Informatie

Wat zijn in chromatine de verschillen tussen toestanden, interacties en structuren?


Ik ben nieuw in de studie van chromatine en ik probeer te begrijpen wat mensen bedoelen als ze schrijven over chromatinetoestanden, chromatine-interacties en chromatinestructuren.

Wat is het verschil tussen deze? Is er iemand beschikbaar om ze mij duidelijk uit te leggen?

Zijn lussen interacties of structuren?


Chromatinetoestand verwijst naar de markeringen (dwz gemethyleerd DNA, histonmodificaties, euchromatine v. heterochromatine) die op specifieke loci worden gevonden en wordt vaak open (gemakkelijk gebonden door DNA-bindende eiwitten, zoals transcriptiefactoren) of gesloten (ontoegankelijk voor de meeste factoren) genoemd. .

Chromatine-interacties kunnen de binding van transcriptiefactoren en andere DNA-bindende eiwitten omvatten, maar worden gewoonlijk gebruikt om lokale en functionele contacten over lange afstand tussen twee of meer chromatinegebieden te beschrijven. Deze interacties worden actief gegenereerd door eiwitafhankelijke chromatine-organisatie en passief via polymeerfysica en de nucleaire omgeving.

Chromatinestructuren kunnen verwijzen naar de werkelijke moleculaire vorm en samenstelling van het DNA of naar de moleculaire modificaties die in specifieke chromatinegebieden worden gevonden (bijv. heterochromatine, DNA-methylatie). Het kan ook verwijzen naar de geordende verdichting van mitotische/meiotische chromosomen.

Chromatinelussen zijn structuren die kunnen werken bij het bevorderen van regulerende interacties. Omgekeerd kunnen chromatine-interacties looping induceren.

Cavalli en Misteli, functionele implicaties van genoomtopologie, Natuur Structurele en moleculaire biologie 2013


Chromatine

Abstract

Chromatine is een sterk georganiseerd complex van DNA en eiwitten en is een hoofdbestanddeel van de celkern. Histon-eiwitten helpen bij het organiseren van DNA in structurele eenheden die nucleosomen worden genoemd, die vervolgens worden samengevoegd tot een compacte structuur (chromatine) en uiteindelijk tot zeer grote structuren van hoge orde (chromosomen). De gelokaliseerde toegankelijkheid van chromatine wordt grotendeels gereguleerd door posttranslationele modificaties van zowel histon-eiwitten als DNA, die dramatische effecten hebben op de regulatie van de chromatinestructuur, binding van chromatine-modificerende complexen en transcriptionele regulatoren. Dit artikel onderzoekt eerder vastgestelde en recent ontdekte rollen van chromatine als een structurele component van de kern en als een regulator van activering en onderdrukking van gentranscriptieactiviteit.


Biochemisch onderzoek van verschillende toestanden van chromatine en genactiviteit in cellen

Gevoeligheid van chromatine voor nucleasen

Een baanbrekende observatie in de correlatie van genactiviteit met toegankelijker chromatine was de demonstratie dat transcriptioneel actieve genen worden gevonden in chromatine dat gevoeliger is voor DNasen. Weintraub en Groudine toonden in 1976 aan dat de algehele gevoeligheid van een gen voor DNase I ongeveer 3 tot 10 keer groter is dan die van DNA in bulkchromatine, maar alleen in weefsels die het gen tot expressie brengen (Figuur 4.6.8). Latere studies hebben deze correlatie voor veel genen in veel weefsels aangetoond, maar het wordt niet in alle gevallen gezien. Sommige genen bevinden zich in toegankelijk chromatine, of ze nu tot expressie worden gebracht of niet. De redenen voor deze verschillen worden onderzocht.

Figuur 4.6.8.DNase I-digestie van kernen vermindert de concentratie van actief getranscribeerd DNA. Aangepast van Stalder et al. (1980) Cel 20:451-460.

De experimentele basisbenadering was het meten van de gevoeligheid van bepaalde sequenties voor nucleasedigestie in kernen van tot expressie brengende en niet tot expressie brengende weefsels (Figuur 4.6.8). Zo werden kernen van erytroïde cellen van kippen (rode bloedcellen van vogels behouden hun kernen, in tegenstelling tot zoogdieren) en levercellen afzonderlijk verteerd met DNase I. Er werd voldoende nuclease toegevoegd zodat gevoelige gebieden zouden worden doorgesneden, maar het grootste deel van het DNA in chromatine werd slechts licht verteerd. Chromosomale eiwitten werden vervolgens verwijderd (proteïnase K gevolgd door fenolextractie) waardoor gezuiverd DNA achterbleef. Het gedeeltelijk verteerde nucleaire DNA werd gedenatureerd en geanneald aan gelabelde genspecifieke hybridisatieprobes, en het verschijnen van de gelabelde probe in duplex met het nucleaire DNA werd gevolgd als een functie van Cot (concentratie van DNA en acute tijd - herinner dit uit deel één van de cursus). DNA van gedeeltelijk verteerde leverkernen geanneald met de globine-genprobe bij een veel lagere Cot dan DNA van gedeeltelijk verteerde erytroïde kernen. Dit toont aan dat de hoeveelheid globinegen-DNA in erytroïde kernen aanzienlijk wordt verminderd door de DNase I-behandeling, d.w.z. het globinegen is gevoelig voor DNase I in een cel die het tot expressie brengt.

Een belangrijke negatieve controle is de annealing aan een gelabelde ovalbumine-genprobe, een gen dat niet tot expressie wordt gebracht in lever of rode bloedcellen (alleen eileider). In dit geval gloeide het DNA van gedeeltelijk verteerde kernen van beide weefsels met dezelfde kinetiek aan de ovalbumine-probe. Er is dus geen grove oververtering van de erytroïde kernen en het is duidelijk dat het globine-gen veel minder gevoelig is voor nucleasen in niet tot expressie brengende weefsels.

In kaart brengen van de omvang van het gebied rond het gen dat toegankelijk is

De basisstrategie is vergelijkbaar met die hierboven gebruikt, maar het nucleaire DNA wordt gevolgd als een functie van [DNase I], hybridisatieprobes van buiten het gen worden gebruikt en er wordt een blot-hybridisatie-assay gebruikt (Figuur 4.6.9). Nadat het DNA is verkregen uit kernen die in toenemende mate met DNase I zijn gedigereerd, wordt het DNA volledig gedigereerd met restrictie-endonucleasen, op grootte gescheiden op een agarosegel, geblot op een membraan zoals nylon en gehybridiseerd met een radioactieve sonde vanuit het gen of van gebieden die het gen flankeren. Probes van binnenuit en direct aan weerszijden van het gen vertonen een progressief signaalverlies naarmate de [DNase I] wordt verhoogd bij de initiële vertering, vandaar de naam "fade-out"-experimenten voor deze testen. Verder weg van het gen, als men eenmaal buiten het open domein is, neemt het signaal van de restrictiefragmenten niet sneller af dan de negatieve controle. De grenzen van het open domein liggen buiten de fragmenten die gevoeligheid tonen, maar binnen de fragmenten die ongevoeligheid tonen.

Figuur 4.6.9. DNase I-digestie van kernen knipt bij voorkeur restrictie-endonucleasefragmenten die actief getranscribeerd DNA bevatten. Aangepast van Stalder et al. (1980) cel 20:451-460, figuur 2,

In het geval van het menselijke b-achtige globinegencluster (zie hieronder), begint het gebied voor ongevoeligheid meer dan 60 kb 5' voor het b-globinegen en meer dan 100 kb 3' ervoor. In andere gevallen, b.v. kip lysozym-gen, het hele domein is ongeveer 20 kb groot en heeft een enkel gen.

