Informatie

Thermodynamica van spontane eiwitvouwing: rol van enthalpieveranderingen


Ik probeer duidelijk te krijgen waarom eiwitvouwing spontaan plaatsvindt.

$$ceDelta G=Delta H-TDelta S$$

Volgens de thermodynamica moet de ΔG negatief zijn om een ​​proces spontaan te laten plaatsvinden. Wanneer een eiwit vouwt, neemt de ΔS (Entropy) af, omdat het eiwit meer geordend wordt. Ik denk echter dat de vorming van de bindingen (disulfide en andere zwakke interacties) deze ongunstige stijgende entropie tegenwerkt door een enthalpie (ΔH) te vormen, wat dus zou resulteren in een negatieve ΔG.

Ik zag echter een andere verklaring online die de Gibbs-formule voor vrije energie niet op het eiwit toepaste, maar in plaats daarvan op het water. Omdat het water meer geordend is wanneer het eiwit ontvouwd is, zou het volgens de tweede wet van de thermodynamica gunstig zijn om het eiwit te vouwen omdat na het vouwen de watermoleculen vrijer kunnen bewegen --> hogere entropie --> negatieve ΔG --> spontaan vouwen.

Dus mijn vraag is welke van deze twee (of misschien beide) de oorzaak zijn van de spontane vouwing van eiwitten?


Samenvatting

  • De eerste verklaring komt vaak voor.
  • De tweede verklaring kan niet correct zijn, zoals het er nu uitziet, omdat het de vrije energieverandering in het eiwit negeert.
  • Een wijziging van de tweede verklaring (misschien wat bedoeld was) is dat het nodig is om de eiwitvouwing en verandering in het water als gekoppeld te beschouwen, in welk geval de totale vrije energieverandering - de som van de twee afzonderlijk beschouwd - de determinant van eiwitvouwing. De stelling zou dan zijn dat een negatieve vrije-energieverandering in het watersysteem de doorslag geeft. Deze opvatting is overtuigend bepleit op basis van experimentele metingen.

Vrije energieverandering in individuele transformaties

Het is standaardpraktijk in de biochemie om de Gibbs-vrije energie van transformatie van de soort A → B afzonderlijk te beschouwen om te bepalen of deze spontaan zal verlopen. Een chemische reactie waarvoor ΔG negatief is, kan warmte genereren (dwz een negatieve enthalpieverandering (ΔH) hebben) die de waterige omgeving beïnvloedt, maar het lijkt gerechtvaardigd om de reactie afzonderlijk te beschouwen, aangezien het niet logisch is dat de verandering in de vibratie van de watermoleculen drijven of zijn gekoppeld aan de reactie.

Deze benadering is toegepast op de structurele verandering van eiwitvouwing met de conclusie (in overeenstemming met de eerste verklaring) dat de verandering in enthalpie (ΔH) voldoende is om een ​​negatieve ΔG te produceren en dus eiwitvouwing te stimuleren (Citaat 1, hieronder).

Vrije energieverandering in gekoppelde transformaties Veel biochemische veranderingen omvatten transformaties die individueel een positieve vrije energieverandering hebben, maar mogelijk worden gemaakt door koppeling aan een andere reactie met negatieve vrije energieverandering, van grotere omvang:

A → B , ΔG1 = +x

C → D , ΔG2 = -y

Als y>x en deze twee reacties zijn gekoppeld (meestal via een complex reactiepad op een enzym), dan hebben we:

A + C → B + D , ΔGalgemeen = -ve

Zien ook Berg et al.

Hoewel men de tweede verklaring in de huidige vraag kan verwerpen omdat deze de vrije-energieverandering bij de eiwitvouwing negeert, was het misschien de bedoeling dat de vouwing van het eiwit (A → B) moet worden beschouwd als gekoppeld aan de verandering in de omgeving van het water (C → D), en dat de negatieve ΔG voor de waterige omgeving een grotere bijdrage leverde aan de totale ΔG dan die voor de eiwitvouwing.

Is het geldig om deze twee systemen als gekoppeld te beschouwen? In de oorspronkelijke versie van mijn antwoord betoogde ik tegen dit standpunt, maar ben niet langer overtuigd door mijn eigen argumenten. De wateromgeving is duidelijk essentieel voor het hydrofobe effect - het begraven van de hydrofobe resten in het midden van het eiwit, weg van het water. Dit is duidelijk als men hetzelfde eiwit in een hydrofobe omgeving zoals een celmembraan beschouwt - het zou niet vouwen. In membraaneiwitten zijn het hydrofobe resten die worden blootgesteld aan de lipidedubbellaag en het is hun interieur dat soms hydrofiele kanalen heeft.

Dus in dit gekoppelde systeem, wat is de determinant van de negatieve vrije energieverandering? Minikel (Citaat 2, hieronder) beweert dat er geen netto enthalpieverandering is voor de eiwitvouwing, en het is het entropie-effect op de ΔG voor de waterige omgeving die de vouwing aandrijft. Hij geeft aan dat deze visie wordt ondersteund door differentiële scanning-colorimetrie en hoewel hij geen referenties citeert, is er een recente (zij het nogal complexe) recensie van dit onderwerp door Christopher M. Johnson.

Citaat 1: Bewering van de rol van ΔH van eiwit

De volgende uitleg, ontleend aan Essential Biochemistry, behandelt de eiwitvouwing afzonderlijk en stelt dat verandering in enthalpie voldoende is om een ​​negatieve vrije energieverandering te produceren:

Het vouwen van een eiwit geeft ook een voorbeeld van de termen "ΔH" en "-TΔS" die met elkaar concurreren om de ΔG van het vouwproces te bepalen. Zoals hierboven beschreven, is de verandering in entropie van het eiwit tijdens het vouwen negatief, dus de term "-TΔS" is positief. Naast entropische effecten zijn er echter enthalpische bijdragen aan eiwitvouwing. Deze omvatten waterstofbruggen, ionische zoutbruggen en Van der Waals-krachten. Er is een invoer van thermische (warmte) energie nodig om deze krachten te verstoren, en omgekeerd, wanneer deze interacties zich vormen tijdens het vouwen van eiwitten, geven ze warmte af (de ΔH is negatief). Wanneer al deze entropische en enthalpische bijdragen worden gewogen, wint de enthalpieterm het van de entropieterm. Daarom is de vrije energie van eiwitvouwing negatief en is eiwitvouwing een spontaan proces.

Citaat 2: Weerlegging van de rol van ΔH van eiwit en bewering van de rol van water

De volgende uitleg, ontleend aan online college-aantekeningen van Eric V. Minikel van de Harvard University, die het bovenstaande standpunt weerlegt:

Een onjuist en simplistisch beeld van eiwitvouwing is als volgt. Een ongevouwen eiwit heeft een hoge configuratie-entropie maar ook een hoge enthalpie omdat het weinig stabiliserende interacties heeft. Een gevouwen eiwit heeft veel minder entropie, maar ook veel minder enthalpie. Er is hier een afweging tussen H en S. Merk op dat, omdat ΔG = ΔH - TΔS, een verhoogde temperatuur de S-term zwaarder weegt, wat betekent dat een hogere temperatuur het ontvouwen bevordert.

Die hele uitleg houdt alleen rekening met de energie van het eiwit en niet die van het oplosmiddel. In feite beperken hydrofobe domeinen van een eiwit de mogelijke configuraties van het omringende water (zie uitleg hierboven), en dus verhoogt hun begraving bij het vouwen de entropie van het water. Bovendien blijkt dat aan de waterstofbinding van polaire resten en de ruggengraat zowel in uitgevouwen toestand (door water) als in opgevouwen toestand (door elkaar) wordt voldaan. Daarom is enthalpie "nulsom" en wordt eiwitvouwing bijna volledig aangedreven door entropie.


Thermodynamica van eiwitvouwing: methodologie, gegevensanalyse en interpretatie van gegevens

Thermodynamica van eiwitvouwing verwijst naar de stabiliteitsmetingen waarbij structurele veranderingen van een bepaald eiwit in de aanwezigheid van een denaturerend middel worden gevolgd door spectroscopische of calorimetrische technieken. In macroscopisch oogpunt vertegenwoordigt eiwitstabiliteit de verhouding van de populatie van zijn ongevouwen staat tot die van gevouwen in evenwichtstoestand, terwijl in microscopisch oogpunt de stabiliteit eigenlijk een nettowaarde is van een combinatie van gunstige en ongunstige bijdragen die de structurele integriteit van een eiwitmolecuul beïnvloeden. In dit manuscript worden de principes en methodologische aspecten van thermodynamische studies en methoden van data-analyse en interpretatie van de resultaten gepresenteerd.

Grafisch abstract

Dit is een voorbeeld van abonnementsinhoud, toegang via uw instelling.


De enthalpieverandering in eiwitvouwing en -binding: verfijning van parameters voor op structuur gebaseerde berekeningen

Twee effecten zijn voornamelijk verantwoordelijk voor de waargenomen enthalpieverandering bij het ontvouwen van eiwitten: de verstoring van interne interacties binnen het eiwitmolecuul (van der Waals, waterstofbruggen, enz.) aan het oplosmiddel bij het ontvouwen. In de traditionele thermodynamische analyse zijn de effecten van hydratatie meestal geëvalueerd met behulp van de thermodynamische gegevens voor de overdracht van kleine modelverbindingen van de gasfase naar water. De bijdrage van interne interacties wordt daarentegen meestal geschat door de hydratatie-effecten af ​​te trekken van de experimentele enthalpie van ontvouwen. Het belangrijkste nadeel van deze benadering is dat de enthalpische bijdragen van hydratatie, en die als gevolg van de verstoring van interne interacties, meer dan één orde van grootte groter zijn dan de experimentele enthalpiewaarde. De enthalpiebijdragen van hydratatie en verstoring van interne interacties hebben tegengestelde tekens en heffen elkaar bijna volledig op, wat resulteert in een uiteindelijke waarde die meer dan 10 keer kleiner is dan de individuele termen. Om deze reden kan de klassieke benadering niet worden gebruikt om ontvouwende enthalpie nauwkeurig uit de structuur te voorspellen: elke fout in de schatting van de hydratatie-enthalpie zal worden versterkt met een factor 10 of meer in de schatting van de ontvouwende enthalpie. Onlangs is aangetoond dat eenvoudige parametrische vergelijkingen die de enthalpieverandering relateren aan bepaalde structurele parameters, met name veranderingen in voor oplosmiddelen toegankelijke oppervlakten, een aanzienlijk voorspellend vermogen hebben. In dit artikel bieden we een fysieke basis voor die parametrisering en in het proces presenteren we een systeem van vergelijkingen dat expliciet de enthalpische effecten van de pakkingsdichtheid tussen de verschillende atomen in het eiwitmolecuul omvat. Met deze benadering is de fout in de voorspelling van vouw-/ontvouwingsenthalpieën bij 60°C, de mediane temperatuur voor thermische ontvouwing, beter dan ±3% (standaarddeviatie = 4 kcal/mol). © 1996 Wiley-Liss, Inc.


Abstract

We hebben veranderingen in warmtecapaciteit, entropie en enthalpie gemeten voor elke stap in de vouwreactie van CD2.d1 en de effecten van kernmutaties op deze eigenschappen geëvalueerd. Alle wildtype en mutante vormen vouwen door een snel gevormde tussentoestand die voorafgaat aan de snelheidsbeperkende overgangstoestand. Mutaties hebben een uitgesproken effect op de enthalpie van zowel de intermediaire als de gevouwen toestand, maar in alle gevallen resulteert een compenserende verandering in entropie in een kleine netto vrije-energieverandering. Hoewel de enthalpieverandering in de gevouwen toestand kan worden toegeschreven aan een verlies van van der Waals-interacties, is al aangetoond dat veranderingen in de stabiliteit van het tussenproduct worden gedomineerd door veranderingen in de neiging tot secundaire structuur [Lorch et al. (1999) Biochemie38, 1377-1385]. Hieruit volgt dat de thermodynamische basis van β-propensity enthalpische oorsprong is. De effecten van mutaties op de enthalpie en entropie van de overgangstoestand zijn kleiner dan op de grondtoestanden. Deze relatieve ongevoeligheid voor mutatie wordt besproken in het licht van theorieën over de aard van de snelheidsbeperkende barrière bij vouwreacties.


Abstract

Analyse van thermodynamische gegevens over het oplossen van vaste cyclische dipeptiden in water in termen van groepsadditiviteit geeft een reden voor de enthalpie- en entropie-convergentietemperaturen die worden waargenomen voor denaturatie van kleine globulaire eiwitten en het oplossen van modelverbindingen in water. Convergentietemperaturen zijn temperaturen waarbij de geëxtrapoleerde enthalpie- of entropieveranderingen voor een reeks verwante verbindingen een gemeenschappelijke waarde aannemen. Bij deze temperaturen ( T H ∗ en T S ∗ ) de apolaire bijdragen aan de corresponderende thermodynamische waarden (H° en S°) worden weergegeven als nul. Andere bijdragen zoals waterstofbinding en configuratie-effecten kunnen dan worden geëvalueerd en hun kwantitatieve effecten op de stabiliteit van bolvormige eiwitten kunnen worden beoordeeld.

Het is aangetoond dat de denaturatiewarmtecapaciteit bestaat uit een grote positieve bijdrage van de blootstelling van apolaire groepen en een significante negatieve bijdrage van de blootstelling van polaire groepen in overeenstemming met eerdere resultaten. De grote apolaire bijdrage suggereert dat een vloeibaar koolwaterstofmodel van het hydrofobe effect de apolaire bijdrage aan H° van denaturatie. In plaats daarvan blijken significante enthalpische stabiliserende bijdragen voort te komen uit peptidegroepen (waterstofbinding).


Resultaten

In-Cell-effecten op de gevouwen toestand.

