de tweede ronde van DNA-replicatie te remmen. We melden dat van meer dan 200 amplicons die zijn geanalyseerd door mRNA-differentiële weergave, ongeveer 45% ervan wordt onderdrukt tussen de tweecellige en viercellige stadia. Deze repressie wordt gescoord als ofwel een afname van ampliconexpressie die optreedt tussen de tweecellige en viercellige stadia of op het vermogen van ofwel trichostatine A (een remmer van histondeacetylasen) of aphidicoline (een remmer van replicatieve DNA-polymerasen) om te verhogen het niveau van ampliconexpressie. De resultaten van deze studie geven ook aan dat ongeveer 16% van de geanalyseerde amplicons waarschijnlijk nieuwe genen zijn waarvan de sequentie niet overeenkomt met de sequenties in de huidige databases, terwijl ongeveer 20% van de sequenties die tijdens deze overgang tot expressie worden gebracht waarschijnlijk repetitieve sequenties zijn. Ten slotte remt het induceren van histonhyperacetylering in de tweecellige embryo's de splitsing naar het viercellige stadium. Deze resultaten suggereren dat genoomactivering globaal en relatief promiscue is en dat een functie van de transcriptioneel repressieve toestand is om het juiste profiel van genexpressie te dicteren dat compatibel is met verdere ontwikkeling.


Materialen en methodes

Muismodellen, menselijke CRC-patiënten en tumorverzameling

Muis tumoren

Alle tumoren werden geïsoleerd als spontaan optredende laesies in Apc Min/+ [57], Smad3 -/- [58], en Tgfb1 -/- Rag2 -/-, verzameld op de leeftijd van drie tot negen maanden, afhankelijk van het model (voor een overzicht, zie [6]). De enige uitzonderingen waren twee Apc Min/+ tumoren, UW_3_2778 en UW_6_2748, die 13 en 14 maanden waren en de drie Tgfb1 -/- Rag2 -/- tumoren, die alle vijf histologische kenmerken hadden van lokaal invasief carcinoom [7]. Drie tot vier maanden oude muizen van verschillende AXB-recombinante inteeltlijnen werden behandeld met AOM-doses die waren gekozen voor het versterken van verschillen tussen stammen in gevoeligheid [11]. Muizen kregen vier keer per week i.p. injecties van 10 mg AOM per kg lichaamsgewicht en zes maanden na de eerste injectie werden tumoren verzameld. Dieren werden geëuthanaseerd met CO2, dubbele punten verwijderd, gespoeld met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en neergelegd op Whatman 3 MM-papier. Een samenvatting van de muizenstammen, mutante allelen en bronlaboratoria wordt weergegeven in Tabel 5. Alle tumoren werden alleen uit de dikke darm verkregen, waarvan het specifieke segment is aangegeven in de Gene Expression Omnibus (GEO)-database [59] opgeslagen monsterinformatie ( GSE5261). De meerderheid van Tgfb1 -/- Rag2 -/- en Smad3 -/- tumoren komen voor in de blindedarm en het proximale colon en alle voor karakterisering geïsoleerde monsters werden daaruit verkregen. Daarentegen tumoren geïsoleerd uit Apc Min/+ en AOM-muizen kwamen voornamelijk voor in het midden- en distale colon. Een klein deel van de tumor werd in formaline geplaatst voor histologie, en de rest werd fijn ontleed in RNAlater (Ambion Inc., Austin, TX, VS) en bewaard bij -20°C. Normaal volwassen colon-RNA ter referentie werd verkregen uit hele colonmonsters die waren geoogst van tien acht weken oude C57BL/6 mannelijke muizen. Het weefsel werd gelyseerd in Trizol Reagent (Invitrogen Systems Inc., Carlsbad, CA, VS) en gehomogeniseerd. Totaal RNA werd gezuiverd met behulp van een Qiagen-kit (USA-Qiagen Inc., Valencia, CA, VS).

Menselijke monsters: verzameling/biopten, regelgevingsaspecten, naleving en geïnformeerde toestemmingen

Monsterafnameprotocol en analyses bij het H Lee Moffitt Cancer Center en Research Institute zijn eerder beschreven [37]. De informatie die met de monsters voor dit onderzoek is verzameld, omvat criteria voor vaste tumorstadiëring voor tumor, knooppunten en metastasen (TNM), Dukes-stadiërings-/presentatiecriteria, pathologische diagnose en differentiatiecriteria.