De structureel basisvoor de verhoogde gevoeligheid voor vertering door DNase lin cellen is niet stevig verankerd. Het is vaakgeïnterpreteerd als het resultaat van het ontvouwen in een hogere orde structuur. Een mogelijkheid is dat DNA dat gevoelig is over een breed gebied zich in de 10 nm-vezel bevindt (een lineaire reeks nucleosomen), terwijl ongevoelige gebieden zich in een 30 nm-vezel kunnen bevinden, waarvan wordt gedacht dat het een solenoïde van nucleosomen is. Sommige genen in de 30 nm-vezel kunnen echter actief zijn en inactivering kan overeenkomen met een verdichting van een hogere orde of assemblage van een silencing-structuur.

Men denkt dat de uitgebreide regio's van algemene DNase-gevoeligheid een functioneel domein in chromatine definiëren. Het kan overeenkomen met een grote lus van chromatine (bijvoorbeeld 100 kb of meer) (Figuur 4.6.10).

Figuur 4.6.10. Regio's met algemene DNase-gevoeligheid kunnen overeenkomen met "lampbrush" chromosoomachtige lussen of domeinen. Aangepast van Stalder et al., 1980, Cell 20:451

DNase overgevoelige sites

Specifieke, korte regio's (meestal ongeveer 100 tot 200 bp) zijn ongeveer 100 keer gevoeliger dan bulk-DNA in kernen. Omdat DNase I snijdt vaakin deze korte regio genereert het a dubbelstrengs pauzeOp deze overgevoelige site(afgekort HS). Dit produceert een nieuwe band op een genomische blot-hybridisatie-assay (Figuur 4.6.11).

De gebruikte techniek, genaamd "indirecte eindlabels"is een wijziging van het "fade-out"-experiment beschreven in figuur 4.6.9 hierboven, en wordt gebruikt om HS's te detecteren. Net als in de vorige testen worden kernen gedigereerd met toenemende hoeveelheden DNase I, wordt DNA gezuiverd en gesplitst met een restrictie-endonuclease en wordt het interessegebied geanalyseerd door genomische blot-hybridisatie (Southern blot). Door gebruik te maken van een radioactieve sonde van het ene uiteinde van het restrictiefragment dat wordt gedetecteerd op de genomische blot-hybridisatie-assay (in plaats van de grotere sondes die in de vorige assays werden gebruikt), kan men de nieuwe fragmenten gegenereerd door splitsing door DNase I op een HS. De grootte van het nieuwe fragment vertelt je de positie van de HS. Een nieuw fragment van 5 kb zou bijvoorbeeld betekenen dat een HS zich op 5 kb van de restrictie-endonucleasesplitsingsplaats bevindt die het dichtst bij de in de test gebruikte probe ligt.

Figuur 4.6.11. Indirecte end-labeling-assay brengt DNase-overgevoelige sites in kaart. In dit voorbeeld wordt indirecte eindlabeling gebruikt om DNase HS's in gammaglobinegenen te zien. Aangepast van Groudine et al. (1983) PNAS 80:7551-7555.

Deze aanpak kan zowel meerdere overgevoelige sites (Figuur 4.6.12) als één enkele site aan het licht brengen.

Figuur 4.6.12. Voorbeeld van resultaten van een indirecte eindlabeling-assay. Dit experiment brengt drie DNase-HS'en in kaart in het menselijke beta-globine locus-controlegebied (zie Sectie E van dit hoofdstuk0. Gegevens van H. Petrykowska.

Algemene eigenschappen van DNase HS's in chromatine

(1)HS's zijn vrij van nucleosomen, of de nucleosomen zijn sterk verstoord. bijv. het SV40-controlegebied is een HS en visualisatie in de EM laat zien dat SV40-minichromosomen geen nucleosomen in dit gebied hebben.

(2) DNA-sequenties die zich in HS's in chromatine bevinden, zijn: vaak betrokken bij genregulatie. Voorbeelden zijn promotors, versterkers, geluiddempers en LCR's. Matrix- en scaffold-aanhechtingsgebieden (MAR's en SAR's) zijn ook overgevoelig voor DNase I.

(3) Uit onderzoek van de HS's blijkt dat ze: meerdere sites voor bindende transcriptiefactoren(zoals verwacht voor promotors, versterkers, dempers, enz.) of andere regulerende of structurele eiwitten (bijv. MAR's die topoisomerase II binden).

(4) Het basisidee is dat het DNA kan worden ingenomen door specifieke bindingsfactoren (wanneer het gen wordt getranscribeerd) of dat het in nucleosomen kan worden gewikkeld. In de meeste (maar niet alle) gevallen zijn dit elkaar uitsluitende opties. Het DNA is niet hypergevoelig voor DNase I-splitsing wanneer het zich in nucleosomen bevindt. De dekking van het DNA door de transcriptiefactoren is niet volledig en maakt nog steeds splitsing door DNase I tussen de gebonden factoren mogelijk.

(5) De DNase HS's zijn oriëntatiepunten voor genregulerende sequenties


De chromatinestructuur verandert tijdens verschillende processen vanuit een DNA-sequentieweergave

De DNA-sequentie-afhankelijkheid van chromatine 3D-structuurvorming.

Verbeterde segregatie van chromatinedomeinen van geboorte tot veroudering en vaststelling van celidentiteit door middel van domeinoverschrijdende contacten.

Een uniform model voor chromatinestructuurveranderingen tijdens ontwikkeling, differentiatie, veroudering en tumorigenese.

Chromatine bestaat voornamelijk uit eiwit en DNA, en de sequentie-informatie van DNA draagt ​​bij aan het beheersen van de ruimtelijke structuur van chromatine. Genoombrede contactpatronen van chromosoom met hoge precisie onthullen fijne structurele eigenschappen, geleidend voor het verkennen van onderliggende mechanismen bij het opzetten van structuren en het realiseren van functies voor chromatine. In deze korte recensie beschrijven we veranderingen van de chromatinestructuur tijdens verschillende biologische processen vanuit een DNA-sequentieweergave, met een toename van de algemene domeinsegregatie van geboorte tot veroudering en totstandkoming van celidentiteitsgerelateerde domeinoverschrijdende contacten. Segregatiepatronen variëren met het celstadium en de genomische afstand. Ondertussen worden mogelijke effecten van celcyclus, temperatuur, nucleaire lamina en nucleolus op de chromatinestructuur besproken. Ten slotte worden ook belangrijke rollen van transcriptiefactoren en andere eiwitten in de juiste chromatine-organisatie besproken.


Resultaten

Voorspellende modellering van chromatine-organisatie

We introduceren een voorspellend model om celtype-specifieke 3D-chromatine-vouwing te bestuderen. Dit model neemt een sequentie van chromatinetoestanden afgeleid van genoombrede histonmodificatieprofielen en een lijst van CTCF-bindingsplaatsen als invoer. We hebben deze genomische kenmerken geselecteerd vanwege hun bekende rol bij het organiseren van het chromatine op verschillende lengteschalen (figuur 1A). De kern van dit model is een energiefunctie - een krachtveld - dat sequentiespecifiek is en de stabiliteit van verschillende chromatine-conformaties rangschikt. Uitgaande van de invoer voor een bepaald chromatinesegment, gebruiken we moleculaire dynamica-simulaties om chromatine-conformaties te onderzoeken die worden gedicteerd door de energiefunctie en om een ​​ensemble van structuren met hoge resolutie te voorspellen. Deze structuren kunnen direct worden vergeleken met superresolutie-beeldvormingsexperimenten of worden omgezet in contactwaarschijnlijkheidskaarten voor validatie tegen genoombrede chromosoomconformatie-opname-experimenten (Hi-C).

(A) Illustratie van genoomorganisatie op verschillende lengteschalen, waaronder de vorming van CTCF-gemedieerde chromatinelussen, TAD's en compartimenten. (B) een schematische weergave van het rekenmodel dat de toewijzing van chromatine-staten en CTCF-bindingsplaatsen benadrukt. Chromatinetoestanden voor elke kraal - een 5 kb lang genomisch segment - zijn afgeleid van de combinatorische patronen van histonmarkeringen. Ze worden weergegeven in deel (C) als een hittekaart met donkerdere kleuren die een hogere kans op het waarnemen van verschillende markeringen aangeven.

