Informatie

Wat is het beste oplosmiddel voor Mutageen X?


Er kunnen veel oplosmiddelen worden gebruikt voor mutageen X (3-chloor-4-(dichloormethyl)-5-hydroxy-5H-furan-2-on), maar stabiliteit op lange termijn is niet gespecificeerd. Wat is het beste oplosmiddel voor langdurige opslag? Kan het eenmaal opgelost worden bewaard bij kamertemperatuur of -20ºC?

Bedankt


De verstrekkende effecten van mutagenen op de menselijke gezondheid

Om te overleven, te bloeien en zich met succes voort te planten, zijn organismen afhankelijk van een hoge mate van genetische stabiliteit. Mutagene agentia, die de integriteit van de genetische code kunnen bedreigen door mutaties in het DNA te veroorzaken, vormen een ernstig risico voor de menselijke gezondheid. Ze zijn al lang betrokken bij een reeks genetisch overgeërfde aandoeningen, evenals kanker, veroudering en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer.

Het lijkt er nu op dat mutagene bedreigingen voor de subtiele machinerie van een cel veel wijdverspreider zijn dan eerder werd aangenomen. In een nieuwe studie tonen Michael Lynch en zijn collega's aan dat de DNA-mutatie zelf slechts een fractie kan zijn van de gezondheidsgerelateerde schade die wordt veroorzaakt door mutagenen.

De studie benadrukt het vermogen van mutagene verbindingen om ook het transcriptieproces te beïnvloeden, waarbij een DNA-sequentie wordt omgezet (of getranscribeerd) naar mRNA, een tussenstadium voorafgaand aan translatie in eiwit.

De onderzoeksresultaten (die mutagene transcriptiefouten in gist, wormen, vliegen en muizen benadrukken), suggereren dat de schadelijke effecten van mutagenen op transcriptie waarschijnlijk veel doordringender zijn dan eerder werd aangenomen - een feit dat belangrijke implicaties kan hebben voor de menselijke gezondheid.

"Onze resultaten hebben het potentieel om de manier waarop we denken over de gevolgen van mutagenen in het milieu volledig te veranderen", zegt Lynch.

Professor Lynch is de directeur van het Biodesign Center for Mechanisms in Evolution en een onderzoeker in ASU's School of Life Sciences.

De onderzoeksresultaten verschijnen in het huidige nummer van het tijdschrift PNAS.

Cellen onder bedreiging

Vanwege hun belangrijke rol in ziekteprocessen zijn mutagene verbindingen al lang onderwerp van intensief wetenschappelijk onderzoek. Dergelijke middelen omvatten zonlicht en andere stralingsbronnen, chemotherapeutica, giftige bijproducten van het cellulaire metabolisme of chemicaliën die aanwezig zijn in voedsel en water.

Mutagenen kunnen schade toebrengen aan het DNA, wat later kan sneeuwballen wanneer cellen zich delen, en DNA-replicatie vermenigvuldigt deze fouten. Dergelijke mutaties kunnen, indien niet gecorrigeerd door middel van DNA-proefleesmechanismen, worden doorgegeven aan volgende generaties en afhankelijk van de locatie waar ze verschijnen langs de drie miljard lettercode van de menselijke DNA-streng, kan dit ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid, in sommige gevallen, met dodelijke gevolgen.

Maar zelfs als het wordt gerepareerd vóór replicatie, kan tijdelijk beschadigd DNA ook interfereren met transcriptie - het proces van het produceren van RNA uit een DNA-sequentie. Dit kan gebeuren wanneer RNA-polymerase, een enzym dat langs een enkele DNA-streng beweegt en een complementaire RNA-streng produceert, een gemuteerde DNA-sequentie leest, wat een fout veroorzaakt in het resulterende RNA-transcript.

Omdat RNA-transcripten de sjablonen zijn voor het produceren van eiwitten, kunnen transcriptiefouten afwijkende eiwitten produceren die schadelijk zijn voor de gezondheid of de eiwitsynthese helemaal beëindigen. Het is al bekend dat zelfs onder de beste omstandigheden de foutenpercentages voor transcriptie orden van grootte hoger zijn dan die op DNA-niveau.

RNA: een reeks fouten?

Hoewel het bestaan ​​van transcriptiefouten al lang wordt erkend, was hun kwantificering een uitdaging. De nieuwe studie beschrijft een slimme techniek om transcriptiefouten veroorzaakt door mutagenen op te sporen en deze te scheiden van experimentele artefacten - mutaties veroorzaakt tijdens bibliotheekbereiding van RNA-transcripten door processen van omgekeerde transcriptie en sequencing.

De beschreven methode omvat het gebruik van massaal parallelle sequentietechnologie om alleen die fouten in de RNA-sequentie te identificeren die rechtstreeks worden veroorzaakt door de activiteit van een mutageen. De resultaten tonen aan dat ten minste enkele mutagene verbindingen krachtige bronnen zijn van zowel genomische mutaties als overvloedige transcriptiefouten.

De circulaire sequencing-assay die in het onderzoek wordt beschreven, creëert overtolligheden in het omgekeerd getranscribeerde bericht, waardoor het resulterende lineaire DNA kan worden nagelezen. Op deze manier kunnen onderzoekers bevestigen dat de waargenomen transcriptiefouten het gevolg zijn van de effecten van het mutageen op de transcriptie en niet een artefact van de monstervoorbereiding.

Het is aangetoond dat het DNA-molecuul bijzonder kwetsbaar is voor een klasse van mutagenen die bekend staat als alkylerende middelen. Een daarvan, bekend als MNNG, werd gebruikt om transcriptiefouten toe te brengen aan de vier onderzoeksorganismen. De waargenomen effecten waren dosisafhankelijk, waarbij hogere niveaus van mutageen een overeenkomstige toename van transcriptiefouten veroorzaakten.