RNA isolatie

Alle RNA-monsters werden gezuiverd met behulp van Trizol-reagens van fijn ontlede tumoren en werden onderworpen aan kwaliteitscontrolescreening met behulp van de Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS).

Microarray-procedures en gegevensanalyse

Muis-cDNA-arrays

Muistumoren werden geanalyseerd op Vanderbilt University Microarray Core (VUMC)-geprinte 20 K muizen-cDNA-arrays, voornamelijk samengesteld uit PCR-producten afgeleid van drie bronnen: de 15 K National Institute of Aging muis-cDNA-bibliotheek, de Research Genetics-muis 5 K-set en een extra set cDNA's toegewezen aan RefSeq-transcripten. Labeling, hybridisatie, scanning en kwantitatieve evaluatie van deze tweekleurige kanaalarrays werden uitgevoerd volgens VUMC-protocollen [60] met behulp van een Universal Reference-standaard voor hele muizen (E17.5 hele foetale muis-RNA). Arrays werden geanalyseerd door GenePix versie 3.0 (MDS Inc., Sunnyvale, CA, VS), gemarkeerd en gefilterd op onbetrouwbare metingen, met kleurstofkanaalverhoudingen gecorrigeerd met behulp van Lowess en kleurstofspecifieke correctienormalisatie zoals eerder beschreven [15].

Menselijke Affymetrix-oligonucleotide-arrays

Menselijke RNA-monsters werden gelabeld voor hybridisatie met Affymetrix HG-U133plus2-microarrays met behulp van het door Affymetrix aanbevolen standaard labelingsprotocol (kleinschalig labelingsprotocol versie 2.0 met 0,5 μg totaal RNA Affymetrix Technical Bulletin). Microarrays werden gescand met MicroarraySuite versie 5.0 om 'CEL'-bestanden te genereren die werden verwerkt met behulp van het RMA-algoritme zoals geïmplementeerd door Bioconductor [15].

Analyse strategie

De vier verschillende muismodellen van CRC werden vergeleken op modelspecifieke verschillen, vervolgens vergeleken met de ontwikkelingsstadia van de dikke darm van de muis en vervolgens met menselijke CRC-monsters (Figuur 1). De gegevens van de muizentumormonsterarray zijn samengesteld uit Lowess-genormaliseerde Cy3: Cy5-labelingverhoudingen van elk afzonderlijk tumormonster versus een universeel E17.5-referentie-RNA van hele foetale muizen (beschreven met behulp van MIAME-richtlijnen in de NCBI GEO-database onder serietoegangsnummer GSE5261). De eerste benadering van referentie was het vergelijken van genormaliseerde ratio's over de tumorreeksen. Om dit te doen, werd voor elk gen de Lowess-gecorrigeerde ratio voor elk probe-element (monster versus E17.5 hele foetale muisreferentie) gedeeld door de mediane ratio voor die probe over de gehele tumormonsterreeks. Dit wordt de mediane expressieratio per tumor genoemd en was nuttig voor het identificeren, clusteren en visualiseren van verschillen die optreden tussen de verschillende tumormonsters. Omdat we eerder muisexpressiegegevens verzamelden voor normale E13.5-E18.5 colonmonsters van inteelt C57BL/6J en gekruiste CD-1-muizen [15] met behulp van de identieke E17.5 hele foetale muisreferentie, stelde dit ons in staat om de gegevens te combineren direct. Differentiële expressieprofielen in de tumoren werden gecombineerd met relatieve ontwikkelingsgenexpressieniveaus door directe vergelijkingen van verhoudingen bepaald binnen elke experimentele reeks. Initiële vergelijkingen werden gemaakt tussen mediane genormaliseerde tumorgegevens met genexpressieniveaus waargenomen in de E13.5-E18.5 en volwassen (acht weken postnataal) colonmonsters, die werden verwezen naar E13.5-monsters of naar het volwassen colon. De laatste benadering maakte vervolgens de breedste vergelijking mogelijk van muis- en mensgegevens met behulp van genorthologe mapping. Gecorreleerde verschijnselen konden worden waargenomen vanuit elk van de verschillende referentiestrategieën.

