Informatie

Transcriptie en vertaling van prokaryotische operons


Ik volg een cursus moleculaire genetica en we bespreken momenteel prokaryotische operons. Het lacZ-operon kwam voor mij als student vaak naar voren als een voorbeeld voor het aanleren van regulerende controle van transcriptie, en de focus lag altijd op het bepalen of het operon onder bepaalde omstandigheden (mutaties, voedingsstoffen, enz.) werd getranscribeerd. Ik herinner me niet veel discussie over wat er gebeurt na transcriptie. Vandaag merkte ik echter iets op dat ik nog nooit eerder had gezien: drie van de genen in het lacZ-operon worden gelijktijdig op hetzelfde transcript getranscribeerd - ik weet niet hoe ik dit eerder heb gemist!

Mijn vraag is wat er gebeurt na de transcriptie. Uiteraard zijn er 3 eiwitproducten. Hoe zijn deze producten afgeleid van het transcript? Is het transcript in 3 stukken gebroken, of vertaalt een enkel ribosoom alle 3 de eiwitten van een enkel transcript substraat, of vertalen ribosomen een enkel eiwit van een enkel transcript substraat tegelijk? Waar kon ik de relevante literatuur vinden die het vertaalproces toelichtte?


Zoals u aangaf, wordt het repressorgen lacI getranscribeerd als één mRNA, en drie structurele genen: lacZ, lacY en lacA worden getranscribeerd in één enkel polycistronisch mRNA. De twee mRNA's worden onafhankelijk van elkaar getranslateerd.

Het polycisronische mRNA wordt niet in stukjes gebroken. Het wordt eerder vertaald door ribosomen (minstens drie, uitleg hieronder), wat aanleiding geeft tot drie individuele eiwitten.

Hoe worden van één mRNA drie eiwitproducten vertaald? Het polycistronische DNA bestaat uit een promotor (Plac), die ervoor zorgt dat de transcriptie wordt gestart, en drie open leesramen (ORF's) voor voor lacZ, lacY en lacA. Stroomopwaarts van elk van de ORF's bevinden zich ribosoombindingsplaatsen (RBS's). Translatie wordt geïnitieerd door de binding van het ribosoom met zowel het RBS als het startcodon. Zo kunnen meerdere ribosomen stroomopwaarts van de drie ORF's binden en zo resulteren in drie eiwitten.

Er is niet erg grondige literatuur over de translatie van polycistronisch RNA in prokaryoten, voornamelijk omdat de voorwaarde die nodig is voor translatie de RBS is en er niets specifieks is voor polycistronische translatie. Een kort overzicht van het onderwerp is op verschillende plaatsen te vinden, aangezien ik het volgende aanbeveel:

  1. Ralston, A. (2008) Operons en prokaryotische genregulatie. Natuureducatie
  2. Van genen tot genomen: concepten en toepassingen van DNA-technologie
  3. Moleculaire celbiologie
  4. Analyse van genen en genomen

Transcriptiemechanisme in prokaryoten | Genetica

In dit artikel zullen we het hebben over:- 1. Betekenis van transcriptie in prokaryoten 2. Transcriptiemechanisme in prokaryoten 3. Omgekeerde transcriptie 4. Prokaryotische versus eukaryote transcriptie 5. Detectie.

Betekenis van transcriptie in prokaryoten:

Transcriptie is het proces waarbij een DNA-sequentie enzymatisch wordt gekopieerd door een RNA-polymerase om een ​​complementair RNA te produceren. De synthese van RNA uit een enkele streng van een DNA-molecuul in aanwezigheid van het enzym RNA-polymerase wordt transcriptie genoemd.

Met andere woorden, het is het proces van vorming van een boodschapper-RNA-molecuul met behulp van een DNA-molecuul. Veel van het baanbrekende werk op het gebied van transcriptie werd uitgevoerd in prokaryoten, met name in de bacterie E. coli. Deze studies legden de basis voor werk dat later werd uitgevoerd in de meer complexe eukaryoten.

De RNA-synthese door RNA-polymerase werd in 1965 door verschillende laboratoria in vitro vastgesteld, maar het door deze enzymen gesynthetiseerde RNA had eigenschappen die suggereerden dat er een extra factor bestond die nodig was om de transcriptie correct te beëindigen.

In 1972 werd Walter Fiers de eerste persoon die het bestaan ​​van het terminerende enzym daadwerkelijk aantoonde. In 2006 won Roger D. Kornberg de Nobelprijs voor Scheikunde 'voor zijn onderzoek naar de moleculaire basis van eukaryote transcriptie.'

De belangrijkste punten met betrekking tot transcriptie worden hieronder opgesomd:

RNA wordt gesynthetiseerd uit een DNA-template. Het RNA wordt verwerkt tot messenger RNA [mRNA], dat vervolgens wordt gebruikt voor de synthese van een eiwit. Het aldus gesynthetiseerde RNA wordt boodschapper-RNA (mRNA) genoemd, omdat het een genetische boodschap van het DNA naar de eiwitsynthetiserende machinerie van de cel brengt.

Het belangrijkste verschil tussen RNA en DNA-sequentie is de aanwezigheid van U of uracil in RNA in plaats van de T of thymine van DNA.

Het RNA wordt gesynthetiseerd uit een enkele matrijs [streng] van een DNA-molecuul. Het stuk DNA dat in een RNA-molecuul wordt getranscribeerd, wordt een transcriptie-eenheid genoemd. Een transcriptie-eenheid codeert de sequentie die wordt vertaald in eiwit. Het stuurt en reguleert ook de eiwitsynthese.

De DNA-streng die wordt gebruikt bij de RNA-synthese wordt de matrijsstreng genoemd omdat deze de matrijs verschaft voor het ordenen van de sequentie van nucleotiden in een RNA-transcript. De DNA-streng die niet deelneemt aan de DNA-synthese wordt coderende streng genoemd, omdat de nucleotidesequentie ervan dezelfde is als die van het nieuw gecreëerde RNA-transcript.

Het enzym dat transcriptie uitvoert, wordt RNA-polymerase genoemd en bestaat uit vier soorten polypeptiden, aangeduid als α, β, ’ en σ, die aan elkaar zijn gebonden tot een complex dat een holo-enzym wordt genoemd.

4. Genetische informatie gekopieerd:

In dit proces wordt de genetische informatie die in DNA is gecodeerd gekopieerd naar een RNA-molecuul. De genetische informatie wordt getranscribeerd of gekopieerd, van DNA naar RNA.

De expressie van een gen bestaat uit twee hoofdstappen, namelijk transcriptie en translatie. Transcriptie is dus de eerste stap in het proces van genregulatie of eiwitsynthese.

6. Richting van synthese:

Net als bij DNA-replicatie wordt RNA gesynthetiseerd in de richting 5'8242 —> 3'8242. De DNA-matrijsstreng wordt door RNA-polymerase afgelezen als 3'8242 —> 5'8242 en de nieuwe RNA-streng wordt gesynthetiseerd in de 5'8217-> 3'8242-richting. RNA-polymerase bindt aan het 3'8242-uiteinde van een gen (promotor) op de DNA-matrijsstreng en reist naar het 5'8242-uiteinde.

Transcriptiemechanisme in prokaryoten:

Het mechanisme van transcriptie bestaat uit drie hoofdfasen of stadia, namelijk:

Deze worden als volgt kort besproken:

In bacteriën begint transcriptie met de binding van RNA-polymerase aan de promotor in DNA. Het RNA-polymerase is een kernenzym dat bestaat uit vijf subeenheden: 2 -subeenheden, 1 -subeenheid, 1 β’-subeenheid en 1 σ-subeenheid. Aan het begin van de initiatie wordt het kernenzym geassocieerd met een sigmafactor (nummer 70) die helpt bij het vinden van de juiste -35 en -8211 10 basenparen stroomafwaarts van promotorsequenties.

De initiatie bestaat uit de volgende stappen:

(i) RNA-polymerase (RNAP) bindt aan een van verschillende specificiteitsfactoren om een ​​holo-enzym te vormen. In deze vorm kan het specifieke promotorregio's in het DNA herkennen en eraan binden. In dit stadium is het DNA dubbelstrengs ('8220gesloten'8221). Deze holoenzym/wond-DNA-structuur wordt het gesloten complex genoemd.

(ii) Het DNA wordt afgewikkeld en wordt enkelstrengs ('8220open'8221) in de buurt van de initiatieplaats (gedefinieerd als + 1). Deze holoenzym/afgewikkelde-DNA-structuur wordt het open complex genoemd.

(iii) De RNA-polymerase transcribeert het DNA, maar produceert ongeveer 10 mislukte (korte, niet-productieve) transcripten die de RNA-polymerase niet kunnen verlaten omdat het uitgangskanaal wordt geblokkeerd door de cr-factor.

(iv) De a-factor dissocieert uiteindelijk van het holo-enzym en de verlenging gaat door. De meeste transcripten zijn afkomstig van adenosine-5'8242-trifosfaat (ATP) en, in mindere mate, guanosine-5'8242-trifosfaat (GTP) (purine-nucleoside-trifosfaten) op de +1-plaats. Uridine-5'8242-trifosfaat (UTP) en cytidine-5'8242-trifosfaat (CTP) (pyrimidine-nucleoside-trifosfaten) zijn ongunstig op de startplaats.

Bij transcriptie neemt slechts één DNA-streng [matrijsstreng of niet-coderende streng genoemd] deel als sjabloon. Naarmate de transcriptie vordert, doorkruist RNA-polymerase de matrijsstreng en gebruikt het basenparen complementariteit met de DNA-matrijs om een ​​RNA-kopie te creëren.

Hoewel RNA-polymerase de template-streng van 3'8242 —> 5'8242 doorkruist, wordt de coderende (niet-template) streng gewoonlijk als referentiepunt gebruikt, dus de transcriptie zou gaan van 5'8242 -> 3'8242.

Dit produceert een RNA-molecuul van 5'8242 3'8242, een exacte kopie van de coderende streng (behalve dat thymines worden vervangen door uracils en de nucleotiden zijn samengesteld uit een ribose (5-koolstof) suiker waarbij DNA deoxyribose heeft (een minder zuurstofatoom) in zijn suikerfosfaatruggengraat).

Bij de prokaryoten begint de elongatie met de “abortieve initiatiecyclus”. Tijdens deze cyclus zal RNA-polymerase mRNA-fragmenten van 2-12 nucleotiden lang synthetiseren. Dit blijft gebeuren totdat de σ-factor herschikt, wat resulteert in het transcriptie-verlengingscomplex (wat een bewegende voetafdruk van 35 bp geeft). De a-factor wordt vrijgegeven voordat 80 nucleotiden mRNA zijn gesynthetiseerd.

In prokaryoten zijn er twee verschillende manieren van transcriptiebeëindiging, namelijk:

(ii) Rho-afhankelijk zijn algemeen bekend.

Deze worden als volgt kort besproken:

(i) Rho-onafhankelijke beëindiging:

Het is ook bekend als intrinsieke transcriptieterminatie. Het gaat om terminatorsequenties in het RNA die het RNA-polymerase signaleren om te stoppen. De terminatorsequentie is gewoonlijk een palindroomsequentie die een stamlus-haarspeldstructuur vormt die leidt tot de dissociatie van het RNAP van de DNA-template.

In de Rho-onafhankelijke transcriptieterminatie stopt de RNA-transcriptie wanneer het nieuw gesynthetiseerde RNA-molecuul een G-C-rijke haarspeldlus vormt, gevolgd door een reeks U'8217's, waardoor het de DNA-template losmaakt.

(ii) Rho-afhankelijke beëindiging:

In de “Rho-afhankelijk” type terminatie, een eiwitfactor genaamd “Rho” [P-factor] wordt gebruikt om de RNA-synthese op specifieke plaatsen te stoppen. Dit eiwit bindt op een Rho-gebruiksplaats op de ontluikende RNA-streng en loopt langs het mRNA naar het RNA-polymerase.