Verborgen fouten kunnen kostbaar zijn voor de gezondheid

Transcriptiefouten verschillen in ten minste één essentieel opzicht van mutaties in het genoom. Terwijl DNA-replicatie tijdens celdeling mutaties in het genoom versterkt, kunnen transcriptiefouten zich ophopen in niet-delende cellen, waarbij een enkele gemuteerde DNA-template aanleiding geeft tot meerdere abnormale RNA-transcripten.

De volledige effecten van deze transcriptiefouten op de menselijke gezondheid blijven grotendeels speculatief omdat ze tot nu toe niet konden worden bestudeerd. Met behulp van de nieuwe techniek kunnen onderzoekers het transcriptoom ontginnen - de volledige bibliotheek van de RNA-transcripten van een levende cel, op zoek naar fouten veroorzaakt door mutagenen.

Hoewel het nieuwe onderzoek hoop biedt op een grondiger begrip van de relatie tussen verschillende mutagenen en de menselijke gezondheid, is het ook een waarschuwend verhaal. Een preoccupatie met mutatiedefecten in de DNA-sequentie heeft de wetenschap mogelijk blind gemaakt voor de mogelijke effecten van middelen die resulteren in transcriptiefouten zonder permanente sporen in het genoom achter te laten.

Dit feit verhoogt de mogelijkheid dat een breed scala aan omgevingsfactoren, evenals chemicaliën en voedingsmiddelen die als veilig worden beschouwd voor menselijke consumptie, een zorgvuldige herevaluatie nodig hebben op basis van hun potentieel voor het produceren van transcriptionele mutagenese. Verder zijn transcriptiefouten in zowel delende als niet-delende celtypen waarschijnlijk belangrijke spelers in de complexe processen van fysieke veroudering en mentale achteruitgang.


Wat is het beste oplosmiddel voor Mutageen X? - Biologie

Een mutageen is een stof die een blijvende wijziging in de fysieke samenstelling van een DNA-gen teweeg kan brengen, zodat de genetische boodschap wordt gewijzigd.

Als het gen eenmaal is beschadigd of veranderd, zal het mRNA dat van dat gen is getranscribeerd, nu een gewijzigde boodschap bevatten.

Het polypeptide dat is gemaakt door het veranderde mRNA te vertalen, zal nu een andere sequentie van aminozuren bevatten. De functie van het eiwit dat wordt gemaakt door dit polypeptide te vouwen, zal waarschijnlijk worden veranderd of verloren gaan. In dit voorbeeld is het enzym dat de productie van bloemkleurpigment katalyseert zodanig gewijzigd dat het niet langer de productie van het rode pigment katalyseert.

Er wordt geen product (rood pigment) geproduceerd door het gewijzigde eiwit.

  • bootsen de juiste nucleotidebasen in een DNA-molecuul na, maar slagen er niet in om correct te baseren tijdens DNA-replicatie.
  • verwijder delen van het nucleotide (zoals de aminogroep op adenine), wat opnieuw een onjuiste basenparing veroorzaakt tijdens DNA-replicatie.
  • voeg koolwaterstofgroepen toe aan verschillende nucleotiden, wat ook een onjuiste basenparing veroorzaakt tijdens DNA-replicatie.

Straling Hoogenergetische straling van een radioactief materiaal of van röntgenstralen wordt geabsorbeerd door de atomen in watermoleculen die het DNA omringen. Deze energie wordt overgedragen aan de elektronen die vervolgens wegvliegen van het atoom. Achtergelaten is een vrije radicaal, een zeer gevaarlijk en zeer reactief molecuul dat het DNA-molecuul aanvalt en op vele manieren verandert.
Straling kan ook dubbelstrengsbreuken in het DNA-molecuul veroorzaken, die de reparatiemechanismen van de cel niet kunnen herstellen.

Zonlicht bevat ultraviolette straling (het bestanddeel dat zonnebrand veroorzaakt) dat, wanneer het wordt geabsorbeerd door het DNA, een kruisverbinding veroorzaakt tussen bepaalde aangrenzende basen. In de meeste normale gevallen kunnen de cellen deze schade herstellen, maar niet-gerepareerde dimeren van dit soort zorgen ervoor dat het replicerende systeem de fout overslaat en een leemte achterlaat die later zou moeten worden opgevuld.
Onbeschermde blootstelling aan UV-straling door de menselijke huid kan ernstige schade veroorzaken en kan leiden tot huidkanker en uitgebreide huidtumoren.

Spontane mutaties treden op zonder blootstelling aan een duidelijk mutageen middel. Soms verschuiven DNA-nucleotiden zonder waarschuwing naar een andere chemische vorm (bekend als een isomeer) die op zijn beurt een andere reeks waterstofbindingen met zijn partner zal vormen. Dit leidt tot fouten op het moment van DNA-replicatie.

Wetenschap op afstand
&kopie 1997, 1998, 1999, 2000 Professor John Blamire


3.3C: Bepalen welk oplosmiddel te gebruiken

  • Bijgedragen door Lisa Nichols
  • Professor (Chemie) aan Butte College

De belangrijkste factor voor het succes van kristallisatie is waarschijnlijk het gekozen oplosmiddel. Naast de cruciale oplosbaarheidseigenschappen voor kristallisatie (de verbinding moet oplosbaar zijn in het hete oplosmiddel en zo onoplosbaar mogelijk in het koude oplosmiddel), zijn er andere factoren die een geschikt oplosmiddel bepalen.