Zoals weergegeven in figuur 1B, wordt in dit model een continu genomisch segment weergegeven als kralen aan een touwtje. Elke kraal is goed voor vijf kilo basen in sequentielengte en krijgt een chromatinetoestand toegewezen die is afgeleid van de onderliggende combinatorische patronen van 12 belangrijke histonmarkeringen. Van chromatinetoestanden is bekend dat ze sterk gecorreleerd zijn met Hi-C-compartimenttypen [39,54,66] en daarom zullen ze helpen bij het modelleren van grootschalige chromosoomcompartimentering. In de tussentijd kunnen chromatinetoestanden verder gaan dan traditionele A/B-compartimenten of subcompartimenten om polymeermodellen te voorzien van de specificiteit die nodig is voor het bestuderen van interacties tussen regulerende elementen. We definiëren in totaal 15 chromatinetoestanden, geïdentificeerd met behulp van een verborgen Markov-model [67], om promotors, versterkers, heterochromatine, latent chromatine, enz. te onderscheiden (zie Methoden). Gedetailleerde histonmodificatiepatronen voor deze chromatinetoestanden worden getoond in figuur 1C. We merken op dat 15 groot genoeg is om de diversiteit van epigenetische modificaties vast te leggen, terwijl het nog steeds klein genoeg is om een ​​voldoende populatie van elke staat te garanderen voor een robuuste conclusie van interactieparameters daartussen (Figuur A1 in S1 Ondersteunende informatie). We hebben verder een verborgen Markov-model met 20 toestanden bestudeerd en ontdekten dat een verdere toename van het aantal toestanden niet leidt tot de ontdekking van extra epigenetische klassen met significante populaties (Figuur A2 in S1 Ondersteunende informatie). Een polymeerparel wordt verder gelabeld als een CTCF-plaats om chromatine-lusgrenzen te markeren als zowel CTCF- als cohesine-moleculen aanwezig blijken te zijn in het overeenkomstige genomische gebied. We definiëren de oriëntatie van deze CTCF-sites door het onderliggende CTCF-motief en de relatieve positie van CTCF-moleculen ten opzichte van cohesine te analyseren. Details voor de definitie van CTCF-bindingsplaatsen worden gegeven in: Methoden:.

De potentiële energie voor een bepaalde chromatineconfiguratie R is een som van drie componenten, en uchroom(R) = u(R) + uCS(R) + uCTCF(R). u(R) is een generiek polymeerpotentieel dat is opgenomen om de continuïteit van het chromatine te waarborgen en om het uitgesloten volume-effect tussen genomische loci af te dwingen. uCS(R) is een belangrijke innovatie van het chromatinemodel en is cruciaal om de vorming van TAD's en compartimenten vast te leggen. Het kwantificeert de chromatinetoestand-specifieke interactie-energieën tussen paren loci. Zoals gedetailleerd in Sectie: Fysische principes van chromatine-organisatie en Methoden:, we gebruikten een algemeen formulier voor uCS(R) om zijn afhankelijkheid van genomische scheiding vast te leggen. uCTCF(R) is geïnspireerd op het lusextrusiemodel [29-31] en vergemakkelijkt de vorming van lusdomeinen die worden omsloten door paren CTCF-bindingsplaatsen in convergente oriëntatie (figuur 1A). Beide uCS(R) en uCTCF(R) bevatten instelbare parameters die kunnen worden afgeleid uit Hi-C-gegevens volgens de optimalisatieprocedure die is ontwikkeld door een van de auteurs [64,65]. Segmenten van chromosomen 1, 10, 19 en 21 van GM12878-cellen werden gebruikt voor parametrering om een ​​voldoende dekking van alle chromatinetoestanden te garanderen (zie figuur A1 in S1 ondersteunende informatie). Gedetailleerde uitdrukkingen voor de potentiële energie en de parametreringsprocedure worden gegeven in Methoden: en in de S1 ondersteunende informatie.

Met behulp van de geparametriseerde energiefunctie hebben we het ensemble van chromatinestructuren gesimuleerd en de bijbehorende contactwaarschijnlijkheidskaart bepaald voor een 20 Mb-regio van chromosoom 1 van GM12878-cellen. Zoals getoond in figuur 2A, komt de gesimuleerde contactkaart goed overeen met die gemeten door Hi-C-experimenten van Ref. [7] en reproduceert het algehele blokgewijze dambordpatroon dat overeenkomt met de compartimentering van chromatinedomeinen. Een ingezoomde weergave langs de diagonaal van de contactkaart in figuur 2B en 2C suggereert verder dat chromatine-TAD's en -lussen ook goed worden gereproduceerd. Vergelijkbare vergelijkingen voor andere chromosomen die worden gebruikt bij het parametriseren van het model worden gegeven in figuur B in S1 ondersteunende informatie. We merken op dat de lengte 20 Mb is gekozen voor rekenefficiëntie, maar het model kan gemakkelijk worden gegeneraliseerd naar langere chromatinesegmenten (zie figuur C in S1 ondersteunende informatie).

(A) Resultaten van simulatie en het Hi-C-experiment uitgevoerd in Ref. [7] zijn respectievelijk in de bovenste en onderste driehoek weergegeven op een logschaal. Ook getoond aan de linker- en bovenste panelen zijn de sequentie van chromatinetoestanden en de genomische posities van CTCF-bindingsplaatsen. (B) een ingezoomde weergave van de contactkaarten langs het diagonale gebied om de vorming van TAD's te markeren. TAD-grenzen die zijn gedetecteerd met behulp van de software TADbit, worden bovenaan de contactkaart uitgezet, met de simulatie in cyaan en experiment in grijs. (C) Ingezoomde weergave van verschillende representatieve regio's langs de diagonaal om de vorming van chromatine-lussen te markeren. (D) Een representatieve chromatinestructuur voorspeld door het rekenmodel wordt getekend in een buisrepresentatie en gekleurd door chromatinetoestanden. (E) De gemiddelde contactkans als functie van de genomische scheiding wordt hieronder weergegeven op een log-logschaal voor respectievelijk de gesimuleerde (blauwe) en experimentele (rode) contactkaarten.

Om verder te gaan dan de visuele inspectie en de correlatie tussen gesimuleerde (GM-Sim) en experimentele (GM-Exp) contactkaarten te kwantificeren, hebben we de Pearson-correlatiecoëfficiënt (PCC) tussen de twee voor chromosoom 1 berekend en vastgesteld dat deze hoger is dan 0,96.Belangrijk is dat dit aantal hoger is dan de PCC (0,94) tussen GM-Sim- en Hi-C-gegevens van IMR90-cellen (IMR-Exp). Het opsplitsen van de PCC op verschillende genomische scheidingen ondersteunt ook dat GM-Sim meer gecorreleerd is met GM-Exp op alle bereiken dan met IMR-Exp (Figuur D in S1 Ondersteunende informatie). Daarnaast hebben we ook de voor de stratum gecorrigeerde correlatiecoëfficiënt (SCC) bepaald die rekening houdt met het afstandsafhankelijkheidseffect van contactkaarten door ze te stratificeren volgens de genomische afstand [68], en verkregen 0,7 voor GM-Sim/GM-Exp , en 0,66 voor GM-Sim/IMR-Exp. Daarom valideert SCC-analyse ook het vermogen van ons model bij het reproduceren van Hi-C-contactkaarten en bij het vastleggen van het onderscheid tussen celtypen. We merken op dat de grootte van SCC gevoelig kan zijn voor de afvlakkingsparameter die bij de berekening wordt gebruikt en met voorzichtigheid moet worden geïnterpreteerd (Figuur E in S1 Ondersteunende informatie).

