Informatie

Wat kan DNA doen in zijn ongecondenseerde vorm?


Ik denk dat het twee dingen kan doen:

  • De cel kan het genoom dupliceren tijdens de S-fase.
  • De cel kan het DNA in mRNA transcriberen.

Vraag: Kunnen de twee activiteiten tegelijkertijd of één voor één plaatsvinden? Met andere woorden, zijn cellen efficiënte multitaskers?


In bacteriën kunnen ze dat tenminste. Onder optimale omstandigheden, E coli verdeelt zich ongeveer eens in de 20-30 minuten. Wat nog belangrijker is, de replicatietijd van het genoom is ongeveer 40-50 minuten. Dat betekent dat, in exponentiële fase, E coli heeft ten minste twee actieve replicatiebellen. Aangezien de dichtheid van ribosomen min of meer constant moet zijn, evenals de nieuwe cellen die peptidoglycaan en andere celcomponenten moeten synthetiseren, betekent dit dat replicatie en transcriptie gelijktijdig plaatsvinden. Zo niet, dan zouden ribosomen, enzymen, tRNA's en mRNA's bij elke replicatie worden verdund.

In eukarya zie ik geen reden waarom dat niet zou kunnen. De vorming van chromatine is geen willekeurige gebeurtenis en sommige specifieke eiwitten zijn nodig gedurende korte perioden tijdens sommige stappen van mitose, dus het is logisch om aan te nemen dat sommige specifieke delen niet zijn gecomprimeerd of dat transcriptionele activiteit zelfs in chromatine kan plaatsvinden.

Het specifieke gebied dat zichzelf in een bepaalde tijd dupliceert, zal waarschijnlijk niet in staat zijn om te transcriberen, omdat het polymerasecomplex behoorlijk groot is en ze de dubbele helix moeten openen, en dat. Maar dit is op de een of andere manier zoals kinderen die in de treinrails spelen. Als de trein nadert, blijven de kinderen uit elkaar en gaan ze weer verder als de trein weg is.


Is DNA gecondenseerd in g2?

Dubbelstrengs DNA draait tweemaal rond 8 histonen en vormt het nucleosoom, de bouwsteen van chromatineverpakking. DNA kan verder worden verpakt door het vormen van spoelen van nucleosomen, chromatinevezels genaamd. Deze vezels zijn gecondenseerd in chromosomen tijdens mitose, of het proces van celdeling.

hoe heet gecondenseerd DNA? DNA Structuur. Laten we, voordat we mitose bespreken, de structuur bekijken van: DNA. Chromosomen worden door histoneiwitten verpakt in a gecondenseerd structuur genaamd chromatine. De twee identieke chromosomen die het resultaat zijn van: DNA replicatie worden zusterchromatiden genoemd.

Men kan zich ook afvragen, in welk deel van de celcyclus is DNA gecondenseerd?

Tijdens interfase (1) is chromatine op zijn minst gecondenseerd staat en lijkt losjes verdeeld over de kern. chromatine condensatie begint tijdens profase (2) en chromosomen worden zichtbaar. Chromosomen blijven gecondenseerd gedurende de verschillende stadia van mitose (2-5).

Wat is de g2-fase van de celcyclus?

G2 fase, of tussenruimte 2 fase, is de derde subfase van interfase in de celcyclus direct voorafgaand aan de mitose. Het volgt de succesvolle afronding van S fase, waarbij de cellen DNA wordt gerepliceerd. G2 fase is een periode van snelle cel groei en eiwitsynthese waarbij de cel bereidt zich voor op mitose.


Vormen van DNA

DNA (erfelijk materiaal van de cel) bestaat uit een lange polynucleotideketen en vertoont structurele diversiteit door de structurele configuratie te veranderen, gebaseerd op verschillende factoren zoals:

  • Het hydratatieniveau
  • Zoutconcentratie
  • DNA-sequentie:
  • Hoeveelheid en richting van supercoiling
  • Aanwezigheid van gemodificeerde basen
  • Aanwezigheid van metaalionen, polyaminen in de oplossing

Algemene vormen

Van de zes verschillende vormen van DNA zijn B-, A- en Z-vormen de meest voorkomende:

B-vorm

Het is de meest voorkomende vorm van DNA, die bestaat als a rechtshandig dubbel-helix DNA. Het werd ontwikkeld door Watson en Crick. B-DNA-structuur vormt zich onder normale fysiologische omstandigheden zoals 92% relatieve vochtigheid en lage ionsterkte.

Op basis van de röntgendiffractiestudies vertegenwoordigt B-DNA een gemiddelde conformatie van DNA. Het grootste deel van de cel bestaat uit een B-DNA-type en het oprollen van de B-vorm is in een rechtshandig patroon.

De nucleotidebasen bezetten de kern, terwijl het suiker-fosfaatbot de perifere regio van de DNA-helix. In het oplosmiddel zijn de basen aanwezig aan de randen van de B-vorm wordt blootgesteld. De breedte van elk basenpaar is vergelijkbaar in beide polynucleotideketens van DNA.

De diameter van de B-vorm helix is 20Å, en een enkele draai in B-vorm omvat 10 basenparen (loodrecht op de spiraalvormige as). Basen tonen complementaire basenparen op een manier zoals A=T en G≡C. Er is plectonemic coiling in de B-vorm, waarbij de twee strengen in dezelfde helix in elkaar wikkelen.

De B-vormige structuur is "asymmetrisch", omdat de grote en kleine groeven afwisselend aanwezig zijn. De grote en kleine groeven zijn respectievelijk breder en smal. Bij een B-type is de suikerplooi op "C2endovorm.

De breedte en diepte van de grote groeven van het B-type zijn: 12Å en 8.5Å, respectievelijk. Daarentegen zijn de breedte en diepte van de kleine groeven van het B-type: en 7,5Å, respectievelijk.

Een vorm

Het is de tweede meest voorkomende vorm van DNA, ook wel A-DNA genoemd. Het heeft DNA van rechts-spiraalvormige zin. A-DNA-structuur vormt zich onder normale fysiologische omstandigheden zoals 75% relatieve vochtigheid en de aanwezigheid van natrium-, kalium- en cesiumionen.

Het oprollen van A-DNA gebeurt op een rechtshandige manier. Het is metastabiel, d.w.z. verandert gemakkelijk in een D-vorm. De nucleotidebasen worden van de kern verwijderd en dichter bij de hoofdgroef gevonden.

De conformatie van basen in de A-vorm geeft aanleiding tot de lintachtig structuur met een open cilindrische kern. A-DNA wordt beschouwd als stabieler vanwege een extra –OH-groep. De breedte van elk basenpaar is vergelijkbaar in beide polynucleotideketens van DNA met een diameter van 23Å.

In de A-vorm is de helling van het basenpaar hoger dan de B-vorm. Een enkele draai in B-vorm omvat 11 basenparen (loodrecht op de spiraalvormige as). Ook in de A-vorm zijn beide strengen antiparallel of hebben ze een plectonemische spiraal.

In de A-vorm wordt de grote groef smaller en dieper, terwijl de kleine groef breder en afgeplat wordt. De suikerpucker of deoxyribose-ring is aanwezig bij C3 endoconformatie. De breedte van de grote groef van het B-type is: 2.7Å, terwijl de breedte van de kleine groef van het A-type is 11.0Å.

Z-vorm

Het is een andere vorm van DNA, die verschilt van zowel het B-DNA als het A-DNA. Het bestaat als linkshandig dubbel-helix DNA. Deze structuur vormt zich onder zeer hoge zoutconcentratie. Sommige cellen omvatten het Z-DNA-type en het werd voor het eerst geïntroduceerd door de drie wetenschappers Rijk, Northeim en Wang in 1984.

Het oprollen van de Z-vorm is in een linkshandige en zigzag patroon. De conformatie van Z-DNA is lang en dun vergeleken met het B-DNA. Het toont een asymmetrische structurele configuratie, die aanleiding geeft tot de spiraalvormige zigzagstructuur zonder interne ruimte.

Het Z-DNA wordt gevormd door het afwisselend uitrekken van purines en pyrimidinebasen. De diameter van de Z-vorm helix is 18Å, en de helling van het basenpaar is 7, wat lager is dan de B- en A-vorm. Een enkele draai in B-vorm omvat 12 basenparen, die loodrecht op de spiraalvormige as staan.

In Z-vorm is er ook een zigzag plectonemic coiling. Het bezit antiparallelle strengen zoals B-DNA. In het Z-type is de suikerpucker of deoxyribosering aanwezig op de "C"3” endoform voor de purinebasen en de “C2” endoform voor de pyrimidinebasen. De breedte van de grote groef van het Z-type is: , terwijl de breedte van de kleine groef van het Z-type is 8.8Å.

Andere vormen

Naast A-, B- en Z-vormen van DNA komen weinig andere typen zelden voor:

C-vorm

C-DNA wordt in minimale hoeveelheid gevonden en de configuratie ervan bestaat bij een relatieve vochtigheid van 66% met een lage ionsterkte. De helix van C-DNA is rechtshandig gedraaid met een helix-pitch van 30,97Å. Het bestaat uit 9,33 basenparen per beurt.

Beide strengen van C-DNA zijn antiparallel aan elkaar, in tegenstelling tot Z-DNA. C-DNA heeft een helixdiameter van 19,0. De rotatie per basenpaar is 38.6 graden, met een basenpaarkanteling van 7.8 graden. De grootte en vorm van het C-DNA zijn kleiner dan het B-DNA en A-DNA.

D-vorm

In de cel wordt zeer zelden D-DNA gevonden. De helix van D-DNA is rechtshandig gedraaid en wordt de poly (dA-dT) en poly (dG-dC) vorm genoemd. D-vorm bestaat uit 8 basenparen per draai, die achterwaarts verplaatst worden ten opzichte van de DNA-helix. Beide strengen van D-DNA zijn antiparallel aan elkaar. De basenpaarkanteling van D-DNA vertoont een negatieve helling van -16.7 graden met een axiale stijging van 3.03Å per basenpaar.

E-formulier

In de cel wordt E-DNA zeer zelden gevonden en met verlengde of excentriek DNA. De helix van E-DNA is lang en de basen staan ​​loodrecht op de helix. E-DNA bestaat uit de diepe hoofdas en ondiepe kleine as. Na de röntgenkristallografische studie wordt E-DNA gevonden tussenliggend tussen het B-DNA naar het A-DNA.

EigendommenA-DNAB-DNAZ-DNAC-DNAD-DNAE-DNA
spiraalvormige zinRechtshandig oprollenRechtshandig oprollenLinkshandig oprollenRechtshandig oprollenRechtshandig oprollen-
Voorvalvoorwaarden75% relatieve vochtigheid met de aanwezigheid van ionen zoals natrium, kalium, cesium.92% relatieve vochtigheid met de lage ionenconcentratieKomt voor bij zeer hoge zoutconcentratie met afwisselende purine- en pyrimidine-basesequentie66% relatieve vochtigheid met de aanwezigheid van lithium- en magnesiumionen.--
Vlak van de basisLoodrecht op de spiraalvormige asLoodrecht op de spiraalvormige asLoodrecht op de spiraalvormige asLoodrecht op de spiraalvormige asLoodrecht op de spiraalvormige as-
Rotatie per basenpaar33 graden36 graden30 graden38,6 graden--
Axiale stijging per basenpaar2.563.383.713.323.03-
Helixdiameter:25,52018 jaar19,0--
Basenparen per beurt11bp10bp12bp9,33bp8bp7,5 bp
Suikerfosfaat ruggengraatnormaalnormaalZigzagnormaalnormaal-
Basispaar kanteling19 graden6,3 graden7 graden-7,8 graden-16,7 graden-
Helix-pitch25,535,545.630,9--
Grote grooveSmalle en diepe grote grooveBrede en diepe grote groovePlatte grote groef---
kleine groefBrede en diepe kleine grooveSmalle en diepe kleine grooveSmalle en diepe kleine groove---
Suiker tuitenC3 – endoconformatieC2 - endoconformatieC3 – endoconformatie voor purines en C2 – endoconformatie voor pyrimidines---

Factoren die conformatieverandering beïnvloeden

De conformationele verandering van het dubbel-helix DNA in verschillende vormen hangt voornamelijk af van de volgende drie factoren:

  1. Fysiologische aandoeningen: Vochtigheid en de ionische of hydratatieomgeving bevorderen de conformatieverandering in het DNA.
  2. DNA basenvolgorde: Het is de meest cruciale factor die de vorm, grootte, kronkeling en andere structurele eigenschappen van het DNA bepaalt.
  3. Aanwezigheid en binding van eiwit: Een eiwit bindt zich aan de ene spiraalvormige conformatie van het DNA en verandert zijn structuur in verschillende vormen. Een eiwit kan bijvoorbeeld binden aan het B-DNA en de conformatie veranderen in A- of Z-vormen.

Bovenstaande drie factoren beïnvloeden vooral het DNA en maken het structureel variant. Daarom kunnen we concluderen dat de dubbele helixstructuur van het DNA niet uniform is en kan variëren onder verschillende fysiologische omstandigheden.


A‑form nucleïnezuren en Z‑DNA

Er zijn drie verschillende vormen van duplex-nucleïnezuur beschreven. De meest voorkomende vorm, aanwezig in het meeste DNA bij neutrale pH en fysiologische zoutconcentraties, is de B-vorm. Dat is de klassieke, rechtshandige dubbele spiraalstructuur die we hebben besproken. Een dikkere rechtshandige duplex met een kortere afstand tussen de basenparen is beschreven voor RNA-DNA-duplexen en RNA-RNA-duplexen. Dit wordt A-vorm nucleïnezuur genoemd.

Een derde vorm van duplex-DNA heeft een opvallend andere, linkshandige spiraalvormige structuur. Dit Z-DNA wordt gevormd door stukken afwisselende purines en pyrimidinen, b.v. GCGCGC, vooral in negatief supercoiled DNA. Een kleine hoeveelheid van het DNA in een cel bestaat in de Z-vorm. Het was verleidelijk om voor te stellen dat deze andere structuur op de een of andere manier betrokken is bij de regulatie van een cellulaire functie, zoals transcriptie of regulatie, maar sluitend bewijs voor of tegen dit voorstel is nog niet beschikbaar.

Verschillen tussen A-vorm en B-vorm nucleïnezuur

Het belangrijkste verschil tussen A-vorm en B-vorm nucleïnezuur zit in de conformatie van de deoxyribosesuikerring. Het is in de C2'-endoconformatie voor B-vorm, terwijl het in de C3'-endoconformatie in A-vorm is. Zoals weergegeven in figuur (PageIndex<4>), als je kijkt naar het vlak gedefinieerd door de C4'-O-C1'-atomen van de deoxyribose, in de C2'-endoconformatie, bevindt het C2'-atoom zich boven het vlak, terwijl het C3'-atoom bevindt zich boven het vlak in de C3'-endoconformatie. De laatste conformatie brengt de 5'- en 3'-hydroxylen (beide veresterd met de fosfaten die aan de volgende nucleotiden zijn gekoppeld) dichter bij elkaar dan wordt gezien in de C2'-endoconfromatie (Figuur 2.16). Zo wordt de afstand tussen aangrenzende nucleotiden verminderd met ongeveer 1 Angstrom in A-vorm ten opzichte van B-vorm nucleïnezuur (Figuur (PageIndex<4>)).

Afbeelding (PageIndex<4>): Syn- en anti-conformaties van de base ten opzichte van de suiker in nucleotiden.

Een tweede belangrijk verschil tussen A-vorm en B-vorm nucleïnezuur is de plaatsing van basenparen in de duplex. In B-vorm zijn de basenparen bijna gecentreerd over de spiraalvormige as (Figuur (PageIndex<4>)), maar in A-vorm worden ze van de centrale as en dichter bij de hoofdgroef verplaatst. Het resultaat is een lintachtige helix met een meer open cilindrische kern in A-vorm.


Wat kan DNA doen in zijn ongecondenseerde vorm? - Biologie

Onze redacteuren zullen beoordelen wat je hebt ingediend en bepalen of het artikel moet worden herzien.

DNA, afkorting van desoxyribonucleïnezuur, organische chemische stof met een complexe moleculaire structuur die wordt aangetroffen in alle prokaryotische en eukaryote cellen en in veel virussen. DNA codeert genetische informatie voor de overdracht van erfelijke eigenschappen.

Wat doet DNA?

Deoxyribonucleïnezuur (DNA) is een organische chemische stof die genetische informatie en instructies voor eiwitsynthese bevat. Het wordt gevonden in de meeste cellen van elk organisme. DNA is een belangrijk onderdeel van reproductie waarbij genetische erfelijkheid plaatsvindt door het doorgeven van DNA van ouder of ouders naar nakomelingen.