Een ideaal kristallisatieoplosmiddel zou niet-reactief, goedkoop en een lage toxiciteit moeten hebben. Ook is het van belang dat het oplosmiddel een relatief laag kookpunt heeft (kp. vaak (< 100^ ext ekst) omdat het het beste is als het oplosmiddel na herstel gemakkelijk uit de vaste stof verdampt. Tabel 3.1 toont een lijst van gebruikelijke oplosmiddelen die bij kristallisatie worden gebruikt. Tolueen heeft het hoogste kookpunt (links( 111^ ext ekst ight)) van de lijst, en moet worden vermeden als er om deze reden alternatieven bestaan ​​(evenals de toxiciteit en geur). Naast snelle verdamping is een relatief laagkokend oplosmiddel ook ideaal voor kristallisatie, omdat het de kans minimaliseert dat een verbinding "uit olie" komt, waarbij materiaal boven het smeltpunt uit de oplossing komt en een vloeistof vormt in plaats van een vaste stof. Wanneer een verbinding eerst vloeibaar wordt, kristalliseert deze zelden goed.

Tabel 3.1: Kookpunt van gebruikelijke oplosmiddelen bij kristallisatie. Opmerking: petroleumether is een mengsel van koolwaterstoffen en is zeer apolair. De term "ether" komt van zijn vluchtigheid, niet van de aanwezige functionele groepen.
oplosmiddel Kookpunt (°C)
Diethyl ether 35
Aceton 56
Petroleumether (laagkokend) 30-60
Ligroin (hoogkokende petroleumether) 60-90
Methanol 65
Hexanen 69
Athylacetaat 77
ethanol 78
Water 100
Tolueen 111

Oplosmiddelen met een zeer laag kookpunt (bijv. diethylether, aceton en petroleumether met een laag kookpunt) zijn zeer ontvlambaar en kunnen moeilijk zijn om mee te werken omdat ze gemakkelijk verdampen. Ze kunnen nog steeds met zorg worden gebruikt, maar als er alternatieven zijn, hebben ze vaak de voorkeur.

Er zijn enkele algemene trends bij het voorspellen van het juiste oplosmiddel voor een bepaalde verbinding. Omdat de verbinding oplosbaar moet zijn in het kokende oplosmiddel, helpt het als de verbinding en het oplosmiddel vergelijkbare intermoleculaire krachten hebben. Als een verbinding bijvoorbeeld waterstof kan binden (alcoholen, carbonzuren en aminen), kan deze soms uit water worden gekristalliseerd. Als een verbinding een matige polariteit heeft, wordt deze soms gekristalliseerd uit ethanol. Als een verbinding meestal niet-polair is, wordt deze soms gekristalliseerd uit petroleumether of hexanen, of kan een gemengd oplosmiddel nodig zijn.

Omdat het moeilijk kan zijn om het ideale oplosmiddel voor kristallisatie te voorspellen, geeft een gepubliceerde procedure uit een tijdschriftartikel vaak het juiste oplosmiddel aan. Als er geen oplosmiddel wordt vermeld, kan een geschikt oplosmiddel worden voorspeld met behulp van oplosbaarheidsgegevens (volgende sectie), experimenteel bepaald of gekozen uit Perrin's Zuivering van organische chemicaliën,(^4) een naslagwerk waarin zuiveringsprocedures worden opgesomd voor ongeveer 5700 bekende verbindingen.

(^4)D.D. Perrin, W.L.F. Armarego, Zuivering van organische chemicaliën, Pergamon Press, 3(^ ext) editie, 1988.


3. De aard van eiwitkristallen  

Röntgenanalyse is een unieke gebeurtenis die beperkt is tot het onderzoekslaboratorium en het eindproduct is wetenschappelijke basiskennis. De kristallen zelf hebben, op enkele uitzonderingen na, geen medicinale of farmaceutische waarde, maar dienen gewoon als tussenpersoon in het kristallografische proces. De kristallen leveren de röntgendiffractiepatronen die op hun beurt dienen als de onbewerkte gegevens die de directe visualisatie van de macromoleculen of hun complexen waaruit de kristallen zijn samengesteld mogelijk maken. Enkele voorbeelden van kristallen van eiwitten en virussen die zijn gekweekt in een van de laboratoria van de auteur (AM) worden getoond in Fig. 1 ▶ .

Microfoto's van eiwit- en viruskristallen gekweekt in het laboratorium van AM tonen de verscheidenheid aan gewoonten die macromoleculaire kristallen gemeen hebben. (een, B, F) Satelliettabakmozaïekvirus, (C) Desmodium geelvlekvirus, (NS) zeshoekig canavaline en (e) intact antilichaam tegen hondenlymfoom.

Bij het kristalliseren van eiwitten voor röntgendiffractie-analyse heeft men meestal te maken met homogene, vaak uitzonderlijk zuivere macromoleculen, en het doel kan zijn om slechts enkele grote, hoogwaardige, hoogwaardige kristallen te laten groeien. Het is belangrijk om te benadrukken dat hoewel het aantal benodigde kristallen misschien klein is, de beschikbare hoeveelheid eiwit vaak ernstig beperkt is. Dit legt op zijn beurt ernstige beperkingen op aan de benaderingen en strategieën die kunnen worden gebruikt om die kristallen te verkrijgen. Hoewel nieuwe methodologieën zoals synchrotronstraling (Helliwell, 1992 ▶) en cryokristallografie (Garman & Schneider, 1997 ▶) de noodzakelijke grootte en het aantal specimenkristallen consequent naar beneden hebben gedreven, hebben ze de behoefte aan kristal kwaliteit en stabiliteit.