Wanneer de p-factor het RNAP bereikt, zorgt dit ervoor dat RNAP zich losmaakt van het DNA, waardoor de transcriptie wordt beëindigd. Met andere woorden, het destabiliseert de interactie tussen de matrijs en het mRNA, waardoor het nieuw gesynthetiseerde mRNA vrijkomt uit het elongatiecomplex.

Omgekeerde transcriptie in prokaryoten:

Synthese van DNA uit een RNA-molecuul in aanwezigheid van het enzym reverse transcriptase wordt reverse transcriptie genoemd. Reverse transcriptie werd voor het eerst gerapporteerd door Temin en Baltimore in 1970, waarvoor ze in 1975 de Nobelprijs kregen.

Reverse transcriptie wordt ook wel Teminisme genoemd. Sommige virussen (zoals HIV, de oorzaak van AIDS) hebben het vermogen om RNA om te zetten in DNA. HIV heeft een RNA-genoom dat wordt gedupliceerd in DNA.

Het resulterende DNA kan worden samengevoegd met het DNA-genoom van de gastheercel. Het belangrijkste enzym dat verantwoordelijk is voor de synthese van DNA uit een RNA-matrijs wordt reverse transcriptase genoemd. In het geval van HIV is reverse transcriptase verantwoordelijk voor het synthetiseren van een complementaire DNA-streng (cDNA) aan het virale RNA-genoom.

Een geassocieerd enzym, ribonuclease H, verteert de RNA-streng en reverse transcriptase synthetiseert een complementaire DNA-streng om een ​​dubbele helix-DNA-structuur te vormen. Dit cDNA wordt via een ander enzym (integrase) in het genoom van de gastheercel geïntegreerd, waardoor de gastheercel virale eiwitten genereert die zich weer in elkaar zetten tot nieuwe virale deeltjes. Vervolgens ondergaat de gastheercel geprogrammeerde celdood (apoptose).

Prokaryotische versus eukaryote transcriptie:

Het transcriptieproces is in verschillende opzichten hetzelfde in zowel eukaryoten als prokaryoten. Er zijn echter enkele verschillen in transcriptie van deze twee groepen, zoals hieronder wordt aangegeven.

1. Het proces is veel gecompliceerder bij eukaryoten dan bij prokaryoten.

2. In eukaryoten vinden transcriptie en translatie afzonderlijk plaats in respectievelijk kern en cytoplasma, terwijl in prokaryoten beide processen gelijktijdig plaatsvinden in het cytoplasma.

3. Het eukaryote mRNA bevat introns en moet daarom worden aangepast voordat het aan de eiwitsynthese deelneemt. In prokaryoot vereist het mRNA geen modificatie.

4. Eukaryoten hebben DNA in de kern, terwijl in prokaryoten DNA zich in het cytoplasma bevindt.

Detectie van transcriptie in prokaryoten:

Transcriptie kan op verschillende manieren worden gemeten en gedetecteerd.

De veelgebruikte methoden voor het detecteren van transcriptie worden hieronder gegeven:

1. Nuclear Run-on-assay, meet de relatieve abundantie van nieuw gevormde transcripten.

2. RNAse-beschermingstest en ChlP-chip van RNAP, detecteren actieve transcriptieplaatsen.

3. RT-PCR, meet de absolute overvloed aan totale of nucleaire RNA-niveaus, die echter kunnen verschillen van transcriptiesnelheden.

4. DNA-microarrays meten de relatieve abundantie van de globale totale of nucleaire RNA-niveaus, die echter kunnen verschillen van de transcriptiesnelheden.


Transcriptie en vertaling van prokaryotische operons - Biologie

Figuur 1: Elektronenmicroscopiebeeld van gelijktijdige transcriptie en vertaling. De afbeelding toont bacterieel DNA en de bijbehorende mRNA-transcripten, die elk worden ingenomen door ribosomen. (Overgenomen van O.L. Miller et al., Science 169:392, 1970.)

Transcriptie, de synthese van mRNA uit DNA, en translatie, de synthese van eiwit uit mRNA, zijn de belangrijkste pijlers van het centrale dogma van de moleculaire biologie. Hoe verhouden de snelheden van deze twee processen zich tot elkaar? Deze vraag wordt des te interessanter als gevolg van waarnemingen zoals die in figuur 1, namelijk het bestaan ​​van de prachtige "kerstboom"-structuren die zijn waargenomen in E. coli met behulp van elektronenmicroscopie. Deze stereotiepe structuren weerspiegelen de gelijktijdige transcriptie en translatie van hetzelfde gen en roepen de vraag op hoe de relatieve snelheden van de twee processen zich verhouden tot het mogelijk maken van een dergelijke synchronisatie van deze twee ongelijksoortige processen.

Figuur 2: Berekening van de achterkant van de envelop waarin de transcriptie- en translatiesnelheden worden vergeleken, waaruit blijkt dat ze in feite erg op elkaar lijken. nt staat voor nucleotiden, d.w.z. basen.

Transcriptie van RNA in E. coli van zowel mRNA als het stabiele rRNA en tRNA, wordt uitgevoerd door ≈1000-10.000 RNA-polymerasemoleculen (BNID 101440) met een maximale snelheid van ongeveer 40-80 nt/sec, zoals weergegeven in Tabel 1 (BNID 104900, 104902, 108488). Translatie van eiwitten in E. coli wordt uitgevoerd door ≈ 10.000-100.000 ribosomen (BNID 101441) en verloopt met een maximale snelheid van ongeveer 20 aa/sec, zoals weergegeven in Tabel 2 (BNID 100059, 105067, 108490). Interessant is dat, aangezien elke 3 basenparen coderen voor één aminozuur, de snelheden van de twee processen bijna overeenkomen, zoals schematisch weergegeven in figuur 2 (zie ook BNID 108487). Als translatie sneller zou zijn dan transcriptie, zou dit ertoe leiden dat het ribosoom "botst" met het RNA-polymerase in prokaryoten waar de twee processen gelijktijdig kunnen plaatsvinden. Dergelijke co-transcriptionele vertaling is leerboekmateriaal geworden door middel van afbeeldingen zoals figuur 1. Maar recente microscopie met één molecuul laat zien dat dit relatief zelden voorkomt en de meeste vertalingen gaan niet gepaard met transcriptie in E. coli (S. Bakshi et al., Mol Microbiol. 85:21, 2012). Integendeel, de meeste translatie vindt plaats op mRNA dat al is gediffundeerd van het DNA-rijke nucleoïde gebied naar ribosoomrijke cytoplasmatische gebieden. De verdeling van ribosomen in de cellen is verder weergegeven in het vignet over “Hoeveel ribosomen zitten er in een cel?”. In een andere draai en draai van het centrale dogma werd aangetoond dat ribosomen belangrijk kunnen zijn voor snelle transcriptie in bacteriën (S. Proshkin et al., Science 328:504, 2010). De ribosomen lijken te voorkomen dat RNA-polymerase achteruitgaat en pauzeert, wat anders heel gewoon kan zijn voor deze machines, waardoor een opvallende omgekeerde koppeling tussen translatie en transcriptie ontstaat.

Tabel 1. Transcriptiesnelheid gemeten over organismen en omstandigheden. Alle waarden gemeten bij 37°C behalve D. melanogaster gemeten bij 22°C.

Tabel 2: Vertaalsnelheid gemeten over organismen en omstandigheden. Alle waarden gemeten bij 37°C behalve S. cerevisiae en N. crassa gemeten bij 30°C.

Wat betekenen de relatieve snelheden van transcriptie en translatie voor de totale tijd die nodig is vanaf transcriptie-initiatie tot gesynthetiseerd eiwit voor een bepaald gen? In bacteriën zou een gen van één kb bij een maximale transcriptiesnelheid ongeveer 1000 nt/80 nt/s ≈ 10s moeten zijn en de verlenging van de translatie bij maximale snelheid ongeveer hetzelfde. We merken op dat de totale tijdschaal de som is van een verlengingstijd zoals hierboven en de initiatietijd, die in sommige gevallen langer kan zijn. Onlangs werd waargenomen dat het verhogen van de translatiesnelheid, door het vervangen van wiebelcodons door perfect passende codons, resulteert in fouten bij het vouwen (P.S. Spencer et al, J. Mol. Biol., 422:328, 2012). Dit suggereert een afweging waarbij de translatiesnelheid wordt beperkt door de tijd die nodig is om een ​​juiste vouwing van domeinen in het ontluikende eiwit mogelijk te maken.

Figuur 3: Effect van rifampicine op transcriptie-initiatie. Elektronenmicrofoto's van E. coli rRNA-operons: (A) vóór het toevoegen van rifampicine, (B) 40 s na toevoeging van rifampicine en (C) 70 s na blootstelling. Na medicamenteuze behandeling worden geen nieuwe transcripten geïnitieerd, maar degenen die al zijn geïnitieerd, houden elongatie door. In delen (A) en (B) geeft de pijl de plaats aan waar RNaseIII het ontluikende RNA-molecuul splitst en 16S- en 23S-ribosomale subeenheden produceert. RNA-polymerase-moleculen die niet zijn aangetast door het antibioticum zijn gemarkeerd met de pijlen in deel (C). (Overgenomen van L.S. Gotta et al., J. Bacteriol. 20:6647, 1991.)

Hoe worden de snelheden van deze sleutelprocessen van het centrale dogma gemeten? Dit is een interessante uitdaging, zelfs met de geavanceerde technologieën van vandaag. Laten we eens kijken hoe we dit probleem kunnen aanpakken. Een vaag idee zou kunnen zijn: "laten we een GFP uitdrukken en de tijd meten totdat deze verschijnt". Om de gebreken in een dergelijke aanpak te zien, bekijk het vignet over "Wat is de rijpingstijd voor fluorescerende eiwitten?" (kort antwoord -8211 minuten tot een uur), wat een mismatch aantoont van tijdschalen tussen de processen van belang en die van de vermeende uitlezing. Het experimentele arsenaal dat beschikbaar was in de jaren zeventig, toen de antwoorden voor het eerst overtuigend werden verkregen, was veel beperkter. Maar in een reeks slimme experimenten, met behulp van elektronenmicroscopie en radioactieve labeling, werden deze snelheden nauwkeurig bepaald (Miller et al., Science 169:392, 1970 RY Young & H. Bremer, Biochem. J., 152:243, 1975) . Zoals hieronder zal worden aangetoond, vertrouwden ze op een subtiele kwantitatieve analyse om de tarieven te achterhalen.

Metingen van transcriptiesnelheden waren gebaseerd op een truc waarbij de transcriptie-initiatie werd stopgezet met behulp van het medicijn rifampicine.Hoewel er geen nieuwe transcriptiegebeurtenissen kunnen beginnen, gaan degenen die al aan de gang zijn onverminderd door, d.w.z. rifampicine remt de initiatie van transcriptie, maar niet de verlenging van RNA-transcripten. Als gevolg hiervan begint deze medicamenteuze behandeling effectief met het laten lopen van een stopwatch, de tijdsduur sinds het laatste transcriptieproces begon. Door de cellen te fixeren en het transcriptieproces op verschillende tijdstippen na de medicamenteuze behandeling te stoppen en vervolgens elektronenmicroscopie uit te voeren, resulterend in afbeeldingen zoals die in figuur 3, was het mogelijk om de lengte van RNA-polymerase-vrij DNA te meten. Door rekening te houden met de verstreken tijd sinds de medicamenteuze behandeling, wordt de snelheid waarmee deze polymerasen bewegen afgeleid.

Figuur 4: Dynamiek van transcriptie in het vliegembryo. (A) Schematische voorstelling van het experiment dat laat zien hoe een lus in het ontluikende RNA-molecuul dient als een bindingsplaats voor een viraal eiwit dat is gefuseerd met GFP. (B) Afhankelijk van of de RNA-lussen op het 5'- of 3'-uiteinde van het mRNA-molecuul worden geplaatst, zal de tijd die nodig is om GFP-puncta te zien, anders zijn. De vertragingstijd is gelijk aan de lengte van het getranscribeerde gebied gedeeld door de snelheid van het polymerase. (C) Microscopie-afbeeldingen die het uiterlijk van puncta tonen die zijn gekoppeld aan het transcriptieproces voor beide constructies die worden weergegeven in (B). (D) Distributie van tijden van eerste verschijning voor de twee constructies die een vertragingstijd van 2,2 minuten opleveren, waaruit een transcriptiesnelheid van 25 nt/s wordt afgeleid. Metingen uitgevoerd bij kamertemperatuur van 22OC. (overgenomen van H.G. Garcia, et al., Current Biology, 23, 2140-2145, 2013.)