Ons modeleiwit is de 110-residu -barrel scaffold [Protein Data Bank (PDB) code 4BCZ] van de alomtegenwoordige radicalenvanger Cu/Zn superoxide dismutase (VOB-code 1HL5). Deze SOD1-variant (SOD1-vat) werd geconstrueerd door de metaalbindende lus IV en de elektrostatische lus VII van het moedereiwit (26) af te kappen, die de natieve dimerisatie uitwist en een katalytisch inactief, braaf monomeer achterlaat dat verschillende voordelen biedt voor in-celanalyse (Fig. S1). Het SOD1-vat vertoont een simplistische vouwtransitie in twee toestanden (26) zonder complexiteit in de vorm van natieve metaalbindende liganden (27) en cysteïne-eenheden (28) en wordt uitgebreid gekarakteriseerd met betrekking tot de mutatierespons (27, 29, 30), structurele dynamiek (26, 31) en aggregatiegedrag (6). Ook vertoont SOD1-vat volledig opgeloste NMR-spectra in zoogdiercellen (32). Voor de experimenten met zoogdiercellen gebruikten we de humane ovariumadenocarcinoomcellijn A2780 (33), die goede eigenschappen bleek te hebben voor eiwitafgifte en duurzaamheid in de NMR-buizen. 15 N-gelabeld eiwit werd door elektroporatie in het cytosol van zoogdiercellen afgeleverd (SI-materialen en -methoden) en na herstel en wassen werden de behandelde cellen voorzichtig verpakt in een NMR-buis (SI-materialen en -methoden). Intracellulaire SOD1-vatconcentraties waren 20-30 M, overeenkomend met die in transgene ALS-muizen (34, 35), en aanzienlijk hoger dan de endogene concentratie van 1 tot 5 μM van SOD1 in zoogdiercellen (36). Controles van efficiëntie en opbrengst van internalisatie worden beschreven in: SI-bedieningen en Afb. S2EEN. De resultaten tonen hoge-resolutie in-cel heteronucleaire meervoudige kwantumcoherentie (HMQC) spectra van gevouwen en vrij tuimelende SOD1-cilindermoleculen, die nauw overeenkomen met die welke in vitro zijn verkregen (SI-bedieningen en Afb. S2B). Een opmerkelijk effect van de internalisatie is echter een verhoogde mate van protonering van de histidine-zijketens van het eiwit. Door SOD1 I35A zelf als pH-sonde te gebruiken, bepalen we de intracellulaire pH tot 6,5 (SI-bedieningen en Afb. S2C). Deze cytosolverzuring wordt verwacht en komt voort uit de hypoxische omstandigheden in dicht opeengepakte NMR-buizen: de gekweekte kankercellen leiden hun metabolisme om naar glycolytische routes met weinig effect op de levensvatbaarheid (32). De NMR-kruispieken laten zien dat de verzuring vroeg in het experiment begint, uniform is over de eiwitpopulatie en langer dan 5 uur stabiel blijft.

De structuur van het natieve SOD1-dimeer (PDB-code 1HL5) en de lusregio's verwijderd door eiwitengineering. (EEN) In het natieve SOD1-dimeer passen de lange lussen IV en VII een compacte en sterk geordende structuur aan rond de actieve plaats, waar lus IV ook deel uitmaakt van de dimeerinterface (groen). Het linker monomeer wordt weergegeven als toegankelijk oppervlak (1,4 sondestraal), terwijl het rechter monomeer wordt weergegeven als een cartoon. Gemarkeerd zijn de residuen die de actieve plaats Cu 1+/2+ en Zn 2+ ionen en de C57-C146 disulfidebinding tussen lus IV en de centrale β-barrel coördineren. (B) Verwijdering van lussen IV en VII van apoSOD1 vermindert het dimeer-interface evenals de metaalbindende delen en leidt tot oplosbare apoSOD1-vatmonomeren (PDB-code 4BCZ). De afgeknotte lussen IV en VII zijn respectievelijk groen en blauw gemarkeerd. (Aangepast van ref. 26.)

(EEN) Beheersing van internalisatie. Eendimensionale 15 N-HMQC-spectra van SOD1 I35A in A2780-cellen (blauw) en in supernatant (rood) vertonen geen of kleine hoeveelheden lekkage. (B, Links) Röntgenstructuur van SOD1-vat (PDB-code 4BCZ), die de β-barrel-steiger van het ALS-geassocieerde eiwit Cu/Zn-superoxide-dismutase 1 (66) vertegenwoordigt. De methode levert hier intracellulaire concentraties op van 20-30 M, overeenkomend met die van menselijke SOD1 in transgene ALS-muizen (43) en in vitro aggregatiestudies (6). (B, Centrum en Rechts) HMQC-spectra van SOD1-vat in zoogdiercellen (blauw) en het daaropvolgende cellysaat (zwart). (C, Links) Overlay van 1H-<15 N>-HMQC-spectra verkregen bij pH-waarden variërend van 5,8 tot 7,6. (C, Centrum) Close-ups van de meest getroffen kruispieken. (C, Rechts) Overlay van de best passende in vitro spectra (rood) en de in-cell spectra (blauw), gebruikt samen met de rest van de gegevens om de pH in de A2780-cellen te schatten op 6,5 ± 0,1 (32).

Thermodynamische analyse.

Hoewel het in-celspectrum van gevouwen SOD1-vat kan worden gebruikt voor het vaststellen van de cytosolische pH en basale moleculaire mobiliteit, kan het niet op zichzelf worden gebruikt voor het meten van het vouwevenwicht. Een dergelijke analyse vereist gelijktijdige detectie van zowel de gevouwen (N) als de gedenatureerde (D) toestanden in vrij evenwicht, d.w.z. een zich ontvouwende titratiecurve (37), waarbij het vouwende evenwicht (KD-N) en stabiliteit (ΔGD-N) worden gegeven door Δ G D-N = − R T ln K D-N = − R T ln [ N ] [ D ] . [1] Om zo'n evenwichtig evenwicht tot stand te brengen, hebben we SOD1-vat gedestabiliseerd door de kernmutatie I35A (SOD1 I35A). De mutatie laat de structuur en het oppervlak onveranderd (SI-bedieningen, Afb. S3 A–Fen Tabel S1) maar maakt het eiwit gedeeltelijk ongevouwen onder fysiologische omstandigheden. Als bewijs van het principe toont het NMR-spectrum van SOD1 I35A gemengde populaties van D en N in PBS-buffer bij pH 6,5 en 37 °C (Fig. 1). Voor kwantificering van KD-N = [N]/[D] we gebruiken de volumes van de C-terminale Q153-kruispieken, die goed gescheiden zijn en ongevoelig voor door temperatuur/viscositeit geïnduceerde relaxatie-effecten (SI-bedieningen en Afb. S3 G–L).Bij het verlagen van de temperatuur verschuift het SOD1 I35A-evenwicht geleidelijk naar N, waarbij een thermisch ontvouwend middelpunt van tm = 35 ° C in de in vitro controle (Fig. 1). Bij 17 °C bereikt N een maximale bezetting van 85% om uiteindelijk weer af te nemen naarmate de temperatuur nog lager wordt. Deze gekromde temperatuurafhankelijkheid van KD-N is een generiek effect van de toename van de warmtecapaciteit bij het ontvouwen (ΔCP) volgens ref. 37 en 38, Δ G D-N ( T ) = Δ H D-N ( T 0 ) − T Δ S D-N ( T 0 ) + Δ C p [ T − T 0 − T ln ( T T 0 ) ] , [2] waar ΔHD-N enSD-N zijn respectievelijk de enthalpie en entropie van ontvouwen. deCP verandering is het gevolg van een toename van de hydrofobe hydratatie en biedt een bruikbare maat voor de toename van het voor oplosmiddel toegankelijke oppervlak van de N naar D-overgang (39). Omdat de hydratatie bij lagere temperaturen “sterker” wordt, bevordert het grotere oppervlak van D koude ontvouwing en kromming ΔGD-N(t) profielen (38). Voor SOD1 I35A wordt het middelpunt van de koude ontvouwing bepaald om: tC = −3 °C, in goede overeenstemming met onafhankelijke controles op basis van CD-gegevens (SI-bedieningen en Afb. S4 EEN en B). Deze thermodynamische beschrijving van SOD1 I35A in vitro vormt de referentie voor kwantificering van de effecten in cellen (tabel 1 en tabel S2).

In vitro benchmarking van SOD1 barrel , klaar voor marginale thermodynamische stabiliteit door de mutatie SOD1 I35A . (EEN) HMQC-spectra van SOD1-vat bij 37 ° C, met uniform gevouwen eiwit. inzet toont de röntgenstructuur van SOD1-vat (PDB-code 4BCZ), dat de β-barrel-steiger vormt van het ouder-ALS-geassocieerde eiwit Cu/Zn-superoxide-dismutase 1 (32). (B) Overeenkomstige HMQC-spectra van de mutant SOD1 I35A (PDB-code 4XCR), die een gemengde populatie van gevouwen (N) en ongevouwen (D) materiaal toont. Kwantificering van het D/N-evenwicht is van de kruispiekvolumes van de C-terminale resonantie Q153. (C)GD-N vs. temperatuurprofielen van SOD1 barrel en SOD1 I35A verkregen uit NMR thermische scans. De populaties van D en N versus temperatuur laten een smeltpunt zien tm = 35,4 °C, d.w.z. ΔGD-N = 0 (Vgl. 1), en koude ontvouwing bij temperaturen onder het vriespunt. De gebogenGD-N profielen met stabiliteitsmaxima rond kamertemperatuur zijn kenmerkend voor natuurlijk ontwikkelde eiwitten (58) en definiëren een standaardset van thermodynamische parameters met een gevestigde structurele betekenis (vgl. 2).

Thermodynamische parameters van de gegevens in de cel en in-vitrocontroles

(A–C) De kristalstructuur van SOD1 I35A (PDB-code 4XCR) (rood) bedekt met die van het SOD1-vat (PDB-code 4BCZ) (grijs), wat aantoont dat de gevouwen toestanden van de twee eiwitvarianten grotendeels hetzelfde zijn. (NS en E, Bovenste) In vitro HMQC - spectra van marginaal stabiele SOD1 I35A en de volledig gevouwen SOD1 barrel . (NS en E, Lager) De elektrostatische oppervlakken van de twee eiwitten. Alles bij elkaar genomen laten de gegevens zien dat de structuren en oppervlakte-eigenschappen van SOD1 I35A en SOD1 barrel erg op elkaar lijken. (F) Chevron-grafieken van SOD1 I35A bij 17 °C, 25 °C en 37 °C. De lagere temperaturen tonen de handtekening van een map met twee toestanden (28), terwijl bij 37 °C het middelpunt te laag is om enige hervouwing van het eiwit waar te nemen. (G) Het vrije-energieprofiel van SOD1 I35A in A2780-cellen (blauw) en in vitro-gegevens met een gesimuleerde variërende selectieve lijnverbreding van de Q153-kruispiek van de gevouwen toestand, PF (rood). (H) De factoren van lijnverbreding toegepast op PF om in-cell-gegevens (blauw) te reproduceren in vergelijking met de factoren gemeten aan de hand van in-cell-gegevens (rood) en de factoren gemeten in in-vitromonsters met hoge viscositeit (zwart). (l) Berekend maximaal effect op ΔGD-N van viscositeitseffecten bij lage temperaturen. De bepaling van het piekvolume kan last hebben van systematische fouten als gevolg van lijnverbreding bij lage temperaturen, maar het maximale effect is minder dan 250 J⋅mol −1 . (J) De verhouding van R2 voor de gevouwen en ongevouwen Q153 kruispiek bij 280 K, 290 K en 310 K vertoont slechts een matige temperatuurafhankelijkheid. (K) Overlay van HMQC-spectra van de gevouwen SOD1-cilinder en de volledig uitgevouwen SOD1 I35A/G93A met dubbele mutant. (L) De relatieve piekvolumes van Q153 D (rood) en N (zwart) als functie van de temperatuur. De berekende populatie van N blijft constant op 0,5 (blauw), zoals verwacht voor een systeem met slechts een kleine bijdrage van lijnverbreding en relaxatiebias.

Statistieken van kristallografische gegevensverzameling en verfijning

(EEN) Vrije-energieprofielen van SOD1-vat (blauw) en SOD1 I35A (groen), afgeleid van CD-smeltgegevens (inzet), vergeleken met het vrije-energieprofiel van SOD1 I35A bepaald door NMR (oranje). (B) De pH-afhankelijkheid van tm enH van SOD1 I35A gebruikt om Δ . te bepalenCP uit de relatieCP =Htm. (C) In-cel monsterstabiliteit versus tijd. De 1D 1H-<15 N>-HMQC-spectra van SOD1 I35A in A2780-cellen aan het begin van het experiment (rood) en na 2D-acquisitie (blauw) zijn over het algemeen vergelijkbaar. (NS-H) Controle van pH- en zouteffecten. (NS) Populatie gevouwen SOD1 I35A materiaal bepaald uit Q153 kruispieken als functie van pH. (E) Thermisch smeltpunt van SOD1 I35A bepaald door CD als functie van pH. (F) Vrije-energieprofielen direct bepaald op basis van gegevens in de cel (blauw) en scheeftrekken van gegevens die ontstaan ​​door de pH te compenseren met 6,25 (rood) en 6,72 (zwart). (G) Vrije-energieprofielen voor SOD1 I35A zonder toegevoegd zout (oranje) en in toenemende hoeveelheden NaCl, tot 300 mM. (H) De smelttemperaturen voor SOD1 I35A bij de NaCl-concentraties gebruikt in G.

Thermodynamische parameters van de gegevens in de cel en in-vitrocontroles

Cellen bevorderen de wereldwijde ontplooiing van SOD1 I35A.