We hebben de overeenkomst tussen gesimuleerde en experimentele contactkaarten verder onderzocht met behulp van meerdere functiespecifieke statistieken. Eerst definiëren we de contactverbetering voor een paar genomische loci als de verhouding van hun contactkansen over de gemiddelde contacten gemiddeld over een lokaal geselecteerd achtergrondgebied (zie figuur F1 in S1 ondersteunende informatie). De contactverbetering voor chromatine-lussen van chromosoom 1 is altijd groter dan één, wat wijst op een sterke verbetering van ruimtelijke colokalisatie tussen lusankers. Bovendien vertoont meer dan 74% van de lusparen een contactverbetering die groter is dan het 90e percentiel van de verdeling voor willekeurige genoomparen. Deze willekeurige paren worden geselecteerd ongeacht de CTCF-bezetting, maar met vergelijkbare sequentiescheidingen als die gevonden in chromatinelussen. Daarom, als we het 90e percentiel van de willekeurige verdeling als drempel (1,16) gebruiken en alle convergente CTCF-paren als lussen voorspellen, zal de voorspelling een fout-negatief percentage hebben van 26% en een fout-positief percentage van minder dan 10%. De fout-positieve waarde is een bovengrens, aangezien de meeste willekeurige paren niet worden geflankeerd door convergente CTCF. De gevoeligheid van chromatine-lusvoorspellingen op de drempel wordt getoond in figuur F2 in S1 ondersteunende informatie. Het is de moeite waard erop te wijzen dat de contactverbetering voor chromatine-lussen berekend met behulp van Hi-C-gegevens in het algemeen groter is dan gesimuleerde waarden en beter scheidt van die voor willekeurige paren (Figuur F3 in S1 Ondersteunende informatie). De overlap tussen de twee distributies in onze simulatie is te wijten aan het feit dat willekeurige paren een aanzienlijk deel van convergente CTCF-paren bevatten waarvan de contacten zijn verbeterd als gevolg van de potentiële uCTCF(R). Veel van deze paren worden echter niet herkend als lussen in Hi-C, en er zijn waarschijnlijk meer geavanceerde algoritmen dan eenvoudige bindingsplaatsoriëntaties nodig om lusvormende CTCF-paren te identificeren [69].

Om verder te gaan dan CTCF-gemedieerde contacten en het vermogen van ons model om sterke interacties tussen genomische loci te reproduceren te evalueren, selecteerden we statistisch significante contactparen uit gesimuleerde en experimentele contactkaarten voor chromosoom 1 met behulp van de software Fit-Hi-C [48] (Figuur G in S1 Ondersteunende informatie). Als kwantitatieve maatstaf definiëren we de matchingscore als het percentage experimentele paren dat kan worden gevonden in de lijst die is geëxtraheerd uit simulatie. De omgekeerde matching-score kan op dezelfde manier worden gedefinieerd als het percentage gesimuleerde paren dat in de experimentele lijst wordt gevonden. De matchingscore voor de top 1000 chromatinecontacten wordt bepaald op 46% en 52% voor de reverse matching. Om specifieke interacties tussen regulerende elementen te onderzoeken, hebben we een vergelijkbare analyse uitgevoerd door de top 100 enhancer (state: EnhW1)-promotor (state: PromD1) paren met de hoogste contactkansen te selecteren op basis van gesimuleerde en experimentele contactkaarten. We vinden dat meer dan 70% van de experimentele paren wordt vastgelegd in onze simulatie voor chromosoom 1. Deze resultaten suggereren dat ons model op basis van chromatinetoestanden en CTCF-medierende interacties in staat is om een ​​groot deel van de significante contacten te reproduceren die zijn gedetecteerd in Hi-C-experimenten. Verdere verbetering van het vermogen van het model bij het voorspellen van functioneel belangrijke paren zou mogelijk vereisen dat rekening wordt gehouden met het effect van andere eiwitten, zoals YY1 waarvan bekend is dat ze chromatine-interacties mediëren [70], en zal een interessante toekomstige richting zijn.

Vervolgens bepaalden we de correlatiecoëfficiënten tussen de top vijf eigenvectoren voor gesimuleerde en experimentele contactmatrices. Zoals weergegeven in figuur H in S1 ondersteunende informatie, reconstrueren de contactkaarten die zijn gereconstrueerd met alleen deze eigenvectoren de vorming van TAD's en compartimenten die in de originele kaarten zijn waargenomen. De hoge correlatie tussen gesimuleerde en experimentele eigenvectoren (met PCC van ongeveer 0,8) ondersteunt dat de overeenkomstige kenmerken goed worden vastgelegd door het rekenmodel, en bevestigt de kwalitatieve waarnemingen van figuur 2 en figuur B in S1 ondersteunende informatie.

Om de kwaliteit van gesimuleerde TAD's nader te onderzoeken, hebben we het isolatieprofiel berekend door een uniform vierkant van 500 kb × 500 kb langs de diagonaal van de contactmatrix te schuiven en het gemiddelde te nemen over alle contacten binnen het vierkant. De minima van dit profiel kunnen worden gebruikt om TAD-grenzen te identificeren, aangezien inter-TAD-contacten schaarser zijn in vergelijking met intra-TAD-contacten, wat resulteert in een daling van het isolatiescoreprofiel wanneer het schuifvenster TAD-grenzen overschrijdt [71]. De PCC tussen experimentele en gesimuleerde isolatieprofielen voor chromosoom 1 is 0,7. We vinden dat de matchingscore voor TAD-grenzen 80% is en 100% voor de reverse matching. Als een andere onafhankelijke validatie bepaalden we TAD-grenzen met behulp van de software TADbit [43], en ontdekten dat de gesimuleerde resultaten weer goed overeenkwamen met experimentele (zie figuur I in S1 Ondersteunende informatie).

Om de overdraagbaarheid van het rekenmodel over chromosomen en celtypen aan te tonen, hebben we aanvullende simulaties uitgevoerd voor chromosomen van GM12878-, K562- en Hela-cellen, waarvan de Hi-C-gegevens niet werden opgenomen tijdens de parametreringsprocedure. Zoals weergegeven in figuur 3 en figuur J in S1 ondersteunende informatie, zijn deze: de novo voorspellingen komen goed overeen met experimentele resultaten zoals gemeten door PCC (Fig 3B) en SCC (Fig 3C) tussen experimentele en gesimuleerde contactkaarten, overeenkomende score tussen TAD-grenzen gedetecteerd uit het isolatieprofiel (Fig 3D) en uit TADbit (Figuur K1A in S1 ondersteunende informatie), PCC tussen experimentele en gesimuleerde isolatieprofielen (Figuur K1D in S1 Ondersteunende Informatie), matching score tussen significante contacten gedetecteerd met Fit-Hi-C (Fig 3E), matching score tussen interagerende enhancer-promotor paren (Figuur K2C in S1 ondersteunende informatie), correlatiecoëfficiënten van de top vijf eigenvectoren (figuur 3F en figuur H in S1 ondersteunende informatie), en vals-negatieve snelheid van lusvoorspellingen (figuur 3F). Bovendien slaagt het model erin de celtypespecificiteit van Hi-C-contactkaarten te onthullen, en de gesimuleerde contactkaarten zijn altijd meer gecorreleerd met de overeenkomstige experimentele gegevens van hetzelfde celtype dan met die van IMR90-cellen (lichte kleuren in Fig 3B en 3C). De overeenkomende scores tussen experimentele en simulatieresultaten zijn ook significant hoger dan die berekend tussen experimentele en controlegegevens (lichte kleuren in Fig 3D en 3E), die werden verkregen door willekeurig de grootte van lussen / versterker-promotorparen / TAD's langs het chromosoom te schudden terwijl hun totale aantal ongewijzigd blijft. Het succes van deze de novo voorspellingen ondersteunt dat het op chromatine-toestand gebaseerde model dat hier is geïntroduceerd, een consistente beschrijving biedt van de 3D-genoomorganisatie over celtypen.

