Informatie

6: Micro-organismen kweken - Biologie


6: Micro-organismen kweken

Microbiologische cultuur

EEN microbiologische cultuur, of microbiële cultuur, is een methode om microbiële organismen te vermenigvuldigen door ze te laten reproduceren in een vooraf bepaald kweekmedium onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Microbiële culturen zijn fundamentele en fundamentele diagnostische methoden die worden gebruikt als onderzoeksinstrument in de moleculaire biologie.

Microbiële culturen worden gebruikt om het type organisme, de overvloed in het te testen monster of beide te bepalen. Het is een van de belangrijkste diagnostische methoden van de microbiologie en wordt gebruikt als een hulpmiddel om de oorzaak van infectieziekten te bepalen door het middel zich in een vooraf bepaald medium te laten vermenigvuldigen. Een keelkweek wordt bijvoorbeeld afgenomen door het weefsel achter in de keel af te schrapen en het monster in een medium te deppen om te kunnen screenen op schadelijke micro-organismen, zoals Streptococcus pyogenes, de veroorzaker van keelontsteking. [1] Bovendien wordt de term cultuur meer in het algemeen informeel gebruikt om te verwijzen naar het "selectief kweken" van een specifiek soort micro-organisme in het laboratorium.

Het is vaak essentieel om een ​​zuivere cultuur van micro-organismen te isoleren. Een zuivere (of axenisch) cultuur is een populatie van cellen of meercellige organismen die groeien in afwezigheid van andere soorten of typen. Een zuivere cultuur kan afkomstig zijn van een enkele cel of een enkel organisme, in welk geval de cellen genetische klonen van elkaar zijn. Voor het geleren van de microbiële cultuur wordt het medium van agarosegel (agar) gebruikt. Agar is een geleiachtige substantie afkomstig van zeewier. Een goedkoop alternatief voor agar is guargom, dat kan worden gebruikt voor de isolatie en het onderhoud van thermofielen.


6: Micro-organismen kweken - Biologie

Schoolbiologie: hoe micro-organismen te kweken - antibacteriële middelen testen

Micro-organismen zoals bacteriën kweken

Hoe micro-organismen te kweken en

testen van antibiotica en antiseptica-desinfectiemiddelen

Doc Brown's revisienotities over schoolbiologie: GCSE-biologie, IGCSE-biologie, biologie op O-niveau,

Amerikaanse klas 8, 9 en 10 wetenschappelijke cursussen op school of gelijkwaardig voor:

14-16 jarige studenten biologie

Deze pagina helpt u bij het beantwoorden van vragen zoals .

Hoe kweek je veilig micro-organismen in een laboratorium?

Hoe toets je eerlijk de effectiviteit van antibiotica?

Hoe analyseer je de resultaten van het testen van antibiotica?

Hoe bacteriën in het laboratorium te kweken?

Invoering

Je kunt bacteriën en andere micro-organismen laten groeien veilig in een school- of universiteitslaboratorium met behulp van de juiste procedures.

U kunt dan test de culturen van de bacteriën voor de effectiviteit van verschillende antibiotica, antiseptica en desinfectiemiddelen bij het remmen en doden van een bepaalde bacteriegroei - dit wordt beschreven in het 2e deel van deze pagina over groeiende micro-organismen.

De opstelling - uitrusting en materialen (diagram ==>)

Alle apparatuur moet worden gesteriliseerd voor gebruik om de groei van andere bacteriën uit te sluiten, behalve die waarin u experimenteel geïnteresseerd bent, voorkomt het ook besmetting van de laboratoriumomgeving.

De experimenten worden uitgevoerd in Petri schalen - ondiepe ronde kunststof/glazen containers waarover een goed sluitend deksel kan worden aangebracht.

De bacteriën worden gekweekt ('gekweekt') in een kweekmedium zoals agar gelei (gel) die het noodzakelijke voedsel bevat voor de micro-organisme-bacteriën om te groeien.

De agargel (voedingsbouillonoplossing) bevat koolhydraten, mineralen, eiwitten en vitamines gemengd met water - de bacteriën kunnen niet groeien zonder water dat voedingsstoffen bevat, maar het moet gelei-achtige voedzame bouillon zijn.

In de farmaceutische industrie wordt de Mueller-Hinton agar gebruikt voor het testen van antibiotica.

Eén recept gebruikt een mix van rundvlees, melkeiwit en bloed en is goed voor het kweken van menselijke ziekteverwekkers.

Wanneer geïnoculeerd met een pathogeen, zouden de agarplaten worden geïncubeerd bij

37 o C (de lichaamstemperatuur).

Op scholen zouden de agargels nooit boven 25°C worden geïncubeerd vanwege het risico op groeiende kolonies van ziekteverwekkers.

Hete vloeibare agargelei wordt in de petrischaal gegoten en afgekoeld en in een stevige gelachtige toestand gezet.

Het geselecteerde micro-organisme dat moet worden onderzocht, kan vervolgens worden overgebracht op het oppervlak van het kweekmedium met behulp van een entlus die vooraf is gesteriliseerd door het in een bunsenbrandervlam te verwarmen.

Sommige vloeibare bacterieculturen bevinden zich in flesjes, deze moeten zo kort mogelijk worden geopend terwijl u de cultuur over de gel verspreidt om te voorkomen dat er ander micro-organisme uit de lucht binnendringt.

Het deksel wordt over de petrischaal geplaatst en vastgezet met een beetje plakband, maar niet volledig verzegeld met plakband.

De kweek (agargel + micro-organisme in de petrischaal) kan bij een geschikte temperatuur worden geïncubeerd om de bacteriën te stimuleren om te groeien en zich te vermenigvuldigen.

De platen worden ondersteboven geïncubeerd om te voorkomen dat condensdruppels op het agar-oppervlak vallen.

Wanneer een bepaalde bacterie over het oppervlak van de agargel wordt verspreid (bijv. met een entlus), ziet u kolonies groeien die zich uiteindelijk over het hele oppervlak zal verspreiden, hopelijk met een gelijkmatige laag van de geselecteerde bacteriën als deze zich vermenigvuldigt.

Met een ruime toevoer van voedingsstoffen en een geschikte temperatuur, zullen de bacteriën zich vermenigvuldigen door binaire splitsing waarbij één cel in tweeën splitst.

Deze continue deling in een levende bacterie resulteert in: kolonie dat zich over de agargel verspreidt.

Een kolonie bevat miljoenen bacteriën.

Een bacterie kan een gemiddelde delingstijd van minuten hebben, b.v. 15 minuten en de wiskunde is eng!

Ik bedoel niet dat het moeilijk is, maar in 5 uur (300 minuten) kunnen er 600/15 = 20 divisies zijn.

Dus na 5 uur is er 2 20 meer dan 1 miljoen bacteriën!

(theoretisch micro-organisme 1 048 576 cellen, maar sommige kunnen daarbij sterven)

Opmerking over bacteriegroeicurven

Je kunt de groei van een bacteriekolonie gedurende vele uren volgen en eindigen met dit soort grafieken.

1. De lag-fase: Voor de initiële lag-fase is er geen celdeling, maar de bacteriën kopiëren hun DNA en synthetiseren de benodigde eiwitten.

2. De exponentiële groeifase: Veel voedsel beschikbaar, waardoor celdeling snel plaatsvindt en het aantal bacteriën in relatief korte tijd kan verdubbelen waardoor de 'versnelling' in de grafieklijn ontstaat.

3. De stationaire fase De groei van de kolonie kan niet blijven versnellen omdat de voedingsbronnen uitgeput raken. Uiteindelijk is de snelheid van bacteriegroei gelijk aan de snelheid van bacteriesterfte en wordt de grafieklijn horizontaal. Als je meer voedsel introduceert, kan de kolonie weer groeien, maar anders.

4. De doodsfase: Niet alleen worden hulpbronnen verminderd, maar bacteriën produceren toxines als afvalproduct, waardoor de levende bacteriën worden vergiftigd en de kolonie gestaag in aantal afneemt.

Veiligheidsopmerkingen en zorgen voor niet-verontreinigde culturen voorafgaand aan het testen van 'antibacteriële middelen'

Culturen van micro-organismen mogen niet boven de 25 o C worden gehouden omdat er bij lagere temperaturen minder kans is dat schadelijke ziekteverwekkers (micro-organismen die ziekten veroorzaken) groeien.

In onderzoekslaboratoria van universiteiten en de industrie kunnen culturen veilig bij hogere temperaturen worden geïncubeerd om ze sneller te laten groeien - tijd is geld!

Als de kweek besmet is met ongewenste micro-organismen, zullen deze uw resultaten beïnvloeden en sommige zelfs ziekteverwekkers!

Te nemen voorzorgsmaatregelen - het gebruik van aseptische technieken

Aseptische technieken zijn ontworpen om besmetting door ongewenste micro-organismen voorkomen die uw resultaten kunnen beïnvloeden, d.w.z. de groei van ziekteverwekkers.

Desinfecteer alle werkoppervlakken in het laboratorium - alcohol is zeer effectief, maar zeer brandbaar!

De agargel, al het glaswerk en andere apparatuur moeten voor gebruik worden gesteriliseerd.

De petrischalen en het kweekmedium - agargel, moeten allemaal worden gesteriliseerd voordat het experiment wordt uitgevoerd door tot een hoge temperatuur te verwarmen, b.v. >100 o C.

Dit kan in een autoclaaf die stoom onder hoge druk gebruikt om eventueel aanwezige micro-organismen/pathogenen te doden.

De hogere temperatuur zou alle ongewenste micro-organismen moeten doden.

Het metaal entlus is gesteriliseerd door het in een brullende blauwe bunsenvlam te plaatsen totdat het rood gloeit - geen micro-organisme zal deze hittebehandeling overleven!

De vloeibare bacterieculturen moeten in speciale kweekflesjes met deksel worden bewaard.

De deksels mogen slechts kort worden verwijderd, wanneer de bacteriën naar de petrischalen worden overgebracht, om te voorkomen dat andere micro-organismen binnendringen.

Je kunt de hals van een glazen container met bacteriën kort afbranden net nadat deze is geopend en net voordat deze is gesloten - de hete convectielucht verplaatst lucht uit de container en voorkomt dat microben in de lucht binnenkomen.

Wanneer de petrischaal klaar is met de agargel toegevoegd en gezet, moet er een licht getapet deksel op worden geplaatst om te voorkomen dat micro-organismen in de lucht binnendringen.

De petrischalen moeten ondersteboven worden bewaard om te voorkomen dat er condensdruppels op de agargelei vallen.

De bereide agargel petrischalen mag niet worden geïncubeerd voor het geval er andere bacteriën beginnen te groeien.

Na gebruik de agarplaten moeten worden gesteriliseerd in een autoclaaf om de stappen te voltooien om besmetting te voorkomen - om voltooi de aseptische procedure.

Een autoclaaf is een apparaat dat stoom onder druk gebruikt om schadelijke bacteriën, virussen, schimmels en sporen te doden op items die in het verwarmde drukvat worden geplaatst. De te steriliseren artikelen worden gedurende een bepaalde tijd verwarmd tot een geschikte sterilisatietemperatuur.

Om de vergelijkende effectiviteit van antibiotica of antiseptica te testen

Inleiding tot testen en de redenen om tests te doen

Veel onschadelijke bacteriën leven op onze huid en in ons spijsverteringsstelsel. In ons spijsverteringsstelsel voorkomen ze dat schadelijke bacteriën zich in ons lichaam ophopen en helpen ze nuttige voedingsstoffen te produceren die je lichaam kan opnemen. Darmbacteriën hebben een reeks enzymen die complexe suikers kunnen afbreken en tal van andere metabolische chemische reacties kunnen vergemakkelijken.

Helaas kunnen we worden binnengevallen door schadelijke organismen, b.v. ziekteverwekkers zoals sommige bacteriën die ziekten veroorzaken.

Er zijn verschillende laboratoriummethoden ontwikkeld om potentieel schadelijke bacteriën te kweken (kweken) en verschillende chemicaliën te testen om hun schadelijke effecten te doden of tegen te gaan, d.w.z. hoe antibiotica en antiseptica-desinfectiemiddelen te testen.