Waar is DNA van gemaakt?

DNA is opgebouwd uit nucleotiden. Een nucleotide heeft twee componenten: een ruggengraat, gemaakt van de deoxyribose- en fosfaatgroepen, en stikstofbasen, bekend als cytosine, thymine, adenine en guanine. Genetische code wordt gevormd door verschillende opstellingen van de basen.

Wie heeft de structuur van DNA ontdekt?

De ontdekking van de dubbele helixstructuur van DNA wordt toegeschreven aan de onderzoekers James Watson en Francis Crick, die samen met collega-onderzoeker Maurice Wilkins in 1962 een Nobelprijs ontvingen voor hun werk. Velen zijn van mening dat Rosalind Franklin ook de eer moet krijgen, aangezien ze de revolutionaire foto van de dubbele helixstructuur van DNA maakte, die zonder haar toestemming als bewijs werd gebruikt.

Kun je DNA bewerken?

Genbewerking wordt tegenwoordig meestal gedaan door middel van een techniek genaamd Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), overgenomen van een bacterieel mechanisme dat specifieke secties in DNA kan wegsnijden. Een gebruik van CRISPR is het creëren van genetisch gemodificeerde organismen (GGO) gewassen.

Wat is een DNA-computer?

DNA-computing is een voorgestelde computerarchitectuur die de zelfbindende aard van DNA zou gebruiken om berekeningen uit te voeren. In tegenstelling tot klassieke informatica, zou DNA-computing meerdere parallelle processen en berekeningen tegelijkertijd mogelijk maken.

Een korte behandeling van DNA volgt. Voor een volledige behandeling, zien genetica: DNA en de genetische code.

Het chemische DNA werd voor het eerst ontdekt in 1869, maar de rol ervan in genetische overerving werd pas in 1943 aangetoond. In 1953 bepaalden James Watson en Francis Crick, geholpen door het werk van biofysici Rosalind Franklin en Maurice Wilkins, dat de structuur van DNA een dubbele -helixpolymeer, een spiraal bestaande uit twee DNA-strengen die om elkaar heen zijn gewikkeld. De doorbraak leidde tot aanzienlijke vooruitgang in het begrip van wetenschappers van DNA-replicatie en erfelijke controle van cellulaire activiteiten.

Elke streng van een DNA-molecuul is samengesteld uit een lange keten van monomeernucleotiden. De nucleotiden van DNA bestaan ​​uit een deoxyribosesuikermolecuul waaraan een fosfaatgroep en een van de vier stikstofbasen is bevestigd: twee purines (adenine en guanine) en twee pyrimidinen (cytosine en thymine). De nucleotiden zijn met elkaar verbonden door covalente bindingen tussen het fosfaat van de ene nucleotide en de suiker van de volgende, en vormen een fosfaat-suikerruggengraat waaruit de stikstofbasen uitsteken. De ene streng wordt aan de andere vastgehouden door waterstofbruggen tussen de basen. De volgorde van deze binding is specifiek, d.w.z. adeninebindingen alleen met thymine en cytosine alleen met guanine.

De configuratie van het DNA-molecuul is zeer stabiel, waardoor het kan fungeren als een sjabloon voor de replicatie van nieuwe DNA-moleculen, evenals voor de productie (transcriptie) van het verwante RNA-molecuul (ribonucleïnezuur). Een DNA-segment dat codeert voor de celsynthese van een specifiek eiwit, wordt een gen genoemd.

DNA repliceert door te scheiden in twee enkele strengen, die elk dienen als een sjabloon voor een nieuwe streng. De nieuwe strengen worden gekopieerd door hetzelfde principe van waterstofbrugparing tussen basen dat in de dubbele helix bestaat. Er worden twee nieuwe dubbelstrengs DNA-moleculen geproduceerd, elk met een van de oorspronkelijke strengen en een nieuwe streng. Deze "semiconservatieve" replicatie is de sleutel tot de stabiele overerving van genetische eigenschappen.

Binnen een cel is DNA georganiseerd in dichte eiwit-DNA-complexen die chromosomen worden genoemd. Bij eukaryoten bevinden de chromosomen zich in de kern, hoewel DNA ook wordt aangetroffen in mitochondriën en chloroplasten. In prokaryoten, die geen membraangebonden kern hebben, wordt het DNA gevonden als een enkel cirkelvormig chromosoom in het cytoplasma. Sommige prokaryoten, zoals bacteriën, en enkele eukaryoten hebben extrachromosomaal DNA dat bekend staat als plasmiden, die autonoom, zelfreplicerend genetisch materiaal zijn. Plasmiden zijn uitgebreid gebruikt in recombinant-DNA-technologie om genexpressie te bestuderen.

Het genetische materiaal van virussen kan enkel- of dubbelstrengs DNA of RNA zijn. Retrovirussen dragen hun genetisch materiaal als enkelstrengs RNA en produceren het enzym reverse transcriptase, dat DNA uit de RNA-streng kan genereren. Vierstrengige DNA-complexen bekend als G-quadruplexen zijn waargenomen in guanine-rijke gebieden van het menselijk genoom.

De redacteuren van Encyclopaedia Britannica Dit artikel is voor het laatst herzien en bijgewerkt door Adam Augustyn, hoofdredacteur, referentie-inhoud.


Korte DNA-sequenties zijn fundamentele componenten van genetische schakelaars

We hebben gezien hoe een specifieke nucleotidesequentie kan worden gedetecteerd als een patroon van structurele kenmerken op het oppervlak van de dubbele DNA-helix. Bepaalde nucleotidesequenties, elk typisch minder dan 20 nucleotideparen lang, fungeren als fundamentele componenten van genetische schakelaars door te dienen als herkenningsplaatsen voor de binding van specifieke genregulerende eiwitten. Duizenden van dergelijke DNA-sequenties zijn geïdentificeerd, elk herkend door een ander genregulerend eiwit (of door een reeks verwante genregulerende eiwitten). Sommige van de genregulerende eiwitten die in de loop van dit hoofdstuk worden besproken, staan ​​vermeld in Tabel 7-1, samen met de DNA-sequenties die ze herkennen.

Tabel 7-1

Sommige genregulerende eiwitten en de DNA-sequenties die ze herkennen.

We wenden ons nu tot de genregulerende eiwitten zelf, de tweede fundamentele component van genetische schakelaars. We beginnen met de structurele kenmerken waardoor deze eiwitten korte, specifieke DNA-sequenties kunnen herkennen die zich in een veel langere dubbele helix bevinden.


Voorbeeld van DNA-sequencing

Hoewel DNA-sequencing vroeger jaren duurde, kan het nu in uren worden gedaan. Verder kostte de eerste volledige sequentie van menselijk DNA ongeveer 3 miljard dollar. Nu zullen bepaalde bedrijven je hele genoom sequencen voor minder dan $ 1.000. De meest geavanceerde tests zullen elk nucleotide in uw genoom analyseren. Veel bedrijven bieden nu echter single-nucleotide polymorfisme testen.

Er zijn twee hoofdtypen DNA-sequencing. De oudere, klassieke kettingbeëindigingsmethode wordt ook wel de Sanger-methode genoemd. Nieuwere methoden die een groot aantal DNA-moleculen snel kunnen verwerken, worden gezamenlijk High-Throughput Sequencing (HTS)-technieken of Next-Generation Sequencing (NGS)-methoden genoemd.

Sanger-sequencing

De Sanger-methode is gebaseerd op een primer die bindt aan een gedenatureerd DNA-molecuul en initieert de synthese van een enkelstrengs polynucleotide in aanwezigheid van een DNA-polymerase-enzym, met gebruikmaking van het gedenatureerde DNA als een matrijs. In de meeste gevallen katalyseert het enzym de toevoeging van een nucleotide. Er vormt zich daarom een ​​covalente binding tussen het 3'8242 koolstofatoom van het deoxyribosesuikermolecuul in de ene nucleotide en het 5'8242 koolstofatoom van de volgende. Deze afbeelding hieronder laat zien hoe deze binding wordt gevormd.

Een reactiemengsel voor sequentiebepaling zou echter een klein aandeel gemodificeerde nucleotiden hebben die deze covalente binding niet kunnen vormen vanwege de afwezigheid van een reactieve hydroxylgroep, wat aanleiding geeft tot de term 'dideoxyribonucleotiden', dwz ze hebben geen 2'- of 3'-zuurstofatoom in vergelijking met het overeenkomstige ribonucleotide. Dit zou de DNA-polymerisatiereactie voortijdig beëindigen. Aan het einde van meerdere ronden van dergelijke polymerisaties zou een mengsel van moleculen van verschillende lengtes worden gecreëerd.

In de vroegste pogingen om de Sanger-methode te gebruiken, werd het DNA-molecuul eerst geamplificeerd met behulp van een gelabelde primer en vervolgens gesplitst in vier reageerbuizen, elk met slechts één type ddNTP. Dat wil zeggen dat elk reactiemengsel slechts één type gemodificeerd nucleotide zou hebben dat ketenbeëindiging zou kunnen veroorzaken. Nadat de vier reacties waren voltooid, zou het mengsel van DNA-moleculen gecreëerd door ketenbeëindiging elektroforese ondergaan op een polyacrylamidegel en gescheiden worden op basis van hun lengte.

/>
In de bovenstaande afbeelding werd een sequencingreactie met ddATP door de eerste kolom geëlektroforeerd. Elke lijn vertegenwoordigt een DNA-molecuul van een bepaalde lengte, het resultaat van een polymerisatiereactie die werd beëindigd door de toevoeging van een ddATP-nucleotide. De tweede, derde en vierde kolom bevatten respectievelijk ddTTP, ddGTP en ddCTP.

Na verloop van tijd werd deze methode aangepast zodat elke ddNTP een ander fluorescerend label had. De primer was niet langer de bron van het radiolabel of de fluorescerende tag. Deze methode, ook bekend als dye-terminator-sequencing, gebruikte vier kleurstoffen met niet-overlappende emissiespectra, één voor elke ddNTP.


De afbeelding toont het verschil tussen gelabelde primers, gelabelde dNTP's en geverfde terminator NTP's.


De afbeelding hierboven toont een schematische weergave van de sequencing van de kleurstof-terminator. Er is een enkel reactiemengsel dat alle elementen bevat die nodig zijn voor DNA-verlenging. Het reactiemengsel bevat ook kleine concentraties van vier ddNTP's, elk met een ander fluorescerend label. De voltooide reactie wordt uitgevoerd op een capillaire gel. De resultaten worden verkregen door een analyse van de emissiespectra van elke DNA-band op de gel. Een softwareprogramma analyseert vervolgens de spectra en presenteert de sequentie van het DNA-molecuul.

Sequentie met hoge doorvoer

Sanger-sequencing blijft nuttig voor het bepalen van de sequenties van relatief lange stukken DNA, vooral bij lage volumes. Het kan echter duur en arbeidsintensief worden wanneer een groot aantal moleculen snel moet worden gesequenced. Ironisch genoeg, hoewel de traditionele dye-terminator-methode nuttig is wanneer het DNA-molecuul langer is, zijn high-throughput-methoden op grotere schaal gebruikt, vooral wanneer volledige genomen moeten worden gesequenced.

Er zijn drie grote veranderingen ten opzichte van de Sanger-methode. De eerste was de ontwikkeling van een celvrij systeem voor het klonen van DNA-fragmenten. Traditioneel werd het stuk DNA waarvan de sequentie moest worden bepaald eerst gekloond in een prokaryotisch plasmide en geamplificeerd in bacteriën voordat het werd geëxtraheerd en gezuiverd. High-throughput sequencing of next-generation sequencing-technologieën vertrouwden niet langer op deze arbeidsintensieve en tijdrovende procedure.

Ten tweede creëerden deze methoden ruimte om miljoenen sequentiereacties parallel uit te voeren. Dit was een enorme stap voorwaarts ten opzichte van de oorspronkelijke methoden waarbij acht verschillende reactiemengsels nodig waren om een ​​enkele betrouwbare nucleotidesequentie te produceren. Ten slotte is er geen scheiding tussen de rek- en detectiestappen. De basen worden geïdentificeerd naarmate de sequentiebepalingsreactie vordert. Terwijl HTS kosten en tijd verminderde, waren hun 'reads' relatief kort. Dat wil zeggen, om een ​​volledig genoom samen te stellen, is intensieve berekening noodzakelijk.

De komst van HTS heeft de toepassingen voor genomics enorm uitgebreid. DNA-sequencing is nu een integraal onderdeel geworden van de basiswetenschap, translationeel onderzoek, medische diagnostiek en forensisch onderzoek.


Inhoud

DNA-schade, als gevolg van omgevingsfactoren en normale metabolische processen in de cel, treedt op met een snelheid van 10.000 tot 1.000.000 moleculaire laesies per cel per dag. [2] Hoewel dit slechts 0,000165% van de ongeveer 6 miljard basen van het menselijk genoom uitmaakt, kunnen niet-herstelde laesies in kritieke genen (zoals tumorsuppressorgenen) het vermogen van een cel om zijn functie uit te voeren belemmeren en de kans op tumorvorming aanzienlijk vergroten en bijdragen tot tumorheterogeniteit.

De overgrote meerderheid van de DNA-schade beïnvloedt de primaire structuur van de dubbele helix, dat wil zeggen dat de basen zelf chemisch gemodificeerd zijn. Deze modificaties kunnen op hun beurt de reguliere helixstructuur van de moleculen verstoren door niet-eigen chemische bindingen of omvangrijke adducten te introduceren die niet in de standaard dubbele helix passen. In tegenstelling tot eiwitten en RNA heeft DNA gewoonlijk geen tertiaire structuur en daarom treedt er op dat niveau geen schade of verstoring op. DNA is echter supercoiled en gewikkeld rond "verpakkings"-eiwitten die histonen worden genoemd (in eukaryoten), en beide superstructuren zijn kwetsbaar voor de effecten van DNA-schade.

Bronnen Bewerken

DNA-schade kan worden onderverdeeld in twee hoofdtypen:

    schade zoals aanval door reactieve zuurstofsoorten geproduceerd uit normale metabole bijproducten (spontane mutatie), vooral het proces van oxidatieve deaminering
    1. bevat ook replicatiefouten
    1. ultraviolette [UV 200-400 nm] straling van de zon of andere kunstmatige lichtbronnen
    2. andere stralingsfrequenties, waaronder röntgen- en gammastraling of thermische verstoring
    3. bepaalde planttoxines
    4. door de mens gemaakte mutagene chemicaliën, met name aromatische verbindingen die fungeren als DNA-intercalatiemiddelen [8]

    De replicatie van beschadigd DNA vóór celdeling kan leiden tot de opname van verkeerde basen tegenover beschadigde. Dochtercellen die deze verkeerde basen erven, dragen mutaties waarvan de oorspronkelijke DNA-sequentie onherstelbaar is (behalve in het zeldzame geval van een terugmutatie, bijvoorbeeld door genconversie).

    Soorten Bewerken

    Er zijn verschillende soorten schade aan DNA als gevolg van endogene cellulaire processen:

    1. oxidatie van basen [bijv. 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG)] en het genereren van onderbrekingen in de DNA-streng door reactieve zuurstofspecies,
    2. alkylering van basen (meestal methylering), zoals vorming van 7-methylguanosine, 1-methyladenine, 6-O-methylguanine
    3. hydrolyse van basen, zoals deaminering, depurinatie en depyrimidinatie. (bijv. benzo[a]pyreendiolepoxide-dG-adduct, aristolactam I-dA-adduct)
    4. mismatch van basen, als gevolg van fouten in DNA-replicatie, waarbij de verkeerde DNA-base op zijn plaats wordt gehecht in een nieuw vormende DNA-streng, of een DNA-base wordt overgeslagen of per ongeluk wordt ingevoegd.
    5. Monoadductschade veroorzaakt door verandering in enkele stikstofbase van DNA
    6. Diadduct schade

    Schade veroorzaakt door exogene agentia komt in vele vormen voor. Enkele voorbeelden zijn:

    1. UV-B-licht veroorzaakt verknoping tussen aangrenzende cytosine- en thyminebasen waardoor pyrimidine dimeren. Dit wordt directe DNA-schade genoemd.
    2. UV-A-licht creëert voornamelijk vrije radicalen. De schade veroorzaakt door vrije radicalen wordt indirecte DNA-schade genoemd.
    3. Ioniserende straling zoals die gecreëerd door radioactief verval of in kosmische stralen veroorzaakt breuken in DNA-strengen. Ioniserende straling op middelhoog niveau kan onherstelbare DNA-schade veroorzaken (leidend tot replicatie- en transcriptiefouten die nodig zijn voor neoplasie of kan virale interacties veroorzaken), wat kan leiden tot vroegtijdige veroudering en kanker.
    4. Thermische storing bij verhoogde temperatuur verhoogt de snelheid van depurinatie (verlies van purinebasen uit de DNA-ruggengraat) en enkelstrengige breuken. Hydrolytische depurinatie wordt bijvoorbeeld gezien bij de thermofiele bacteriën, die groeien in warmwaterbronnen bij 40-80 ° C. [9][10] De snelheid van depurinatie (300 purineresiduen per genoom per generatie) is bij deze soorten te hoog om te worden gerepareerd door normale reparatiemachines, daarom kan een mogelijkheid van een adaptieve reactie niet worden uitgesloten.
    5. Industriële chemicaliën zoals vinylchloride en waterstofperoxide, en milieuchemicaliën zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen die worden aangetroffen in rook, roet en teer, creëren een enorme diversiteit aan DNA-adducten: ethenobasen, geoxideerde basen, gealkyleerde fosfotriesters en verknoping van DNA, om er maar een paar te noemen.