(A) Vergelijking tussen gesimuleerde (Rechtsboven) en experimenteel (Linksonder) contactkaarten voor chromosoom 2 van GM12878 (Links), K562 (Midden), en Hela-cellen (Rechts). (BE) Kwaliteit van computationele voorspellingen voor alle chromosomen van de drie celtypen gemeten door Pearson (PCC) en stratum-aangepaste correlatiecoëfficiënten (SCC) tussen gesimuleerde en experimentele contactkaarten (B,C), overeenkomende score voor TAD-grenzen gedetecteerd door isolatie profielen (D) en bijpassende score voor de top 1000 significante contacten (E). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt één chromosoom. Gegevens weergegeven als lichte kleuren in (B,C) komen overeen met PCC/SCC tussen gesimuleerde en IMR90 experimentele contactkaarten, terwijl die in (D,E) overeenkomen met overeenkomende scores tussen experimentele en controlegegevens. De vakjes vertegenwoordigen de 25% en 75% hoeveelheden van de overeenkomende scoreverdeling, en de dikke lijn binnen elk vakje komt overeen met de mediaanwaarde. Whiskers geven de laatste waarden aan die binnen 1,5 keer het interkwartielbereik vallen. (F) gemiddelde correlatiecoëfficiënten tussen de top vijf eigenvectoren voor de logaritme van contactmatrices voor alle drie celtypen. Foutbalken komen overeen met standaarddeviaties van de resultaten voor alle chromosomen. (G) Vals-negatieve tarieven voor het voorspellen van chromatine-lussen geïdentificeerd in Hi-C-gegevens met convergente CTCT-bindingsplaatsen in verschillende celtypen.

Structurele karakterisering van chromatine-organisatie

Vervolgens analyseren we de gesimuleerde 3D-structurele ensembles om extra inzicht te krijgen in de chromatine-organisatie. In overeenstemming met eerdere experimentele en theoretische studies [37,72,73], reproduceert ons model de clustering van de actieve chromatinetoestand en hun voorkeurslocatie aan de buitenkant van chromosomen (Figuur L in S1 Ondersteunende informatie).

Superresolutie-beeldvormingsexperimenten onderzoeken de organisatie van chromatine in de 3D-ruimte om ruimtelijke afstanden tussen genomische segmenten te kwantificeren. Deze 3D-metingen kunnen direct worden vergeleken met gesimuleerde chromatinestructuren en bieden zo een cruciale validatie van het rekenmodel dat is geparametriseerd op basis van Hi-C-experimenten met onafhankelijke datasets. Om de algehele compactheid van verschillende chromatinetypen te begrijpen, hebben we een reeks actieve, repressieve en inactieve chromatines geselecteerd en hun gyratiestralen bepaald uit het ensemble van gesimuleerde structuren. Deze verschillende chromatinetypen worden geïdentificeerd met behulp van twee belangrijke histonmarkeringen H3K4me2 en H3K27me3 (figuur 4A). De volledige lijst van chromatinedomeinen met hun genomische locaties vindt u in het uitgebreide gegevensblad. Zoals getoond in figuur 4B, neemt de gyratiestraal toe bij grotere genomische scheiding na een machtswetgedrag in alle gevallen met exponenten van respectievelijk 0,34, 0,31 en 0,23 voor de drie chromatinetypen. Deze schaalexponenten zijn in kwantitatieve overeenstemming met beeldvormingsmetingen die zijn uitgevoerd voor Drosophila-chromosomen [12] en ondersteunen het idee dat actieve chromatines minder gecondenseerde conformaties aannemen om genactiviteit te bevorderen. In overeenstemming met het beeldvormende onderzoek uitgevoerd op chromosoom 21 van IMR90-cellen [13,20], nemen we ook een sterke correlatie waar tussen Hi-C-contactwaarschijnlijkheden en ruimtelijke afstanden voor paren van genomische loci (Fig 4C).

(A) Karakteristieke histon-modificatieprofielen voor repressieve, actieve en inactieve chromatine. (B) De afmetingen van repressieve (blauwe), actieve (oranje) en inactieve (groene) chromatine-domeinen, gemeten aan de hand van hun draaistraal, worden uitgezet als een functie van de genomische scheiding op een log-schaal. De rechte lijnen komen overeen met numerieke passingen van de gegevens met een machtswet-uitdrukking R = ROL α , met de waarden van α weergegeven in de legende. Representatieve structuren met een lengte van 500 kb voor de drie chromatinetypen worden in de inzet getoond. Foutbalken komen overeen met standaarddeviaties van structuren van het gehele gesimuleerde ensemble. (C) Scatterplot van de contactkansen tussen paren van genomische loci versus hun ruimtelijke afstanden weergegeven op een log-logschaal. De zwarte lijn past het beste bij de gegevens met behulp van de uitdrukking P = POR β , met β = −4.18.

Een van de meest opvallende kenmerken die zijn onthuld door Hi-C-experimenten met hoge resolutie, is de vorming van chromatine-lussen die verankerd zijn in paren convergerende CTCF-sites [7,10,74,75]. Microscopiestudies die 3D-afstanden direct visualiseren met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) methoden, vinden verder dat deze lussen dynamisch zijn en dat ondanks hun hoge contactfrequenties lusankers niet in elke cel in nauw contact staan ​​[16,41,76]. In overeenstemming met hun dynamische aard, nemen chromatine-lussen in onze simulatie ook flexibele conformaties aan. Zoals getoond in figuur 5A, zien we voor de lus gevormd tussen chr1: 39.56-39.73 Mb een grote variantie in de kansverdeling van de end-to-end afstanden. Aanvullende resultaten voor andere lusparen worden gegeven in figuur M in S1 Ondersteunende informatie. Twee voorbeeldconfiguraties van het lusdomein met een afstand van 0,08 en 0,24 m worden weergegeven in de inzet. Een systematische karakterisering van alle lussen geïdentificeerd in Ref. [7] voor het gesimuleerde chromatine-segment laat zien dat de conformationele flexibiliteit inderdaad algemeen is, hoewel er een trend is in afnemende variantie voor lussen met grotere contactkansen (figuur 5B). We benadrukken ook dat hoewel hogere contactkansen over het algemeen overeenkomen met kleinere end-to-end-afstanden, hun relatie niet strikt monotoon is. De tegenovergestelde correlatie is in veel gevallen te zien in figuur 5B. Dergelijke schijnbaar paradoxale waarnemingen zijn inderdaad gevonden in eerdere experimentele onderzoeken die 3C vergelijken met FISH-experiment [16,77], en kunnen natuurlijk ontstaan ​​als gevolg van dynamische looping of loop-extrusie [78].

(A) kansverdeling van de end-to-end afstand voor de chromatine-lus gevormd tussen chr1:39.56 Mb en chr1:39.73 Mb van GM12878-cellen (blauw) en voor een willekeurig genomisch paar (geel). Twee voorbeeldconfiguraties die overeenkomen met open en gesloten chromatine-lusstructuren worden weergegeven in de inzet. (B) End-to-end-afstanden van chromatine-lussen versus hun overeenkomstige contactkansen. De gearceerde gebieden vertegenwoordigen de varianties in afstanden geschat op basis van het gesimuleerde structurele ensemble.

In vergelijking met chromatine-lussen zijn TAD's langer en worden ze gestabiliseerd door een complexe reeks interacties [79]. De analyse van hun structurele ensemble is minder eenvoudig en de end-to-end-afstand is mogelijk niet voldoende voor een getrouwe beschrijving van hun conformationele fluctuatie [80]. Het is wenselijk om TAD-structuren te analyseren met behulp van reactiecoördinaten die niet alleen helpen om verschillende clusters van chromatine-conformaties te onderscheiden, maar ook inzicht kunnen geven in het mechanisme van TAD-vouwing en -vorming. Door ideeën te lenen uit eiwitvouwstudies, benaderen we deze reactiecoördinaten met behulp van collectieve variabelen met de langzaamste relaxatietijdschalen zoals bepaald volgens de diffusiekaartanalyse [81,82]. Progressie langs deze variabelen benadert goed de meest waarschijnlijke overgang tussen twee sets structuren en kan daarom licht werpen op het pad voor conformationele herschikkingen. Diffusiekaartanalyse is met succes toegepast op een verscheidenheid aan systemen om mechanistische inzichten te verschaffen over de conformationele dynamiek die betrokken is bij eiwitvouwing, liganddiffusie, enz. [83,84].