Je moet weten hoe effectief? een antibioticum of antiseptische chemische stof is.

Helaas kunnen bacteriën muteren en ontstaan ​​er verschillende stammen die resistent zijn tegen de momenteel gebruikte antibiotica. Daarom is er een constante vraag naar de farmaceutische industrie om nieuwe effectieve antibiotica te ontwikkelen.

De bereidingsagarplaten zijn hierboven al beschreven in de eerste sectie, dus hier pakken we het verhaal op met vooraf voorbereide agargelplaten die klaar zijn om antibiotica of antiseptica enz.

OPMERKING: Middelen voor de bestrijding van ziekteverwekkers

Een antibioticum doodt bacteriën in het lichaam.

Antiseptica doden bacteriën buiten het lichaam bijv. op je huid aangebracht..

Desinfecterende middelen worden gebruikt om oppervlakken te reinigen anders dan uw lichaam b.v. keukenwerkbladen en toiletten.

Voorbereiding van de testmonsters en het uitvoeren van het experimentele onderzoek.

De bereiding van geënte petrischalen is hierboven al beschreven en NIET geïncubeerd.

Je kunt petrischaaltjes van agar gelei plus a enkele geselecteerde bacteriën om de effectiviteit van verschillende antibiotica, antiseptica en ontsmettingsmiddelen te testen bij het remmen en doden van een bepaalde bacteriegroei.

Het is erg belangrijk dat de bacteriestam die voor de tests is gekozen, vertegenwoordiger van de populatie bacteriën.

De disc-diffusietechniek

Je week kleine ronde papieren schijfjes (allemaal even groot) geïmpregneerd met verschillende soorten antibiotica / antiseptica, laat ze uitlekken en plaats ze op het oppervlak zodat ze verspreiden over een gelijkmatig met bacteriën gecoat oppervlak van de agargel.

De bacteriën moeten zeer gelijkmatig worden verspreid om er een eerlijke test van te maken, en de antibiotica-testschijven moeten worden uitgespreid om de vorming van remzones mogelijk te maken

Een inhibitie zone is waar het antibioticum effectief is in het doden van de bacteriën (zie onderstaande afbeelding, met een fictieve bacteriestam en vier fictieve antibiotica).

De petrischaal en inhoud zijn voor b.v. 48 uur om

25 o C waarna het klaar is om onderzocht te worden en de resultaten te analyseren.

Met deze opstelling kun je antibiotica, antiseptica en plantenextracten (*) testen om hun effectiviteit te onderzoeken bij het doden of remmen van de groei van gekweekte bacteriën.

(*Sommige planten produceren hun eigen antiseptica als onderdeel van hun afweersysteem tegen ziekteverwekkers))

De antibiotica/antiseptica (monsters A1 tot A4 op het diagram) gedrenkt in de ronde papieren schijfjes zal diffunderen in de agargelei en kan de bacteriën al dan niet doden.

Als het antibioticum/antisepticum werkt, worden de bacteriën gedood, waardoor de groei wordt geremd, er zal een 'vrijgemaakt' gebied rond de schijf groeien - een zogenaamde inhibitie zone - zie schema hierboven.

Als de bacteriën resistent zijn tegen het antibioticum/antisepticum, zal de kolonie blijven groeien op de agargel rond de papieren schijfjes.

Het is belangrijk dat de bacteriën oorspronkelijk zeer gelijkmatig over de agargel werden verspreid. Als dit het geval is, moeten de remzones uniform cirkelvormig en er moet een uniforme groei van de bacteriën zijn over de rest van de agarplaat.

Alle agarplaten moeten worden weggegooid waar de zones niet cirkelvormig zijn of als er een slechte inconsistente groei van de bacteriekolonie is.

U kunt dan metingen doen als alles in orde lijkt.

De diameter (radius = diameter / 2) van de remzone meet je met een mm-liniaal.

U berekent dan de oppervlakte van de remmingszone voor een specifiek antibioticum uit: π x r 2 .

De hoe groter de remmingszone, hoe effectiever het antibioticum/antisepticum tegen de specifieke bacteriestam die op de agargel groeit.

Als u een antibioticum/antisepticum heeft resistente bacteriën, dan zullen de bacteriën rond de papieren schijf blijven groeien.

U kunt deze experimentele procedure gebruiken om zowel antibiotica als antiseptica te testen.

De resultaten analyseren

C is gewoon een papieren schijf gedrenkt in steriel water om als controle te fungeren.

. het zou geen effect moeten hebben op de bacteriegroei

. het mag ook geen ander verontreinigend micro-organisme introduceren

. dit gaat allemaal over een eerlijke test om aan te tonen dat elke remming te wijten is aan het antisepticum

. en elk gebrek aan remming is te wijten aan de antibacteriële eigenschappen van de bacteriën die worden onderzocht.

Antibioticum/antiseptisch A1 is een ineffectief antibioticum met betrekking tot de specifieke bacteriën die worden onderzocht - deze bacteriestam is alleen antibioticaresistent met betrekking tot A1.

Antibioticum/antiseptisch A2 heeft een zwak antibacteriële werking - kleine remzone.

Antibioticum/antiseptisch A3 is een 'matig' effectief in zijn antibacteriële werking.

Antibioticum/antiseptisch A4 is zeer effectief in het doden van deze specifieke bacteriestam - de grootste remmingszone.

U kunt de effectiviteit van de antibiotica/antiseptica kwantitatief meten door het gebied van de dode bacteriën te berekenen - beter en nauwkeuriger dan alleen een oppervlakkige visuele beoordeling.

De diameter van het cirkelvormige gebied meet je zo nauwkeurig mogelijk met een liniaal (bijvoorbeeld in mm) waar geen bacteriën meer groeien - zie rechts in het experimentdiagram hierboven.

relatief effect van antibioticum/antisepticum

= Oppervlakte van cirkel = π x r 2 bijv. in mm2. (pi = 3,14, r = diameter/2)

Voorbeeldberekening van relatieve effectiviteit:

Stel dat in het experiment de diameter van de remzones 10 mm was voor testmonster A3 en 20 mm voor monster A4.

Relatief effect van A3 = 3,14 x (10/2) 2 = 78,5

Relatief effect van A4 = 3,14 x (20/2) 2 = 314

314/78.5 = 4.0: dus antibioticum/antiseptisch A4 is vier keer effectiever dan A3.

U kunt dezelfde diametermeting en berekeningstechniek gebruiken om de gebied van een kolonie. van een bacteriestam.

Variaties op het experiment

U kunt het antibioticum/antisepticum constant houden en de concentratie ervan variëren op de papieren filterschijven.

Je kunt het antibioticum constant houden en het agaroppervlak bedekken met 'strips' van verschillende bacteriestammen.

Als alternatief kunt u een specifiek antibioticum mengen met de agargel en het oppervlak vervolgens behandelen met verschillende bacteriestammen.

U kunt dan het groeigebied meten om de effectiviteit van het antibioticum bij het doden van die specifieke bacterie te testen.

Praktisch werk op scholen en universiteiten - gezondheids- en veiligheidsoverwegingen

onbesmet culturen van micro-organismen zijn nodig voor onderzoek naar de werking van desinfectiemiddelen en antibiotica.

Petrischalen en kweekmedia moeten vóór gebruik worden gesteriliseerd om ongewenste micro-organismen te doden.

Entlussen die worden gebruikt om micro-organismen naar de media over te brengen, moeten worden gesteriliseerd door ze door een vlam te leiden.

Het deksel van de petrischaal moet worden vastgezet met plakband om te voorkomen dat micro-organismen uit de lucht de cultuur besmetten.

In school- en universiteitslaboratoria moeten culturen worden geïncubeerd bij een maximale temperatuur van 25 ° C, wat de kans op groei van ziekteverwekkers die schadelijk kunnen zijn voor de mens aanzienlijk vermindert.

In industriële omstandigheden kunnen hogere temperaturen leiden tot een snellere groei van ongewenste, potentieel schadelijke micro-organismen.

Alle praktische werkzaamheden en onderzoeken die je hebt gedaan, moeten ook worden herzien - goed contextmateriaal voor examenvragen! Zie onder!

Hopelijk je school praktisch werk zal het volgende bevatten (dat ook moet worden herzien, helpt bij het begrijpen van 'hoe wetenschap werkt' en vragen over contextonderzoek):

Onderzoek de effectiviteit van verschillende antibioticaschijven bij het doden van bacteriën.

Het kweken van micro-organismen in petrischalen om de steriele techniek te demonstreren en het kweken van zuivere culturen.

Micro-organismen worden gekweekt in een kweekmedium dat meestal bestaat uit agar-gelei die koolhydraten, mineralen, eiwitten en vitamines bevat die alle voedingsstoffen leveren die nodig zijn voor celgroei.

Gebruik van voorgeïnoculeerde agar in petrischalen om het effect van ontsmettingsmiddelen en antibiotica te evalueren.

De hete vloeibare agargelei wordt in ondiepe petrischalen gegoten om af te koelen en op te stijven - net als een gelei!

De petrischalen moeten worden afgedekt met een luchtdicht deksel om te voorkomen dat micro-organismen uit de omringende lucht de experimenten besmetten.

Draadlussen, gesteriliseerd in een hete vlam, worden gebruikt om micro-organismen over te brengen op de agargelei, waar ze zich vermenigvuldigen en vrij snel vele kolonies produceren - veel om van te eten!

Als de draadlus niet wordt gesteriliseerd, kunnen andere bacteriën het experiment besmetten en zullen deze andere micro-organismen de resultaten verwarren.

Kleine stukjes poreus papier (filterpapier?) gedrenkt in verschillende antibiotica worden op de bacteriekolonies op de gelei geplaatst.

Je kunt dan zien welke antibiotica welke bacteriën doden, maar de antibioticaresistente bacteriën blijven groeien.

In de farmaceutische en medische industrie, waar extreem gevaarlijke ziekteverwekkers worden onderzocht, is extreem strikte gezondheids- en veiligheidsregelgeving essentieel voor zowel de veiligheid van werknemers als leden van het grote publiek.

Computersimulaties zien om te modelleren

(i) de groei van bacteriekolonies in wisselende omstandigheden,

(ii) de werking van het immuunsysteem en het effect van antibiotica en vaccins.

Enkele bijbehorende pagina's

Trefwoorden voor gcse biologie revisie opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - testen van antibiotica: GCSE 9-1 biologie biologische wetenschap IGCSE revisie opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - testen van antibiotica KS4 biologie wetenschappelijke opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - testen van antibiotica GCSE biologie gids opmerkingen over kweken micro-organismen zoals bacteriën - testen van antibiotica voor scholen hogescholen academies wetenschap cursus docenten afbeeldingen afbeeldingen diagrammen voor het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - testen van antibiotica wetenschappelijke herziening opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - testen van antibiotica voor het herzien van biologie modules biologie onderwerpen opmerkingen om te helpen bij het begrijpen van het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - testen van antibiotica universitaire cursussen in de biologische wetenschappen loopbanen in de wetenschap biologie banen in de farmaceutische industrie biologisch laboratorium assistent leerlingplaatsen technische stages in de biologie VS VS graad 8 graad 9 graad10 AQA GCSE 9-1 biologie wetenschappelijke opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - het testen van antibiotica GCSE opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - het testen van antibiotica Edexcel GCSE 9-1 biologie wetenschappelijke opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - het testen van antibiotica voor OCR GCSE 9-1 Biologie wetenschappelijke opmerkingen van de 21e eeuw over het kweken micro-organismen zoals bacteriën - antibiotica testen OCR GCSE 9-1 Gateway biologie wetenschappelijke opmerkingen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - antibiotica testen WJEC gcse wetenschap CCEA/CEA gcse wetenschap gcse biologie herzieningsaantekeningen over het kweken van micro-organismen zoals bacteriën - antibiotica testen


Wat is het doel van subcultuur in de microbiologie?

Het doel van subculturen in de microbiologie is om een ​​microbemonster te laten groeien en in stand te houden dat geschikt is voor experimenten en tests. Subkweek verlengt de levensduur van de cellen of micro-organismen, waardoor onderhoud en observatie van de cultuur op lange termijn mogelijk is.