Inter-organisme gen ortholoog en inter-platform vergelijkingsstrategie

Paren van orthologgenen van mens en muis (12.693) werden samengesteld met behulp van de databases Mouse Genome Informatics (MGI The Jackson Laboratory) [61] en National Center for Biotechnology Information (NCBI) Homologene [62]. Individuele microarray-elementen of functies werden hieraan toegewezen. De aaneengeschakelde RefSeq ID's van mensen en muizen werden gebruikt als de samengestelde ID voor het orthologe genenpaar in de orthologe genoomdefinitie. NIA/Research Genetics muis-cDNA's werden toegewezen aan menselijke orthologen met behulp van een verscheidenheid aan bronnen, meestal via de Stanford Online Universal Reference-bron [63]. Gentranscripttoewijzingen werden uniek gemaakt door het langste corresponderende transcript te kiezen. Om de gegevens van de Affymetrix-array van mens en muis in het orthologe genoom in kaart te brengen, hebben we een benadering voor het matchen van sequenties gebruikt. Eerst hebben we transcriptsequenties van mensen en muizen verkregen van RefSeq [64] en probesequenties van de website van de fabrikant [65]. Vervolgens hebben we alle perfecte probe-transcriptparen berekend. We hebben probes uitgesloten die overeenkwamen met meerdere gensymbolen, maar accepteerden probes die met meerdere transcripten overeenkwamen. Probe-sets werden toegewezen om een ​​bepaald transcript te vertegenwoordigen als ten minste 50% van de perfect match-probes van de probe-set overeenkwamen met dat transcript. De nieuw toegewezen transcript-identifiers werden vervolgens gebruikt om probe-sets in kaart te brengen met orthologe genen. Omdat sommige transcripten meerdere probe-set-representaties hebben op zowel de Affymetrix- als cDNA-microarrays tot één orthologe identifier, hebben we een AD hoc strategie om het gemiddelde te gebruiken van die probesets of cDNA's die consistente regulatie vertoonden over een monsterreeks. In dergelijke gevallen werden de signalen van de gereguleerde sondesets die als in overeenstemming werden geïnterpreteerd, gemiddeld en toegewezen aan de overeenkomstige ortholoog. We hebben probesets of cDNA's uitgesloten waarvan we wisten dat ze overeenkwamen met niet-transcript genomische sequentie zoals getest met BLAT op de UCSC Goldenpath-website [66].

Muis-mens RefSeq gen orthologe toewijzingen zijn te vinden op GenomeTrafac [67, 68]. Alle orthologe toewijzingen en annotaties voor het in kaart brengen van verschillende soorten werden opgenomen in annotaties die verband houden met het Affymetrix HG-U133 plus2.0-genoom. Genexpressieverhoudingen verkregen voor de muizenmonsters werden vervolgens weergegeven als expressiewaarden binnen het menselijke platform voor alle probesets die waren toegewezen aan de overeenkomstige muisgen-ortholoog. Gegevens voor de primaire menselijke monsterreeksen, evenals de gecombineerde muis-mens-gegevenssets, zijn beschikbaar in de microarray-gegevensserver van het Cincinnati Children's Hospital Medical Center [69] in het HG-U133-genoom onder de KaiserEtAl_2006-mappen ('guest' login all cross-platform orthologe gen-ID's zijn opgenomen als annotatievelden in de HG-U133-genoomtabel).

Statistische en datavisualisatiebenaderingen

De meeste normalisatie, verwijzingen op expressieniveau, statistische vergelijkingen en gegevensvisualisatie werden uitgevoerd met behulp van GeneSpring v7.0 (Silicon Genetics-Agilent (onderdeel van Agilent Technologies). Fisher's exact-test werd online uitgevoerd op de MATFORSK Fisher's Exact Test-server [70]. Om differentieel uitgedrukte kenmerken tussen twee of meer klassen te identificeren, pasten we respectievelijk de Wilcoxon-Mann-Whitney- of de Kruskal-Wallis-test van GeneSpring toe. Voor drie of meer klassen werd de initiële niet-parametrische test gevolgd door de Student-Newman-Keuls post-hoc toets. Resultaten van de primaire analyses werden gecorrigeerd voor meerdere testeffecten door Benjamini en Hochberg false discovery rate (FDR) correctie toe te passen [71]. In het algemeen konden, vanwege de referentiestrategieën, goede technische prestaties van het platform en matig lage biologische variatie van genexpressie binnen de groep, strikte grenswaarden worden gebruikt, dat wil zeggen dat het FDR-niveau van significantie werd ingesteld tussen FDR < 5.10-5 en FDR < 5.10 -4 . K-means-clustering werd uitgevoerd met behulp van de GeneSpring K-means-tool en de Pearson-correlatieovereenkomstmaat.