    UV-schade, alkylering/methylering, röntgenschade en oxidatieve schade zijn voorbeelden van geïnduceerde schade. Spontane schade kan het verlies van een base, deaminering, rimpelvorming van de suikerring en tautomere verschuiving omvatten. Constitutieve (spontane) DNA-schade veroorzaakt door endogene oxidanten kan worden gedetecteerd als een laag niveau van histon H2AX-fosforylering in onbehandelde cellen. [11]

    Nucleair versus mitochondriaal

    In menselijke cellen, en eukaryote cellen in het algemeen, wordt DNA gevonden op twee cellulaire locaties - in de kern en in de mitochondriën. Nucleair DNA (nDNA) bestaat als chromatine tijdens niet-replicatieve stadia van de celcyclus en wordt tijdens celdeling gecondenseerd tot aggregaatstructuren die bekend staan ​​als chromosomen. In beide toestanden is het DNA sterk verdicht en gewikkeld rond kraalachtige eiwitten die histonen worden genoemd. Telkens wanneer een cel de genetische informatie die in zijn nDNA is gecodeerd, tot expressie moet brengen, wordt het vereiste chromosomale gebied ontrafeld, de daarin gelokaliseerde genen worden tot expressie gebracht en vervolgens wordt het gebied teruggecondenseerd tot zijn rustende conformatie. Mitochondriaal DNA (mtDNA) bevindt zich in mitochondria-organellen, bestaat in meerdere exemplaren en is ook nauw verbonden met een aantal eiwitten om een ​​complex te vormen dat bekend staat als de nucleoïde. Binnen mitochondriën creëren reactieve zuurstofsoorten (ROS), of vrije radicalen, bijproducten van de constante productie van adenosinetrifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylering, een zeer oxidatieve omgeving waarvan bekend is dat deze mtDNA beschadigt. Een cruciaal enzym bij het tegengaan van de toxiciteit van deze soorten is superoxide-dismutase, dat aanwezig is in zowel de mitochondriën als het cytoplasma van eukaryote cellen.

    Senescentie en apoptose

    Senescentie, een onomkeerbaar proces waarbij de cel zich niet meer deelt, is een beschermende reactie op de verkorting van de chromosoomuiteinden. De telomeren zijn lange gebieden van repetitief niet-coderend DNA die chromosomen afdekken en een gedeeltelijke afbraak ondergaan telkens wanneer een cel deling ondergaat (zie Hayflick-limiet). [12] Rust is daarentegen een omkeerbare toestand van cellulaire rust die geen verband houdt met genoomschade (zie celcyclus). Senescentie in cellen kan dienen als een functioneel alternatief voor apoptose in gevallen waarin de fysieke aanwezigheid van een cel om ruimtelijke redenen vereist is door het organisme, [13] dat dient als een "laatste redmiddel"-mechanisme om te voorkomen dat een cel met beschadigd DNA repliceert ongepast in de afwezigheid van pro-groei cellulaire signalering. Ongereguleerde celdeling kan leiden tot de vorming van een tumor (zie kanker), die potentieel dodelijk is voor een organisme. Daarom wordt de inductie van veroudering en apoptose beschouwd als onderdeel van een strategie van bescherming tegen kanker. [14]

    Mutatie Bewerken

    Het is belangrijk om onderscheid te maken tussen DNA-schade en mutatie, de twee belangrijkste soorten fouten in DNA. DNA-schade en mutatie zijn fundamenteel verschillend. Schade resulteert in fysieke afwijkingen in het DNA, zoals enkel- en dubbelstrengs breuken, 8-hydroxydeoxyguanosine-residuen en polycyclische aromatische koolwaterstofadducten. DNA-schade kan worden herkend door enzymen en kan dus correct worden gerepareerd als overtollige informatie, zoals de onbeschadigde sequentie in de complementaire DNA-streng of in een homoloog chromosoom, beschikbaar is om te kopiëren. Als een cel DNA-schade vasthoudt, kan transcriptie van een gen worden voorkomen, en dus ook de translatie naar een eiwit. Replicatie kan ook worden geblokkeerd of de cel kan afsterven.

    In tegenstelling tot DNA-schade is een mutatie een verandering in de basenvolgorde van het DNA. Een mutatie kan niet worden herkend door enzymen als de baseverandering eenmaal in beide DNA-strengen aanwezig is, en dus kan een mutatie niet worden gerepareerd. Op cellulair niveau kunnen mutaties veranderingen in de eiwitfunctie en -regulatie veroorzaken. Mutaties worden gerepliceerd wanneer de cel repliceert. In een populatie van cellen zullen mutante cellen in frequentie toenemen of afnemen afhankelijk van de effecten van de mutatie op het vermogen van de cel om te overleven en zich voort te planten.

    Hoewel ze duidelijk van elkaar verschillen, zijn DNA-schade en mutatie gerelateerd omdat DNA-schade vaak fouten in de DNA-synthese veroorzaakt tijdens replicatie of reparatie. Deze fouten zijn een belangrijke bron van mutatie.

    Gezien deze eigenschappen van DNA-beschadiging en -mutatie, kan worden gezien dat DNA-beschadiging een speciaal probleem is in niet- of langzaam delende cellen, waar niet-herstelde schade zich in de loop van de tijd zal ophopen. Aan de andere kant, in snel delende cellen, zal niet-herstelde DNA-schade die de cel niet doodt door replicatie te blokkeren, de neiging hebben om replicatiefouten en dus mutatie te veroorzaken. De grote meerderheid van de mutaties die niet neutraal zijn in hun effect, zijn schadelijk voor het voortbestaan ​​van een cel. Dus in een populatie van cellen die een weefsel met replicerende cellen vormen, zullen mutante cellen de neiging hebben verloren te gaan. Zeldzame mutaties die een overlevingsvoordeel bieden, zullen echter de neiging hebben om klonaal uit te breiden ten koste van naburige cellen in het weefsel. Dit voordeel voor de cel is nadelig voor het hele organisme, omdat dergelijke gemuteerde cellen kanker kunnen veroorzaken. Zo is DNA-schade in vaak delende cellen, omdat het aanleiding geeft tot mutaties, een prominente oorzaak van kanker. Daarentegen is DNA-schade in niet vaak delende cellen waarschijnlijk een prominente oorzaak van veroudering. [15]

    Cellen kunnen niet functioneren als DNA-schade de integriteit en toegankelijkheid van essentiële informatie in het genoom aantast (maar cellen blijven oppervlakkig functioneel wanneer niet-essentiële genen ontbreken of beschadigd zijn). Afhankelijk van het type schade dat is toegebracht aan de dubbele helixstructuur van het DNA, zijn er verschillende herstelstrategieën ontwikkeld om verloren informatie te herstellen. Indien mogelijk gebruiken cellen de ongemodificeerde complementaire streng van het DNA of de zusterchromatide als sjabloon om de oorspronkelijke informatie te herstellen. Zonder toegang tot een sjabloon gebruiken cellen als laatste redmiddel een foutgevoelig herstelmechanisme dat bekend staat als translesiesynthese.

    Schade aan DNA verandert de ruimtelijke configuratie van de helix en dergelijke veranderingen kunnen door de cel worden gedetecteerd. Zodra de schade is gelokaliseerd, binden specifieke DNA-reparatiemoleculen zich op of nabij de plaats van schade, waardoor andere moleculen worden aangezet om te binden en een complex te vormen dat de daadwerkelijke reparatie mogelijk maakt.

    Directe omkering Bewerken

    Van cellen is bekend dat ze drie soorten schade aan hun DNA elimineren door het chemisch om te keren. Deze mechanismen hebben geen sjabloon nodig, omdat de soorten schade die ze tegengaan, slechts in een van de vier basen kunnen voorkomen. Dergelijke directe omkeringsmechanismen zijn specifiek voor het soort schade dat wordt opgelopen en houden geen breuk in van de fosfodiester-ruggengraat. De vorming van pyrimidinedimeren bij bestraling met UV-licht resulteert in een abnormale covalente binding tussen aangrenzende pyrimidinebasen. Het fotoreactiveringsproces keert deze schade direct om door de werking van het enzym fotolyase, waarvan de activering verplicht afhankelijk is van de energie die wordt geabsorbeerd door blauw/UV-licht (golflengte 300-500 nm) om katalyse te bevorderen. [16] Photolyase, een oud enzym dat aanwezig is in bacteriën, schimmels en de meeste dieren werkt niet meer bij mensen, [17] die in plaats daarvan nucleotide-excisieherstel gebruiken om schade door UV-straling te herstellen. Een ander type schade, de methylering van guaninebasen, wordt direct ongedaan gemaakt door het eiwit methylguanine-methyltransferase (MGMT), waarvan het bacteriële equivalent ogt wordt genoemd. Dit is een duur proces omdat elk MGMT-molecuul slechts één keer kan worden gebruikt, dat wil zeggen dat de reactie stoichiometrisch is in plaats van katalytisch. [18] Een algemene reactie op methylerende middelen in bacteriën staat bekend als de adaptieve reactie en verleent een niveau van resistentie tegen alkylerende middelen bij aanhoudende blootstelling door opregulatie van alkyleringsherstel-enzymen. [19] Het derde type DNA-schade dat door cellen wordt teruggedraaid, is bepaalde methylering van de basen cytosine en adenine.

    Enkelstrengs schade Bewerken

    Wanneer slechts één van de twee strengen van een dubbele helix een defect heeft, kan de andere streng worden gebruikt als een sjabloon om de correctie van de beschadigde streng te begeleiden. Om schade aan een van de twee gepaarde DNA-moleculen te herstellen, bestaan ​​er een aantal excisieherstelmechanismen die het beschadigde nucleotide verwijderen en vervangen door een onbeschadigd nucleotide dat complementair is aan dat in de onbeschadigde DNA-streng. [18]

      (BER): beschadigde enkele basen of nucleotiden worden meestal gerepareerd door de betrokken base of nucleotide te verwijderen en vervolgens de juiste base of nucleotide in te voegen. Bij base-excisieherstel verwijdert een glycosylase[20]-enzym de beschadigde base uit het DNA door de binding tussen de base en de deoxyribose te splitsen. Deze enzymen verwijderen een enkele base om een ​​apurine- of apyrimidinische site (AP-site) te creëren. [20] Enzymen genaamd AP endonucleasen knippen de beschadigde DNA-ruggengraat op de AP-site. DNA-polymerase verwijdert vervolgens het beschadigde gebied met behulp van zijn 5'- tot 3'-exonuclease-activiteit en synthetiseert correct de nieuwe streng met behulp van de complementaire streng als een sjabloon. [20] De opening wordt vervolgens afgesloten door het enzym DNA-ligase. [21] (NER): omvangrijke, helix-vervormende schade, zoals pyrimidine-dimerisatie veroorzaakt door UV-licht, wordt meestal hersteld door een proces in drie stappen. Eerst wordt de schade herkend, vervolgens worden 12-24 nucleotide-lange DNA-strengen zowel stroomopwaarts als stroomafwaarts van de schadeplaats verwijderd door endonucleasen, en het verwijderde DNA-gebied wordt vervolgens opnieuw gesynthetiseerd. [22] NER is een zeer evolutionair geconserveerd reparatiemechanisme en wordt gebruikt in bijna alle eukaryote en prokaryotische cellen. [22] In prokaryoten wordt NER gemedieerd door Uvr-eiwitten. [22] Bij eukaryoten zijn veel meer eiwitten betrokken, hoewel de algemene strategie hetzelfde is. [22] systemen zijn in vrijwel alle cellen aanwezig om fouten te corrigeren die niet zijn gecorrigeerd door proeflezen. Deze systemen bestaan ​​uit minimaal twee eiwitten. De ene detecteert de mismatch en de andere werft een endonuclease aan die de nieuw gesynthetiseerde DNA-streng dicht bij het gebied van schade splitst. In E coli , zijn de betrokken eiwitten de Mut-klasse eiwitten: MutS, MutL en MutH. In de meeste eukaryoten is de analoog voor MutS MSH en de analoog voor MutL is MLH. MutH is alleen aanwezig in bacteriën. Dit wordt gevolgd door verwijdering van het beschadigde gebied door een exonuclease, hersynthese door DNA-polymerase en nick-sealing door DNA-ligase. [23]

    Dubbelstrengige breuken Bewerken

    Dubbelstrengs breuken, waarbij beide strengen in de dubbele helix worden doorgesneden, zijn bijzonder gevaarlijk voor de cel omdat ze kunnen leiden tot genoomherschikkingen. Wanneer een dubbelstrengs breuk gepaard gaat met een verknoping die de twee strengen op hetzelfde punt verbindt, kan geen van beide strengen worden gebruikt als sjabloon voor de herstelmechanismen, zodat de cel niet in staat zal zijn om de mitose te voltooien wanneer het deelt zich vervolgens en zal ofwel sterven of, in zeldzame gevallen, een mutatie ondergaan. [3] [4] Er bestaan ​​drie mechanismen om dubbelstrengige breuken (DSB's) te repareren: niet-homologe end-joining (NHEJ), microhomology-mediated end-joining (MMEJ) en homologe recombinatie (HR). [18] [24] In een in vitro systeem, MMEJ kwam voor in zoogdiercellen op het niveau van 10-20% van HR wanneer zowel HR- als NHEJ-mechanismen ook beschikbaar waren. [25]

    In NHEJ verbindt DNA Ligase IV, een gespecialiseerd DNA-ligase dat een complex vormt met de cofactor XRCC4, direct de twee uiteinden. [26] Voor nauwkeurige reparatie vertrouwt NHEJ op korte homologe sequenties, microhomologieën genaamd, die aanwezig zijn op de enkelstrengs staarten van de te verbinden DNA-uiteinden. Als deze overhangen compatibel zijn, is reparatie meestal nauwkeurig. [27] [28] [29] [30] NHEJ kan ook mutaties introduceren tijdens reparatie. Verlies van beschadigde nucleotiden op de breukplaats kan leiden tot deleties, en het samenvoegen van niet-overeenkomende uiteinden vormt inserties of translocaties. NHEJ is vooral belangrijk voordat de cel zijn DNA heeft gerepliceerd, omdat er geen sjabloon beschikbaar is voor reparatie door homologe recombinatie. Er zijn "back-up" NHEJ-routes in hogere eukaryoten. [31] Naast zijn rol als genoomverzorger, is NHEJ nodig voor het verbinden van dubbelstrengsbreuken met haarspeldkapjes die worden geïnduceerd tijdens V(D)J-recombinatie, het proces dat diversiteit genereert in B-cel- en T-celreceptoren in het immuunsysteem van gewervelde dieren. systeem. [32]

    Homologe recombinatie vereist de aanwezigheid van een identieke of bijna identieke sequentie om te worden gebruikt als een sjabloon voor reparatie van de breuk. De enzymatische machinerie die verantwoordelijk is voor dit herstelproces is bijna identiek aan de machine die verantwoordelijk is voor chromosomale cross-over tijdens meiose. Via deze route kan een beschadigd chromosoom worden gerepareerd met behulp van een zusterchromatide (beschikbaar in G2 na DNA-replicatie) of een homoloog chromosoom als sjabloon. DSB's die worden veroorzaakt door de replicatiemachinerie die proberen te synthetiseren over een enkelstrengige breuk of niet-gerepareerde laesie, veroorzaken ineenstorting van de replicatievork en worden meestal gerepareerd door recombinatie.