Het proces van subculturen omvat het overbrengen van microben van de ene groeicontainer naar de andere, waardoor de microben een verse voorraad voedingsstoffen krijgen op een vast of vloeibaar medium. Door subculturen kan de analist de parameters van de habitat van een microbe veranderen, zoals de temperatuur en de fysieke omgeving, om informatie te verkrijgen die wordt gebruikt bij het identificeren van soorten. Begrijpen waar een microbiële cultuur leeft of sterft, helpt om zijn stam te isoleren. In sommige gevallen kan een microbiële cultuur worden geïdentificeerd op basis van de tijd die nodig is om nieuwe groei te laten verschijnen na de overdracht van de subcultuur.

Petrischalen met agar, een geleiachtige substantie gemaakt van zeewier, worden gebruikt als een vaste omgeving om micro-organismen te laten groeien. Wanneer een vloeibare omgeving nodig is, wordt een kunstmatige voedingsbouillon gebruikt. Culturen met gemengde micro-organismen die in een bouillon worden gekweekt, moeten worden gesubcultureerd op een vast medium om kolonies te isoleren voor nauwkeurige identificatie. Eenmaal op het agar-oppervlak vertegenwoordigt elke microbekolonie een enkele soort micro-organisme, afkomstig van de vermenigvuldiging van een enkele cel. Deze afgebakende en geïsoleerde kolonie wordt een zuivere cultuur genoemd en is een essentieel startpunt in microbiologisch onderzoek.


De VIS-techniek

FISH is een hybridisatietechnologie die het labelen van doel-RNA's met een fluorescerende probe mogelijk maakt.

Leerdoelen

Beschrijf hoe fluorescente in situ hybridisatie (FISH) wordt gebruikt in klinische en biomedische studies om de aan- of afwezigheid van specifieke DNA-sequenties te detecteren en te lokaliseren en om pathogenen te identificeren

Belangrijkste leerpunten

Belangrijkste punten

  • FISH kan in een klinische setting worden gebruikt om pathogenen of DNA / RNA-doelen van belang te identificeren.
  • FISH wordt gebruikt om de aan- of afwezigheid van specifieke DNA- of RNA-sequenties in weefsel of cellen te detecteren en te lokaliseren.
  • FISH kan ook worden gebruikt om de genomen van twee biologische soorten te vergelijken, zoals in ecologische studies, waar een bacterie mogelijk niet kweekbaar is, kan deze worden geïdentificeerd met FISH.

Sleutelbegrippen

  • fluorescentie: De emissie van licht (of andere elektromagnetische straling) door een materiaal wanneer gestimuleerd door de absorptie van straling of van een subatomair deeltje
  • hybridiseren: Om complementaire subeenheden van meerdere biologische macromoleculen te combineren.
  • VIS: Fluorescentie in situ hybridisatie is een cytogenetische techniek die wordt gebruikt om de specifieke DNA- of RNA-sequenties te detecteren en te lokaliseren.

FISH (fluorescentie in situ hybridisatie) is een cytogenetische techniek die begin jaren tachtig door biomedische onderzoekers is ontwikkeld. Het wordt gebruikt om de aan- of afwezigheid van specifieke DNA-sequenties op chromosomen te detecteren en te lokaliseren. FISH maakt gebruik van fluorescerende sondes die binden aan die doelen die een hoge mate van sequentiecomplementariteit vertonen. FISH kan worden gebruikt om RNA- of DNA-sequenties van belang te detecteren. FISH wordt vaak gebruikt voor het vinden van specifieke kenmerken in DNA voor gebruik bij genetische counseling, medicijnen en soortidentificatie. FISH kan ook worden gebruikt om specifieke RNA-doelen, waaronder mRNA's, in cellen te detecteren en te lokaliseren. In deze context kan het helpen bij het definiëren van de ruimtelijk-temporele patronen van genexpressie in cellen en weefsels.

Centraal in FISH staat het gebruik van sondes. De probe moet groot genoeg zijn om specifiek met zijn doelwit te hybridiseren, maar niet zo groot dat het hybridisatieproces wordt belemmerd. Ze zijn anti-sense voor het doelwit-mRNA of DNA van belang, dus hybridiseren ze met doelwitten. De sonde kan direct worden gelabeld met fluoroforen, of met doelen voor fluorescerend gelabelde antilichamen of andere substraten. Er kunnen verschillende soorten tags worden gebruikt, waardoor verschillende doelen tegelijkertijd in hetzelfde monster kunnen worden gedetecteerd (multi-colour FISH). Tagging kan op verschillende manieren worden gedaan, zoals nick-translatie of PCR met behulp van getagde nucleotiden. Probes kunnen in lengte variëren van 20 tot 30 nucleotiden tot veel langere sequenties.

Dual label FISH-afbeelding: Hier is een voorbeeld van FISH die wordt gebruikt om bifidobacteriën (rood) en andere bacteriën (groen) te onderscheiden

FISH wordt vaak gebruikt in klinische studies. Als een patiënt is geïnfecteerd met een vermoedelijk pathogeen, worden bacteriën uit de weefsels of vloeistoffen van de patiënt meestal op agar gekweekt om de identiteit van het pathogeen te bepalen. Veel bacteriën, zelfs bekende soorten, groeien echter niet goed onder laboratoriumomstandigheden. FISH kan worden gebruikt om de aanwezigheid van de verdachte direct te detecteren op kleine monsters van het weefsel van de patiënt. FISH kan ook worden gebruikt om de genomen van twee biologische soorten te vergelijken, om evolutionaire relaties af te leiden. Een vergelijkbare hybridisatietechniek wordt een zoo-blot genoemd. Bacteriële FISH-sondes zijn vaak primers voor het 16s-rRNA-gebied. FISH wordt veel gebruikt op het gebied van microbiële ecologie, om micro-organismen te identificeren. Biofilms zijn bijvoorbeeld samengesteld uit complexe (vaak) multi-species bacteriële organisaties. Door DNA-sondes voor één soort voor te bereiden en FISH met deze sonde uit te voeren, kan men de verspreiding van deze specifieke soort in de biofilm visualiseren. Het voorbereiden van sondes (in twee verschillende kleuren) voor twee soorten maakt het mogelijk om co-lokalisatie van deze twee soorten in de biofilm te visualiseren / bestuderen en kan nuttig zijn bij het bepalen van de fijne architectuur van de biofilm.


Inhoud

Het bestaan ​​van micro-organismen werd eeuwenlang verondersteld voordat ze daadwerkelijk werden ontdekt. Het bestaan ​​van ongezien microbiologisch leven werd gepostuleerd door het jaïnisme, dat al in de 6e eeuw v.Chr. gebaseerd is op Mahavira's leringen. [7] Paul Dundas merkt op dat Mahavira het bestaan ​​beweerde van onzichtbare microbiologische wezens die in aarde, water, lucht en vuur leven. [8] Jain-geschriften beschrijven nigodas die submicroscopische wezens zijn die in grote clusters leven en een zeer kort leven hebben, waarvan wordt gezegd dat ze elk deel van het universum doordringen, zelfs in weefsels van planten en vlees van dieren. [9] De Romein Marcus Terentius Varro verwees naar microben toen hij waarschuwde voor het lokaliseren van een woning in de buurt van moerassen "omdat er bepaalde minuscule schepsels zijn gefokt die niet met het oog kunnen worden gezien, die in de lucht zweven en het lichaam binnendringen via mond en neus en daardoor ernstige ziekten veroorzaken." [10]

In de gouden eeuw van de islamitische beschaving veronderstelden Perzische wetenschappers het bestaan ​​van micro-organismen, zoals Avicenna in zijn boek De canon van de geneeskunde, Ibn Zuhr (ook bekend als Avenzoar) die schurftmijten ontdekte, en Al-Razi die de vroegst bekende beschrijving van pokken gaf in zijn boek Het deugdzame leven (al-Hawi). [11]

In 1546 stelde Girolamo Fracastoro voor dat epidemische ziekten werden veroorzaakt door overdraagbare zaadachtige entiteiten die infectie konden overbrengen door direct of indirect contact, of overdracht door voertuigen. [12]

In 1676 observeerde Antonie van Leeuwenhoek, die het grootste deel van zijn leven in Delft, Nederland woonde, bacteriën en andere micro-organismen met behulp van een door hem ontworpen microscoop met één lens. [17] [2] Hij wordt beschouwd als de grondlegger van de microbiologie, aangezien hij een pionier was in het gebruik van eenvoudige microscopen met één lens van zijn eigen ontwerp. [17] Terwijl Van Leeuwenhoek vaak wordt genoemd als de eerste die microben observeerde, maakte Robert Hooke zijn eerste geregistreerde microscopische observatie, van de vruchtlichamen van schimmels, in 1665. [20] Er is echter gesuggereerd dat een jezuïetenpriester genaamd Athanasius Kircher was de eerste die micro-organismen observeerde. [21]

Kircher was een van de eersten die toverlantaarns ontwierp voor projectiedoeleinden, dus hij moet goed bekend zijn geweest met de eigenschappen van lenzen. [21] Hij schreef "Over de wonderbaarlijke structuur van de dingen in de natuur, onderzocht door een microscoop" in 1646, waarin hij verklaarde: "wie zou geloven dat azijn en melk rijk zijn aan een ontelbare veelheid aan wormen." Hij merkte ook op dat verrot materiaal vol zit met ontelbare kruipende diertjes. Hij publiceerde zijn Scrutinium Pestis (Onderzoek van de pest) in 1658, waarin hij correct verklaarde dat de ziekte werd veroorzaakt door microben, hoewel hij hoogstwaarschijnlijk rode of witte bloedcellen zag in plaats van de plaag zelf. [21]

Het gebied van bacteriologie (later een subdiscipline van de microbiologie) werd in de 19e eeuw opgericht door Ferdinand Cohn, een botanicus wiens studies over algen en fotosynthetische bacteriën hem ertoe brachten verschillende bacteriën te beschrijven, waaronder Bacil en Beggiatoa. Cohn was ook de eerste die een schema formuleerde voor de taxonomische classificatie van bacteriën en die endosporen ontdekte. [22] Louis Pasteur en Robert Koch waren tijdgenoten van Cohn en worden vaak beschouwd als de grondleggers van respectievelijk de moderne microbiologie [21] en de medische microbiologie. [23] Pasteur is het meest bekend om zijn reeks experimenten die bedoeld waren om de toen wijdverbreide theorie van spontane generatie te weerleggen, waardoor de identiteit van de microbiologie als biologische wetenschap werd bevestigd. [24] Een van zijn studenten, Adrien Certes, wordt beschouwd als de grondlegger van de mariene microbiologie. [25] Pasteur ontwierp ook methoden voor het bewaren van voedsel (pasteurisatie) en vaccins tegen verschillende ziekten zoals miltvuur, kippencholera en hondsdolheid. [2] Koch is vooral bekend om zijn bijdragen aan de ziektekiemtheorie, waarmee hij aantoont dat specifieke ziekten werden veroorzaakt door specifieke pathogene micro-organismen. Hij ontwikkelde een reeks criteria die bekend zijn geworden als de postulaten van Koch. Koch was een van de eerste wetenschappers die zich richtte op de isolatie van bacteriën in pure cultuur, wat resulteerde in zijn beschrijving van verschillende nieuwe bacteriën, waaronder: Mycobacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose. [2]