Op ontologie gebaseerde analyse van gencluster-geassocieerde functionele correlaten

Genexpressieclusters werden geanalyseerd op het voorkomen van meerdere genen die betrokken zijn bij verwante genfunctiecategorieën door elke lijst van gecoördineerd gereguleerde geclusterde genen te vergelijken met categorieën binnen Gene Ontology, pathways of op literatuur gebaseerde genassociaties met behulp van GATACA [72], Ontoexpress [73] , en Ingenuity Pathway Analysis, versie 3 (IPA, Ingenuity Systems, Redwood City, CA, VS) [74]. Om dit te doen, werd elk cluster aangegeven in de figuren 2, 4, 5, 6 en 8 geconverteerd naar een lijst met gen-identifiers, geüpload naar de applicatie en onderzocht op oververtegenwoordiging van meerdere genen uit een of meer moleculaire netwerken, of functionele of ziekteassociaties zoals ontwikkeld uit literatuuronderzoek. Netwerken van deze focusgenen werden algoritmisch gegenereerd op basis van de relaties van individuele genen zoals afgeleid uit literatuuronderzoek en gebruikt om de biologische functies en/of geassocieerde pathologische processen te identificeren die het meest significant zijn voor elk gencluster. Fisher's exact test werd gebruikt om a . te berekenen P waarde die de waarschijnlijkheid schat dat een bepaalde functionele classificatie of categorie van genen meer geassocieerd is met een bepaald patroon of cluster van genexpressie dan op basis van toeval zou worden verwacht. Voor elk cluster worden alleen de belangrijkste functionele klassen en canonieke paden weergegeven. Figuur 7a toont een diagram van de canonieke WNT-signaleringsroute en een geassocieerd genennetwerk dat een topassociatie was van de clusters die significante overexpressie vertoonden in AOM en Apc Min/+ versus Smad3 -/- en Tgfb1 -/- Rag2 -/- muismodellen. Genen of genproducten worden weergegeven als knopen en biologische relaties tussen knopen worden weergegeven als randen (lijnen). Alle randen worden ondersteund door ten minste één literatuurverwijzing uit een manuscript of uit canonieke informatie die is opgeslagen in de Ingenuity Pathways Knowledge Base.

QRT-PCR

Om de validiteit van gegevensnormalisatie en referentieprocedures te bevestigen, evenals de cDNA-gentoewijzingen van de afgedrukte arrays die in de microarray-analyses worden gebruikt, hebben we qRT-PCR gebruikt om relatieve niveaus van negen genen te meten die door microarray-gegevensanalyse zijn gevonden om differentieel tot expressie te worden gebracht (FDR < 5.10 -5) in tumoren van Apc Min/+ en Smad3 -/- muizen. Totaal RNA's van C57BL6 Apc Min/+ en 129 Smad3 -/- tumormonsters (20 g) werden omgekeerd getranscribeerd naar cDNA met behulp van de cDNA-archiefkit met hoge capaciteit (oligo-dT primed Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). qRT-PCR-reacties (20 l) werden opgezet in MicroAmp-reactieplaten met 96 putjes (Applied Biosystems) met behulp van 10 ng cDNA-template in Taqman Universal PCR Master Mix en 6-FAM-gelabelde Assays-on-Demand primer-sondesets ( toegepaste biosystemen). De reacties werden uitgevoerd op een MX3000P (Stratagene, een divisie van Agilent Technologies) met geïntegreerde analysesoftware. Drempelcyclusnummers (Ct) werden bepaald voor elk doelgen met behulp van een algoritme dat een fluorescentiebasislijn toewijst op basis van metingen voorafgaand aan exponentiële amplificatie. Relatieve genexpressieniveaus werden berekend met behulp van de ΔΔCt-methode [75], met de Gusb gen als controle. Fold-change werd bepaald ten opzichte van expressie in normale volwassen colon van twee C57BL/6J-muizen.