Bij overdracht in de zoogdier-A2780-cellen is het eiwit SOD1 I35A duidelijk gedestabiliseerd: bij 37 ° C verschuift het vouwevenwicht viervoudig naar de gedenatureerde toestand (Fig. 2 en Tabel 1). Dit effect is met name tegengesteld aan het effect dat wordt verwacht van sterische crowding (11 ⇓ -13) en wijst op de aanwezigheid van aantrekkelijke interacties tussen SOD1 I35A en het intracellulaire medium. De aard van deze interacties wordt aangegeven door de temperatuurafhankelijkheid van de stabiliteit in de cel. Binnen cellen vertoont de D ⇄ N-overgang een toename van 37% van ΔCP (Tabel S2), resulterend in een vernauwing van de thermische ontvouwingsovergangen (Fig. 2). Ook blijven de D- en N-soorten in dynamisch evenwicht tijdens de experimenten van 4 uur, zonder significante drift van populaties of verlies van eiwitmateriaal (SI-bedieningen en Afb. S4C). Omdat de NMR-chemische verschuivingen en lijnverbreding suggereren dat de structuur van geïnternaliseerd N onveranderd blijft en vrij van specifieke interacties (Fig. S3), is het redelijk om te concluderen dat de ΔCP toename is voornamelijk te wijten aan modulatie in de cel van D. Voor controles van gegevensscheefheid door temperatuurgeïnduceerde pH-verschuivingen en ionsterkte, zie SI-bedieningen en Afb. S4 NSH. Als aanvullende test hebben we in-cel experimenten uitgevoerd op SOD1 I35A tot overexpressie gebracht in Escherichia coli (Figuur 2). De resultaten laten zien dat E coli neemt af tm in mindere mate dan A2780-cellen, maar heft de ΔGD-N(t) profiel naar algehele lagere stabiliteit (Fig. 2). Gekoppeld aan deze lift is een substantiële toename van het koude-ontvouwende middelpunt, dat naar het fysiologische regime gaat bij tC = 8,4 ± 1,7 °C (tabel 1), en de temperatuur voor maximale SOD1 I35A-stabiliteit verschuift van 14 °C in zoogdiercellen naar 20 °C in E coli (Fig. 2, Tabel 1, SI-gegevens, en Afb. S5 EEN, H, en l). Dus, te oordelen naar tm alleen zouden de zoogdiercellen bedrieglijk een kleiner destabiliserend effect lijken te hebben dan E coli, waarbij het belang wordt benadrukt van het karakteriseren van het geheel ΔGD-N(t) profiel in dit type experiment. Door hogere lijnverbreding in E coli cellen (Fig. S5 H en l), kunnen we momenteel niet nauwkeurig bepalen KD-N = [N]/[D] onder 10 °C en dus het precieze effect op ΔCP. Van deCP toename van zoogdiercellen, er wordt echter aangegeven dat de SOD1 I35A-destabilisatie hier gepaard gaat met een groter oppervlak van de gedenatureerde toestand. De canonieke structuren van D, waarvan wordt waargenomen dat ze relatief zijn ingestort in zuiver water (40), lijken uit te zetten bij interactie met de intracellulaire componenten. Een dergelijke uitbreiding is ook consistent met eerdere waarnemingen van toegenomen ontvouwing m waarden in E coli (21) en verhoogde temperatuurgevoeligheid van de eiwithervouwingskinetiek in zoogdiercellen (18).

In-cel kwantificering van eiwitstabiliteit. (EEN) Schematische illustratie van eiwitafgifte door elektroporatie. De methode levert intracellulaire concentraties van SOD1 I35A = 20–30 M op, overeenkomend met die van menselijk SOD1 in transgene ALS-muizen (43) en in vitro aggregatiestudies (6). (B) Twee overlappende in-cel HMQC-spectra van SOD1 I35A die laten zien dat het eiwit voornamelijk is gevouwen bij 17 ° C (rood) en al volledig is uitgevouwen bij 37 ° C (blauw). Een voordeel van deze detectiestrategie is dat het doeleiwit volledig fysiologisch wordt behouden en verstoken is van potentieel storende spectroscopische reporters. (C)GD-N vs. temperatuurprofielen op basis van kwantificering van het D/N-evenwicht van de Q153-kruispiekvolumes. De resultaten laten zien dat zowel zoogdier- als bacteriële cellen SOD1 I35A aanzienlijk destabiliseren, zij het op enigszins verschillende manieren. Een gemeenschappelijk kenmerk is dat de destabilisatie in de cel zowel koude ontvouwing (tC) en smelttemperaturen (tm) aan het fysiologische regime (Tabel 1).

Vrije-energieprofielen gebruikt voor in vitro controles. De in vitro referenties (PBS) worden in oranje weergegeven. (EEN) Het effect van E coli lysaten op SOD1 I35A-stabiliteit is kritisch gevoelig voor lysaatbereiding. (B) Toenemende hoeveelheden van de inerte crowder Ficoll 70 verhoogt de stabiliteit van SOD1 I35A: 50 mg/ml (groen), 100 mg/ml (rood), 150 mg/ml (blauw), 200 mg/ml (zwart) en 250 mg/ ml (roze). (C) Het overeenkomstige effect van PEG 400: 5% (bruin), 10% (blauw), 20% (zwart) en 30% (roze). (NS) Verdringing met BSA levert slechts matige effecten op: 40 mg/ml (rood), 80 mg/ml (blauw) en 100 mg/ml (zwart). (E) Het overeenkomstige effect van 100 mg/ml holoSOD1-dimeer (rood). (F) Verdringing met TTHA pwt : 50 mg/mL (blauw) en 100 mg/mL (rood). (G) Verdringing met lysozym levert duidelijke destabilisatie op, zelfs bij lage concentraties: 30 mg/ml (blauw) en 50 mg/ml (rood). (H en l) In-E. coli HMQC-spectra van SOD1 I35A bij 290 K en 310 K tonen lijnverbreding. Toch kunnen de smalle kruispieken van de dynamische C-terminal Q153 worden gebruikt voor een nauwkeurige bepaling van de D- en N-populaties. (J–L) Thermodynamische en kinetische overeenkomst van SOD1 I35A en verminderde apoSOD1 pwt. Het thermisch smelten van de twee SOD1-varianten vertoont onafscheidelijke sporen. (K) Vergelijking van vrije-energieprofielen van SOD1 I35A afgeleid van NMR (zwart) en CD-gegevens (blauw) en het vrije-energieprofiel van apoSOD1 pwt afgeleid van CD-gegevens (rood). (L) SOD1 I35A en gereduceerde apoSOD1 pwt vertonen vergelijkbare ontvouwingssnelheden en vergelijkbare lineaire ureumafhankelijkheid, wat vergelijkbare gevouwen structuren suggereert (66).

Formele beschrijving van in-cel interacties.

Op voorwaarde dat de interacties tussen SOD1 I35A en de intracellulaire omgeving over het algemeen zwak zijn, zoals wordt gesuggereerd door de NMR-gegevens, is het mogelijk om hun effect op het D N-evenwicht als volgt formeel te beschrijven. Neem aan dat men een aantal cellulaire componenten heeft van concentratie CJ. Voor elke component wordt de interactiepotentiaal met SOD1 I35A gegeven door Uij(Rij,<τ>), waar? l geeft N of D aan, Rij is de relatieve positie van l en J, en τ geeft alle andere coördinaten aan die nodig zijn om de potentiaal te beschrijven. Het effect op het D ⇌ N-evenwicht van de niet-specifieke interacties U(Rij) kan dan worden gekwantificeerd met behulp van een virale expansie van de osmotische druk en de tweede viriale coëfficiënt is B ij = − 1 N ( τ ) ∫ ​ exp < − U ij ( r → , τ ) k T − 1 >d τ dr → , [3] waar N(τ) is een normalisatie-integraal over de variabelen <τ>. De integraal over het massamiddelpunt scheiding dRij houdt in dat Bij heeft de afmeting van een volume. Uit de Gibbs-Duhem-relatie volgt dat de chemische potentiaal van SOD1 I35A in conformatie l is μ ik = μ ik 0 + k T ln C ik + k T ∑ j B ij C j . [4] Wanneer we hogere-orde termen in de viriale expansie verwaarlozen, volgt uit Vgl. 4 dat de evenwichtsconstante in de cel K D-N cel = K D-N ref exp < ∑ j ( B Nj − B Dj ) C j >, [5] is waarbij K D − N ref de in vitro referentie is. Dus, afhankelijk van het verschil tussen de viriale coëfficiënten in de celomgeving, kan N of D de voorkeur hebben. Het is verder waarschijnlijk dat de som over celcomponenten J bevat zowel negatieve als positieve termen, waarbij de waarde van de viriale coëfficiënt Bij wordt bepaald door de intermoleculaire potentiaal Uij (Vergelijk. 3). De belangrijkste weerzinwekkende bijdrage aan de potentiële Uij is te wijten aan de uitgesloten volume-interactie. Uitgesloten volume is altijd aanwezig en levert een positieve bijdrage aan de viriale coëfficiënt, die groter is voor de uitgebreide D dan voor de compactere N. Als dit de dominante bijdrage aan B wasij, K D − N cel < K D − N ref in Vgl. 5 en het evenwicht zou worden verschoven naar N: Deze stabilisatie van de soort met het kleinste volume wordt vaak het crowding-effect genoemd (11 ⇓ -13). Naast het afstotende effect van uitgesloten volume zijn er ook aantrekkelijke termen in de intermoleculaire potentialen, die een negatieve bijdrage leveren aan de viriale coëfficiënt. De dominante, maar niet de enige, aantrekkelijke bijdragen komen voort uit lokale interacties tussen ionische groepen met tegengestelde lading en fragmentarische hydrofobe contacten. Voor SOD1 I35A, met een kleine netto lading en dicht bij elkaar gelegen anionische en kationische groepen, wordt verwacht dat de compacte N-soort relatief zwakke lokale elektrostatische interacties vertoont met de andere celcomponenten. In de meer uitgebreide D-toestand daarentegen, waar de ladingen verspreid en ruimtelijk flexibel zijn, zijn er grotere mogelijkheden om zulke aantrekkelijke interacties te vinden, die de neiging hebben om | B-dj | > | B Nj | in verg. 5. Het analoge argument geldt voor zwakke hydrofobe interacties waarbij, nogmaals, het gedenatureerde ensemble zal worden gestabiliseerd vanwege de hogere blootstelling van ruimtelijk ontvankelijke hydrofobe patches aan de intracellulaire omgeving. Een illustratie van hoe de uitgebreide D-conformatie de K D N-cel verschuift (Vgl. 5) door meer mogelijkheden te bieden voor interacties met cellulaire componenten wordt gegeven door het gekoppelde evenwicht (zie Fig. 4).

Aanwijzingen van in Vitro Crowders.

Om de bijdragen aan de in-cel destabilisatie van SOD1 I35A experimenteel af te bakenen, hebben we de impact van een reeks chemisch verschillende cosolutes in vitro in kaart gebracht (SI-gegevens en Afb. S5 B–G). In overeenstemming met voorspellingen van effecten met uitgesloten volume (12) (Vgl. 35), levert de "hard-sphere mimic" ficoll 70 een progressieve toename van de SOD1 I35A-stabiliteit op (Fig. 3). De gegevens laten echter zien dat de oorsprong van deze stabilisatie moleculair complexer is dan het uitgesloten volume alleen, omdat het overwegend enthalpisch van aard is en zonder noemenswaardige invloed op Δ.CP (Tabel S2). Dit is niet verrassend, aangezien osmolyten in het algemeen niet alleen volume innemen, maar ook de osmotische druk veranderen, wat meerdere componenten oplevert voor het effect op de eiwitstabiliteit (vergelijk Vgl. 3). Omdat het ficoll 70-effect contrasteert met de gegevens in de cel, lijken de stabiliserende bijdragen aan uitgesloten volume / osmotische druk teniet te worden gedaan door tegengestelde aantrekkelijke interacties in levende cellen (Vgl. 5). Vervolgens hebben we PEG 400 gebenchmarkt waarvan wordt gemeld dat het een tussenproduct is tussen een stabiliserende osmolyt en een chemisch denatureringsmiddel (41). Net als bij ficoll 70 levert PEG 400 een algehele stabilisatie van SOD1 I35A op (Fig. 3), maar met een bijbehorende toename van ΔCP (Tabel S2). De laatste geeft expansie van de gedenatureerde toestand van SOD1 I35A aan, consistent met de eerder waargenomen PEG 400-binding (41) en de huidige in-celgegevens (Tabel 1 en Tabel S2). Om de aantrekkelijke bijdragen aan opgeloste stoffen beter te isoleren, hebben we SOD1 I35A uiteindelijk overvol met een reeks verschillende bolvormige eiwitten. De veronderstelling is dat deze structureel gefixeerde eiwitten harde bollen vertegenwoordigen met variabele oppervlakte-eigenschappen die worden bepaald door hun respectievelijke aminozuursamenstelling. Als een vermeende "sterke" interactiepartner gebruikten we gevouwen lysozym met een netto positieve lading (+8,5 e), waardoor meerdere elektrostatische coördinatiemogelijkheden met de negatief geladen SOD1 I35A-soorten (-0,5 e) mogelijk waren (Tabel S3). Om eventuele tegengestelde effecten van uitgesloten volume te minimaliseren, hebben we de experimenten uitgevoerd in het lage-concentratieregime van [lysozyme] = 0 mg/mL, 30 mg/mL en 50 mg/mL. In tegenstelling tot de inerte osmolyten bevordert lysozyme een duidelijke destabilisatie van SOD1 I35A (Fig. 3, Tabel 1 en Tabel S2). Het netto negatieve runderserumalbumine (BSA) (−8,5 e) en het bacteriële vermeende zware metaalbindende eiwit TTHA pwt (−1,5 e) vertonen daarentegen geen of weinig effect op de SOD1 I35A-stabiliteit, terwijl de cysteïne-verarmde SOD1-dimeer, holoSOD1-dimeer (−5 e), levert een lichte stabilisatie op (Fig. 3, Tabel 1 en Tabel S2). Alles bij elkaar genomen laten deze resultaten zien dat het effect van omringende eiwitten variabel is en afhangt van hun gedetailleerde oppervlaktekenmerken. De waarneming voldoet niet alleen aan de regel dat eiwit-eiwitinteracties sequentiespecifiek zijn, maar benadrukt ook dat het in-cel effect afhangt van de sequentie van het doeleiwit zelf: het aantrekkingspotentieel is afhankelijk van alle partners in het spel (Vgl. 3).

Vergelijking van in vivo en in vitro gegevens, waaruit blijkt dat osmolyten stabiliteitsveranderingen opleveren die tegengesteld zijn aan die van de cellen, terwijl eiwitcrowders het hele spectrum van effecten opleveren, wat de afhankelijkheid van de aminozuursequentie van de interacties van de opgeloste eiwitten onderstreept. De opgeloste concentraties van A2780 en E coli cellen vertonen aanzienlijke variatie in de literatuur (13), die het bereik van de foutbalken overspant.


Bijdrage aan de thermodynamica van eiwitvouwing door de vermindering van het voor water toegankelijke niet-polaire oppervlak

Artikelweergaven zijn de COUNTER-conforme som van full-text artikeldownloads sinds november 2008 (zowel PDF als HTML) bij alle instellingen en individuen. Deze statistieken worden regelmatig bijgewerkt om het gebruik in de aanloop naar de afgelopen dagen weer te geven.

Citaties zijn het aantal andere artikelen waarin dit artikel wordt geciteerd, berekend door Crossref en dagelijks bijgewerkt. Vind meer informatie over Crossref citatietellingen.

De Altmetric Attention Score is een kwantitatieve maat voor de aandacht die een onderzoeksartikel online heeft gekregen. Als u op het donutpictogram klikt, wordt een pagina op altmetric.com geladen met aanvullende details over de score en de aanwezigheid op sociale media voor het betreffende artikel. Vind meer informatie over de Altmetric Attention Score en hoe de score wordt berekend.

Opmerking: In plaats van een samenvatting is dit de eerste pagina van het artikel.


