Informatie

DNA-denaturatie en -renaturatie


Als we dsDNA denatureren door het te verwarmen en vervolgens snel af te koelen, wat zou er dan gebeuren?? Ik las deze vraag, waar stond dat als we een dsDNA-monster kregen dat volledig gedenatureerd was en we het dan snel zouden afkoelen. Wat zou het resultaat zijn? Zou het ook snel gloeien of zal het gloeien langzaam zijn?

  1. Als we PCR zien, varieert de gloeitijd maar is ongeveer 45 sec min met een temperatuurbereik van 55-65 °C (afhankelijk van de Tm-waarde). Dus mijn eerste twijfel is of het snelle afkoeling wordt genoemd?
  2. In het geval van conservering van het RNA of DNA, behoudt koeling op ijs de structuur en voorkomt het ook verdere structuurveranderingen.
  3. Ik probeerde kranten te lezen en ik las ergens dat als we het volledig denatureren, het langzaam uithardt. Dat gebeurt in twee stappen: eerst zal het proberen zijn volledige match te vinden door middel van een botsingsproces. Ten tweede zal het ritsen. Dat duurt ongeveer 55 minuten. Dus dat stelt dat het snel gloeien zal zijn.

Iets denatureren kan verschillende betekenissen hebben:

In de context van dsDNA betekent het scheiding van de 2 stands, terwijl de individuele strengen zelf gefragmenteerd zijn.

Ik neem aan dat uw vraag betrekking heeft op PCR. In deze context zou snelle afkoeling tot zeer lage temperaturen het uitgloeien van de twee gescheiden strengen voorkomen.

Afgezien daarvan wil ik wijzen op een veel voorkomende misvatting, dat snelle afkoeling op de een of andere manier 'destructieve' effecten heeft, wat niet waar is. Hoe sneller iets wordt bevroren, hoe beter de structuur behouden blijft.


Het hangt echt van verschillende factoren af. (1) de aard van het dsDNA, is het een plasmide of chromosomaal DNA? Plasmiden renatureren gemakkelijker dan chromosomen, dus snelle afkoeling en verwarming hebben geen invloed op de renaturatie van plasmiden, maar wel op DNA.

Het langzaam afkoelen in een PCR-gebaseerd experiment kan worden gedaan als u DNA-fragmenten wilt uitgloeien, maar niet zeker bent over de optimale uitgloeitemperatuur. Vaak gedaan als je bijvoorbeeld twee primers aan elkaar wilt laten gloeien. Je moet specifieker zijn, zodat we je kunnen helpen.


Denaturatie en renaturatie van DNA

De eerste aanwijzing dat eukaryoot DNA verschillende soorten sequenties bevat die niet aanwezig zijn in prokaryotisch DNA, kwam van onderzoeken waarin dubbelstrengs DNA werd gescheiden en vervolgens opnieuw kon associëren. Wanneer dubbelstrengs DNA in oplossing wordt verwarmd, worden de waterstofbruggen die de twee nucleotidestrengen bij elkaar houden verzwakt en met voldoende warmte scheiden de twee strengen volledig, een proces dat denaturatie of smelten wordt genoemd. De temperatuur waarbij DNA denatureert, de smelttemperatuur (Tm) genoemd, hangt af van de basenvolgorde van het specifieke DNA-monster: G-C-basenparen hebben drie waterstofbruggen, terwijl A-T-basenparen er slechts twee hebben, dus de scheiding van G-C-paren vereist meer warmte (energie) dan de scheiding van A-T-paren. De denaturatie van DNA door verhitting is omkeerbaar: als enkelstrengs DNA langzaam wordt afgekoeld, zullen enkelstrengs botsen en zullen zich opnieuw waterstofbruggen vormen tussen complementaire basenparen, waardoor dubbelstrengs DNA ontstaat. Deze reactie wordt renaturatie of herannealing genoemd.


Denaturatie en renaturatie van DNA

Denaturatie en renaturatie is het kenmerk van DNA-moleculen. De factoren zoals temperatuur, pH en chemische middelen vormen of verbreken de waterstofbruggen die aanwezig zijn tussen de twee DNA-strengen. Het is een omkeerbaar proces en wordt gebruikt om de complexiteit van het genoom te bestuderen. Genetisch onderzoek en dergelijke studies maken gebruik van DNA-denaturatie- en -renaturatieprocessen.

Denaturatie wordt gedefinieerd als verandering in de natieve structuur van het biomolecuul. Het verbreken van niet-covalente bindingen zoals waterstof, ionische en van der waals krachten etc veroorzaakt de denaturatie. Het DNA heeft een rechtshandige spiraalvormige structuur, het bestaat uit twee polynucleotiden die bij elkaar worden gehouden door waterstofbruggen die worden gevormd tussen de complementaire stikstofbasenparen. DNA-denaturatie betekent het verbreken van waterstofbruggen die scheiding van twee strengen veroorzaakt.

De waterstofbinding is de aantrekkingskracht tussen het waterstofatoom van een covalent elektronegatief atoom of groep met een ander elektronegatief atoom of groep. Het is een zwakke binding en de sterkte varieert van 4 kJ tot 50 kJ per mol. De sterkte van waterstofbinding is slechts 5% in vergelijking met covalente binding. Vanwege de zwakte zijn waterstofbruggen vatbaar voor breuk. Verschillende factoren zoals temperatuur, pH en chemische middelen kunnen het verbreken van waterstofbruggen veroorzaken. En daarom wordt denaturatie ook beïnvloed door dezelfde factoren.