    MMEJ begint met eindresectie op korte afstand door MRE11-nuclease aan weerszijden van een dubbelstrengs breuk om microhomologiegebieden te onthullen. [25] In verdere stappen is [33] Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) vereist en kan een vroege stap in MMEJ zijn. Er is paring van microhomologieregio's gevolgd door rekrutering van flapstructuur-specifiek endonuclease 1 (FEN1) om overhangende flappen te verwijderen. Dit wordt gevolgd door rekrutering van XRCC1-LIG3 naar de plaats voor het ligeren van de DNA-uiteinden, wat leidt tot een intact DNA. MMEJ gaat altijd gepaard met een deletie, zodat MMEJ een mutageen pad is voor DNA-herstel. [34]

    de extremofiel Deinococcus radiodurans heeft een opmerkelijk vermogen om DNA-schade door ioniserende straling en andere bronnen te overleven. Ten minste twee kopieën van het genoom, met willekeurige DNA-breuken, kunnen door annealing DNA-fragmenten vormen. Gedeeltelijk overlappende fragmenten worden vervolgens gebruikt voor de synthese van homologe regio's via een bewegende D-lus die de verlenging kan voortzetten totdat ze complementaire partnerstrengen vinden. In de laatste stap is er crossover door middel van RecA-afhankelijke homologe recombinatie. [35]

    Topoisomerasen introduceren zowel enkel- als dubbelstrengs breuken in de loop van het veranderen van de staat van supercoiling van het DNA, wat vooral gebruikelijk is in gebieden in de buurt van een open replicatievork. Dergelijke breuken worden niet als DNA-schade beschouwd omdat ze een natuurlijk tussenproduct zijn in het biochemische mechanisme van topoisomerase en onmiddellijk worden gerepareerd door de enzymen die ze hebben gemaakt.

    Translesiesynthese Bewerken

    Translesiesynthese (TLS) is een DNA-schadetolerantieproces dat de DNA-replicatiemachinerie in staat stelt om vroegere DNA-laesies zoals thyminedimeren of AP-plaatsen te repliceren. [36] Het omvat het uitschakelen van reguliere DNA-polymerasen voor gespecialiseerde translesiepolymerasen (d.w.z. DNA-polymerase IV of V, van de Y-polymerasefamilie), vaak met grotere actieve plaatsen die de insertie van basen tegenover beschadigde nucleotiden kunnen vergemakkelijken. Aangenomen wordt dat de polymerase-omschakeling onder andere wordt gemedieerd door de post-translationele modificatie van de replicatie-procesiviteitsfactor PCNA. Translesiesynthesepolymerasen hebben vaak een lage betrouwbaarheid (hoge neiging om verkeerde basen in te voegen) op onbeschadigde templates in vergelijking met reguliere polymerasen. Velen zijn echter uiterst efficiënt in het inbrengen van de juiste bases tegenover specifieke soorten schade. Pol η medieert bijvoorbeeld een foutloze bypass van laesies die zijn geïnduceerd door UV-straling, terwijl Pol ι mutaties op deze plaatsen introduceert. Van Pol η is bekend dat het de eerste adenine over het T^T-fotodimeer toevoegt met behulp van Watson-Crick-basenparing en de tweede adenine zal worden toegevoegd in zijn syn-conformatie met behulp van Hoogsteen-basenparing. Vanuit een cellulair perspectief kan het riskeren van de introductie van puntmutaties tijdens translesiesynthese de voorkeur hebben boven het toevlucht nemen tot meer drastische mechanismen van DNA-herstel, die grove chromosomale afwijkingen of celdood kunnen veroorzaken. Kortom, het proces omvat gespecialiseerde polymerasen die laesies omzeilen of repareren op locaties van vastgelopen DNA-replicatie. Humaan DNA-polymerase eta kan bijvoorbeeld complexe DNA-laesies zoals guanine-thymine intra-strand crosslink, G[8,5-Me]T omzeilen, hoewel het gerichte en semi-gerichte mutaties kan veroorzaken. [37] Paromita Raychaudhury en Ashis Basu [38] bestudeerden de toxiciteit en mutagenese van dezelfde laesie in Escherichia coli door een G[8,5-Me]T-gemodificeerd plasmide te repliceren in E coli met specifieke DNA-polymerase-knockouts. De levensvatbaarheid was erg laag in een stam zonder pol II, pol IV en pol V, de drie SOS-induceerbare DNA-polymerasen, wat aangeeft dat translesiesynthese voornamelijk wordt uitgevoerd door deze gespecialiseerde DNA-polymerasen. Een bypass-platform wordt aan deze polymerasen verschaft door Proliferating cell nucleair antigeen (PCNA). Onder normale omstandigheden repliceert PCNA gebonden aan polymerasen het DNA. Op een plaats van laesie wordt PCNA alomtegenwoordig of gemodificeerd door de RAD6/RAD18-eiwitten om een ​​platform te bieden voor de gespecialiseerde polymerasen om de laesie te omzeilen en DNA-replicatie te hervatten. [39] [40] Na translesiesynthese is verlenging vereist. Deze verlenging kan worden uitgevoerd door een replicatieve polymerase als de TLS foutloos is, zoals in het geval van Pol , maar als TLS resulteert in een mismatch, is een gespecialiseerd polymerase nodig om het Pol ζ uit te breiden. Pol ζ is uniek omdat het terminale mismatches kan verlengen, terwijl meer processieve polymerasen dat niet kunnen. Dus wanneer een laesie wordt aangetroffen, zal de replicatievork tot stilstand komen, PCNA zal overschakelen van een processieve polymerase naar een TLS-polymerase zoals Pol ι om de laesie te repareren, dan kan PCNA overschakelen naar Pol ζ om de mismatch uit te breiden, en de laatste PCNA zal overschakelen naar de processieve polymerase om de replicatie voort te zetten.

    Cellen die worden blootgesteld aan ioniserende straling, ultraviolet licht of chemicaliën zijn vatbaar voor meerdere plaatsen van omvangrijke DNA-laesies en dubbelstrengige breuken. Bovendien kunnen DNA-beschadigende middelen andere biomoleculen beschadigen, zoals eiwitten, koolhydraten, lipiden en RNA. De accumulatie van schade, om specifiek te zijn, dubbelstrengs breuken of adducten die de replicatievorken blokkeren, behoren tot bekende stimulatiesignalen voor een globale reactie op DNA-schade. [41] De globale reactie op schade is een handeling die gericht is op het behoud van de cellen zelf en triggert meerdere wegen van macromoleculair herstel, laesie-bypass, tolerantie of apoptose. De gemeenschappelijke kenmerken van globale respons zijn inductie van meerdere genen, stopzetting van de celcyclus en remming van celdeling.

    Eerste stappen Bewerken

    De verpakking van eukaryotisch DNA in chromatine vormt een barrière voor alle op DNA gebaseerde processen die rekrutering van enzymen naar hun werkingsplaatsen vereisen. Om DNA-herstel mogelijk te maken, moet het chromatine opnieuw worden gemodelleerd. In eukaryoten zijn ATP-afhankelijke chromatine-remodelleringscomplexen en histon-modificerende enzymen twee overheersende factoren die worden gebruikt om dit remodelleringsproces te bereiken. [42]

    Chromatine-relaxatie vindt snel plaats op de plaats van een DNA-beschadiging. [43] [44] In een van de eerste stappen fosforyleert het door stress geactiveerde eiwitkinase, c-Jun N-terminaal kinase (JNK), SIRT6 op serine 10 als reactie op dubbelstrengs breuken of andere DNA-schade. [45] Deze post-translationele modificatie vergemakkelijkt de mobilisatie van SIRT6 naar DNA-schadeplaatsen en is vereist voor efficiënte rekrutering van poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) naar DNA-breukplaatsen en voor efficiënt herstel van DSB's. [45] PARP1-eiwit begint in minder dan een seconde op DNA-schadeplaatsen te verschijnen, met een halve maximale accumulatie binnen 1,6 seconden nadat de schade is opgetreden. [46] PARP1 synthetiseert polymere adenosinedifosfaatribose (poly (ADP-ribose) of PAR) ketens op zichzelf. Vervolgens hecht de chromatine-remodeller ALC1 zich snel aan het product van PARP1-actie, een poly-ADP-riboseketen, en ALC1 voltooit de aankomst bij de DNA-schade binnen 10 seconden na het optreden van de schade. [44] Ongeveer de helft van de maximale chromatine-relaxatie, vermoedelijk door de werking van ALC1, vindt plaats na 10 seconden. [44] Hierdoor kan het DNA-reparatie-enzym MRE11 binnen 13 seconden worden gerekruteerd om DNA-herstel te starten. [46]

    γH2AX, de gefosforyleerde vorm van H2AX, is ook betrokken bij de vroege stappen die leiden tot decondensatie van chromatine na dubbelstrengs DNA-breuken. De histonvariant H2AX vormt ongeveer 10% van de H2A-histonen in humaan chromatine. [47] γH2AX (H2AX gefosforyleerd op serine 139) kan worden gedetecteerd al 20 seconden na bestraling van cellen (met vorming van dubbelstrengs DNA-breuk), en de halve maximale accumulatie van γH2AX vindt plaats in één minuut. [47] De omvang van chromatine met gefosforyleerd γH2AX is ongeveer twee miljoen basenparen op de plaats van een dubbelstrengs DNA-breuk. [47] γH2AX zelf veroorzaakt geen decondensatie van chromatine, maar binnen 30 seconden na bestraling kan RNF8-eiwit worden gedetecteerd in combinatie met γH2AX. [48] ​​RNF8 bemiddelt uitgebreide decondensatie van chromatine, door de daaropvolgende interactie met CHD4, [49] een component van het nucleosoomremodellering en deacetylasecomplex NuRD.

    DDB2 komt voor in een heterodimeer complex met DDB1. Dit complex vormt verder een complex met het ubiquitine-ligase-eiwit CUL4A [50] en met PARP1. [51] Dit grotere complex associeert snel met UV-geïnduceerde schade in chromatine, met een half-maximale associatie voltooid in 40 seconden. [50] Het PARP1-eiwit, bevestigd aan zowel DDB1 als DDB2, dan PARylaten (creëert een poly-ADP-riboseketen) op DDB2 dat het DNA-remodellerende eiwit ALC1 aantrekt. [51] De werking van ALC1 ontspant het chromatine op de plaats van UV-schade aan DNA. Door deze relaxatie kunnen andere eiwitten in de nucleotide-excisieherstelroute het chromatine binnendringen en UV-geïnduceerde cyclobutaanpyrimidinedimeerschade repareren.

    Na snelle chromatine-remodellering worden celcycluscontrolepunten geactiveerd om DNA-herstel mogelijk te maken voordat de celcyclus vordert. Ten eerste worden twee kinasen, ATM en ATR, geactiveerd binnen 5 of 6 minuten nadat het DNA is beschadigd. Dit wordt gevolgd door fosforylering van het celcycluscontrolepunteiwit Chk1, dat zijn functie initieert, ongeveer 10 minuten nadat het DNA is beschadigd. [52]

    Controlepunten voor DNA-schade Bewerken

    Na DNA-schade worden celcycluscontrolepunten geactiveerd. Checkpoint-activering pauzeert de celcyclus en geeft de cel de tijd om de schade te herstellen voordat hij verder gaat met delen. Controlepunten voor DNA-schade vinden plaats op de G1/S- en G2/M-grenzen. Er bestaat ook een intra-S-checkpoint. De activering van checkpoints wordt bestuurd door twee hoofdkinasen, ATM en ATR. ATM reageert op dubbelstrengige DNA-breuken en verstoringen in de chromatinestructuur, [53] terwijl ATR voornamelijk reageert op vastgelopen replicatievorken. Deze kinasen fosforyleren stroomafwaartse doelen in een signaaltransductiecascade, wat uiteindelijk leidt tot stopzetting van de celcyclus. Er is ook een klasse van checkpointmediator-eiwitten geïdentificeerd, waaronder BRCA1, MDC1 en 53BP1. [54] Deze eiwitten lijken nodig te zijn voor het doorgeven van het checkpoint-activeringssignaal aan stroomafwaartse eiwitten.

    Controlepunt voor DNA-schade is een signaaltransductieroute die de voortgang van de celcyclus in G1, G2 en metafase blokkeert en de snelheid van de progressie van de S-fase vertraagt ​​wanneer DNA wordt beschadigd. Het leidt tot een pauze in de celcyclus waardoor de cel de tijd heeft om de schade te herstellen voordat hij verder gaat met delen.

    Checkpoint-eiwitten kunnen worden onderverdeeld in vier groepen: fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-achtige eiwitkinase, prolifererende celkernantigeen (PCNA)-achtige groep, twee serine/threonine (S/T)-kinasen en hun adapters. Centraal in alle door DNA-schade geïnduceerde checkpointreacties is een paar grote eiwitkinasen die behoren tot de eerste groep van PI3K-achtige eiwitkinasen - de ATM (Ataxia telangiectasia gemuteerd) en ATR (Ataxia- en Rad-gerelateerde) kinasen, waarvan de sequentie en functies zijn in de evolutie goed bewaard gebleven. Alle DNA-schadereacties vereisen ATM of ATR omdat ze het vermogen hebben om te binden aan de chromosomen op de plaats van DNA-schade, samen met aanvullende eiwitten die platforms zijn waarop DNA-schadereactiecomponenten en DNA-reparatiecomplexen kunnen worden geassembleerd.

    Een belangrijk stroomafwaarts doelwit van ATM en ATR is p53, omdat het nodig is voor het induceren van apoptose na DNA-schade. [55] De cycline-afhankelijke kinaseremmer p21 wordt geïnduceerd door zowel p53-afhankelijke als p53-onafhankelijke mechanismen en kan de celcyclus op de G1/S- en G2/M-controlepunten stoppen door cycline/cycline-afhankelijke kinasecomplexen te deactiveren. [56]

    De prokaryotische SOS-reactie

    De SOS-respons is de verandering in genexpressie in Escherichia coli en andere bacteriën als reactie op uitgebreide DNA-schade. Het prokaryotische SOS-systeem wordt gereguleerd door twee belangrijke eiwitten: LexA en RecA. Het LexA-homodimeer is een transcriptionele repressor die bindt aan operatorsequenties die gewoonlijk SOS-boxen worden genoemd. In Escherichia coli het is bekend dat LexA de transcriptie reguleert van ongeveer 48 genen, waaronder de lexA- en recA-genen. [57] Van de SOS-respons is bekend dat deze wijdverbreid is in het Bacteria-domein, maar is meestal afwezig in sommige bacteriële phyla, zoals de spirocheten. [58] De meest voorkomende cellulaire signalen die de SOS-respons activeren, zijn regio's van enkelstrengs DNA (ssDNA), die voortkomen uit vastgelopen replicatievorken of dubbelstrengige breuken, die worden verwerkt door DNA-helicase om de twee DNA-strengen te scheiden. [41] In de initiatiestap bindt het RecA-eiwit aan ssDNA in een door ATP-hydrolyse aangedreven reactie waarbij RecA-ssDNA-filamenten worden gecreëerd. RecA-ssDNA-filamenten activeren LexA-autoprotease-activiteit, wat uiteindelijk leidt tot splitsing van LexA-dimeer en daaropvolgende afbraak van LexA. Het verlies van LexA-repressor induceert transcriptie van de SOS-genen en zorgt voor verdere signaalinductie, remming van celdeling en een toename van de niveaus van eiwitten die verantwoordelijk zijn voor schadeverwerking.

    In Escherichia coli, SOS-boxen zijn sequenties van 20 nucleotiden in de buurt van promotors met een palindroomstructuur en een hoge mate van sequentieconservering. In andere klassen en phyla varieert de volgorde van SOS-boxen aanzienlijk, met verschillende lengte en samenstelling, maar het is altijd sterk geconserveerd en een van de sterkste korte signalen in het genoom. [58] Het hoge informatiegehalte van SOS-boxen maakt differentiële binding van LexA aan verschillende promotors mogelijk en zorgt voor timing van de SOS-respons. De laesieherstelgenen worden aan het begin van de SOS-respons geïnduceerd. De foutgevoelige translesie-polymerasen, bijvoorbeeld UmuCD'2 (ook wel DNA-polymerase V genoemd), worden later als laatste redmiddel geïnduceerd. [59] Zodra de DNA-schade is hersteld of omzeild met behulp van polymerasen of door recombinatie, neemt de hoeveelheid enkelstrengs DNA in cellen af, waardoor de hoeveelheid RecA-filamenten de splitsingsactiviteit van LexA-homodimeer vermindert, dat vervolgens bindt aan de SOS-boxen in de buurt van promotors en herstelt de normale genexpressie.