Macromoleculaire kristallen bestaan ​​gemiddeld uit ongeveer 50% oplosmiddel, hoewel dit kan variëren van 25 tot 90%, afhankelijk van het specifieke macromolecuul. Eiwit of nucleïnezuur neemt het resterende volume in beslag, zodat het gehele kristal in veel opzichten een geordende gel is die doordrongen is van uitgebreide interstitiële ruimten waardoor oplosmiddel en andere kleine moleculen vrijelijk diffunderen.

In verhouding tot zijn molecuulmassa is het aantal bindingen (zoutbruggen, waterstofbruggen, hydrofobe interacties) dat een conventioneel molecuul vormt met zijn buren in een kristal veel groter dan de weinige die worden vertoond door kristallijne macromoleculen. Aangezien deze contacten zorgen voor de roosterinteracties die essentieel zijn voor kristalonderhoud, verklaart dit grotendeels het verschil in eigenschappen tussen kristallen van zouten of kleine moleculen en van macromoleculen (Chernov, 2003 ▶ Vekilov & Chernov, 2002 ▶).

Levende systemen zijn bijna uitsluitend gebaseerd op waterige chemie binnen nauwe temperatuur- en pH-bereiken. Macromoleculen hebben dus een geschikte compatibiliteit ontwikkeld en ernstige afwijkingen of verstoringen worden zelden getolereerd. Als gevolg hiervan moeten alle eiwit- en nucleïnezuurkristallen worden gekweekt uit waterige oplossingen waarvoor ze tolerant zijn, en deze oplossingen worden moederlogen genoemd. Macromoleculaire kristallen zijn tot nu toe alleen uit dergelijke media gegroeid.

Hoewel ze qua morfologie en uiterlijk vergelijkbaar zijn, zijn er belangrijke praktische verschillen tussen kristallen van verbindingen met een laag molecuulgewicht en kristallen van eiwitten en nucleïnezuren. Kristallen van conventionele moleculen worden gekenmerkt door stevige roosterkrachten, zijn relatief sterk geordend, zijn over het algemeen fysiek hard en bros, zijn gemakkelijk te manipuleren, kunnen meestal worden blootgesteld aan lucht, hebben sterke optische eigenschappen en buigen röntgenstralen intens af. Macromoleculaire kristallen zijn, ter vergelijking, gewoonlijk beperkter in grootte, zijn erg zacht en breken gemakkelijk, vallen uiteen als ze mogen uitdrogen, vertonen zwakke optische eigenschappen en buigen röntgenstralen slecht af. Macromoleculaire kristallen zijn temperatuurgevoelig en ondergaan uitgebreide schade na langdurige blootstelling aan straling. Vaak moeten meerdere of zelfs veel kristallen worden geanalyseerd om een ​​structuurbepaling succesvol te laten zijn, hoewel de komst van cryokristallografie (Pflugrath, 1992 ▶), CCD-gebiedsdetectoren met een zeer hoge fotonentelefficiëntie en dynamisch bereik (Gruner et al., 2001 ▶), synchrotron röntgenbronnen met hoge intensiteit (Pflugrath, 1992 ▶ Helliwell, 1992 ▶) en nieuwe faseringsmethoden (Rossmann & Arnold, 2001 ▶) hebben deze beperking sterk verminderd .

De omvang van het diffractiepatroon van een kristal is direct gecorreleerd met de mate van interne orde. Hoe groter het patroon, of hoe hoger de resolutie waartoe het zich uitstrekt, des te meer structureel uniform zijn de moleculen in het kristal en des te nauwkeuriger is hun periodieke rangschikking. Het detailniveau waarop atomaire posities kunnen worden bepaald door kristalstructuuranalyse komt nauw overeen met deze mate van kristallijne orde. Terwijl conventionele kristallen vaak buigen tot hun theoretische resolutielimiet, produceren eiwitkristallen, in vergelijking, diffractiepatronen van een beperktere omvang.

De vloeistofkanalen en met oplosmiddel gevulde holtes die macromoleculaire kristallen doordringen, zijn primair verantwoordelijk voor de beperkte resolutie van de diffractiepatronen. Vanwege de relatief grote ruimten tussen aangrenzende moleculen en de daaruit voortvloeiende zwakke roosterkrachten, kunnen alle moleculen in het kristal niet exact equivalente oriëntaties en posities innemen, maar kunnen ze enigszins variëren binnen of tussen eenheidscellen. Bovendien kunnen eiwitmoleculen in een bepaald kristal, vanwege hun structurele complexiteit en hun potentieel voor conformationele dynamiek, lichte variaties vertonen in het verloop van hun polypeptideketens of in de disposities van zijgroepen van de ene naar de andere.

Hoewel de aanwezigheid van uitgebreide oplosmiddelgebieden een belangrijke bijdrage levert aan de over het algemeen bescheiden diffractiekwaliteit van eiwitkristallen, is het ook verantwoordelijk voor hun waarde voor biochemici. Vanwege het hoge oplosmiddelgehalte zijn de afzonderlijke macromoleculen in eiwitkristallen omgeven door waterlagen die hun structuur vrijwel ongewijzigd behouden ten opzichte van die in oplossing. Dientengevolge zijn ligandbinding, enzymatische, spectroscopische kenmerken en de meeste andere biochemische kenmerken in wezen hetzelfde als voor het volledig gesolvateerde molecuul. Conventionele chemische verbindingen, die ionen, liganden, substraten, co-enzymen, remmers, geneesmiddelen of andere effectormoleculen kunnen zijn, kunnen vrijelijk in en uit de kristallen worden gediffundeerd. Kristallijne enzymen, hoewel geïmmobiliseerd, zijn volledig toegankelijk voor experimenten door eenvoudigweg de omringende moederloog te veranderen.