Thermodynamica van spontane eiwitvouwing: rol van enthalpieveranderingen - Biologie

Copyright © 2015 door auteur en Scientific Research Publishing Inc.

Dit werk valt onder de Creative Commons Attribution International License (CC BY).

Ontvangen 10 januari 2015 geaccepteerd 25 januari 2015 gepubliceerd 29 januari 2015

De thermodynamische hypothese van Anfinsen wordt herzien en misverstanden worden opgehelderd. Het zou eigenlijk het thermodynamische principe van eiwitvouwing moeten worden genoemd. Energielandschap is eigenlijk gewoon de wiskundige grafiek van de Gibbs-functie voor vrije energie />, een zeer hoogdimensionaal hyperoppervlak. Zonder het te weten heeft elk beeld van het vrije-energielandschap van Gibbs geen theoretische basis, inclusief de beweringen over de trechtervorm. Nieuw inzicht gegeven door nieuw verkregen analytische Gibbs vrije-energiefunctie />van eiwitvouwing afgeleid via kwantumstatistische mechanica worden besproken. Geschillen zoals target-based of cause-based wat is de vouwkracht, hydrofoob effect of hydrofiele kracht? Enkele moleculen of ensembles van moleculen die gebruikt kunnen worden voor de statistische fysica studie van eiwitvouwing, worden besproken. Klassieke observaties van de jaren 70 en 80 over globale geometrische kenmerken van inheemse structuren van bolvormige eiwitten blijken de essentie van eiwitvouwing te hebben gegrepen, maar zijn helaas grotendeels vergeten.

Eiwitvouwing, Gibbs-vrije energie, kwantumstatistiek, enkel molecuul

1.1. De tweede wet van de thermodynamica

De tweede wet van de thermodynamica stelt dat in een geïsoleerd systeem de entropie zal toenemen. Voor een spontaan proces in een systeem van constante temperatuur />, druk /> en samenstelling, stelt de equivalente verklaring van de tweede wet van de thermodynamica dat de vrije energie van Gibbs zal worden verlaagd, en bij de nieuwe evenwichtstoestand zal deze op een minimum. Dit geldt inderdaad voor elk proces of elke chemische reactie met constante temperaturen en druk [1] . De vrije energie van Gibbs heeft de vorm />, waarbij /> de interne energie is, /> de druk, /> het volume, /> de temperatuur en /> de entropie van het systeem. Zelfs />en />zijn niet uniform in het systeem, bovendien zijn ze niet goed gedefinieerd in het systeem, de beschikbare vrije energie /> zal worden verlaagd en tot het minimum worden beperkt zolang het warmtebad van het systeem een ​​goed gedefinieerde temperatuur heeft en druk en op de grens van het systeem zijn het constanten />en />respectievelijk [2] . Dit fundamentele principe was al lang bekend.

1.2. Anfinsen's thermodynamica-hypothese van eiwitvouwing

Een goed voorbeeld van het toepassen van dit fundamentele principe om experimentele resultaten naar de theorie van verder onderzoek te tillen, is Anfinsen's thermodynamische hypothese van eiwitvouwing [3]. Na vele jaren van experimenteel werk bleek dat het hervouwingsproces van ribonuclease spontaan is, vatte Anfinsen samen: "De studies naar de renaturatie van het volledig gedenatureerde ribonuclease vereisten veel ondersteunende onderzoeken om uiteindelijk de algemeenheid vast te stellen die we af en toe de 'thermodynamische hypothese' hebben genoemd. '. Deze hypothese stelt dat de driedimensionale structuur van een natuurlijk eiwit in zijn normale fysiologische milieu (oplosmiddel, pH, ionsterkte, aanwezigheid van andere componenten zoals metaalionen of prothetische groepen, temperatuur en andere) degene is waarin de Gibbs vrije energie van het hele systeem is het laagst, dat wil zeggen dat de natieve conformatie wordt bepaald door de totaliteit van de inter-atomaire interacties, en dus door de aminozuursequentie, in een bepaalde omgeving.” [3] .

Als we eenmaal weten dat eiwitvouwing een spontaan proces is, moet de thermodynamische hypothese worden opgewaardeerd naar het thermodynamisch principe. Het thermodynamische principe maakt het eiwitvouwprobleem een ​​puur natuurkundig probleem, alle biologische kennis die nodig is, is hoe de fysiologische omgeving voor een bepaald eiwit te specificeren en hoe de omgeving redelijkerwijs te vereenvoudigen voor de verdere studie.

Maar dit is tot nu toe niet erkend, in plaats daarvan wordt gedacht dat theoretische overweging bij biologische problemen zoals eiwitvouwing onpraktisch is. Toevallig, in het begin van de jaren zeventig, in dezelfde tijd dat het thermodynamische principe van eiwitvouwing door Anfinsen werd vastgesteld, deed de computer zijn intrede in het onderzoek en speelde een steeds grotere rol in het onderzoek naar eiwitvouwing. Theorie werd verwaarloosd, simulaties werden essentieel alsof het experimenten waren, maar velen kunnen niet voldoen aan de essentiële eis voor experimenten in de experimentele wetenschappen, de reproduceerbaarheid, zie [4] . Bovendien werd de theoretische achtergrondverantwoording van deze simulaties zelden in twijfel getrokken. Je kunt je afvragen dat als de toenemende computerkracht echt zou worden geleid door het principe van de thermodynamica, het mysterie van het eiwitvouwingsfenomeen vandaag de dag misschien geen echt mysterie meer zou zijn.

1.3. Redenen van het thermodynamische principe van eiwitvouwing worden verwaarloosd

Waarom werd het principe van de thermodynamica niet actief en volhardend nagestreefd?

Ten eerste denken sommigen niet dat het thermodynamische principe correct is. In [5] wordt bijvoorbeeld beweerd dat de theorie van Anfinsen lange tijd werd afgekeurd omdat "andere complexiteiten van biologische systemen, bijvoorbeeld oplosmiddelen met verschillende samenstellingen, de vouwing/ontvouwing van eiwitten kunnen beïnvloeden, de rol van een hoge diëlektrische constante van water, chaperonne geassisteerde vouwing van eiwitten en het bestaan ​​van stabiele vouwintermediairen.”

Alle hierboven genoemde redenen om het thermodynamische principe af te keuren, behoren tot het negeren dat in het thermodynamische principe van eiwitvouwing de omgeving dezelfde belangrijke rol speelt als de peptideketen van een eiwit. In feite heeft Anfinsen nooit beweerd "dat de primaire aminozuursequentie van polypeptiden alle noodzakelijke informatie bevat om hun vouwing in functionele natuurlijke eiwitten te sturen" [6]. In plaats daarvan benadrukte Anfinsen dat "in een bepaalde omgeving". Oplosmiddelen met verschillende samenstellingen, bijzondere eigenschappen van water, chaperonnes om het vouwen te vergemakkelijken, enz., zijn vormen van milieu. Globulaire eiwitten hebben bijvoorbeeld de eenvoudigste omgeving die kan worden vereenvoudigd als alleen watermoleculen die een eiwitmolecuul omringen. Voor eiwitten die chaperonnes nodig hebben om te helpen bij het vouwen, moeten chaperonne-moleculen in de omgeving verschijnen. Voor membraaneiwitten moet de omgeving worden beschreven als drie lagen, de middelste is hydrofoob en de andere twee zijn voornamelijk watermoleculen. Sommige eiwitten zouden niet vouwen in omgevingen die bepaalde vormen niet omvatten, keurt het thermodynamische principe niet af, maar de eiwitten bevinden zich niet in hun "normale fysiologische milieu". Dit is slechts één voorbeeld dat de algemeenheid van het thermodynamische principe vaak verkeerd wordt begrepen en vervolgens als verkeerd wordt beschouwd.

1.3.2. Misverstanden veroorzaakt door energielandschap "theorie"

Ten tweede, de belangrijkste reden dat het thermodynamische principe niet genoeg werd nagestreefd, is vanwege de verwarring veroorzaakt door de "theorie" van het energielandschap, zowel de EL (potentieel energielandschap) als de GEL (Gibbs energielandschap) "theorieën". Om de Gibbs vrije energie te minimaliseren zou men inderdaad een Gibbs vrije energie functie /> moeten hebben, waarbij de variabele /> een conformatie is van het eiwit />, en de parameter /> de fysiologische omgeving is waarin het eiwit vouwt. Hoewel velen hebben geprobeerd om /> af te leiden, bijvoorbeeld [7] , faalden ze allemaal.

Zonder te weten /> vinden landschaps-"theorieën" plaats, zoals de GEL-"theorie". In feite heeft de GEL “theorie” eigenlijk geen theorie, en kan in principe niets verklaren [8] . Alle formules voor het berekenen van Gibbs vrije energie zijn ad hoc, zonder enige theoretische basis. Termen zoals willekeurige energieformule, minimaal gefrustreerd principe, zijn alleen leningen van andere velden zonder discussie over rechtvaardiging, zie [8] . Vooral, hoewel eiwitten vouwen in een vaste omgeving, heeft GEL verschillende temperaturen die kunnen worden gebruikt om Gibbs-vrije energieën van verschillende conformaties te berekenen, [9] , in principe is er iets mis. Dat wil zeggen, als iemand een theorie bedenkt om een ​​natuurverschijnsel te verklaren, kan men niet iets toevoegen dat niet in het natuurverschijnsel staat.

In feite is de GEL slechts de grafiek van />, een zeer groot dimensionaal hyperoppervlak (de dimensie /> is minstens meer dan 200 voor een peptideketen met 100 residuen). Voorstanders van GEL begrijpen dit volledig, bijvoorbeeld in [10] wordt gesteld dat "In het veld van de fysische chemie wordt het energielandschap van een eiwit-oplosmiddelsysteem gedefinieerd als een energiefunctie />, waarbij />variabelen zijn specificeren van de eiwitmicroscopische toestanden". De GEL "theorie" probeert foto's te maken van het hypo-oppervlak met zeer hoge afmetingen. Natuurlijk kan niemand de remmende hoge dimensie van dit hypo-oppervlak doordringen, in een poging het te laten zien als een tweedimensionaal oppervlak, veel misleidende metaforen geven zoals "trechtervormig", meer verwarring dan begrip veroorzaken.

Dus als we weten dat />, het weergeven van de grafiek ervan alleen maar problemen oplevert, hebben we de GEL echt niet nodig. Als we niet weten wat /> is, maakt GEL "theorie" alleen ad hoc berekeningen van de Gibbs vrije energie van verschillende conformaties zonder theoretische basis en zonder consistentie. Geen wonder dat het meer misverstanden veroorzaakte dan begrip van het thermodynamische principe van eiwitvouwing.

In [1] wordt bijvoorbeeld beweerd dat het nastreven van het thermodynamische principe (vergelijkbaar met GEL) tot valkuilen leidt, en dat het thermodynamische principe niet zal helpen om het eiwitvouwprobleem op te lossen [5] , [11] .

1.3.3. Gebrek aan wiskundige training

Een van de belangrijkste redenen van GEL, in feite het thermodynamische principe, zal niet helpen bij het oplossen van het eiwitvouwprobleem, is dat de tweede wet van de thermodynamica niet kan garanderen dat de Gibbs vrije energie />een globaal minimum zal hebben [6]. Ook al hebben we geen expliciete formule, een beetje wiskundige kennis zal deze situatie helpen verduidelijken. Een lagere semi-continue functie kan bijvoorbeeld altijd zijn minimum bereiken op een compacte verzameling is een stelling in de wiskunde. Aangezien de diameter van elke conformatie uniform begrensd is, is het definitiedomein van />zeker vervat in een compacte set in een hoger dimensionale Euclidische ruimte. Het is moeilijk voor te stellen dat een energiefunctie slechter is dan een lagere semi-continue functie, daarom moet /> een globaal minimum hebben. Bovendien is recentelijk een analytische formule />voor monomere bolvormige eiwitten afgeleid via kwantumstatistieken, [12] - [15] , en deze functie is zeker continu, zie (6). In [6] is het geen goed argument om de bewering van GEL over de trechtervorm van GEL te weerleggen door te vermoeden dat er een globaal minimum bestaat.

1.3.4. Moet de inheemse structuur slechts een lokaal minimum zijn?

Een andere belangrijke reden waarom GEL niet zal helpen bij het oplossen van het eiwitvouwprobleem, is dat de oorspronkelijke structuur van een eiwit misschien slechts een lokaal minimum is, in plaats van het globale minimum aan vrije energie van Gibbs. Dit is mogelijk, maar in omstandigheden die niet in strijd zijn met de tweede wet van de thermodynamica, en zal daarom het thermodynamische principe niet ontkrachten. In dit geval zal de initiële conformatie bepalen welke minimale punten worden behaald door de oorspronkelijke structuur. We zouden meer moeten weten over de conformatie van de nieuw gesynthetiseerde polypeptideketen in een cel. Is het altijd dezelfde conformatie of varieert het met elk individueel molecuul? Als het de eerste is, kan het starten met andere initiële conformaties leiden tot lokale of globale minima die verschillen van de oorspronkelijke structuur. Als het de laatste is, dan is de oorspronkelijke structuur misschien echt het unieke globale minimum, aangezien het starten van alle initiële conformaties tot dezelfde oorspronkelijke structuur leidt. Afgaande op de experimentresultaten van ribonucleasedenaturatie/renaturatie, heeft gedenatureerd ribonuclease nog steeds ongeveer 1% biologische functie. Aangezien er 105 patronen zijn om de 4 disulfidebindingen te vervullen, kunnen we daaruit afleiden dat elk van de 105 patronen misschien hetzelfde percentage heeft in de gedenatureerde toestand. Toch vouwen al deze initiële conformaties zich opnieuw tot dezelfde natuurlijke structuur waarin het eiwit 100% biologische functie heeft. We kunnen dus afleiden dat voor ribonuclease de /> echt een uniek globaal minimum heeft. Aangezien dit de volledige kennis was die Anfinsen kende, veronderstelde hij dat de "laagste" Gibbs vrije energie. Gezien een bepaalde initiële conformatie leidt tot een bepaalde minimiser, lokaal of globaal, zal het wijzigen van het thermodynamische principe om een ​​lokaal minimum toe te laten het principe niet schaden.