De temperatuur van meer dan 80 ° C veroorzaakt DNA-denaturatie door de waterstofbruggen te verbreken en twee afzonderlijke strengen te produceren. De temperatuur waarbij DNA denatureert wordt het smeltpunt van DNA of smelttemperatuur (Tm) genoemd. Het smeltpunt is kenmerkend voor DNA omdat Tm wordt beïnvloed door het ATGC-gehalte. De sequentie met meer AT-gehalte zou minder Tm hebben dan de DNA-sequentie met GC. Het is omdat GC drievoudige bindingen heeft en daarom is er meer temperatuur of energie nodig om drie bindingen te verbreken dan twee.

De verhoging of verlaging van de pH veroorzaakt veranderingen in ionische ladingen van stikstofbasen (purine en pyrimidines). Bij een lage pH worden de aminogroepen geprotoneerd en een hoge pH veroorzaakt de deprotonering ervan. Beide omstandigheden zijn niet gunstig om de waterstofbruggen te vormen en daarom verstoort het de natuurlijke structuur van DNA en leidt het tot denaturatie.

Van ureum en formamide of formaldehyde is bekend dat ze de waterstofbruggen van DNA-helix verbreken. Deze chemicaliën hebben de neiging om waterstofbruggen te vormen met de elektronegatieve centra van stikstofbasen. Dit veroorzaakt verstoring van de natieve waterstofbruggen tussen complementaire basenparen van de DNA-structuur. Het smeltpunt van DNA of Tm kan worden gewijzigd door dergelijke chemicaliën toe te voegen.

Kenmerken van gedenatureerd DNA
1) Viscositeit: De dubbelstrengs spiraalvormige structuur is viskeus van aard. Wanneer DNA wordt gedenatureerd door een van de genoemde factoren, verliest het zijn viscositeit.
2) Optische rotatie: De natieve structuur van DNA is optische activiteit. De denaturatie van DNA veroorzaakt een afname van de optische activiteit.
4) UV-absorptie: de natuurlijke structuur van DNA absorbeert UV-licht bij 260 nm vanwege de aromatische ringen van stikstofbasen. Wanneer DNA denatureert, neemt de absorptie van UV-licht toe vanwege de blootstelling aan stikstofbasen en wordt dit hyperchrome verschuiving of hychromaciteit genoemd.
Vandaar dat de mate van denaturatie van DNA kan worden waargenomen door middel van de absorptie van UV-licht.

PS: Denaturatie en renaturatie van DNA wordt ook gebruikt om de relativiteit van twee genomen en repetitieve sequenties in een genoom te begrijpen.

Renaturatie:
Wanneer de twee gescheiden strengen DNA weer aan elkaar binden, wordt dit renaturatie van DNA genoemd. Het betekent dat het een transformatie is van een gedenatureerde structuur naar een natuurlijke structuur. Renaturatie van DNA vindt plaats bij kamertemperatuur of neutrale pH of bij afwezigheid van denaturerende chemische middelen. De lage temperatuur vermindert de entropie en bevordert de botsing en het contact van de twee strengen. Wanneer twee strengen dicht bij elkaar komen, hebben ze de neiging om waterstofbruggen te vormen die opnieuw een dubbelstrengs helix vormen. Vandaar dat denaturatie een omkeerbaar proces is.

Wanneer gedenatureerd DNA wordt gerenatureerd, neemt de absorptie van UV bij 260 nm af vanwege het verbergen van stikstofbasen. En dit wordt hypochrome verschuiving genoemd.

Het enkelstrengs DNA heeft ook de neiging om waterstofbruggen te vormen met SS-DNA uit een andere bron. Het gebeurt wanneer SS-DNA van verschillende bronnen een complementaire sequentie heeft. Dit proces wordt hybridisatie genoemd. Het wordt gebruikt om de evolutionaire relatie van verschillende soorten te bestuderen.
De renaturatie van hangt af van de concentratie van DNA en de tijd. Hoe hoger de concentratie van DNA, hoe sneller de renaturatie. En daarom wordt de term gegeven als Cot (concentratie x tijd)

Bron: Lehninger, Nelson en Cox

De grafiek toont de renaturatie van dubbelstrengs DNA van prokaryotische cellen. Het ledikant (concentratie van DNA x tijd) staat op de X-as en het percentage of fractie van SS-DNA staat op de Y-as. De curve die begint vanaf de linkerbovenhoek van de Y-as geeft het begin van de renaturatiereactie aan. 1 of 100% op de X-as betekent dat het gehele DNA in enkelstrengige vorm aanwezig is. Naarmate de tijd verstrijkt, worden de DNA-strengen opnieuw geannexeerd en neemt het aandeel of percentage enkelstrengs DNA af. Wanneer het gehele DNA opnieuw wordt geanneald of gerenatureerd, wordt het aandeel SS-DNA nul. Het punt waarop de helft van het DNA wordt gerenatureerd, wordt Cot1/2 genoemd.