Polymorfisme, zoals blijkt uit Fig. 1 ▶ , is een veel voorkomend verschijnsel voor eiwitten, nucleïnezuur en viruskristallen. Vermoedelijk is dit een gevolg van hun conformationeel dynamisch bereik en de gevoeligheid van de betrokken roostercontacten. Er kunnen dus verschillende gewoonten en verschillende eenheidscellen voortkomen uit wat volgens de meeste normen identieke omstandigheden zouden worden genoemd. In feite worden soms meerdere kristalvormen naast elkaar gezien in hetzelfde monster van moederloog.

Er zijn nog meer verschillen die de kristallisatie van macromoleculen bemoeilijken in vergelijking met conventionele kleine moleculen (Feigelson, 1988 ▶ Feher, 1986 ▶ Durbin & Feher, 1996 ▶ McPherson, 1982 ▶, 1999 ▶ McPherson et al., 1995 ▶). Ten eerste kunnen macromoleculen verschillende onderscheidende vaste toestanden aannemen, waaronder amorfe precipitaten, oliën of gels, evenals kristallen, en de meeste hiervan hebben kinetisch de voorkeur. Ten tweede kiemen macromoleculaire kristallen, of initiëren ze ontwikkeling, alleen bij zeer hoge niveaus van oververzadiging, vaak twee tot drie orden van grootte groter dan nodig is om de groei in stand te houden. Ten slotte is de kinetiek van macromoleculaire kristalkiemvorming en groei in het algemeen twee tot drie ordes van grootte langzamer dan voor conventionele moleculen (Kuznetsov et al., 1995 ▶ Malkin et al., 1996 ▶, 1997 ▶). Dit laatste verschil komt voort uit hun aanzienlijk grotere omvang, lagere diffusiviteit en zwakkere associatieneigingen in vergelijking met kleine moleculen of ionen, evenals de lagere waarschijnlijkheid van opname van een binnenkomend macromolecuul in een groeistap (Chernov, 2003 ▶ Vekilov & Tsjernov, 2002 ▶).


Chemische mutagenen:

Chemicaliën zijn eigenlijk gevaarlijk voor de hele wereld. Het eerste mutagene effect van de stikstofmosterd werd in 1942 gemeld door Charlotte Auerbach.

(de stikstofmosterd is een giftig gas dat tijdens de Eerste en Tweede Wereldoorlog werd gebruikt).

Basis analogen:

De base-analogen zijn chemicaliën die lijken op de basen van DNA-purine en pyrimidines of die qua structuur op de DNA-basen lijken. Bromouracil en aminopurine zijn twee veel voorkomende base-analogen die tijdens het replicatieproces in DNA worden ingebouwd in plaats van in normale basen.

De 5-bromouracil zijn kunstmatig gesynthetiseerde moleculen - een base-analoog die wordt gebruikt in het genetische onderzoek dat in het DNA wordt opgenomen in plaats van de thymine. In plaats van de methylgroep van de thymine, bevat de broomuracil een Br-groep die sterk lijkt op de thymine.

Het paren met de adenine als de thymine en produceert de mutatie. Zie onderstaande afbeelding,

De koppeling van adenine en 5-bromouracil.

Het mechanisme van 5-BU-actie is best interessant. Tijdens de replicatie genereert het in plaats van thymine de guanine die gepaard gaat met het cytosine. Zie onderstaande afbeelding,

De broomuracil vervangt de adenine en paren met de guanine tijdens replicatie.

Het TA-basenpaar wordt dus aan het einde van de replicatie vervangen door het GC-basenpaar en dit gebeurt vanwege de tautomere verschuiving van 5-BU van 'enol' naar 'keto'-vorm. Het hele mechanisme ervan wordt weergegeven in de onderstaande afbeelding,

Grafische illustratie van het effect van base-analoog-broomuracil op DNA. Het gesprek van AT-basenpaar met het CG-basenpaar.

Aminopurines:

Een ander base-analogon is AP of aminopurine dat vergelijkbaar is met adenine en kan paren met T of C, hoewel paren met C minder vaak voorkomt. Het kan ook de overgang van AT naar GC of van GC naar AT veroorzaken tijdens de replicatie.

Alkyleringsmiddelen:

Ethylnitrosoureum, mosterdgas en vinylchloride zijn veelvoorkomende alkylerende middelen die een alkylgroep aan het DNA toevoegen en het beschadigen. De middelen veroorzaken basenparingfouten door de ionisatie te verhogen en veroorzaken gaten in de DNA-streng.

De gealkyleerde purinebasen worden verwijderd door het fenomeen dat depurinatie wordt genoemd, hoewel depurinatie niet mutageen is en kan worden gerepareerd door de DNA-reparatieroute.

  1. Methylhydrazine
  2. Temozolomide
  3. Dacarbazine
  4. Busulfan
  5. Thio-TEPA
  6. Carmustine
  7. lomustine
  8. Dimethylsulfaat
  9. Ethylethaansulfaat

"Wanneer nitriteiten (conserveringsmiddelen) aan gerookt vlees worden toegevoegd, vormt het nitrosamine-achtig mutageen dat DNA kan breken of DNA-verknoping kan creëren."

Intercalerende middelen:

Komt er iets in je op?

Ons EtBrethidiumbromide dat wordt gebruikt tijdens de agarosegelelektroforese is een van de intercalerende middelen. Andere intercalerende middelen zoals proflavine, acridine-sinaasappel of daunorubicine werken door hetzelfde mechanisme als de EtBr.

De moleculen intercaleren tussen de basen van DNA en verstoren de structuur ervan. Als het tijdens de replicatie wordt opgenomen, kan het frameshift-mutatie veroorzaken. Het kan ook transcriptie blokkeren.

De grafische illustratie van het effect van een intercalerend middel op DNA.

De intercalerende middelen veroorzaken ofwel deletie of insertie en verstoren de DNA-structuur.

