Informatie

18: Transcriptieregulatie na initiatie - Biologie


Hoewel regulatie van de initiatie van transcriptie een dominante factor lijkt te zijn bij het beheersen van expressie van veel genen, wordt het belang van regulatie na initiatie steeds beter begrepen in een toenemend aantal en verscheidenheid aan systemen. De klassieke systemen waarin deze problemen zijn onderzocht, zijn antiterminatie in bacteriofaag l en in verzwakking van transcriptie in bacteriële biosynthetische operons, in het bijzonder de trp operon in E coli. Hoewel sommige mechanistische details eigen kunnen zijn aan bacteriën, met name de behoefte aan gekoppelde transcriptie en translatie in de trpverzwakkingssysteem, wordt het fenomeen van regulatie na initiatie gezien in een grote verscheidenheid aan organismen, variërend van bacteriën tot mensen. Een deel van dit werk is besproken in de secties over verlenging van transcriptie in hoofdstuk II van deel drie.

Invoering

Beide systemen die in dit hoofdstuk worden besproken, regelen de frequentie van beëindiging van transcriptie. Antiterminatie in bacteriofaag I kan voorkomen dat RNA-polymerase stopt bij r-afhankelijke terminators, wat leidt tot transcriptie van stroomafwaartse genen. Verzwakking in het trp-operon regelt ook de frequentie waarmee RNA-polymerase stopt bij een vroege terminator in het operon, waardoor de transcriptie van stroomafwaartse genen wordt gereguleerd. In tegenstelling tot het systeem in l, reguleert verzwakking in trp de beëindiging op een r-onafhankelijke terminator.

Antiterminatie in bacteriofaag l

Om snel een van de punten in hoofdstuk III te bespreken: antitermination vindt plaats op twee verschillende tijdstippen in de levenscyclus. Het N-eiwit maakt read-through-transcriptie mogelijk in de verschuiving van onmiddellijk-vroege naar vroege transcriptie, en het Q-eiwit maakt read-through-transcriptie van de late genen mogelijk.

Afbeelding 4.4.1

Bedenk uit deel drie van de tekst dat r-afhankelijke terminators geen goed geconserveerde sequentie of secundaire structuur hebben. Ook volgt het eiwit r langs eiwitvrije gebieden van het RNA totdat het een gepauzeerd transcriptiecomplex op een r-afhankelijke plaats raakt, op welk punt de RNA-helicase-activiteit beëindiging en dissociatie van het polymerase en transcript van het sjabloon-DNA kan veroorzaken.

Figuur 4.4.2. Actie van eiwit op terminators van transcriptie

Sites op het DNA die nodig zijn voor antitermination in bacteriofaag l. nootplaatsen (N utilisatieplaatsen) voor pN, qutsite voor pQ en de nootsites bevinden zich binnen de transcriptie-eenheid, niet bij de promotor en niet bij de terminator.

  • nootLis in het 5' onvertaalde gebied van de Ngen, en nootRis in het 3' onvertaalde gebied van de crogen.
  • In beide gevallen is de nootplaats gaat vooraf aan de terminator waarop pN zal werken.

Figuur 4.4.3. notensites bevinden zich binnen transcriptie-eenheden

Beide nootLen nootR zijn sequenties van 17 bp met een dyade-symmetrie.

5' AGCCCTGAARAAGGGCA

TCGGGACTTYTTCCCGT5'

Het eiwit pN herkent de nootplaats en bindt aan RNA-polymerase terwijl het door de plaats transcribeert. Het complex van pN met de RNA-polymerasen is zeer processief en overschrijft de inspanningen van r bij de terminator.

E coli (gast)eiwitten die nodig zijn voor de werking van pN. Deze werden geïsoleerd als gastheerfuncties die bij mutatie de werking van pN verhinderden. NusA (gecodeerd door nusA, voor N jijbetegeling sstof, complementatiegroep A) is het best gekarakteriseerd.

  1. Kan deel uitmaken van het transcriptiecomplex
  2. Er is voorgesteld om te binden aan het kern-RNA-polymerase nadat het is gedissocieerd.
  3. Kan ook pN binden.
  4. Model:

NusA bindt het kernpolymerase nadat het is gedissocieerd. Aangezien dit complex transcribeert via a nootplaats bindt pN ook. Het complexe a2bb'-NusA-pN voorkomt r-afhankelijke beëindiging bij tR1, tR2, en tL1.

Figuur 4.4.4.

verschillende andere nusgenen zijn geïdentificeerd. NusG is de bacteriële homoloog van een familie van geconserveerde eiwitten die betrokken zijn bij verlenging. Het is homoloog aan de grote subeenheid van DSIF, wat een verlengingsfactor is bij zoogdieren. DSIF is de DRB-gevoeligheidsinducerende factor. Huidige studies impliceren het in zowel negatieve als positieve effecten op verlenging. Het heeft twee subeenheden, een van 160 kDa die homoloog is aan het gisttranscriptieregulerende eiwit Spt5, en een van 14 kDa die homoloog is aan het gist-Spt4-eiwit. Een ander nusgen codeert voor een ribosomaal eiwit. Er moet nog veel meer worden geleerd over zowel beëindiging als antitermination. De nusfenotype van mutaties in een gen dat codeert voor een ribosomaal eiwit suggereert dat translatie ook aan dit proces is gekoppeld.

Onderdelen van de E. coli trp operon

De trpoperon codeert voor de enzymen die nodig zijn voor biosynthese van tryptofaan. Meer specifiek, de vijf genen (trpEDCBA) coderen voor vijf subeenheden van eiwitten die in totaal vijf enzymatische stappen katalyseren, chorisminezuur omzetten in tryptofaan. Er is echter geen 1:1 overeenkomst tussen een cistron en een enzym. Bijvoorbeeld, trpBen trpAcoderen respectievelijk voor de b- en a-subeenheden van tryptofaansynthase, dat de vervanging van glycerol-3-fosfaat van indool-3-glycerolfosfaat door serine katalyseert om tryptofaan te vormen, met glyceraldehyde-3-fosfaat als het andere product

Figuur 4.4.5.

EEN leider sequentie scheidt de promotor en operator van het eerste structurele gen van het operon, trpE. Een verzwakker van transcriptie volgt de leider. Zoals we hieronder in meer detail zullen zien, wordt de efficiëntie van "voortijdige" beëindiging bij deze verzwakker bepaald door de mate van translatie van de leider, die op zijn beurt wordt bepaald door de beschikbaarheid van Trp-tRNAtrp. Dit is een belangrijk onderdeel van de regulatie van het operon. Twee terminators van transcriptie volgen de structurele genen, één afhankelijk van r en één onafhankelijk van r.

Regelingsmodi: zet operon uit in aanwezigheid van Trp

Repressor-operator: vereist een eiwitbinding aan een specifieke plaats in aanwezigheid van Trp om de efficiëntie van de initiatie van transcriptie te verminderen. demping: de verlenging (en beëindiging) van transcriptie door RNA-polymerase is gekoppeld aan de voortgang van translatie door een ribosoom. In aanwezigheid van Trp zorgt de translatie door het ribosoom ervoor dat de transcriptie van de volgende genen in het operon stopt.

Repressor: apo-repressor en co-repressor (Trp)

De apo-repressor is gecodeerd door trpRop een verre plaats. De apo-repressor is een homo-tetrameer. Het heeft alleen een hoge affiniteit voor de operator als het gebonden is aan de aminozuur Trp, dat dient als een co-repressor. De actieve repressor is dus een tetrameer van (voorheen apo-) repressor in complex met Trp. De actieve repressor bindt aan de operator om de start van transcriptie te voorkomen. De operator overlapt de promotor, inclusief het -10-gebied van de promotor. Het heeft een dyade-symmetrieas.

Figuur 4.4.6.

Demping

De verzwakker is een voorwaardelijke transcriptionele terminator die wordt gebruikt om de expressie van biosynthetische operons in bacteriën te reguleren. Het is stroomopwaarts van de structurele genen trpEDCBA en is een r-onafhankelijke eindsite. Zijn vermogen om transcriptie te beëindigen is afhankelijk van zijn vermogen om de stam van duplex-RNA te vormen die kenmerkend is voor r-onafhankelijke terminatieplaatsen.

Afbeelding 4.4.7

De fractie transcripten die door de verzwakker wordt gelezen, wordt bepaald door de [Trp-tRNAtrp]. De concentratie van geladen tRNA's is een maat voor de hoeveelheid Trp die beschikbaar is voor eiwitsynthese. Als het meeste tRNAtrp is geladen, is er een overvloed aan Trp en hoeft de cel niet meer aan te maken. Laag [Trp-tRNAtrp] maakt read-through transcriptie door de verzwakker mogelijk, zodat: trpEDCBA wordt tot expressie gebracht en hoge [Trp-tRNAtrp] veroorzaakt beëindiging van transcriptie bij de verzwakker.

De [Trp-tRNAtrp] bepaalt de voortgang van ribosomen terwijl ze een kort leiderpeptide vertalen. Het leiderpeptide is een korte polypeptide van 14 aminozuren die wordt gecodeerd door trpL. Twee codons voor Trp bevinden zich in de leader en de voortgang van ribosomen voorbij deze Trp-codons zal worden bepaald door de beschikbaarheid van Trp-tRNAtrp. Wanneer de concentratie tryptofanyl-tRNA hoog is, wordt de translatie van de trpleider zal worden voltooid, maar wanneer deze laag is, zal de vertaling stoppen bij de tryptofaancodons.

De mate van voortgang van de ribosomen bepaalt de secundaire structuren die in het leider-RNA worden gevormd. Wanneer de [Trp-tRNAtrp] hoog is, vertalen de ribosomen langs de Trp-codons om de syntheseleider van het peptide te voltooien. Hierdoor kan het ontluikende RNA de structuur vormen voor r-onafhankelijke terminator. Dus transcriptie eindigt voordat de RNA-polymerase bereikt trpEDCBA. Wanneer de [Trp-tRNAtrp] laag is, blokkeren de ribosomen bij de Trp-codons, wat de vorming van de secundaire structuren in het RNA voorkomt die nodig zijn voor terminatie bij de verzwakker. Dus read-through transcriptie gaat door tot trpEDCBAen het operon wordt uitgedrukt, zodat er meer Trp wordt gemaakt.

Tabel 4.4.1: De basiscomponenten van de regulatie bij de verzwakker van het E. coli trpoperon zijn hieronder weergegeven.
[trp-tRNA]vertaling van trpLsecundaire structuren gevormd in RNAverzwakkeroperon
Hoogcompleet3-4 stengelstranscriptie beëindigenUIT
Laagkraampjes bij Trp-codons2-3 stengeltranscriptie doorlezen toestaanAAN

Alternatieve base-gepaarde structuren in leider-RNA. Vier regio's van het leider-RNA kunnen betrokken zijn bij de vorming van secundaire structuren, in het bijzonder basengepaarde stengels; deze worden eenvoudigweg regio's 1, 2, 3 en 4 genoemd. Mogelijk kan 1 paren met 2, 2 kan paren met 3 en 3 kan paren met 4.

Afbeelding 4.4.8

Een stam gevormd door paring tussen 3 en 4 maakt een G+C rijke stam gevolgd door U's, wat voldoende is voor r-onafhankelijke beëindiging van transcriptie. Wanneer de [Trp-tRNAtrp] hoog is, wordt de structuur met 3-4 basenparen gevormd en eindigt de transcriptie bij de verzwakker. Dit zet de operon UIT. De vorming van een stam met basenparen tussen de regio's 2 en 3 sluit de vorming van de 3-4 terminator uit en de transcriptie zal doorgaan in de structurele genen trpEDCBA. Dit zet de operon AAN.

Afbeelding 4.4.9

De keuze tussen een 2-3-stam of een 3-4-stam wordt bepaald door de voortgang van het ribosoom. Als het ribosoom voorbij de Trp-codons kan transleren (wanneer de [Trp-tRNAtrp] hoog is), zal het een natuurlijk translatieterminatiecodon bereiken. Wanneer het ribosoom zich in die positie bevindt, wordt regio 2 van het leider-RNA bedekt door het ribosoom, dus de 2-3-stam kan zich niet vormen, maar de 3-4-stam wel. Dit genereert de secundaire structuur die nodig is voor beëindiging van transcriptie bij de verzwakker. Als het ribosoom daarentegen vastloopt op de Trp-codons in de leider, omdat de [Trp-tRNAtrp] laag is, wordt regio 2 van het leider-RNA niet bedekt door het ribosoom. Het kan dan basenparen met regio 3. Dit voorkomt de vorming van de 3-4 terminator, en RNA-polymerase kan de verlenging doorzetten tot trpEDCBA.

Mutatieanalyse (geselecteerde voorbeelden)

  • Vertaling van trpLis nodig voor regulering door demping. Mutatie van de AUG voor initiatie van translatie van het leider-RNA voorkomt transcriptie voorbij de verzwakker. Bij afwezigheid van translatie kunnen zowel de 1-2 als de 3-4 stelen zich vormen. De laatste 3-4 stam is de terminator.
  • Geladen tRNAtrp is vereist voor regulering. Mutatie van de genen voor tRNAtrp of Trp-tRNAtrp synthetase leidt tot constitutieve expressie van trpEDCBA. In deze mutanten zal de translatie bij Trp-codons tot stilstand komen, ongeacht de intracellulaire [Trp], en er zal zich geen terminator vormen bij de verzwakker.
  • Specifieke secundaire structuren in de trpleider RNA zijn nodig voor regulatie. bijv. mutaties die het aantal basenparen tussen de 3 en 4 regio's verminderen, zullen de hoeveelheid transcriptionele terminatie verminderen (d.w.z. de expressie van het operon verhogen). Compenserende mutaties die het aantal basenparen tussen 3 en 4 verhogen, zullen de oorspronkelijke mutaties onderdrukken.

Verzwakking vereist gekoppelde transcriptie en vertaling

Vereist geen regulerende eiwitten: opladen van verwant tRNA is het regulerende signaal. Een transcriptionele pauzeplaats op +90 nodig om de ribosomen in staat te stellen het RNA-polymerase in te halen en daardoor de secundaire structuren in het ontluikende RNA te beïnvloeden.

Verzwakking is een algemeen mechanisme voor het reguleren van biosynthetische operons

Veel operons die coderen voor de enzymen die de biosynthese van aminozuren katalyseren, worden gereguleerd door verzwakking. In elk geval is het leiderpolypeptide rijk aan het aminozuur dat het product is van de route, b.v. zijn, phe, leu, thr, ilv.

Aanvullende metingen

  • Friedman, DI en graaf, D.L. (1995) Transcriptionele antiterminatie: het lambda-paradigma bijgewerkt. Moleculaire Microbiologie 18: 191-200.
  • Henkin, T. (2000) Transcriptionele terminatie in bacteriën. Huidige meningen in de microbiologie 3: 149-153.
  • Gusarov, I. en Nudler, E. (2001) Controle van intrinsieke transcriptionele terminatie door N en NusA: het basismechanisme. Cel 107: 437-449.

Transcriptie (biologie)

Transcriptie is het proces van het kopiëren van een stukje DNA naar RNA. De segmenten van DNA die worden getranscribeerd in RNA-moleculen die kunnen coderen voor eiwitten, zouden boodschapper-RNA (mRNA) produceren. Andere DNA-segmenten worden gekopieerd naar RNA-moleculen die niet-coderende RNA's (ncRNA's) worden genoemd. Gemiddeld over meerdere celtypen in een bepaald weefsel, is de hoeveelheid mRNA meer dan 10 keer de hoeveelheid ncRNA (hoewel in het bijzonder ncRNA's van enkelvoudige cellen mRNA's kunnen overschrijden). [1] Het algemene overwicht van mRNA in cellen is geldig, hoewel minder dan 2% van het menselijke genoom kan worden getranscribeerd in mRNA (menselijk genoom#codering versus niet-coderend DNA), terwijl ten minste 80% van het genomische DNA van zoogdieren actief kan worden getranscribeerd (in een of meer soorten cellen), waarbij de meerderheid van deze 80% wordt beschouwd als ncRNA. [2]

Zowel DNA als RNA zijn nucleïnezuren, die basenparen van nucleotiden gebruiken als een complementaire taal. Tijdens transcriptie wordt een DNA-sequentie gelezen door een RNA-polymerase, dat een complementaire, antiparallelle RNA-streng produceert die een primair transcript wordt genoemd.