De meting van translatiesnelheden was op dezelfde manier afhankelijk van het vinden van een geschikte stopwatch, maar dit keer voor het eiwitsyntheseproces. De kern van de methode is de volgende: begin gelabeld aminozuur toe te voegen op tijdstip nul en volg (“achtervolging” zoals het vaak wordt genoemd) de fractie van gelabeld eiwit met massa m zoals gedefinieerd door naar een specifieke band op een gel te kijken. Onmiddellijk na de puls van gelabelde aminozuren begint men eiwitten met massa m te zien met aan hun uiteinden radioactief gelabelde aminozuren. Na verloop van tijd zal de fractie van een bepaalde eiwitmassa die wordt gelabeld toenemen naarmate de ketens een groter deel van hun lengte gelabeld hebben. Na een tijd τm, afhankelijk van de transcriptlengte, zal de hele keten worden gelabeld, aangezien dit eiwitten zijn die hun translatie begonnen op tijdstip nul toen het label werd toegevoegd. Op dit moment neemt men een verandering waar in de accumulatiedynamiek (indien op de juiste manier genormaliseerd naar de algemene labeling in de cel). Uit de verstreken tijd, τm, en door te weten hoeveel aminozuren zich in een polypeptideketen met massa m bevinden, is het mogelijk om een ​​schatting voor de translatiesnelheid af te leiden. Er zijn onzekerheden verbonden aan het doen van dit die worden geminimaliseerd door dit uit te voeren voor verschillende eiwitmassa's, m, en een regressielijn te berekenen over alle verkregen waarden. Voor een volledig begrip van de methode zal de lezer profiteren van de originele studie van Young & Bremer, Biochem. J., 160:185, 1976. Het blijft tot op de dag van vandaag een betrouwbare waarde voor de vertaalsnelheid van E. coli. We zijn niet op de hoogte van nieuwere methoden die betere resultaten geven.

Figuur 5: verdeling van gemeten transcriptie-verlengingssnelheden afgeleid van het verlichten van transcriptieremming en het sequencen van alle transcripten op latere tijdstippen. (Aangepast van G. Fuchs et al., Genome Bio., 15:5, 2014.)

Wat zijn de overeenkomstige tarieven in eukaryoten? Zoals getoond in Tabellen 1 en 2, bestaat transcriptie in zoogdiercellen uit verlenging met snelheden die vergelijkbaar zijn met die gemeten in E. coli (50-100 nt/sec, BNID 105566, 105113, 100662). Er wordt gesuggereerd dat deze stukken van snelle transcriptie worden afgewisseld met pauzes die leiden tot een gemiddelde snelheid die ongeveer een orde van grootte langzamer is (≈6 nt/sec, 100661), maar sommige rapporten stellen geen dergelijke vertraging vast (BNID 105565). Recente in-vivo-metingen in vliegenembryo's hebben een prachtig realtime beeld opgeleverd van het transcriptieproces door fluorescentie te gebruiken om de eerste verschijning van mRNA te bekijken, zoals weergegeven in figuur 4. Onlangs leidde een andere benadering die gebruikmaakt van de kracht van sequencing de distributie van transcriptie-verlenging af. snelheden in een HeLa-cellijn zoals weergegeven in figuur 5, met een bereik van 30-100 nts/s met een mediane snelheid van 60 nts/s (BNID 111027). Onthoud dat bij eukaryoten transcriptie en translatie ruimtelijk gescheiden zijn, waarbij transcriptie plaatsvindt in de kern en translatie in het cytoplasma. Introns worden uit transcripten gesneden voorafgaand aan translatie, wat gemiddeld ongeveer 5-10 minuten duurt voor dit proces van mRNA-splitsing (BNID 105568). Hoewel onze focus hier lag op transcriptieverlenging, lijkt in sommige gevallen het snelheidsbeperkende proces de initiatie van transcriptie te zijn. Dit is het proces waarbij het RNA-polymerasecomplex wordt geassembleerd en de twee DNA-strengen worden gescheiden om een ​​bel te vormen die transcriptie mogelijk maakt.

Figuur 6: het afleiden van de snelheid van vertaling door het ribosoom in embryonale stamcellen van muizen met behulp van ribosoomprofilering. (A) Remming van de translatie-initiatie gevolgd door remming van rek creëert een patroon van ribosoomstalling afhankelijk van de tijdsverschillen en translatiesnelheden. Met behulp van moderne sequencing-technieken kan dit genoombreed worden gekwantificeerd en kan de translatiesnelheid nauwkeurig worden gemeten voor elk transcript. (B) Meting van de vertaalsnelheid met behulp van de methode die schematisch is aangegeven in deel (A). (Aangepast van N. Ingolia et al., Cell, 146:789, 2011.

Hoe zit het met de vertaalsnelheid in eukaryoten? In ontluikende gist is de snelheid ongeveer 2 keer langzamer dan die in bacteriën (3-10 aa/s, BNID 107871), maar men moet er rekening mee houden dat de "fysiologische" temperatuur waarbij het wordt gemeten 30ºC is, terwijl voor E. coli metingen zijn op 37ºC. Zoals besproken in het vignet over "Hoe beïnvloedt temperatuur snelheden en affiniteiten?", is de langzamere snelheid wat men zou verwachten op basis van de algemene afhankelijkheid van een factor 2-3 per 10ºC (Q10-waarde, BNID 100919). Met behulp van de methode van ribosoomprofilering op basis van high-throughput-sequencing en schematisch weergegeven in figuur 6, werd de translatiesnelheid in embryonale stamcellen van muizen onderzocht voor veel verschillende transcripten. Het bleek dat de snelheid vrij constant is over eiwitten heen en ongeveer 6 aminozuren per seconde is (BNID 107952). Na tientallen jaren van intensief onderzoek en steeds meer uitgebreide technieken die we tot onze beschikking hebben, lijken we op het punt te zijn aangekomen waarop de kwantitatieve beschrijving van de verschillende stappen van het centrale dogma kan worden geïntegreerd om de ingewikkelde tijdelijke afhankelijkheden ervan te onthullen.


Caenorhabditis elegans: moleculaire genetica en ontwikkeling

J. Jason Morton, Thomas Blumenthal, in Methods in Cell Biology, 2011

6 Hoe wijdverbreid zijn operons?

Hoewel operons in metazoans voor het eerst werden ontdekt in C. elegans, ze zijn geenszins uniek voor deze groep nematoden of zelfs voor de nematodenphylum. Ze zijn ook aanwezig in C. briggsae, evenals verschillende andere soorten in de rhabditid-groep. Er is bewijs voor operons voor verder verwante nematoden, waaronder: Brugia maleisië en Ascaris suum ( Guiliano en Blaxter, 2006 Liu et al., 2010 ). Hoewel operons nog niet zijn geïdentificeerd in de nematodensoort die het verst verwant is aan C. elegans, zoals Trichinella spiralis, de aanwezigheid van een gesplitste leider in deze soort maakt hun bestaan ​​mogelijk ( Pettitt et al., 2008 ). Het is redelijk om te veronderstellen dat operons zich kort na de komst van trans-splitsing ontwikkelden en universeel zijn onder nematoden. Eenmaal gevormd, zijn operons noodzakelijkerwijs extreem moeilijk te verliezen, evolutionair gezien. Omdat stroomafwaartse genen nu gescheiden zijn van hun promotors, is het minder waarschijnlijk dat hun duplicatie of transpositie resulteert in een functioneel gen (Qian en Zhang, 2008). Bovendien, aangezien de verwerking van het polycistronische RNA dat resulteert uit operons trans-splitsing vereist is, kunnen out-of-frame startcodons evolueren in de DNA-sequenties stroomopwaarts van een trans-splitsingsplaats (Blumenthal, 2005). Om deze reden hebben studies geconcludeerd dat, eenmaal gevormd, operons niet gemakkelijk verloren gaan door evolutie. Maar zelfs bij nauw verwante soorten, zoals C. elegans en C. briggsae, gescheiden door ongeveer 100 miljoen jaar evolutie, zijn de inhoud en rangschikking van operonen opmerkelijk verschillend (Qian en Zhang, 2008). Toen ook verder verwante nematoden werden onderzocht, documenteerden deze auteurs talrijke aanvullende gevallen van operonverlies en herschikking.

Buiten de nematode phylum zijn operons gemeld in verschillende aanvullende phyla. Het blijkt dat in al deze gevallen trans-splitsing onafhankelijk is ontstaan ​​(uit cis-splitsing), en dat vervolgens operons in het genoom zijn ontstaan. In ten minste twee gevallen, geleedpotigen en chordaten, lijkt het erop dat trans-splitsing en mogelijk operons relatief recent zijn ontstaan, aangezien de meeste takken van deze phyla deze kenmerken niet hebben ( Douris et al., 2010 ).


Operons

Bij prokaryoten worden genen die coderen voor enzymen van bepaalde metabole routes vaak als een groep gecontroleerd, waarbij de genen die coderen voor de eiwitten van de route dicht bij elkaar staan ​​en onder controle staan ​​van een gemeenschappelijke promotor. Zo'n groep genen heet an operon. Meestal worden deze genen niet de hele tijd getranscribeerd. In plaats daarvan kan de productie van deze eiwitten worden getriggerd door de aanwezigheid van een geschikte stof genaamd an inductor. Dit fenomeen heet inductie. Een bijzonder goed bestudeerd voorbeeld van een induceerbaar eiwit is het enzym galactosidase in E coli.

de disacharide lactose (een -galactoside) is het substraat van β-galactosidase. Het enzym hydrolyseert de glycosidische binding tussen galactose en glucose, de monosachariden die de samenstellende delen van lactose zijn. E coli kan overleven met lactose als enige koolstofbron. Hiervoor heeft de bacterie β-galactosidase nodig om de eerste stap in de afbraak van lactose te katalyseren.

De productie van β-galactosidase vindt alleen plaats in aanwezigheid van lactose, niet in aanwezigheid van andere koolstofbronnen, zoals glucose. Een metaboliet van lactose, allolactose, is de eigenlijke inductor, en β-galactosidase is een induceerbaar enzym.


β -Galactosidase wordt gecodeerd door astructureel gen(lacZ) (Figuur 11.10). Structurele genen coderen voor de genproducten die betrokken zijn bij de biochemische route van het operon. Twee andere structurele genen maken deel uit van het operon. Een is kanten, dat codeert voor het enzym lactosepermease, waardoor lactose de cel kan binnendringen. De andere is lacA, dat codeert voor een enzym dat trans-acetylase wordt genoemd. Het doel van dit laatste enzym is niet bekend, maar sommigen veronderstellen dat zijn rol erin bestaat bepaalde antibiotica te inactiveren die de cel kunnen binnendringen via

het lactosepermease. De expressie van deze structurele genen staat op zijn beurt onder controle van a regulerend gen (lacI ), en de werkingswijze van het regulerende gen is het belangrijkste onderdeel van de lac operon mechanisme. Het regulerende gen is verantwoordelijk voor de productie van een eiwit, de repressor. Zoals de naam aangeeft, remt de repressor de expressie van de structurele genen. In aanwezigheid van de inductor wordt deze remming opgeheven. Dit is een voorbeeld van negatieve regulatie omdat delacoperon is ingeschakeld tenzij er iets aanwezig is om het uit te schakelen, wat in dit geval de repressor is.


Transcriptie wordt anders gereguleerd in prokaryoten en eukaryoten. Over het algemeen is prokaryotische regulatie eenvoudiger dan eukaryote regulatie.