DNA bevat unieke en zich herhalende sequenties. Uniek betekent genen voor een bepaald karakter, die maar één of twee keer in het DNA voorkomen. Herhaalde sequentie betekent een stuk nucleotide dat meerdere keren in het DNA wordt herhaald. Britten en Davidson hebben ontdekt dat het renaturatie- of annealingproces sneller is dan het aantal repetitieve sequenties dat in DNA aanwezig is. Omdat dezelfde reeks in meerdere exemplaren voorkomt, wordt de kans op een botsing met de complementaire reeks groter. De repetitieve sequenties kunnen sterk of matig worden herhaald.

Laten we een voorbeeld nemen om bovenstaande verklaring te begrijpen. Stel je een kuip voor met rode, blauwe en witte ballen. Stel dat de doos 60 rode ballen, 30 blauwe ballen en 10 witte ballen heeft. Als je deze ballen willekeurig probeert te plukken, is de kans dat je rode ballen plukt groter dan blauwe ballen en veel meer dan witte ballen. Op dezelfde manier is de botsing van repetitieve reeksen met elkaar meer dan een unieke reeks.

Vandaar dat op basis van soorten sequenties (zeer repetitieve, matig repetitieve of unieke genen) aanwezig in DNA de snelheid van renaturatie beïnvloeden. De snelheid van renaturatie is recht evenredig met het aantal repetitieve sequenties. De Cot-analyse wordt gebruikt om repetitieve sequenties en complexiteit van het genoom te meten.

De denaturatie en renaturatie van DNA speelt een integrale rol in veel methoden en toepassingen en wordt beschouwd als een belangrijke en cruciale stap in praktische toepassingen.

D. Nelson en M, Cox, Freeman, 2004,

Biochemie (9e editie) Jeremy M. Berg, Lubert Stryer, John Tymoczko, Gregory Gatto, WH Freeman

Als je deze bron leuk vond, like, deel en abonneer ons dan voor meer inhoud.


Bernocchi, G. (1975). Contenuto in DNA en gebied nucleair dei neuroni durante l'istogenesi cerebellare del ratto.ren. Ist Lomb. Wetenschap. Let. 109, 143–61.

Bernocchi, G. & De Stefano, G.F. (1976b). Analisi della cinetico de eobrolisidella reasione di Feulgen in cellule a diverso rapporto di eu-erd eterocrometino.Riv. Istoch. Norm. Pat. 20, 120.

Bernocchi, G., De Vivo, M.L. & De Stefano, G.F. (1976). Sull'esistenza di due aspetti morfofunzionali di versi delle cellule di Purkinje nel cervelletto di ratto adulto.Riv. Istoch. Norm. Pat. 20, 119.

Bradbury, EM (1975). Histonen in chromosomale structuur en controle van celdeling. In:De structuur en functie van chromatine.Ciba Foundation Symposium.28, blz. 131–55. Amsterdam: Associated Scientific Publishers.

Britten, R.J., Graham, D.E. & Neufeld, B.R. (1974). Analyse van herhalende DNA-sequenties door herassociatie. In:Methoden in de enzymologie, vol. XXIX, deel E. blz. 363-418. New York en Londen: Academic Press.

Britten, R.J. & Kohne, D.E. (1968). Herhaalde sequenties in DNA.Wetenschap 11, 529–40.

Brown, D.M. & Todd, A.R. (1955). Bewijs van de aard van de chemische bindingen in nucleïnezuren. In:De nucleïnezuren (eds. E. Chagraff & JN Davidson), deel 1, blz. 409-45. New York: academische pers.

Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Sharpless, T. & Melamed, M.R. (1975). Thermische denaturatie van DNAter plaatse zoals bestudeerd door acridine-sinaasappelkleuring en geautomatiseerde cytofluorometrie.Uitleg Cel res. 90, 411–428.

Davidson, JN (1973)Biochimica degli acidi nucleici. Padua: Ed. Piccin.

De La Chapelle, A., Schroeder, J., Selander, R.K. (1973).ter plaatse lokalisatie en karakterisering van verschillende klassen van chromosomaal DNA: acridine-oranje en quinacrine-mosterdfluorescentie.chromosoom 40, 347–60.

Diaz, M. (1972). Methylgroene kleuring en zeer repetitief DNA in polytene-chromosomen.chromosoom 37, 131–8.

Engelhardt, W.A. (1975). Locatie van chromatinecomponenten. In:De structuur en functie van chromatine.Ciba Foundation Symposium, vol. 28, blz. 337-51. Amsterdam: Elsevier Excerpta Medica. Noord-Holland.

Fraschini, A., De Stefano, G.F., Pellicciari, C. & Bernocchi, G. (1975). Evoluzione strutteusle della cromatina durante la maturazione delle cellule door Purkinje nel cervelletto di ratto.Bol. Zool. 42, 457–8. XLIII Congr. UZI, Siena.

Fraschini, A. & Pellicciari, C. (1976). II verde de metile come indicatore dello stato chimico-fisico del DNA nella cromatina interfasica.Riv. Istoch. Norm. Pat. 20, 95–6.

Frenster, JH (1974). Ultrastructuur en functie van heterochromatine en euchromatine. In:De celkern, vol. 1, blz. 565–80. New York, Londen: Academic Press.