Transcriptie verloopt in de volgende algemene stappen:

  1. RNA-polymerase bindt samen met een of meer algemene transcriptiefactoren aan promotor-DNA.
  2. RNA-polymerase genereert een transcriptiebel, die de twee strengen van de DNA-helix scheidt. Dit wordt gedaan door de waterstofbruggen tussen complementaire DNA-nucleotiden te verbreken.
  3. RNA-polymerase voegt RNA-nucleotiden toe (die complementair zijn aan de nucleotiden van één DNA-streng).
  4. RNA-suikerfosfaat-ruggengraat wordt gevormd met behulp van RNA-polymerase om een ​​RNA-streng te vormen.
  5. Waterstofbindingen van de RNA-DNA-helix breken, waardoor de nieuw gesynthetiseerde RNA-streng vrijkomt.
  6. Als de cel een kern heeft, kan het RNA verder worden verwerkt. Dit kan polyadenylatie, capping en splicing omvatten.
  7. Het RNA kan in de kern blijven of via het kernporiecomplex naar het cytoplasma gaan.

Als het stuk DNA wordt getranscribeerd in een RNA-molecuul dat codeert voor een eiwit, wordt het RNA messenger-RNA (mRNA) genoemd. Het mRNA dient op zijn beurt als een sjabloon voor de synthese van het eiwit door middel van translatie. Andere stukken DNA kunnen worden getranscribeerd in kleine niet-coderende RNA's zoals microRNA, transfer-RNA (tRNA), klein nucleolair RNA (snoRNA), klein nucleair RNA (snRNA) of enzymatische RNA-moleculen genaamd ribozymen [3], evenals grotere niet-coderende RNA's zoals ribosomaal RNA (rRNA) en lang niet-coderend RNA (lncRNA). Over het algemeen helpt RNA bij het synthetiseren, reguleren en verwerken van eiwitten, daarom speelt het een fundamentele rol bij het uitvoeren van functies in een cel.

In de virologie kan de term transcriptie ook worden gebruikt wanneer wordt verwezen naar mRNA-synthese van een RNA-molecuul (d.w.z. equivalent aan RNA-replicatie). Het genoom van een negatief-sense enkelstrengs RNA (ssRNA -) virus kan bijvoorbeeld een sjabloon zijn voor een positief-sense enkelstrengs RNA (ssRNA+) [ verduidelijking nodig ] . Dit komt omdat de positive-sense streng de sequentie-informatie bevat die nodig is om de virale eiwitten te vertalen die nodig zijn voor virale replicatie. Dit proces wordt gekatalyseerd door een virale RNA-replicase. [4] [ verduidelijking nodig ]


Achtergrond

Gentranscriptie is een meerstapsproces dat bestaat uit rekrutering van RNA-polymerase II (Pol II) naar promoters, transcriptie-initiatie, verlenging en beëindiging. Naast het produceren van RNA-polymeren op basis van de DNA-matrijs, reguleert het Pol II-holo-enzym ook tal van RNA-verwerkingsgebeurtenissen, waaronder de vorming van 5'-caps, splicing, polyadenylatie en RNA-transport [1-7].

Hoewel historisch gezien de meeste onderzoeken gericht waren op het begrijpen hoe promotorbinding en transcriptie-initiatie worden gereguleerd, hebben recente onderzoeken aangetoond dat aanvullende stadia van het transcriptieproces ook strak gereguleerd zijn en van cruciaal belang zijn voor genactivering. Deze studies hebben aangetoond dat binding van Pol II aan genpromoters niet voldoende is voor productieve transcriptie. In plaats daarvan is Pol II in de meeste genen gedeeltelijk 'gepauzeerd' 20 tot 60 nt van de transcriptiestartplaats (TSS), en zijn er verschillende gereguleerde stappen nodig om Pol II van de TSS te laten vertrekken en de rest van het gen te transcriberen [8-15].

De snelheid van Pol II-beweging door genlichamen is ook in verband gebracht met verschillende aspecten van co-transcriptionele RNA-verwerking. Veranderingen in transcriptie-verlengingssnelheden kunnen bijvoorbeeld de uitkomst van de splicing-machinerie beïnvloeden [7, 16, 17], en langzame verlenging door Pol II bleek de opname van specifieke zwakke exons [7] te versterken ter ondersteuning van dit idee, Pol II bleek te accumuleren bij exons [18-20]. Evenzo is de snelheid van verlenging door Pol II gekoppeld aan regulering van alternatieve polyadenylatie [21] inderdaad, Pol II accumuleert op polyadenylatieplaatsen [9].

Het belang van stappen na transcriptionele initiatie wordt ook onderstreept door de impact van misregulatie van deze stappen op de levensvatbaarheid van cellen en organismen. Veel van de MLL-gentranslocatiepartners, waarvan wordt gedacht dat ze agressieve acute leukemie veroorzaken, maken bijvoorbeeld deel uit van het superelongatiecomplex (SEC). Leukemie-geassocieerde MLL-fusie-eiwitten herlokaliseren de SEC naar MLL-doelgenen, waarbij ze de normale transcriptionele controle omzeilen en afwijkende expressie van die genen veroorzaken [22]. Evenzo werd gesuggereerd dat overmatige c-Myc de genexpressie zou verhogen door de afgifte van gepauzeerde Pol II te verhogen en zo actieve verlenging te vergemakkelijken, waardoor de snelheidsbeperkende beperkingen op de groei en proliferatie van tumorcellen worden verlicht [23]. Bovendien gebruiken of wijzigen virussen transcriptie-verlenging-gerelateerde processen in hun voordeel. Het influenza A NS1-eiwit omvat bijvoorbeeld een histonachtige sequentie die zich kan richten op het PAF1-elongatiecomplex, waardoor selectieve modulatie van gastheercelgenexpressie mogelijk wordt en bijdraagt ​​aan de onderdrukking van de antivirale respons [24].Bovendien rekruteert de virale transactivator van transcriptie (Tat) tijdens actieve HIV-1-infectie de SEC naar de HIV-1 long terminal repeat (LTR) om expressie van het provirus in gastheercellen te activeren [25-27]. Een betere opheldering van de regulatie van transcriptionele verlenging zou dus kunnen bijdragen aan het begrip van moleculaire mechanismen van ziekte en zelfs nieuwe therapeutische benaderingen kunnen suggereren.

Ondanks de gedocumenteerde verbanden tussen verlengingssnelheden en talrijke RNA-gerelateerde functies, blijven de werkelijke verlengingssnelheden binnen cellen ter discussie, met gerapporteerde waarden variërend van 1 kilobase per minuut (Kb/min) tot 6 Kb/min [28]. In de meeste gevallen werden de verlengingspercentages van slechts een paar genen tegelijk gemeten. Een studie, waarbij gebruik werd gemaakt van Global Run-On sequencing (GRO-seq), was in staat om de percentages te bepalen voor ongeveer 166 lange genen die opgereguleerd waren als reactie op een korte behandeling met fysiologische , niet-toxische inductoren [29]. Omdat de verlengingssnelheden van individuele genen op een stimulusafhankelijke manier kunnen worden gewijzigd [29], is het belangrijk om de verlengingssnelheden van niet-gestimuleerde genen te meten om meer algemeen begrip te krijgen van de relatie tussen basale transcriptieverlengingssnelheden en stabiele staat RNA-verwerking en genexpressie. Bovendien kan de beoordeling van een groot aantal genen meer definitieve informatie opleveren over de factoren die de verlenging van de transcriptie beïnvloeden. Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt om gemakkelijk gelijktijdig, in een enkel experiment, de steady-state verlengingssnelheden van duizenden genen in levende cellen te meten.


Cis-werkende regelgevende sequenties: promotors en versterkers

Zoals reeds besproken, wordt transcriptie in bacteriën gereguleerd door de binding van eiwitten aan cis-acterende sequenties (bijv. de lac operator) die de transcriptie van aangrenzende genen regelen. Vergelijkbaar cis-werkende sequenties reguleren de expressie van eukaryote genen. Deze sequenties zijn in zoogdiercellen grotendeels geïdentificeerd door het gebruik van genoverdrachtstesten om de activiteit van vermoedelijke regulerende regio's van gekloonde genen te bestuderen (Figuur 6.18). De eukaryote regulerende sequenties worden gewoonlijk geligeerd aan een reportergen dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar enzym. De expressie van het reportergen volgend op zijn overdracht in gekweekte cellen verschaft dan een gevoelige test voor het vermogen van de gekloneerde regulerende sequenties om transcriptie te sturen. Zo kunnen biologisch actieve regulerende regio's worden geïdentificeerd, en in vitro mutagenese kan worden gebruikt om de rollen van specifieke sequenties binnen de regio te bepalen.

Afbeelding 6.18

Identificatie van eukaryote regulerende sequenties. De regulerende sequentie van een gekloond eukaryoot gen wordt geligeerd aan een reportergen dat codeert voor een gemakkelijk detecteerbaar enzym. Het resulterende plasmide wordt vervolgens door transfectie in gekweekte ontvangende cellen geïntroduceerd. (meer. )

Genen getranscribeerd door RNA-polymerase II hebben twee kernpromotorelementen, de TATA-box en de Inr-sequentie, die dienen als specifieke bindingsplaatsen voor algemene transcriptiefactoren. Ander cis-werkende sequenties dienen als bindingsplaatsen voor een grote verscheidenheid aan regulerende factoren die de expressie van individuele genen regelen. Deze cis-werkende regulerende sequenties bevinden zich vaak, maar niet altijd, stroomopwaarts van de TATA-box. Twee regulerende sequenties die in veel eukaryote genen worden gevonden, werden bijvoorbeeld geïdentificeerd door studies van de promotor van het herpes simplex-virusgen dat codeert voor thymidinekinase (Figuur 6.19). Beide sequenties bevinden zich binnen 100 basenparen stroomopwaarts van de TATA-box: hun consensussequenties zijn CCAAT en GGGCGG (een GC-box genoemd). Specifieke eiwitten die aan deze sequenties binden en transcriptie stimuleren, zijn sindsdien geïdentificeerd.

Afbeelding 6.19

Een eukaryote promotor. De promotor van het thymidinekinasegen van het herpes simplex-virus bevat drie sequentie-elementen stroomopwaarts van de TATA-box die nodig zijn voor efficiënte transcriptie: een CCAAT-box en twee GC-boxen (consensussequentie GGGCGG). (meer. )

In tegenstelling tot de relatief eenvoudige organisatie van CCAAT- en GC-boxen in de herpes-thymidinekinasepromoter, worden veel genen in zoogdiercellen gecontroleerd door regulerende sequenties die zich verder weg bevinden (soms meer dan 10 kilobasen) van de transcriptiestartplaats. Deze sequenties, versterkers genoemd, werden voor het eerst geïdentificeerd door Walter Schaffner in 1981 tijdens studies van de promotor van een ander virus, SV40 (Figuur 6.20). Naast een TATA-box en een set van zes GC-boxen, zijn twee herhalingen van 72 basenparen die verder stroomopwaarts zijn gelokaliseerd, vereist voor efficiënte transcriptie van deze promotor. Deze sequenties bleken de transcriptie van andere promotors evenals van die van SV40 te stimuleren, en verrassend genoeg was hun activiteit niet afhankelijk van hun afstand of hun oriëntatie met betrekking tot de transcriptie-initiatieplaats (Figuur 6.21). Ze zouden transcriptie kunnen stimuleren wanneer ze stroomopwaarts of stroomafwaarts van de promotor worden geplaatst, in een voorwaartse of achterwaartse oriëntatie.

Afbeelding 6.20

De SV40-versterker. De SV40-promotor voor vroege genexpressie bevat een TATA-box en zes GC-boxen die zijn gerangschikt in drie sets van herhaalde sequenties. Bovendien vereist efficiënte transcriptie een stroomopwaartse versterker die bestaat uit twee herhalingen van 72 basenparen (bp). (meer. )

Afbeelding 6.21

Actie van versterkers. Zonder een enhancer wordt het gen op een laag basaal niveau (A) getranscribeerd. Toevoeging van een versterker, bijvoorbeeld E—, de SV40 72-basenpaar-herhalingen'x02014 stimuleert de transcriptie. De versterker is niet alleen actief als hij net (meer.)

Het vermogen van enhancers om te functioneren, zelfs wanneer ze door lange afstanden van transcriptie-initiatieplaatsen gescheiden zijn, suggereerde aanvankelijk dat ze werken door mechanismen die verschillen van die van promoters. Dit bleek echter niet het geval te zijn: versterkers werken, net als promotors, door transcriptiefactoren te binden die vervolgens RNA-polymerase reguleren. Dit is mogelijk vanwege DNA-looping, waardoor een transcriptiefactor die aan een verre enhancer is gebonden, kan interageren met RNA-polymerase of algemene transcriptiefactoren op de promotor (Figuur 6.22). Transcriptiefactoren gebonden aan ver verwijderde versterkers kunnen dus werken door dezelfde mechanismen als die gebonden aan promotors, dus er is geen fundamenteel verschil tussen de werking van versterkers en die van cis-werkende regulerende sequenties grenzend aan transcriptie startplaatsen. Interessant is dat, hoewel versterkers voor het eerst werden geïdentificeerd in zoogdiercellen, ze vervolgens zijn gevonden in bacteriën, een ongebruikelijk geval waarin studies van eukaryoten als model dienden voor de eenvoudigere prokaryotische systemen.

Afbeelding 6.22

DNA-looping. Transcriptiefactoren gebonden aan verre enhancers kunnen interageren met algemene transcriptiefactoren bij de promotor omdat het tussenliggende DNA lussen kan vormen. Er is dus geen fundamenteel verschil tussen de werking van transcriptie (meer.)

De binding van specifieke transcriptionele regulerende eiwitten aan enhancers is verantwoordelijk voor de controle van genexpressie tijdens ontwikkeling en differentiatie, evenals tijdens de respons van cellen op hormonen en groeifactoren. Een van de meest grondig bestudeerde versterkers van zoogdieren regelt de transcriptie van immunoglobulinegenen in B-lymfocyten. Experimenten met genoverdracht hebben aangetoond dat de immunoglobuline-versterker actief is in lymfocyten, maar niet in andere celtypes. Deze regulerende sequentie is dus ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk voor weefselspecifieke expressie van de immunoglobulinegenen in het geschikte gedifferentieerde celtype.

Een belangrijk aspect van enhancers is dat ze gewoonlijk meerdere functionele sequentie-elementen bevatten die aan verschillende transcriptionele regulerende eiwitten binden. Deze eiwitten werken samen om de genexpressie te reguleren. De versterker van de zware keten van immunoglobuline omvat bijvoorbeeld ongeveer 200 basenparen en bevat ten minste negen verschillende sequentie-elementen die dienen als eiwitbindingsplaatsen (Figuur 6.23). Mutatie van een van deze sequenties vermindert de activiteit van de enhancer, maar doet deze niet teniet, wat aangeeft dat de functies van individuele eiwitten die aan de enhancer binden, ten minste gedeeltelijk overbodig zijn. Veel van de afzonderlijke sequentie-elementen van de immunoglobuline-versterker stimuleren op zichzelf transcriptie in niet-lymfoïde cellen. De beperkte activiteit van de intacte versterker in B-lymfocyten is daarom niet het gevolg van de weefselspecifieke functie van elk van zijn componenten. In plaats daarvan resulteert weefselspecifieke expressie uit de combinatie van de individuele sequentie-elementen die de volledige versterker vormen. Deze elementen omvatten enkele cis-werkende regulerende sequenties die transcriptionele activatoren binden die specifiek tot expressie worden gebracht in B-lymfocyten, evenals andere regulerende sequenties die repressoren binden in niet-lymfoïde cellen. De immunoglobuline-versterker bevat dus negatieve regulerende elementen die transcriptie in ongepaste celtypen remmen, evenals positieve regulerende elementen die transcriptie in B-lymfocyten activeren. De algehele activiteit van de versterker is groter dan de som van zijn delen, wat de gecombineerde werking van de eiwitten weerspiegelt die zijn geassocieerd met elk van zijn individuele sequentie-elementen.

Afbeelding 6.23

De immunoglobuline-versterker. De versterker van de zware keten van immunoglobuline omvat ongeveer 200 basen en bevat negen functionele sequentie-elementen (E, 𻳡-5, π, 㯋 en OCT), die samen de transcriptie in B-lymfocyten stimuleren.