De rol van operons

Regulatie van transcriptie in prokaryoten omvat typisch operons. Een operon is een DNA-gebied dat bestaat uit een of meer genen die coderen voor de eiwitten die nodig zijn voor een specifieke functie. Het operon omvat ook een promotor en een operator. De operator is een gebied van het operon waar regulerende eiwitten binden. Het is gelegen nabij de promotor en helpt bij het reguleren van de transcriptie van de operon-genen.

Het Lac Opéron

Een bekend voorbeeld van operon-regulatie is de: lac operon in E coli bacteriën (zie Figuur hieronder en de video op de onderstaande link). Het lac-operon bestaat uit een promotor, een operator en drie genen die coderen voor de enzymen die nodig zijn om lactose te verteren, de suiker die in melk wordt aangetroffen. Het lac-operon wordt gereguleerd door lactose in de omgeving. De Lac operon video op http://www.youtube.com/watch?v=oBwtxdI1zvk legt de operon in meer detail uit.

  • Wanneer lactose afwezig is, a repressor eiwit bindt aan de operator. De operator bevindt zich tussen de promotor en de drie lac-operon-genen. Het eiwit blokkeert de binding van RNA-polymerase aan de promotor. Als resultaat worden de lac-genen niet tot expressie gebracht.
  • Wanneer lactose aanwezig is, bindt het repressoreiwit niet aan de operator. Hierdoor kan RNA-polymerase aan de promotor binden en met transcriptie beginnen. Hierdoor worden de lac-genen tot expressie gebracht en wordt lactose verteerd.

Waarom zou het nuttig zijn om genen alleen tot expressie te brengen als ze nodig zijn? (Hint: het synthetiseren van eiwitten vereist energie en materialen.)

De drie genen van het lac-operon zijn lacZ, lacY en lacA. Ze coderen voor eiwitten die nodig zijn om lactose te verteren. De genen komen alleen tot expressie in aanwezigheid van lactose.


Samenvatting: trp vs. lac-operon

De overeenkomsten tussen deze twee operons zijn fundamenteler dan de verschillen:

  • Beide produceren polycistronische mRNA's, die coderen voor meerdere eiwitten. Elk polycistronisch mRNA codeert voor een reeks eiwitten die samenwerken in een biochemische route.
  • Beide maken gebruik van negatieve genregulatie door middel van een repressor-eiwit. Wanneer het repressoreiwit bindt aan het operator-DNA, wordt RNA-polymerase geblokkeerd om aan de promotor te binden, dus wordt transcriptie onderdrukt. Beide operons worden dus gereguleerd door de initiatie van transcriptie te regelen.

De verschillen tussen deze twee operons houden verband met de functies van de betrokken biochemische routes:

  • Het trp-operon codeert voor eiwitten die een anabole route vormen. De cel blijft tryptofaan produceren totdat er genoeg is. Op dit punt werkt het tryptofaan als een co-repressor, waarbij het repressor-eiwit allosterisch wordt geactiveerd. Het repressoreiwit is uit zichzelf inactief, totdat het allosterisch wordt geactiveerd.
  • Het lac-operon codeert voor eiwitten die een katabole route vormen. De cel produceert deze enzymen alleen als er wat lactose aanwezig is om te kataboliseren. Het repressoreiwit is op zichzelf actief, totdat het allosterisch wordt geactiveerd door lactose. Bovendien vindt een sterke opwaartse regulatie van dit operon alleen plaats wanneer de cel geen glucose als alternatief heeft.

Het kan een uitdaging zijn om de details van deze operons te onthouden, maar het is een stuk eenvoudiger als je begint met te vragen waarom ze verschillende mechanismen zouden gebruiken.

Waarom komen deze twee operons in elk bio-leerboek voor?

Er zijn twee redenen: ten eerste zijn deze twee operons een voorbeeld van de regulatie van enzymen in katabole en anabole routes, die samen verantwoordelijk zijn voor de hele biochemie. Er zijn veel andere operons in bacteriële genomen, en ze hebben de neiging om te lijken op het trp-operon (anabole routes) of het lac-operon (katabole routes). Ten tweede vertegenwoordigen deze twee operons klassieke ontdekkingen in de geschiedenis van de biologie. Wanneer de mechanismen van het lac-operon van E coli werden voor het eerst beschreven door Francois Jacob, Jacques Monod en Andre Lwoff, vanaf de jaren vijftig, was het de eerste keer dat iemand erachter kwam hoe genexpressie in een organisme werd gecontroleerd.

Vergelijking van bacteriële operons met eukaryote genen

Net als bacteriële operons worden uw eigen genen vaak gereguleerd door de initiatie van transcriptie te regelen. Eukaryote chromosomen zijn echter veel complexer dan die van E coli. Eukaryotisch DNA is uitgebreid gecomplexeerd met histonen en andere eiwitten, waardoor aanvullende mechanismen van genregulatie mogelijk zijn, waaronder epigenetische mechanismen. Daarnaast maken eukaryoten ook uitgebreid gebruik van genregulatiemechanismen die optreden na transcriptie, zoals RNA-editing. Ten slotte zijn de meeste eukaryote genen niet polycistronisch.

U zult later dit kwartaal de mechanismen van eukaryote genregulatie onderzoeken.


Prokaryote genregulatie

In bacteriën en archaea, worden structurele eiwitten met verwante functies gewoonlijk samen gecodeerd in het genoom in een blok genaamd an operon en worden samen getranscribeerd onder de controle van een enkele promotor, resulterend in de vorming van een polycistronisch transcript (Figuur 1). Op deze manier kan de regulatie van de transcriptie van alle structurele genen die coderen voor de enzymen die de vele stappen in een enkele biochemische route katalyseren tegelijkertijd worden gecontroleerd, omdat ze ofwel allemaal tegelijkertijd nodig zullen zijn, of er geen nodig zal zijn. Bijvoorbeeld in E coli, alle structurele genen die coderen voor enzymen die nodig zijn om lactose als energiebron te gebruiken, liggen naast elkaar in de lactose (of lac) operon onder de controle van een enkele promotor, de lac promotor. Franse wetenschappers François Jakob (1920-2013) en Jacques Monod aan het Pasteur Instituut waren de eersten die de organisatie van bacteriële genen in operons lieten zien, door middel van hun studies over de lac operon van E coli. Voor dit werk wonnen ze in 1965 de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde. Hoewel eukaryote genen niet in operons zijn georganiseerd, zijn prokaryotische operons uitstekende modellen om over genregulatie in het algemeen te leren. Er zijn enkele genclusters in eukaryoten die vergelijkbaar zijn met operons. Veel van de principes kunnen worden toegepast op eukaryote systemen en dragen bij aan ons begrip van veranderingen in genexpressie in eukaryoten die pathologische veranderingen zoals kanker tot gevolg kunnen hebben.

Figuur 1. In prokaryoten zijn structurele genen met een verwante functie vaak samen op het genoom georganiseerd en samen getranscribeerd onder de controle van een enkele promotor. Het regulerende gebied van de operon omvat zowel de promotor als de operator. Als een repressor aan de operator bindt, worden de structurele genen niet getranscribeerd. Als alternatief kunnen activatoren binden aan het regulerende gebied, waardoor transcriptie wordt versterkt.

Elk operon bevat DNA-sequenties die de eigen transcriptie beïnvloeden. Deze bevinden zich in een gebied dat het regulerende gebied wordt genoemd. De regulerende regio omvat de promotor en de regio rond de promotor, waarnaar: transcriptiefactoren, eiwitten die worden gecodeerd door regulerende genen, kunnen binden. Transcriptiefactoren beïnvloeden de binding van RNA-polymerase naar de promotor en laat de progressie ervan structurele genen transcriberen. EEN repressor is een transcriptiefactor die de transcriptie van een gen onderdrukt als reactie op een externe stimulus door te binden aan een DNA-sequentie in het regulerende gebied genaamd de operator, die zich bevindt tussen de RNA-polymerase-bindingsplaats van de promotor en de transcriptionele startplaats van het eerste structurele gen. Repressorbinding blokkeert fysiek RNA-polymerase van het transcriberen van structurele genen. Omgekeerd, een activator is een transcriptiefactor die de transcriptie van een gen verhoogt als reactie op een externe stimulus door de binding van RNA-polymerase aan de promotor te vergemakkelijken. Een inductor, een derde type regulerend molecuul, is een klein molecuul dat transcriptie activeert of onderdrukt door interactie met een repressor of een activator.

In prokaryoten zijn er voorbeelden van operons waarvan de genproducten vrij consistent vereist zijn en waarvan de expressie daarom niet gereguleerd is. Dergelijke operaties zijn constitutief uitgedrukt, wat betekent dat ze continu worden getranscribeerd en vertaald om de cel te voorzien van constante tussenliggende niveaus van de eiwitproducten. Dergelijke genen coderen voor enzymen die betrokken zijn bij huishoudelijke functies die nodig zijn voor cellulair onderhoud, waaronder DNA-replicatie, reparatie en expressie, evenals enzymen die betrokken zijn bij het kernmetabolisme. Daarentegen zijn er andere prokaryotische operons die alleen worden uitgedrukt wanneer dat nodig is en worden gereguleerd door repressoren, activatoren en inductoren.

Denk er over na

  • Wat zijn de onderdelen in de DNA-sequentie van een operon?
  • Welke soorten regulerende moleculen zijn er?

Mechanismen die mogelijk UTT . mogelijk maken

Gezien het bewijsmateriaal dat wordt gepresenteerd in de sectie Het CTT-dogma is uitgedaagd: op weg naar ontkoppelde transcriptie-vertaling, is het aannemelijk dat CTT mogelijk niet zo universeel is als jarenlang werd aangenomen. Met andere woorden, transcriptie kan translatie-onafhankelijk plaatsvinden, en mRNA's zouden kunnen worden getranscribeerd en vertaald in ruimtelijk-temporele scheiding. Maar om UTT te laten plaatsvinden, zouden bacteriën drie grote uitdagingen moeten aangaan: (1) Voorkom associatie tussen het leidende ribosoom en het ontluikende mRNA, zodra de SD-sequentie uit RNAP tevoorschijn komt. (2) Bescherm het ribosoomvrije transcript tegen ribonucleolytisch verval in het cytoplasma. (3) Voer translatie-ontkoppelde transcriptie uit zonder verstoring door intrinsieke en Rho-afhankelijke terminators.

Dynamiek van transcriptie-verlenging over 5'-proximale coderende sequenties is van speciaal belang voor UTT. In E coli, RNAP vertoont uitgesproken transcriptionele pauzes op plaatsen die overlappen met SD-sequenties en startcodons (Larson et al., 2014), waardoor een tijdelijk venster wordt geopend voor regulatie over de naakte 5'-UTR's door RNA-bindende eiwitten (RBP's) of RNA-vouwgebeurtenissen voorafgaand aan ribosoomassociatie met het transcript. Bovendien wordt verwacht dat transcriptie van 5'-proximale coderende sequenties hoe dan ook translatie-onafhankelijk zal plaatsvinden (zie sectie The Molecular Architecture of CTT), dus waarom kan dit type regulatie niet blijven worden uitgeoefend over het stroomafwaartse ribosoom-naakte transcript voordat de translatie begint?

Hieronder beschrijven we verschillende moleculaire factoren en mechanismen die, wanneer ze samenwerken, UTT mogelijk bevorderen op een manier dat de drie bovengenoemde uitdagingen naar tevredenheid zouden worden opgelost (Figuur 5). Bewijs dat het vermogen van deze factoren en mechanismen ondersteunt om cotranscriptioneel te werken op ontluikende mRNA's wordt gepresenteerd. Verder worden de vorming van biomoleculaire condensaten door LLPS en hun vermeende implicatie bij het bevorderen van UTT kort besproken.