    Eukaryote transcriptionele reacties op DNA-schade

    Eukaryote cellen die zijn blootgesteld aan DNA-beschadigende middelen, activeren ook belangrijke verdedigingsroutes door meerdere eiwitten te induceren die betrokken zijn bij DNA-herstel, controle van de celcyclus, eiwittransport en afbraak. Een dergelijke genoombrede transcriptionele respons is zeer complex en strak gereguleerd, waardoor een gecoördineerde wereldwijde respons op schade mogelijk is. Blootstelling van gist Saccharomyces cerevisiae aan DNA-beschadigende middelen resulteert in overlappende maar verschillende transcriptionele profielen. Overeenkomsten met omgevingsschokrespons geven aan dat er een algemene globale stressresponsroute bestaat op het niveau van transcriptionele activering.Daarentegen reageren verschillende menselijke celtypen verschillend op schade, wat wijst op de afwezigheid van een gemeenschappelijke globale respons. De waarschijnlijke verklaring voor dit verschil tussen gist- en menselijke cellen kan liggen in de heterogeniteit van zoogdiercellen. Bij een dier zijn verschillende soorten cellen verdeeld over verschillende organen die verschillende gevoeligheden voor DNA-schade hebben ontwikkeld. [60]

    In het algemeen omvat een globale respons op DNA-schade de expressie van meerdere genen die verantwoordelijk zijn voor herstel na replicatie, homologe recombinatie, herstel van nucleotide-excisie, controlepunt voor DNA-schade, globale transcriptionele activatie, genen die het verval van mRNA beheersen, en vele andere. Een grote hoeveelheid schade aan een cel laat hem achter met een belangrijke beslissing: apoptose ondergaan en sterven, of overleven ten koste van levensonderhoud met een gemodificeerd genoom. Een toename van de tolerantie voor schade kan leiden tot een verhoogde overlevingskans die een grotere accumulatie van mutaties mogelijk maakt. Gist Rev1 en humane polymerase η zijn leden van [Y-familie translesion-DNA-polymerasen die aanwezig zijn tijdens globale respons op DNA-schade en zijn verantwoordelijk voor verbeterde mutagenese tijdens een globale respons op DNA-schade in eukaryoten. [41]

    Pathologische effecten van slecht DNA-herstel

    Proefdieren met genetische tekortkomingen in DNA-herstel vertonen vaak een kortere levensduur en een verhoogde incidentie van kanker. [15] Muizen met een tekort aan de dominante NHEJ-route en in telomeeronderhoudsmechanismen krijgen bijvoorbeeld vaker lymfoom en infecties en hebben als gevolg daarvan een kortere levensduur dan wildtype muizen. [61] Op een vergelijkbare manier hebben muizen die een tekort hebben aan een sleutelreparatie- en transcriptie-eiwit dat DNA-helices afwikkelt, een voortijdig begin van verouderingsgerelateerde ziekten en een daaruit voortvloeiende verkorting van de levensduur. [62] Niet elke DNA-reparatiedeficiëntie creëert echter precies de voorspelde effecten. muizen die deficiënt zijn in de NER-route vertoonden een kortere levensduur zonder overeenkomstig hogere mutatiesnelheden. [63]

    Als de snelheid van DNA-schade het vermogen van de cel om het te herstellen overschrijdt, kan de opeenhoping van fouten de cel overweldigen en resulteren in vroege veroudering, apoptose of kanker. Erfelijke ziekten die verband houden met een gebrekkig functionerend DNA-herstel leiden tot vroegtijdige veroudering, [15] verhoogde gevoeligheid voor kankerverwekkende stoffen en een overeenkomstig verhoogd risico op kanker (zie hieronder). Aan de andere kant, organismen met verbeterde DNA-reparatiesystemen, zoals Deinococcus radiodurans, het meest stralingsbestendige bekende organisme, vertoont een opmerkelijke resistentie tegen de dubbelstrengs breuk-inducerende effecten van radioactiviteit, waarschijnlijk als gevolg van verhoogde efficiëntie van DNA-herstel en vooral NHEJ. [64]

    Levensduur en caloriebeperking Bewerken

    Er is vastgesteld dat een aantal individuele genen van invloed zijn op variaties in levensduur binnen een populatie van organismen. De effecten van deze genen zijn sterk afhankelijk van de omgeving, in het bijzonder van de voeding van het organisme. Calorische beperking resulteert reproduceerbaar in een langere levensduur van een verscheidenheid aan organismen, waarschijnlijk via routes voor het detecteren van voedingsstoffen en een verminderde stofwisseling. De moleculaire mechanismen waarmee een dergelijke beperking resulteert in een langere levensduur zijn tot nu toe onduidelijk (zie [65] voor enige discussie), maar het gedrag van veel genen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij DNA-herstel, wordt veranderd onder omstandigheden van caloriebeperking. Van verschillende middelen waarvan is gemeld dat ze anti-verouderingseigenschappen hebben, is aangetoond dat ze het constitutieve niveau van mTOR-signalering, een bewijs van vermindering van de metabole activiteit, verminderen en tegelijkertijd het constitutieve niveau van DNA-schade veroorzaakt door endogeen gegenereerde reactieve zuurstofsoorten verminderen. [66]

    Bijvoorbeeld het verhogen van de gendosering van het gen SIR-2, dat de DNA-verpakking in de nematodeworm regelt Caenorhabditis elegans, kan de levensduur aanzienlijk verlengen. [67] Van de zoogdierhomoloog van SIR-2 is bekend dat hij stroomafwaartse DNA-reparatiefactoren induceert die betrokken zijn bij NHEJ, een activiteit die vooral wordt bevorderd onder omstandigheden van caloriebeperking. [68] Caloriebeperking is nauw verbonden met de snelheid van base-excisieherstel in het nucleaire DNA van knaagdieren, [69] hoewel vergelijkbare effecten niet zijn waargenomen in mitochondriaal DNA. [70]

    De C. elegans gen AGE-1, een stroomopwaartse effector van DNA-herstelroutes, zorgt voor een dramatisch verlengde levensduur onder omstandigheden van vrije voeding, maar leidt tot een afname van de reproductieve fitheid onder omstandigheden van caloriebeperking. [71] Deze observatie ondersteunt de pleiotropietheorie van de biologische oorsprong van veroudering, wat suggereert dat genen die vroeg in het leven een groot overlevingsvoordeel opleveren, zullen worden geselecteerd, zelfs als ze op latere leeftijd een overeenkomstig nadeel hebben.

    Erfelijke DNA-reparatiestoornissen

    Defecten in het NER-mechanisme zijn verantwoordelijk voor verschillende genetische aandoeningen, waaronder:

      : overgevoeligheid voor zonlicht/UV, resulterend in verhoogde incidentie van huidkanker en vroegtijdige veroudering : overgevoeligheid voor UV en chemische middelen : gevoelige huid, broos haar en nagels

    Mentale retardatie gaat vaak gepaard met de laatste twee aandoeningen, wat wijst op een verhoogde kwetsbaarheid van ontwikkelingsneuronen.

    Andere DNA-reparatiestoornissen zijn onder meer:

      : vroegtijdige veroudering en vertraagde groei : overgevoeligheid voor zonlicht, hoge incidentie van maligniteiten (vooral leukemieën). : gevoeligheid voor ioniserende straling en sommige chemische agentia

    Alle bovengenoemde ziekten worden vaak "segmentale progeria's" ("versnelde verouderingsziekten") genoemd omdat hun slachtoffers op een abnormaal jonge leeftijd ouder lijken en aan verouderingsgerelateerde ziekten lijden, terwijl ze niet alle symptomen van ouderdom vertonen.

    Andere ziekten die verband houden met een verminderde DNA-herstelfunctie zijn Fanconi-anemie, erfelijke borstkanker en erfelijke darmkanker.

    Vanwege inherente beperkingen in de DNA-reparatiemechanismen, zouden mensen, als ze lang genoeg zouden leven, uiteindelijk allemaal kanker krijgen. [72] [73] Er zijn minstens 34 erfelijke mutaties van het menselijke DNA-herstelgen die het risico op kanker verhogen. Veel van deze mutaties zorgen ervoor dat DNA-herstel minder effectief is dan normaal. In het bijzonder is erfelijke niet-polyposis colorectale kanker (HNPCC) sterk geassocieerd met specifieke mutaties in de DNA-mismatch-reparatieroute. BRCA1 en BRCA2, twee belangrijke genen waarvan de mutaties een enorm verhoogd risico op borstkanker aan dragers geven, [74] zijn beide geassocieerd met een groot aantal DNA-herstelroutes, met name NHEJ en homologe recombinatie.

    Kankertherapieprocedures zoals chemotherapie en radiotherapie werken door het overweldigen van het vermogen van de cel om DNA-schade te herstellen, wat resulteert in celdood. Cellen die zich het snelst delen - meestal kankercellen - worden bij voorkeur aangetast. Het neveneffect is dat andere niet-kankerachtige maar snel delende cellen zoals voorlopercellen in de darm, de huid en het hematopoëtische systeem ook worden aangetast. Moderne kankerbehandelingen proberen de DNA-schade aan cellen en weefsels te lokaliseren die alleen verband houden met kanker, hetzij door fysieke middelen (concentratie van het therapeutische middel in het gebied van de tumor) of door biochemische middelen (gebruikmakend van een eigenschap die uniek is voor kankercellen in het lichaam) . In de context van therapieën die gericht zijn op DNA-schaderesponsgenen, wordt de laatste benadering 'synthetische letaliteit' genoemd. [75]

    Misschien wel de meest bekende van deze 'synthetische letaliteit'-medicijnen is de poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) -remmer olaparib, die in 2015 door de Food and Drug Administration werd goedgekeurd voor de behandeling bij vrouwen van BRCA-defecte eierstok kanker. Tumorcellen met gedeeltelijk verlies van DNA-schaderespons (met name homologe recombinatiereparatie) zijn afhankelijk van een ander mechanisme - enkelstrengs breukherstel - dat een mechanisme is dat gedeeltelijk bestaat uit het PARP1-genproduct. [76] Olaparib wordt gecombineerd met chemotherapeutica om herstel van enkelstrengs breuken, veroorzaakt door DNA-schade veroorzaakt door de gelijktijdig toegediende chemotherapie, te remmen. Tumorcellen die afhankelijk zijn van dit resterende DNA-herstelmechanisme zijn niet in staat de schade te herstellen en zijn daarom niet in staat om te overleven en te prolifereren, terwijl normale cellen de schade kunnen herstellen met het functionerende homologe recombinatiemechanisme.

    Veel andere geneesmiddelen voor gebruik tegen andere resterende DNA-herstelmechanismen die vaak bij kanker worden aangetroffen, worden momenteel onderzocht. Echter, therapeutische benaderingen voor synthetische letaliteit zijn in twijfel getrokken vanwege het opkomende bewijs van verworven resistentie, bereikt door herbedrading van DNA-schaderesponsroutes en omkering van eerder geremde defecten. [77]

    DNA-reparatiedefecten bij kanker

    Het is de afgelopen jaren duidelijk geworden dat de reactie op DNA-schade een barrière vormt voor de kwaadaardige transformatie van preneoplastische cellen. [78] Eerdere studies hebben een verhoogde respons op DNA-schade aangetoond in celcultuurmodellen met oncogenactivering [79] en preneoplastische colonadenomen. [80] Responsmechanismen voor DNA-schade veroorzaken stilstand van de celcyclus en proberen DNA-laesies te herstellen of celdood/veroudering te bevorderen als herstel niet mogelijk is. Replicatiestress wordt waargenomen in preneoplastische cellen als gevolg van verhoogde proliferatiesignalen van oncogene mutaties. Replicatiestress wordt gekenmerkt door: verhoogde replicatie-initiatie/oorsprong-vuren verhoogde transcriptie en botsingen van transcriptie-replicatiecomplexen nucleotidedeficiëntie toename van reactieve zuurstofspecies (ROS). [81]

    Replicatiestress, samen met de selectie voor het inactiveren van mutaties in DNA-schaderesponsgenen in de evolutie van de tumor, [82] leidt tot downregulatie en/of verlies van sommige DNA-schaderesponsmechanismen, en dus verlies van DNA-herstel en/of senescentie/ Geprogrammeerde celdood. In experimentele muismodellen werd verlies van DNA-schaderespons-gemedieerde celsenescentie waargenomen na gebruik van een kort haarspeld-RNA (shRNA) om de dubbelstrengs breukrespons kinase ataxia telangiectasia (ATM) te remmen, wat leidde tot een grotere tumorgrootte en invasiviteit. [80] Mensen geboren met erfelijke defecten in DNA-herstelmechanismen (bijvoorbeeld Li-Fraumeni-syndroom) hebben een hoger risico op kanker. [83]

    De prevalentie van mutaties in reactie op DNA-schade verschilt tussen kankertypes. Zo heeft 30% van de invasieve borstcarcinomen mutaties in genen die betrokken zijn bij homologe recombinatie. [78] Bij kanker wordt neerwaartse regulatie waargenomen in alle DNA-schaderesponsmechanismen (base-excisieherstel (BER), nucleotide-excisieherstel (NER), DNA-mismatchreparatie (MMR), homologe recombinatiereparatie (HR), niet-homologe end-joining ( NHEJ) en translesion DNA-synthese (TLS). [84] Naast mutaties in genen voor DNA-schadeherstel, treden er ook mutaties op in de genen die verantwoordelijk zijn voor het stoppen van de celcyclus om voldoende tijd te geven voor DNA-herstel, en sommige genen zijn betrokken in zowel DNA-schadeherstel als controlepuntcontrole van de celcyclus, bijvoorbeeld ATM en checkpoint kinase 2 (CHEK2) - een tumorsuppressor die vaak afwezig is of wordt gedownreguleerd bij niet-kleincellige longkanker. [85]

    HR NHEJ SSA FA BER NER MMR
    Geldautomaat x x x
    ATR x x x
    PAXIP x x
    RPA x x x
    BRCA1 x x
    BRCA2 x x
    RAD51 x x
    RFC x x x
    XRCC1 x x
    PCNA x x x
    PARP1 x x
    ERCC1 x x x x
    MSH3 x x x

    Tabel: Genen die betrokken zijn bij DNA-schadereactieroutes en vaak gemuteerd bij kanker (HR = homologe recombinatie NHEJ = niet-homologe eindverbinding SSA = enkelstrengs annealing FA = fanconi-anemieroute BER = base-excisieherstel NER = nucleotide-excisieherstel MMR = mismatch reparatie)

    Epigenetische DNA-reparatiedefecten bij kanker

    Klassiek wordt kanker gezien als een reeks ziekten die worden veroorzaakt door progressieve genetische afwijkingen, waaronder mutaties in tumorsuppressorgenen en oncogenen, en chromosomale afwijkingen. Het is echter duidelijk geworden dat kanker ook wordt veroorzaakt door epigenetische veranderingen. [86]

    Epigenetische veranderingen verwijzen naar functioneel relevante modificaties van het genoom die geen verandering in de nucleotidesequentie met zich meebrengen. Voorbeelden van dergelijke modificaties zijn veranderingen in DNA-methylering (hypermethylering en hypomethylering) en histonmodificatie, [87] veranderingen in chromosomale architectuur (veroorzaakt door ongepaste expressie van eiwitten zoals HMGA2 of HMGA1) [88] en veranderingen veroorzaakt door microRNA's. Elk van deze epigenetische veranderingen dient om genexpressie te reguleren zonder de onderliggende DNA-sequentie te veranderen. Deze veranderingen blijven meestal door celdelingen, duren meerdere celgeneraties en kunnen worden beschouwd als epimutaties (equivalent aan mutaties).