DISCUSSIE

We hebben eerder aangetoond dat CLN3 mRNA-niveaus worden gereguleerd door de koolstofbron en dat glucose-inductie van CLN3 transcriptie is niet afhankelijk van cellulaire groei of progressie door de celcyclus (19). Door het gebruiken van CLN3 promotor-reporter fusieconstructen, hebben we een gebied geïdentificeerd tussen posities � en � in de CLN3 promotor die glucoseregulatie kan verlenen aan een heteroloog reportergen. Deze regio binnen de CLN3 promotor bevat vijf kopieën, vier exacte en één gedeeltelijke, van de sequentie AAGAAAAAA. Kleine dubbelstrengs oligonucleotiden die deze herhaalde sequenties bevatten, kunnen glucoseafhankelijke expressie van het reportergen aansturen. Mutaties in deze elementen verminderen de transcriptionele inductie van zowel a URA3 verslaggever en de CLN3 gen door glucose. Mobiliteitsverschuivingsassays tonen specifieke binding aan van eiwitten uit gistextracten aan DNA-fragmenten die de herhalingen bevatten. Eiwitbinding aan het gelabelde oligonucleotide kan worden geconcurreerd met een molaire overmaat van niet-gelabelde oligonucleotiden die de bovenstaande herhaalde sequenties bevatten, maar mutatie van de centrale G’s binnen de herhalingen vermindert het vermogen van het niet-gelabelde DNA om te concurreren. Deze resultaten geven het belang aan van de herhaalde elementen voor zowel inductie van transcriptie als DNA-eiwitinteracties. Southwestern-blotting onthulde een eiwit met een schijnbare grootte van 69 kDa dat specifiek aan deze sequenties bindt op een manier die afhangt van de intacte herhalingen, evenals een kleiner eiwit dat bindt op een manier die niet wordt beïnvloed door veranderingen in de herhalingen.

We hebben geen bewijs gevonden dat erop wijst dat glucose de binding van eiwitten aan elementen van de reguleert CLN3 promotor die glucoserespons verleent. Dit suggereert dat glucoseregulatie van CLN3 omvat een proces dat complexer is dan de eenvoudige gereguleerde binding van een transactivator, of repressoreiwit, aan de CLN3 promotor. Een belangrijke stap om te leren hoe glucose van invloed is CLN3 expressie zou zijn om de eiwitten te identificeren die binden aan de glucose-responsieve elementen in de CLN3 promotor. Het zou interessant zijn om te weten hoe deze eiwitten door glucose worden beïnvloed. Een andere belangrijke vraag is of deze factoren specifiek zijn voor: CLN3 expressie of maken deel uit van een gemeenschappelijke route die de expressie van een grote groep genen als reactie op glucose coördineert. In dit opzicht leverde een zoekactie in de database slechts enkele gistpromotors op die deze herhaalde elementen droegen. Deze genen vielen niet in een voor de hand liggende groep in termen van functie, en ze lijken ook niet allemaal transcriptioneel te worden gereguleerd door glucose. Daarom kunnen we niet zeggen of de kenmerken die de transcriptie van CLN3 reguleren belangrijk zijn bij het reguleren van andere genen.

Mutatie van slechts vijf basen, beperkt tot A2GA5 herhalingen binnen de CLN3 promotor, produceert cellen die de Cln3-spiegels niet goed verhogen als reactie op glucose. Deze afnamerespons heeft duidelijk functionele betekenis, omdat deze cellen in glucosemedium ongeveer twee keer zo groot worden als de controles die tot expressie brengen CLN3 van de wildtype promotor. We waren niet in staat om een ​​merkbare hoeveelheid Cln3-eiwit in de TKL1-cellen te detecteren, maar we denken dat Cln3-eiwit in deze cellen tot expressie wordt gebracht, omdat ze kleiner lijken dan cellen met CLN3 volledig verwijderd. Het single-copy plasmide produceerde Cln3-eiwitniveaus die in onze studie dicht bij de detectielimiet lagen. We stellen voor dat TKL1-cellen een bepaald niveau van functioneel Cln3-eiwit hebben dat te laag is om een ​​signaal te geven in onze experimenten. Hoewel het duidelijk is dat deze elementen bijdragen aan de reactie op glucose, is het even duidelijk dat deze elementen op zichzelf niet verantwoordelijk zijn voor de verkorting van de celcyclus die glucose produceert. Allereerst, terwijl mutatie van de vijf A2GA5 herhalingen verminderden het vermogen van glucose om te verhogen CLN3 mRNA-niveaus, dit schafte de respons niet volledig af. Dit kan zijn omdat andere elementen of mechanismen waarbij deze herhaalde reeksen niet betrokken zijn, kunnen toenemen CLN3 transcriptniveaus als reactie op glucose. Het is ook mogelijk dat de resterende respons voortkomt uit de aanwezigheid van extra imperfecte kopieën van de herhaalde reeks. Hoewel we ons hebben gefocust op de 8-bp A2GA5 sequenties, zijn er in totaal 13 kopieën van de kortere 6-bp sequentie AAGAAA binnen de 1.000 basen stroomopwaarts van de CLN3 coderende volgorde. Mogelijk dragen deze ook bij aan de glucoserespons. Ten tweede worden Cln3-eiwitniveaus op verschillende niveaus gereguleerd naast transcriptie als reactie op voedingssignalen. Deze mechanismen omvatten posttranscriptionele regulatie door rijk medium (20), de Ras-cyclische AMP-route (10), eiwitsynthesesnelheden (10) en stikstofbeperking (8). eindelijk, de CLN3 gen wordt verondersteld te werken in een redundante route, in die deletie van CLN3 is alleen dodelijk in combinatie met verlies van andere genen, met name BCK2 (4, 7). Het lijkt waarschijnlijk dat voedingsstoffen naast andere componenten van de celcyclus ook andere componenten van de celcyclus zullen reguleren CLN3.

De zoogdierhomologen die het dichtst bij Cln3 staan, lijken de D-type cyclinen te zijn. Zowel D-type cyclinen en CLN3 hebben overeenkomsten in expressie, worden minder beïnvloed door de positie van de celcyclus dan andere cyclinen, en beide soorten cycline lijken te functioneren in het proces van het beëindigen van G1. De D-cyclines dienen om mitogene signalen uit de cellulaire omgeving te koppelen aan het proces van het verlaten van G1 (22) Net als bij de D-cyclinen lijken Cln3-niveaus te worden gereguleerd door omgevingssignalen, in dit geval afkomstig van voedingsbronnen. De transcriptionele regulatie van CLN3 die we beschrijven, lijkt maar een van de meerdere controlelagen te zijn die gistcellen in staat stellen om G . te moduleren1 lengte.


Werken met moleculaire genetica

Dit online leerboek behandelt belangrijke onderwerpen in de moleculaire genetica in een probleemgebaseerde benadering. Het is ontstaan ​​uit het geven van een cursus aan studenten van het hoogste niveau en afgestudeerde studenten aan de Pennsylvania State University (BMB400).

Het copyright berust bij de auteur, Ross C. Hardison. Iedereen is vrij om deze informatie voor elk doel te lezen en te gebruiken, BEHALVE voor winst. Ik maak het gratis beschikbaar, dus houd het gratis. Als u bijvoorbeeld een klas lesgeeft en studenten ernaar wilt verwijzen, doe dat dan alstublieft. Als je dit materiaal wilt gebruiken om wat moleculaire genetica te leren, doe dat dan alsjeblieft. Als u enkele van de cijfers in een rapport wilt gebruiken, doe dat dan, vermeld deze pagina als uw bron. Als u een of meer van dit materiaal wilt gebruiken en het als een boek wilt publiceren voor uw winst, NIET DOEN!

Het materiaal was actueel vanaf de herfst van 2002. Het meeste materiaal is relatief "stabiel", dus hopelijk zal het nog een tijdje bruikbaar zijn. Ik ben niet van plan om het heel vaak te updaten, of helemaal niet. Feedback is echter altijd welkom en kan me inspireren om dit nog wat te bewerken.

Diverse gastdocenten hebben belangrijk materiaal aan dit vak en boek toegevoegd. In het bijzonder dank ik Tracy Nixon (Dept. BMB, PSU) voor zijn bijdragen aan hoofdstuk 16 en Jerry Workman (voorheen in BMB bij PSU, nu bij het Stowers Institute) voor zijn bijdragen aan hoofdstuk 20. Sommige afbeeldingen zijn afgeleid van andere boeken, artikelen en websites. Ik heb geprobeerd al die bronnen te citeren, vergeef me als ik er een over het hoofd heb gezien.

U heeft toegang tot zowel html- als pdf-versies van de hoofdstukken. De pdf's zijn nauwkeuriger, maar voor het gemak wordt html verstrekt. Het originele materiaal is gegenereerd in Microsoft Word, en de html wordt gegenereerd door de "Word naar html"-conversiefunctie in Word. Ik weet dat sommige dingen (zoals pijlen, exponenten en zelfs posities van figuren ten opzichte van tekst) niet nauwkeurig worden weergegeven, dus pas op voor dit probleem. Sommige afbeeldingen zijn jaren geleden gemaakt in MacDraw (pict-bestanden) en worden niet zo goed weergegeven. Een klein aantal is met de hand getekend en gescand, deze zijn moeilijk leesbaar. De meeste cijfers moeten echter leesbaar zijn, vooral in de pdf's.


Download nu!

We hebben het je gemakkelijk gemaakt om een ​​PDF Ebooks te vinden zonder te graven. En door online toegang te hebben tot onze e-boeken of door deze op uw computer op te slaan, heeft u handige antwoorden met Campbell Biology Chapter 18 Test Pdf. Om te beginnen met het vinden van Campbell Biology Chapter 18 Test Pdf, hebt u gelijk onze website met een uitgebreide verzameling handleidingen.
Onze bibliotheek is de grootste van deze die letterlijk honderdduizenden verschillende producten heeft vertegenwoordigd.

Eindelijk krijg ik dit e-boek, bedankt voor al deze Campbell Biology Chapter 18 Test Pdf die ik nu kan krijgen!

Ik had niet gedacht dat dit zou werken, mijn beste vriend liet me deze website zien, en dat doet het! Ik krijg mijn meest gezochte eBook

wtf dit geweldige ebook gratis?!

Mijn vrienden zijn zo boos dat ze niet weten hoe ik alle e-boeken van hoge kwaliteit heb, wat zij niet hebben!

Het is heel gemakkelijk om e-boeken van hoge kwaliteit te krijgen)

zoveel nepsites. dit is de eerste die werkte! Erg bedankt

wtffff ik begrijp dit niet!

Selecteer gewoon uw klik en download-knop en voltooi een aanbieding om het e-boek te downloaden. Als er een enquête is, duurt het slechts 5 minuten, probeer een enquête die voor u werkt.


Resultaten

Enhancer-geassocieerde epigenetische markeringen aan de Ikzf1 lymfoïde-specifiek DHS

In kaart brengen van lymfoïde-specifieke clusters van DHS's aan de Ikzf1 locus heeft eerder 10 vermeende regulerende regio's 16 geïdentificeerd (Figuur 1).De meeste van deze locaties zijn onlangs ook geïdentificeerd door middel van genoombrede DHS-mapping in thymocyten, splenocyten en B-cellen die zijn gegenereerd door het ENCODE-project 20 (aanvullende figuur 1 aanvullende tabellen 6 en 8). In de nabijheid van deze DHS-locaties waren gebieden met uitgebreide conservering tussen de muis en de mens Ikzf1 (IKZF1). Zeven intronische (p, D, E, F, G, H en I) en 1 stroomopwaartse (J) geconserveerde regio's werden geïdentificeerd, en 5 (DH) bevonden zich binnen het intron van ∼40 kb tussen exons 3 en 4 (>86 % Tabel 1 Afbeelding 1).

Epigenetische afbakening van Ikzf1 regelgevende regio's. De locatie van 10 eerder beschreven lymfoïde-specifieke DHS-clusters 16 en niet-coderende regio's met uitgebreide conservering van de muis-menselijke sequentie worden getoond op de Ikzf1 plaats. Individuele DHS- en DHS-clusters worden aangegeven door korte verticale balken of rode balken. Op de Ikzf1 locus worden de niet-vertaalde exons la en 1b geassocieerd met verschillende promotoractiviteiten aangeduid als ongevulde rechthoeken en de 7 getranslateerde exons 2 tot 8 als volle rechthoeken. Verrijkingspieken voor histon H3-modificaties (H3K4me1, me2, me3, H3K9/14Ac en H3K36me3) en voor de RNA Pol II (pII)-initiatie (8WG16) en elongatie (S5, S2) vormen aan de Ikzf1 locus worden weergegeven door de Integrative Genomics Viewer (IGV) 2.1 met behulp van de muisgenoomdatabase mm9. Verrijkingspieken voor H3K27Ac en p300 werden afgeleid uit ENCODE-gegevens (aanvullende tabel 8). 20

Epigenetische afbakening van Ikzf1 regelgevende regio's. De locatie van 10 eerder beschreven lymfoïde-specifieke DHS-clusters 16 en niet-coderende regio's met uitgebreide conservering van de muis-menselijke sequentie worden getoond op de Ikzf1 plaats. Individuele DHS- en DHS-clusters worden aangegeven door korte verticale balken of rode balken. Op de Ikzf1 locus worden de niet-vertaalde exons la en 1b geassocieerd met verschillende promotoractiviteiten aangeduid als ongevulde rechthoeken en de 7 getranslateerde exons 2 tot 8 als volle rechthoeken. Verrijkingspieken voor histon H3-modificaties (H3K4me1, me2, me3, H3K9/14Ac en H3K36me3) en voor de RNA Pol II (pII)-initiatie (8WG16) en elongatie (S5, S2) vormen aan de Ikzf1 locus worden weergegeven door de Integrative Genomics Viewer (IGV) 2.1 met behulp van de muisgenoomdatabase mm9. Verrijkingspieken voor H3K27Ac en p300 werden afgeleid uit ENCODE-gegevens (aanvullende tabel 8). 20

Om inzicht te krijgen in de soorten regelgevende elementen die verband houden met de Ikzf1 geconserveerde DHS's, werd de directe chromatine-omgeving onderzocht door ChIP van histon-modificaties in combinatie met high-throughput sequencing (ChIP-Seq) in thymocyten. We onderzochten eerst de methyleringsstatus van H3K4 die correleert met zowel transcriptioneel gestabiliseerde als transcriptioneel actieve promoters en versterkers. 23 H3K4me1 vertoonde een brede spreiding over het gehele Ikzf1 plaats. H3K4me2 en H3K4me3 daarentegen werden specifiek verrijkt aan de Ikzf1 vermeende regulerende sites en niet door de hele locus (J, p, D, E, F, G, H en I). Desalniettemin verschilden hun distributies, waarbij H3K4me3 sterk verrijkt was bij promotors en relatief uitgeput was bij de 5′ en intronische DHS, terwijl H3K4me2 gelijkmatig was verdeeld op al deze sites. Net als H3K4me3 vertoonde H3K9Ac een sterke promotorverrijking en lagere verrijking op andere regulerende locaties. Net als bij H3K4me2 vertoonden de versterkermarkeringen p300 en H3K27Ac 20 een niet-promoterverdeling.

Transcriptioneel actieve versterkers aan de Ikzf1 locus werden verder geëvalueerd door de verdeling van de pre-initiatie- en verlengingsvormen van RNApII te onderzoeken. 24 De S5- en S2-gefosforyleerde vormen van RNA-polymerase, evenals het transcriptionele elongatieteken H3K36me3, waren verspreid over de Ikzf1 locus (Figuur 1). Daarentegen werd de niet-gefosforyleerde vorm van RNA-polymerase (herkend door het 8WG16-antilichaam) die de pre-initiatiefase van transcriptie en actieve versterkers markeert, alleen gedetecteerd op de Ikzf1 regelgevende clusters.

Dus de differentiële verdeling van histoncodes, chromatinemodificatoren en transcriptiefactoren op verschillende van de Ikzf1 geconserveerde DHS-clusters ondersteunen hun potentiële rol als transcriptionele versterkers bij het reguleren van Ikaros-expressie tijdens de ontwikkeling.

Epigenetische en transcriptionele eigenschappen van de Ikzf1 versterkers

de vermeende Ikzf1 versterkers werden getest op hun vermogen om transcriptie van een GFP-reporter uit de hoofdgroep te bevorderen Ikzf1 (B-p) promotor (figuren 1 en 2A). Er werden 16 Reporter-cassettes gegenereerd waarin de vermoedelijke oriëntatie van de versterker ten opzichte van de promotor behouden was, zoals in de Ikzf1 plaats. Voor elke reportercassette werden meerdere transgene muizenlijnen gegenereerd en getest op GFP-expressie in perifere bloedleukocyten (PBL's). Het aantal regels voor elke reporter en het transgene kopienummer worden gegeven (aanvullende figuren 2 en 3 aanvullende tabel 1).