Figuur 5. Mechanismen die mogelijk UTT mogelijk maken. Cotranscriptionele gebeurtenissen, zoals associatie met een RBP of met een sRNA, evenals riboswitch-vorming, voorkomen transcriptieterminatie door Rho en associatie met het leidende ribosoom. Wanneer ribosoomvrije transcripten worden afgegeven aan het cytoplasma, werken deze transcriptbeschermende gebeurtenissen de activiteit van ribonucleasen tegen. Merk op dat, hoewel lineair getekend, transcripten zogenaamd complexe secundaire en tertiaire structuren verwerven die verdere bescherming verlenen. Deze bescherming voorkomt ook mRNA-translatie totdat ze hun eindbestemming bereiken.

RNA-bindende eiwitten

RBP's hebben grote belangstelling gekregen als gevolg van hun vermogen om het lot van transcripten te reguleren door de mRNA-translatie en -stabiliteit te beïnvloeden (Holmqvist en Vogel, 2018 Richards en Belasco, 2019), en opkomend bewijs suggereert dat ze UTT kunnen bevorderen. Bijvoorbeeld, Synechocystis RBP's Rbp2 en Rbp3 zijn vereist voor de translatie-onafhankelijke thylakoïde membraanlokalisatie van transcripten die coderen voor fotosysteemeiwitten (Mahbub et al., 2020), wat impliceert dat ze cotranscriptioneel werken op mRNA-targeting voordat de translatie begint. Evenzo werden Grad-seq-experimenten uitgevoerd in Salmonella en E coli toonde aan dat verschillende RBP's hier samen met RNAP zijn beoordeeld (Smirnov et al., 2016 Hör et al., 2020), wat zou kunnen wijzen op een co-transcriptionele associatie van RBP's met ontluikende RNA's. Gezien hun transcriptie-lotbepalende activiteiten, komen deze RBP's naar voren als potentiële kandidaten voor het promoten van UTT.

Koude Shock Proteïnen

Cold Shock Proteins (CSP's) behoren tot een evolutionair wijdverbreide familie van kleine, zure eiwitten die oorspronkelijk werden ontdekt als mediatoren van koudeshockrespons, maar momenteel wordt aangenomen dat hun functie de aanpassing aan kou overtreft (besproken in Ermolenko en Makhatadze, 2002 Horn et al. al., 2007 Budkina et al., 2020). Met name de aanwezigheid van ten minste één csp gen in de cel is essentieel voor levensvatbaarheid in B. subtilis (Graumann et al., 1997). De E coli genoom codeert voor negen verschillende CSP-genen, waarvan er slechts vier, CspA, CspB, CspG en CspI, worden geïnduceerd door koude shock (Etchegaray en Inouye, 1999 Wang et al., 1999), en twee, CspC en CspE, worden constitutief tot expressie gebracht bij 37ଌ (Yamanaka et al., 1994 Bae et al., 1999). Merk op dat het koude-schokdomein (CSD) in CSP's het vermogen verleent om enkelstrengs nucleïnezuren te binden (Jiang et al., 1997 Lopez et al., 1999 Phadtare en Inouye, 1999) en secundaire structuren erin te smelten (Phadtare et al., 2002a Phadtare en Severinov, 2005 Rennella et al., 2017). Daarom kunnen CSP's, naast het bemiddelen van UTT zoals hieronder beschreven, CTT helpen door te zorgen voor de overdracht van ongevouwen mRNA van het nucleoïde naar ribosomen (El-Sharoud en Graumann, 2007).

Bio-informatische verkenningen ontrafelden een vooroordeel op sequentieniveau in de richting van U-rijkdom in transcripten die coderen voor integrale membraaneiwitten in E coli (Prilusky en Bibi, 2009) en Lactococcus lactis (van Gijtenbeek et al., 2016). Informatie gepubliceerd door ons laboratorium bevestigde dat de U-rijkdom in membraandoorsnijdende domeinen belangrijk is voor hun membraanlokalisatie, zoals bio-informatisch voorspeld (Kannaiah et al., 2019). interessant, E coli CspC en CspE binden bij voorkeur U-rijke kunstmatige transcripten en endogene membraan-mRNA's (Benhalevy et al., 2015). Bovendien veroorzaakt overexpressie van CspE de accumulatie van ribosoomvrije transcripten die coderen voor membraaneiwitten in het cytoplasma en heeft dit een positieve invloed op hun translatie in het membraan (Benhalevy et al., 2017). Dit suggereert dat, via CspE-bemiddeling, deze transcripten vermijden CTT totdat ze het membraan bereiken, waar ze lokaal worden vertaald.

Huidig ​​​​bewijs suggereert dat CSP's UTT bevorderen door ontluikende transcripten te beschermen tegen RNasen. Overexpressie van CspC en CspE verhoogt bijvoorbeeld de stabiliteit van transcripten die coderen voor stressrespons-eiwitten RpoS en UspA (Phadtare en Inouye, 2001). Terwijl CspE-niveaus constant blijven tijdens verschillende groeifasen, nemen CspC-niveaus toe bij binnenkomst in de stationaire fase, wat resulteert in de stabilisatie van rpoS transcripties (Shenhar et al., 2012). Deze transcriptstabiliserende vermogens kunnen worden verklaard door de neiging van CspE om poly (A) -sequenties te binden, waardoor de ribonucleolytische activiteit van PNPase en RNase E wordt tegengegaan (Feng et al., 2001). Aangezien de meeste transcripten polyadenylatie ondergaan (Mohanty en Kushner, 2006), zou CspE kunnen fungeren als een globaal moleculair schild tegen de gecoördineerde poly(A)-afhankelijke exoribonucleolytische werking van PNPase in het 3'-uiteinde en de endonucleolytische aanval van RNase E in interne splitsingsplaatsen van ontluikende transcripten. Van belang, cspE mRNA wordt gedownreguleerd in afwezigheid van PNPase (Polissi et al., 2003), wat suggereert dat een regulerend mechanisme de ribonucleolytische activiteit van PNPase en de anti-RNase-bescherming door CspE in evenwicht houdt.

Om ervoor te zorgen dat deze activiteiten UTT promoten, moeten CSP's toegang krijgen tot ontluikende transcripten zodra ze uit RNAP komen. CspE bindt inderdaad ontluikende RNA's en werkt als een antiterminator door secundaire structuren van intrinsieke terminators te smelten (Hanna en Liu, 1998 Bae et al., 2000 Phadtare et al., 2002a, b Phadtare en Severinov, 2005). Gezamenlijk geven deze bewijsstukken aan dat CSP's de ontkoppeling van transcriptie en translatie kunnen bevorderen door RNase-activiteit ten opzichte van transcripten tegen te gaan en translatie-onafhankelijke transcriptie via intrinsieke terminators te bevorderen.

Cold shock-eiwitten vertonen UTT-bevorderende activiteiten bij andere soorten. In Salmonella, CspC en CspE binden ongeveer 20% van het transcriptoom met belangrijke regulerende implicaties voor de pathogeniteit ervan (Michaux et al., 2017). Bijvoorbeeld de ecnB mRNA, dat door deze CSP's wordt gebonden, vertoont lagere transcriptniveaus en stabiliteit in a 㥌spCE achtergrond. Niveaus en stabiliteit van dit transcript werden hersteld in 㥌spCE cellen die een temperatuurgevoelige RNase E-mutant tot expressie brengen bij de beperkende temperatuur. Dus CSP's beschermen ecnB transcripten van RNase E-gemedieerd verval (Michaux et al., 2017). Evenzo bindt en stabiliseert CspE yciF transcripties, het verlenen van Salmonella verhoogde weerstand tegen galzouten door het celmembraan ondoordringbaar te maken (Ray et al., 2019b). Ook in B. subtilis, CspB toont extranucleoïdale lokalisatie op een transcriptie-afhankelijke manier (Mascarenhas et al., 2001 Weber et al., 2001), wat suggereert dat CspB transcripten bindt bij binnenkomst in het cytoplasma.

Al met al zijn CSP's naar voren gekomen als RBP's met een belangrijke rol in genregulatie en, mogelijk, bevordering van UTT. Hun functie lijkt op die van FRGY2, een CSD-bevattend eiwit dat mRNA's bindt in de kern van kikkereicellen en transcripten beschermt tegen afbraak en translatie in het cytoplasma totdat ze op een gereguleerde manier vrijkomen tijdens de ontwikkeling van eicellen (Bouvet en Wolffe, 1994). Hun veelzijdige functies als transcriptie-antiterminators en antiribonucleolytische schilden maken CSP's veelbelovende onderwerpen voor toekomstig onderzoek met betrekking tot hun vermeende rol als UTT-facilitators.

Ribosomale eiwitten

Naast meerdere interacties met rRNA's in het ribosoom, voeren ribosomale eiwitten (RP's) extraribosomale maanlichtfuncties uit als vrije RBP's, vaak betrokken bij genregulatie (besproken in Bhavsar et al., 2010 Aseev en Boni, 2011). Verschillende RP's binden hun verwante mRNA's om hun translatie negatief te reguleren en om RP-homeostase te behouden. In andere gevallen spelen RP's functies af die UTT kunnen inschakelen.

Een voorbeeld is de S1 RP in E coli, die enkelstrengs AU-rijke sequenties bindt die stroomopwaarts van SD-sequenties in de 5'-UTR's zijn gelokaliseerd (Boni et al., 1991 Mogridge en Greenblatt, 1998 Komarova et al., 2002), een activiteit waarvan is aangetoond dat deze de stabiliteit van de lacZ mRNA (Komarova et al., 2005), hoogstwaarschijnlijk vanwege de overlap tussen S1-bindingsplaatsen en RNase E-splitsingsplaatsen (Kaberdin en Bläsi, 2006). In overeenstemming met deze hypothese bindt S1 cspE en rpsO transcripten en beschermt ze tegen RNase E-aanvallen (Delvillani et al., 2011). Van S1 werd verder aangetoond dat het PNPase-gemedieerd mRNA-verval tegengaat (Briani et al., 2008). Bij overexpressie bindt S1 verschillende mRNA's, waaronder de pnp mRNA zelf, en verhoogt hun stabiliteit tegen PNPase-gemedieerd verval. In overeenstemming met deze resultaten leidt uitputting van S1 tot de destabilisatie van deze transcripten in vivo (Briani et al., 2008). Net als CspE bindt S1 poly(A)-sequenties (Kalapos et al., 1997), maar deze binding beschermt transcripten niet tegen PNPase-afbraak in vitro (Feng et al., 2001). Of S1 PNPase tegengaat in vivo door CspE-afhankelijke transcriptbescherming te bevorderen (zie hierboven) of door een alternatief mechanisme blijft onbekend. Bovendien bleek S1 de eiwitsecretie te verhogen die wordt gemedieerd door het hemolysine-signaalpeptide, en dit ging gepaard met de stabilisatie van de overeenkomstige transcripten (Khosa et al., 2018). Als S1 UTT kan bevorderen, moeten deze RNA-beschermende activiteiten worden geïmplementeerd zodra het ontluikende transcript uit RNAP tevoorschijn komt. In dit opzicht associeert S1 zich met RNAP en bevordert het de transcriptionele processiviteit ervan (Sukhodolets en Garges, 2003 Sukhodolets et al., 2006). Bovendien bindt S1 RNAP indirect en vormt een ribonucleoproteïne (RNP) met IsrA-sRNA (van Nues et al., 2015). Het is dus aannemelijk dat S1 ontluikende transcripten cotranscriptioneel bindt en ze beschermt tegen ribonucleolytische aanvallen, waardoor het optreden van UTT wordt bevorderd.