Gur, E. (1971).Synthetische kleurstoffen in de biologie Geneeskunde en Scheikunde, blz. 64-87. Londen: Academic Press.

Kurnick, NB (1949). Methyl groen-pyronine. I: Basen van selectieve kleuring van nucleïnezuren.J. Gen. Physiol. 33, 265–74.

Kurnick, NB (1949). Methyl groen-pyronine. II: stoichiometrie van reactie met nucleïnezuren.J. Gen. Physiol. 33, 365–74.

Kurnick, NB (1950). De kwantitatieve schatting van deoxyribonucleïnezuur op basis van methylgroene kleuring.Uitleg Cel res. 1, 151–8.

Kurnick, NB (1952). De basen voor de specificiteit van methylgroene kleuring.Uitleg Cel res. 3, 649–51.

Marmur, J. & Ts'o, POP (1961). Denaturatie van deoxyribonucleïnezuur door formamide.Biochim. biofysica. Acta 51, 32–6.

More, J.A.R. & Paul, J. (1973). Sjabloonactiviteit en elektronenmicroscopisch uiterlijk van met zout geëxtraheerd chromatine.Uitleg Cel. Onderzoek 76, 79–86.

Palay, S.L. & Chan Palay, V. (1974).Cerebellaire cortex. Berlijn: Springer Verlag.

Pollister, A.W. & Leuchtenberger, C. (1949). De aard van de specificiteit van methylgroen voor chromatine.Proc. Nat. Acad. Wetenschap. 35, 111–6.

Rigler, R. (1966). Microfluorometrische karakterisering van intracellulaire nucleïnezuren en nucleoproteïnen door acridine oranje.Acta fysio. scannen.,67, 7–123.

Rigler, R. (1968). Microfluorometrische bepaling van nucleïnezuren en nucleo-eiwitten in afzonderlijke cellen door acridine-oranje. In:Macromoleculen en de functie van het neuron, (eds. Z. Lodin & S.P.R. Rose), blz. 3-12. Amsterdam: Uittreksel Medica gevonden.

Rigler, R. (1969). Acridine-oranje in nucleïnezuuranalyse.Ann. NY Acad. Wetenschap. 157, 211–24.

Scott, J.E. (1967). Over het mechanisme van de methylgroen-pyroninekleuring voor nucleïnezuren.Histochemie 9, 30–46.

Senior, M.B., Olins, A.L. & Olins, D.E. (1975). chromatinefragmenten die lijken opv lichamen.Wetenschap 187, 173–5.

Smart, J.E. & Bonner, J. (1971). Selectieve dissociatie van histonen van chromatine door natriumdeoxycholaat.J. Molec. Biol. 58, 651–9.

Stockert, J.C. & Lisanti, J.A. (1972). Acridine-oranje differentiële fluorescentie van snel en langzaam opnieuw associërend chromosomaal DNA nater plaatse DNA-denaturatie en reassociatie.chromosoom,37, 117–30.

Sumner, A.T., Evans, H.J. & Buckland, R.A. (1973). Mechanismen die betrokken zijn bij de bandvorming van chromosomen met quinacrine en Giemsa.Uitleg Cel res. 81, 214–22.

Wertmur, J.G. & Davidson, N. (1968). Kinetiek van renaturatie van DNA.J. Molec. Biol. 31, 349–70.


Cyclische denaturatie en renaturatie van dubbelstrengs DNA door redox-state-omschakeling van DNA-intercalators

Hybridisatie van complementaire nucleïnezuurstrengen is fundamenteel voor bijna alle moleculaire bioanalytische methoden, variërend van polymerasekettingreactie en DNA-biosensoren tot sequencing van de volgende generatie. Voor nucleïnezuuramplificatiemethoden is gecontroleerde DNA-denaturatie en -renaturatie bijzonder essentieel en wordt bereikt door cyclische verhoogde temperaturen. Hoewel dit verreweg de meest gebruikte techniek is, vereist het beheer van snelle temperatuurveranderingen omvangrijke instrumentatie en een intensieve stroomvoorziening. Deze factoren stonden tot nu toe de ontwikkeling van echte point-of-care-tests voor moleculaire diagnostiek in de weg. Om deze beperking te overwinnen, hebben we de mogelijkheid onderzocht om elektrochemische middelen te gebruiken om omkeerbare DNA-hybridisatie te controleren door gebruik te maken van de elektroactieve intercalator daunomycine (DM). We laten zien dat redox-state-omschakeling van DM zijn eigenschappen veranderde van DNA-binding naar niet-bindend, onder overigens constante omstandigheden, en dus de thermodynamische stabiliteit van duplex-DNA veranderde. Het werkingsprincipe werd aangetoond met behulp van complementaire synthetische 20-meer en 40-meer DNA-oligonucleotiden. Op absorptie gebaseerde smeltcurve-analyse onthulde significant hogere smelttemperaturen voor DNA in de aanwezigheid van geoxideerd in vergelijking met chemisch gereduceerd DM. Dit verschil werd benut om cyclische elektrochemisch gecontroleerde denaturatie en renaturatie aan te sturen. Analyse met in situ UV-vis en circulair dichroïsme spectro-elektrochemie, als twee onafhankelijke technieken, gaf aan dat tot 80% van het DNA omkeerbaar was gehybridiseerd. Deze opmerkelijke demonstratie van elektrochemische controle van vijf cycli van DNA-denaturatie en -renaturatie, onder overigens constante omstandigheden, zou verreikende implicaties kunnen hebben voor de toekomstige ontwikkeling van geminiaturiseerde analytische systemen voor moleculaire diagnostiek en daarbuiten.