Metaalionen:

Metaalionen zijn ook gevaarlijk voor ons DNA omdat het op verschillende manieren werkt. Nikkel, chroom, kobalt, cadmium, arseen, chroom en ijzer zijn enkele van de meest voorkomende metaalionen die mutaties veroorzaken.

De metaalionen werken door ROS (reactieve zuurstofspecies) te produceren, het DNA-herstelpad te belemmeren, DNA-hypermethylering te veroorzaken of het DNA direct te beschadigen.

Andere chemische mutagenen:

ROS-reactieve zuurstofsoorten, benzeen, synthetisch rubber en rubberproducten, natriumazide, aromatische aminen, alkaloïden, deamineringsmiddelen en PAK (Polycyclische aromatische koolwaterstoffen) zijn andere mutagenen die verschillende mutaties veroorzaken.

De base-analoog en het intercalerende middel, respectievelijk 5- broomuracil en acridine.


Slotopmerkingen en onbeantwoorde vragen

Zoals overal in dit hoofdstuk opgemerkt, Drosophila mist een aantal eiwitten die essentieel zijn voor DNA-herstel in andere modelorganismen. Om deze reden, Drosophila werd soms gezien als een eigenaardigheid. Aangezien herstelroutes echter over het algemeen vergelijkbaar lijken te zijn met die van andere organismen, is het waarschijnlijk dat voortgezette studies naar DNA-herstel in Drosophila zal leiden tot nieuwe inzichten in reparatiemechanismen door te onthullen hoe reparatieroutes functioneren bij afwezigheid van belangrijke componenten. Interessante vragen zijn onder meer:

Hoe is Drosophila grote hoeveelheden uracil in het DNA van larvale weefsels kunnen verdragen?

Wat zijn de gevolgen van het ontbreken van transcriptie-gekoppelde NER, wat belangrijk is bij zowel schimmels als zoogdieren?

Hoe werkt? Drosophila niet-complementaire DSB-uiteinden voor NHEJ verwerken, aangezien er geen B-familie-polymerasen zijn en geen Artemis-nuclease?

Hoe werkt? Drosophila Rad51-filamentvorming bereiken zonder BRCA1, Rad52 of Rad51B?

Wat zijn de signalen die translesie-polymerasen rekruteren naar beschadigde basen die replicatievorken tegenkomen?

Antwoorden zullen waarschijnlijk de promotie van secundaire routes naar primaire rollen omvatten, een manier bieden om deze routes beter te begrijpen, en rekrutering of uitvinding van andere eiwitten om de plaats in te nemen van degenen die ontbreken (zie Kohl et al. 2012 voor een voorbeeld hiervan in meiotische recombinatie).

Een gebied waarin Drosophila heeft een bijzonder belangrijke bijdrage geleverd als modelorganisme voor het bestuderen van DSB-reparatiemechanismen en -gevolgen, te beginnen met de ontdekking dat röntgenstralen chromosoomherschikkingen en recombinatie induceren (Muller 1927 Friesen 1933 Patterson en Suche 1934), en doorgaand tot meer recente analyses van gap reparatie volgende P element excisie, wat resulteerde in het SDSA-model van HR (Nassif et al. 1994), en de ontdekking van de sleutelrol van Polθ in het Ku-onafhankelijke EJ (Chan et al. 2010). Veel details van deze processen moeten nog worden opgehelderd. Interessant is dat bij een enkele reparatie zowel SDSA als TMEJ betrokken kunnen zijn (Adams et al. 2003) is een belangrijke vraag nu waardoor een cel overschakelt van SDSA naar TMEJ (Figuur 2).

Het begrijpen van DSB-reparatiemechanismen is nog belangrijker met de recente ontwikkeling van de bacteriële CRISPR/Cas9-systemen om genoomengineering uit te voeren (Cong et al. 2013 Mali et al. 2013). Empirische gegevens van trial-and-error-inspanningen, hoewel gebaseerd op ons onvolledige begrip van DSB-reparatieroutes, zijn erin geslaagd het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie te verbeteren en uit te breiden om precieze genomische veranderingen aan te brengen in een grote verscheidenheid aan organismen, zowel traditionele modellen als soorten voorheen niet vatbaar voor genetische analyses (besproken in Zhang et al. 2016). Uit discussies met collega's en observaties in mijn eigen laboratorium blijkt echter dat reparatiegebeurtenissen die niet gemakkelijk kunnen worden verklaard door de huidige paradigma's, niet zeldzaam zijn. Het is misschien nooit mogelijk om elke ongebruikelijke reparatiegebeurtenis te verklaren, maar een beter begrip van het complexe netwerk van mogelijkheden zal zeker helpen om deze technologie verder te ontwikkelen. Experimenten die gebruik maken van de talrijke beschikbare tools om Drosophila onderzoekers moeten hierbij een rol spelen.


  • Antibiotica zijn de secundaire metabolieten van micro-organismen.
  • Tijdens de verwerking moet het antibioticum worden geëxtraheerd en gezuiverd tot een kristallijn product.
  • Nuttige antibiotica worden vaak ontdekt via een screeningsproces of een rationeel ontwerpproces.
  • antibiotica: Elke stof die de groei van bacteriën en soortgelijke micro-organismen kan vernietigen of remmen.
  • fermentatie: Een van de vele anaërobe biochemische reacties waarbij een enzym (of meerdere enzymen geproduceerd door een micro-organisme) de omzetting van de ene stof in een andere katalyseert, met name de omzetting (met gist) van suikers in alcohol of azijnzuur met de ontwikkeling van kooldioxide.
  • metaboliet: Elke stof die wordt geproduceerd door, of deelneemt aan, een stofwisselingsreactie.