Enhancer-activiteiten die verband houden met de Ikzf1 regelgevende sites. (A) Diagrammen van de reporterconstructies die in deze studie worden gebruikt, worden aan de linkerkant weergegeven. Het aantal oprichters dat GFP tot expressie brengt, wordt weergegeven over het totale aantal oprichters dat voor elke verslaggever is verkregen. De statistische significantie van het verschil (toename) in stichterlijnen die GFP tot expressie brengen in vergelijking met de ouderlijke B-P-GFP-lijnen werden geleverd door χ 2-analyse en worden weergegeven als a P waarde. (B) Het percentage GFP + PBL's beoordeeld door flowcytometrie wordt weergegeven voor elke grondlegger als cirkels. Het gemiddelde percentage GFP + PBL's voor elke transgene reporter werd berekend voor ofwel alle oprichters die GFP tot expressie brengen (zwarte balk) of alle oprichters (grijze balk). (C) De MFI van GFP + PBL's werd geschat voor elke grondlegger (grijze diamanten) van elke transgene reporter zoals beschreven in paneel B.

Enhancer-activiteiten die verband houden met de Ikzf1 regelgevende sites. (A) Diagrammen van de reporterconstructies die in deze studie worden gebruikt, worden aan de linkerkant weergegeven. Het aantal oprichters dat GFP tot expressie brengt, wordt weergegeven over het totale aantal oprichters dat voor elke verslaggever is verkregen. De statistische significantie van het verschil (toename) in stichterlijnen die GFP tot expressie brengen in vergelijking met de ouderlijke B-P-GFP-lijnen werden geleverd door χ 2-analyse en worden weergegeven als a P waarde. (B) Het percentage GFP + PBL's beoordeeld door flowcytometrie wordt weergegeven voor elke grondlegger als cirkels. Het gemiddelde percentage GFP + PBL's voor elke transgene reporter werd berekend voor ofwel alle oprichters die GFP tot expressie brengen (zwarte balk) of alle oprichters (grijze balk). (C) De MFI van GFP + PBL's werd geschat voor elke grondlegger (grijze diamanten) van elke transgene reporter zoals beschreven in paneel B.

De activiteit van de Ikzf1 regulerende regio's bij het tegengaan van lokale chromatine-uitschakeling en bij het bevorderen van transcriptie werden geëvalueerd door het aantal GFP tot expressie brengende transgene lijnen (>1% expressie in PBL's), de expressie in PBL-subsets en het gemiddelde niveau van reporterexpressie te schatten. De meerderheid van de transgene lijnen die door deze enhancer-gedreven reporters werden gegenereerd, vertoonden GFP-expressie in PBL (Figuur 2A-B). Dit was een forse stijging (P < .05) over de kleine fractie van de oprichters die GFP tot expressie brengen, verkregen met de door de just-promotor gestuurde ouderreporter (Figuur 2A B-P-GFP, 11%). 16 Onder de Ikzf1 regulerende regio's, J, D en E vertoonden de sterkste versterkeractiviteit, en ondersteunden de expressie in 88% tot 93% van de transgene lijnen, terwijl F, I en H zwakker waren, wat de expressie in 53% tot 75% van de transgene lijnen ondersteunde (Figuur 2A aanvullende figuren 2 en 3 aanvullende tabel 1).

Reporterexpressie in PBL's was zeer gevarieerd (Figuur 2B), wat aangeeft dat hoewel de Ikzf1 versterkers konden aanvankelijk chromatine tegengaan op de plaats van reporterintegratie, ze waren niet in staat om transcriptioneel permissieve chromatine binnen de Ikzf1-uitdrukken van PBL-subsets. Hoewel bijvoorbeeld de B-P-GFP-D-reporter werd uitgedrukt in 93% van zijn transgene lijnen (P < 5 x 107), werd expressie gemiddeld in slechts 42% van de PBL's gedetecteerd. Aan de andere kant, hoewel de B-P-GFP-H-reporter werd uitgedrukt in een kleinere fractie (53%) van de grondleggers, expressie werd gezien in een grotere fractie (48%) van PBL's, wat wijst op een sterker potentieel bij het handhaven van transcriptioneel permissieve chromatine (Figuur 2B).

De Ikzf1 versterkers werden verder geëvalueerd door het niveau van reporterexpressie te meten. Met name de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van GFP tot expressie brengende cellen van de D-enhancer-reporterlijnen overtrof die van alle andere reporters, gemeten vanaf alle transgene lijnen of van het uitdrukken van transgene lijnen (Figuur 2C, gemiddelde weergegeven als grijze of zwarte lijn respectievelijk). Het aanzienlijke verschil in expressie dat wordt verschaft door de gemiddelde MFI van alle transgene versus tot expressie brengende transgene lijnen voor F, H en I suggereerde dat deze versterkers krachtig waren in het stimuleren van transcriptie, maar alleen in permissieve chromatine. Daarentegen, hoewel de stroomopwaartse J-enhancer zwak was in het stimuleren van transcriptie, was het zeer efficiënt in het tegengaan van repressief chromatine, wat een groter aantal laag tot expressie brengende transgene lijnen opleverde.

Analyse van transgene reporters onthulde dus de aanwezigheid van 2 soorten cis-werkende elementen geassocieerd met Ikzf1 versterkers (aanvullende tabel 1). Eén type ging restrictieve chromatine- en positie-effectvariegatie (PEV) tegen, zoals gedocumenteerd door een toename van zowel het aantal tot expressie brengende oprichters als reporter tot expressie brengende PBL's. Deze elementen ondersteunen waarschijnlijk de rekrutering van epigenetische factoren die een transcriptioneel permissieve chromatinetoestand bevorderen. Het tweede type was krachtig in het stimuleren van transcriptie in permissieve chromatine, in overeenstemming met de activiteit van een klassieke versterker die functioneert door de initiatie- of verlengingsfase van de RNApII-cyclus te bevorderen.

Celtype specificiteit van de Ikzf1 versterkers

De Ikzf1 versterkers werden vervolgens geëvalueerd op hun celtype-specifieke effecten op reporterexpressie (Figuur 3A-B aanvullende Figuren 2, 3 en 5). Het expressiepatroon van hun transgene lijnen werd onderzocht op afwijkingen van het "hoge B / lage T / intermediaire myeloïde" profiel dat werd geleverd door de door de ouder net-promotor aangedreven reporter waarop deze versterkers werden getest (Figuur 3A-B B-P-GFP). 16 PBL's van elke stamvader werden onderzocht op GFP-expressie in B-cellen (B220+), T-cellen (TCRβ+) en myeloïde cellen (Mac-1+) in perifeer bloed door middel van flowcytometrie (Figuur 3A aanvullende Figuren 2, 3, en 5).

Celtype specificiteit van de Ikzf1 versterkers. (A) Diagrammen van de reporterconstructies die in deze studie worden gebruikt, worden aan de linkerkant weergegeven. Patronen van afstammingsspecifieke GFP-expressie in PB B-cellen (B220+, B), T-cellen (TCRβ+, T) en myeloïde (Mac-1+, My) cellen worden aan de rechterkant samengevat. (B) Ikzf1 versterkeractiviteit in T-cellen. Foutbalken (standaarddeviatie) geven variatie aan van GFP-expressie tussen de verschillende oprichterlijnen die door elke op versterker gebaseerde reporter worden gegenereerd. De significantie in het verschil van GFP-expressie tussen GFP-reporterlijnen werd beoordeeld door Student t toets *P < 5 × 10 −3 . (C) Enhancer D- en H-activiteit in de HSC/MPP-verrijkte LSK (Lin - c-Kit + Sca-1 +), zoals bepaald door expressie van B-P-GFP-D- en -H-reporters vergeleken met de ouderlijke B-P-GFP-verslaggever. De LMPP wordt gedefinieerd als LSK Flt3+ (vierkante poort). GFP-expressie in de LSK wordt weergegeven als een histogram of samen met Flt3-expressie als een contourplot. Het dunne grijze lijnhistogram vertegenwoordigt een negatieve controle van de verslaggever.

Celtype specificiteit van de Ikzf1 versterkers. (A) Diagrammen van de reporterconstructies die in deze studie worden gebruikt, worden aan de linkerkant weergegeven. Patronen van afstammingsspecifieke GFP-expressie in PB B-cellen (B220+, B), T-cellen (TCRβ+, T) en myeloïde (Mac-1+, My) cellen worden aan de rechterkant samengevat. (B) Ikzf1 versterkeractiviteit in T-cellen. Foutbalken (standaarddeviatie) geven variatie aan van GFP-expressie tussen de verschillende oprichterlijnen die door elke op versterker gebaseerde reporter worden gegenereerd. De significantie in het verschil van GFP-expressie tussen GFP-reporterlijnen werd beoordeeld door Student t toets *P < 5 × 10 −3 . (C) Enhancer D- en H-activiteit in de HSC/MPP-verrijkte LSK (Lin - c-Kit + Sca-1 +), zoals bepaald door expressie van B-P-GFP-D- en -H-reporters vergeleken met de ouderlijke B-P-GFP-verslaggever. De LMPP wordt gedefinieerd als LSK Flt3+ (vierkante poort). GFP-expressie in de LSK wordt weergegeven als een histogram of samen met Flt3-expressie als een contourplot. Het dunne grijze lijnhistogram vertegenwoordigt een negatieve controle van de verslaggever.

De meerderheid van de grondleggers die door de J-, E-, F-, G- en I-reportercassettes werden gegenereerd, vertoonden een vergelijkbaar expressiepatroon als de oudercassette (Figuur 3A-B aanvullende figuren 2 en 5 aanvullende tabel 1). In scherp contrast, een significant groot aantal van de D- en H-stichterlijnen brachten GFP tot expressie in een grote fractie van T-cellen vergeleken met de ouderreporter (34% en 43% vergeleken met 4% Figuur 3A-B aanvullende figuren 2 en 3 aanvullende tabel 1). Het gemiddelde aandeel van GFP + myeloïde cellen was ook het hoogst in de D-transgene lijnen (37% versus 22% aanvullende figuren 2 en 3 aanvullende tabel 1). Van alle Ikzf1 hier geteste versterkers, was D de enige die in staat was om reporterexpressie in het LMPP, de eerste stap in beperking van de lymfoïde afstamming, boven de basale niveaus te stimuleren die werden gedetecteerd in de HSC-verrijkte populatie (Figuur 3C, LSK Flt3 + vs LSK Flt3 -). 4

Dus, terwijl alle 6 van de Ikzf1 versterkers (J, D, E, F, H en I) waren actief in B- en myeloïde cellen, 2 (D en H) waren ook actief in T-cellen en waren waarschijnlijk verantwoordelijk voor hoge expressie van Ikzf1 in thymocyten die nodig zijn voor normale rijping en homeostase. 1,9,17,25,26 Een van de 2 Ikzf1 T-cel-specifieke versterkers (D) waren actief in het LMPP en waren geassocieerd met zowel een toename in Ikaros-expressie als inductie van differentiatiepotentieel van lymfoïde afstamming. 4,6

Enhancer D speelt een niet-redundante rol in de transcriptionele regulatie van Ikzf1

Gezien het potentiële belang van de versterker D, hebben we onderzocht hoe de deletie de transcriptionele activiteit aan de beïnvloedde Ikzf1 plaats. Een Ikzf1 BAC-kloon met de menselijke CD2 (hCD2)-reporter ingevoegd in exon 2 (Ik-BAC-hCD2) is ontworpen om loxP herkenningsplaatsen die de 1,7-kb D-regio flankeren en werden getest op expressie in lymfoïde en myeloïde cellen voorafgaand aan (Ik-BAC-lDl) en na Cre-gemedieerde deletie (Ik-BAC-ΔD) (Figuur 4A). Omdat deze BAC-vectoren in een cirkelvormige vorm in bevruchte eieren werden geïnjecteerd, namen we aan dat transgene lijnen met ≥3-kopieën van het transgen ≥1 intacte BAC-kloon hadden. Alle oprichters die werden verkregen met Ik-BAC-hCD2 en Ik-BAC-lDl werden tot expressie gebracht in ∼90% van de T-, B- en myeloïde cellen, zelfs wanneer 2 kopieën van het BAC-transgen aanwezig waren (Figuur 4B). Daarentegen werd in alle met Ik-BAC-ΔD verkregen oprichters een zeer gevarieerde expressie van de hCD2-reporter gedetecteerd in alle celtypen, ongeacht het kopienummer van het transgen (Figuur 4C). Enhancer D is dus van cruciaal belang bij het tegengaan van repressieve chromatine-effecten aan de Ikzf1 locus en het handhaven van transcriptie op een hoog niveau, een activiteit die niet door de andere kan worden vervangen Ikzf1 versterkers.

Enhancer D is vereist voor normale transcriptie aan de Ikzf1 locus (A) Schema van de Ikzf1 BAC transgene reporterconstructen. De eerste vertaalde exon (exon 2) in de Ikzf1 BAC-kloon werd vervangen door de menselijke CD2 (hCD2) reportergen (witte rechthoek) ingevoegd bij het startcodon (Ik-BAC-CD2). Twee flankerende loxP sites (witte driehoeken) werden 5 'en 3' van het D-gebied (Ik-BAC-lDl) ingevoegd. De D-regio is verwijderd uit Ik-BAC-lDl door Cre recombinase om Ik-BAC-ΔD-construct te genereren. (B) Reporter-expressie in de PBL van Ik-BAC transgene lijnen met intacte enhancer D-regio. (C) Reporter-expressie in PBL van transgene Ik-BAC-ΔD-lijnen. Het kopienummer wordt vermeld naast elke oprichter die is gegenereerd uit de Ik-BAC-CD2 of de Ik-BAC-DL-lijn. Het percentage hCD2+-myeloïde cellen (grijze balken), T-cellen (zwarte balken) en B-cellen (witte balken) werd voor elk van de grondleggers bepaald door middel van flowcytometrie met antilichamen tegen respectievelijk Mac-1, B220 en TCRβ. N.D., niet bepaald.

Enhancer D is vereist voor normale transcriptie aan de Ikzf1 locus (A) Schema van de Ikzf1 BAC transgene reporterconstructen. De eerste vertaalde exon (exon 2) in de Ikzf1 BAC-kloon werd vervangen door de menselijke CD2 (hCD2) reportergen (witte rechthoek) ingevoegd bij het startcodon (Ik-BAC-CD2). Twee flankerende loxP sites (witte driehoeken) werden 5 'en 3' van het D-gebied (Ik-BAC-lDl) ingevoegd. De D-regio is verwijderd uit Ik-BAC-lDl door Cre recombinase om Ik-BAC-ΔD-construct te genereren. (B) Reporter-expressie in de PBL van Ik-BAC transgene lijnen met intacte enhancer D-regio. (C) Reporter-expressie in PBL van transgene Ik-BAC-ΔD-lijnen. Het kopienummer wordt vermeld naast elke oprichter die is gegenereerd uit de Ik-BAC-CD2 of de Ik-BAC-DL-lijn. Het percentage hCD2+-myeloïde cellen (grijze balken), T-cellen (zwarte balken) en B-cellen (witte balken) werd voor elk van de grondleggers bepaald door middel van flowcytometrie met antilichamen tegen respectievelijk Mac-1, B220 en TCRβ. N.D., niet bepaald.

Karakterisering van de cis-werkende elementen van de Ikzf1 versterker D

We karakteriseerden verder de cis-werkende elementen die verantwoordelijk zijn voor enhancer D-activiteiten. Het gebied van 1,7 kb dat deze versterker omvat, bevatte 7 kleinere gebieden (D1-D7) met een sterk behoud van muis-mens (86% -96%) die in grootte varieerden van 37 tot 103 bp (Figuur 5A, aanvullende afbeelding 6, aanvullende tabel 3). De eerste 4 gebieden (D1-D4) waren geclusterd aan het 5'-uiteinde en waren geassocieerd met de 2 DHS-C6-locaties (Figuur 5A DHS-C6-a en DHS-C6-b), terwijl de andere 3 locaties (D5- D7) bedekte in totaal 394 basen aan het 3'-uiteinde (Figuur 5A). Twee fragmenten van 500 bp die respectievelijk de sequenties D1 tot D4 (DI) en D5 tot D7 (DIII) omvatten, werden gekloond in de B-P-GFP-cassette en geëvalueerd op activiteit vergeleken met de 2 ouderlijke vectoren (Figuur 5B B-P-GFP en B-P-GFP-D).