Renaturatie

Definitie
zelfstandig naamwoord, meervoud: renaturaties
(moleculaire biologie) De omzetting van gedenatureerd eiwit of nucleïnezuur naar zijn oorspronkelijke configuratie
Supplement
Renaturatie in de moleculaire biologie verwijst naar de reconstructie van een eiwit of nucleïnezuur (zoals DNA) naar hun oorspronkelijke vorm, vooral na denaturatie. Dit proces is dus het omgekeerde van denaturatie. Bij denaturatie verliezen de eiwitten of nucleïnezuren hun natuurlijke biomoleculaire structuur. Een DNA-molecuul wordt bijvoorbeeld gedenatureerd door verhitting. Het door warmte gedenatureerde DNA scheidt zich in twee strengen. Wat eiwitten betreft, wordt denaturatie uitgevoerd door de toepassing van een externe spanning of verbinding zoals een sterk zuur of een sterke base, een geconcentreerd anorganisch zout, een organisch oplosmiddel, straling of warmte. 1 . Het reconstrueren van het gedenatureerde nucleïnezuur of eiwit in zijn oorspronkelijke vorm wordt gedaan door het proces van renaturatie. Een door warmte gedenatureerd DNA kan bijvoorbeeld terugkeren naar zijn oorspronkelijke vorm door de twee strengen langzaam af te koelen en vervolgens opnieuw te vormen tot zijn oorspronkelijke dubbelstrengs helix. Een gedenatureerd eiwit kan na denaturatie worden hersteld, hoewel dit niet zo gebruikelijk is als bij gedenatureerde nucleïnezuren. Een manier waarop een gedenatureerd eiwit in zijn oorspronkelijke vorm wordt hersteld, is door de SDS en denaturerende middelen te verwijderen na denaturatie tijdens PAGE- of IEF-eiwitidentificatie. 2
Zie ook:

1 Denaturatie (biochemie). (n.d.) Mosby's8217s Medical Dictionary, 8e editie. (2009). Op 23 maart 2015 opgehaald van http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/Denaturation+(biochemistry).

2 Rosenberg, I. (2005). Proteïne analyse en zuivering benchtop technieken. Boston: Birkhäuser.


Sandwalk


Verschillende studenten hebben mij geschreven met vragen over de structuur van DNA. De meest verontrustende vragen zijn van studenten die het artikel hebben gelezen dat ik schreef over een paper dat de stapelinteracties in polynucleotiden meet [Measuring Stacking Interactions]. In dat bericht schreef ik.

De twee strengen dubbelstrengs DNA worden bij elkaar gehouden door een aantal zwakke interacties zoals waterstofbruggen, stapelinteracties en hydrofobe effecten [The Three-Dimensional Structure of DNA].

Hiervan zijn de stapelinteracties tussen basenparen het meest significant. De sterkte van de basisstapelingsinteracties hangt af van de basissen. Het is het sterkst voor stapels G/C-basenparen en het zwakst voor stapels A/T-basenparen en daarom is het gemakkelijker om A/T-rijk DNA bij hoge temperatuur te smelten. (Vaak wordt ten onrechte aangenomen dat dit komt doordat er slechts twee waterstofbruggen zijn tussen A/T-basenparen en drie tussen G/C-basenparen.)

Deoxyribonucleïnezuur (DNA) Veel studenten hebben geschreven om te zeggen dat mijn uitspraken in tegenspraak zijn met hun professoren en hun leerboeken. Ik ben niet verrast. De ouderwetse kijk op DNA-denaturatie (vóór 1990) veronderstelde dat de verschillen tussen A/T-rijk DNA en G/C-rijk DNA te wijten waren aan de extra waterstofbinding in G/C-basenparen. Veel van de professoren die inleidende biochemie doceren, zijn zich niet bewust van het feit dat deze opvatting onjuist is. Nog verrassender is dat sommige van de huidige leerboeken niet de moeite hebben genomen om hun materiaal over de structuur van DNA bij te werken.

Hier is het verhaal zoals we het nu kennen. Voor de studenten die mij hebben geschreven, herhaal ik de waarschuwing die ik noemde in mijn antwoord aan jou & mdash, zorg ervoor dat je contact opneemt met je professor voordat je een test schrijft. Zorg ervoor dat hij/zij begrijpt waarom je in tegenspraak bent met wat er in de klas is gezegd, zodat er geen punten worden afgetrokken. Het is altijd beter om dit van tevoren te doen in plaats van ruzie te maken nadat je punten op de test hebt verloren.

Laten we eerst kijken naar wat er gebeurt als DNA wordt gedenatureerd door de temperatuur te verhogen.