We hebben de diffusiekaarttechniek toegepast op het voorspelde structurele ensemble van de genomische regio chr1: 34-38 Mb van GM12878-cellen die uit drie zichtbare TAD's bestaat. Zoals getoond in figuur 6, worden verschillende bassins waargenomen in de waarschijnlijkheidsverdeling van chromatine-conformaties die op de eerste twee reactiecoördinaten worden geprojecteerd, wat de aanwezigheid van meerdere stabiele TAD-structuren suggereert, in plaats van een unieke. Conformationele heterogeniteit in TAD's is inderdaad waargenomen in een recent beeldvormingsonderzoek met superresolutie dat eencellige chromatinestructuren kenmerkt [20]. Om fysieke intuïtie te krijgen over de reactiecoördinaten en inzicht te krijgen in de overgang tussen TAD-structuren, hebben we de bijbehorende contactkaarten berekend bij verschillende waarden van deze coördinaten. Zoals weergegeven in het bovenste paneel, legt reactiecoördinaat één de vorming van contacten tussen TAD1 en TAD3 vast, terwijl de structuren voor alle drie TAD's relatief intact blijven. Aan de andere kant leidt progressie langs reactiecoördinaat twee (linkerpaneel) tot significante overlappingen tussen TAD1 en TAD2. Interactie tussen TAD2 en TAD3 kan ook worden waargenomen langs een derde coördinaat, zoals weergegeven in figuur N in S1 ondersteunende informatie. Op het rechterpaneel staan ​​ook voorbeeldstructuren voor de drie TAD's in verschillende regio's. Deze resultaten zijn consistent met het idee dat TAD's stabiele structurele eenheden zijn voor genoomorganisatie [79], maar suggereren ook de aanwezigheid van significante overspraak tussen naburige TAD's [85].

(Centrum) Vrije-energieprofiel van TAD-conformaties geprojecteerd op twee coördinaten die de langzaamste collectieve bewegingen beschrijven. De (Links) en (Bovenkant) panelen illustreren de verandering in contactkaarten langs de twee coördinaten. (Rechts) Representatieve structuren voor het chromatinesegment op verschillende posities geven aan in het centrale en onderste paneel. De drie contactkaarten voor reactiecoördinaat 1 werden berekend met behulp van chromatinestructuren die vallen in de regio's [-2.5, -0.5), [-0.5, 0.5) en [0.5,1.5). De drie regio's die worden gebruikt om de contactkaarten voor reactiecoördinaat 2 te bepalen, zijn [-2,5, -1,0), [-1,0, 1,5) en [1,5, 3,5).

Fysische principes van chromatine-organisatie

Hoewel het exacte moleculaire mechanisme en de drijvende kracht voor het vouwen van chromatine ongrijpbaar blijven, wordt het steeds duidelijker dat verschillende moleculaire spelers betrokken zijn bij het organiseren van het chromatine op verschillende lengteschalen [49,60,86,87]. Transcriptiefactoren en architecturale eiwitten zijn bijvoorbeeld van cruciaal belang bij het stabiliseren van de vorming van chromatine-lussen en TAD's [4,33,79]. Aan de andere kant dragen nucleaire compartimenten, zoals de nucleolus en de nucleaire envelop, bij aan chromatinecompartimentalisatie en bemiddelen ze contacten tussen chromatinedomeinen gescheiden door tientallen Mb in volgorde [50,88]. We verwachten dat deze verschillende moleculaire mechanismen aanleiding zullen geven tot verschillende interactie-energieën op verschillende genomische lengteschalen. Bijvoorbeeld, voor hetzelfde paar chromatinetoestanden, aangezien de genomische scheiding daartussen gevarieerd is, zou de interactie-energie die hun contact stabiliseert, moeten variëren. In het volgende onderzoeken we de afhankelijkheid van afgeleide contactenergieën van genomische scheiding om de principes van genoomorganisatie te onthullen.

Fig 7A presenteert de afgeleide contactenergieën tussen chromatinetoestanden uCS(R) op verschillende genomische scheidingen (500kb, 1,5 Mb, 4 Mb en 10 Mb van links naar rechts), met respectievelijk blauw en rood voor aantrekkelijke en weerzinwekkende interacties. Een opmerkelijk kenmerk voor alle vier de lengteschalen is de duidelijke verdeling van chromatinetoestanden in ten minste twee groepen die respectievelijk overeenkomen met bekende actieve en repressieve chromatines. Er worden bijvoorbeeld aantrekkelijke interacties waargenomen tussen de bovenste helft van chromatinetoestanden die promotors (PromD1, PromU), versterkers (TxEnh5, Enhw1) en genlichaam (Tx) omvatten, en voor de onderste helft die inactief chromatine (Quies) omvat, polycomb onderdrukt domein (ReprPC) en heterochromatine (Het).De ongunstige interacties tussen actieve en repressieve chromatines zullen hun fasescheiding aansturen, getoond in figuur 2D en figuur L in S1 ondersteunende informatie. De verdeling van chromatinetoestanden in actieve en inactieve groepen blijkt ook uit het dendrogram getoond in figuur 7B, en de eigenvectoren voor de grootste eigenwaarde van de interactiematrices getoond in figuur 7C.

(A) Warmtekaarten voor de interactiematrices bij verschillende genomische scheidingen, waarbij blauw en rood respectievelijk overeenkomen met aantrekkelijke en weerzinwekkende interacties. We hebben het gemiddelde van de interactie-energieën afgetrokken om verschillende plots naar dezelfde schaal te verplaatsen. (B) Dendrogram berekend met behulp van de interactie-energiematrix op 1,5 Mb om de hiërarchische clustering van chromatinetoestanden te benadrukken. Het kleurschema is hetzelfde als in onderdeel (A). (C) De eigenvectoren die overeenkomen met de grootste eigenwaarden van de vier interactiematrices, waarbij grijs en rood respectievelijk positieve en negatieve waarden aangeven. (D) Pearson-correlatiecoëfficiënten tussen interactiematrices op verschillende schalen. (E) De complexiteitsmaat voor verschillende interactiematrices als functie van de index voor top eigenwaarden. Zie tekst voor de definitie van de complexiteitsmaatstaf.

Ondanks hun algemene overeenkomsten, verschillen de interactie-energieën bij verschillende genomische scheidingen van elkaar. Om hun verschillen te kwantificeren, hebben we de paarsgewijze Pearson-correlatiecoëfficiënten tussen de interactiematrices bepaald. Zoals getoond in figuur 7C, zijn de interacties die verantwoordelijk zijn voor de vorming van TAD (

1 Mb) inderdaad aanzienlijk verschillen van die welke leiden tot chromatinecompartimentering (

10 Mb), zoals blijkt uit de lage correlatie tussen hen. Opvallend is dat de correlatiecoëfficiënt tussen interactiematrices bij 4 Mb en 10 Mb groter is dan 0,9, wat wijst op de convergentie van chromatine-interacties bij grote genomische scheiding.

We vergeleken de complexiteit van de interactiematrices verder door de verhouding van de eerste . te berekenen N eigenwaarden over de som van alle eigenwaarden. Fig 7D plot deze complexiteitsmaat als een functie van N, en absolute waarden van de eigenwaarden werden gebruikt om de maat te berekenen. Voor alle drie matrices met genomische scheiding groter dan 1 Mb, vinden we dat de eerste zes eigenvectoren een groot deel van hun complexiteit kunnen verklaren (meer dan 80%). Deze observatie komt overeen met het succes van onze eerdere poging om de chromatine-organisatie te modelleren met zes compartimenttypen [37]. Er zijn echter meer eigenvectoren nodig, vooral voor korte afstand in sequentie-interacties, om de volledige matrixcomplexiteit vast te leggen. Deze resultaten benadrukken samen de aanwezigheid van verschillende mechanismen die het chromatine vouwen bij verschillende genomische scheidingen, en pleiten voor het belang van het gebruik van sequentielengte-afhankelijke contactenergieën.