T-cel-specifiek cis-werkende elementen in enhancer D. (A) Gebieden van sequentiebehoud (D1-D7) binnen de versterker D van 1,7 kb worden weergegeven als rechthoeken. Horizontale lijnen onder het D-gebied geven de twee 500-bp DI- en DIII-subregio's weer die worden gebruikt in transgene reporters. (B) Vergelijking van reporterexpressie tussen de B-P-GFP-DI, B-P-GFP-DIII, B-P-GFP, en B-P-GFP-D oprichter lijnen. De reporterconstructies die zijn gebruikt om deze oprichterlijnen te genereren, worden links weergegeven. Het aantal oprichters dat GFP tot uitdrukking brengt, wordt weergegeven over het totale aantal gegenereerde oprichters. De statistische significantie van het verschil (toename of afname) in het aandeel van GFP tot expressie brengende oprichter vergeleken met de ouderlijke B-P-GFP-lijn (a) of B-P-GFP-D (b) werd geleverd door χ2-analyse en wordt weergegeven als a P waarde. Het percentage GFP-positieve PBL's wordt weergegeven voor elke grondlegger (cirkel). Het gemiddelde percentage GFP + PBL's voor elke transgene reporter werd berekend voor ofwel alle oprichters die GFP tot expressie brengen (zwarte balk) of alle oprichters (grijze balk). De specificiteit van het celtype van elke reporter is rechts afgebeeld. (C) De MFI van GFP + PBL's van B-P-GFP-D, B-P-GFP-D-I, en B-P-GFP-D-III transgene lijnen werden berekend voor elke grondlegger (grijze diamanten). Grijze lijnen geven de gemiddelde MFI onder alle oprichters aan en zwarte lijnen geven de gemiddelde MFI aan onder de oprichters die GFP tot expressie brengen. (D) Lineage-specifieke GFP-expressie in de PBL's van B-P-GFP-D, B-P-GFP-DI, en B-P-GFP-DIII-oprichters. Het gemiddelde percentage GFP+-cellen in B-cellen (B), T-cellen (T) en myeloïde cellen (My) van perifeer bloed wordt weergegeven. De significantie in het verschil in expressie tussen GFP-reporters werd beoordeeld door Student t toets *P < 5 × 10 −2 **P < 5 × 10 −3 . Foutbalken (standaarddeviatie) geven variatie aan van GFP-expressie tussen de verschillende oprichterlijnen die door elke op versterker gebaseerde reporter zijn gemaakt.

T-cel-specifiek cis-werkende elementen in enhancer D. (A) Gebieden van sequentiebehoud (D1-D7) binnen de versterker D van 1,7 kb worden weergegeven als rechthoeken. Horizontale lijnen onder het D-gebied geven de twee 500-bp DI- en DIII-subregio's weer die worden gebruikt in transgene reporters. (B) Vergelijking van reporterexpressie tussen de B-P-GFP-DI, B-P-GFP-DIII, B-P-GFP, en B-P-GFP-D oprichter lijnen. De reporterconstructies die zijn gebruikt om deze oprichterlijnen te genereren, worden links weergegeven. Het aantal oprichters dat GFP tot uitdrukking brengt, wordt weergegeven over het totale aantal gegenereerde oprichters. De statistische significantie van het verschil (toename of afname) in het aandeel van GFP tot expressie brengende oprichter vergeleken met de ouderlijke B-P-GFP-lijn (a) of B-P-GFP-D (b) werd geleverd door χ2-analyse en wordt weergegeven als a P waarde. Het percentage GFP-positieve PBL's wordt weergegeven voor elke grondlegger (cirkel). Het gemiddelde percentage GFP + PBL's voor elke transgene reporter werd berekend voor ofwel alle oprichters die GFP tot expressie brengen (zwarte balk) of alle oprichters (grijze balk). De specificiteit van het celtype van elke reporter is rechts afgebeeld. (C) De MFI van GFP + PBL's van B-P-GFP-D, B-P-GFP-D-I, en B-P-GFP-D-III transgene lijnen werden berekend voor elke grondlegger (grijze diamanten). Grijze lijnen geven de gemiddelde MFI onder alle oprichters aan en zwarte lijnen geven de gemiddelde MFI aan onder de oprichters die GFP tot expressie brengen. (D) Lineage-specifieke GFP-expressie in de PBL's van B-P-GFP-D, B-P-GFP-DI, en B-P-GFP-DIII-oprichters. Het gemiddelde percentage GFP+-cellen in B-cellen (B), T-cellen (T) en myeloïde cellen (My) van perifeer bloed wordt weergegeven. De significantie in het verschil in expressie tussen GFP-reporters werd beoordeeld door Student t toets *P < 5 × 10 −2 **P < 5 × 10 −3 . Foutbalken (standaarddeviatie) geven variatie aan van GFP-expressie tussen de verschillende grondleggers die door elke op versterker gebaseerde reporter zijn gemaakt.

Beide subdomeinen van de versterker genereerden een groot aantal tot expressie brengende oprichterlijnen die vergelijkbaar waren met die van de intacte versterker D (Figuur 5B). Binnen de tot expressie brengende populaties was de reportervariatie echter groter in vergelijking met die van de intacte enhancer. Gemiddeld bracht 42% van de PBL's van de D-stichterlijnen GFP tot expressie, maar slechts 27% of 15% van de PBL van de DI- of DIII-stichters brachten respectievelijk GFP tot expressie (Figuur 5B aanvullende tabel 2).

Het niveau van reporterexpressie ondersteund door de 2 enhancer D-subdomeinen verschilde sterk, die door DIII was veel lager in vergelijking met DI of met de intacte ouderlijke enhancer (Figuur 5C-D MFI: 512 vs 1282 of 512 vs 1567). Expressie ondersteund door DI was vergelijkbaar met die van de intacte versterker (Figuur 5C MFI: 1282 vs 1567). Bovendien was DI maar niet DIII in staat om expressie te verlenen in een substantiële fractie van T-cellen (Figuur 5B, D aanvullende Figuur 4 aanvullende Tabel 2). Volgens deze criteria had de DI-subregio vergelijkbare transcriptionele en celtype-specifieke eigenschappen als de versterker van volledige lengte D.

Combinatie van Ikzf1 versterkers fungeren als locus control-regio

Wanneer afzonderlijk getest, de Ikzf1 versterkers waren in staat tot merkbare maar niet volledige verlichting van PEV op reporterexpressie (Figuur 2). Dit suggereert dat de gecombineerde versterkeractiviteiten, zoals aangetroffen in de Ikzf1 locus, zijn vereist voor een juiste Ikaros-expressie in lymfo-myeloïde cellen.

Om deze hypothese te testen, hebben we een transgene reporter gegenereerd die de meeste van deze elementen combineerde, met behoud van hun oriëntatie zoals in de endogene locus (Ikaros mini-regulerende locus [Ik-MC2] Figuur 6A). Acht van de 11 transgen-positieve oprichters vertoonden GFP-reporterexpressie in bijna 100% van de B-cellen, T-cellen en myeloïde cellen in PBL's (Figuur 6B). De 3 grondleggers met lage reporterexpressie kunnen te wijten zijn aan de integratie van een onvolledige transgene reporter in het genoom. Zo kan de gecombineerde activiteit van regulerende elementen die aanwezig zijn in de Ik-MC2-cassette PEV tegengaan en zorgen voor een endogeen Ikaros-achtig expressiepatroon in PBL's (Figuur 6B).

Gecombineerde activiteit van Ikzf1 regulerende elementen in lymfo-myeloïde en neuronale cellen. (A) Diagram van het Ik-MC2-construct. (B) GFP-reporterexpressie in PBL-subsets van de oprichterslijnen van Ik-MC2. Het percentage GFP + myeloïde cellen (grijze staven), T-cellen (zwarte staven) en B-cellen (witte staven) werd voor elke stamlijn bepaald door middel van fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) analyse. (C) GFP-expressie in de HSC-verrijkte (LSK) en erythro-myeloïde (LK-Lin - c-Kit + Sca-1 -) voorlopercellen van het beenmerg. CD34 en Flt3 expressie in LSK en LK GFP hoge (hi) en lage (lo) subsets worden getoond. Dunne lijn histogram vertegenwoordigt FACS kleuring van een reporter of marker negatieve controle. (D) Zijaanzicht van GFP-expressie in de P0-hersenen in de hele berg. De omtrek van de hersenen wordt weergegeven als een witte lijn. Heldere GFP-expressie wordt waargenomen in de basale ganglia. Onder deze omstandigheden werd geen fluorescentie waargenomen in wildtype-controles. Beugels markeren het geschatte vlak van het frontale gedeelte dat wordt weergegeven in paneel E. (E) Schematische weergave van het gedeelte met vermelding van de cortex (COR), caudate putamen (CP) en septum (S) en het gebied dat wordt weergegeven op de foto (vak) . GFP-expressie wordt waargenomen in het caudate putamen. Met uitzondering van verspreide cellen elders, wordt GFP niet waargenomen in omringend weefsel.

Gecombineerde activiteit van Ikzf1 regulerende elementen in lymfo-myeloïde en neuronale cellen. (A) Diagram van het Ik-MC2-construct. (B) GFP-reporterexpressie in PBL-subsets van de oprichterslijnen van Ik-MC2. Het percentage GFP + myeloïde cellen (grijze staven), T-cellen (zwarte staven) en B-cellen (witte staven) werd voor elke stamlijn bepaald door middel van fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) analyse. (C) GFP-expressie in de HSC-verrijkte (LSK) en erythro-myeloïde (LK-Lin - c-Kit + Sca-1 -) voorlopercellen van het beenmerg. CD34 en Flt3 expressie in LSK en LK GFP hoge (hi) en lage (lo) subsets worden getoond. Dunne lijn histogram vertegenwoordigt FACS kleuring van een reporter of marker negatieve controle. (D) Zijaanzicht van GFP-expressie in de P0-hersenen in de hele berg. De omtrek van de hersenen wordt weergegeven als een witte lijn. Heldere GFP-expressie wordt waargenomen in de basale ganglia. Onder deze omstandigheden werd geen fluorescentie waargenomen in wildtype-controles. Beugels markeren het geschatte vlak van het frontale gedeelte dat wordt weergegeven in paneel E. (E) Schematische weergave van het gedeelte met vermelding van de cortex (COR), caudate putamen (CP) en septum (S) en het gebied dat wordt weergegeven op de foto (vak) . GFP-expressie wordt waargenomen in het caudate putamen. Met uitzondering van verspreide cellen elders, wordt GFP niet waargenomen in omringend weefsel.

We evalueerden ook het expressieprofiel van de Ik-MC2-cassette in de HSC's en in vroege afstammingsbeperkte voorlopers. Dit leek erg op wat eerder is beschreven voor de enhancer D-bevattende reporters (Figuur 3C B-P-GFP-D en B-P-GFP-C). 4 De bimodale expressie van de GFP-reporter ondersteund door de Ik-MC2-cassette scheidde de LMPP van de multipotente HSC (Figuur 6C LSK Flt3++: GFP hi van LSK Flt3 neg–lo: GFPlo). Het scheidde ook granulocyt-macrofaagvoorlopers van megakaryocyt-erytrocytvoorlopers in een gemengde erytro-myeloïde voorlopercellenpopulatie (Figuur 6C LK CD34+: GFP hi van LK CD34 neg-lo: GFP+). 4

Ikzf1 komt ook tot uiting in het zich ontwikkelende striatum, 27,28 waar het een rol kan spelen in de neurale progenitorfunctie. 29,30 In tegenstelling tot versterker D of andere Ikzf1 versterkers die afzonderlijk werden getest, ondersteunden hun gecombineerde activiteit GFP-expressie in het striatum (Figuur 6D-E). Secties door dit gebied van de hersenen onthulden expressie in het caudate putamen vergelijkbaar met die vertoond door het endogene Ikzf1 locus (Figuur 6D-E).

Dus de combinatie van 9 van 10 van de Ikzf1 geconserveerde regio's (J, B, p, D, E, F, G, H en I) in een miniregulerende locus zorgden voor genexpressie in cellen van de lymfo-myeloïde en neuronale lijn op een manier die leek op de celtypespecificiteit van de endogeen Ikzf1 locus en dat werd niet beïnvloed door lokale chromatine-silencing-effecten.

Netwerk van transcriptiefactoren die reguleren Ikzf1 uitdrukking

Om inzicht te krijgen in de transcriptiefactoren die betrokken zijn bij: Ikzf1 regulatie, werd motiefonderzoek naar transcriptiefactorbindingsplaatsen bij versterkers D en H uitgevoerd. Enhancer D was specifiek verrijkt met bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren die tot expressie worden gebracht in vroege hematopoëtische voorlopers zoals Runx (Runx1-3), Homeobox A9 (Hoxa9), speciaal AT-rijk sequentiebindend eiwit 1 (Satb1), interferonregulerende factoren (Irf1, Irf4), CCAAT/enhancer bindende eiwitten (Cebpa, Cepbb), en myocyten-enhancer factor 2C (Mef2c) (Figuur 7B aanvullende tabel 7D-H). Deze vroege lymfo-myeloïde transcriptiefactorbindingsplaatsen waren niet aanwezig in enhancer H. Desalniettemin waren er verschillende gedeelde factorbindingsplaatsen voor transcriptiefactoren met eerder gerapporteerde activiteit in T-cellen aanwezig in enhancers D en H, zoals E2A (Tcf3), Ets-1 (Ets1), Tal-1 (Tal1), en Ikaros (Ikzf1) (aanvullende tabel 7D, H Figuur 7B). Verdere dissectie van D in de DI- en DIII-subregio's leverde onafhankelijk bewijs dat de progenitor- en T-celspecifieke activiteiten van enhancer D zich in de DI-subregio bevonden (aanvullende tabel 7DI-DIII figuur 7B).

Netwerk van targeting op transcriptiefactoren Ikzf1 versterkers. (A) TF-verrijkingspieken bij de Ikzf1 locus in thymocyten (T-cellen), CH12 (B-cellen) en erythoïde voorlopers werden gevisualiseerd door de IGV-browser. Een samenvatting van regelgevende activiteiten wordt gegeven boven de respectieve versterkerregio's op de: Ikzf1 plaats. (BC) Een model van Ikzf1 regulatie. (B) Ikzf1 versterker-promotor interacties tijdens hematopoëse. Erytroïde-specifieke factoren die binden aan enhancer G maken interacties mogelijk met de myeloïde-specifieke promoter A en Ikaros-expressie tijdens vroege erytropoëse. Lymfo-myeloïde-specifieke factoren die binden aan versterkers D en H ondersteunen interacties met de lymfo-myeloïde-specifieke promotor B en Ikaros-expressie tijdens lymfoïde en myeloïde differentiatie. Afstammingsspecifieke transcriptiefactoren op deze plaatsen worden weergegeven als kleurgecodeerde cirkels. Pijlen geven mogelijke interacties aan tussen celtypespecifieke versterkers en promotors die Ikzf1 expressie in de juiste ontwikkelingsstadia. (C) Ikzf1 activiteit van de regulerende regio tijdens lymfopoëse. De Ikzf1 lymfo-myeloïde promotor B, hoewel actief vanuit de HSC's via B-cel en myeloïde differentiatie, vereist input van een versterker om de beperkende chromatine-effecten en PEV (gele cirkel) te overwinnen. Enhancers J, D(C), E, ​​F, H en I gaan PEV tegen en verhogen Ikzf1 genexpressie (oranje cirkel). Voor Ikzf1 expressie voorbij het DN-stadium van T-celontwikkeling, is input vereist van versterkers D(C) (blauw) en H (groen). Inductie van Ikzf1 expressie in het LMPP tot het niveau dat nodig is voor differentiatie van lymfocyten is afhankelijk van de activiteit van enhancer D(C) (blauw).

Netwerk van targeting op transcriptiefactoren Ikzf1 versterkers. (A) TF-verrijkingspieken bij de Ikzf1 locus in thymocyten (T-cellen), CH12 (B-cellen) en erythoïde voorlopers werden gevisualiseerd door de IGV-browser. Een samenvatting van regelgevende activiteiten wordt gegeven boven de respectieve versterkerregio's op de: Ikzf1 plaats. (BC) Een model van Ikzf1 regulatie. (B) Ikzf1 versterker-promotor interacties tijdens hematopoëse. Erytroïde-specifieke factoren die binden aan versterker G maken interacties mogelijk met de myeloïde-specifieke promotor A en Ikaros-expressie tijdens vroege erytropoëse. Lymfo-myeloïde-specifieke factoren die binden aan versterkers D en H ondersteunen interacties met de lymfo-myeloïde-specifieke promotor B en Ikaros-expressie tijdens lymfoïde en myeloïde differentiatie. Afstammingsspecifieke transcriptiefactoren op deze plaatsen worden weergegeven als kleurgecodeerde cirkels. Pijlen geven mogelijke interacties aan tussen celtypespecifieke versterkers en promotors die Ikzf1 expressie in de juiste ontwikkelingsstadia. (C) Ikzf1 activiteit van de regulerende regio tijdens lymfopoëse. De Ikzf1 lymfo-myeloïde promotor B, hoewel actief vanuit de HSC's via B-cel en myeloïde differentiatie, vereist input van een versterker om de beperkende chromatine-effecten en PEV (gele cirkel) te overwinnen. Enhancers J, D(C), E, ​​F, H en I gaan PEV tegen en verhogen Ikzf1 genexpressie (oranje cirkel). Voor Ikzf1 expressie voorbij het DN-stadium van T-celontwikkeling, is input vereist van versterkers D(C) (blauw) en H (groen). Inductie van Ikzf1 expressie in het LMPP tot het niveau dat nodig is voor differentiatie van lymfocyten is afhankelijk van de activiteit van enhancer D(C) (blauw).