    Hoewel grote aantallen epigenetische veranderingen worden gevonden bij kankers, lijken de epigenetische veranderingen in DNA-reparatiegenen, die verminderde expressie van DNA-reparatie-eiwitten veroorzaken, bijzonder belangrijk te zijn. Men denkt dat dergelijke veranderingen zich vroeg in de progressie naar kanker voordoen en een waarschijnlijke oorzaak zijn van de genetische instabiliteit die kenmerkend is voor kankers. [89] [90] [91]

    Verminderde expressie van DNA-reparatiegenen veroorzaakt een gebrekkige DNA-reparatie. Wanneer DNA-herstel deficiënt is, blijft DNA-schade in cellen op een hoger dan normaal niveau en deze overmatige schade veroorzaakt verhoogde frequenties van mutatie of epimutatie. Mutatiesnelheden nemen aanzienlijk toe in cellen die defect zijn in DNA-mismatchreparatie [92] [93] of in homologe recombinatiereparatie (HRR). [94] Chromosomale herschikkingen en aneuploïdie nemen ook toe in HRR-defecte cellen. [95]

    Hogere niveaus van DNA-schade veroorzaken niet alleen verhoogde mutatie, maar veroorzaken ook verhoogde epimutatie. Tijdens reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken of reparatie van andere DNA-schade, kunnen onvolledig gewiste reparatieplaatsen epigenetische genuitschakeling veroorzaken. [96] [97]

    Deficiënte expressie van DNA-reparatie-eiwitten als gevolg van een erfelijke mutatie kan een verhoogd risico op kanker veroorzaken. Personen met een erfelijke stoornis in een van de 34 DNA-reparatiegenen (zie artikel DNA-reparatie-deficiëntiestoornis) hebben een verhoogd risico op kanker, waarbij sommige defecten een levenslange kans op kanker tot 100% veroorzaken (bijv. p53-mutaties). [98] Dergelijke kiembaanmutaties (die zeer penetrante kankersyndromen veroorzaken) zijn echter de oorzaak van slechts ongeveer 1 procent van de kankers. [99]

    Frequenties van epimutaties in DNA-reparatiegenen

    Deficiënties in DNA-reparatie-enzymen worden soms veroorzaakt door een nieuw opkomende somatische mutatie in een DNA-reparatiegen, maar worden veel vaker veroorzaakt door epigenetische veranderingen die de expressie van DNA-reparatiegenen verminderen of stilleggen. Toen bijvoorbeeld 113 colorectale kankers achter elkaar werden onderzocht, hadden slechts vier een missense-mutatie in het DNA-reparatiegen MGMT, terwijl de meerderheid de MGMT-expressie had verminderd als gevolg van methylering van het MGMT-promotergebied (een epigenetische wijziging). [100] Vijf verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat tussen 40% en 90% van de colorectale kankers de MGMT-expressie hebben verminderd als gevolg van methylering van het MGMT-promotergebied. [101] [102] [103] [104] [105]

    Evenzo was van de 119 gevallen van niet-overeenkomende reparatie-deficiënte colorectale kankers die DNA-herstelgen PMS2-expressie misten, PMS2 deficiënt in 6 als gevolg van mutaties in het PMS2-gen, terwijl in 103 gevallen PMS2-expressie deficiënt was omdat de paringspartner MLH1 werd onderdrukt vanwege tot promotormethylering (PMS2-eiwit is onstabiel in afwezigheid van MLH1). [106] In de andere 10 gevallen was het verlies van PMS2-expressie waarschijnlijk te wijten aan epigenetische overexpressie van het microRNA, miR-155, dat MLH1 neerwaarts reguleert. [107]

    In een ander voorbeeld werden epigenetische defecten gevonden bij verschillende kankers (bijvoorbeeld borst-, eierstok-, colorectaal en hoofd-hals). Twee of drie tekortkomingen in de expressie van ERCC1, XPF of PMS2 komen gelijktijdig voor bij de meeste van 49 darmkankers die zijn geëvalueerd door Facista et al. [108]

    De grafiek in deze sectie toont enkele veelvoorkomende DNA-beschadigende middelen, voorbeelden van DNA-laesies die ze veroorzaken, en de wegen die met deze DNA-schade omgaan. Ten minste 169 enzymen worden ofwel direct gebruikt bij DNA-reparatie of beïnvloeden DNA-reparatieprocessen. [109] Hiervan worden er 83 rechtstreeks gebruikt bij het repareren van de 5 soorten DNA-schade die in de grafiek worden geïllustreerd.

    Enkele van de meer goed bestudeerde genen die centraal staan ​​in deze herstelprocessen worden weergegeven in de grafiek. De genaanduidingen in rood, grijs of cyaan geven genen aan die vaak epigenetisch veranderd zijn bij verschillende soorten kankers. Wikipedia-artikelen over elk van de genen gemarkeerd door rood, grijs of cyaan beschrijven de epigenetische verandering(en) en de kanker(s) waarin deze epimutaties worden gevonden. Overzichtsartikelen, [110] en brede experimentele onderzoeksartikelen [111] [112] documenteren ook de meeste van deze epigenetische DNA-reparatiedeficiënties bij kankers.

    Rood gemarkeerde genen worden vaak verminderd of tot zwijgen gebracht door epigenetische mechanismen bij verschillende kankers. Wanneer deze genen een lage of afwezige expressie hebben, kan DNA-schade zich ophopen. Replicatiefouten voorbij deze beschadigingen (zie translesiesynthese) kunnen leiden tot verhoogde mutaties en uiteindelijk tot kanker. Epigenetische repressie van DNA-herstelgenen in nauwkeurig DNA-herstelroutes lijken centraal te staan ​​in carcinogenese.

    De twee grijs gemarkeerde genen RAD51 en BRCA2, zijn vereist voor homologe recombinatiereparatie. Ze worden soms epigenetisch tot overexpressie gebracht en soms tot onderexpressie gebracht bij bepaalde vormen van kanker. Zoals aangegeven in de Wikipedia-artikelen over RAD51 en BRCA2 hebben dergelijke kankers gewoonlijk epigenetische tekortkomingen in andere DNA-herstelgenen. Deze reparatiedeficiënties zouden waarschijnlijk meer niet-gerepareerde DNA-schade veroorzaken. De overexpressie van RAD51 en BRCA2 die bij deze kankers wordt gezien, kan een weerspiegeling zijn van selectieve druk voor compenserende RAD51 of BRCA2 overexpressie en verhoogde homologe recombinatie reparatie om op zijn minst gedeeltelijk om te gaan met dergelijke overmatige DNA-schade. In die gevallen waarin RAD51 of BRCA2 onderexpressie zijn, zou dit zelf leiden tot verhoogde niet-herstelde DNA-schade. Replicatiefouten voorbij deze beschadigingen (zie translesiesynthese) kunnen verhoogde mutaties en kanker veroorzaken, zodat onderexpressie van RAD51 of BRCA2 op zich kankerverwekkend zou zijn.

    Cyaan-gemarkeerde genen bevinden zich in de microhomologie-gemedieerde end-join (MMEJ) -route en worden opwaarts gereguleerd bij kanker. MMEJ is een extra foutgevoelig onnauwkeurig reparatieroute voor dubbelstrengs breuken. Bij MMEJ-reparatie van een dubbelstrengige breuk is een homologie van 5-25 complementaire basenparen tussen beide gepaarde strengen voldoende om de strengen uit te lijnen, maar niet-overeenkomende uiteinden (flappen) zijn meestal aanwezig. MMEJ verwijdert de extra nucleotiden (flappen) waar de strengen zijn verbonden en ligeert vervolgens de strengen om een ​​intacte dubbele DNA-helix te creëren. MMEJ omvat bijna altijd ten minste een kleine deletie, zodat het een mutageen pad is. [24] FEN1, het flap-endonuclease in MMEJ, wordt epigenetisch verhoogd door promotorhypomethylering en wordt tot overexpressie gebracht in de meeste borstkankers, [113] prostaat, [114] maag, [115] [116] neuroblastomen, [ 117] alvleesklier, [118] en long.[119] PARP1 wordt ook tot overexpressie gebracht wanneer de ETS-site van de promotorregio epigenetisch gehypomethyleerd is, en dit draagt ​​bij aan de progressie naar endometriumkanker [120] en BRCA-gemuteerde sereuze eierstokkanker. [121] Andere genen in de MMEJ-route worden ook tot overexpressie gebracht in een aantal kankers (zie MMEJ voor een samenvatting), en worden ook weergegeven in cyaan.

    Genoombrede distributie van DNA-reparatie in menselijke somatische cellen

    Differentiële activiteit van DNA-herstelroutes in verschillende regio's van het menselijk genoom zorgt ervoor dat mutaties zeer ongelijk verdeeld zijn binnen tumorgenomen. [122] [123] In het bijzonder vertonen de genrijke, vroeg replicerende gebieden van het menselijk genoom lagere mutatiefrequenties dan de gen-arme, laat-replicerende heterochromatine. Een mechanisme dat hieraan ten grondslag ligt, is de histonmodificatie H3K36me3, die mismatch-reparatie-eiwitten kan rekruteren [124], waardoor de mutatiesnelheden in H3K36me3-gemarkeerde regio's worden verlaagd. [125] Een ander belangrijk mechanisme betreft het herstel van nucleotide-excisie, dat kan worden gerekruteerd door de transcriptiemachinerie, waardoor de somatische mutatiesnelheid in actieve genen [123] en andere open chromatinegebieden wordt verlaagd. [126]

    De basisprocessen van DNA-herstel zijn sterk geconserveerd onder zowel prokaryoten als eukaryoten en zelfs onder bacteriofagen (virussen die bacteriën infecteren), maar complexere organismen met complexere genomen hebben dienovereenkomstig complexere herstelmechanismen. [127] Het vermogen van een groot aantal structurele eiwitmotieven om relevante chemische reacties te katalyseren, heeft tijdens de evolutie een belangrijke rol gespeeld bij de uitwerking van reparatiemechanismen. Voor een uiterst gedetailleerd overzicht van hypothesen met betrekking tot de evolutie van DNA-reparatie, zie. [128]

    Het fossielenbestand geeft aan dat eencellig leven zich op een bepaald moment tijdens de Precambrische periode op de planeet begon te verspreiden, hoewel het onduidelijk is wanneer precies het moderne leven ontstond. Nucleïnezuren werden het enige en universele middel om genetische informatie te coderen, waarvoor DNA-herstelmechanismen nodig waren die in hun basisvorm door alle bestaande levensvormen van hun gemeenschappelijke voorouder zijn geërfd. De opkomst van de zuurstofrijke atmosfeer van de aarde (bekend als de "zuurstofcatastrofe") als gevolg van fotosynthetische organismen, evenals de aanwezigheid van potentieel schadelijke vrije radicalen in de cel als gevolg van oxidatieve fosforylering, maakte de ontwikkeling van DNA-reparatiemechanismen noodzakelijk die specifiek werken om de soorten schade veroorzaakt door oxidatieve stress tegen te gaan.

    Snelheid van evolutionaire verandering

    In sommige gevallen wordt DNA-schade niet gerepareerd of gerepareerd door een foutgevoelig mechanisme dat resulteert in een verandering van de oorspronkelijke sequentie. Wanneer dit gebeurt, kunnen mutaties zich voortplanten in de genomen van het nageslacht van de cel. Mocht een dergelijke gebeurtenis plaatsvinden in een kiemlijncel die uiteindelijk een gameet zal produceren, dan kan de mutatie worden doorgegeven aan de nakomelingen van het organisme. De snelheid van evolutie in een bepaalde soort (of, in een bepaald gen) is een functie van de snelheid van mutatie. Als gevolg hiervan hebben de snelheid en nauwkeurigheid van DNA-reparatiemechanismen invloed op het proces van evolutionaire verandering. [129] Bescherming en herstel van DNA-schade heeft geen invloed op de snelheid van aanpassing door genregulatie en door recombinatie en selectie van allelen. Aan de andere kant beïnvloedt het herstel en de bescherming van DNA-schade de snelheid van accumulatie van onherstelbare, voordelige, code-uitbreidende, erfelijke mutaties, en vertraagt ​​het het evolutionaire mechanisme voor uitbreiding van het genoom van organismen met nieuwe functionaliteiten. De spanning tussen evolueerbaarheid en mutatieherstel en -bescherming behoeft nader onderzoek.

    Een technologie genaamd geclusterde regelmatige interspaced short palindromic repeat (afgekort tot CRISPR-Cas9) werd in 2012 ontdekt. ​​De nieuwe technologie stelt iedereen met een opleiding in moleculair biologie in staat om de genen van elke soort met precisie te veranderen door DNA-schade op een specifiek punt te veroorzaken en vervolgens het veranderen van DNA-reparatiemechanismen om nieuwe genen in te voegen. [130] Het is goedkoper, efficiënter en nauwkeuriger dan andere technologieën. Met behulp van CRISPR–Cas9 kunnen door wetenschappers delen van een genoom worden bewerkt door delen in een DNA-sequentie te verwijderen, toe te voegen of te wijzigen.


    DNA: structuur, functie, verpakking en eigenschappen (met diagram)

    Laten we een diepgaande studie maken van de deoxyribonucleïnezuur. Na het lezen van dit artikel leert u over: 1. Deoxyribonucleïnezuur (DNA) 2. Structuur van DNA 3. Functies van DNA 4. Verpakking van DNA en 5. Fysieke eigenschappen van DNA.

    Deoxyribonucleïnezuur (DNA):

    Deoxyribonucleïnezuur, ook afgekort als DNA, is het belangrijkste informatieve macromolecuul van de cel, dat de genetische informatie opslaat, vertaalt en overdraagt. In de prokaryoten wordt het DNA meestal gevonden in de nucleaire zone. In eukaryoten wordt het gevonden in de kern, mitochondriën en chloroplast. Het huidige begrip van de opslag en het gebruik van de genetische informatie van de cel is gebaseerd op de ontdekking van de structuur van DNA door Watson en Crick in 1953.

    Structuur van DNA:

    Dubbele spiraalvormige structuur van DNA (Watson en Crick-model):

    De driedimensionale structuur van DNA zoals voorgesteld door Watson en Crick en de recente ontwikkelingen daarin worden hier samengevat:

    1. DNA is gemaakt van twee spiraalvormige kettingen die rond dezelfde as zijn gewikkeld om een ​​rechtshandige dubbele helix te vormen.

    2. De twee ketens in de helix zijn antiparallel aan elkaar, d.w.z. het 5'8242-uiteinde van de ene polynucleotideketen en het 3'8242-uiteinde van de andere polynucleotideketen bevinden zich aan dezelfde kant en dicht bij elkaar.

    Dubbele helixstructuur van DNA

    3. De afstand tussen elke winding is 3,6 nm (voorheen 3,4 nm).

    4. Er zijn 10,5 nucleotiden per beurt (voorheen 10 nucleotiden).

    5. De ruimtelijke relatie tussen de twee strengen creëert grote en kleine groeven tussen de twee strengen. In deze groeven interageren sommige eiwitten.

    6. De hydrofiele ruggengraat van afwisselende deoxyribose en negatief geladen fosfaatgroepen bevinden zich aan de buitenkant van de dubbele helix.

    7. De hydrofobe pyrimidine- en purinebasen bevinden zich in de dubbele helix, die de dubbele helix van het DNA stabiliseert.

    8. De dubbele helix wordt ook gestabiliseerd door waterstofbinding tussen de ketens gevormd tussen een purine- en pyrimidinebase.

    9. Een bepaalde purinebase, paren door waterstofbruggen, alleen met een bepaalde pyrimidinebase, d.w.z. Adenine (A) paren met Thymine (T) en Guanine (G) paren met alleen cytosine (C).

    10. Twee waterstofbruggen paren adenine en thymine (A = T), terwijl drie waterstofbruggen guanine en cytosine paren (G ≡ C).

    11. De basenparen A = T en G ≡ C staan ​​bekend als complementaire basenparen.

    12. Door de aanwezigheid van complementaire basenparing zijn de twee ketens van de dubbele DNA-helix complementair aan elkaar.

    Het aantal A'8217 basen is dus gelijk aan het aantal T'8217 basen (of '8216G'8217 is gelijk aan '8216C) in een gegeven dubbelstrengs DNA.

    13. Een van de strengen in de dubbele helix staat bekend als sense-streng, d.w.z. die codeert voor RNA/eiwitten en de andere streng staat bekend als antisense-streng.

    Verschillende structurele vormen van DNA:

    De DNA-moleculen bestaan ​​in vier verschillende structurele vormen of organisaties onder verschillende fysiologische omstandigheden of in verschillende cellen of op verschillende punten in hetzelfde DNA.

    Functies van DNA:

    De basenvolgorde van het DNA vormt het informatiesignaal dat het genetische materiaal wordt genoemd. Deze nucleotide-basesequentie stelt het DNA in staat om de genetische informatie te functioneren, op te slaan, tot expressie te brengen en over te dragen. Daarom programmeert en controleert het alle activiteiten van een organisme direct of indirect gedurende zijn levenscyclus.

    (a) DNA slaat de volledige genetische informatie op die nodig is om de structuur van alle eiwitten en RNA's van elk organisme te specificeren (vormen).

    (b) DNA is de bron van informatie voor de synthese van alle cellulaire lichaamseiwitten. Sommige van de eiwitten zijn structurele eiwitten en sommige zijn enzymen. Deze enzymen rangschikken micromoleculen om macromoleculen te vormen. Deze macromoleculen zijn gerangschikt om supramoleculaire complexen of celorganellen te vormen die associëren om cellen te vormen. Deze cellen groeperen zich om weefsels te vormen die op hun beurt verschillende organen van een lichaam vormen, specifiek eigen aan dat organisme tijdens de ontwikkeling, groei en herstel van de foetus. Vandaar dat DNA in tijd en ruimte de geordende biosynthese van cellen en weefselcomponenten programmeert.