Hoewel Pasteur en Koch vaak worden beschouwd als de grondleggers van de microbiologie, weerspiegelde hun werk niet nauwkeurig de ware diversiteit van de microbiële wereld vanwege hun exclusieve focus op micro-organismen met directe medische relevantie. Pas aan het einde van de 19e eeuw en het werk van Martinus Beijerinck en Sergei Winogradsky werd de ware reikwijdte van de microbiologie onthuld. [2] Beijerinck leverde twee belangrijke bijdragen aan de microbiologie: de ontdekking van virussen en de ontwikkeling van verrijkingscultuurtechnieken. [26] Terwijl zijn werk aan het tabaksmozaïekvirus de basisprincipes van de virologie vestigde, was het zijn ontwikkeling van verrijkingscultuur die de meest directe impact had op de microbiologie door de teelt van een breed scala aan microben met enorm verschillende fysiologieën mogelijk te maken. Winogradsky was de eerste die het concept van chemolithotrofie ontwikkelde en daarmee de essentiële rol onthulde die micro-organismen spelen in geochemische processen. [27] Hij was verantwoordelijk voor de eerste isolatie en beschrijving van zowel nitrificerende als stikstofbindende bacteriën. [2] De Frans-Canadese microbioloog Felix d'Herelle was in 1917 mede-ontdekker van bacteriofagen en was een van de vroegst toegepaste microbiologen. [28]

Joseph Lister was de eerste die fenolontsmettingsmiddel op de open wonden van patiënten gebruikte. [29]


INVOERING

Zoals voorgesteld door Robert Koch, is een zuivere cultuur de basis van al het onderzoek naar infectieziekten (1, 2). De eerste isolatie van een bacterie maakt het ontwerpen van experimentele modellen mogelijk om de virulentie te analyseren en om de criteria van Koch te voltooien, waardoor een verband wordt gelegd tussen micro-organismen en infectieziekten (3). Bacteriecultuur maakt het ook mogelijk de gevoeligheid van bacteriën voor antibiotica te bestuderen en is de eerste stap bij het opstellen van aanbevelingen voor een effectieve behandeling (4, 5). Het verkrijgen van een zuivere bacteriecultuur maakt ook genoomsequencing van deze stammen (6, 7) en proteomische studies mogelijk om specifieke eiwitten te markeren en hun antigeniteit te analyseren door middel van immunoproteomische technieken, waardoor uiteindelijk de productie van deze eiwitten wordt vergemakkelijkt, die dienen als antigenen voor serologische tests (8) . Ten slotte maakt pure bacteriële cultuur manipulatie en transformatie mogelijk door genen toe te voegen of te verwijderen om de oorzaak van virulentie en antibioticaresistentie en het invasieve potentieel van bacteriën te analyseren. In de afgelopen 30 jaar is dezelfde vooruitgang die is waargenomen met de moleculaire biologie echter niet naar voren gekomen met kweken in de klinische microbiologie (9).

Bacteriecultuur is vaak moeilijker en vereist vaak meer training dan moleculaire technieken. Als gevolg hiervan is het aantal microbiologen dat gespecialiseerd is in anaërobe bacteriën gedurende 30 jaar gestaag afgenomen, en momenteel zijn er weinig specialisten in vergelijking met het aantal specialisten in de jaren zeventig. Hernieuwde interesse in bacteriecultuur werd grotendeels geïnitieerd door klinische microbiologen (10,�) die gespecialiseerd zijn in intracellulaire bacteriën. Ze hebben axenische media ontwikkeld, dit zijn steriele media die geen levend organisme bevatten behalve het gekweekte, om extreem kieskeurige bacteriën te kweken (11, 13, 14). We stellen hier, na een kort verslag van vroege cultuurstrategieën, een uitgebreid overzicht voor van vroegere en huidige kweektechnieken die worden gebruikt voor het kweken van kieskeurige bacteriën. In een aanvullende review gaan we dieper in op de vorderingen die mogelijk zijn gemaakt door nieuwe identificatiemethoden en de toepassing van al deze vorderingen door het voorbeeld van de studie van de menselijke darmmicrobiota door culturomics (15).


Praktisch werk om te leren

Aantekeningen op basis van 'Basispracticum microbiologie' © Vereniging voor Algemene Microbiologie.

Aseptische technieken liggen ten grondslag aan al het werk in de microbiologie. Zorg ervoor dat u bekend bent met al deze technieken voordat u aan de andere microbiologische protocollen op deze website begint.

Alleen niet-pathogene culturen mogen op scholen worden gebruikt - verkregen van een erkende educatieve leverancier. Bij de overdracht en kweek van micro-organismen moeten steriele apparatuur en media worden gebruikt. Aseptische techniek moet in acht worden genomen wanneer micro-organismen van de ene container naar de andere worden overgebracht.

Het is verstandig om alle culturen als potentieel pathogeen te behandelen, omdat culturen mogelijk besmet zijn en omdat mutaties naar ziekteverwekkende vormen kunnen optreden. De hier beschreven aseptische technieken beheersen de mogelijkheden voor besmetting van culturen door micro-organismen uit de omgeving, of besmetting van de omgeving door de micro-organismen die worden gehanteerd.

Er zijn enkele algemene regels die moeten worden gevolgd voor elke aseptische techniek.

  • Sluit ramen en deuren om tocht te verminderen en plotselinge bewegingen te voorkomen die de lucht kunnen verstoren.
  • Maak transfers over een gedesinfecteerd oppervlak. Desinfectie met ethanol wordt aanbevolen vanwege de snelle werking. Als het oppervlak van de bank moeilijk schoon te maken is, dek de bank dan af met een vel taai materiaal dat gemakkelijker te desinfecteren is.
  • Begin pas met de werkzaamheden als alle apparaten en materialen binnen handbereik zijn.
  • Voltooi alle bewerkingen zo snel mogelijk, maar zonder enige haast.
  • Schepen moeten zo lang mogelijk open zijn.
  • Terwijl de vaten open zijn, moeten alle werkzaamheden worden uitgevoerd in de buurt van een bunsenbrandervlam waar luchtstromen naar boven worden getrokken.
  • Bij het openen van een reageerbuis of fles moet de hals onmiddellijk worden verwarmd door vlammen (zie hieronder) waarbij het vat zo dicht mogelijk horizontaal wordt gehouden en zodat elke beweging van lucht uit het vat naar buiten is.
  • Beperk tijdens manipulaties met een petrischaal de blootstelling van de steriele binnenoppervlakken aan verontreiniging vanuit de lucht.
  • De delen van steriele pipetten die in kweken of steriele vaten worden geplaatst, mogen niet worden aangeraakt of in contact komen met andere niet-steriele oppervlakken, zoals kleding, het oppervlak van het werkgebied of de buitenkant van flessen/reageerbuizen .
  • Alle items die in contact komen met micro-organismen moeten voor en na elke dergelijke blootstelling worden gesteriliseerd. Dit kan hetzij door het technische team dat zich voorbereidt op en opruimt na een praktisch werk (bijvoorbeeld in het geval van te gebruiken glaswerk), hetzij door de werknemer tijdens het practicum (bijvoorbeeld bij het aansteken van een draadlus).

Gezondheid & veiligheid en technische opmerkingen

Voor het overbrengen van schimmelculturen die groeien door het produceren van een mycelium van hyfen, een entdraad waarvan het uiteinde in een kleine haak is beter dan een lus. Gebruik de haak om in de agar aan de rand van de cultuur te gutsen en pak een klein stukje agar plus hyfen op. Breng dit over naar agarplaat of helling en keer het stuk schimmelagar om zodat de schimmel in contact komt met de agar in de schaal of buis. Zorg ervoor dat de cultuur stevig aan de nieuwe agar hecht. U kunt besluiten om agarplaten niet onmiddellijk om te keren als de overgebrachte cultuur van de agar valt.

Een lekkende pipet wordt veroorzaakt door een defecte of slecht passende speen, of door vezels van de wattenprop tussen de speen en de pipet.

Een druppelpipet (pasteur) kan worden omgebouwd om afgemeten volumes af te leveren door deze met een rubberen slang aan een niet-steriele spuitcilinder te bevestigen.

Watten pluggen

Wattenstoppen zijn voor studenten gemakkelijker te hanteren dan schroefdoppen - dit maakt complexe manipulaties eenvoudiger.

Als een stekker per ongeluk vlam vat, doof dan de vlammen onmiddellijk door deze af te dekken met een droge doek, niet door te blazen of in water te weken.

Procedure

Inoculeren van agarplaten, hellingen en culturen

een Voer de overdracht van culturen zo snel mogelijk uit, met buizen en platen open voor de lucht voor een minimale tijdsduur.

B De normale praktijk is om agarplaten weg van het lichaam te openen en zonder het deksel volledig van de basis te verwijderen.

C In gevallen waarin het deksel van de petrischaal voor langere tijd dan normaal kan worden verwijderd, werk dan heel dicht bij de vlam van de bunsenbrander om de kans op besmetting te verkleinen.

NS Als u frequente besmetting van platen met schimmelsporen ervaart, verklein dan de kans op tocht verder en overweeg om platen van onderaf te enten met het agar-oppervlak naar beneden gericht. Op deze manier is er wellicht minder kans dat sporen vanuit de lucht op de plaat terechtkomen.

Een draadlus gebruiken

een Als de lus geen vloeistof kan vasthouden, heeft de draad geen volledige cirkel gevormd. Reinig de lus door hem tot roodgloeiend te verwarmen zoals hieronder beschreven, laat hem afkoelen en breng hem opnieuw in vorm met een pincet voordat u opnieuw begint. Gebruik uw vingers niet vanwege de mogelijkheid om uw huid te doorboren.

B Houd het handvat van de draadlus dicht bij de bovenkant, zoals je een pen zou vasthouden, in een hoek die bijna verticaal is. Hierdoor blijft de pink vrij om de schroefdop/wattenplug van de fles/reageerbuis vast te pakken. Het zorgt er ook voor dat elke vloeibare cultuur op de lus in de vlam terechtkomt.

C Steriliseer een draadlus door deze voor en na gebruik tot roodgloeiend te verwarmen in een brullende blauwe bunsenbrandervlam. Dit zorgt ervoor dat besmette bacteriesporen worden vernietigd.

NS De vlamprocedure moet de punt van de lus geleidelijk opwarmen. Dit komt omdat het na gebruik cultuur bevat, die bij snelle verwarming kan sputteren en mogelijk kleine cultuurdeeltjes kan afgeven, waardoor een aerosol ontstaat.

l Plaats het handvatuiteinde van de draad in de lichtblauwe kegel van de vlam. Dit is het koelste deel van de vlam.

ii Trek de rest van de draad langzaam omhoog naar het heetste deel van de vlam - direct boven de blauwe kegel.

iii Houd daar totdat het roodgloeiend is.

NS Zorg ervoor dat de volledige lengte van de draad voldoende wordt verwarmd.

v Laat een paar seconden in de lucht afkoelen en gebruik dan onmiddellijk.

vi Leg de lus niet neer en zwaai er niet mee.

vii Steriliseer de lus onmiddellijk na gebruik opnieuw.

Methode 1 (meer horizontaal)

l Plaats het handvatuiteinde van de lus in het hete deel van de vlam, met de lus buiten de vlam, en laat de warmte langs de draad naar de punt van de lus worden geleid, waarbij deze wordt voorverwarmd.

ii Trek de draad gestaag door het heetste deel van de vlam, zodat elk deel ervan roodgloeiend gloeit.

iii Trek ten slotte de punt in de vlam en laat deze roodgloeiend gloeien.

Methode 2 (meer verticaal)

l Plaats de punt van de lus in het koelere deel van de vlam van de bunsenbrander - de blauwe kegel - met de rest van de draad in het heetste deel van de vlam. Dit verwarmt de punt van de lus en eventuele vloeistoffen erop voor.

ii Houd totdat de draad roodgloeiend is.

Een pipet gebruiken

Steriele maat- of druppelpipetten (pasteur) worden gebruikt om culturen, steriele media en steriele oplossingen over te brengen.

een Haal de pipet uit de houder/verpakking aan het uiteinde met daarin een prop watten en zorg ervoor dat u zo min mogelijk van de pipet aanraakt om hem stevig vast te houden.

B Pas de speen aan. Soms is het handig om de speen eerst in steriele vloeistof te dopen om hem te smeren.

C Houd de pipetcilinder vast zoals u een pen zou vasthouden, maar grijp de speen niet vast. Hierdoor heeft u uw pink vrij om de dop/wattenplug van een fles/reageerbuisje vast te pakken en uw duim vrij om de speen te bedienen.