Immunohistochemie

Immunohistochemische procedures werden uitgevoerd zoals beschreven [15]. Apc Min/+ en Smad3 -/- colontumoren werden snel ontleed, gefixeerd in 4% paraformaldehyde en ingebed in paraffine voordat 10 μm dikke coupes werden gesneden. Het terugwinnen van antigeen werd uitgevoerd door 20 minuten te koken in citraatbuffer, pH 6,0. Secties werden gedurende 30 minuten behandeld met 0,3% waterstofperoxide in PBS, gewassen in PBS, geblokkeerd in PBS plus 3% geitenserum en 0,1% Triton X-100, en vervolgens geïncubeerd met primaire antilichamen en HRP-geconjugeerd geit-anti-konijn secundair antilichaam (Sigma, St. Louis, MO, VS). Antigeen-antilichaamcomplexen werden gedetecteerd met een DAB-peroxidasesubstraatkit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, VS) volgens het protocol van de fabrikant.


Dankbetuigingen

De auteurs bedanken leden van het Harrison-laboratorium en de reviewers voor nuttige feedback op het manuscript. KNS werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) National Research Service award T32 GM007215. M.M.H. werd ondersteund door subsidie ​​R01GM11694 van het National Institute of General Medical Sciences en een Vallee Scholar Award.

Reviewer informatie

Natuur beoordelingen Genetica bedankt B. Cairns, K. Kuznetsova, N. Vastenhouw en de andere anonieme reviewer(s) voor hun bijdrage aan de peer review van dit werk.


Verhoogde activering van embryonale megakaryocyten veroorzaakt aneurysma's in de zich ontwikkelende hersenen van muizen zonder podoplanine

Christopher Hoover, Yuji Kondo, Bojing Shao, Michael J. McDaniel, Robert Lee, Samuel McGee, Sidney Whiteheart, Wolfgang Bergmeier, Rodger P. McEver, Lijun Xia Verhoogde activering van embryonale megakaryocyten veroorzaakt aneurysma's in de zich ontwikkelende hersenen van muizen zonder podoplanine. Bloed 2021 137 (20): 2756-2769. doi: https://doi.org/10.1182/blood.2020010310


Günesdogan Lab

Hackett JA*, Huang Y*, Günesdogan U*, Gretarsson KA, Kobayashi T, Surani MA.

NANOG alleen induceert kiemcellen in geprimede epiblast in vitro door activering van versterkers.

Murakami K*, Günesdogan U*, Zylicz JJ, Tang WWC, Sengupta R, Kobayashi T, Kim S, Butler R, Dietmann S, Surani MA.

Histontoevoer regelt de timing van de S-fase en de voortgang van de celcyclus.

Günesdogan U, Jäckle H, Herzig A.

Laatste nieuws

Elsa heeft haar masterscriptie afgerond

Mila en Julia hebben hun masterscriptie afgerond

Felicitaties aan Mila en Julia, de eerste studenten in onze groep die hun scriptie hebben voltooid!

Cera verzekert zich van fellowship

Van harte gefeliciteerd Cera, die een PhD fellowship heeft gekregen van het Boehringer Ingelheim Fonds!

Voorkeuren

Günesdogan Lab

Afdeling Ontwikkelingsbiologie
Universiteit van Göttingen, Duitsland
Fax: +49 551 395416


Activering van menselijke embryonale genexpressie in cytoplasmatische hybride embryo's geconstrueerd tussen runderoöcyten en menselijke fibroblasten

Cross-species somatic all number transfer (SCNT) biedt een mogelijke oplossing om het probleem van oöcytentekort voor therapeutisch klonen te overwinnen. Om het systeem verder te karakteriseren, hebben we hybride cytoplasma-embryo's tussen runderoöcyten en menselijke fibroblasten geconstrueerd en de dynamiek van menselijke genactivatie tijdens pre-implantatiestadia onderzocht. Gegevens uit deze studie toonden aan dat menselijke embryonale genen, OCT4, SOX2, NANOG, E-CADHERIN, evenals bèta-ACTIN, werden geactiveerd door ontkernde runderoöcyten. Activering van menselijke genen was gecorreleerd met het ontwikkelingspotentieel van de embryo's. De mate van menselijke genactivatie varieerde drastisch en was onvolledig in een groot deel van de embryo's. Activering van menselijke genen in de hybride embryo's van het cytoplasma van mens en rund vindt plaats in een temporeel patroon dat lijkt op dat van de rundersoort. Resultaten van deze studie suggereren dat menselijke genproducten nodig zijn voor hybride embryo's om zich te ontwikkelen tot latere pre-implantatiestadia. Het vergemakkelijken van activering van het menselijk genoom kan de succesvolle percentages in SCNT tussen soorten verbeteren.


Bekijk de video: Embryo Development Day 5 Using The Eeva Test (November 2021).