Naarmate de temperatuur stijgt, begin je lokale afwikkeling van het dubbelstrengs DNA te krijgen. Dit afwikkelen vindt bij voorkeur plaats in gebieden waar de twee strengen minder sterk bij elkaar worden gehouden. In deze gebieden scheiden de strengen zich om bellen van enkelstrengs gebieden te vormen. De DNA-sequentie in deze regio's is verrijkt in A/T-basenparen omdat de interacties tussen de twee strengen zwakker zijn in A/T-rijke regio's. In G/C-rijke regio's worden de strengen sterker bij elkaar gehouden, zodat ze pas bij hogere temperaturen ontspannen.

Overigens, zelfs bij normale celtemperaturen "ademt" het DNA en worden lokale regio's tijdelijk afgewikkeld. Zoals je zou verwachten, is de kans groter dat A/T-rijke regio's opengaan dan G/C-rijke regio's. Dit is een van de redenen waarom transcriptie-initiatiebellen en DNA-replicatieoorsprongen vaak A/T-rijk zijn. Het is gemakkelijker voor de eiwitten (RNA-polymerase en oorsprongsbindende eiwitten) om de lokaal afgewikkelde regio's te creëren.

Wanneer alle basisinteracties verbroken zijn, scheiden de twee strengen. Dit wordt denaturatie genoemd. (Lokaal onthaasten is niet denaturatie.)

De base wordt nu blootgesteld aan de waterige omgeving. Enkelstrengs DNA is stabieler dan dubbelstrengs DNA bij hogere temperatuur. Merk op dat de randen van de basen in deze situatie nog steeds waterstofbruggen zullen vormen. Ze vormen waterstofbruggen met watermoleculen. In feite zullen ze veel meer waterstofbruggen met water vormen dan ze zouden vormen met complementaire basen in dubbelstrengs DNA.

Naarmate de temperatuur wordt verlaagd, wordt de dubbelstrengs vorm stabieler dan de enkelstrengs in oplossing, en het DNA renatureert. De eerste stap is een nucleatiegebeurtenis waarbij twee complementaire regio's met elkaar in contact komen. Nucleatie is de snelheidsbeperkende stap in renaturatie. Zodra kiemvorming plaatsvindt, ritst de rest van het molecuul vrij snel dicht.

Het is gemakkelijk om de denaturatie van DNA te volgen omdat er een verschil is in de absorptie van ultraviolet licht tussen enkel- en dubbelstrengs DNA. Enkelstrengs DNA absorbeert sterker.

In een typische smeltcurve meet u de toename van de UV-absorptie naarmate de temperatuur stijgt. Dit volgt de afwikkeling en denaturatie van DNA. Het smeltpunt (Tm) is de temperatuur waarbij de helft van het DNA wordt afgewikkeld.

DNA dat volledig uit AT-basenparen bestaat, smelt bij ongeveer 70° en DNA dat alleen G/C-basenparen heeft, smelt bij meer dan 100°. Je kunt de T . berekenenm van een DNA-molecuul als je de samenstelling van de base kent. De eenvoudigste formules houden gewoon rekening met de algehele samenstelling en ze zijn niet erg nauwkeurig. Een nauwkeuriger formule zal de stapelinteracties van elk basenpaar gebruiken om de smelttemperatuur te voorspellen [Wikipedia: DNA melting].

De vraag is waarom er een verband is tussen de basissamenstelling van DNA en de stabiliteit van de dubbelstrengs regio's?

De eerste mensen die over deze vraag nadachten, begrepen de rol van het stapelen van interacties tussen basenparen in het midden van dubbelstrengs DNA niet echt. Ze waardeerden ook niet echt waterstofbruggen. Ze gingen er naïef van uit dat de verschillen tussen G/C-rijk DNA en A/T-rijk DNA te wijten waren aan het feit dat G/C-basenparen drie waterstofbruggen hebben en A/T-basenparen slechts twee [The Chemical Structure of Double-stranded DNA].

We weten nu dat deze uitleg niet klopt. Er is geen netto verlies van waterstofbruggen wanneer DNA wordt gedenatureerd, integendeel zelfs. Er worden meer waterstofbruggen gevormd tussen de basen in enkelstrengs DNA en watermoleculen dan tussen basenparen in DNA. Er is geen reden waarom enkelstrengs DNA zou renatureren als de vorming van dubbelstrengs DNA werd aangedreven door de vorming van waterstofbruggen tussen basenparen. Voor elke waterstofbinding tussen basen zou je bijna twee waterstofbruggen aan watermoleculen moeten verbreken.

De belangrijkste interacties in dubbelstrengs DNA zijn de stapelinteracties tussen aangrenzende basenparen. Je kunt dit zien als de interacties van elektronen op de boven- en ondervlakken van de ringen die de basen vormen.

Er zijn tien mogelijke interacties tussen aangrenzende basenparen. De energieën van deze interacties worden weergegeven in de tabel aan de linkerkant. De pijlen geven de richting aan van de DNA-stand van 3&prime&rarr5&prime [The Chemical Structure of Double-Stranded DNA].

Merk allereerst op dat de sterkte van deze stapelinteracties (gemiddeld ongeveer 30 kJ mol -1) groter zijn dan de de sterkte van stabiliteit verleend door waterstofbruggen (ongeveer 3 4 kJmol -1) 1 . Ervan uitgaande dat er gemiddeld zes drie waterstofbruggen per in tweeën gestapeld G/C basenpaar, de totale sterkte van de waterstofbruggen (18 12 kJ mol -1) is nog steeds veel minder dan de stapelinteracties.