NS Druk de speen voorzichtig aan en neem een ​​hoeveelheid vloeistof op die voldoende is voor de benodigde hoeveelheid, maar komt niet bij de wattenprop en maakt deze nat. Door met de pipetpunt onder het vloeistofoppervlak in de speen te knijpen, ontstaan ​​er luchtbellen die kunnen leiden tot ‘spugen’ en dus tot aerosolvorming. Voorkom dit door in de speen te knijpen voordat u de punt in de vloeistof plaatst. Laat vervolgens de druk voorzichtig los totdat de benodigde hoeveelheid vloeistof is opgezogen en til de pipetpunt uit de vloeistof.

e Breng het overtollige voorzichtig terug.

F Plaats de besmette pipet onmiddellijk na gebruik in een nabijgelegen pot met ontsmettingsmiddel.

G Verwijder de speen pas als de pipet zich in de wegwerppot bevindt, anders zullen cultuurdruppels het werkoppervlak verontreinigen.

De hals van flessen en reageerbuizen vlammen

Dit zorgt ervoor dat er geen micro-organismen in de mond van het vat komen om de cultuur of het medium te verontreinigen. Door de opening van de fles door een vlam te leiden, ontstaat er een convectiestroom weg van de opening en helpt besmetting te voorkomen. Het hete deel van de vlam bevindt zich boven de binnenste helderblauwe 'kegel' en het vat moet door de vlam worden bewogen, niet op zijn plaats worden gehouden.

een Draai de dop van de fles los zodat deze gemakkelijk kan worden verwijderd.

B Til de fles/reageerbuis op met uw linkerhand.

C Verwijder de dop/wattenplug van de fles/reageerbuis met de pink naar de palm van uw rechterhand gekruld. (Draai de fles, niet de dop.)

NS Leg de dop/wattenplug niet neer.

e Vlam de hals van de fles/reageerbuis door de hals naar voren en naar achteren door een hete bunsenbrandervlam te leiden.

F Na het uitvoeren van de vereiste procedure, bijvoorbeeld het opzuigen van cultuur, plaatst u de dop/wattenplug op de fles/reageerbuis met uw pink. Wees voorzichtig! De fles zal heet zijn. (Draai de fles, niet de dop.)

G Als wattenpropjes gedeeltelijk hun vorm hebben verloren, kunnen ze gemakkelijker terug in de hals van het vat worden geleid door de mond van het vat langzaam te draaien terwijl de plug naar beneden wordt gedrukt.

Oppervlakken desinfecteren

een Voor technici wordt desinfectie met ethanol aanbevolen vanwege de snelle werking (ongeveer 5 minuten). Technici zullen meer ervaren en in staat zijn om te gaan met de bijbehorende brandgevaren van het werken met ethanol.

B Voor desinfectie door studenten is 1% Virkon-oplossing veiliger en goedkoper, maar het oppervlak moet 10 minuten nat blijven.

Web links

http://www.microbiologyonline.org.uk/teachers/resources
Vereniging voor Algemene Microbiologie - bron van Basis praktische microbiologie, een uitstekend handboek laboratoriumtechnieken en Praktijkmicrobiologie voor het secundair, een selectie van beproefde practica met micro-organismen.

www.microbiologyonline.org.uk
MiSAC (Microbiology in Schools Advisory Committee) wordt ondersteund door de Society for General Microbiology (zie hierboven) en hun websites bevatten meer veiligheidsinformatie en een link om per e-mail om advies te vragen.

(Websites bezocht oktober 2011)

© 2019, Royal Society of Biology, 1 Naoroji Street, Londen WC1X 0GB geregistreerd liefdadigheidsnummer 277981, opgericht door Royal Charter


Abstract

Microbiologie is grotendeels ontwikkeld dankzij de ontdekking en optimalisatie van kweekmedia. Het eerste vloeibare kunstmatige kweekmedium werd in 1860 gemaakt door Louis Pasteur. Eerder was bacteriegroei op dagelijkse materialen zoals sommige voedingsmiddelen waargenomen. Deze waarnemingen benadrukten het belang van de natuurlijke omgeving van de bacteriën en hun voedingsbehoeften bij de ontwikkeling van kweekmedia voor hun isolatie. Een kweekmedium bestaat in wezen uit basiselementen (water, voedingsstoffen), waaraan verschillende groeifactoren moeten worden toegevoegd die specifiek zijn voor elke bacterie en nodig zijn voor hun groei.

De evolutie van bacteriecultuur via de media die voor hun kweek werden gebruikt, begon met de ontwikkeling van het eerste vaste kweekmedium door Koch, waardoor niet alleen de productie van bacteriekolonies mogelijk werd, maar ook de mogelijkheid om een ​​bacteriële kloon te zuiveren. Het belangrijkste geleermiddel dat in vaste kweekmedia wordt gebruikt, is agar. Er zijn echter enkele limieten waargenomen bij het gebruik van agar vanwege enkele extreem zuurstofgevoelige bacteriën die niet op agarmedia groeien, en andere alternatieven werden voorgesteld en getest. Vervolgens leidde de ontdekking van antimicrobiële middelen en hun specifieke doelen tot de opkomst van selectieve media. Deze remmende middelen maken het mogelijk om ongewenste bacteriën uit de microbiota te verwijderen en de gewenste bacteriën te selecteren. Dankzij een betere kennis van de bacteriële omgeving zal het mogelijk zijn om nieuwe kweekmedia en nieuwe kweekomstandigheden te ontwikkelen, beter aangepast aan bepaalde moeilijke bacteriën die moeilijk te isoleren zijn.


Celcultuurprotocol

Materialen die nodig zijn voor celcultuur:

  • Een bron van cellen
  • Groeimedia met essentiële voedingsstoffen
  • Groeifactoren
  • Kweekschalen geschikt voor het celtype
  • Gas- en temperatuurgereguleerde broedstoof

Cellen kunnen worden geïsoleerd uit een primaire bron, zoals een orgaan of weefsel uit een levend organisme, of uit een secundaire bron, zoals een bevroren cellijn.

Stap 2

Groeimedia-oplossing wordt bereid met geschikte groeifactoren voor het type cel (bijv. epidermale groeifactoren voor epidermale cellen, cytokinen voor immuuncellen). De media moeten steriel worden gefilterd en bevatten meestal antibiotica om bacteriële besmetting van de celcultuur te voorkomen.

Stap 3

Deze cellen worden geteld als de hoeveelheid nog niet bekend is. Het bekende aantal cellen wordt gepelleteerd en opnieuw gesuspendeerd in de bereide groeimedia. Het volume van celresuspensie moet optimaal zijn voor de kweekschaal en voor het aantal cellen per schaal (d.w.z. celdichtheid).

Stap 4

De celhersuspensie wordt overgebracht naar de geschikte kweekschaal en voorzichtig geschud om een ​​gelijkmatige dispersie van cellen op de schaal te creëren.

Stap 5

De schaal wordt in de incubator geplaatst met CO2 en O2en de temperatuur die op de juiste manier is ingesteld voor de cellijn of het type. De cellen mogen zich hechten (indien hechtend) en groeien in de komende paar dagen.

Stap 6

De cellen mogen de komende dagen optimaal groeien en samenvloeien door regelmatig nieuwe media te gebruiken.

Stap 7

Wanneer de cellen confluentie hebben bereikt, zijn ze klaar voor passage. Dit wordt gedaan door de groeimedia te verwijderen en een dissociatiemedium toe te voegen, zodat de cellen, als ze aan de schaal hechten, zichzelf losmaken. Eenmaal losgemaakt, worden de cellen overgebracht naar een buis waar ze worden gepelleteerd en meerdere keren worden gewassen. Ze worden ook geteld en meestal beoordeeld op de hoeveelheid celdood. De nieuwe hoeveelheid cellen wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd en verdund in vers bereide groeimedia, zoals eerder, voor de juiste celdichtheid. Deze suspensie van cellen wordt vervolgens uitgeplaat op nieuwe kweekschalen en men laat het opnieuw groeien tot confluentie.

Het proces kan worden voortgezet totdat de gewenste hoeveelheid cellen of passages is bereikt.


9.1 Hoe microben groeien

Jeni, een 24-jarige zwangere vrouw in haar tweede trimester, bezoekt een kliniek met klachten van hoge koorts, 38,9 ° C (102 ° F), vermoeidheid en spierpijn - typische griepachtige tekenen en symptomen. Jeni oefent regelmatig en volgt een voedzaam dieet met de nadruk op biologisch voedsel, inclusief rauwe melk die ze koopt van een lokale boerenmarkt. Al haar vaccinaties zijn up-to-date. De zorgverlener die Jeni ziet, maakt zich echter zorgen en laat een bloedmonster opsturen voor onderzoek door het microbiologisch laboratorium.

Ga naar de volgende Clinical Focus-box

De bacteriële celcyclus omvat de vorming van nieuwe cellen door de replicatie van DNA en de verdeling van cellulaire componenten in twee dochtercellen. Bij prokaryoten is de voortplanting altijd aseksueel, hoewel uitgebreide genetische recombinatie in de vorm van horizontale genoverdracht plaatsvindt, zoals in een ander hoofdstuk zal worden onderzocht. De meeste bacteriën hebben een enkel circulair chromosoom, maar er zijn enkele uitzonderingen. Bijvoorbeeld, Borrelia burgdorferi , de veroorzaker van de ziekte van Lyme, heeft een lineair chromosoom.

Binaire splijting

Het meest voorkomende mechanisme van celreplicatie bij bacteriën is een proces dat binaire splitsing wordt genoemd en dat wordt weergegeven in figuur 9.2. Alvorens te delen, groeit de cel en neemt het aantal cellulaire componenten toe. Vervolgens begint de replicatie van DNA op een locatie op het circulaire chromosoom die de replicatieoorsprong wordt genoemd, waar het chromosoom aan het binnenste celmembraan is bevestigd. Replicatie gaat door in tegengestelde richtingen langs het chromosoom totdat het eindpunt is bereikt.

Het centrum van de vergrote cel vernauwt zich totdat twee dochtercellen worden gevormd, waarbij elk nageslacht een volledige kopie van het ouderlijke genoom en een deling van het cytoplasma (cytokinese) ontvangt. Dit proces van cytokinese en celdeling wordt gestuurd door een eiwit genaamd FtsZ. FtsZ assembleert tot een Z-ring op het cytoplasmatische membraan (Figuur 9.3). De Z-ring is verankerd door FtsZ-bindende eiwitten en definieert het delingsvlak tussen de twee dochtercellen. Extra eiwitten die nodig zijn voor celdeling worden aan de Z-ring toegevoegd om een ​​structuur te vormen die het divisoom wordt genoemd. Het divisoom wordt geactiveerd om een ​​peptidoglycaancelwand te produceren en een septum te bouwen dat de twee dochtercellen verdeelt. De dochtercellen worden gescheiden door het delingsseptum, waar alle buitenste lagen van de cellen (de celwand en buitenmembranen, indien aanwezig) opnieuw moeten worden gemodelleerd om de deling te voltooien. We weten bijvoorbeeld dat specifieke enzymen bindingen tussen de monomeren in peptidoglycanen verbreken en de toevoeging van nieuwe subeenheden langs het scheidingsseptum mogelijk maken.

Controleer uw begrip

  • Wat is de naam van het eiwit dat samenkomt in een Z-ring om cytokinese en celdeling te initiëren?

Generatie tijd

In eukaryote organismen is de generatietijd de tijd tussen dezelfde punten van de levenscyclus in twee opeenvolgende generaties. De typische generatietijd voor de menselijke populatie is bijvoorbeeld 25 jaar. Deze definitie is niet praktisch voor bacteriën, die zich snel kunnen vermenigvuldigen of duizenden jaren inactief kunnen blijven. In prokaryoten (Bacteria en Archaea) wordt de generatietijd ook wel de verdubbelingstijd genoemd en wordt gedefinieerd als de tijd die de populatie nodig heeft om zich te verdubbelen door één ronde van binaire splitsing. Bacteriële verdubbelingstijden variëren enorm. Terwijl Escherichia coli kan verdubbelen in slechts 20 minuten onder optimale groeiomstandigheden in het laboratorium, bacteriën van dezelfde soort kunnen enkele dagen nodig hebben om te verdubbelen in bijzonder barre omgevingen. De meeste ziekteverwekkers groeien snel, zoals: E coli, maar er zijn uitzonderingen. Bijvoorbeeld, Mycobacterium tuberculosis , de veroorzaker van tuberculose, heeft een generatietijd tussen 15 en 20 uur. Anderzijds, M. leprae, die de ziekte van Hansen (lepra) veroorzaakt, groeit veel langzamer, met een verdubbelingstijd van 14 dagen.