1.3.5. Verkeerde omgeving

Een echt legitieme bezorgdheid over het thermodynamische principe wordt beargumenteerd in [16]. Het zegt dat

"Volgens deze hypothese, als we /> definiëren als de Gibbs-vrije energie G van een gevouwen eiwit in zijn oorspronkelijke staat N, /> is het globale minimum van de functionele vrije energie van het eiwit />. /> kan echter alleen worden bereikt als N de huidige evenwichtstoestand is voor de oorspronkelijke thermodynamische omstandigheden />. We beschrijven de voorwaarde set />als />, waarbij />en />de evenwichtsdruk en temperatuur zijn voor een eiwit in een toestand X met de conformatie />. We gaan uit van constante T en P en gebruiken de enige microscopische oplosmiddelsamenstelling om de huidige omstandigheden voor X te definiëren. De thermodynamische hypothese van Anfinsen lijkt daarom logisch. Inderdaad, uit de tweede wet (bij constante T en P), zou een vrije energieverandering /> moeten worden verkregen voor elke thermodynamische route om de niet-evenwichtstoestand X te ontspannen tot de gevouwen natuurlijke evenwichtstoestand N met de respectieve vrije energieën />en />. /> en /> zijn respectievelijk de natieve conformatie en de oplosmiddelsamenstelling. De mogelijke valkuil is dat /> een niet-evenwichtsvrije energie is omdat /> niet in evenwicht is voor />. De echte verandering in vrije energie die moet worden overwogen in een pad waar een tussentoestand X voldoende tijd heeft om evenwicht te bereiken, is />, waarbij /> (We denken dat dit een fout is voor />, anders is />) het evenwichtsvrije energie voor />. De thermodynamische hypothese van Anfinsen kan daarom alleen met een goede waarschijnlijkheid gelden als />. Gevallen waarin /> een diep minimum is met /> kunnen echter niet worden uitgesloten, wat kan leiden tot />.”

Het punt is dat de oplosmiddelsamenstelling /> echt varieert met de conformatie />, dwz er is geen gemeenschappelijke oplosmiddelsamenstelling />, zie de volgende paragraaf over de formule />, waarbij /> de eerste waterlaag van de conformatie />en maakt deel uit van het thermodynamische systeem />voor elke conformatie />, en />is echt de Gibbs vrije energie van het thermodynamische systeem />. Wat het evenwicht betreft, moet het eiwitvouwproces worden beschouwd als een quasi-statisch proces, en zoals eerder vermeld, hebben we alleen nodig dat het warmtebad een constante temperatuur /> en druk /> heeft, en in dit geval is de tweede wet van de thermodynamica dat de beschikbare energie /> zijn minima krijgt zoals in het begin vermeld volgens [2] .

Nadat we deze vermoedens over het thermodynamica-principe hebben verduidelijkt, zullen we demonstreren wat de /> is en kijken naar een nieuw inzicht dat het geeft.

2. De formule />

We zullen de afleiding van />, die werd gedaan in [12] - [15] , niet geven met hetzelfde idee, maar een steeds beter begrip van de kwantumfysica. We concentreren ons op de rationals die voortkomen uit het begrip van het thermodynamische principe van eiwitvouwing.

Ons begrip van het thermodynamische principe is dat het een holistische visie benadrukt, het vereist een enkele molecuulmethode en kwantumstatistieken in plaats van klassieke statistieken om de Gibbs vrije-energieformule /> af te leiden.

2.1. De functie />Kan geen som zijn van lokale bijdragen

In tegenstelling tot de potentiële energiefunctie, is de Gibbs-vrije-energiefunctie, of, de GEL, niet paarsgewijs additief zoals is aangegeven in [6]. In feite kunnen we niet eerst lokale bijdragen overwegen en ze vervolgens optellen om de Gibbs gratis energie te krijgen. Dit wordt benadrukt door Anfinsen in de verklaring "dat wil zeggen dat de natieve conformatie wordt bepaald door de totaliteit van de inter-atomaire interacties, en dus door de aminozuursequentie, in een bepaalde omgeving." [3] .

Zodat wanneer we /> proberen af ​​te leiden volgens het eerste principe, we /> niet in verschillende delen kunnen verdelen, elk deel kunnen beschouwen en Gibbs vrije energieën van al deze delen kunnen optellen. In feite kunnen we zelfs geen grofkorrelig conformatiemodel gebruiken om te proberen /> af te leiden, omdat de bijdrage van een atoom aan het geheel niet kan worden gescheiden. Daarom is een conformatie voor ons de coördinaten van de atomaire centra van alle atomen /> van het gegeven eiwit />, te weten />. Voor eiwitten met meer dan één polypeptideketen moeten alle ketens samen worden beschouwd, d.w.z. laat />, />, />, dan />.

2.2. Behandeling met één molecuul is nodig

Zoals elke computersimulatie van eiwitvouwing, beschrijven we slechts één eiwitmolecuul in verschillende conformaties />, niet een ensemble van (dezelfde) eiwitmoleculen die elk een conformatie aannemen. Om /> af te leiden, is het de natuur dat men de statistische fysica moet overnemen. Bij het toepassen van statistiek denkt men natuurlijk dat er veel kopieën van hetzelfde object, zoals een eiwitmolecuul, moeten zijn om een ​​ensemble te vormen. Dit werd door velen nagestreefd, zie bijvoorbeeld [7] , waar integraties op alle moleculaire conformaties van het ensemble behalve één /> werden uitgevoerd om /> te krijgen. Met een niet integreerbare integrand (in feite is het in exponentiële vorm) en zonder duidelijke afbakening van het integrale domein, is de verkregen formule /> een gecompliceerde onbekende functie begraven in een multidimensionale integraal. Erger nog, />is zelfs niet de Gibbs vrije energie. Niettemin noemden de auteurs van [7] het de effectieve energie en gebruikten het op veel plaatsen alsof het het thermodynamische principe volgt.Dit is een perfect voorbeeld van vertrekken vanuit het thermodynamische principe en eindigen met metaforen en eindeloze computersimulaties om theoretische armoede te verdoezelen. In navolging van deze trend zal het probleem van het vouwen van eiwitten nooit worden opgelost.

Aangezien een van de taken van het eiwitvouwprobleem is om de oorspronkelijke structuur van het individuele eiwit te achterhalen, maar in een ensemble van moleculen, alle beschikbare methoden in feite de structuren van het individuele molecuul verwaarlozen, kunnen we de ensemble-methode niet gebruiken. Daarom moeten we een enkel molecuul /> nemen, een willekeurige conformatie beschouwen ervan, en om een ​​thermodynamisch systeem te bedenken die op maat is gemaakt voor het exterieur en bevat de directe omgeving van. Eindelijk, de Gibbs gratis energie is de Gibbs vrije energie van het thermodynamische systeem.

2.3. Klassieke of kwantumstatistieken?

We moeten uitzoeken hoe we statistieken kunnen maken over dit thermodynamische systeem. Zowel klassieke als kwantumstatistieken werden geprobeerd, zie [12] , waarbij het klassieke resultaat de volumebijdrage in formule (6) mist. Bedenk dat klassieke mechanica niet geschikt is om de fysica van objecten van moleculen en zelfs macromoleculen te beschrijven, we kiezen voor kwantumstatistieken. Bovendien zullen kwantumstatistieken ons in staat stellen verder theoretisch onderzoek te doen naar eiwitvouwing, als we de elektronische dichtheidsfunctie kunnen hanteren die is gedefinieerd in [17] , wat we momenteel niet kunnen doen. Deze functie bevat de oorsprong van onze classificatie van hydrofobiciteitsniveaus in subsectie 2.6.

2.4. Het belang van het milieu

Ons op maat gemaakte thermodynamisch systeem bevat in feite de directe omgeving van de conformatie. Biologische kennis komt hier om ons te helpen bij het beschrijven en maken van noodzakelijke en rationale vereenvoudigingen van deze directe omgeving. Het is bijvoorbeeld bekend van bolvormige eiwitten, we kunnen eenvoudig aannemen dat in de fysiologische toestand alleen watermoleculen die een conformatie direct omringen. Voor membraaneiwitten moet de directe omgeving minstens drie parallelle lagen hebben, watermoleculen in de buitenste twee lagen en het midden is hydrofoob. Voor eiwitten die de hulp van chaperonnes nodig hebben om te vouwen, moeten deze chaperonnes zich in de directe omgeving van de conformatie bevinden. Dit is ook de holistische visie, zonder de chaperonnes bevindt het eiwit zich in een verkeerde omgeving en zal het ofwel vouwen naar een andere structuur, of helemaal geen structuur, wat betekent dat veel verschillende conformaties het minimum aan Gibbs vrije energie bereiken.

Omdat we, behalve voor monomere bolvormige eiwitten, niet hebben ontdekt hoe we met de omgeving moeten omgaan, onze huidige functie is alleen voor monomere bolvormige eiwitten.

2.5. Het thermodynamisch systeem voor monomere bolvormige eiwitten

Omdat alleen bolvormige eiwitten ons in staat stellen hun fysiologische omgeving te vereenvoudigen als bestaande uit alleen watermoleculen, zullen we hier alleen werken aan monomere bolvormige eiwitten. Een conformatie van een polymeer bolvormig eiwit is,. Theoretisch is onze functie kan zonder enige theoretische moeilijkheid worden gegeneraliseerd naar polymere bolvormige eiwitten. Maar om het toe te passen, zullen we het dockingprobleem onder ogen zien, d.w.z. overwegen: en de relatieve posities tussen's. Dit is voor nu te moeilijk.

Ten eerste, een conformatie leeft per definitie in, maar de tekstboekdefinitie van een thermodynamisch systeem is dat het een regio is in, zie bijvoorbeeld [18] . Maken, wij overwegen, waar

is een stevige bal met een straal en gecentreerd op. in wezen de samen met zijn eerste laag watermoleculen zal onze. Hier namen we aan dat elk atoom's vorm is een stevige bal met een van der Waals-straal. Hoewel de vorm van elk atoom in wordt goed gedefinieerd door de theorie van atomen in moleculen [17] , wat ons hier betreft de algemene vorm van de structuur. De afsnijding van elektronendichtheid in [17] , geeft de algemene vorm van een moleculaire structuur die lijkt op, een stel overlappende ballen. Bovendien is de grens van de afsnijding is bijna hetzelfde als het moleculaire oppervlak die werd gedefinieerd door Richards in 1977 [19] en in 1992 en 1993, [20] en [21] bleek een geschikter grensoppervlak te zijn van dan andere oppervlakken.

Om de formule uit te leggen:, we moeten beschrijven in detail.

Over het algemeen is elk gesloten oppervlak (verbonden, begrensd en heeft geen grens, bijvoorbeeld een bol) zal verdelen in drie delen,

(1)

waar is een begrensd domein (verbonden open verzameling) en een onbegrensd domein, betekent de grens van.

Een bol met een straal rollen op het grensvlak van zal een moleculair oppervlak produceren [19] . Laten de diameter van een watermolecuul zijn en het moleculaire oppervlak aangeven als. Indien is aangesloten, dan kunnen we gebruiken in 1). Indien heeft meerdere aangesloten componenten, , zoals dat is de grootste component, d.w.z. alle andere componenten van zijn vervat in (dit is het geval dat) heeft gaatjes, , elk is groot genoeg om een ​​watermolecuul te bevatten), en geeft dan aan: en. Zo hebben we altijd

(2)

(3)

wees de eerste hydratatieschaal rondom. Dan het op maat gemaakte thermodynamische systeem voor het exterieur is

(4)

Elke vrije-energieformule van Gibbs moet niet alleen een vrij algemene vorm hebben voor alle eiwitten, of op zijn minst een klasse eiwitten zoals monomere bolvormige eiwitten, maar moet ook verschillende eiwitten kunnen onderscheiden. Dat betekent dat als en zijn twee verschillende eiwitten met hetzelfde aantal atomen, zeg maar. dan zelfs verschijnt tegelijkertijd als conformaties van beide en, en zijn in geen enkel opzicht identiek buurt van. In het bijzonder, zelfs en dezelfde minimumwaarden hebben, en zouden verschillende inheemse structuren moeten hebben, als ze al inheemse structuren hebben.

Daarom moeten we een manier vinden om eiwitten te onderscheiden aan de hand van hun peptideketens. De moeilijkste taak is dat gegeven een peptideketen, laten het aantal aminozuren zijn verschijnt in, schud het aminozuurin de buurt zullen we hebben verschillende aminozuursequenties, de formule moet deze allemaal kunnen onderscheiden peptide ketens. Er moet bijvoorbeeld verschillende minimaliseringsproblemen in (9), hoewel de minimisers voor sommige ervan licht kunnen verschillen.

Hiertoe verdelen we atomen in een eiwit volgens hun hydrofobiciteitsniveaus. Atomen in een eiwitmolecuul komen van nature voor in atoomgroepen of groepen die verschillende fysisch-chemische eigenschappen hebben. Een van deze eigenschappen is dat de elektronische ladingsverdelingen de neiging veroorzaken om waterstofbruggen te vormen, hetzij met andere groepen (intramoleculair) of met andere moleculen in de omgeving (intermoleculair). Dienovereenkomstig kunnen we deze atoomgroepen of groepen verdelen in verschillende niveaus van hydrofobiciteit, van de meest hydrofobe (kan geen waterstofbinding vormen) tot de meest hydrofiele, laten we zeggen dat er niveaus,. Dan kunnen we een atoom toewijzen in één hydrofoob niveau indien behoort tot een atoom groep. We mogen bijvoorbeeld aannemen dat de classificatie is zoals in [22] , er zijn klassen, C, O/N, O ? , N + , S. Anders dan in [22] , classificeren we ook elk waterstofatoom in een van de hydrofobiciteitsniveau groepen. Merk op dat deze classificatie onafhankelijk is van conformaties, het hangt alleen af ​​van de peptideketen.

Voor elke compacte (gesloten en begrensde) set, laten de afstand tussen het punt zijn en de subset. Definieer compacte sets, , dan. Definieer ondergronden in,

(5)

waar is de reeks punten die behoren tot maar behoren niet tot.

Naar elk hydrofoob niveau, er is een chemisch potentieel, zodat een watermolecuul dat raakt krijgt een Gibbs gratis energie. Evenzo is er een chemisch potentieel voor elektronen binnen. Laten het gemiddelde aantal watermoleculen zijn dat elkaar tegelijkertijd kan raken in een eenheidsgebied, dan zal de chemische potentiaal zijn per oppervlakte-eenheid van. Bovendien, aangezien de kromming van is uniform begrensd voor alle conformaties,'s zijn niet afhankelijk van conformaties.

2.7. De Formule

Laten het volume zijn van en de oppervlakte van een oppervlak. Nu kunnen we de analytische Gibbs-formule voor vrije energie schrijven.

Stelling 1 Let een monomeer bolvormig eiwit zijn met atomen en een conformatie zijn. Laten zijn de elektronische ladingen in de kern van.