Een ander voorbeeld is de S4 RP, die zijn translatie negatief autoreguleert door zijn verwante cistron te binden in het α-operon en een pseudoknot te creëren die leidt tot de insluiting van een inactief translatie-initiatiecomplex (Spedding en Draper, 1993 Schlax et al., 2001). Deze autoregulatie onderdrukt ook de vertaling van verschillende andere RP's die binnen hetzelfde operon zijn gecotranscribeerd. Echter, de regulering van de rpoA gen, dat codeert voor de α-subeenheid van RNAP en ook wordt gecotranscribeerd binnen het α-operon, wordt niet aan deze negatieve regulatie onderworpen (Thomas et al., 1987). Hoewel het mechanisme van deze uitsluiting onbekend blijft, impliceert dit dat het α-operon kan worden onderworpen aan gedeeltelijke verstoring van CTT, dwz dat terwijl de α-subeenheid van RNAP cotranscriptioneel wordt getranslateerd, de genen die coderen voor ribosomale eiwitten worden gecotranscribeerd maar translationeel onderdrukt door S4. Om een ​​dergelijke CTT-verstoring uit te oefenen, zou S4 cotranscriptioneel moeten handelen. S4 kan inderdaad RNAP binden en Rho-afhankelijke terminators tegengaan (Torres et al., 2001), waardoor ribosoomvrije ontluikende transcripten worden beschermd tegen PTT. Daarom speelt S4 een dubbele rol bij het bevorderen van UTT: verstoring van de transcriptie-translatiekoppeling in het α-operon en het voorkomen van Rho-gemedieerde beëindiging van TEC's die niet fysiek zijn gekoppeld aan een vertalend ribosoom.

De L4 RP toont ook meerdere activiteiten die UTT zouden kunnen promoten. L4 bindt de regulerende CTD van RNase E en remt de activiteit ervan, wat leidt tot stabilisatie van een subset van stressgerelateerde transcripten die cruciaal zijn voor celoverleving (Singh et al., 2009). Verlichting van de ribonucleolytische druk op deze mRNA's zou een minder strak CTT-regime voor deze transcripten mogelijk maken. Onder de L4-gestabiliseerde transcripten is die van de triptophanase (tna) operon, dat wordt onderworpen aan een extra regulatielaag door L4 die degradosoomonafhankelijk is. In het bijzonder verhoogt L4-overexpressie de stabiliteit van de tnaCAB transcript maar veroorzaakt translationele repressie van het TnaA-eiwit door te binden aan de spacer tussen tnaC-tnaA (Singh et al., 2020). Dit zou kunnen leiden tot de gedeeltelijke verstoring van CTT in deze operon, d.w.z. tnaC kan worden uitgedrukt door CTT, terwijl: tnaA translatie wordt onderdrukt ondanks de toename van de mRNA-niveaus. Interessant is dat deze translationele repressie van tnaA vindt plaats in de vroege stationaire fase om de afbraak van tryptofaan te voorkomen, wat nodig is voor overleving op lange termijn door een diepe stationaire fase (Singh et al., 2020), wat erop wijst dat CTT-verstoringen belangrijke fysiologische implicaties kunnen hebben. Belangrijk is dat L4 zijn verwante transcript bindt om zijn transcriptie te verzwakken (Lindahl et al., 1983). L4 zou dus cotranscriptioneel kunnen werken als een antitranslatiemiddel, ook ten opzichte van andere ontluikende transcripten. Nader onderzoek naar extraribosomale functies van RP's zou moeten leiden tot een beter begrip van deze activiteiten die mogelijk betrokken zijn bij UTT.

Naast zijn sterk bestudeerde rol als sRNA-mRNA-matchmaker (zie hieronder), oefent Hfq post-transcriptionele regulatie uit in E coli door direct te binden aan transcripten en hun lot te beïnvloeden (besproken in Kavita et al., 2018). Hfq bleek de 5'-UTR's van zijn verwante transcript te binden (Veპrek et al., 2005) en van cirA (Salvail et al., 2013) en mutS mRNA's (Chen en Gottesman, 2017), evenals de ribosoombindingsplaats (RBS) van het Tn10-transposase-mRNA (Ellis et al., 2015). In al deze gevallen leidt Hfq-binding tot translationele repressie van de doeltranscripten. Deze activiteiten kunnen worden verklaard door de observatie dat bij enterohemorrhagische E coli, Hfq vertoont een voorkeur voor bindende ARN-tripletten die zich in de nabijheid van RBS's bevinden (Tree et al., 2014), wat de initiatie van translatie zou kunnen uitsluiten. Evenzo speelt translationele onderdrukking door Hfq een centrale rol bij de katabole onderdrukking van de opportunistische ziekteverwekker Pseudomonas aeruginosa. Met de hulp van het katabole repressiecontrole-eiwit Crc, bindt Hfq specifieke A-rijke sequenties in de nabijheid van translatie-initiatieregio's om de translatie van door kataboliet onderdrukte genen te onderdrukken (Sonnleitner en Bläsi, 2014 Pei et al., 2019).

Hfq bleek ook bij voorkeur intrinsieke terminatorsequenties te binden in Salmonella (Holmqvist et al., 2016). Dienovereenkomstig bindt Hfq aan PAP I en bevordert het de synthese van poly(A)-staarten bij intrinsieke terminators in E coli (Hajnsdorf en Røx000E9gnier, 2000 Le Derout et al., 2003 Mohanty et al., 2004). Analoog aan CspE (zie hierboven), bindt Hfq aan poly(A)-sequenties die overlappen met RNase E-splitsingsplaatsen en biedt het bescherming tegen exoribonucleolytisch verval door PNPase en RNase II (Folichon et al., 2003 Moll et al., 2003 Zhang et al. , 2003). Gezamenlijk geeft dit bewijs aan dat Hfq intrinsieke terminatieplaatsen bindt om polyadenylatie te bevorderen en, door te binden aan deze poly(A)-sequenties, 3'-UTR's en stroomopwaartse sequenties beschermt tegen ribonucleolytisch verval.

Belangrijk is dat Hfq interageert met RNAP om transcriptie te bevorderen (Sukhodolets en Garges, 2003). Bovendien deelt Hfq topologische overeenkomsten met YaeO, het enige tot nu toe ontdekte eiwit dat Rho bindt en remt in E coli (Pichoff et al., 1998 Gutiérrez et al., 2007) en Vibrio cholerae (Pal et al., 2019). Dienovereenkomstig onderdrukt Hfq Rho-afhankelijke terminatie door gelijktijdig Rho- en AU-rijke sequenties stroomopwaarts te binden sleur sites (Rabhi et al., 2011). Onlangs is aangetoond dat Hfq op doordringende wijze ontluikende transcripten bindt in E coli (Persson et al., 2013 Sedlyarova et al., 2016) en P. aeruginosa (Kambara et al., 2018 Gebhardt et al., 2020). De helix-achtige lokalisatie van Hfq waargenomen in E coli onder bepaalde groeiomstandigheden (Taghbalout et al., 2014 Malabirade et al., 2017 Kannaiah et al., 2019) lijkt op de spiraalvormige-ellipsoïde conformatie van de nucleoïde (Fisher et al., 2013), wat het idee versterkt dat Hfq indirect zou kunnen associëren met het chromosoom door ontluikende transcripten te binden. Net als S1 vormt Hfq een RNP met IsrA-sRNA dat associeert met RNAP (van Nues et al., 2015). Daarom komt Hfq naar voren als een potentiële UTT-bevorderende factor door antiterminerende ribosoomvrije transcriptie die anders door Rho zou kunnen worden beëindigd. Het feit dat Hfq kan interageren met ontluikende transcripten houdt in dat de antitranslatie- en antiribonuclease-rollen van Hfq die hier worden beschreven co-transcriptioneel in het spel kunnen komen om CTT te verstoren en ontluikende mRNA's te beschermen tegen RNasen.

CsrA/RsmA

Hoewel CsrA aanvankelijk werd ontdekt als een regulator van de biosynthese van glycogeen bij binnenkomst in de stationaire fase (Romeo et al., 1993), is CsrA naar voren gekomen als een wereldwijde post-transcriptionele regulator die betrokken is bij meerdere cellulaire functies (besproken in Vakulskas et al., 2015 Romeo en Babitzke , 2018). Van CsrA is aangetoond dat het honderden transcripten bindt in E coli (Edwards et al., 2011 Potts et al., 2017), Campylobacter (Dugar et al., 2016), Salmonella (Holmqvist et al., 2016), en Legionella (Sahr et al., 2017) die hun post-transcriptionele lot beïnvloeden en mogelijk UTT bevorderen.

De belangrijkste regelgevende activiteit van CsrA is: via translationele repressie (Dugar et al., 2016 Potts et al., 2017). CsrA bindt bijvoorbeeld de SD-sequentie van de hfq mRNA en remt de translatie ervan (Baker et al., 2007). Evenzo bindt CsrA op twee plaatsen in de 5'-UTR, inclusief de SD-sequentie, van transcripten die coderen voor de transcriptionele regulator NhaR, die reageert op hoge natriumconcentraties en alkalische pH (Pannuri et al., 2012). Evenzo remt CsrA de vertaling van de ijzeropslag dsp mRNA door het 5'-UTR-gebied van het transcript te binden (Potts et al., Pourciau et al., 2019). In enteropathogeen E coli (EPEC), onderdrukt CsrA de vertaling van de virulentie-effector NleA (Katsowich et al., 2017). Bij contact met de gastheer injecteert EPEC effectoren in de gastheercel via een type III-secretiesysteem met de hulp van de effectorgebonden chaperonne CesT. Na het vrijgeven van de effector bindt en remt vrij CesT CsrA, wat leidt tot derepressie van NleA en de daaropvolgende translatie en translocatie naar de gastheercel (Katsowich et al., 2017). De CsrA-homoloog RsmA bindt de 5'-UTR van psl mRNA dat verantwoordelijk is voor de biosynthese van een structureel polysacharide in P. aeruginosa biofilms en remt de translatie ervan door de transcriptstructuur opnieuw te vouwen zodat de SD-sequentie niet toegankelijk is voor ribosomen (Irie et al., 2010). In alle hier besproken voorbeelden ging translatieremming niet gepaard met verminderde transcriptstabiliteit. Bijgevolg kan dit leiden tot de accumulatie van ribosoomvrije transcripten in het cytoplasma, wat lijkt op het fenomeen dat wordt waargenomen bij overexpressie van CspE en S1 (zie hierboven). Interessant is dat de CsrA / RsmA-gereguleerde transcripten die hier zijn besproken, coderen voor eiwitten die reageren op omgevingsstimuli. Het is dus verleidelijk om te speculeren dat CsrA / RsmA UTT bevordert en de accumulatie van niet-vertaalde pools van mRNA's waarvan de expressie snel kan worden onderdrukt bij omgevingsproblemen zonder transcriptionele vertraging.

Bovendien kan CsrA ook fungeren als een anti-RNase-schild (Esquerré et al., 2016 Potts et al., 2017). Zo bleek CsrA essentieel te zijn voor E coli beweeglijkheid door het reguleren van de fhl operon, het hoofdoperon voor de biosynthese van flagellum, door de stabiliteit van fhlDC transcripten (Wei et al., 2001), en dit wordt bereikt door deze mRNA's te beschermen tegen RNase E-splitsing (Yakhnin et al., 2013). Evenzo stabiliseert CsrA de Legionella ijzeropname regulator vacht mRNA door een specifieke plaats te binden in de nabijheid van een potentiële RNase E-plaats (Sahr et al., 2017). Van CsrA en RsmA werd ook aangetoond dat ze de stabiliteit van het STM3611-transcript verhogen Salmonella (Jonas et al., 2010) en van de hrpG transcript, de hoofdregulator van T3SS-genen in Xanthomonas, respectievelijk (Andrade et al., 2014).

CsrA vertoont ook transcriptiegerelateerde activiteiten, bijv. binding aan de gat operon transcript in Legionella cotranscriptioneel om Rho-afhankelijke transcriptieterminatie tegen te gaan (Sahr et al., 2017) en voor RNAP als een RNP met IsrA-sRNA in E coli (van Nues et al., 2015). Verder is in P. aeruginosa, RsmA bleek cotranscriptioneel meer dan 500 ontluikende transcripten te binden (Gebhardt et al., 2020). Gezamenlijk geven deze publicaties aan dat CsrA/RsmA belangrijke genregulatoren zijn die werken op ontluikende transcripten. Het is dus aannemelijk dat de antitranslatie-, anti-RNase- en antiterminatie-activiteiten van CsrA/RsmA het optreden van UTT bevorderen. Nader onderzoek van de co-transcriptionele activiteiten van CsrA/RsmA zou licht moeten werpen op de gedetailleerde betrokkenheid van CsrA/RsmA bij het promoten van UTT.