    (c) Het bepaalt de activiteiten van een organisme gedurende zijn hele levenscyclus, d.w.z. de periode van zwangerschap, geboorte, volwassenheid, veroudering en dood.

    (d) Het bepaalt de individualiteit en identiteit van een bepaald organisme.

    (e) Het dupliceert (repliceert om twee dochter-DNA te vormen) zichzelf en draagt ​​een van de kopie over aan de dochtercel tijdens celdeling, waardoor het genetische materiaal van generatie op generatie behouden blijft.

    Verpakking van DNA:

    Verpakking van DNA in de cellen:

    De lengte van DNA-moleculen die in een bepaalde cel bestaan, is veel langer dan de lange afmetingen van de cel of het organel waar ze bestaan. De contourlengte (dwz de helixlengte) van een dubbelstrengs DNA kan worden berekend uit het molecuulgewicht, waarbij wordt aangenomen dat het gemiddelde molecuulgewicht van elk nucleotidepaar ongeveer 650 Da is en dat er één nucleotidepaar is voor elke 0,36 nm van de duplex .

    Dienovereenkomstig is de lengte van het kleinste DNA 1938,96 nm, behorend tot de ɸX174-virus (in duplexvorm), waarvan de lengte van de deeltjes 25 nm is. Aan de andere kant is de totale contourlengte van het gehele DNA in een enkele menselijke cel ongeveer 2 meter en de celkern is slechts 5-10 nm in diameter. Deze lange DNA-moleculen zijn zeer dicht opeengepakt, zodat ze in de cel passen.

    Deze verpakking is mogelijk doordat DNA verder op verschillende manieren wordt opgerold. Het lineaire dubbele helixvormige DNA, het ontspannen DNA genoemd, buigt of draait om zijn eigen as, wat DNA-kronkeling wordt genoemd. Dit opgerolde DNA rolt zich verder op om de DNA-superspoel te vormen, net als de telefoonkabel van de basis van de telefoon naar de ontvanger.

    De mate van DNA-supercoiling hangt af van het type cel/organel dat moet worden verpakt en is zodanig opgerold dat DNA gemakkelijk toegankelijk is voor de enzymen/eiwitten voor al zijn functies, zoals replicatie en transcriptie.

    Er zijn twee soorten DNA-supercoiling mogelijk:

    (a) Solenoidal, waarbij het DNA zich bolvormig op zichzelf wikkelt en

    (b) Plectonemisch, waarbij het DNA op zijn omgekeerde lengte terugspoelt in de vorm van plooien. Verder verschillen de supercoiling en pakking van DNA in de prokaryoten (d.w.z. die zonder een echte kernenvelop) en in de eukaryoten (d.w.z. die met een kernmembraan).

    (een) Verpakking van viraal DNA:

    Hoewel het virale DNA veel kleiner is dan een bacterieel of eukaryoot DNA, is de contourlengte veel groter dan de lange afmetingen van het virale deeltje waarin ze worden gevonden. Het DNA van bacteriofaag T2 is 3500 keer de deeltjesdiameter. De lange afmetingen van verschillende virale deeltjes/de contourlengte van hun DNA's respectievelijk in nanometers is T2-210/65520 Lamdaphage-190/17460 Ti-78/14376 en φX174 (in duplexvorm)-25/1938. Om zichzelf in het deeltje te krijgen, zijn de meeste van deze virale DNA's aan de uiteinden covalent verbonden en vormen daarom een ​​​​eindeloze riem en worden zo cirkelvormig. Een deel van het enkelstrengs DNA (φX174) wordt dubbelstrengs en circulair.

    (B) Verpakking van bacterieel DNA:

    De lengte van de E.coli-cel is 2 micrometer en het volledige DNA-molecuul (het volledige DNA-molecuul van een organisme wordt het chromosoom genoemd) is 1,7 mm lang, dat bestaat als een enkel, covalent gesloten dubbelstrengs cirkelvormig molecuul, opgerold en verpakt in nucleon van de cel.

    Dit circulaire chromosoom is georganiseerd in een scaffold-achtige structuur, die het chromosoom in lusvormige domeinen vouwt. Deze domeinen zijn verder opgerold rond enkele basiseiwitten, Hu-eiwitten genoemd (Mw = 10 000). Naast het nucleosomale DNA bevat de bacterie enkele kleine cirkelvormige supercoiled niet-chromosomale DNA genaamd plasmiden.

    (C) Organisatie en verpakking van eukaryoot DNA:

    Al het chromosomale DNA van een eukaryote cel is ingebed in een vliezig cellulair organel dat de kern wordt genoemd. Het eukaryote DNA in de kern is lineair en niet circulair. In de niet-delende rustende cel vormt al het DNA van de cel een fijn filamenteus netwerk in de kern, het chromatine genaamd. Tijdens celdeling wordt het chromatinenetwerk onderverdeeld in gedefinieerde aantal en gevormde chromosomen, hun diploïde aantal (paren) hangt af van de soort organisme.

    Het normale aantal chromosomen bij de mens is 46 (23 paren). Elk chromosoom heeft een centrale as die het centromeer wordt genoemd, van waaruit twee DNA-armen uitsteken en elk wordt chromatide genoemd. Elk chromosoom verschilt in grootte en vorm binnen een bepaald organisme.

    Het 2 meter lange eukaryote menselijke cel-DNA wordt verpakt in de cel met een diameter van ongeveer 5-10 micrometer. Om het pakket te vergemakkelijken, is het spiraalvormige DNA-molecuul stevig gebonden rond kralen van basiseiwitten, histonen genaamd, die op regelmatige afstanden van elkaar zijn geplaatst. De complexen van histonen en DNA worden nucleosomen genoemd. Elk nucleosoom bevat acht histonmoleculen, elk twee exemplaren van H2AH2B, H3 en H4 146 basenparen DNA opwinden.

    Tussen de twee nucleosomen bevindt zich een spacer-DNA van 54 basenparen met een enkel histonmolecuul (H1). Door DNA rond een nucleosoom te wikkelen, wordt het ongeveer zevenvoudig gecomprimeerd. Deze nucleosomen zijn heel dicht bij elkaar georganiseerd om een ​​structuur te vormen, eenvoudigweg 30 nm-vezel genoemd. Dit zorgt voor een 100-voudige verdichting van DNA. De 30 nm-vezel vormt dan plectonemische plooien, lussen genoemd.

    Zes van dergelijke lussen worden begrensd door steigerbevestiging aan eiwitten (histon-H1/topoisomerase-II) om aanleiding te geven tot een cluster van lussen genaamd rozet. 30 van dergelijke rozetten bundelen samen om een ​​enkele spoel te vormen, 10 van dergelijke spoelen (zoals een telefoonsnoer) vormen een chromatide en de twee chromatiden zijn met elkaar verbonden door een zeer repetitieve basensequentie die rijk is aan AT-basenparen, satelliet-DNA genoemd, het centromeer. Twee chromatiden met een centromeer vormen een chromosoom.

    Fysieke eigenschappen van DNA:

    (a) Denaturatie:

    Wanneer DNA wordt blootgesteld aan extreme pH-waarden of temperaturen boven 80 tot 90 graden Celsius, wordt het gedenatureerd en wordt de dubbele helixstructuur ontvouwd als gevolg van verstoring van waterstofbindingen tussen de basen en de hydrofobe interacties van de basen. Ten slotte scheiden de twee strengen volledig van elkaar. Dit is het smelten van DNA. De temperatuur waarbij een bepaald DNA wordt gedenatureerd tot ongeveer 50% staat bekend als Tm.

    Verschillende DNA smelt bij verschillende temperaturen, wat afhangt van het G C gehalte van dat DNA. Hoe hoger het G ≡ C-gehalte, hoe hoger de smelttemperatuur (Tm) en vice versa. Wanneer de temperatuur of pH langzaam terug naar het normale biologische bereik wordt gebracht, zullen de twee strengen automatisch terugspoelen of uitgloeien en opnieuw dezelfde dubbele helixstructuur vormen. Als de temperatuur plotseling afkoelt, blijven de twee strengen gescheiden en bestaan ​​ze als enkele strengen.

    (b) Drijfvermogen:

    Wanneer DNA met hoge snelheden wordt gecentrifugeerd in een geconcentreerde oplossing van cesiumchloride-(CsCI), zal de CsCl een dichtheidsgradiënt vormen (oplopend) en zal het DNA stationair of drijvend blijven op een punt in de buis waar de dichtheid gelijk is aan de dichtheid van CsCI op dat punt. Verschillend DNA zal verschillende dichtheden hebben, die weer afhangen van het GsC-gehalte van dat DNA. Hoe hoger het G = C-gehalte, hoe hoger de drijvende dichtheid van dat DNA en vice versa.

    Meting van deze twee karakters, namelijk smelttemperatuur en drijvende dichtheid, stelt ons in staat om de verhoudingen van G ≡ C en A = T-paren in dat DNA te berekenen, wat indirect helpt bij het afleiden van de gensequentie.


    DNA: typen, structuur en functie van DNA

    Nucleïnezuren werden voor het eerst geïsoleerd door Friedrich Miescher (1869) uit puscellen.

    Ze werden nucleïne genoemd. Hertwig (1884) stelde voor dat nucleïne de drager is van erfelijke eigenschappen. Vanwege hun zure aard werden ze nucleïnezuren en vervolgens nucleïnezuren genoemd (Altmann, 1899).

    Fisher (1880s) ontdekte de aanwezigheid van purine- en pyrimidinebasen in nucleïnezuren. Levene (1910) ontdekte dat deoxyribose-nucleïnezuur zowel fosforzuur als deoxyribosesuiker bevat.

    Hij karakteriseerde vier soorten nucleotiden die aanwezig zijn in DNA. In 1950 ontdekte Chargaff dat het purine- en pyrimidinegehalte van DNA gelijk was. Tegen die tijd had W.T. Astbury door middel van röntgendiffractie ontdekt dat DNA een polynucleotide is met nucleotiden die loodrecht op de lange as van het molecuul staan ​​en van elkaar gescheiden zijn door een afstand van 0,34 nm.

    In 1953 kregen Wilkins en Franklin zeer fraaie röntgenfoto's van DNA. De foto's toonden aan dat DNA een helix was met een breedte van 2,0 nm. Eén draai van de helix was 3,4 nm met 10 lagen basen erin gestapeld. Watson en Crick (1953) werkten het eerste correcte dubbele helixmodel uit op basis van de röntgenfoto's van Wilkins en Franklin. Wilkins, Watson en Crick kregen daarvoor in 1962 de Nobelprijs.

    Watson en Crick (1953) bouwden een 3D, moleculair DNA-model dat aan alle details van röntgenfoto's voldeed. Ze stelden voor dat DNA bestond uit een dubbele helix met twee ketens met suikerfosfaat aan de buitenkant en stikstofbasen aan de binnenkant.

    De stikstofbasen van de twee ketens vormden complementaire paren met purine van de ene en pyrimidine van de andere die bij elkaar werden gehouden door waterstofbruggen (A-T, C-G). Complementaire basenparing tussen de twee polynucleotideketens wordt beschouwd als kenmerkend voor hun voorstel. Het is natuurlijk gebaseerd op de vroege bevinding van Chargaff dat A = T en С = G. Hun tweede grote voorstel was dat de twee ketens antiparallel zijn met 5’→ 3′ oriëntatie van de ene en У → 5’oriëntatie van de andere.

    De twee kettingen zijn spiraalvormig gedraaid, net als een touwladder met stijve treden die in een spiraal zijn gedraaid. Elke draai van de spiraal bevat 10 nucleotiden. Dit dubbele helix- of duplexmodel van DNA met antiparallelle polynucleotideketens met complementaire basen heeft een impliciet mechanisme van replicatie en kopiëren.

    Hier functioneren beide polynucleotideketens als matrijzen die twee dubbele helices vormen, elk met één ouderketen en één nieuwe maar complementaire streng. Het fenomeen wordt semi-conservatieve replicatie genoemd. In vitro synthese van DNA is uitgevoerd door Kornberg in 1959.

    Soorten DNA:

    Het door Watson en Crick voorgestelde DNA-duplexmodel is een rechtshandige spiraal en wordt B-DNA (gebalanceerd DNA) genoemd. In het model liggen de basenparen bijna loodrecht op de as van de helix (Fig. 6.5 D). Een ander rechtshandig duplexmodel is A-DNA (Alternatief DNA). Hier heeft een enkele draai van de helix 11 basenparen.

    De basenparen liggen op 20° afstand van loodrecht op de as. C-DNA heeft 9 basenparen per spiraalwinding, terwijl in D-DNA het aantal slechts 8 basenparen is. Beide zijn rechtshandig.Z-DNA (Zigzag-DNA) is een linkshandige dubbele helix met zigzagruggengraat, afwisselende purine- en pyrimidinebasen, een enkele winding van 45 A lengte met 12 basenparen en een enkele groef.

    B-DNA is meer gehydrateerd en wordt het vaakst aangetroffen in levende cellen. Het is een fysiologisch en biologisch actieve vorm. Het kan echter in andere vormen veranderen. Van rechtshandig DNA is bekend dat het tijdelijk in de linkshandige vorm verandert, althans voor een korte afstand. Dergelijke veranderingen kunnen veranderingen in genexpressie veroorzaken.

    Circulaire en Lineair DNA:

    In veel prokaryoten zijn de twee uiteinden van een DNA-duplex covalent gekoppeld om circulair DNA te vormen. Circulair DNA is naakt, dat wil zeggen zonder associatie met histon-eiwitten, hoewel polyaminen wel voorkomen. In lineair DNA zijn de twee uiteinden vrij. Het wordt gevonden in eukaryote kernen waar het wordt geassocieerd met histon-eiwitten.

    Lineair DNA, zonder associatie met histon-eiwitten, komt ook voor in sommige prokaryoten, bijv. Mycoplasma. In semi-autonome celorganellen (mitochondria, plastiden) is DNA circulair, minder vaak lineair. Het is altijd naakt.

    De regels van Chargaff:

    Chargaff (1950) deed waarnemingen aan de basen en andere componenten van DNA. Deze observaties of generalisaties worden de basisequivalentieregel van Chargaff genoemd.

    (i) Purine- en pyrimidine-basenparen zijn in gelijke hoeveelheid, dat wil zeggen, adenine + guanine = thymine + cytosine. [A + G] = [T + C], d.w.z. [A+G] / [T+C] = 1

    (ii) De molaire hoeveelheid adenine is altijd gelijk aan de molaire hoeveelheid thymine. Evenzo wordt de molaire concentratie van guanine geëvenaard door de molaire concentratie van cytosine.

    [A] = [T], d.w.z. [A] / [T] = 1 [G] = [C], d.w.z. [G] / [C] = 1

    (iii) Suikerdeoxyribose en fosfaat komen in equimolaire verhoudingen voor.

    (iv) A-T-basenparen zijn zelden gelijk aan С-G-basenparen.

    (v) De verhouding van [A+T] / [G+C] is variabel maar constant voor een soort (Tabel 6.2). Het kan worden gebruikt om de bron van DNA te identificeren. De verhouding is laag in primitieve organismen en hoger in geavanceerde.

    Tabel 6.2. Basissamenstelling van DNA uit verschillende bronnen:

    Soort EEN G С t A+T/C+G
    1. Man 30.4 19.0 19.9 30.1 1.55
    2. Kalf 29.0 21.2 21.2 28.5 1.35
    3. Tarwekiemen 28.1 21.8 22.7 27.4 1.25
    4. Erwt 30.8 19.2 18.5 30.5 1.62
    5. Euglena 22.6 27.7 25.8 24.4 0.88
    6 Escherichia coli 24.7 26.0 25.7 23.6 0.93

    Structuur van DNA:

    DNA of deoxyribonucleïnezuur is een spiraalvormig gedraaid polydeoxyribonucleotide-macromolecuul met dubbele keten dat het genetische materiaal vormt van alle organismen, met uitzondering van rhinovirussen. In prokaryoten komt het voor in nucleoïde en plasmiden. Dit DNA is meestal circulair. In eukaryoten wordt het meeste DNA gevonden in chromatine van de kern.