(6)

In [12] - [15] , krijgt de kwantumstatistische afleiding eerst een tussenformule, die veel bekend is maar met een nieuwe betekenis voor:

(7)

waar en’s zijn gemiddelde aantallen elektronen in en watermoleculen die elkaar raken. Bovendien is er een zoals dat dus definieer. Gebruik makend van en de volume-ontleding

(8)

Met theoretisch vastgesteldeab initio structuurvoorspelling wordt niet alleen mogelijk, maar ook eenvoudig. Het is een puur wiskundig probleem van het zoeken naar de minimalizers van. Dat wil zeggen, laten we de oorspronkelijke structuur zijn, dan

(9)

Of, voor het geval dat slechts een lokale minimiser is, moet deze voldoen aan:

(10)

Zoals eerder besproken, in deze situatie, initiële conformatie is belangrijk. Als de biologische kennis inclusief de conformatie van de ontluikende peptideketen is, moeten we die gebruiken.

Om (9) op te lossen is het niet nodig om landschappen te doorzoeken, zoals dat zo belangrijk is in de GEL "theorie" [9] . Gewoon de . volgen (de negatieve gradiënt van Bij) van elke initiële conformatie tot, en is een klein positief getal. Als de GEL echt trechtervormig is, zal de oorspronkelijke structuur uiteindelijk worden bereikt door de snelst dalende methode van deze klassieke Newton.

Wanneer de oorspronkelijke structuur alleen een lokaal minimum mag aannemen in plaats van een globaal, moeten we verschillende initiële conforms proberen, om zoveel mogelijk lokale minimisers te krijgen (zoals dat) volgens de snelst dalende methode van Newton. De oorspronkelijke structuur moet een van de's. Andere informatie is nodig om te bepalen welke is.

Natuurlijk kunnen we een andere reeks variabelen gebruiken, d.w.z. de tweevlakshoeken, inclusief alle routeerbare tweevlakshoeken, in hoofdketen of zijketens. Tweevlakshoeken die overeenkomen met een covalente binding in een Bunsen-ring is een voorbeeld van een niet-draaibare tweevlakshoek.

In feite zijn de tweevlakshoeken de meest efficiënte variabelen bij het oplossen van (9) en (10). Voor de expliciete afgeleide formules van, zie [23] en [13] .

3.2. Het vouwproces begrijpen

theoretisch afgeleid kan verschillende verschijnselen in het vouwproces verklaren. Bijvoorbeeld, aangezien de vouwkracht isd.w.z. het natuurlijke vouwproces zal de snelste daling van Newton volgen

pad, de initiële conformatie bepaalt het pad van het vouwen. Om de vorm van GEL te testen, kan men zoveel mogelijk initiële conformaties selecteren en de snelst dalende methode toepassen om een ​​oplossing van (10) te vinden, d.w.z. een conformatie zoals dat. Als alle initiële conformaties tot dezelfde oplossing leiden, dan is de landscape GEL echt trechtervormig. Als we veel verschillende krijgen's, welke de oorspronkelijke structuur is, moet verder worden besproken met meer informatie. Maar in dit geval, als de conformatie van de ontluikende peptideketen altijd hetzelfde is, hebben we nog steeds een enkele vouwroute en kunnen we zelfs een klassiek tweefasenvouwfenomeen waarnemen.

Overweeg nu een ensemble van conformaties van hetzelfde eiwit,. Deze ensemble-case is meer bekend en is in feite het enige thermodynamische systeem dat tot nu toe in de literatuur over eiwitvouwing is verschenen. Verschijnselen van enkelvoudige moleculen, zoals de vorm van de oorspronkelijke structuur, kunnen nooit uit een dergelijk ensemblesysteem worden afgeleid. In plaats daarvan zou de zorg moeten worden geconcentreerd op het kennen van de collectieve fenomenen zoals vouwsnelheid

en vouwtijd, enz. Dan moeten we inderdaad rekening houden met de verdeling. De tweede wet van de thermodynamica geeft bijvoorbeeld aan dat er een verdeling is zodanig dat wanneer de eiwitten volledig functioneren, voor elke distributie, het zal zijn

(11)

waar is de Gibbs vrije energie van het ensemble onder distributie. Het probleem is dat niemand het weet, zoals Ben-Naim toegaf in [24]. Een suggestie is dat we toepassen en probeer de Boltzmann-distributie

(12)

Het rationele is dat elke conformatie met zal veel kleiner zijn,

dus minder kans om in de volwaardige staat van het ensemble te verschijnen. Dit is natuurlijk slechts een vermoeden en het is niet zo belangrijk om te weten, althans niet als een bewering in [24]: “Als men deze verdeling kende, dan zou men kunnen zeggen welke conformaties waarschijnlijker zijn dan de andere onder de gegeven omgeving.” In feite weten we nu allemaal dat in een fysiologische situatie de oorspronkelijke structuur "waarschijnlijker is dan de andere in de gegeven omgeving", maar we kennen de vorm van de oorspronkelijke structuur nog steeds niet. Dus om het eiwitvouwprobleem op te lossen, tenminste voor de voorspelling van de natieve structuur vanuit de kennis van de aminozuursequentie, moeten we weten wat en los (9) of (10) op met welke wiskundige methode dan ook.

In [6] wordt de vouwkracht geclaimd als. In [6] wordt ook beweerd dat het zoeken naar de minimiser in GEL, zoals in (9), op doelen is gebaseerd en dat het identificeren van de vouwkracht op oorzaken is gebaseerd. In feite zijn target-based en cause-based slechts kunstmatige onderscheidingen. We zien dat we bij het oplossen van (9) geen doel hebben om subjectief te benaderen en als we de snelste beslissingsmethode gebruiken om de minimiser te vinden, zijn we echt op oorzaken gebaseerd, omdat we expliciet de kracht gebruiken.

3.4. Denaturatie en hervouwen begrijpen

Indien theoretisch afgeleid staat bekend om elke specifieke omgevingomgevingen verschillen bijvoorbeeld alleen in temperatuurwaarden, kan de denaturatie en eiwithervouwing verklaren door veranderende omgevingen. De omgeving veranderen zeggen, de oorspronkelijke structuur van zal niet langer een minimalizer zijn van in probleem (9) of (10), dus is instabiel in. Bovendien,. Volgens dezelfde tweede wet van de thermodynamica, of thermodynamisch principe, zal een minimalisering van afdwingen, resulterend in verschillende andere minimisers dan. Dit is een theoretische verklaring van denaturatie. Voor bepaalde soorten eiwitten, wanneer de omgeving verandert terug, of soortgelijke, gebeurt het opnieuw vouwen volgens dezelfde procedures als in probleem (9).

Verder kunnen verschillende thermodynamische functies, zoals de entropie, kan worden verkregen door de familie. Bijvoorbeeld,

(13)

3.5. Hydrofoob, hydrofiel, wat is de vouwkracht?

Er is een verhit debat in [6] over welke de belangrijkste vouwkracht, hydrofoob effect of hydrofiele kracht is? Zodra we het weten, bewegend langs de krachtrichting, kleiner zal worden. Het kwalitatieve karakter van is dat als de klas? is hydrofoob, dan, en als is hydrofiel, dan. Zo verminderen hydrofobe gebieden (hydrofoob effect) of het vergroten van hydrofiele gebieden (hydrofiele kracht?) zal de vrije energie van Gibbs verminderen.

In termen van de kracht, is de situatie veel gecompliceerder. Beschouw het geval van en, zij dragen bij aan een kracht die duwt naar een nieuwe conformatie zoals dat en. Dit verklaart goed dat zowel het hydrofobe effect als de hydrofiele kracht hun rol spelen bij het verminderen van de vrije energie van Gibbs. Maar dit zijn slechts twee termen in, zullen de waarden van andere termen uiteindelijk het teken bepalen van. En als, of, wat zal er gebeuren? We moeten dus een holistische kijk op de vouwkracht aannemen, zowel het hydrofobe effect als de hydrofiele kracht spelen hun rol, die domineert, hangt af van concrete omstandigheden.

Om de bespreking van hydrofobe en hydrofiele effecten (of kracht) te vereenvoudigen, beschouwen we de eenvoudigste classificatie van hydrofobiciteitsniveaus, d.w.z. zijn er alleen hydrofobe en hydrofiele atoomgroepen. noem als de hydrofobe klasse, als de hydrofiele klasse. In dit geval hebben we

(14)

Dus voor vast, vergroten is gelijk aan verminderen, geen onderscheid tussen hydrofoob effect en hydrofiele kracht. In dit geval,

(15)

Sinds, de combinatie van hydrofoob effect en hydrofiele kracht is het effect van het verminderen van het hydrofobe gebied;. In [25] een simulatie van het verminderen van alleen werd uitgevoerd, is het resultaat zeer interessant. Secundaire structuren, zoals: helices, strengen, bochten, en waterstofbruggen verschenen in verkregen conformaties met statistische significantie [25]. Houd er rekening mee dat bij het verminderen van, niets-

ing over secundaire structuur en waterstofbinding werden overwogen. Geen berekening van de tweevlakshoeken. Geen testen van posities van de donor- en acceptorgroepen, laat staan ​​​​de bedoeling om ze dichter bij elkaar te brengen om een ​​waterstofbrug te vormen. Toch verschenen secundaire structuren en waterstofbruggen in statistische significantie. Vóór deze simulatie werd erkend dat waterstofbinding expliciet gemodelleerd moet worden voor helixvorming en paarsgewijze simulatie zonder te specificeren dat waterstofbinding geen secundaire structuren kan produceren [26].

3.6. Ga door met een klassieke globale weergave

Indien, dan in de versie (15) is een realisatie van een klassiek globaal beeld van de kenmerken van de globale geometrie van natieve structuren van bolvormige eiwitten. Deze kenmerken zijn: 1) de oorspronkelijke structuur heeft een kleiner volume 2) de oorspronkelijke structuur heeft een kleiner oppervlak 3) de oorspronkelijke structuur heeft een betere hydrofobe kern of een kleiner hydrofoob oppervlak, [19] , [21] en [27] - [31] . Deze belangrijke waarnemingen werden na 1990 vergeten, men was meer geïnteresseerd in computersimulaties op basis van krachtveld, GEL, EL, enz. Op basis van deze kenmerken werd een fenomenologisch model gevormd met precies de vorm van (15) met drie positieve coëfficiënten, dus beweren dat het gelijktijdig verminderen van volume, oppervlakte en hydrofoob gebied ons uiteindelijk naar de oorspronkelijke structuur zal leiden, zie [32] en [25] . Bovendien zijn de eerste twee termen van formule (15) de formule van de Gibbs vrije energie van een holte in water, de twee coëfficiënten zijn druk en oppervlaktespanning [18]. Eerste principe en fenomenologie, beide afgeleid van dezelfde Gibbs-formule voor vrije energie, kan het gewoon toeval zijn?

De redenen waarom de thermodynamische hypothese van Anfinsen gedurende vier decennia is afgedaan als leidend tot valkuilen, als afgekeurd, als helemaal niet belangrijk, worden geanalyseerd en verduidelijkt. Ze zijn te wijten aan misverstanden en onvermogen bij het afleiden van een Gibbs vrije-energieformule van eiwitvouwing. De misverstanden komen vooral voort uit het verwaarlozen van de rol van de omgeving die Anfinsen zo benadrukte. Het onvermogen om een ​​Gibbs-vrije-energiefunctie van eiwitvouwing af te leiden, komt van het gebruik van een ensemble van conformaties die de driedimensionale vorm van de individuele conformatie verwaarloosden. Het negeren van het belang kwam samen met verschillende computersimulaties zonder theoretische bespreking van hun theoretische basis.Nieuw afgeleide Gibbs-functie voor vrije energie wordt geïntroduceerd, worden de rollen ervan bij het voorspellen van de eiwitstructuur en bij het verklaren van het vouwproces besproken. De afleiding van past kwantumstatistieken toe op thermodynamische systemen op maat gemaakt voor een enkele conformatie en zijn directe omgeving, volgens Anfinsens oorspronkelijke oriëntatie op één molecuul.


Thermodynamica van de door GTP-GDP bediende conformatieschakelaar van Selenocysteïne-specifieke vertaalfactor SelB

De onderstaande vragen zijn gebaseerd op gegevens, grafieken en cijfers uit het volgende artikel:

Thermodynamica van de door GTP-GDP bediende conformatieschakelaar van selenocysteïne-specifieke vertaalfactor SelB. Alena Paleskava, Andrey L. Konevega en Marina V. Rodnina. The Journal of Biological Chemistrja, 287, 27906-27912 (2012) . doi: 10.1074/jbc.M112.366120 .

Achtergrond/revisievragen:

A. Kijkend naar de calorimetriecellen hierboven, welke componenten zouden hoogstwaarschijnlijk in de referentiecel, monstercellen en spuit worden geplaatst?

Antwoord: referentiecel bevat bufferoplossing, monstercel bevat eiwit (waarschijnlijk moeilijk voldoende te concentreren om in de spuit te plaatsen) en de spuit bevat het GXP-nucleotide.

B. ITC is erg gevoelig en kan minieme enthalpieveranderingen detecteren wanneer een titrant in de referentiecel wordt geïnjecteerd. Noem mogelijke fysische en chemische processen die kunnen leiden tot enthalpieveranderingen bij injectie van een titrant in de controlecel.

antwoord: verdunning, protonatieveranderingen, ligandbinding, conformationele veranderingen en chemische reacties.

C. Wat is het meest logische controle-experiment dat u zou uitvoeren? Hoe zou u de experimenteel afgeleide enthalpieveranderingen corrigeren voor die in het controlegeval?

antwoord: injecteer ligand (GTP, GDP, enz.) in de monstercel die alleen bufferoplossing bevat (die ook in de referentiecel wordt geplaatst. Trek de DH voor de verdunningen af ​​van de DH voor de experimentele DHs.

NS. Beschouw het volgende eenvoudige evenwicht voor de interactie van een ligand L met een macromolecuul M, gekenmerkt door de dissociatieconstante Kd zoals hieronder weergegeven.

waarbij M de concentratie van het vrije macromolecuul is, L de concentratie van het vrije ligand is en ML de concentratie van het complex is. Voor dissocieerbare bindingsinteracties is Kd net zo belangrijk als pka ​​voor een ioniseerbaar proton van een zuur. Een vergelijking voor ML als functie van MO, L en KNS wordt hierboven getoond. Kd-waarden worden typisch bepaald uit het bindingsexperiment wanneer MO, de totale hoeveelheid M is veel minder dan vrije L. Teken uit de vergelijking van ML hierboven een grafiek van ML vs L op de onderstaande assen.

e. Vereenvoudig de vergelijking voor ML als functie van L voor elk van de volgende voorwaarden:

De evenwichtsconstante, Keq = 1/Kd, is gerelateerd aan de standaard vrije energieverandering, D G 0 met behulp van de volgende vergelijking:

F. Wat is de D G bij evenwicht? Leid met behulp van deze informatie een vergelijking af die de relaties tussen D G 0 en Keq evenals Kd geeft.