ProQ, een FinO-domein eiwit dat fungeert als een sRNA-mRNA matchmaker (Smirnov et al., 2017 Westermann et al., 2019 Melamed et al., 2020), is onlangs naar voren gekomen als een belangrijk RBP, dat een aanzienlijk deel van de E coli en Salmonella transcriptomen (Smirnov et al., 2016 Holmqvist et al., 2018), wat suggereert dat het mogelijk betrokken is bij de implementatie van UTT.

ProQ herkent structurele kenmerken die aanwezig zijn in sRNA's en 3'-UTR's van mRNA's en verhoogt hun stabiliteit bij binding (Smirnov et al., 2016 Holmqvist et al., 2018 Bauriedl et al., 2020 Stein et al., 2020). In het bijzonder bleek ProQ te stabiliseren cspE mRNA door zijn 3'-UTR te binden en RNase II-gemedieerde exobonucleolytische aanval te voorkomen (Holmqvist et al., 2018). Stabiliteit van cspC, cspD, en ompD werd ook verlaagd in ΔproQ achtergrond (Holmqvist et al., 2018), maar of ProQ deze transcripten stabiliseert door antiribonucleasebescherming, wacht op experimentele bevestiging. Bovendien vindt ongeveer een derde van de ProQ-bindingsgebeurtenissen plaats op plaatsen die overlappen met RNase E-splitsingsplaatsen (Chao et al., 2017 Holmqvist et al., 2018). Gezamenlijk lijken deze anti-RNase-activiteiten op die weergegeven door FinO, dat een vergelijkbaar structureel kenmerk van zijn enige doel FinP-antisense-RNA herkent en bindt en anti-RNase E-bescherming uitoefent (Jerome et al., 1999 Arthur et al., 2011). Belangrijk is dat ProQ associeert met RNAP via een RNP gevormd met IsrA-sRNA (van Nues et al., 2015). Het is dus aannemelijk dat ProQ ontluikende transcripten cotranscriptioneel benadert en bindt, en UTT bevordert door onvertaalde transcripten te beschermen tegen ribonucleolytisch verval.

Nus-factoren

Nus-factoren reguleren de verlenging van de transcriptie door het pauzeren van RNAP te beïnvloeden en transcriptiebeëindiging / antiterminatie te bevorderen (Santangelo en Artsimovitch, 2011 Sen et al., 2014). NusA is een essentieel onderdeel van het antitermination-complex dat, samen met NusB, NusE, NusG en verschillende ribosomale eiwitten, de rRNA-transcriptiesnelheden verhoogt (Squires en Zaporojets, 2000 Paul et al., 2004). Bovendien bevordert NusA het pauzeren van RNAP, wat de vorming, stabiliteit en efficiëntie van intrinsieke terminators bevordert (Farnham et al., 1982 Schmidt en Chamberlin, 1987 Toulokhonov et al., 2001). Zoals besproken in de sectie Coördinatie van CTT, bemiddelt NusA ook transcriptieterminatie door Rho (Epshtein et al., 2010 Hao et al., 2020 Said et al., 2020). Toch zou NusA in bepaalde gevallen Rho-afhankelijke beëindiging kunnen tegengaan. In het bijzonder NusA-mutanten met verhoogde affiniteit voor het binden van NusA-gebruik (noot) sites verminderden Rho-afhankelijke beëindiging in specifieke gevallen waarin: noot en sleur sites overlappen elkaar (Qayyum et al., 2016). Met betrekking tot UTT zou NusA dus translatie-onafhankelijke transcriptie van mRNA's kunnen vergemakkelijken door te interfereren met bepaalde Rho-afhankelijke terminatiegebeurtenissen op ontluikende ribosoomvrije transcripten.

Andere Nus-factoren zijn betrokken bij processieve antiterminatiemechanismen (PA). In tegenstelling tot speciale antiterminators, associëren PA-factoren zich met en wijzigen TEC's om transcriptionele readthrough te bevorderen over meerdere transcriptieterminators die distaal zijn gelokaliseerd in de operons onder hun regulatie (Goodson en Winkler, 2018). De NusG-paraloog LoaP reguleert bijvoorbeeld transcriptie via terminatieplaatsen die zich in twee biosynthese-operons van antibiotica bevinden in Firmicutes, Actinobacteriën, en Spirochaeten (Goodson et al., 2017). Verwijdering van loaP leidde tot een verlaging van de transcriptniveaus van LoaP-regulonen. Van LoaP wordt gedacht dat het intrinsieke terminators processief antitermineert, een activiteit waarvoor de 5'-leidersequentie van de transcripten onder zijn regulatie vereist is (Goodson et al., 2017). Al met al zou de PA-activiteit van dergelijke Nus-paralogen op hun specifieke doeloperons UTT kunnen bevoordelen door de behoefte aan een translationeel gekoppeld ribosoom voor het tegengaan van intrinsieke en Rho-afhankelijke terminators te verminderen.

Cis-Actieve RNA-elementen

Riboswitches zijn regulerende elementen die zich in de 5'-UTR van mRNA's bevinden die uit twee modules bestaan: een structureel complexe aptamer die een ligand bindt en een expressieplatform dat wordt gereguleerd door de structurele vouwing van de aptamer. Ligandbinding veroorzaakt structurele hervouwing van het aptameer, wat de expressie van het stroomafwaartse expressieplatform op een AAN / UIT-manier beïnvloedt (Sherwood en Henkin, 2016). Sommige riboswitches werken door de ORF translationeel te onderdrukken onder hun regulering (Breaker, 2018). In cobalamine-riboswitches is de SD-sequentie bijvoorbeeld gesekwestreerd in de aptamer-structuur (Johnson et al., 2012), die alleen toegankelijk wordt voor ribosomen na ligandbinding. In thiamine-pyrofosfaatriboswitches daarentegen, hecht een anti-SD-sequentie in de aptamer-structuur zich aan en vouwt zich over de SD-sequentie die zich in het expressieplatform bevindt en remt de translatie-initiatie (Winkler et al., 2002). Nogmaals, ligandbinding veroorzaakt de hervouwing van het aptameer en maakt de SD-sequentie vrij voor ribosoombinding. Net als riboswitches zijn RNA-thermometers 5'-UTR-elementen die structurele hervouwing ondergaan en stroomafwaartse genexpressie beïnvloeden, maar hun hervouwing wordt veroorzaakt door veranderingen in temperatuur in plaats van ligandbinding (Kortmann en Narberhaus, 2012). Bijvoorbeeld, de transcriptie van de koude-geïnduceerde cspA gen vindt plaats bij alle temperaturen, maar de cspA transcript is zeer onstabiel bij 37°C als gevolg van RNase E-gemedieerd verval (Fang et al., 1997). Bij koude shock, de cspA transcript ondergaat aanzienlijke hervouwing en wordt gestabiliseerd in een meer RNase-resistente vouwing die translatie van het eiwit mogelijk maakt (Giuliodori et al., 2010). Integendeel, de vertaling van rpoH transcript, dat codeert voor de hitteschok-sigmafactor, wordt onderdrukt bij fysiologische temperaturen door een secundaire structuur die de SD-sequentie sequestreert. Bij het opschakelen van de temperatuur wordt deze structuur opnieuw gevouwen op een manier die de SD-sequentie blootlegt voor translatie-initiatie (Morita et al., 1999). Evenzo worden verschillende virulentiefactoren gereguleerd door RNA-thermometers die translatie mogelijk maken bij 37 ° C bij binnenkomst in warmbloedige zoogdiergastheren (Johansson, 2009). Belangrijk is dat riboswitch-structuren cotranscriptioneel worden gevouwen (Mironov et al., 2002 Frieda en Block, 2012 Watters et al., 2016 Uhm et al., 2017 Ray et al., 2019a). Gezien het feit dat RNAP pauzeert bij SD-sequenties en codons start (Larson et al., 2014), is het waarschijnlijk dat riboswitch-regulatie in actie komt kort nadat ze uit RNAP komen en vóór de translatie-initiatie. Daarom is het redelijk om te beweren dat riboswitches en RNA-thermometers de translatie cotranscriptioneel kunnen blokkeren en transcripten kunnen beschermen tegen ribonucleolytische aanvallen, wat UTT zou bevorderen. Dergelijke inerte transcripten zouden worden geactiveerd bij veranderingen in de omgeving die hun translatie induceren.

evenzo, cis-werkende RNA-elementen fungeren als translationele repressoren van type I toxine-antitoxine (TA) -systemen (Masachis en Darfeuille, 2018). In veel type I TA-systemen is het primaire toxinetranscript translationeel inert, en dit wordt bereikt door de SD-sequentie te sekwestreren in een secundaire structuur gevormd met een anti-SD-sequentie die stroomopwaarts in het transcript is gelokaliseerd (Gultyaev et al., 1997 Darfeuille et al. , 2007 Shokeen et al., 2008 Kristiansen et al., 2016 Wen et al., 2017). In andere gevallen wordt de translatie van het toxine onderdrukt door structuren gevormd door interacties tussen de 5'- en 3'-uiteinden van het mRNA van volledige lengte (Thisted et al., 1995 Franch en Gerdes, 1996 Gultyaev et al., 1997 ). De hoge structurele complexiteit van toxine-mRNA's wordt ook verondersteld de interactie van het ontluikende toxinetranscript met het matrijs-DNA te voorkomen, wat de vorming van schadelijke R-lussen vermijdt, en om verhoogde antiribonucleaseresistentie te verlenen (Masachis en Darfeuille, 2018). Structurele kenmerken van toxine-mRNA's zorgen dus voor hun translationeel inerte transcriptie en bescherming tegen RNasen totdat stroomafwaartse activeringsgebeurtenissen post-transcriptionele translatie van deze transcripten activeren.

Sommige cis-werkende RNA-elementen zouden UTT op een meer indirecte manier kunnen vergemakkelijken. Remmende RNA-aptameren (iRAP's) interageren bijvoorbeeld met RNAP en vergemakkelijken Rho-afhankelijke beëindiging (Sedlyarova et al., 2017). Interessant is dat veel iRAP's in kaart zijn gebracht met de antisense-streng en antisense-transcriptie beteugelen, wat transcriptionele interferentie vermindert en de zinstranscriptie bevordert (Sedlyarova et al., 2017 Magán et al., 2019). Aangezien translatie-onafhankelijke TEC's minder snel transcriptie opnieuw starten na botsing met een antisense-TEC (Hoffmann et al., 2019), kan het verminderen van antisense-transcriptie door antisense iRAP's de eis van een leidend ribosoom dat de TEC-geleidende sense-transcriptie ondersteunt, verlichten.

Ander cis-werkende RNA-elementen hebben niet alleen het potentieel om CTT te verzwakken, maar ook om de verstoring ervan af te dwingen. Bijvoorbeeld de Salmonella virulentie mgtCBR operon herbergt een leiderregio die fungeert als een Rho-antagoniserend RNA-element (RARE) en a sleur site die nodig is voor Rho-gemedieerde transcriptieterminatie van dit operon (Sevostyanova en Groisman, 2015). De RARE gaat beëindiging tegen door Rho op te sluiten in een beëindiging-defecte conformatie. Belangrijk is dat de vertaling van de mgtCBR transcript sequestreert de RARE in een stam-loop (Sevostyanova en Groisman, 2015). De enige manier om dit operon tot expressie te brengen is dus door UTT, op een manier dat de RARE Rho-gemedieerde terminatie remt en translatie-ontkoppelde transcriptie van het volledige mRNA mogelijk maakt, dat post-transcriptioneel zou worden vertaald. De corA operon van Salmonella is onderworpen aan een zeer vergelijkbare regulering en zijn leiderregio is sterk geconserveerd in enterobacteriën (Kriner en Groisman, 2015), dus een dergelijke strikt UTT-afhankelijke genexpressie zou relatief wijdverspreid kunnen zijn in deze soorten. Ten slotte, naast elementen die werken tegen individuele terminatieplaatsen , ander cis-werkende RNA-sequenties zijn betrokken bij PA (zie hierboven Goodson en Winkler, 2018). Bijvoorbeeld in B. subtilis de eps operon, dat codeert voor biosynthese-eiwitten van exopolysacchariden, wordt gereguleerd door een eps-geassocieerde RNA (EAR) -sequentie, gelokaliseerd in het intergene gebied tussen de tweede en derde genen van het operon (Irnov en Winkler, 2010). De EAR-sequentie is nodig voor de transcriptie van het gehele operon, omdat het verschillende intrinsieke terminators tegengaat die zich op distale plaatsen binnen het operon bevinden. De EAR-sequentie is ook in staat om heterologe terminators te antitermineren, wat de hypothese ondersteunt dat het als een PA werkt (Irnov en Winkler, 2010). Zo een cis-werkende RNA-elementen met PA-activiteiten zouden UTT kunnen bevorderen in de operons die ze reguleren, omdat ze de vereiste van een cotranscriptioneel gekoppeld ribosoom zouden verlichten om terminators tegen te gaan.