Transcriptiefactoren met vermeende bindingsplaatsen in de Ikzf1 regelgevende elementen werden verder geëvalueerd door analyse van ChIP-seq-gegevens aan de Ikzf1 locus 17,19,31 (Figuur 7A). Veel van de baanbrekende factoren van de lymfoïde lijn, zoals Ikaros, HEB, Runx1 en TCF-1, bonden op meerdere locaties in de Ikzf1 plaats. Enhancer D ondersteunde een sterke verrijking van een groot aantal transcriptiefactoren die tot expressie werden gebracht van de vroege tot de latere stadia van lymfoïde differentiatie (E-box/HEB, Runx1, TCF-1, Ets-1, c-Myc), consistent met de brede activiteit van de enhancer van de vroege voorlopers tot latere stadia in de differentiatie van lymfocyten en de sleutelrol ervan in de Ikzf1 regulatie. Interessant is dat de naburige versterker E een vergelijkbare verrijking van transcriptiefactoren vertoonde als D, hoewel de in vivo activiteit ervan beperkter was. De H-enhancer met alleen activiteit in T-cellen had een beperkt repertoire van transcriptiefactoren, waaronder Ikaros, TCF-1, Ets-1 en c-Myc. Ten slotte bonden alle lymfoïde-bevorderende transcriptiefactoren aan de lymfo-myeloïde promotor B, terwijl binding van de erytroïde-specifieke transcriptiefactor GATA-1 werd gedetecteerd in de buurt van de myeloïde-specifieke promotor A, die specifiek werd gemarkeerd door H3K4me3 en H3K9Ac in erytroïde voorlopers. Analyse van erytroïde transcriptiefactor zoals GATA-1, GATA-2 en SCL/Tal-1 (Tal1) identificeerde verrijking in F- en G-regio's in de buurt van H3K9Ac, wat suggereert dat dit versterkers kunnen zijn die verantwoordelijk zijn voor het ondersteunen van Ikaros-expressie in erytroïde voorlopers. (Figuur 7A-B).


INVOERING

De inherente neiging van guanines om zichzelf te associëren onder vorming van vierstrengige spiraalvormige structuren is bekend sinds het begin van de jaren zestig (1). Vervolgens werd aangetoond dat de geconserveerde DNA-sequentieherhalingen van telomeren G-quadruplex (of G4) structuren vormen in vitro (2, 3). Sindsdien hebben talrijke biochemische en structurele analyses vastgesteld dat nucleïnezuursequenties, zowel DNA als RNA, die runs van guanines (G-kanalen) bevatten, gescheiden door andere basen, spontaan vouwen in G-quadruplexstructuren in vitro. De bouwstenen van G-quadruplexen zijn G-kwartetten die worden gevormd door een cyclische Hoogsten-waterstofbindingsrangschikking van vier guanines met elkaar. De vlakke G-kwartetten stapelen zich op elkaar en vormen vierstrengige spiraalvormige structuren. De vorming van G-quadruplex wordt aangedreven door monovalente kationen zoals Na + en K +, en daarom bevorderen fysiologische bufferomstandigheden hun vorming (Figuur 1A).

Structuur van G-quadruplexen. G-quadruplexen vorm in vitro in DNA- of RNA-sequenties die stukken van drie tot vier guanine bevatten. (EEN) De bouwstenen van G-quadruplexen zijn G-kwartetten die ontstaan ​​door de associatie van vier guanines tot een cyclische opstelling die wordt gestabiliseerd door Hoogsten-waterstofbinding (N1-N6 en N2-N7). De vlakke G-kwartetten stapelen zich op elkaar en vormen vierstrengige spiraalvormige structuren. De vorming van G-quadruplex wordt aangedreven door eenwaardige kationen zoals Na+ en K+. (B) G-quadruplex-structuren zijn polymorf en kunnen worden onderverdeeld in verschillende families, zoals bijvoorbeeld parallel of antiparallel volgens de oriëntatie van de strengen en kunnen inter- of intramoleculair worden gevouwen. Het type structuur hangt af van het aantal G-kanalen in een streng.

Structuur van G-quadruplexen. G-quadruplexen vorm in vitro in DNA- of RNA-sequenties die stukken van drie tot vier guanine bevatten. (EEN) De bouwstenen van G-quadruplexen zijn G-kwartetten die ontstaan ​​door de associatie van vier guanines tot een cyclische opstelling die wordt gestabiliseerd door Hoogsten-waterstofbinding (N1-N6 en N2-N7). De vlakke G-kwartetten stapelen zich op elkaar en vormen vierstrengige spiraalvormige structuren. De vorming van G-quadruplex wordt aangedreven door eenwaardige kationen zoals Na+ en K+. (B) G-quadruplex-structuren zijn polymorf en kunnen worden onderverdeeld in verschillende families, zoals bijvoorbeeld parallel of antiparallel volgens de oriëntatie van de strengen en kunnen inter- of intramoleculair worden gevouwen. Het type structuur hangt af van het aantal G-kanalen in een streng.

G-quadruplex-structuren zijn topologisch zeer polymorf en kunnen ontstaan ​​door de intra- of intermoleculaire vouwing van G-rijke strengen. Intramoleculaire vouwing vereist de aanwezigheid van vier of meer G-kanalen in één streng, terwijl intermoleculaire vouwing kan ontstaan ​​uit twee of vier strengen die aanleiding geven tot parallelle of antiparallelle structuren, afhankelijk van de oriëntatie van de strengen in een G-quadruplex ( 4, 5) (Figuur 1B). Kennis van de precieze 3D-structuur (6) is belangrijk voor het ontwerp van G-quadruplex-stabiliserende liganden die worden gebruikt voor het onderzoeken van de gevolgen van G-quadruplex-stabilisatie op processen zoals DNA-replicatie en gentranscriptie, en als geneesmiddelen tegen kanker om zich op G-quadruplexen te richten in de promotors van oncogenen en bij telomeren (7). De thermische stabiliteit van G-quadruplexen is afhankelijk van kenmerken zoals het aantal G-kwartetten dat aanwezig is in de structuur en de lengte en samenstelling van de lussen gevormd door niet-guaninebasen (8, 9). De thermische stabiliteit van een G-quadruplex in vitro correleert mogelijk niet met zijn in vivo uitwerking (11). In vitro veel G-quadruplex-DNA-structuren zijn, eenmaal gevormd, thermodynamisch stabieler dan dubbelstrengs DNA en wat belangrijk is voor de biologische functie, is dat hun ontvouwingskinetiek veel langzamer is dan die van DNA- of RNA-haarspeldstructuren (10). Over het algemeen is het daarom waarschijnlijk dat G-quadruplex-structuren het DNA- en RNA-metabolisme belemmeren en daarom moet hun vorming worden gereguleerd. In de afgelopen jaren is het steeds directere bewijs voor de aanwezigheid van G-quadruplexen in vivo, en de identificatie van eiwitten die specifiek het vouwen en ontvouwen van G-quadruplex reguleren, is begonnen inzicht te geven in het voorkomen en functioneren van G-quadruplex.

Potentiële G-quadruplexen in het menselijk genoom

Computationele analyses van het zoeken naar het menselijk genoom met de consensussequentie (G3+N1–7G3+N1–7G3+N1–7G3+) onthulde dat het meer dan 300.000 sequenties bevat die het potentieel hebben om G-quadruplexen (pG4 of PQS) te vormen (12). Dit is waarschijnlijk een te grote simplificatie, aangezien niet-consensussequenties G-quadruplexen kunnen vormen ( 13), evenals een onderschatting omdat lange reeksen herhaalde DNA-sequenties ontbreken in de beschikbare sequentiedatabase (S. Schuster, persoonlijke mededeling). Veelbetekenend werd gevonden dat de lokalisatie van pG4s niet-willekeurig is: pG4 colokaliseert met functionele regio's van het genoom en is bovendien sterk geconserveerd tussen verschillende soorten (8), wat wijst op een selectiedruk om dergelijke sequenties op specifieke genomische locaties te behouden. Deze instandhouding is het hoogst bij zoogdiersoorten en neemt af bij niet-zoogdiersoorten en lagere organismen (14). Ten slotte zijn pG4's ook aanwezig in bacteriën (15) en menselijke RNA- en DNA-virussen (16-18).

De hoogste abundantie van pG4's is bij telomeren, die bij mensen bestaan ​​​​uit 5 tot 10.000 bp van de tandemly gerangschikte TTAGGG-herhaling. Ze zijn ook sterk verrijkt met genpromotors, op de grens tussen introns en exons en recombinatie van de doel-immunoglobuline-genklasseschakelaar (9). Het meest interessante is dat onlangs is gebleken dat 90% van de oorsprong van de menselijke DNA-replicatie pG4-motieven bevat, en in hogere dichtheden in de buurt van de oorsprong die vaak wordt gebruikt (19-21) (Figuur 2A-C). Genoombrede analyse van DNA-breekpunten bij verschillende kankertypes toont een significante verrijking in pG4's in de buurt van somatische kopie-aantalveranderingen (22), evenals dat telomeren de favoriete doelen zijn van aanhoudende DNA-schaderespons bij veroudering (23). Er is ook gevonden dat in ongeveer 3000 menselijke genen pG4's aanwezig zijn in het gebied dat de 5'-UTR van de gecodeerde mRNA's specificeert en translatie kan onderdrukken (Figuur 2D) (24, 25). De lange G-rijke RNA-transcripten van telomeer DNA, TERRA, zijn ook rijk aan pG4's (26). Al deze waarnemingen van de geconserveerde aanwezigheid van pG4's in belangrijke genomische regio's suggereren dat ze een regulerende rol spelen door hun vermogen om G-quadruplex-structuren te vormen. Of alle, of een subset van pG4's die aanwezig zijn in genomen een in vivo functie moet nog worden vastgesteld.

Mogelijke locaties van G-quadruplex-structuren in cellen. Genoombrede zoekopdrachten hebben de locatie onthuld van G-rijke regio's met G-quadruplex vormend potentieel (pG4). pG4's zijn niet willekeurig verdeeld in het genoom en promotors en telomeren zijn bijzonder verrijkt in deze sequenties. In de kern kan G-quadruplexvorming optreden in dubbelstrengs G-rijke gebieden wanneer DNA tijdelijk enkelstrengs wordt, tijdens (EEN) transcriptie en (C) replicatie en (B) bij de enkelstrengs telomere G-rijke overhangen. Buiten de kern kunnen G-quadruplexen zich ook vormen in mRNA en (NS) zijn betrokken bij translationele controle. Rode T-balken geven belemmeringen voor transcriptie, replicatie en translatie aan.

Mogelijke locaties van G-quadruplex-structuren in cellen. Genoombrede zoekopdrachten hebben de locatie onthuld van G-rijke regio's met G-quadruplex vormend potentieel (pG4). pG4's zijn niet willekeurig verdeeld in het genoom en promotors en telomeren zijn bijzonder verrijkt in deze sequenties. In de kern kan G-quadruplexvorming optreden in dubbelstrengs G-rijke gebieden wanneer DNA tijdelijk enkelstrengs wordt, tijdens (EEN) transcriptie en (C) replicatie en (B) bij de enkelstrengs telomere G-rijke overhangen. Buiten de kern kunnen G-quadruplexen zich ook vormen in mRNA en (NS) zijn betrokken bij translationele controle. Rode T-balken geven belemmeringen voor transcriptie, replicatie en translatie aan.

Voor biologie is de belangrijke vraag of, waar en wanneer de in kaart gebrachte pG4's G-quadruplex-structuren vormen? in vivo. Genomisch DNA is voornamelijk dubbelstrengs en wordt gestabiliseerd door te worden verpakt in chromatine. Twee uitzonderingen zijn de uiteinden van de lineaire eukaryote chromosomen die het geconserveerde kenmerk hebben dat ze eindigen in een enkelstrengs G-overhang en in mRNA. In dubbelstrengs DNA ontstaat de mogelijkheid om G-quadruplexen te vormen tijdens DNA-replicatie, transcriptie en reparatie wanneer DNA tijdelijk enkelstrengs wordt gemaakt door het verbreken van de Watson-Crick-basenparing, wat de alternatieve Hoogsteen-basenparing in G-quadruplexen mogelijk zou maken plaatsvinden ( 27, 28) (Figuur 2). Inderdaad, in opkomst in vivo waarnemingen zijn consistent met de vorming en resolutie van G-quadruplex die een regulerende rol spelen in deze routes (zie hieronder). Bovendien kan worden overwogen dat de vorming van G-quadruplex kan worden bevorderd door superhelische stress, moleculaire crowding (29) en specifieke G-quadruplex-bindende eiwitten (30). Bovendien is er, in tegenstelling tot het Watson-Crick-basenparingdogma, gevonden dat Hoogsteen-basenparen zich tijdelijk vormen in canoniek dubbelstrengs DNA (31), wat suggereert dat G-quadruplexvorming niet noodzakelijk het voorafgaande smelten van de dubbele DNA-helix door bijvoorbeeld DNA-replicatie.

Een doorbraak bij het vaststellen van de aanwezigheid en locatie van G-quadruplexen in vivo kwam meer dan tien jaar geleden voort uit de ontwikkeling van specifieke antilichamen gericht tegen telomische DNA G-quadruplexen. Dit maakte de eerste directe visualisatie mogelijk door ter plaatse immunokleuring in de micronuclei van de ciliaat Stylonychia lemnae ( 32). Later werd een G-quadruplex-antilichaam gebruikt om de locatie van dergelijke structuren in menselijk genomisch DNA in kaart te brengen met behulp van immunoprecipitatie, gevolgd door diepe sequentiebepaling van de geselecteerde DNA-fragmenten (33). Deze studie onthulde hun aanwezigheid op meerdere genomische locaties: in genpromotors en zowel 5'- als 3'-onvertaalde regio's (UTR's), wat een rol suggereert bij zowel transcriptionele initiatie als terminatie, in introns en in subtelomere regio's. Opgemerkt moet worden dat de immunoprecipitatie van de G-quadruplex-structuren werd uitgevoerd met geïsoleerd en gefragmenteerd DNA, dus het kan niet worden uitgesloten dat G-quadruplex-vorming tijdens de analyse plaatsvond. Een andere benadering om het genoom van G-quadruplexen te identificeren, was door het G-quadruplex-interagerende geneesmiddel pyridostatine te gebruiken, wat leidt tot replicatie en transcriptie-afhankelijke DNA-schade. Chromatine-immunoprecipitatie met een antilichaam gericht tegen de DNA-schademarker histon gamma H2AX identificeerde genen verrijkt in pG4s (34). Aangezien deze waarnemingen consistent zijn met het feit dat G-quadruplexen betrokken zijn bij verschillende biologische processen, is de verwachting dat de vorming van G-quadruplex dynamisch en gereguleerd is, en daarom kan hun distributie verschillen in verschillend gedifferentieerde cellen. Daarom zou het van groot belang zijn om het voorkomen van G-quadruplexen in cellen met verschillende transcriptionele repertoires in kaart te brengen.