Vragen op basis van artikel:

1. Beantwoord de volgende vragen op basis van de ITC-thermogrammen voor binding van GTP aan SelB (A) en GDP aan SelB (B) hieronder.

A. De bovenstaande titratiecurven lijken sigmoïdaal in tegenstelling tot de hyperbolische verzadigingsbindingscurve die u tekende voor een eenvoudig M + L-bindingsevenwicht. Sigmoidal ML vs L-bindingsgrafieken worden vaak geassocieerd met coöperatieve bindingsinteracties. Waarom zijn deze plots NIET hyperbolisch, zelfs als de enthalpieveranderingen het best kunnen worden gemodelleerd door een eenvoudige, niet-coöperatieve binding van M en L met een stoichiometrie van 1?

Antwoord: De onderste grafieken hierboven tonen signaalverandering (enthalpieverandering) als een functie van molverhouding, NIET vrij ligand. Met behulp van de Kd afgeleid van de theoretische fit, en de werkelijke totale concentraties van SelB en GXP, kon de hoeveelheid ML en vrij GXP worden berekend. Een grafiek van enthalpieverandering versus vrije GXP zou hyperbolisch zijn.

B. Is de binding exotherm of endotherm? Wat is het teken van DH?

Antwoord: exotherm negatief

B. Welke gaat verder met een lagere dissociatieconstante (Kd)?

Antwoord: De binding van GTP aangezien bij een molaire verhouding van 1:1 van SelB en GTP, de signaalverandering (enthalpie) de helft is van de maximale verandering, wat wijst op een hoge concentratie SelB:GTP-complex dan in B.

C. Ervan uitgaande dat de binding de voorkeur heeft, welke heeft dan een meer negatieve D G 0 ? Ga uit van gelijke concentraties SelB in de monstercel. Welke heeft de voorkeur onder standaardconditie?

Antwoord: De binding van GTP want hoe hoger de Keq, hoe lager de Kd, hoe negatiever de D G 0 .

NS. De verandering in Gibbs-vrije energie is ook gerelateerd aan de verandering in enthalpie en entropie, zoals weergegeven in de onderstaande vergelijking:

Kun je uit eenvoudige inspectie van de bovenstaande curven afleiden of D S 0 is <, = of >? Leg uit.

Antwoord: Aangezien binding plaatsvindt onder de experimentele omstandigheden, laten we aannemen dat Keq > 1 en Kd < 1 (hoewel dit misschien niet waar zou zijn als de concentraties van SelB en GXP in het experiment voldoende hoog genoeg waren om een ​​Keq < 1) te overwinnen. Vandaar D G 0 <0. Aangezien binding exotherm is, D H 0 < 0. Dat impliceert dat -T D S 0 ofwel negatief kan zijn (dus D S 0 is positief) of dat T D S 0 positief is (dus D S 0 is negatief), maar niet positief genoeg om de reactie ongunstig te maken.

De ITC-thermogrammen die de binding van GTP (A) en twee analogen van GTP, GTP'947S (B), GDPNP (C), vergelijken, worden hieronder weergegeven

NS. Wederom uitgaande van een vergelijkbare concentratie van SelB in monster C, vergelijk de Kds voor de interactie van GTP'947S en GDPN met SelB.

Antwoord: De reactie van GTP'947S is in grotere mate gevorderd bij een 1:1 stoichiometrie dan die van GDPN op SelB. Vandaar dat GTP'947S een lagere Kd heeft om SelB te binden.

e. De structuren van GTP en de twee analogen worden hieronder getoond. Geeft een reden aan waarom de onderzoekers de analogen in hun studies hebben gebruikt.

Antwoord: Deze zullen waarschijnlijk hydrolyse ondergaan bij de gamma P, die import is, omdat ze een eiwit bestuderen dat ofwel GTP ofwel GDP kan binden en dat GTPase-activiteit heeft. De S in de GTP'947S-analoog is minder elektronegatief dan O en daarom is het minder waarschijnlijk dat pi-gebonden elektronen in de dubbele binding naar de zich ontwikkelende overgangstoestand worden getrokken om een ​​oxyanion vijfwaardig tussenproduct te vormen. Evenzo is het minder waarschijnlijk dat de P-N-binding in de andere analoog wordt gesplitst, omdat de vertrekkende groep met een negatieve lading op de minder elektronegatieve N minder stabiel is.

F. De ITC-thermogrammen passen in een theoretisch model voor M- en L-binding met een stoichiometrie van één. Uit deze data fit kan Kd worden bepaald. Hoe zou je de D S 0 berekenen voor de interactie van SelB en GXP?

Antwoord: Als je Kd kent, kun je D G 0 bepalen omdat het gelijk is aan -RTlnKeq = RTlnKd. U kunt D H 0 direct uit het experiment bepalen. Daarom kun je D S 0 verkrijgen uit de vergelijking D G 0 = D H 0 -T D S 0 .

De thermodynamische parameters van SelB-binding aan guanine-nucleotiden bij verschillende temperaturen worden hieronder weergegeven.

G. Bevestigen ze uw antwoorden op b en d hierboven?

2. Om het effect van verandering in protoneringstoestand op binding van SelB en GXP te bepalen, werd het effect van verschillende bufferoplossingen op de bindingsenthalpie van SelB-GTP bestudeerd.

Figuur A hieronder toont de bindingsenthalpie van GTP aan SelB in fosfaatbuffer (●), HEPES-buffer (○) en Tris-buffer (■) als functie van de temperatuur.

A. Elke verandering in enthalpie die gepaard gaat met protonafgifte of opname bij binding van een macromolecuul aan een ligand zou worden beïnvloed door de verandering in enthalpie bij binding van protonen aan de bufferbase. Om het effect van bufferionisatie-enthalpie te onderzoeken, heeft elk van de buffers een andere D Hion dat is de enthalpieverandering bij ionisatie van een proton uit het bufferzuur. Noem twee feiten die kenmerkend zijn voor de grafieken.

Antwoord: Hier zijn er twee - de grafieken zijn allemaal parallel en de DH van binding van SelB en GXP hangt af van de temperatuur

B. Figuur B hierboven toont de afhankelijkheid van bindingsenthalpie van SelB-GTP interactie (y-as) op de buffer proton-ionisatie enthalpie bij 10 C (●), 15 C (○), 20 C (' 9632), en 25 °C (□) voor 4 verschillende buffers waarvan de ionisatie-enthalpie bekend is bij verschillende temperaturen (x-as). Wat zijn de eenheden voor de helling van de lijn? Wat is de werkelijke helling? Wat zegt dit jou? Wat zegt het onderscheppen van de y? Waarom wordt het y-snijpunt in deze studie gebruikt?

Antwoord: zonder eenheid. De helling van de grafiek levert het netto aantal protonen op dat is gekoppeld aan de bindingsreactie, 0,2𔂾.3 voor de drie gebruikte buffers, en het Y-snijpunt levert de biochemische bindingsenthalpieverandering op bij de gegeven temperatuur, ΔH . De laatste vertegenwoordigt de echte warmte die vrijkomt bij complexvorming wanneer de complexvorming niet wordt beïnvloed door bufferionisatiewarmte omdat het intercept de warmtewaarde geeft voor de reactie in een hypothetische buffer met de protonionisatiewarmte gelijk aan 0. Dit is wat de onderzoekers wilden : de enthalpieverandering geassocieerd met binding van SelB en GTP zonder bijdragen aan veranderingen in protonering van de componenten van de bufferoplossing.

Figuur C hierboven toont de enthalpieverandering voor binding van SelB en GTP gecorrigeerd voor protoneringsveranderingen in bufferoplossing. Standaarddeviaties van metingen worden weergegeven door foutbalken (in sommige gevallen niet zichtbaar omdat ze kleiner zijn dan de symboolgrootte). Merk op dat de DH een lineaire functie van temperatuur is. De helling van de lijn heeft eenheden van kcal/mol/o C, wat de warmtecapaciteit is. De verandering in warmtecapaciteit, D Cp = d D H/dT kan ons inzicht geven in de aard van de bindingsinteracties. Om dit te begrijpen, moet u eerst een verandering in de thermodynamische parameter overwegen wanneer benzeen wordt overgebracht van puur benzeen naar water. Een grafiek met thermodynamische eigenschappen als functie van de temperatuur voor deze overdrachtsreactie wordt hieronder getoond.

C. Is de positieve waarde van D G voor de overdracht van benzeen van zuivere benzeen naar water in overeenstemming met uw begrip van de fysische en chemische eigenschappen van benzeen? Leg uit.

Antwoord: Ja. Benzeen is niet-polair en is als zodanig zeer onoplosbaar in water. Vandaar dat de vrije energieveranderingen voor dat proces positief zouden moeten zijn.

NS. Op het eerste gezicht zou je verwachten dat de collectieve benzeen-benzeen-IMFS en H2O-H2O-IMFS mogelijk sterker zijn dan benzeen-H2O-IMFS en dat het oplossen van benzeen in water daarom een ​​invoer van warmte-energie zou kunnen vereisen om het aan te drijven, zodat het proces endotherm zou zijn . Maar rond 275K is het een beetje enthalpisch om benzeen op te lossen in water. Wat het dramatisch afkeurt, is entropie. Dit is een manifestatie van het hydrofobe effect dat de eiwitvouwing stimuleert, zodat hydrofobe zijketens worden begraven.

Een belangrijk kenmerk van het hydrofobe effect is dat de overdracht van niet-polaire groepen naar water gepaard gaat met een positieve D Cp. Merk op dat het nemen van benzeen uit benzeen water wordt gekenmerkt door een lineair toenemende D H met toenemende temperatuur en dus een positieve D Cp. We zullen dit idee gebruiken om de D Cp voor SelB- en GTP-binding te analyseren. Wat is voor grafiek C hierboven het teken van D Cp? Welke moleculaire interpretatie kun je aan die waarde geven?

Antwoord: De binding van SelB en GTP verloopt met een negatieve D Cp naarmate de D H negatiever wordt bij toenemende temperatuur. Dit houdt in dat de binding van SelB en GTP gepaard gaat met een netto begrafenis van hydrofobe groepen.

3. De belangrijkste bron van Dcp-veranderingen bij binding komt voort uit verlies van water van interactief water van de oppervlakken van eiwit en ligand bij binding, waarbij de belangrijkste bijdrage voortkomt uit het hydrofobe effect. Een andere, minder omvangrijke bijdrage aan D Cp zou voortkomen uit het begraven van polaire residuen met de daaruit voortvloeiende veranderingen in de interactiepotentialen van gebonden en bulkwater. De volgende vergelijking is gebruikt om de bijdrage aan ΔCp van . weer te geven ontbinding van vaste stoffen in water:

waar D ASAap en D ASAP zijn de apolaire en polaire oplosmiddelen toegankelijke oppervlakteveranderingen, respectievelijk. Modelverbindingen geven waarden van D cap = 0,45 en D c P= -0,26 per mol SA (angstrom kwadraat).

Tabel 2 hieronder toont veranderingen in warmtecapaciteit en toegankelijk oppervlak voor SelB-binding aan guaninenucleotiden. ΔCp, verandering in warmtecapaciteit verkregen als ΔH/dT ΔASAap en ΔASAp, veranderingen in apolaire en polaire voor oplosmiddelen toegankelijke oppervlakten in de veronderstelling dat alle veranderingen werden veroorzaakt door apolair (AAap) of polair (AAp) residuen, respectievelijk zonder bijdrage van de ander. (Vb: voor GTP in Hepes, 621/0.45=1380) De waarden voor het begraven gebied werden omgezet in de aantallen aminozuren die van het oppervlak werden verwijderd met behulp van de gemiddelde ASA voor apolair (34 2) en polair (56 2) aminozuren.

Figuur 3 toont de veranderingen in de warmtecapaciteit na SelB-interactie met guaninenucleotiden. A, temperatuurafhankelijkheid van bindingsenthalpie verandert bij SelB-interacties met GTP (●), GTP'947S (○), GDPNP (■) en GDP (□). Standaarddeviaties van metingen worden gegeven door foutbalken, die kleiner zijn dan de symboolgrootte. B, staafweergave van veranderingen in warmtecapaciteit na SelB-interacties met guanine-nucleotiden.

Vergelijk uit grafieken A en B en tabel 2 hierboven de overeenkomsten en verschillen tussen de vrije en gebonden toestanden van SelB met de verschillende liganden.

Antwoord: GTP-binding aan SelB veroorzaakte een grote verandering in warmtecapaciteit, wat een belangrijke structurele herschikking suggereert die overeenkomt met 41'821143 aminozuren die hun contacten bij binding veranderden. Met GTP'947S waren de conformationele veranderingen iets kleiner, wat aangeeft dat 31'821132 aminozuren werden beïnvloed door complexvorming. De kleinste veranderingen werden waargenomen met GDP en GDPNP met 15󈝿 aminozuren die hun interactiepartners veranderden na interactie met SelB. De ITC-metingen geven aan dat de structuren van de GTP- en GDP-gebonden vormen van SelB verschillend zijn en dat ongeveer 25 aminozuren herschikken tijdens de GTP-GDP conformationele omschakeling. Hoewel gewoonlijk wordt aangenomen dat alle niet-hydrolyseerbare GTP-analogen gemakkelijk GTP kunnen vervangen, suggereren onze bevindingen dat een zorgvuldige analyse van verschillende GTP-analogen nodig is om degene te vinden die het meest lijkt op het natuurlijke substraat. De affiniteit van SelB voor GDPNP is slechts twee keer lager dan voor GTP, maar de waarden van zowel enthalpie- als entropieveranderingen leken meer op die van GDP-binding. Bovendien heeft SelB-GDPNP een 10-voudig lagere affiniteit voor Sec-tRNASec in vergelijking met SelB-GTP, wat het idee ondersteunt dat GDPNP geen authentiek GTP-analoog is voor SelB. Aan de andere kant is de binding van GTP'947S aan SelB verrassend strak met een aKd-waarde die 3'82114 keer kleiner is dan die van SelB-GTP. Omdat andere thermodynamische parameters vergelijkbaar zijn voor GTP'947S en GTP-complexen van SelB, concluderen we dat GTP'947S een betere GTP-analoog is voor SelB dan GDPNP. De algemene implicatie van deze bevindingen is dat niet-hydrolyseerbare GTP-analogen niet in alle gevallen getrouwe vervangingen voor GTP zijn, en dus moeten de resultaten die met behulp van deze analogen zijn verkregen, inclusief kristalstructuren, met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.