    Het is lineair. Kleinere hoeveelheden circulair, dubbelstrengs DNA worden gevonden in mitochondriën en plastiden (organel-DNA). Kleine DNA's komen voor in virussen, ф x 174 bacteriofaag heeft 5386 nucleotiden. Bacteriofaag lambda (Faag X) bezit 48502 basenparen (bp), terwijl het aantal basenparen in Escherichia coli 4,6 x 106 is. Een enkel genoom (haploïde set van 23 chromosomen) heeft ongeveer 3,3 x 109 bp bij mensen. Enkelstrengs DNA komt voor als genetisch materiaal in sommige virussen (bijv. faag ф x 174, coliphage fd, M13). DNA is het grootste macromolecuul met een diameter van 2 nm (20Å of 2 x 10 -9 m) en vaak 3 millimeter lang.

    Het is negatief geladen vanwege fosfaatgroepen. Het is een polymeer met lange keten van in het algemeen enkele honderdduizenden deoxyribonucleotiden. Een DNA-molecuul heeft twee onvertakte complementaire strengen. Ze zijn spiraalvormig opgerold. De twee spiraalstrengen van DNA worden gezamenlijk DNA-duplex genoemd (Fig. 6.5).

    De twee strengen zijn niet op elkaar gewikkeld, maar de hele dubbele streng (DNA-duplex) is op zichzelf gewikkeld rond een gemeenschappelijke as als een touwtrap met stevige treden die in een spiraal zijn gedraaid. Door spiraalverdraaiing krijgt de DNA-duplex twee soorten afwisselende groeven, majeur (22 ) en mineur (12 Å).

    In B-DNA heeft één winding van de spiraal ongeveer 10 nucleotiden op elke DNA-streng. Het beslaat een afstand van ongeveer 3,4 nm (34 of 3,4'21510 -9 m), zodat aangrenzende nucleotiden of hun basen worden gescheiden door een ruimte van ongeveer 0,34 nm (0,34'21510 -9 m of 3,4 ).

    Een deoxyribonucleotide van DNA wordt gevormd door verknoping van drie chemicaliën orthofosforzuur (H3PO4), deoxyribosesuiker (C5H10O4) en een stikstofbase. In DNA komen vier soorten stikstofbasen voor. Ze behoren tot twee groepen, purines (9-ledige dubbele ringen met stikstof op 1,3,7 en 9 posities) en pyrimidinen (zesledige ringen met stikstof op 1 en 3 posities). DNA heeft twee soorten purines (adenine of A en guanine of G) en twee soorten pyrimidinen (cytosine of С en thymine of T).

    Afhankelijk van het type stikstofbase heeft DNA vier soorten deoxyribonucleotiden: deoxyadenosine-5-monofosfaat (dAMP), deoxyguaninosine-5-monofosfaat (dGMP), deoxythymidine-5-monofosfaat (dTMP) en deoxy-cytidine-5-monofosfaat. (dCMP).

    De ruggengraat van een DNA-keten of -streng is opgebouwd uit afwisselende deoxyribosesuiker- en fosforzuurgroepen. De fosfaatgroep is verbonden met koolstof 5'8242 van het suikerresidu van zijn eigen nucleotide en koolstof У van het suikerresidu van het volgende nucleotide door (3'8216-5'8217) fosfodiesterbindingen. -H van fosfaat en -OH van suiker worden geëlimineerd als H20 tijdens elke estervorming.

    Fosfaatgroep geeft zuurgraad aan de nucleïnezuren omdat ten minste één van zijn zijgroepen vrij is om te dissociëren. Stikstofbasen staan ​​haaks op de lengteas van DNA-ketens. Ze zijn verbonden met koolstofatoom 1 van de suikers door N-glycosidebindingen. Pyrimidine (C of T) is aan deoxyribose gehecht door zijn N-atoom op positie 1 terwijl een purine (A of G) dit doet door N-atoom op positie 9.

    De twee DNA-ketens zijn antiparallel, dat wil zeggen, ze lopen parallel maar in tegengestelde richtingen. In de ene ketting is de richting 5’→ У terwijl in de tegenovergestelde het is 3′ →5′ (Fig. 6.5). De twee ketens worden bij elkaar gehouden door waterstofbruggen tussen hun basen. Adenine (A), een purine van de ene keten, ligt precies tegenover thymine (T), een pyramidine van de andere keten. Evenzo ligt cytosine (C, een pyrimidine) tegenover guanine (G een purine). Dit maakt een soort slot- en sleutelarrangement mogelijk tussen grote purine en kleine pyrimidine.

    Het wordt versterkt door het verschijnen van waterstofbruggen tussen de twee. Tussen cytosine en guanine (C = G) treden drie waterstofbruggen op op de posities 1’-1’, 2’8242-6’8242 en 6’8242-2’8242. Er zijn twee van dergelijke waterstofbruggen tussen adenine en thymine (A=T) die worden gevormd op de posities 1'-3'8242 en 6'8242-4'8242. Waterstofbindingen ontstaan ​​tussen waterstof van de ene base en zuurstof of stikstof van de andere base. Aangezien er specifieke en verschillende stikstofbasen voorkomen op de twee DNA-ketens, zijn de laatste complementair.

    Dus de sequentie van bijvoorbeeld AAGCTCAG van één keten zou een complementaire sequentie van TTCGAGTC op de andere keten hebben. Met andere woorden, de twee DNA-ketens zijn niet identiek, maar complementair aan elkaar. Het is vanwege een specifieke basenparing met een purine die tegenover een pyrimidine ligt. Dit maakt de twee ketens 2 nm dik.

    Een purine-purine basenpaar maakt het dikker, terwijl een pyrimidine-pyrimidine basenpaar het smaller maakt dan 2 nm. Verder zijn A en С of G en T niet paren omdat ze er niet in slagen om waterstofbruggen ertussen te vormen. 5′ uiteinde van elke keten draagt ​​een fosfaatradicaal terwijl het 3'8242 uiteinde een suikerresidu heeft (З’-ОН).

    Opvallende kenmerken van В-model van DNA van Watson en Crick:

    1. DNA is het grootste biomolecuul in de cel.

    2. DNA is negatief geladen en rechtsdraaiend.

    3. Moleculaire configuratie van DNA is 3D.

    4. DNA heeft twee polynucleotideketens.

    5. De twee DNA-ketens hebben een antiparallelle polariteit, 5'8242 —> 3'8242 in de ene en 3'8242 —> 5'8242 in de andere.

    6. De ruggengraat van elke polynucleotideketen is gemaakt van afwisselende suikerfosfaatgroepen. De stikstofbasen projecteren naar binnen.

    7. Stikstofbasen van twee polynucleotideketens vormen complementaire paren, A tegenover T en С tegenover G.

    8. Een grote purine staat altijd tegenover een kleine pyrimidine. Dit genereert een uniforme afstand tussen twee strengen helix.

    9. Adenine (A) van één polynucleotideketen wordt door twee waterstofbruggen aan thymine (T) van de tegenoverliggende keten gehouden. Cytosine (C) van de ene keten wordt op dezelfde manier vastgehouden aan guanine van de andere keten door drie waterstofbruggen.

    10. De dubbele ketting is spiraalvormig opgerold. De coiling is rechtshandig. Deze wikkeling produceert afwisselend kleine en grote groeven.

    11. De spoed van de helix is ​​3,4 nm (34 A) met ongeveer 10 basenparen in elke winding. De gemiddelde afstand tussen twee aangrenzende basenparen bedraagt ​​ongeveer 0,34 nm (0,34 x 10 -9 m of 3,4 A).

    12. Vlakken van aangrenzende basenparen worden op elkaar gestapeld. Samen met waterstofbinding verleent de stapeling stabiliteit aan de spiraalvormige structuur.

    13. DNA is zuur. Voor zijn verdichting heeft het basiseiwitten (histon) nodig. De histon-eiwitten zijn sterk geladen en bezetten de belangrijkste groeven van het DNA onder een hoek van 30° met de helix-as.

    Sense en Antisense strengen:

    Beide DNA-strengen nemen niet deel aan het beheersen van erfelijkheid en metabolisme. Slechts één van hen doet dat. De DNA-streng die fungeert als matrijs voor RNA-synthese staat bekend als matrijsstreng, minus (-) streng of antisense streng.

    De complementaire streng wordt non-template streng genoemd, plus (+) streng, sense en coderende streng. De laatste naam wordt gegeven omdat volgens afspraak de genetische code van DNA wordt geschreven volgens de volgorde ervan.

    DNA Non-template, Sense (+) of coderingsstreng

    DNA-sjabloon, antisense of niet-coderende of (-) streng

    RNA wordt getranscribeerd op 3'8217→5'8242 (-) streng (sjabloon/antistreng) van DNA in 5 → 3 richting.

    De term antisense wordt ook in bredere zin gebruikt voor elke sequentie of streng van DNA (of RNA) die complementair is aan mRNA.

    Denaturatie en renaturatie:

    De H-bindingen tussen stikstofbasen van twee DNA-strengen kunnen breken door hoge temperatuur (82-90°C) of lage of hoge pH, zodat de twee strengen van elkaar scheiden. Het wordt denaturatie of smelten genoemd. Aangezien A-T-basenpaar slechts 2H-bindingen heeft, kan het gebied dat rijk is aan A-T-basenparen gemakkelijk denatureren (smelten). Deze gebieden worden laagsmeltende gebieden genoemd omdat ze bij relatief lage temperatuur denatureren. Het gebied dat rijk is aan G-C-basenparen (het zogenaamde hoogsmeltende gebied) is relatief stabieler en dichter omdat drie waterstofbruggen de G-C-basen verbinden.

    Deze gebieden hebben een hoge smelttemperatuur (Tm). Bij het smelten neemt de viscositeit van DNA af. Het gedenatureerde DNA heeft de neiging om opnieuw te associëren, d.w.z. de DNA-strengen die gescheiden zijn door smelten bij 82-90°C kunnen opnieuw associëren en duplex vormen bij afkoelen tot temperatuur bij 65°C. Het wordt renaturatie of annealing genoemd.

    Gedenatureerde of gescheiden DNA-strengen absorberen meer lichtenergie dan de intacte dubbele DNA-streng. De verhoogde absorptie van lichtenergie door gescheiden of gedenatureerde DNA-strengen wordt hyperchromatisch effect genoemd. Het effect wordt gebruikt om te weten of DNA enkel- of dubbelstrengs is.

    DNA-duplex bezit gebieden waar de sequentie van nucleotiden hetzelfde is, maar tegengesteld in de twee strengen. Deze sequenties worden herkend door restrictie-endonucleasen en worden gebruikt bij genetische manipulatie. Gegeven onderstaande sequentie van basen in één streng (3'8242 → 5'8242) is GAATTC. Het is hetzelfde in de andere streng wanneer gelezen in de richting 5'8242 → 3'8242. Het is vergelijkbaar met palindroomwoorden met dezelfde woorden in zowel voorwaartse als achterwaartse richting, bijvoorbeeld NITIN, MALAYALAM.

    Het is het DNA met meerdere kopieën van identieke sequenties van stikstofbasen. Het aantal kopieën van dezelfde basensequentie varieert van enkele tot miljoenen. DNA met een enkele kopie van basensequenties wordt uniek DNA genoemd. Het is gemaakt van functionele genen. rRNA-genen worden echter meerdere keren herhaald. Repetitief DNA kan in tandem voorkomen of worden afgewisseld met unieke sequenties.

    Het is van twee soorten, zeer repetitief en matig repetitief. Zeer repetitief DNA bestaat uit korte sequenties van minder dan 10 basenparen die miljoenen keren worden herhaald. Ze komen voor in pre-entromere regio's, heterochromatische regio's van Y-chromosomen en satellietregio's. Matig repetitief dna bestaat uit een paar honderd basenparen die minstens 1000 keer worden herhaald. Het komt voor in telomeren, centromeren en transposons.

    Tandem herhaalde sequenties zijn bijzonder vatbaar voor verkeerde uitlijning tijdens chromosoomparing, en dus heeft de grootte van tandemclusters de neiging om zeer polymorf te zijn, met grote variaties tussen individuen. Kleinere clusters van dergelijke sequenties kunnen worden gebruikt om individuele genomen te karakteriseren in de techniek van "DNA-finger-printing".

    Het is dat deel van repetitief DNA dat lange repetitieve nucleotidesequenties in tandem heeft dat een afzonderlijke fractie vormt bij ultracentrifugatie met dichtheid. Afhankelijk van het aantal basenparen dat betrokken is bij herhalingsgebieden, bestaat satelliet-DNA uit twee typen, microsatellietsequenties (1-6 bp herhalingseenheden geflankeerd door geconserveerde sequenties) en minisatellietsequenties (11-60 bp geflankeerd door geconserveerde restrictieplaatsen). Deze laatste zijn hypervariabel en specifiek voor elk individu. Ze worden gebruikt voor DNA-matching of vingerafdrukken, zoals voor het eerst werd ontdekt door Jeffreys et al (1985).

    De rangschikking van stikstofbasen van DNA (en het product mRNA) bepaalt de volgorde van aminozuurgroepen in polypeptiden of eiwitten gevormd over ribosomen. Eén aminozuur wordt gespecificeerd door de sequentie van drie aangrenzende stikstofbasen. Dit laatste wordt codon genoemd. Het DNA-segment dat de synthese van het volledige polypeptide bepaalt, staat bekend als cistron.

    Bij prokaryoten heeft een cistron een continue coderende sequentie van begin tot eind. In eukaryoten bevat een cistron niet-coderende gebieden die geen deel van het genproduct produceren. Ze worden intronen genoemd. Introns zijn vaak variabel. De coderende delen staan ​​bekend als exons. Cistrons met introns worden gesplitste genen genoemd.

    Coderend en niet-coderend DNA:

    Afhankelijk van het vermogen om functionele of niet-functionele producten te vormen, heeft DNA twee soorten segmenten, coderend en niet-coderend. Bij eukaryoten is een groter deel van het DNA niet-coderend omdat het geen functioneel product vormt. Ze bezitten vaak herhaalde sequenties of repetitief DNA. De meeste van hen hebben vaste posities.

    Sommigen kunnen van de ene plaats naar de andere gaan. De mobiele sequenties worden springgenen of transposons genoemd. Bij prokaryoten is de hoeveelheid niet-coderend of niet-functioneel DNA klein. Coderend DNA bestaat uit coderende DNA-sequenties. Dit zijn twee soorten: eiwitcoderende sequenties die coderen voor alle eiwitten behalve histon en niet-eiwitcoderende sequenties voor tRNA, rRNA en histonen.

    Functies van DNA:

    1. Genetische informatie (genetische blauwdruk):

    DNA is het genetische materiaal dat alle erfelijke informatie bevat. De genetische informatie is gecodeerd in de rangschikking van de stikstofbasen.

    DNA heeft de unieke eigenschap van replicatie of productie van carbonkopieën (autokatalytische functie). Dit is essentieel voor de overdracht van genetische informatie van de ene cel naar de dochters en van de ene generatie naar de volgende.

    DNA komt voor in chromosomen. Dit is essentieel voor een billijke verdeling van DNA tijdens celdeling.

    Tijdens meiose geeft kruising aanleiding tot een nieuwe combinatie van genen die recombinaties worden genoemd.

    Veranderingen in de volgorde van stikstofbasen door toevoeging, deletie of verkeerde replicatie geven aanleiding tot mutaties. Mutaties zijn de bron van alle variaties en evolutie.

    DNA geeft aanleiding tot RNA's door het proces van transcriptie. Het is heterokatalytische activiteit van DNA.

    7. Cellulair metabolisme:

    Het regelt de metabolische reacties van de cellen met behulp van specifieke RNA's, synthese van specifieke eiwitten, enzymen en hormonen.

    Door differentieel functioneren van sommige specifieke DNA-gebieden of genen, worden verschillende delen van de organismen gedifferentieerd in vorm, grootte en functies.

    DNA regelt de ontwikkeling van een organisme door de werking van een interne genetische klok, al dan niet met behulp van extrinsieke informatie.

    10. DNA-vingerafdrukken:

    Hypervariabele microsatelliet-DNA-sequenties van elk individu zijn verschillend. Ze worden gebruikt bij het identificeren van individuen en het ontcijferen van hun relaties. Het mechanisme wordt DNA-vingerafdrukken genoemd.

    Defecte erfelijkheid kan worden verholpen door de juiste genen op te nemen in plaats van defecte genen.

    Overmatige beschikbaarheid van anti-mRNA of antisense RNA's zal niet toestaan ​​dat de pathogene genen zich uiten. Door deze techniek is het falen van dotteren gecontroleerd. Een modificatie van deze techniek is RNA-interferentie (RNAi).


    Bekijk de video: Apa itu DNA I Mengenal material genetik yang disebut DNA (December 2021).