Grafisch abstract

Combinaties van post-translationele modificaties van histon-eiwitten (PTM's of 'markeringen') werken als een synergetisch signaalplatform dat de chromatinefunctie reguleert. Momenteel is een groot aantal histonmodificaties bekend, zoals lysineacetylering (Kac), mono-, di- en trimethylering (Kme1/2/3), symmetrische en asymmetrische argininemethylering, argininedeïminering, serine- en threoninefosforylering en glycosylering, ADP ribosylering, lysine-ubiquitylering (Kub) en SUMOylering die de fysisch-chemische eigenschappen van chromatine direct kunnen veranderen en kunnen fungeren als herkenningsplaatsen voor chromatine-effectoreiwitten [1], [2]. Aan de andere kant verschijnt een andere reeks chemische modificaties op de DNA-matrijs zelf, niet alleen de belangrijkste 5-methyl-cytosine in CpG-dinucleotiden [3], maar ook cytosine-hydroxymethylering en hoger geoxideerde vormen [4]. De colokalisatie en ruimtelijke rangschikking van combinaties van histonmodificaties, samen met specifieke niet-histonchromatine-eiwitten (effectoren of regulatoren) vormen een chromatinetoestand en zijn gekoppeld aan de biologische functie. Fundamentele chromatinetoestanden omvatten heterochromatine, dat zeer compact is, gekenmerkt door H3 K9-methylering, histondeacetylering en door de aanwezigheid van heterochromatine-eiwit 1 (HP1), en waarbij genexpressie tot zwijgen wordt gebracht. Evenzo worden polycomb-onderdrukte regio's gekenmerkt door H3 K27-methylering en de aanwezigheid van polycomb-repressieve complexen 1 en 2 (PRC1, 2) [5]. Omgekeerd vertonen actieve chromatinegebieden, zoals transcriptioneel actieve genen, promotors en versterkers, verschillende graden van histonacetylering, methylering op H3 K4 en K36 en de aanwezigheid van een groot aantal verschillende effectoreiwitten, waaronder RNA-polymerase II en algemene transcriptiefactoren [6 ]. DNA-methylatiepatronen hebben belangrijke functies bij genregulatie op lange termijn en epigenetische overerving [7], terwijl ons begrip van de rol van DNA-hydroxymethylatie nog steeds beperkt is [8], [9].

De buitengewoon hoge complexiteit van mogelijk naast elkaar bestaande histon-PTM's erkennend, werd de hypothese van een 'histoncode' naar voren gebracht om een ​​causaal verband tussen PTM-patronen en genoomfunctie vast te stellen [10]. Histon-modificaties kunnen de DNA-toegankelijkheid en de chromatinestructuur veranderen. Bovendien kunnen ze dienen als bindingsplaatsen voor chromatine-effectoreiwitten zoals histonmodificerende enzymen. Veel effectoren bevatten een of meerdere eiwitdomeinen die specifiek interageren met histonmodificaties ('reader'-domeinen). Voorbeelden zijn chromo-, tudor-, WD40- en kwaadaardige hersentumor MBT-domeinen (die Kme1/2/3 binden), bromodomeinen (BD, die Kac herkennen), 14-3-3 domeinen (binden gefosforyleerde serines) en plant homeodomein PHD vingers (herken ongemodificeerde of gemethyleerde lysines) [11]. Individuele interacties tussen chromatine-eiwitten en histonen zijn vrij zwak en vertonen dissociatieconstanten (KNS) in het micromolaire bereik [12]. Daarom is een enkele PTM-lezer-domeininteractie mogelijk niet voldoende om een ​​bepaald effector-gemedieerd gevolg te transduceren. Een aanzienlijk aantal chromatine-effectoren bevat inderdaad meerdere leesdomeinen, of bestaat in complexen van hogere orde die meerdere chromatine-interactiemotieven bevatten. De combinatorische werking van verschillende (lage affiniteit) leesdomeinen (inclusief andere eiwit-eiwit- of eiwit-DNA-interactiedomeinen) maakt gelijktijdige herkenning mogelijk van meerdere histon-PTM's die naast elkaar bestaan ​​op een nucleosoom op een multivalente manier, met sterk verhoogde affiniteit [12] , [13]. Dit presenteert een interessante mechanistische hypothese hoe een chromatinetoestand, gekenmerkt door combinaties van PTM's, specifiek wordt uitgelezen door effectoren en vertaald in een biologische output. Sinds de ontwikkeling van dit model [13] zijn er verschillende voorbeelden van dergelijke interacties waargenomen en bestudeerd [14], [15], [16], [17].

Naast thermodynamische overwegingen is de gemiddelde verblijftijd op een bepaalde chromatine-locus een kritische parameter voor effectoractie. Grootschalige chromatinecompartimenten, zoals heterochromatine, zijn zeer stabiel, terwijl de individuele factoren snel worden uitgewisseld met oplosbare eiwitten [18]. Dit maakt een snelle reactie op prikkels mogelijk, b.v. voor chromatine-remodellering bij herstel van DNA-schade [19]. Een dergelijke kneedbaarheid kan worden opgevat als een resultaat van veel zwakke effector-chromatine-interacties, geassocieerd met snelle dissociatiesnelheidsconstanten. In deze context zijn multivalente interacties een aantrekkelijke manier om selectiviteit tot stand te brengen met behoud van kinetisch dynamische interacties, omdat ze voornamelijk resulteren in een toename van de lokale concentratie van factoren in het doel-chromatinegebied, waardoor de bindingskinetiek wordt versneld [13]. Op zijn beurt kan er nog steeds lokale competitie voor bindingsplaatsen plaatsvinden en kan door processen zoals gefaciliteerde dissociatie [20], [21] snelle chromatinefactoruitwisseling plaatsvinden. Een cruciale factor voor een dieper begrip van dergelijke interacties is dus de lokale concentratie van zowel factoren als PTM's in de kern, en de resulterende interactie thermodynamica en kinetiek. Hoewel de mate van modificatie op bepaalde chromatine-loci grotendeels onbekend is, hebben recente bevindingen aangetoond dat nucleosomen vaak niet homogeen gemodificeerd zijn, maar dat veel histon-PTM's op een asymmetrische manier bestaan: één kopie van een bepaalde histon kan de ene modificatie bevatten, terwijl de andere kopie dat wel is. ongewijzigd of anders gewijzigd [22]. Dit kan belangrijke gevolgen hebben voor de stroomafwaartse uitlezing door multivalente effectoren.

Gemethyleerd DNA daarentegen werft zijn eigen set van geassocieerde eiwitten, bijvoorbeeld methyl CpG bindend eiwit 2 (MeCP2) en het SET- en RING-geassocieerde (SRA) domein in het ubiquitine-achtige, met PHD- en RING-vingerdomeinen 1 (UHRF1)-complex. Daarentegen worden andere DNA-bindende eiwitten uit hun doelsequenties verdreven door methylering, wat resulteert in een celspecifieke biologische output [23]. Samenvattend definiëren patronen van naast elkaar bestaande chromatinemodificaties en geassocieerde effectoren verschillende chromatinetoestanden, die correleren met de expressieniveaus van onderliggende genen, splicingactiviteit en replicatie- en reparatieprocessen [24], [25]. Chromatinetoestanden kunnen gedurende celgeneraties aanhouden en zijn betrokken bij de regulatie van celdifferentiatie en afstammingsverplichting. Daarom kan worden aangenomen dat de combinatie van de chemische modificaties in DNA en histonen, de geassocieerde effector-eiwitten en de structurele toestanden van chromatine bijdragen aan epigenetische overerving [26].

Momenteel breidt de kennis over de locatie en hoeveelheden, evenals de combinatorische complexiteit en dynamiek van histon-modificaties in celpopulaties zich snel uit door genoombrede onderzoeken waarbij gebruik wordt gemaakt van ChIP-Seq-methodologieën [27] en op massaspectrometrie (MS) gebaseerde onderzoeken [28]. Bovendien zijn er ChIP-methodologieën met een laag aantal cellen en tijdsafhankelijke, waardoor ChIP-analyse op kleine steekproefgroottes mogelijk wordt, informatieverlies door middeling van het ensemble wordt geminimaliseerd en kinetisch onderzoek mogelijk is [29], [30], [31], [32]. Het moleculaire mechanisme van de functie van PTM's is echter slecht begrepen, informatie over de dynamiek van een enkele cel van modificaties ontbreekt vaak en de biologische stroomafwaartse effecten van het epigenetische PTM-landschap blijven ongrijpbaar.