Merk ten tweede op dat stapelinteracties met G/C-basenparen sterker (negatiever) zijn dan die met A/T-basenparen. Dit is de reden waarom de smelttemperatuur van DNA afhangt van de samenstelling van de base. Het is niet omdat G/C-basenparen één waterstofbinding meer hebben dan A/T-basenparen, maar omdat G/C-basenparen sterkere stapelinteracties vormen.

Daarom kun je een nauwkeuriger smelttemperatuur voor oligonucleotiden berekenen als je de stapelinteracties gebruikt. Het zijn stapelinteracties die de stabiliteit van dubbelstrengs DNA bepalen en het zijn stapelinteracties die verstoord worden naarmate de temperatuur stijgt en er meer thermische energie aan het molecuul wordt toegevoegd.

Ten slotte mat het artikel dat ik in juli besprak [Measuring Stacking Interactions] de stapelinteracties in enkelstrengs DNA (poly A). Het blijkt dat de stapelinteracties tussen enkele basen in sommige gevallen sterk genoeg zijn om enkelstrengs DNA in een helixstructuur te dwingen. Dit is een verder bewijs van het belang van stapelinteracties bij het verlenen van stabiliteit aan de dubbele helix.


DNA-denaturatie en -renaturatie - Biologie

Moleculaire Biologie Lezing 3

Fysische en chemische structuur van DNA

Structuur van DNA-subeenheid (nucleotide):

Röntgendiffractiestudies door Rossalind Franklin en Watson en Crick toonden aan dat:

DNA is spiraalvormig - dubbelstrengs helix

Nucleotidebases zijn gestapeld

Chemische analyse toonde aan dat:

(deze verhoudingen hebben alleen betrekking op dubbelstrengs DNA. In veel virussen zit ook enkelstrengs DNA)

De basisstructuur: (afb. 3-1 en afb. 3-5)

10 basen per spiraalvormige draai (in B-DNA, de overheersende vorm)

twee groeven: (deze maken de binding van eiwitten mogelijk)

brede groef / grote groef

smalle groef/kleine groef

Ook een iets strakkere rechtshandige helix: A-DNA

Dit heeft 11 basen per beurt (dubbelstrengs RNA, gedehydrateerd DNA)

Base pairing (fig. 3-2, 3-3, 3-4)

Merk op dat A-T twee H-bindingen heeft. G-C heeft drie H-bindingen

Denk aan de 5 3 polariteit van de strengen

De strengen zijn anti-parallel

Betekenis van G+C-verhoudingen (of % G+C): voor veel organismen is het bijna 50% (voor Campylobacter is het 35%. Dat wil zeggen, Campy is een zeer AT-rijk organisme.

Veel bacteriën en fagen hebben circulair DNA (fig. 3-6 en 3-7)

Supercoiled (ofwel + [dezelfde richting] of [tegenovergestelde richting])

(-) supercoiling kan "bubbels" introduceren en als er compatibele bases zijn, neem dan "stem-lus"-structuren of "cruciform"-structuren.

Dit is met name het geval als er "omgekeerde herhalingen" of pallindroomsequenties aanwezig zijn:

Enzymbindingsplaatsen worden vaak geassocieerd met dit soort structuren.

Topoisomerasen knippen een of beide strengen DNA af en winden of wikkelen zich vervolgens af.

DNA-denaturatie: (fig. 3-8) Smeltcurve

Verwarm dubbelstrengs DNA (native DNA) Het denatureert of smelt en wordt enkelstrengs.

Dit kan worden gemeten met spectrofotometrie aangezien de A260 is lager voor dubbelstrengs DNA dan voor enkelstrengs DNA.

tm of T smelt is het 50% punt

Smelttemperatuur is behoorlijk hoog

Het gaat vrij snel (smal temperatuurbereik)

Alleen niet-covalente bindingen zijn betrokken

Tm is het punt waarop de helft van de moleculen wordt gedenatureerd

Hoe hoger het G+C-gehalte, hoe hoger de Tm

Hoge pH vergemakkelijkt de denaturatie omdat het de basenparing verstoort. Hoge pH ( > 11.3) kan worden gebruikt om DNA te denatureren. [Gebruik dit echter niet voor RNA. RNA hydrolyseert bij hoge pH].

Gedestilleerd water kan DNA denatureren. Negatief geladen ruggengraat moet worden gestabiliseerd met positief geladen kationen.

DNA-renaturatie of DNA-hybridisatie.

Dit gebeurt optimaal bij 20-25 o onder de Tm.

Heeft wat Na + of wat Mg ++ nodig om te voorkomen

Curve (fig. 3-9) stelt u in staat om te zien of er sprake is van repetitieve vs. niet-repetitieve sequenties.

Hybridisatietechnieken worden veel gebruikt in het laboratorium (fig. 3-11)

ssDNA zit vast aan een membraan (nitrocellulose)

vervolgens wordt een oplossing van gelabeld ssDNA of RNA over het membraan gewassen.