Micro-verbindingen

Aantal cellen berekenen

Het is mogelijk om het aantal cellen in een populatie te voorspellen wanneer ze met een constante snelheid delen door binaire splitsing. Kijk bijvoorbeeld eens wat er gebeurt als een enkele cel zich 24 uur lang elke 30 minuten deelt. Het diagram in figuur 9.4 toont de toename van het aantal cellen voor de eerste drie generaties.

Het aantal cellen neemt exponentieel toe en kan worden uitgedrukt als 2 N , waar N is het aantal generaties. Als cellen zich elke 30 minuten delen, zouden er na 24 uur 48 delingen hebben plaatsgevonden. Als we de formule 2 . toepassen N , waar N gelijk is aan 48, zou de enkele cel na 48 generaties (24 uur) 2 48 of 281.474.976.710.656 cellen opleveren. Bij zulke grote getallen is het praktischer om wetenschappelijke notatie te gebruiken. Daarom drukken we het aantal cellen uit als 2,8 × 1014 cellen.

In ons voorbeeld hebben we één cel gebruikt als het aanvankelijke aantal cellen. Voor een willekeurig aantal startcellen wordt de formule als volgt aangepast:

NN is het aantal cellen bij elke generatie N, N0 is het aanvankelijke aantal cellen, en N is het aantal generaties.

Controleer uw begrip

  • Met een verdubbelingstijd van 30 minuten en een startpopulatiegrootte van 1 × 105 cellen, hoeveel cellen zullen er na 2 uur aanwezig zijn, uitgaande van geen celdood?

De groeicurve

Micro-organismen gekweekt in een gesloten cultuur (ook wel batchcultuur genoemd), waarin geen voedingsstoffen worden toegevoegd en de meeste afvalstoffen niet worden verwijderd, volgen een reproduceerbaar groeipatroon dat de groeicurve wordt genoemd. Een voorbeeld van een batchcultuur in de natuur is een vijver waarin een klein aantal cellen groeit in een gesloten omgeving. De kweekdichtheid wordt gedefinieerd als het aantal cellen per volume-eenheid. In een gesloten omgeving is de kweekdichtheid ook een maat voor het aantal cellen in de populatie. Infecties van het lichaam volgen niet altijd de groeicurve, maar er kunnen correlaties bestaan, afhankelijk van de plaats en het type infectie. Wanneer het aantal levende cellen wordt uitgezet tegen de tijd, kunnen verschillende fasen worden waargenomen in de curve (Figuur 9.5).

De vertragingsfase

Het begin van de groeicurve vertegenwoordigt een klein aantal cellen, een inoculum genaamd, dat wordt toegevoegd aan een vers kweekmedium, een voedingsbouillon die de groei ondersteunt. De beginfase van de groeicurve wordt de lag-fase genoemd, waarin cellen zich voorbereiden op de volgende groeifase. Het aantal cellen verandert niet tijdens de lag-fase, maar cellen worden groter en zijn metabolisch actief, en synthetiseren eiwitten die nodig zijn om in het medium te groeien. Als er cellen zijn beschadigd of geschokt tijdens de overdracht naar het nieuwe medium, vindt reparatie plaats tijdens de lag-fase. De duur van de lag-fase wordt bepaald door vele factoren, waaronder de soort en genetische samenstelling van de cellen, de samenstelling van het medium en de grootte van het oorspronkelijke inoculum.

De logfase

In de logaritmische (log) groeifase, ook wel exponentiële groeifase genoemd, zijn de cellen actief aan het delen door binaire splitsing en neemt hun aantal exponentieel toe. Voor een bepaalde bacteriesoort is de generatietijd onder specifieke groeiomstandigheden (voedingsstoffen, temperatuur, pH, enzovoort) genetisch bepaald, en deze generatietijd wordt de intrinsieke groeisnelheid genoemd. Tijdens de log-fase is de relatie tussen tijd en aantal cellen niet lineair maar exponentieel, maar de groeicurve wordt vaak uitgezet in een semilogaritmische grafiek, zoals weergegeven in figuur 9.6, wat de indruk geeft van een lineair verband.

Cellen in de logfase vertonen een constante groeisnelheid en uniforme metabolische activiteit. Om deze reden worden cellen in de logfase bij voorkeur gebruikt voor industriële toepassingen en onderzoekswerk. De logfase is ook de fase waarin bacteriën het meest vatbaar zijn voor de werking van ontsmettingsmiddelen en gewone antibiotica die de eiwit-, DNA- en celwandsynthese aantasten.

Stationaire fase

Naarmate het aantal cellen tijdens de log-fase toeneemt, dragen verschillende factoren bij aan een vertraging van de groeisnelheid. Afvalproducten stapelen zich op en voedingsstoffen worden geleidelijk opgebruikt. Bovendien begint een geleidelijke uitputting van zuurstof de aërobe celgroei te beperken. Deze combinatie van ongunstige omstandigheden vertraagt ​​en stopt uiteindelijk de bevolkingsgroei. Het totale aantal levende cellen bereikt een plateau dat de stationaire fase wordt genoemd (Figuur 9.5). In deze fase is het aantal nieuwe cellen dat door celdeling wordt gecreëerd nu gelijk aan het aantal cellen dat afsterft, dus de totale populatie levende cellen stagneert relatief. De cultuurdichtheid in een stationaire cultuur is constant.Het draagvermogen van de kweek, of maximale kweekdichtheid, hangt af van de soorten micro-organismen in de kweek en de specifieke omstandigheden van de kweek, maar het draagvermogen is constant voor een bepaald organisme dat onder dezelfde omstandigheden wordt gekweekt.

Tijdens de stationaire fase schakelen cellen over naar een overlevingsmodus van het metabolisme. Naarmate de groei vertraagt, neemt ook de synthese van peptidoglycanen, eiwitten en nucleïnezuren af. Stationaire culturen zijn dus minder vatbaar voor antibiotica die deze processen verstoren. Bij bacteriën die endosporen kunnen produceren, ondergaan veel cellen sporulatie tijdens de stationaire fase. Secundaire metabolieten, waaronder antibiotica, worden gesynthetiseerd in de stationaire fase. Bij bepaalde pathogene bacteriën wordt de stationaire fase ook geassocieerd met de expressie van virulentiefactoren, producten die bijdragen aan het vermogen van een microbe om te overleven, zich voort te planten en ziekte te veroorzaken in een gastheerorganisme. Bijvoorbeeld quorum sensing in Staphylococcus aureus initieert de productie van enzymen die menselijk weefsel en celresten kunnen afbreken, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor bacteriën om zich te verspreiden naar nieuw weefsel waar voedingsstoffen overvloediger zijn.

De doodsfase

Naarmate een kweekmedium giftig afval ophoopt en voedingsstoffen uitgeput raken, sterven de cellen in steeds grotere aantallen af. Al snel is het aantal stervende cellen groter dan het aantal delende cellen, wat leidt tot een exponentiële afname van het aantal cellen (Figuur 9.5). Dit is de toepasselijk genaamde doodsfase, ook wel de neergangsfase genoemd. Veel cellen lyseren en geven voedingsstoffen af ​​aan het medium, waardoor overlevende cellen levensvatbaar blijven en endosporen vormen. Enkele cellen, de zogenaamde persisters, worden gekenmerkt door een trage stofwisseling. Persistercellen zijn medisch belangrijk omdat ze in verband worden gebracht met bepaalde chronische infecties, zoals tuberculose, die niet reageren op behandeling met antibiotica.

Microbiële groei ondersteunen

Het groeipatroon van figuur 9.5 vindt plaats in een gesloten omgeving, er worden geen voedingsstoffen toegevoegd en afval en dode cellen worden niet verwijderd. In veel gevallen is het echter voordelig om cellen in de logaritmische groeifase te houden. Een voorbeeld is in industrieën die microbiële producten oogsten. Een chemostaat (Figuur 9.7) wordt gebruikt om een ​​continue kweek in stand te houden waarin voedingsstoffen met een constante snelheid worden geleverd. Voor aerobe processen wordt een gecontroleerde hoeveelheid lucht bijgemengd. Bacteriesuspensie wordt verwijderd met dezelfde snelheid als voedingsstoffen binnenstromen om een ​​optimale groeiomgeving te behouden.

Controleer uw begrip

  • In welke fase vindt de groei het snelst plaats?
  • Noem twee factoren die microbiële groei beperken.

Meting van bacteriegroei

Het schatten van het aantal bacteriecellen in een monster, ook wel het aantal bacteriën genoemd, is een veelvoorkomende taak van microbiologen. Het aantal bacteriën in een klinisch monster dient als indicatie voor de omvang van een infectie. De kwaliteitscontrole van drinkwater, voedsel, medicijnen en zelfs cosmetica is gebaseerd op schattingen van het aantal bacteriën om besmetting op te sporen en de verspreiding van ziekten te voorkomen. Er worden twee belangrijke benaderingen gebruikt om het aantal cellen te meten. De directe methoden omvatten het tellen van cellen, terwijl de indirecte methoden afhankelijk zijn van de meting van de aanwezigheid of activiteit van cellen zonder daadwerkelijk individuele cellen te tellen. Zowel directe als indirecte methoden hebben voor- en nadelen voor specifieke toepassingen.

Directe celtelling

Directe celtelling verwijst naar het tellen van de cellen in een vloeibare cultuur of kolonies op een plaat. Het is een directe manier om te schatten hoeveel organismen er in een monster aanwezig zijn. Laten we eerst kijken naar een eenvoudige en snelle methode waarvoor alleen een speciaal objectglaasje en een samengestelde microscoop nodig zijn.

De eenvoudigste manier om bacteriën te tellen, wordt de directe microscopische celtelling genoemd, waarbij een bekend volume van een kweek wordt overgebracht naar een gekalibreerd objectglaasje en de cellen worden geteld onder een lichtmicroscoop. Het gekalibreerde objectglaasje wordt een Petroff-Hausser-kamer genoemd (Figuur 9.8) en is vergelijkbaar met een hemocytometer die wordt gebruikt om rode bloedcellen te tellen. Het centrale gebied van de telkamer is geëtst in vierkanten van verschillende afmetingen. Een monster van de kweeksuspensie wordt aan de kamer toegevoegd onder een dekglaasje dat op een bepaalde hoogte vanaf het oppervlak van het rooster wordt geplaatst. Het is mogelijk om de concentratie van cellen in het oorspronkelijke monster te schatten door afzonderlijke cellen in een aantal vierkanten te tellen en het volume van het waargenomen monster te bepalen. Het gebied van de vierkanten en de hoogte waarop het dekglaasje wordt gepositioneerd zijn gespecificeerd voor de kamer. De concentratie moet worden gecorrigeerd voor verdunning als het monster vóór de telling is verdund.

Cellen in verschillende kleine vierkanten moeten worden geteld en het gemiddelde moet worden genomen om een ​​betrouwbare meting te verkrijgen. De voordelen van de kamer zijn dat de methode gemakkelijk te gebruiken, relatief snel en goedkoop is. Aan de andere kant werkt de telkamer niet goed met verdunde culturen omdat er mogelijk niet genoeg cellen zijn om te tellen.