Trans-Actieve RNA-elementen

sRNA's zijn het archetypische voorbeeld van trans-werkende RNA's in bacteriële genregulatie. Het zijn typisch 50-2013300 nt lange transcripten die het lot van het transcript bepalen door imperfecte basenparing met doelwit-mRNA's (Wagner en Romby, 2015). Dit proces wordt vaak gefaciliteerd door de mRNA-sRNA-matchmakers Hfq (Updegrove et al., 2016) en ProQ (Holmqvist et al., 2020). Meer recentelijk is matchmaking-activiteit gerapporteerd voor CsrA (Müller et al., 2019). sRNA's kunnen de stabiliteit en/of translatie van doel-mRNA's positief of negatief beïnvloeden, en deze activiteiten kunnen UTT mogelijk bevorderen.

In Salmonella, het op glucose reagerende sRNA SgrS stabiliseert de pdlB-yigL bicistronisch transcript door RNase E-gemedieerde splitsing te voorkomen (Papenfort et al., 2013). Evenzo is het sRNA RydC-basenparen met de 5'-UTR van de cfa mRNA en stabiliseert de langere isovorm van dit transcript door RNase E-aanval tegen te gaan (Fröhlich et al., 2013). In B. subtilis, het sRNA RoxS bindt het 5'-uiteinde van de yflS mRNA en voorkomt exoribonucleolytisch verval door RNase J1 (Durand et al., 2017). Naast anti-RNase-bescherming, B. subtilis sRNA SR1 blokkeert translatie bindt in de 5'-UTR van zijn doelwit ahrC mRNA en blokkeert de vertaling ervan (Heidrich et al., 2006, 2007). Evenzo, in Legionella pneumophila, het competentie-operon wordt translationeel onderdrukt door de sRNA RocR (Attaiech et al., 2016). sRNA's kunnen translationele repressie verder bevorderen door Hfq te rekruteren voor bindingsplaatsen die de associatie van ribosomen met SD-sequenties van hun mRNA-doelen voorkomen (Desnoyers en Mass'x000E9, 2012 Azam en Vanderpool, 2018).

Omdat sRNA's relatief kort zijn en niet worden vertaald door ribosomen, kunnen ze het nucleoïde gaas binnendringen (Sheng et al., 2017) en vermoedelijk deelnemen aan cotranscriptionele processen. Onlangs is inderdaad ontdekt dat de sRNA's DsrA, ArcZ en RprA, hoewel geïnduceerd door verschillende spanningen, de 5'-UTR van ontluikende rpoS transcripten om Rho-afhankelijke terminatie te onderdrukken en expressie van de stationaire fase-sigmafactor mogelijk te maken (Sedlyarova et al., 2016). De expressie van Rho zelf is onderworpen aan vergelijkbare regulatie, aangezien de sRNA SraL-basenparen met de 5'-UTR van de rho transcript om de transcriptie ervan tegen te gaan (Silva et al., 2019). sRNA's zouden dus UTT kunnen bevorderen door de doordringende Rho-gemedieerde transcriptie-antiterminatie van ribosoomvrije mRNA's tegen te gaan. De co-transcriptionele associatie van sRNA's met mRNA's suggereert ook dat ze hun antitranslatie en antiribonucleolytische regulatie kunnen uitoefenen op ontluikende transcripten, waardoor het optreden van UTT wordt vergemakkelijkt.

Interessant is dat de E coli sRNA IsrA associeert met RNAP en vormt RNP's samen met belangrijke transcript-lotbepalende eiwitten Hfq, S1, CsrA, ProQ en PNPase (van Nues et al., 2015). De associatie van deze RNP's met RNAP en hun overeenkomstige regelgevende output wachten op verdere karakterisering.Maar naast het direct optreden als UTT-inducerende factoren, zouden sRNA's UTT kunnen bevorderen door te dienen als landings- en integratieplatforms om co-transcriptiewerking van eiwitten met antitranslatie-, anti-RNase- en antiterminatiefuncties mogelijk te maken.

Bacteriële RNP-lichamen

Biomoleculaire condensaten gevormd door multivalente interacties tussen eiwitten en nucleïnezuren hebben onlangs speciale aandacht gekregen. Deze condensaten assembleren en lossen op volgens LLPS-principes en ze zijn betrokken bij belangrijke cellulaire functies, waaronder RNA-metabolisme (Banani et al., 2017). Van verwerkingslichamen (P-lichamen) en stresskorrels is bijvoorbeeld aangetoond dat ze slecht vertaalde transcripten sekwestreren voor verval of opslag in eukaryoten (Decker en Parker, 2012 Khong en Parker, 2020).

Biomoleculaire condensaten vertonen selectieve permeabiliteit en concentreren biomoleculen en processen in discrete subcellulaire regio's (Banani et al., 2017). Het zijn dus aantrekkelijke hulpmiddelen voor prokaryoten om ruimtelijke complexiteit te krijgen in hun cytoplasma's, die over het algemeen geen membraangebonden organellen bevatten. Het bestaan ​​van bacteriële RNP-lichamen (BR-lichamen) in bacteriën is inderdaad recentelijk gemeld (Al-Husini et al., 2018 Muthunayake et al., 2020). In C. halve maanRNase E assembleert in BR-lichamen samen met de degradosoomcomponenten en slecht vertaalde RNA's, waardoor P-lichaamachtige condensaten ontstaan ​​die betrokken zijn bij RNA-afbraak (Al-Husini et al., 2018, 2020). Deze RNase E-condensaten associëren met de C. halve maan nucleoïde in de nabijheid van rDNA-loci (Bayas et al., 2018). Interessant is dat de E coli RNase E, dat in tegenstelling tot in C. halve maan lokaliseert naar het binnenmembraan samen met de andere degradosoomcomponenten, vormt clusters die RNA-afhankelijke assemblage en dynamiek vertonen (Strahl et al., 2015), die lijkt op de C. halve maan BR-lichamen, wat suggereert dat: E coli degradosomen kunnen condensaten vormen door LLPS in het binnenmembraan. Aangenomen wordt dat endoribonucleolytische aanval door RNase E de eerste en de snelheidsbeperkende stap van RNA-afbraak is, dus het is redelijk om te stellen dat de nabijheid van deze RNase E-condensaten de kans kan vergroten dat een transcript verval ondergaat. In overeenstemming hiermee, E coli membraanlokaliserende transcripten vertonen een lagere gemiddelde stabiliteit en het kunstmatig richten van cytoplasmatische mRNA's op het membraan verhoogt hun afbraaksnelheid (Moffitt et al., 2016). Bovendien maakte het losmaken van RNase E van het membraan gesensibiliseerde cytoplasmatische ribosoomvrije transcripten (Hadjeras et al., 2019). Gezamenlijk geeft dit bewijs aan dat RNase-activiteit sterk gelokaliseerd is in bacteriële cellen door de bemiddeling van BR-lichamen, en dat regio's die ver verwijderd zijn van RNA-afbrekende condensaten mogelijk niet worden onderworpen aan intensieve ribonucleolytische druk. Dit zou UTT zeker ondersteunen, vooral in die organismen waar de kernribonucleolytische machinerie zich in het membraan lokaliseert, aangezien ontluikende ribosoomvrije transcripten niet bereikbaar zouden zijn voor degradosomen en daarom zou substantiële antiribonucleolytische bescherming niet vereist zijn.

Bovendien vertoont het bacteriële cytoplasma glasachtige eigenschappen en varieert de vloeibaarheid ervan afhankelijk van de fysiologische toestand van de cel, waar een hogere metabole activiteit correleert met een hogere vloeibaarheid van het cytoplasma en vice versa (Parry et al., 2014). Deze biofysische eigenschappen kunnen de functie van biomoleculaire condensaten beïnvloeden, d.w.z. meer vloeibare, vloeistofachtige condensaten zorgen voor hogere beweging en enzymatische activiteiten, terwijl vastere, aggregaatachtige entiteiten gespecialiseerd zijn in opslag (Banani et al., 2017). Bacteriën ondergaan een opmerkelijke metabolische vertraging bij binnenkomst in de stationaire fase of stress. Dit leidt tot de verglazing van het cytoplasma (Parry et al., 2014), die BR-lichamen zou kunnen omzetten in RNA-opslagcondensaten in plaats van RNA-verwerkingslichamen (Muthunayake et al., 2020). Dergelijke RNA-opslaande BR-lichamen zouden UTT verder kunnen ondersteunen door niet-vertaalde transcripten te accumuleren en te beschermen totdat gunstige omstandigheden de herinitiatie van de translatie mogelijk maken.


Transcriptie en vertaling werkblad Antwoorden Sleutel: A C C C C T C T.

Soorten chemische bindingen werkbladen antwoordsleutel. Oefening 2 SLEUTEL – Transcriptie- en vertaalwerkblad …

U bent vrij om uw mening met ons en onze lezers te delen in het opmerkingenveld op het laatste deel van de pagina, dat kunt u zien. Transcriptie en vertaaloefening werkblad Antwoordsleutel


Bron: www.williamwithin.com

Wat betekenen de volgende termen? Antwoordblad over DNA-Rna en eiwitsynthese | Kinderen …

Als het gaat om transcriptie en vertaling, kan het hele proces soms een gedoe lijken. Transcriptie en vertaaloefening werkblad Antwoordsleutel

Werkblad voor DNA-transcriptie en vertaling oefenen met dna van werkblad voor transcriptie en vertaling antwoordsleutel, bron: hasshe.com het enige wat u hoeft te doen wanneer u op hun pagina komt, is het selecteren van een van de verschillende sjablonen die ze geven of opnieuw beginnen. Oefening 2 SLEUTEL – Transcriptie- en vertaalwerkblad …

Transcriptie en vertaling praktijk werkblad antwoorden. 16 beste afbeeldingen van 13 1 RNA-werkblad Antwoordsleutel – Hoofdstuk …

Als u een paar minuten de tijd neemt om contact op te nemen met uw klanten, zult u merken dat ze eerder geneigd zijn terug te komen om meer met u te werken, en u uiteindelijk betere resultaten te geven. Kleurwerkblad met uitleg over transcriptie en …

Transcriptie en vertaling praktijk werkblad antwoorden. Identificatiesleutel mitose-werkbladdiagram | Mychaume.com

We hebben een droom over deze transcriptievertaling werkblad antwoordsleutel fotogalerij kan een leidraad voor u zijn, u meer ideeën opleveren en het belangrijkste: Transcriptie en vertaalwerkblad Antwoordsleutel

T g t transcriptie mrna: Best of Biology Corner Dna Coloring Transcription And …

Wat betekenen de volgende termen? transcriptie-en-vertaling-werkblad-antwoord-sleutel-biologie …

Als u een paar minuten de tijd neemt om contact op te nemen met uw klanten, zult u merken dat ze eerder geneigd zijn terug te komen om meer met u te werken, en u uiteindelijk betere resultaten te geven. Transcriptie en vertaaloefening werkblad Antwoord …


Bekijk de video: Цитология. Лекция 29. Транскрипция (December 2021).