4. Om de verschillen in SelB-conformaties na binding van GTP, GDP en niet-hydrolyseerbare analogen verder te bestuderen, werden SelB en zijn complexen gescheiden door chromatografie met uitsluiting op grootte die scheidt op hydrodynamisch volume (waarbij grotere moleculen met dezelfde vorm eerst elueren). Figuur 4 hieronder toont de scheiding van apo-vorm en nucleotide-gebonden vormen van SelB door chromatografie met uitsluiting op grootte. Elutieprofielen van SelB GTP (—'8212), SelB GTP'947S (– – –), SelB GDP ( ), SelB GDPNP ( – – –) en SelB ( – – –) werden gevolgd door intrinsieke tryptofaanfluorescentie (λexcitatie = 280 nm, λemissie = 355 nm). A. u., willekeurige eenheden. Zijn deze resultaten consistent met de ITC-resultaten? Is de volgorde van elutie te verwachten op basis van de resultaten?

Antwoord: De schijnbare hydrodynamische stralen van SelB in apo-vorm en nucleotide-gebonden vormen waren significant verschillend, wat een duidelijke scheiding opleverde van alle vijf vormen van SelB (Fig. 4). De volgorde van elutie volgt de grootte van conformationele veranderingen in SelB die werden afgeleid van de ITC-gegevens, waarbij de complexen elueerden in de volgorde SelB-GTP, SelB-GTP'947S, SelB-GDP, SelB-GDPNP en SelB-apo. De verschillen tussen de GTP-, GDP- en apo-vormen zijn bijzonder duidelijk.

Merk echter op dat de volgorde van elutie niet is wat werd verwacht. Als SelB:GTP de grootste negatieve ΔCp had, en dit wordt geassocieerd met de grootste veranderingen in het oppervlak van het eiwit, zou je verwachten dat het SelB:GTP-complex de kleinste hydrodynamische straal zou hebben en als laatste uit de kolom zou elueren, niet eerst. In plaats van kristalstructuren, die een niet-bolvormige vorm zouden kunnen vertonen die de aangegeven volgorde van elutie zou kunnen rechtvaardigen, moeten we ervan overtuigd zijn dat de scheiding correleerde met de experimentele ΔCp-waarden.

5. De bindingsinteracties tussen SelB en GTP zijn enthalpisch begunstigd en entropisch ongunstig en gaan door met een negatieve - D Cp.

A. Noem mogelijke factoren (exclusief bufferoplossing D Hion) die kunnen leiden tot enthalpieveranderingen bij binding

Antwoord: Enthalpieverandering gaat gepaard met het maken en breken van IMF's tussen atomen in beide soorten. Deze zouden omvatten:

  • verlies van waterstofbruggen met oplosmiddelen en van der Waals-interacties,
  • verlies van ligand-oplosmiddel interacties,
  • de vorming van ligand-eiwitbindingen, zoutbruggen en van der Waals-contacten
  • reorganisatie van het intramoleculaire waterstofbindingsnetwerk van het eiwit,
  • oplosmiddelreorganisatie nabij het eiwitoppervlak, conformationele veranderingen op de bindingsplaats als gevolg van de bindingseven

B. Noem mogelijke factoren (exclusief bufferoplossing D Hion die kunnen leiden tot enthalpieveranderingen bij binding

  • afgifte van opgesloten of grensvlakwatermoleculen naar de bulk (+ D S)
  • watermoleculen die vrijkomen van het complexe oppervlak (+ D S)
  • vermindering van conformationele (rotatie en vibrationele) vrijheidsgraden van eiwitzijketens (- D S)
  • verlies van translationele vrijheidsgraden bij binding in ligand (- D S)

C. Maak een lijst van mogelijke factoren die kunnen leiden tot veranderingen in de warmtecapaciteit bij binding

netto afname van blootstelling aan water van hydrofobe groepen bij complexvorming (- D Cp)

netto verwijdering van het oppervlak van het eiwit door contact met oplosmiddel (- ΔCp)

elk proces waarbij water van het oppervlak vrijkomt (- ΔCp), inclusief conformationele veranderingen in het eiwit die de hydrodynamische straal en dus het oppervlak van het eiwit bij complexvorming verminderen.

6.Vat kort de belangrijkste bevindingen samen die de RelB-functie in een cel verduidelijken.

Antwoord: De gegevens geven aan dat SelB drie discrete conformaties kan aannemen die duidelijk van elkaar te onderscheiden zijn: de apo-vorm, de meest open vorm van het eiwit, de gesloten GTP-gebonden vorm en de GDP-gebonden vorm, de intermediair tussen de apo-vorm en de GTP-gebonden vorm. Gezien de hoge concentratie van GTP in de cel en de hoge mate van nucleotidebinding aan SelB, is de apo-vorm hoogstwaarschijnlijk van korte duur en zal daarom waarschijnlijk geen functionele rol spelen, terwijl de overgang tussen de GTP- naar GDP-vorm essentieel is voor de functie van SelB op het ribosoom. ITC-analyse suggereert dat de GTP- en GDP-gebonden vormen van SelB verschillend zijn en dat de factor waarschijnlijk de functionele en structurele cyclus zal volgen die typisch is voor veel andere GTPasen


Ondersteunende informatie

S1-methoden. Details over de simulatiemethoden en theorie.

S2-methoden. Details over de experimentele methoden.

S3-methoden. Details over de metadata-analysemethoden.

S1 Tekst. Aanvullende resultaten ter ondersteuning van de argumenten in de hoofdtekst.

S1 Tafel. schattingen van α van ITC-experimenten op vier verschillende eiwitten.

Gegevens van de experimenten werden aangepast aan vergelijking 11 om de waarde van te schatten α.

S2 Tafel. Sequenties die worden gebruikt om het totale hydrofobe oppervlak te berekenen.

Alleen de amylogene gebieden van de fibrillen werden gebruikt (wat niet gelijk is aan de volledige sequentie voor α-lactalbumine, α-synucleïne en β-2-microglobuline).

S1 Fig. Toestandsdiagrammen voor fibrilverlenging.

Hier hebben we het effect van de sterkte van de hydrofobe temperatuurafhankelijkheid onderzocht, α, op de stabiliteit van de aggregaten. Er kunnen drie verschillende toestanden worden onderscheiden: de volledig gevormde fibril (zwart), denaturatie van de fibril in monomeren (cyaan) en een amorf aggregaat waarbij de twee extra lagen niet volledig zijn gevormd. Alleen in de modellen met een hydrofobe temperatuurafhankelijkheid, koude destabilisatie (α = 40, 60), of koude denaturatie in monomeren, kan worden waargenomen (α = 60). De stippellijnen geven aan dat de toestand niet is waargenomen (bemonsterd) in de simulaties bij de bijbehorende temperatuur. Merk op dat de eenheden voor verlaagde temperatuur voor dit model kunnen worden geïnterpreteerd als een vriespunt rond T = 0,18 en een kookpunt net boven T = 0,4.

S2 Fig. Variëren van de enthalpische bijdrage aan fibrilstabiliteit door waterstofbruggen.

We hebben de stabiliteit van de fibrillaire toestand onderzocht voor verschillende waarden van de waterstofbindingsterkte (εhb) in het model. Voor variërende waarden εhb, en α = 40 het toestandsdiagram voor de fibrillaire toestand (A), de vrije energie (B), en de bijbehorende entropische (C) en enthalpische (D) bijdragen worden getoond. Door de sterkte van de waterstofbinding te vergroten, wordt de fibril stabieler (b), wat resulteert in een groter temperatuurbereik waarover de fibrillaire toestand stabiel is (a). Stippellijnen geven schattingen aan voor de hydrofobe bijdragen die worden weergegeven, en deze schattingen worden gegenereerd met behulp van Eqns. 13, 15 en 14 met bijbehorende α,CH = −6 en met een offset, Eint =H gebaseerd op simulaties met het equivalente peptide voor α = 0.

S3 Fig. Variëren van de entropische bijdrage aan fibrilstabiliteit door ketenentropie.

We hebben de stabiliteit van de fibrillaire toestand onderzocht voor verschillende waarden van de (entropische) neiging van β-strand staat (Nβ) in het model. Voor variërende waarden Nβ, en α = 40 het toestandsdiagram voor de fibrillaire toestand (A), de vrije energie (B), en de bijbehorende entropische (C) en enthalpische (D) bijdragen worden getoond. Het verhogen van de β-strengneiging maakt de fibril stabieler (B), wat resulteert in een groter temperatuurbereik waarover de fibrillaire toestand stabiel is (A). Stippellijnen geven schattingen aan voor de hydrofobe bijdragen die worden weergegeven, en deze schattingen worden gegenereerd met behulp van Eqns. 13, 15 en 14 met bijbehorende α,CH = −6 en met een offset, Eint =H gebaseerd op simulaties met het equivalente peptide voor α = 0.

S4 Fig. Representatieve ruwe ITC-gegevens.

Ruwe gegevens van ITC-experimenten worden getoond voor experimenten waarbij monomeeroplossingen werden getitreerd tot zaadvezelsuspensies. Experimenten werden uitgevoerd met een VP-ITC (A,C) en een ITC200 (C) instrumenten. (A) Injecties van 10, 80, 80, 80μl (40°) en 10, 80, 40, 80μl (50°) van een oplossing van α-lactalbumine (50 .) μM in 10 mM HCl + 100 mM NaCl) in een suspensie van gesoniceerde zaadfibrillen. (B) Injecties van 2 μl van oplossingen van monomeer α-synucleïne bij 380 μM (50°C), 390 μM (30°C) en 430 μM (40°C) in suspensies van zaadvezels. (C) Injecties van 20, 80, 80, 80μl (30 en 47°) van een oplossing van glucagon (100 μM in 10 mM HCl + 30 mM NaCl) in een suspensie van gesoniceerde zaadfibrillen.

S5 Afb. AFM-afbeeldingen ter illustratie: α-synucleïne amyloïde fibril verlenging.

Atoomkrachtmicroscopie (AFM) beelden werden genomen van zaadfibrillen vóór sonicatie om de lengteverdeling te verkorten en de seeding-efficiëntie (A) te verbeteren, na 10 s sonicatie met een sonicatieprobe (B) en na een ITC-experiment (C), waar de fibrillen (40 μM) was geïncubeerd met in totaal 60 μM van monomeer α-synucleïne.

S6 Fig. Chemische depolymerisatie van amyloïde fibrillen.

(EEN) α-lactalbumine amyloïde fibrillen gedepolymeriseerd met het sterke denaturerende middel GndSCN. (B) glucagon amyloïde fibrillen gedepolymeriseerd met GndHCl. De waarden van het vrije energieverschil tussen de oplosbare en de fibrillaire toestand zijn -52,5 kJ/mol (α-lactalbumine) en -51,2 kJ/mol (glucagon). Deze waarden moeten worden vergeleken met die bepaald voor de aanzienlijk minder stabiele α-synucleïne amyloïde fibrillen van -33,0 kJ/mol [36] of -37,4 kJ/mol (deze studie) in PBS-buffer.

S7 Fig. Thermodynamica van GNNQQNY-kristallisatie.

(A) Ruwe ITC-gegevens van de injectie van GNNQQNY-kristallen en monomeer in zuiver water. Experimentele details zie de sectie Materialen en methoden. (B) Samenvatting van de calorimetrische resultaten van het oplossen van GNNQQNY-kristallen. De gegevenspunten zijn gecorrigeerd voor de exotherme verdunningswarmte van het monomere gehalte van elke injectie. De lineaire aanpassingen aan de datasets bij de twee temperaturen worden gebruikt om de molaire enthalpieën van kristaloplossing te bepalen, wat overeenkomt met het negatief van de molaire hitte van kristalgroei.

S8 Fig. Intrinsieke fluorescentiespectra van de F94W-mutant van α-synucleïne.

Links: intrinsieke fluorescentie van monomeer F94W α-synucleïne werd gemeten in PB pH 7,4 in aanwezigheid en afwezigheid van 150 mM NaCl en in aanwezigheid en afwezigheid van 5 M ureum. Rechts: de fluorescentie-intensiteitsverhoudingen bij 340 en 330 nm werden uitgezet voor alle 4 omstandigheden, wat bevestigt dat deze verhouding bijna constant is voor monomeer onder alle waargenomen omstandigheden. Deze resultaten bieden sterke ondersteuning voor onze interpretatie van de verandering in fluorescentie-intensiteitsverhouding met toenemende ureumconcentratie als een weerspiegeling van fibrildepolymerisatie.

S9 Afb. Evenwicht van α-synucleïnefibrillen bij 4°C.

Ureum denaturatie serie van F94W α-synucleïnefibrillen in aanwezigheid en afwezigheid van 150 mM NaCl werden gedurende 4 weken bij 4°C geïncubeerd en de intrinsieke fluorescentiespectra werden gemeten en de algemene denaturatiecurven bepaald en geanalyseerd met het isodesmische polymerisatiemodel. De bepaalde vrije-energiewaarden werden uitgezet als een functie van de equilibratietijd. Het is te zien dat het evenwicht na een paar dagen wordt bereikt.

S10 Fig. Koude denaturatie van WT α-synucleïne amyloïde fibrillen gevolgd door ThT-fluorescentie en CD-spectroscopie.

(EEN) α-synucleïne amyloïde fibril stabiliteit als functie van de ureumconcentratie bij kamertemperatuur en na equilibratie bij 7°C, gebruikmakend van Thioflavine-T fluorescentie als uitlezing voor de mate van fibrildepolymerisatie. (B) Tijdsverloop van gedeeltelijke fibrildepolymerisatie bij 7 ° C, gevolgd door circulair dichroïsme (CD) spectroscopie. Zie de sectie materialen en methoden voor experimentele details. De gegevens zijn aangepast aan negatieve exponentiële functies, overeenkomend met het verwachte gedrag van fibriloplossing, waarbij het aantal fibrillen ongeveer constant is gedurende het grootste deel van het dissociatietijdsverloop en waarbij de dissociatiesnelheid evenredig is met het verschil tussen de evenwichtsconcentratie en de werkelijke concentratie van monomeer.


Bekijk de video: Kelas 11 TERMOKIMIA Menghitung Perubahan Entalpi (December 2021).