Het gebruik van een telkamer levert niet noodzakelijkerwijs een nauwkeurige telling van het aantal levende cellen op, omdat het niet altijd mogelijk is om onder de microscoop onderscheid te maken tussen levende cellen, dode cellen en puin van dezelfde grootte. Nieuw ontwikkelde fluorescentiekleuringstechnieken maken het echter mogelijk om levensvatbare en dode bacteriën te onderscheiden. Deze levensvatbaarheidsvlekken (of levende vlekken) binden aan nucleïnezuren, maar de primaire en secundaire vlekken verschillen in hun vermogen om het cytoplasmatische membraan te passeren. De primaire kleuring, die groen fluoresceert, kan intacte cytoplasmatische membranen binnendringen en zowel levende als dode cellen kleuren. De secundaire kleuring, die rood fluoresceert, kan een cel alleen kleuren als het cytoplasmatische membraan aanzienlijk is beschadigd. Levende cellen fluoresceren dus groen omdat ze alleen de groene vlek absorberen, terwijl dode cellen rood lijken omdat de rode vlek de groene vlek op hun nucleïnezuren verdringt (Figuur 9.9).

Een andere techniek maakt gebruik van een elektronisch celtelapparaat (Coulter-teller) om de veranderingen in elektrische weerstand in een zoutoplossing te detecteren en te tellen. Een glazen buisje met een kleine opening wordt ondergedompeld in een elektrolytoplossing. In de glazen buis is een eerste elektrode opgehangen. Een tweede elektrode bevindt zich buiten de buis. Terwijl cellen door de kleine opening in de glazen buis worden getrokken, veranderen ze kort de weerstand die wordt gemeten tussen de twee elektroden en de verandering wordt geregistreerd door een elektronische sensor (Figuur 9.10). Elke weerstandsverandering vertegenwoordigt een cel. De methode is snel en nauwkeurig binnen een reeks concentraties, maar als de kweek te geconcentreerd is, kan er op elk moment meer dan één cel door de opening gaan en de resultaten scheeftrekken. Deze methode maakt ook geen onderscheid tussen levende en dode cellen.

Directe tellingen geven een schatting van het totale aantal cellen in een monster. In veel situaties is het echter belangrijk om het aantal levende of levensvatbare cellen te kennen. Tellingen van levende cellen zijn nodig bij het beoordelen van de omvang van een infectie, de effectiviteit van antimicrobiële verbindingen en medicijnen, of besmetting van voedsel en water.

Controleer uw begrip

  • Waarom zou je het aantal cellen in meer dan één vierkant in de Petroff-Hausser-kamer tellen om het aantal cellen te schatten?
  • Waarom zien dode cellen er rood uit in de levensvatbaarheidskleuringsmethode?

Aantal platen

Het aantal levensvatbare platen, of gewoon het aantal platen, is een telling van levensvatbare of levende cellen. Het is gebaseerd op het principe dat levensvatbare cellen zich vermenigvuldigen en aanleiding geven tot zichtbare kolonies wanneer ze worden geïncubeerd onder geschikte omstandigheden voor het monster. De resultaten worden gewoonlijk uitgedrukt als kolonievormende eenheid s per milliliter (CFU/ml) in plaats van cellen per milliliter, omdat er meer dan één cel op dezelfde plek kan zijn geland om een ​​enkele kolonie te veroorzaken. Bovendien zijn monsters van bacteriën die in clusters of ketens groeien moeilijk te verspreiden en kan een enkele kolonie meerdere cellen vertegenwoordigen. Sommige cellen worden beschreven als levensvatbaar maar niet-kweekbaar en zullen geen kolonies vormen op vaste media. Om al deze redenen wordt het aantal levensvatbare platen beschouwd als een lage schatting van het werkelijke aantal levende cellen. Deze beperkingen doen niets af aan het nut van de methode, die schattingen geeft van levende bacteriële aantallen.

Microbiologen tellen meestal platen met 30-300 kolonies. Monsters met te weinig kolonies (<30) geven geen statistisch betrouwbare cijfers, en overvolle platen (>300 kolonies) maken het moeilijk om individuele kolonies nauwkeurig te tellen. Tellingen in dit bereik minimaliseren ook het voorkomen van meer dan één bacteriecel die een enkele kolonie vormt. De berekende CFU ligt dus dichter bij het werkelijke aantal levende bacteriën in de populatie.

Er zijn twee algemene benaderingen voor het inoculeren van platen voor levensvatbare tellingen: de gietplaat- en de spreidplaatmethoden. Hoewel de uiteindelijke inoculatieprocedure verschilt tussen deze twee methoden, beginnen ze allebei met een seriële verdunning van de cultuur.

Seriële verdunning

De seriële verdunning van een cultuur is een belangrijke eerste stap voordat u overgaat tot de gietplaat- of spreidplaatmethode. Het doel van het seriële verdunningsproces is om platen te verkrijgen met CFU's in het bereik van 30-300, en het proces omvat meestal meerdere verdunningen in veelvouden van 10 om de berekening te vereenvoudigen. Het aantal seriële verdunningen wordt gekozen op basis van een voorlopige schatting van de kweekdichtheid. Afbeelding 9.11 illustreert de seriële verdunningsmethode.

Een vast volume van de oorspronkelijke kweek, 1,0 ml, wordt toegevoegd aan en grondig gemengd met de eerste verdunningsbuisoplossing, die 9,0 ml steriele bouillon bevat. Deze stap vertegenwoordigt een verdunningsfactor van 10 of 1:10, vergeleken met de oorspronkelijke cultuur. Uit deze eerste verdunning wordt hetzelfde volume, 1,0 ml, onttrokken en gemengd met een verse buis van 9,0 ml verdunningsoplossing. De verdunningsfactor is nu 1:100 vergeleken met de oorspronkelijke cultuur. Dit proces gaat door totdat een reeks verdunningen is geproduceerd die de gewenste celconcentratie zullen ondersteunen voor nauwkeurig tellen. Van elke buis wordt een monster uitgeplaat op vast medium met behulp van de gietplaatmethode (Figuur 9.12) of de spreidplaatmethode (Figuur 9.13). De platen worden geïncubeerd totdat kolonies verschijnen. Van elke verdunning worden gewoonlijk twee tot drie platen bereid en het aantal kolonies dat op elke plaat wordt geteld, wordt gemiddeld. In alle gevallen is het grondig mengen van monsters met het verdunningsmedium (om ervoor te zorgen dat de celverdeling in de buis willekeurig is) van het grootste belang voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten.

De verdunningsfactor wordt gebruikt om het aantal cellen in de oorspronkelijke celcultuur te berekenen. In ons voorbeeld werd een gemiddelde van 50 kolonies geteld op de platen verkregen uit de 1:10.000 verdunning. Omdat slechts 0,1 ml suspensie op de plaat werd gepipetteerd, is de vermenigvuldiger die nodig is om de oorspronkelijke concentratie te reconstitueren 10 × 10.000. Het aantal CFU per ml is gelijk aan 50 × 10 × 10.000 = 5.000.000. Het aantal bacteriën in de kweek wordt geschat op 5 miljoen cellen/ml. Het koloniegetal verkregen uit de 1:1000 verdunning was 389, ruim onder de verwachte 500 voor een 10-voudig verschil in verdunningen. Dit benadrukt het probleem van onnauwkeurigheid wanneer het aantal kolonies groter is dan 300 en meer dan één bacteriecel uitgroeit tot een enkele kolonie.

Een zeer verdund monster, bijvoorbeeld drinkwater, bevat mogelijk niet genoeg organismen om een ​​van de beschreven plaattellingsmethoden te gebruiken. In dergelijke gevallen moet het oorspronkelijke monster vóór het uitplaten worden geconcentreerd in plaats van verdund. Dit kan worden bereikt met behulp van een wijziging van de plaattellingstechniek, de membraanfiltratietechniek. Bekende volumes worden aseptisch vacuüm gefiltreerd door een membraan met een poriegrootte die klein genoeg is om micro-organismen op te vangen. Het membraan wordt overgebracht naar een Petri-plaat die een geschikt groeimedium bevat. Kolonies worden geteld na incubatie. De celdichtheid wordt berekend door het celgetal te delen door het volume gefilterde vloeistof.

Link naar leren

Bekijk deze video voor demonstraties van seriële verdunningen en spreidplaattechnieken.

Het meest waarschijnlijke aantal

Het aantal micro-organismen in verdunde monsters is meestal te laag om te worden gedetecteerd met de tot nu toe beschreven telmethoden. Voor deze monsters gebruiken microbiologen routinematig de meest waarschijnlijke getalmethode (MPN), een statistische procedure voor het schatten van het aantal levensvatbare micro-organismen in een monster. De MPN-methode wordt vaak gebruikt voor water- en voedselmonsters en evalueert detecteerbare groei door veranderingen in troebelheid of kleur als gevolg van metabolische activiteit waar te nemen.

Een typische toepassing van de MPN-methode is het schatten van het aantal coliformen in een monster van vijverwater. Coliformen zijn gramnegatieve staafbacteriën die lactose fermenteren. De aanwezigheid van coliformen in water wordt beschouwd als een teken van besmetting door ontlasting. Voor de methode geïllustreerd in figuur 9.14 wordt een reeks van drie verdunningen van het watermonster getest door vijf lactosebouillonbuizen te inoculeren met 10 ml monster, vijf lactosebouillonbuizen met 1 ml monster en vijf lactosebouillonbuizen met 0,1 ml monster steekproef. De lactose-bouillonbuizen bevatten een pH-indicator die van kleur verandert van rood naar geel wanneer de lactose wordt gefermenteerd. Na inoculatie en incubatie worden de buisjes onderzocht op een indicatie van coliforme groei door een kleurverandering in media van rood naar geel. De eerste set buisjes (10 ml monster) vertoonde groei in alle buisjes de tweede set buisjes (1 ml) vertoonde groei in twee van de vijf buisjes in de derde set buisjes, er werd geen groei waargenomen in geen van de buisjes (0,1-ml verdunning). De getallen 5, 2 en 0 worden vergeleken met Figuur B1 in Bijlage B, die is geconstrueerd met behulp van een waarschijnlijkheidsmodel van de steekproefprocedure. Uit onze lezing van de tabel concluderen we dat 49 het meest waarschijnlijke aantal bacteriën per 100 ml vijverwater is.no lo

Controleer uw begrip

  • Wat is een kolonievormende eenheid?
  • Welke twee methoden worden vaak gebruikt om het aantal bacteriën in watermonsters te schatten?

Indirecte celtellingen

Naast directe methoden voor het tellen van cellen, worden vaak andere methoden, gebaseerd op een indirecte detectie van celdichtheid, gebruikt om celdichtheden in een kweek te schatten en te vergelijken. De belangrijkste benadering is het meten van de troebelheid (troebelheid) van een bacteriemonster in een vloeibare suspensie. Het laboratoriuminstrument dat wordt gebruikt om de troebelheid te meten, wordt een spectrofotometer genoemd (Figuur 9.15). In een spectrofotometer wordt een lichtstraal doorgelaten door een bacteriële suspensie, het licht dat door de suspensie gaat, wordt gemeten door een detector, en de hoeveelheid licht die door het monster gaat en de detector bereikt, wordt omgezet in procent transmissie of een logaritmische waarde genaamd absorptie (optische dichtheid). Naarmate het aantal bacteriën in een suspensie toeneemt, neemt ook de troebelheid toe en komt er minder licht bij de detector. De afname van het licht dat door het monster gaat en de detector bereikt, gaat gepaard met een afname van het percentage transmissie en een toename van de absorptie gemeten door de spectrofotometer.

Het meten van troebelheid is een snelle methode om de celdichtheid te schatten zolang er genoeg cellen in een monster zijn om troebelheid te produceren. Het is mogelijk om troebelheidsmetingen te correleren met het werkelijke aantal cellen door een telling van levensvatbare platen uit te voeren van monsters die zijn genomen uit culturen met een reeks absorptiewaarden. Met behulp van deze waarden wordt een kalibratiecurve gegenereerd door de troebelheid uit te zetten als een functie van de celdichtheid. Zodra de kalibratiecurve is geproduceerd, kan deze worden gebruikt om het aantal cellen te schatten voor alle monsters die zijn verkregen of gekweekt onder vergelijkbare omstandigheden en met dichtheden binnen het bereik van waarden die zijn gebruikt om de curve te construeren.