Antibiotica worden industrieel geproduceerd door middel van een fermentatieproces, waarbij het bronmicro-organisme wordt gekweekt in grote containers (100.000 & ndash 150.000 liter of meer) die een vloeibaar groeimedium bevatten.

Zuurstofconcentratie, temperatuur, pH en nutriëntenniveaus moeten optimaal zijn en worden nauwlettend gevolgd en indien nodig aangepast. Aangezien antibiotica secundaire metabolieten zijn, moet de populatiegrootte zeer zorgvuldig worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat een maximale opbrengst wordt verkregen voordat de cellen afsterven. Zodra het proces is voltooid, moet het antibioticum worden geëxtraheerd en gezuiverd tot een kristallijn product. Dit is eenvoudiger te bereiken als het antibioticum oplosbaar is in een organisch oplosmiddel. Anders moet het eerst worden verwijderd door ionenuitwisseling, adsorptie of chemische precipitatie.

Micro-organismen die bij fermentatie worden gebruikt, zijn zelden identiek aan hun tegenhangers in het wild. Dit komt doordat soorten vaak genetisch gemodificeerd zijn om de maximale hoeveelheid antibiotica op te leveren. Mutatie wordt vaak gebruikt en wordt aangemoedigd door de introductie van mutagenen zoals ultraviolette straling, röntgenstralen of bepaalde chemicaliën. Selectie en verdere reproductie van de soorten met een hogere opbrengst over vele generaties kunnen de opbrengsten met een factor 20 of meer verhogen. Een andere techniek die wordt gebruikt om de opbrengst te verhogen, is genamplificatie, waarbij kopieën van genen die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de productie van antibiotica, via vectoren zoals plasmiden terug in een cel kunnen worden ingebracht. Dit proces moet nauw worden verbonden met het opnieuw testen van de productie en effectiviteit van antibiotica.

Figuur: Een agarplaat met micro-organismen: Dit is een agarplaat met strepen van micro-organismen.

Ondanks de grote verscheidenheid aan bekende antibiotica heeft minder dan 1% van de antimicrobiële middelen medische of commerciële waarde. Terwijl penicilline bijvoorbeeld een hoge therapeutische index heeft omdat het over het algemeen geen menselijke cellen aantast, is dit niet het geval voor veel antibiotica. Andere antibiotica hebben eenvoudigweg geen voordeel ten opzichte van degenen die al in gebruik zijn of hebben geen andere praktische toepassingen.

Nuttige antibiotica worden vaak ontdekt via een screeningsproces. Om een ​​dergelijke screening uit te voeren, worden isolaten van veel verschillende micro-organismen gekweekt en vervolgens getest op de productie van diffundeerbare producten die de groei van testorganismen remmen. De meeste antibiotica die in een dergelijke screening worden geïdentificeerd, zijn al bekend en moeten daarom worden genegeerd. De rest moet worden getest op hun selectieve toxiciteit en therapeutische activiteiten, en de beste kandidaten kunnen worden onderzocht en mogelijk aangepast.

Een modernere versie van deze benadering is een rationeel ontwerpprogramma. Het gaat hierbij om screening gericht op het vinden van nieuwe natuurlijke producten die een specifiek doelwit remmen, zoals een enzym dat alleen in het doelwitpathogeen wordt aangetroffen, in plaats van tests om algemene remming van een kweek aan te tonen.


Methode

L ) Isoleer een auxotrofe stam van Salmonella Typhimurium voor histidine. (dwz. Zijn-ve)

II) Bereid een testsuspensie van his-ve Salmonella Typhimurium in een gewone buffer met teststof (bijv. 2-aminofluoreen). Voeg ook een kleine hoeveelheid histidine toe.

Opmerking: er is een kleine hoeveelheid histidine nodig, zodat bacteriën beginnen te groeien. Als histidine eenmaal is uitgeput, zijn alleen die bacteriën gemuteerd om het vermogen te krijgen om kolonies in histidine-vorm te synthetiseren.

III) Bereid ook een controlesuspensie van His-ve Salmonella Typhimurium, maar zonder testchemicaliën.

NS) Incubeer de suspensies gedurende 20 minuten bij 37°C

V) Prepare the two agar plate and spread the suspension on agar plate.

VI) Incubate the plates at 37°C for 48 hours.

VII) After48 hours count the number of colonies in each plate.


Gene Mutations: Causes, Examples, and Types

The term ‘mutation’ was introduced by Hugo De Vries, a Dutch Botanist and also rediscovered of Mendel’s laws of heredity.

Mutation is a sudden, hereditary change in the genetic make up of an organism. Mutation is of two types gene mutations or point mutations and chromosomal mutations.

Gene mutations include changes in the structure or composition of genes whereas chromosomal mutations or chromosomal aberrations involve changes in the structure or number of chromosomes about which discussions have been made in the preceding paragraphs.

Since gene consists of few segments of DNA, gene mutations include changes in the number or arrangement of nucleotides. Thus, gene mutations alter or modify the expressions of a particular gene. Sickle cell anemia, chlorophyll deficiencies in plants and albinism (loss of pigment) are caused by gene mutations. Naturally occurring mutations are known as spontaneous mutations. In 1910, Morgan found few white eyed Drosophila in a population of no – mal red eyed Drosophila. In Drosophila many mutant forms such as white eye, black body, vestigial wings arose through spontaneous mutations.

Mutations caused by mutagenic agents like X-ray, Ultra-violet rays, mustard gas, formaldehyde, caffeine, phenol etc. are known as induced mutations. In contrast to spontaneous mutations, the frequency of induced mutations is high.