Regulering van de vorming van G-quadruplex

Een essentiële overweging voor de mogelijke deelname van G-quadruplexen in de biologie is de kinetiek van vorming (vouwen) en resolutie (ontvouwen). Zoals te verwachten was, stapelt experimenteel bewijs zich op voor de rol van eiwitchaperones en helicases bij de regulatie van respectievelijk vouwen en ontvouwen. De vouwkinetiek van G-quadruplexen die sequenties vormen, is sequentieafhankelijk en varieert van ms tot minuten. Voor sequenties die zeer snel vouwen, zoals menselijke telomere herhalingen, ligt de tijdschaal van vouwen in het bereik van die van DNA-replicatie (35). Voor anderen kan de kinetiek van de vorming van G-quadruplex drastisch worden verhoogd door eiwitchaperones (36). Veel van het beschikbare bewijs voor de rol van chaperonnes komt van: in vitro studies en de meeste van de geïdentificeerde eiwitten functioneren bij telomeren: de S. cerevisiae twee decennia geleden werd aangetoond dat telomeer dubbelstrengs bindend eiwit Rap1 de vorming van G-quadruplex bevordert (37): net als de regulerende subeenheid van gisttelomerase Est1 (38): en het menselijke telomere bindende eiwit TRF2 is betrokken bij zowel DNA als RNA (TERRA) G-quadruplex binding ( 39). Overtuigend in vivo het bewijs is begonnen naar voren te komen: de in vitro waarneming dat ciliaat telomeer-eindbindend eiwit TEBPβ de vorming van G-quadruplexen met 10 5 – 6 keer verhoogt (36) is bevestigd door in vivo experimenten die aantonen dat TEBPβ de vorming van G-quadruplex bij telomeren reguleert op een celcyclusafhankelijke manier (40). De menselijke DNA-mismatch-herkenningsfactor MutSα bindt aan G-quadruplexen en bevordert de synapsis van transcriptioneel geactiveerde immunoglobuline-schakelregio's (41). Van bijzonder belang, suggereren recente studies dat nucleofosmine (NPM1) interageert met verschillende G-quadruplex-regio's in ribosomaal DNA, beide in vitro en in vivo. NPM1 is een overvloedig nucleolair eiwit dat betrokken is bij rijping en export van ribosoom en is het meest gemuteerde gen bij acute myeloïde leukemie (42). Aanzienlijk nucleoline, (NCL) een essentieel nucleolair fosfoproteïne waarvoor er oude in vitro bewijs dat het DNA G-quadruplexen met hoge affiniteit bindt ( 43), bleek zeer recentelijk specifiek op een conformatie-afhankelijke manier te worden gesekwestreerd door G-quadruplexen die aanwezig zijn in afgebroken RNA-transcripten die voortkomen uit de expansie van de hexanucleotide-herhaling (GGGGCC)n ( Figuur 4B). Dit leidde tot nucleolaire stress en verstoringen in de RNA-verwerking, waardoor een moleculaire cascade op gang kwam die resulteerde in een type neurodegeneratieve aandoening (44).

Bewijs dat gespecialiseerde helicasen betrokken zijn bij het afwikkelen van DNA- of RNA-G-quadruplexen stapelt zich nu op. Helicases zijn een grote familie van ATP-afhankelijke nucleïnezuurafwikkelende enzymen die een belangrijke rol spelen bij het onderhoud van het genoom. Belangrijk is dat functieverliesmutaties in een afzonderlijke familie van DNA-helicases die zijn gekoppeld aan verschillende kankers en genetische aandoeningen, hebben gezorgd voor een directe link tussen pG4-sequenties en genoominstabiliteit. Het blijkt dat G-quadruplex-helicases een belangrijke rol spelen bij DNA-replicatie en telomeeronderhoud (zie hieronder) (45). De menselijke helicases WRN en BLM en S. cerevisiae Sgs1 zijn betrokken bij het onderhoud van telomeer en hebben G-quadruplex-afwikkelende activiteit in vitro en bevatten een geconserveerd RQC-domein dat G-quadruplexen met hoge affiniteit bindt (30). Mutaties in WRN veroorzaken respectievelijk het Werner-syndroom en mutaties in BLM het Blooms-syndroom, die respectievelijk leiden tot vroegtijdige veroudering (progeria bij volwassenen) en een verhoogd risico op kanker. De integriteit van de C. elegans Het DOG-1-gen (deletie van guanine-rijk DNA) is cruciaal voor de stabiliteit van G-kanalen in het genoom (46). Bovendien is de introductie van een DNA-sequentie die G-quadruplexen vormt in vitro was zeer mutageen en werd verwijderd uit genomen zonder DOG-1 (47). Studies over de FANCJ-helicase van zoogdieren, de ortholoog van de C. elegans DOG-1 helicase, versterken deze bevindingen. De FANCJ-helicase is geassocieerd met de erfelijke kankergevoeligheidsstoornis Fanconi-anemie. Cellijnen van patiënten zonder FANCJ accumuleren grote genomische DNA-deleties die in kaart worden gebracht op pG4s (48). De demonstratie dat FANCJ bij voorkeur G-quadruplexen afwikkelt boven andere DNA-substraten in vitro suggereerde dat de FANCJ-helicase, net als DOG-1, functioneert bij het oplossen van potentiële replicatiebelemmeringen veroorzaakt door DNA G-quadruplexen (48). Mutaties in de DNA-helicaseregulator van zoogdieren met telomeerlengte RETL1 geven een verhoogde gevoeligheid voor bepaalde soorten kanker (49). Vanwege de gelijkenis met het menselijke FANCJ en de C. elegantie DOG-1-helicases, en vanwege de waargenomen toename in telomeerfragiliteit door behandeling met de G-quadruplex-stabiliserende verbinding TMPyP4, was RETL1 betrokken bij het afwikkelen van G-quadruplex (50). Direct biochemisch bewijs voor deze activiteit ontbreekt echter. Studies over de PIF1-DNA-helicasefamilie, die is geconserveerd van bacteriën tot de mens, leveren sterk bewijs voor een krachtige G-quadruplex-afwikkelingsactiviteit in vitro ( 51). Een genoombrede chromatine-immunoprecipitatie van de S. cerevisiae Pif1 onthulde pG4's op een belangrijke subset van Pif1-bindingsplaatsen en dat dergelijke plaatsen in Pif1-deficiënte cellen vatbaar zijn voor DNA-dubbelstrengsbreuken (52-54). De menselijke PIF1 lijkt ook in te werken op pG4s (34). Het komt ook naar voren dat in de afwezigheid van G-quadruplex-helicases, een aantal nucleasen werken om G-quadruplexen te verwerken, wat leidt tot deleties van het G-kanaal. Van nucleasen zoals de gist Kem1 (55) en menselijk FEN1, EXO1 en DNA2 is bekend dat ze G-quadruplexen splitsen in vitro ( 56). EXO1 en FEN1 spelen een rol bij DNA-replicatie en zijn betrokken bij telomeeronderhoud. Uitputting van deze nucleasen veroorzaakt telomeerdisfunctie (57, 58). Bovendien is aangetoond dat het enkelstrengige bindingsreplicatie-eiwit RPA, dat een belangrijke rol speelt bij het onderhoud van telomeer, helpt bij het ontvouwen van G-quadruplexen door het evenwicht te verschuiven van een gevouwen naar een ongevouwen toestand (59).

Voor RNA G-quadruplexen komt overtuigend bewijs voor hun verwerking tot enkelstrengs RNA van de identificatie en karakterisering van de ATP-afhankelijke humane RNA-helicase RHAU (60, 61). RHAU is een DEAH-box-helicase die G4-RNA (en G4-DNA) bindende en oplossende activiteit vertoont. RNA-immunoprecipitatie (RIP)-chipanalyse identificeerde ongeveer 100 RNA's geassocieerd met RHAU in vivo en de meerderheid bevatte pG4s-sequenties. Eén doelwit is de menselijke telomerase-RNA-TER en binding van RHAU hangt af van de aanwezigheid van een stabiele G4-structuur in het 5'-gebied van TER, beide in vivo en in vitro ( 62). De functionele gevolgen van knockdown van RHAU zijn verminderde telomerase-assemblage en veranderingen in telomeerlengte (63). Deze gegevens leveren sterk bewijs dat er eiwitten zijn die de resolutie van G-quadruplexen direct reguleren, of helemaal verwijderen, om te voorkomen dat de replicatievork vastloopt en DNA-breuk en RNA-vouwing optreedt.

De positieve rol van DNA- en RNA-G-quadruplex-structuren in de biologie is minder goed gedocumenteerd. Naast hun rol bij het specificeren van de oorsprong van DNA-replicatie van metazoa en bij telomeren (hieronder besproken), komt het naar voren dat G-quadruplexen kunnen worden uitgebuit als DNA-recombinatieplaatsen. Studies in een gram-negatieve bacterie hebben aangetoond dat een G-quadruplex nodig is om te dienen als de startplaats van de recombinatie in vivo en is vereist voor antigeenvariabiliteit van piline (64, 65).

G-quadruplexen bij telomeren

De tandemorganisatie van G-rijke telomere DNA-herhalingen is bijna universeel geconserveerd in eukaryoten en dergelijke sequenties staan ​​bekend om het vormen van G-quadruplexen in vitro. direct in vivo bewijs voor de aanwezigheid van G-quadruplexen bij telomeren kwam meer dan 10 jaar geleden voor het eerst uit onderzoeken met zeer specifieke antilichamen gericht tegen G-quadruplexen (32, 66). Deze studies toonden aan dat een antiparallelle intermoleculaire G-quadruplex-structuur wordt gevormd op de macronucleaire telomeren van Stylonychia, en belangrijker dat de G-quadruplex-structuur wordt opgelost tijdens DNA-replicatie, wat suggereert dat G-quadruplexen kunnen fungeren als een telomere capping-structuur (Figuur 3A en B). De waarneming dat de ontvouwing van G-quadruplex wordt gereguleerd door een celcyclusafhankelijke fosforylering van het telomere uiteinde-bindende eiwit TEBPβ en een telomerase-geassocieerde RecQ-achtige helicase (64, 67, 68, 30), verschafte een belangrijk mechanistisch inzicht in de ruimtelijke en temporele regulatie van het vouwen en ontvouwen van G-quadruplex om indien nodig telomeersynthese door de telomerase mogelijk te maken.

G-quadruplexen bij telomeren. De G-rijke overhang van telomeren kan G-quadruplex-structuren vormen die betrokken zijn bij telomere eindbescherming en telomeer DNA-metabolisme. (EEN) De lange menselijke G-rijke overhang kan strengen vormen die intramoleculair gevouwen G-quadruplexen vormen die eindbescherming kunnen bieden tegen nucleasen of de telomerase-activiteit reguleren. (B) Ciliate-telomeren vormen intermoleculaire G-quadruplex-structuren waarbij twee telomeren betrokken zijn die worden gepromoot door het telomeer-end bindende eiwit TEBPβ. Telomeren zijn gehecht aan een subnucleaire structuur (de nucleaire matrix of scaffold) via een interactie van het telomeer-eind bindende eiwit TEBPα. (C) Stabilisatie van G-quadruplexen door G-quadruplex bindende liganden (gele sterren) schaadt de synthese van telomeerherhaling door het telomerase-enzym en leidt tot telomeerverkorting (aangepast na (80)).

G-quadruplexen bij telomeren. De G-rijke overhang van telomeren kan G-quadruplex-structuren vormen die betrokken zijn bij telomere eindbescherming en telomerisch DNA-metabolisme. (EEN) De lange menselijke G-rijke overhang kan strengen vormen die intramoleculair gevouwen G-quadruplexen vormen die eindbescherming kunnen bieden tegen nucleasen of de telomerase-activiteit reguleren. (B) Ciliate-telomeren vormen intermoleculaire G-quadruplex-structuren waarbij twee telomeren betrokken zijn die worden gepromoot door het telomeer-end bindende eiwit TEBPβ. Telomeren zijn gehecht aan een subnucleaire structuur (de nucleaire matrix of scaffold) via een interactie van het telomeer-eind bindende eiwit TEBPα. (C) Stabilisatie van G-quadruplexen door G-quadruplex bindende liganden (gele sterren) schaadt de synthese van telomeerherhaling door het telomerase-enzym en leidt tot telomeerverkorting (aangepast na (80)).

Voor menselijke telomeren kwam de eerste indicatie dat G-quadruplexen aanwezig kunnen zijn van de waarneming dat G-quadruplex-stabiliserende liganden het telomeermetabolisme verslechterden en leidden tot telomeerverkorting (Figuur 3C) (69-71). Deze benadering was gebaseerd op de waarneming dat telomere G-quadruplexen telomerase-activiteit remmen (72). Er zijn nu een aantal G-quadruplex-stabiliserende liganden beschikbaar en het is duidelijk geworden dat veel zich niet richten op het telomerase-enzym, maar op de telomeer zelf (73-75). Andere benaderingen om G-quadruplexen op menselijke telomeren te identificeren, omvatten de binding van een radioactief gemerkt G-quadruplex-ligand aan metafasechromosomen (76), het gebruik van een fluorescerende cyaninekleurstof (77) en, meer recentelijk, het gebruik van een gemanipuleerde structuur -specifiek antilichaam tegen menselijke G-quadruplexen (78, 79). In alle gevallen werden signalen gedetecteerd aan de uiteinden van chromosomen, zij het niet aan alle uiteinden. De resolutie van lichtmicroscopie is onvoldoende hoog om te ontcijferen of binding plaatsvond aan het einde van het chromosoom of in subtelomere regio's, waarvan ook bekend is dat ze G-quadruplex-structuren aannemen in vitro (80). Om deze redenen moet nog worden vastgesteld of G-quadruplexen aanwezig zijn bij menselijke telomeren. Echter, de bevinding dat een aantal helicases waarvan bekend is dat ze G-quadruplexen afwikkelen in vitro (zoals de RecQ-helicases WRN en BLM), lokaliseren naar telomeren en zijn vereist voor de integriteit van telomeren in vivo, leveren sterk indirect bewijs voor het bestaan ​​van dergelijke structuren bij zoogdiertelomeren (81, 82, 30, 45, 83, 84).

De primaire functie van WRN- en BLM-helicases lijkt te zijn om te zorgen voor een geschikte replicatie van telomeer DNA door de afwikkelende G-quadruplex-belemmeringen te helpen (Figuur 5). De WRN-helicase is noodzakelijk voor het voorkomen van dramatisch telomeerverlies tijdens achterblijvende strengreplicatie van de G-rijke streng en de daaruit voortvloeiende accumulatie van chromosoomafwijkingen zoals chromosoomfusies (85). WRN colokaliseert en interageert fysiek met de kritische telomeerbindende eiwitten TRF2 en POT1 (86) en zowel WRN als BLM binden met hoge affiniteit aan POT1 (87), wat suggereert dat DNA-bindende telomere eiwitten kunnen functioneren bij helicase-rekrutering. RETL1-deficiënte cellen vertonen telomeerfragiliteit (50, 81), die wordt versterkt door het G-quadruplex-stabiliserende middel TMPyP4. Dit suggereert opnieuw dat G-quadruplexen zich vormen bij telomeren en, indien niet opgelost, resulteren in DNA-schade. De rol van RETL1 lijkt echter algemener te zijn bij het helpen van de replicatie van het genoom, aangezien het rechtstreeks interageert met de replicatieklem PCNA (49).

G-quadruplexen in transcriptie en translatie

De bevinding dat ongeveer 50% van de menselijke genen pG4's bevatten in de buurt van hun promotorregio's suggereerde een rol voor G-quadruplexen bij het reguleren van genexpressie (Figuur 4A). Interessant is dat pG4's vaker voorkomen in oncogenen of regulerende genen dan in huishoud- of tumorsuppressorgenen (88, 89), (ter beoordeling (9, 84)). Het eerste bewijs dat pG4's bij promoters (Figuur 4A) een effect hebben op genexpressie kwam van studies over het oncogen c-MYC, waarvoor werd aangetoond dat mutaties van de pG4, of de toevoeging van een G-quadruplex stabiliserend ligand de transcriptie beïnvloedden in vivo (90, 91). Meer overtuigend tonen genoombrede genexpressiestudies in gist en menselijke cellen veranderingen in talrijke genen na toevoeging van het G-quadruplex bindende ligand TMPyP4 en significant, de genen waarvan de expressie werd beïnvloed, waren verrijkt in pG4s (Figuur 4A) (92, 93) . Studies met gebruikmaking van een G-quadruplex-specifiek enkelketenig antilichaam lieten ook veranderingen zien in genexpressie van genen die pG4's bevatten en het effect was niet alleen beperkt tot promotors maar ook op pG4's aan de uiteinden van genen, wat wijst op een mogelijke betrokkenheid van G-quadruplexen in beide transcriptionele initiatie en beëindiging (94, 95). Bovendien heeft genoombrede analyse van menselijke cellen onthuld dat de bindingsplaatsen van de met transcriptie geassocieerde helicases XPB en XPD significant overlappen met pG4's. Omdat deze helicasen G-quadruplexen binden en ontvouwen, worden ze waarschijnlijk gerekruteerd naar G-quadruplexen in het genoom om transcriptie te ondersteunen (96).

G-quadruplexen in transcriptie en translatie. (EEN) pG4-sequenties zijn aanwezig in ongeveer 50% van de promotors van menselijke genen. De vorming van G-quadruplex zou de initiatie van transcriptie door het RNA-polymerase kunnen belemmeren, of, indien aanwezig in de antisense streng, de transcriptie kunnen remmen. (B) De aanwezigheid van G-quadruplexen gevormd in de 5'-UTR van mRNA's kan de translatie reguleren en leiden tot afgebroken RNA-transcripten bij hexanucleotide-herhalingsexpansieziekten.