Het meten van het drooggewicht van een kweekmonster is een andere indirecte methode voor het evalueren van de kweekdichtheid zonder direct het celgetal te meten. De voor het wegen gebruikte celsuspensie moet worden geconcentreerd door filtratie of centrifugatie, gewassen en vervolgens gedroogd voordat de metingen worden uitgevoerd. De drogingsgraad moet worden gestandaardiseerd om rekening te houden met het resterende watergehalte. Deze methode is vooral nuttig voor filamenteuze micro-organismen, die moeilijk te inventariseren zijn door directe of levensvatbare platentelling.

Zoals we hebben gezien, kunnen methoden om het aantal levensvatbare cellen te schatten arbeidsintensief zijn en tijd kosten omdat cellen moeten worden gekweekt. Onlangs zijn er indirecte manieren ontwikkeld om levende cellen te meten die zowel snel als eenvoudig te implementeren zijn. Deze methoden meten de celactiviteit door de productie van metabolische producten of het verdwijnen van reactanten te volgen. De vorming van adenosinetrifosfaat (ATP), de biosynthese van eiwitten en nucleïnezuren en het zuurstofverbruik kunnen allemaal worden gevolgd om het aantal cellen te schatten.

Controleer uw begrip

  • Wat is het doel van een kalibratiecurve bij het schatten van het celgetal uit troebelheidsmetingen?
  • Wat zijn de nieuwere indirecte methoden voor het tellen van levende cellen?

Alternatieve patronen van celdeling

Binaire splitsing is het meest voorkomende patroon van celdeling bij prokaryoten, maar het is niet het enige. Andere mechanismen omvatten gewoonlijk asymmetrische deling (zoals bij ontluikend) of de productie van sporen in luchtfilamenten.

In sommige cyanobacteriën kunnen veel nucleoïden zich ophopen in een vergrote ronde cel of langs een filament, wat leidt tot de vorming van veel nieuwe cellen tegelijk. De nieuwe cellen splitsen zich vaak van het moederfilament en drijven weg in een proces dat fragmentatie wordt genoemd (Figuur 9.16). Fragmentatie wordt vaak waargenomen in de Actinomycetes, een groep grampositieve, anaërobe bacteriën die vaak in de bodem worden aangetroffen. Een ander merkwaardig voorbeeld van celdeling in prokaryoten, dat doet denken aan levendgeborenen bij dieren, wordt tentoongesteld door de gigantische bacterie Epulopiscium . Verschillende dochtercellen groeien volledig in de oudercel, die uiteindelijk uiteenvalt en de nieuwe cellen vrijgeeft aan de omgeving. Andere soorten kunnen een lange smalle uitloper vormen aan één pool in een proces dat knopvorming wordt genoemd. De punt van de verlenging zwelt op en vormt een kleinere cel, de knop die uiteindelijk loskomt van de oudercel. Ontluiken komt het meest voor bij gist (Figuur 9.16), maar wordt ook waargenomen bij prothecaatbacteriën en sommige cyanobacteriën.

De bodembacteriën Actinomyces groeien in lange filamenten gedeeld door septa, vergelijkbaar met de mycelia die wordt gezien in schimmels, wat resulteert in lange cellen met meerdere nucleoïden. Omgevingssignalen, waarschijnlijk gerelateerd aan een lage beschikbaarheid van voedingsstoffen, leiden tot de vorming van luchtfilamenten. Binnen deze luchtfilamenten delen langwerpige cellen zich gelijktijdig. De nieuwe cellen, die een enkele nucleoïde bevatten, ontwikkelen zich tot sporen die aanleiding geven tot nieuwe kolonies.

Controleer uw begrip

Biofilms

In de natuur groeien micro-organismen voornamelijk in biofilms, complexe en dynamische ecosystemen die zich vormen op een verscheidenheid aan omgevingsoppervlakken, van industriële leidingen en waterzuiveringspijpleidingen tot rotsen in rivierbeddingen. Biofilms zijn echter niet beperkt tot vaste oppervlaktesubstraten. Bijna elk oppervlak in een vloeibare omgeving met minimale voedingsstoffen zal uiteindelijk een biofilm ontwikkelen. Microbiële matten die bijvoorbeeld op water drijven, zijn biofilms die grote populaties fotosynthetische micro-organismen bevatten. Biofilms die in de menselijke mond worden gevonden, kunnen honderden bacteriesoorten bevatten.Ongeacht de omgeving waar ze voorkomen, zijn biofilms geen willekeurige verzamelingen van micro-organismen, maar zijn het zeer gestructureerde gemeenschappen die een selectief voordeel bieden aan hun samenstellende micro-organismen.

Biofilmstructuur

Waarnemingen met behulp van confocale microscopie hebben aangetoond dat omgevingscondities de algehele structuur van biofilms beïnvloeden. Filamenteuze biofilms, streamers genaamd, vormen zich in snel stromend water, zoals zoetwaterstromen, wervelingen en speciaal ontworpen laboratoriumstroomcellen die groeiomstandigheden nabootsen in snel bewegende vloeistoffen. De streamers worden met een "kop" aan het substraat verankerd en de "staart" drijft stroomafwaarts in de stroming. In stilstaand of langzaam stromend water nemen biofilms vooral een paddenstoelachtige vorm aan. De structuur van biofilms kan ook veranderen met andere omgevingsomstandigheden, zoals de beschikbaarheid van voedingsstoffen.

Gedetailleerde observaties van biofilms onder confocale laser- en scanning-elektronenmicroscopen onthullen clusters van micro-organismen ingebed in een matrix afgewisseld met open waterkanalen. De extracellulaire matrix bestaat uit extracellulaire polymere stoffen (EPS) die worden uitgescheiden door de organismen in de biofilm. De extracellulaire matrix vertegenwoordigt een groot deel van de biofilm, goed voor 50% -90% van de totale droge massa. De eigenschappen van de EPS variëren afhankelijk van de aanwezige organismen en omgevingsomstandigheden.

EPS is een gehydrateerde gel die voornamelijk bestaat uit polysachariden en andere macromoleculen bevat, zoals eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Het speelt een sleutelrol bij het handhaven van de integriteit en functie van de biofilm. Kanalen in de EPS zorgen voor beweging van voedingsstoffen, afval en gassen door de biofilm. Dit houdt de cellen gehydrateerd en voorkomt uitdroging. EPS beschermt ook organismen in de biofilm tegen predatie door andere microben of cellen (bijv. protozoën, witte bloedcellen in het menselijk lichaam).

Biofilmvorming

Vrij zwevende microbiële cellen die in een aquatische omgeving leven, worden planktoncellen genoemd. De vorming van een biofilm omvat in wezen de hechting van planktoncellen aan een substraat, waar ze zittend worden (hecht aan een oppervlak). Dit gebeurt in fasen, zoals weergegeven in figuur 9.17. De eerste fase omvat de hechting van planktoncellen aan een oppervlak dat is bedekt met een conditionerende film van organisch materiaal. Op dit punt is de hechting aan het substraat omkeerbaar, maar naarmate cellen nieuwe fenotypes tot expressie brengen die de vorming van EPS vergemakkelijken, gaan ze over van een planktonische naar een sessiele levensstijl. De biofilm ontwikkelt karakteristieke structuren, waaronder een uitgebreide matrix en waterkanalen. Aanhangsels zoals fimbriae, pili en flagella interageren met de EPS, en microscopie en genetische analyse suggereren dat dergelijke structuren nodig zijn voor het tot stand brengen van een volwassen biofilm. In de laatste fase van de levenscyclus van de biofilm keren cellen aan de periferie van de biofilm terug naar een planktonische levensstijl, waarbij de volwassen biofilm wordt afgestoten om nieuwe sites te koloniseren. Deze fase wordt verspreiding genoemd.

Binnen een biofilm gaan verschillende soorten micro-organismen metabole samenwerkingsverbanden aan waarbij het afvalproduct van het ene organisme de voedingsstof wordt voor het andere. Aerobe micro-organismen verbruiken bijvoorbeeld zuurstof, waardoor anaërobe gebieden ontstaan ​​die de groei van anaëroben bevorderen. Dit komt voor bij veel polymicrobiële infecties waarbij zowel aerobe als anaerobe pathogenen betrokken zijn.

Het mechanisme waarmee cellen in een biofilm hun activiteiten coördineren als reactie op omgevingsstimuli, wordt quorum sensing genoemd. Quorum sensing - die kan optreden tussen cellen van verschillende soorten in een biofilm - stelt micro-organismen in staat hun celdichtheid te detecteren door de afgifte en binding van kleine, diffundeerbare moleculen die auto-inducers worden genoemd. Wanneer de celpopulatie een kritische drempel bereikt (een quorum), initiëren deze auto-inducers een cascade van reacties die genen activeren die geassocieerd zijn met cellulaire functies die alleen gunstig zijn wanneer de populatie een kritische dichtheid bereikt. Bij sommige pathogenen begint bijvoorbeeld de synthese van virulentiefactoren pas wanneer er voldoende cellen aanwezig zijn om de immuunafweer van de gastheer te overweldigen. Hoewel meestal bestudeerd in bacteriepopulaties, vindt quorumdetectie plaats tussen bacteriën en eukaryoten en tussen eukaryote cellen zoals de schimmel Candida albicans , een algemeen lid van de menselijke microbiota dat infecties kan veroorzaken bij immuungecompromitteerde personen.

De signaalmoleculen in quorum sensing behoren tot twee hoofdklassen. Gram-negatieve bacteriën communiceren voornamelijk met behulp van N-geacyleerde homoserinelactonen, terwijl grampositieve bacteriën meestal kleine peptiden gebruiken (Figuur 9.18). In alle gevallen bestaat de eerste stap in quorum sensing uit de binding van de autoinducer aan zijn specifieke receptor alleen wanneer een drempelconcentratie van signaalmoleculen is bereikt. Zodra binding aan de receptor plaatsvindt, leidt een cascade van signaleringsgebeurtenissen tot veranderingen in genexpressie. Het resultaat is de activering van biologische reacties die verband houden met quorumsensing, met name een toename van de productie van signaalmoleculen zelf, vandaar de term autoinducer.

Biofilms en menselijke gezondheid

Het menselijk lichaam herbergt vele soorten biofilms, sommige gunstig en sommige schadelijk. Zo spelen de lagen normale microbiota die het darm- en ademhalingsslijmvlies bekleden een rol bij het afweren van infecties door ziekteverwekkers. Andere biofilms in het lichaam kunnen echter een nadelig effect hebben op de gezondheid. De plaque die zich op tanden vormt, is bijvoorbeeld een biofilm die kan bijdragen aan tand- en parodontitis. Biofilms kunnen zich ook vormen in wonden, wat soms ernstige infecties veroorzaakt die zich kunnen verspreiden. de bacterie Pseudomonas aeruginosa koloniseert vaak biofilms in de luchtwegen van patiënten met cystische fibrose en veroorzaakt chronische en soms fatale longinfecties. Biofilms kunnen zich ook vormen op medische hulpmiddelen die in of op het lichaam worden gebruikt en infecties veroorzaken bij patiënten met verblijfskatheters, kunstgewrichten of contactlenzen.

Pathogenen ingebed in biofilms vertonen een hogere resistentie tegen antibiotica dan hun vrij zwevende tegenhangers. Er zijn verschillende hypothesen voorgesteld om te verklaren waarom. Cellen in de diepe lagen van een biofilm zijn metabolisch inactief en zijn mogelijk minder vatbaar voor de werking van antibiotica die metabolische activiteiten verstoren. De EPS kan ook de diffusie van antibiotica en antiseptica vertragen, waardoor ze de cellen in de diepere lagen van de biofilm niet kunnen bereiken. Fenotypische veranderingen kunnen ook bijdragen aan de verhoogde resistentie van bacteriële cellen in biofilms. Zo is aangetoond dat de verhoogde productie van effluxpompen, membraan-ingebedde eiwitten die actief antibiotica uit bacteriële cellen extruderen, een belangrijk mechanisme is van antibioticaresistentie bij biofilm-geassocieerde bacteriën. Ten slotte bieden biofilms een ideale omgeving voor de uitwisseling van extrachromosomaal DNA, dat vaak genen bevat die antibioticaresistentie verlenen.


Bekijk de video: Mikrobiologie: Die Welt der Schimmelpilze (December 2021).