Wassen en visualiseren met verschillende technieken

Tien keer overvloediger dan DNA

Enkelstrengs, veel voorkomende vormen

Stamlus (haarspeld, kruisvormige) structuren (fig. 3-12)

Bevat vaak gemodificeerde basen

Hydrolyse van nucleïnezuren

Lage pH (minder dan pH 1) - zowel RNA als DNA hydrolyseren (fosfodiesterbindingen breken en de basen breken af).

Hoge pH (hoger dan pH 11) - RNA hydrolyseert. DNA zal denatureren, maar de fosfodiëerruggengraat blijft intact.

Exonuclease, endonuclease, restrictie-endonuclease

DNA-sequencing - Sanger-methode (techniek voor het beëindigen van de dideoxy-keten)

Onthoud dat polymerasen alleen de DNA-synthese 5 3 katalyseren, en nieuwe nucleotiden worden toegevoegd aan een vrije 3 -OH-groep.

Deze techniek maakt gebruik van dideoxynucleotiden om een ​​deel van de DNA-synthesereacties te beëindigen.

Er worden vier afzonderlijke reacties uitgevoerd. Je moet voor elk van de vier nucleotiden een aparte reactie uitvoeren.


ASJC Scopus-vakgebieden

  • APA
  • Standaard
  • Harvard
  • Vancouver
  • Auteur
  • BIBTEX
  • RIS

Onderzoeksoutput : Bijdrage aan tijdschrift › Artikel › peer-review

T1 - Effect van guanidiniumion op DNA-denaturatie en -renaturatie

N1 - Financieringsinformatie: deze studie wordt ondersteund door National Science Foundation (GB 5497)

N2-Guanidiniumchloride (GuCl) in geconcentreerde oplossingen is gebruikt in denaturerende eiwitten (Tanford, Kawachara en Lapanje 1967) en om deze reden is het ook voorgesteld voor gebruik bij de isolatie van nucleïnezuren uit nucleoproteïnen (Cox 1968). Hoewel er geen duidelijk effect is van deze procedure op de zo geïsoleerde producten, is er weinig gerapporteerd over de werking ervan op alleen DNA. Rice en Doty (1957) merkten eerder op dat de afname in intrinsieke viscositeit van kalfthymus-DNA optrad bij een lagere temperatuur in 3,2 M GuCl dan in 0,8 M NaCl, maar 8 M ureum was effectiever dan 3,2 M GuCl. De huidige studies gebruiken de meting van het absorptie-temperatuurprofiel (Rice and Doty 1957, Cavalieri en Rosenberg 1957, Marmur en Doty 1962) en laten zien dat de mate van stabilisatie van DNA-helicity door GuCl bij lage ionsterkte evenredig is met de molariteit van het zout, terwijl bij hoge concentraties het omgekeerde het geval is. De resultaten suggereren dus een uniek, dubbel effect van GuCl dat ongebruikelijk is voor de meeste denaturatiemiddelen.

AB - Guanidinium chloride (GuCl) in concentrated solutions has been used in denaturing proteins (Tanford, Kawachara and Lapanje 1967) and for this reason, it has also been suggested for use in the isolation of nucleic acids from nucleoproteins (Cox 1968). While there is no apparent effect of this procedure on the products so isolated, little has been reported as to its action on DNA alone. Rice and Doty (1957) observed earlier that the decrease in intrinsic viscosity of calf thymus DNA occurred at a lower temperature in 3.2 M GuCl than in 0.8 M NaCl, but 8 M urea was more effective than 3.2 M GuCl. The present studies employ the measurement of the absorbance-temperature profile (Rice and Doty 1957, Cavalieri and Rosenberg 1957, Marmur and Doty 1962) and show that the degree of stabilization of DNA helicity by GuCl at low ionic strength is proportional to the molarity of the salt, whereas at high concentrations, the reverse is the case. Thus, the results suggest a unique, dual effect of GuCl uncommon to most denaturants.


Samenvatting

Experimental data have demonstrated that nucleic acid in the form of DNA is the genetic material of cells. The structure of the DNA double helix and the complementary base pairing make double-stranded DNA uniquely suited as a template during replication. The two strands of double-stranded DNA can be denatured by heat and then renatured in a complementary fashion. This property of DNA is exploited in nucleic acid hybridization, where a short single-stranded probe can hybridize to the complementary sequence in denatured DNA or RNA. The melting temperature (Tm) of double-stranded DNA is a function of nucleotide length and composition. The DNA in the nucleus is found in the chromosomes, which are composed of linear DNA associated with proteins. Each chromosome has a centromere, two telomeres, and several origins of replication (ORI). Mitotic chromosomes are highly condensed and easiest to visualize in a karyotype. The genome of a typical eukaryote is composed of unique DNA sequences, interspersed repeated DNA, and short tandem repeats. The DNA in chromatin is highly packed and compressed. The first level of packaging is the nucleosome, DNA wrapped around the core histones. The nucleosomes (so-called "beads on a string") are further packaged into 30-nm chromatin fibers, looped domains of chromatin, and finally, the condensed mitotic chromosome. The interphase chromosomes are less condensed in the regions of the euchromatin, and more condensed in the regions of the heterochromatin. The interphase chromosomes reside in the nucleus, whose nuclear envelope has a double membrane. Transport of molecules, in and out of the nucleus, occurs through the nuclear pores.


Bekijk de video: Denaturasi Protein Kelompok 7 (Januari- 2022).