G-quadruplexen in transcriptie en translatie. (EEN) pG4-sequenties zijn aanwezig in ongeveer 50% van de promotors van menselijke genen. De vorming van G-quadruplex zou de initiatie van transcriptie door het RNA-polymerase kunnen belemmeren, of, indien aanwezig in de antisense streng, de transcriptie kunnen remmen. (B) De aanwezigheid van G-quadruplexen gevormd in de 5'-UTR van mRNA's kan de translatie reguleren en leiden tot afgebroken RNA-transcripten bij hexanucleotide-herhalingsexpansieziekten.

Genoombrede studies onthulden ook dat pG4's sterk verrijkt zijn op plaatsen voor DNaseI-overgevoeligheid (97) en correleren met lage nucleosoombezetting (93). Bijgevolg zouden pG4's zowel de afzetting van regulerende eiwitten kunnen beïnvloeden als de chromatinestructuur en -stabiliteit kunnen veranderen. Het verband tussen G-quadruplexen en chromatine wordt benadrukt door de chromatine-remodeller ATRX (alfa-thalassemie/mentale retardatie X-linked) die samen met zijn interagerende partner DAXX fungeert als een histon-chaperoncomplex bij de afzetting van de histonvariant H3.3 , waardoor chromatine wordt gestabiliseerd (98). ATRX lokaliseert naar pericentrische heterochromatine en telomeren, en genoombrede analyses in muizen- en menselijke cellen onthulden dat het bindt aan GC-rijke sequenties waarvan een significante fractie pG4's zijn. In vitro Er werd aangetoond dat ATRX G-quadruplexen bindt (99). Ziekteveroorzakende mutaties in ATRX beïnvloeden een verscheidenheid aan fundamentele nucleaire processen, waaronder transcriptie. Het ATRX-syndroom is geassocieerd met thalassemie, die wordt toegeschreven aan de neerwaartse regulatie van α-globine door de binding van ATRX aan pG4s-herhalingen stroomopwaarts van het gen. Interessant is dat zowel de nabijheid als de lengte van de variabele aantal tandemherhalingen de ernst van genuitschakeling beïnvloedden, wat een directe oorzaak suggereert door pG4s. Als alternatief werd op basis van observaties van replicatieonderzoeken in DT40-cellen van vogels (100, 101) geconcludeerd dat transcriptionele silencing plaatsvond via G-quadruplex belemmerde DNA-replicatie (Figuur 5) die transcriptie beïnvloedde door de ongepaste overerving van epigenetische histonmarkeringen. Interessant is dat epigenetische instabiliteit kan ontstaan ​​door een G-quadruplex die zich op een afstand van maximaal 3500 basenparen van de startplaats van de transcriptie bevindt (13). Hoewel deze waarnemingen overtuigend bewijs leveren voor de betrokkenheid van pG4's bij de regulatie van genexpressie in vivo, of het mechanisme voor transcriptionele regulatie direct door de vorming van G-quadruplex gaat, moet nog worden bewezen. Als de vorming van G-quadruplex het mechanisme is, dan zou hun optreden (en regulatie) moeten verschillen tussen verschillende gedifferentieerde cellen.

G-quadruplexen en replicatie. G-quadruplexen gevormd tijdens replicatie wanneer het DNA tijdelijk enkelstrengs is, belemmeren replicatie en moeten worden opgelost om de replicatiemachinerie, inclusief DNA-polymerase, te laten doorgaan voor zowel leidende als achterblijvende DNA-synthese. Van G-quadruplexen is bekend dat ze worden opgelost door G-quadruplex-afwikkelende helicases zoals FANCJ met een directionaliteit van 5'-3'. Andere helicases zoals BLM en WRN hebben een 3′-5′ directionaliteit. Andere eiwitten of enzymen zoals polymeren werken ook in de succesvolle bypass van G-quadruplexen.

G-quadruplexen en replicatie. G-quadruplexen gevormd tijdens replicatie wanneer het DNA tijdelijk enkelstrengs is, belemmeren replicatie en moeten worden opgelost om de replicatiemachinerie, inclusief DNA-polymerase, te laten doorgaan voor zowel leidende als achterblijvende DNA-synthese. Van G-quadruplexen is bekend dat ze worden opgelost door G-quadruplex-afwikkelende helicases zoals FANCJ met een directionaliteit van 5'-3'. Andere helicases zoals BLM en WRN hebben een 3′-5′ directionaliteit. Andere eiwitten of enzymen zoals polymeren werken ook in de succesvolle bypass van G-quadruplexen.

Computationele voorspellingen hebben onthuld dat RNA-pG4's ook aanwezig zijn in het 5'-onvertaalde gebied (UTR) van veel genen en de betrokkenheid van G-quadruplexen bij de regulatie van translatie is aangetoond door in vitro en in vivo studies (Figuur 2D) (24). Meer dan tien jaar geleden suggereerden baanbrekende studies naar fragiele X-mentale retardatie, voortkomend uit (CGG)n-herhalingsexpansie, voor het eerst dat G-quadruplexen in mRNA betrokken waren bij de neuronale functie (102) en het doelwit waren van het mentale retardatie-eiwit FMRP. FMRP bindt specifiek aan zijn eigen mRNA via een G-quadruplex dat aanwezig is in zijn 5'-UTR, wat de translatie belemmert en aanleiding geeft tot veranderde translatieprofielen van mRNA in de hersenen (103). Een recent onderzoek naar de rol van de RNA-helicase eIF4A, met behulp van ribosoomvoetafdruk om snapshots van translatie over het transcriptoom te bieden, heeft onthuld dat het kenmerk van eIF4A-afhankelijke transcripten een 12-nucleotide pG4-signatuur (CGG) is.4 die RNA G-quadruplex-structuren kunnen vormen (104). eIF4A bevordert T-cel acute lymfatische leukemie door de translatie van mRNA's met lange en complexe UTR's te helpen. Daarom impliceren deze resultaten RNA G-quadruplexen bij de regulatie van translatie van een aantal oncogenen (Figuur 4B) (104). Bovendien is aangetoond dat pG4 in de 3'-UTR van sommige mRNA's betrokken is bij alternatieve polyadenylatie en de verkorting van de transcripten (25).

Direct bewijs voor eiwitten die RNA G-quadruplexen binden en oplossen is schaars, met uitzondering van recente studies over de RNA-helicase RHAU. Deze ATP-afhankelijke resolvase bleek met een hoge affiniteit en specificiteit te binden aan vele RNA's die pG4's bevatten, waaronder de telomerase RNA TER, en lost G-quadruplexen op. in vitro (60, 62). Mutaties in de pG4 in TER geven aanleiding tot een telomeer fenotype (105). Bovendien, zoals hierboven vermeld, leiden G-quadruplexen die zich vormen in m-RNA dat voortkomt uit hexanucleotide-herhalingsexpansie (GGGGCC)n tot afgebroken RNA-transcripten en verstoring van RNA-verwerking (44).

De lange G-rijke telomeerherhaling met RNA (TERRA) die het resultaat is van de transcriptie van telomeer-DNA van mensen en gisten (106, 107) neemt niet verwonderlijk G-quadruplex-structuren aan in vitro ( 26, 108). In vitro studies hebben aangetoond dat het telomeerbindende eiwit TRF2 van zoogdieren kan interageren met TERRA G-quadruplexen, wat een rol kan suggereren in de telomeerorganisatie (39). Gezien het grote structurele repertoire van RNA's, is het waarschijnlijk dat extra rollen van RNA G-quadruplexen (en andere structuren van hogere orde) in regulerende processen naar voren zullen komen.

G-quadruplexen in replicatie en genoominstabiliteit

DNA G-quadruplexen lijken een dubbele rol te spelen bij de regulatie van DNA-replicatie: als belemmeringen voor replicatie die in mutante achtergronden leiden tot genoominstabiliteit, en als componenten van metazoaire replicatieoorsprong (figuren 5 en 6).

G-quadruplexen en de initiatie van DNA-replicatie. Herkomsten van replicatie bij muizen en mensen zijn GC-rijk en bevatten pG4's. De vorming van G-quadruplex is vereist voor de initiatie van DNA-replicatie en de lokalisatie van de G-quadruplex bepaalt de plaats van initiatie (aangepast na (117)).

G-quadruplexen en de initiatie van DNA-replicatie. Herkomsten van replicatie bij muizen en mensen zijn GC-rijk en bevatten pG4's. De vorming van G-quadruplex is vereist voor de initiatie van DNA-replicatie en de lokalisatie van de G-quadruplex bepaalt de plaats van initiatie (aangepast na (117)).

Er is steeds meer bewijs dat zowel gespecialiseerde DNA-polymerasen als helicasen functioneren bij de replicatie van G-quadruplexen om genetische en epigenetische instabiliteit te voorkomen (Figuur 5) (45, 109). Inzichten in de rol van G-quadruplex-helicases bij DNA-replicatie zijn voortgekomen uit onderzoeken naar genoominstabiliteitssyndromen die worden veroorzaakt door functieverliesmutaties in een van dergelijke helicases (Figuur 5A). In C. elegans met een functieverliesmutatie in het DOG-1-gen, accumuleren deleties in genomische regio's die pG4s bevatten (46). Studies over andere helicases, zoals bijvoorbeeld FANCJ, WRN, BLM en Pif1, ondersteunen en breiden deze bevindingen uit. Hoewel de WRN-helicase primair nodig lijkt te zijn voor replicatie van telomeer DNA, komt dit overeen met patiënten met het Wernersyndroom (die mutaties hebben in de WRN-helicase) die voortijdige veroudering en versnelde telomeerverkorting vertonen. Zowel FANCJ als Pif1- of BLM-helicase werken ook op interne genomische regio's en zijn vereist voor de integriteit van het genoom (45, 109). Mutaties in de FANCJ-helicase leiden tot grote deleties die worden toegewezen aan pG4s in het genoom (48). De demonstratie dat FANCJ bij voorkeur G-quadruplexen afwikkelt in vitro suggereerde dat de FANCJ-helicase zoals DOG1 functioneert door het oplossen van G-quadruplexen gevormd tijdens replicatie (Figuur 5B). In vivo bewijs voor het vastlopen van de replicatievork veroorzaakt door pG4s kwam uit een elegante studie in een aviaire DT40-cellijn die deficiënt is in het translesie-polymerase REV1 ( 100). In deze studie werden de plaatsen van vastgelopen vorken toegewezen aan pG4s en verder toonden de auteurs aan dat het afslaan te wijten was aan de aanwezigheid van een G-quadruplex vormende sequentie, in plaats van een G-rijke sequentie. Veelbetekenend werd gevonden dat het niet handhaven van processieve DNA-replicatie leidt tot de ontkoppeling van DNA-synthese en histonrecycling, en verder dat pG4-geassocieerde epigenetische instabiliteit het gevolg is van mutaties in drie helicases die betrokken zijn bij het afwikkelen van G-quadruplexstructuren (FANCJ, WRN en BLM) ( 100, 101). Recente waarnemingen leveren ook direct bewijs dat ATRX een rol speelt bij het helpen van replicatie. ATRX-disfunctie veroorzaakte replicatiedefecten en verhoogde het aantal DNA-schaderesponsmechanismen bij telomeren in embryonale stamcellen van muizen (110). Deze observatie, samen met de wetenschap dat ATRX pG4's target (97), suggereert dat in dit geval ook G-quadruplexen de oorzaak zouden kunnen zijn van het vastlopen van de replicatievork. Mutaties in menselijke ATRX zijn onlangs geïdentificeerd in tumoren die hun telomeren behouden via een telomerase-onafhankelijke route (de alternatieve verlenging van telomeren (ALT)) waarbij homologe recombinatie betrokken is, wat duidt op replicatiedefecten bij telomeren in ALT-cellen (111). Bewijs voor genoominstabiliteit als gevolg van gebrekkige replicatie is ook afkomstig uit onderzoeken waarin de menselijke subtelomere minisatelliet CBE1, die de G-quadruplex-structuur vormt in vitro (80), werd ingevoegd in het genoom van Pif1-deficiënte gist (52, 54). Verder werd aangetoond dat de replicatie vertraagde in de buurt van pG4s en dat DNA-breuk optrad op deze plaatsen in Pif1-deficiënte S. cerevisiae. Overtuigend voor de rol van Pif1 bij het oplossen van G-quadruplexen, kon G-quadruplex-geassocieerde DNA-breuk worden onderdrukt door de ectopische expressie van Pif1 (51, 112). Evenzo werd in de studie met antilichamen gericht tegen G-quadruplexen (78) aangetoond dat het aantal DNA-schadefoci significant toenam tijdens de S-fase, wat suggereert dat de foci G-quadruplexen vertegenwoordigen die tijdens replicatie gevormd zijn. Hoewel dit waar zou kunnen zijn, zou co-lokalisatie van deze foci met nieuw gesynthetiseerd DNA de conclusie versterken (78).

De grote omvang van metazoa-genomen, waar replicatie plaatsvindt van ongeveer 30 000-50 000 replicatieoorsprongen in menselijke of muizencellen (en mogelijk minstens 10 keer meer potentiële oorsprong bevatten), verhinderde hun identificatie gedurende vele jaren. Verbeterde genoombrede analyses van actieve plaatsen van initiatie van DNA-replicatie hebben nu echter de sequentiespecificiteit van replicatieoorsprongen kunnen aanpakken. In tegenstelling tot de AT-rijke consensussequenties voor oorsprong in S. cerevisiae, 80-90% van alle oorsprong in muizen- en menselijke cellen bevat GC-rijke regio's die G-rijke herhaalde elementen vormen (Figuur 6) (19, 21, 113). Deze GC-rijke eigenschap is geconserveerd in de replicatieoorsprong van planten (114). Deze sequentie-elementen hebben de karakteristieke kenmerken van G-quadruplex vormende sequenties, en dergelijke structuren kunnen belangrijker zijn dan sequentiespecificiteit voor het markeren van de initiatie van DNA-replicatie van beide DNA-strengen (Figuur 6) ( 115). Onlangs werd betoogd dat het hoge voorkomen van pG4's bij de oorsprong een overschatting zou kunnen zijn vanwege de inefficiënte vertering van de G-quadruplex-structuur door het exonuclease dat bij het in kaart brengen werd gebruikt (116). Desalniettemin tonen overtuigende experimentele gegevens aan dat een G-quadruplex inderdaad vereist is voor de initiatie van replicatie in vivo ( 117). Hoe potentiële replicatieoorsprongen binnen een replicon worden geselecteerd voor activering in verschillende celtypen, moet echter nog worden begrepen en kan de overspraak tussen genoom, chromatine-organisatie en replicatie en transcriptie inhouden ( 115, 118). Deze gegevens zijn niet alleen belangrijk voor ons begrip van de controle van DNA-replicatie in hogere eukaryoten, maar kunnen een impact hebben op de toegepaste wetenschap doordat ze de constructie van autonoom replicerende vectoren mogelijk maken voor gebruik in gen- en stamceltherapie.


Download nu!

We hebben het je gemakkelijk gemaakt om een ​​PDF Ebooks te vinden zonder te graven. En door online toegang te hebben tot onze e-boeken of door deze op uw computer op te slaan, heeft u handige antwoorden met Hoofdstuk 18 Regelgeving van genexpressie-antwoorden. Om te beginnen met het vinden van Hoofdstuk 18 Regelgeving van genexpressie-antwoorden, hebt u gelijk onze website met een uitgebreide verzameling handleidingen.
Onze bibliotheek is de grootste van deze die letterlijk honderdduizenden verschillende producten heeft vertegenwoordigd.

Eindelijk krijg ik dit e-boek, bedankt voor al deze Hoofdstuk 18 Regelgeving van genexpressie-antwoorden die ik nu kan krijgen!

Ik had niet gedacht dat dit zou werken, mijn beste vriend liet me deze website zien, en dat doet het! Ik krijg mijn meest gezochte eBook

wtf dit geweldige ebook gratis?!

Mijn vrienden zijn zo boos dat ze niet weten hoe ik alle e-boeken van hoge kwaliteit heb, wat zij niet hebben!

Het is heel gemakkelijk om e-boeken van hoge kwaliteit te krijgen)

zoveel nepsites. dit is de eerste die werkte! Erg bedankt

wtffff ik begrijp dit niet!

Selecteer gewoon uw klik en download-knop en voltooi een aanbieding om het e-boek te downloaden. Als er een enquête is, duurt het slechts 5 minuten, probeer een enquête die voor u werkt.


Bekijk de video: RETHINK EDUCATION: The Biology of Learning Featuring Dr. Andrew Huberman (November 2021).