Causes of Gene Mutations:

Since gene mutations or point mutations involve changes in the number of nucleotides in a DNA segment or cistron, it is otherwise known as the frame shift mutations. Addition or insertion of one or more nucleotides or deletion of one or more nucleotides changes the sequence of amino acids during protein synthesis. If a nucleotide pair (= nitrogenous base pair) is substituted (substitution mutations) by another pair it will also produce gene mutations.

These substitutions are caused either as:

In transition, a purine is replaced by another purine and a pyrimidine is replaced by another pyrimidine i.e., A = T is replaced by G = C or vice-versa. In trans version, a purine is replaced by a pyrimidine or a pyrimidine by a purine, i.e., C = G is replaced by G = C or A = I is replaced by T = A.

Examples of Gene Mutations:

The earliest record of gene mutations dates back to 1791, when Seth Wright observed a lamb with unusually short legs in his flock of sheep. This short legged or Ancon sheep could not gel over the low stone fence and damage the crop in the nearby fields. Wright thought that it would be worthwhile to have a whole flock of these short legged sheep for this reason.

In the successive generations, this character was transferred and a line was developed where all sheep had short legs. This trait resulted from a recessive mutation and the short legged individuals were homozygous recessive. This gene mutation was discovered at a time when the science of genetics did not even have its birth.

The scientific study of mutations started in 1910, when T.H. Morgan started his work on fruitfully, Drosophila melanogaster, and reported white eyed male individuals among normal red eyed females. Later it was found that the gene for this character was found on sex chromosome.

The human blood disease sickle cell anemia is another example of point mutation. It is caused due to abnormal haemoglobin S which is an insufficient oxygen carrier. It has been observed that the abnormal haemoglobin differs from the normal one only in its two P polypeptide chains (haemoglobin 2 alpha and 2 beta chains) which contain amino acid valine instead of glutamic acid at the position sixth.

Minor change involving two nucleotides in DNA brings substitution in amino acid and thus producing profound change preventing synthesis of normal haemoglobin. Thalassemia, Phenyl ketonuria, alcaptonuria and many other human diseases are caused by simple base substitution in the nucleotide that prevents synthesis of normal protein. Gene mutations although cause minute change in the base pairing, its impact is largely felt by the organisms bearing such mutant gene.

Types of Mutations:

Generally mutations are harmful or deleterious and do not produce visible effects. Less than 20% mutations are lethal. The mutant genes when present in homozygous condition cause death of the organism. Mutant genes are mostly recessive to the normal gene. These genes produce their effects only in homozygous condition hence remain undetected for a period of time. It means that the mutation rate is actually much higher than the frequency of visible or detectable mutations.

(i) Forward and Reverse Mutations:

A mutation from wild type (original type) to a new type is known as forward mutation. The mutated gene may mutate back to the wild type. It is known as reverse mutation.

(ii) Somatic and Gametic Mutations:

Mutations occurring in somatic or non-reproductive cells are called somatic mutations, these are not heritable and are lost with ‘he death of the mutant organism. Mutations occurring in germ cells or gametes produce gametic mutations which are heritable.

(iii) Spontaneous and Induced Mutations.

Spontaneous mutations occur in natural conditions and have a very low frequency. Under experimental or artificial conditions induced mutations are caused. Any physical or chemical agent which introduces mutation in an organism is a mutagen or mutagenic agent. H.J. Muller (1927) induced mutations in Drosophila by X-rays and observed that the frequency of mutations is directly proportional to the amount of X-ray.

Role of Mutation in Evolution:

Hugo De Vries (1901) of Netherland propounded the mutation theory of evolution. According to him new species evolve from earlier species, not by natural selection and accumulation of small, continuous variations through generations, but by sudden heritable changes in the characteristics of the individuals. Later, the mutation theory was widely criticized on the point that “new species arose only by mutation”.

At present mutations are considered to be raw material for evolution. Other forces of evolution like natural selection, isolation, genetic drift etc. operate on mutations to bring divergence in the naturally inter breeding populations. Though, majority of mutations are harmful or disadvantageous to their possessors, but some may be harmless and a few advantageous.

Usefulness of Mutation:

Methods for inducing mutations are being widely used all over the world in the improvement of crop plants including food, fodder, horticulture, medicinal or industrial commodity plants. This is done with the help of some mutagens such as some chemicals and radiations. Nitrous oxide, ethylene, colchicine, mustard gas etc. are used as chemical mutagens.

Irradiations by X-rays, gamma rays etc. are also used to induce mutations. Many high yielding, high protein and high vitamin containing crops have been developed by irradiation. Sugar contents of sugarcane, oil contents of oil seed, fibre contents of many fibre yielding plants have been improved with the help of artificial mutation. Some insect pests are sterilized through artificial mutation which is an important attempt towards pest control.

(ii) In Animal Breeding:

Breeding of useful animals through mutation may lead to more healthy and disease resistant animal varieties. However, induced mutants have rarely been tried for this purpose although a number of mutant varieties of animals have also been found beneficial.

Short legged Acorn breed of sheep described in the earlier paragraph belongs lo this category. Now certain mutant varieties of cattle, horses, pigeon and cats have been selected and interbred to maintain their races. Some new breeds of sheep have been developed in U.S.A., Australia and New Zealand.

(iii) In Microorganisms:

It is easy to induce mutations in microorganisms like bread mould- Neurospora (a unicellular fungus) and intestinal bacterium Escherichia coli than the higher plants and animals. Haploid micro organisms have just one copy of each gene. In them, each and every mutation is expressed in the same generation and thus easy to locate mutation. Development of better varieties of yeast, Penicillium and some other microorganisms may increase commercial production of alcohol, antibiotics, acids and solvents.


Bekijk de video: Епизода 93 - Кој е најдобриот фитнес центар? (Januari- 2022).