Toegangsopties

Krijg volledige toegang tot tijdschriften voor 1 jaar

Alle prijzen zijn NET prijzen.
De btw wordt later bij het afrekenen toegevoegd.
De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Krijg beperkte of volledige toegang tot artikelen op ReadCube.

Alle prijzen zijn NET prijzen.


Beschikbaarheid van gegevens en materialen

C++-broncode voor het vouwen van chromatine-polymeer en uitgebreide tutorials die demonstreren hoe simulaties voor het vouwen van polymeren kunnen worden geconfigureerd, zijn openbaar beschikbaar via git-repository [72]. Evenzo zijn C++-broncode voor onze Bayesiaanse Hi-C deconvolutie Gibbs-sampler en loci-modelleringsscripts ook beschikbaar via git [73, 74]. De broncodeversies die specifiek in dit werk worden gebruikt, zijn beschikbaar via Zenodo open-access repository [75]. Alle broncode is gelicentieerd onder de GNU General Public License v3.0.


Resultaten

PSC kan nucleosomale arrays oligomeriseren

Om de interactie tussen PSC en chromatine te analyseren met elektronenmicroscopie (EM) en STEM, hebben we PSC geïncubeerd met 4 nucleosoom (4N) arrays in een verhouding van 0,4𢍡. Deze concentratie verwijst naar de actieve concentratie voor DNA-bindende PSC-preparaten zijn doorgaans 20�% actief, ervan uitgaande dat het eiwit DNA bindt als een monomeer. De resulterende complexen werden verknoopt met glutaaraldehyde en gefractioneerd door sucrosegradiëntsedimentatie (Figuur la). Arrays die niet waren geïncubeerd met PSC-sediment, voornamelijk in fracties 2 en 3. Arrays die waren geïncubeerd met PSC werden verdeeld tussen fracties 3 en 7 (inclusief de pellet). Analyse van deze fracties op natieve agarosegels geeft aan dat een reeks eiwit-DNA-complexen met progressief verminderde mobiliteit in de fracties aanwezig is. De gevormde complexen zijn discreet, wat suggereert dat ze verschillende aantallen nucleosomale arrays kunnen bevatten. Het is onwaarschijnlijk dat de verschillen in mobiliteit alleen kunnen worden gegenereerd door meer PSC-moleculen aan elke array te binden vanwege de lage verhoudingen van PSC tot nucleosomen die worden gebruikt, en omdat de hoeveelheid toegevoegde massa voor elke PSC (169 kDa) klein is in verhouding tot de massa van elke array (0,9 MDa). Het materiaal in deze fracties hebben we met elektronenmicroscopie onderzocht. EM laat zien dat nucleosomale arrays alleen een uitgebreide conformatie aannemen, hoewel er ook 4 nucleosoomcirkels en enkele meer verdichte vormen werden waargenomen (Fig. 1b). PSC-gebonden arrays vormen vrij uniforme afzonderlijke deeltjes. Af en toe werden meerlobbige structuren waargenomen (afbeelding rechtsonder in figuur 1b), maar elke lob heeft een grootte die waarschijnlijk een individuele array vertegenwoordigt. We maten de maximale diameter van arrays van drie fracties (Fig. 1c) (zoals in [15]). PSC-chromatinecomplexen hebben significant kleinere diameters dan arrays alleen (Fig. 1d). Diameters nemen progressief toe naar de onderkant van de gradiënt, consistent met de deeltjes met verschillende samenstellingen. Samen suggereren deze resultaten dat de grotere, enkelvoudige deeltjesstructuren die in lagere fracties worden waargenomen, oligomeriseerde structuren zijn die meer dan één nucleosomale reeks omvatten. De gemiddelde diameters zijn veel kleiner dan de additieve diameter van twee of meer gecompacteerde arrays, wat suggereert dat de geoligomeriseerde structuren zeer compact zijn.

( a ) Representatieve glycerolgradiëntzuivering van nucleosomale sjablonen met en zonder PSC voor EM en STEM. Vakken geven fracties aan die zijn geselecteerd voor analyse. (b) Representatieve EM-beelden van aangegeven fracties. Foto's zijn gemaakt in een donker veld en zijn omgekeerd om het contrast te verbeteren. (c) Verdeling van maximale diameters van deeltjes bepaald op basis van microfoto's zoals die in (b). Merk op dat minder dan 10% van de 4N-arrays alleen een diameter heeft die groter is dan 95 nm en niet in de grafiek wordt weergegeven. (d) Samenvatting van diametermetingen. Merk op dat alle fracties van 4N-arrays geïncubeerd met PSC significant kleiner waren dan alleen 4N-arrays, en fracties 4 en 5 verschillen van 3. Tabel toont p-waarden voor de t-test van studenten (ongepaard, uitgaande van gelijke variantie in monsters).

Om te vragen of PSC nucleosomale arrays met een andere methode kan oligomeriseren, hebben we een gevestigde centrifugatietest [44] gebruikt. PSC werd geïncubeerd met 12-nucleosoomarrays bij toenemende concentraties. reacties werden in een microfuge gepelleteerd en de fractie van de array in de pellet versus het supernatant werd bepaald. Arrays alleen korrelen niet onder onze reactieomstandigheden, zoals verwacht. PSC vormt ook geen pellet onder deze omstandigheden [15] we hebben PSC op volle snelheid gecentrifugeerd voordat het aan reacties werd toegevoegd om eventuele grote aggregaten te verwijderen. Naarmate PSC wordt getitreerd in reacties, neemt de fractie arrays die pellets vormen toe (Fig. 2). Ongeveer 50% van de sjabloonpellets in een verhouding van 0,25 PSC's per nucleosoom, en de reactie verzadigt bij twee PSC's per nucleosoom. Samen zijn de resultaten van verschillende assays en met nucleosomale arrays van verschillende grootte consistent met het feit dat PSC nucleosomale arrays kan oligomeriseren.

(a) Nucleosomale arrays werden gemengd met PSC in de aangegeven verhoudingen en reacties werden gepelleteerd door centrifugatie in een microfuge. Proteïnase K gedigereerde monsters werden gescheiden door agarosegelelektroforese, gekleurd met SYBR-goud en gekwantificeerd. Twee verschillende voorbeelden van de test worden getoond dat er aanzienlijke variabiliteit werd waargenomen in deze test, hoewel de trend constant was. (b) Samenvatting van PSC-geïnduceerde oligomerisatie. Foutbalken zijn standaarddeviatie in deze en alle andere cijfers. n =𠂥.

Stoichiometrie van PSC en nucleosomen in PSC-chromatine-interactie

We hebben eerder vastgesteld dat volledige remming van chromatine-remodellering door PSC optreedt bij verhoudingen van ongeveer één PSC per nucleosoom, op basis van metingen van actieve concentraties [39]. Zoals hierboven besproken, weten we echter niet wat de actieve DNA-bindingsvorm is, zodat het mogelijk is dat meerdere PSC's binden aan enkele DNA's in bindingsassays. We hebben daarom geprobeerd de stoichiometrie van PSC naar nucleosomen direct te meten in gecompacteerd chromatine dat ongevoelig is voor chromatine-remodellering. We gebruikten STEM om de verhouding van PSC tot nucleosomen te bepalen. STEM kan deeltjesmassa's nauwkeurig meten met behulp van de lineaire relatie tussen elektronenverstrooiing door het monster en zijn molecuulmassa [45]. We analyseerden eerst glutaaraldehyde verknoopte PSC alleen door EM en door STEM. Door negatieve kleuring gevolgd door EM werden deeltjes van verschillende groottes waargenomen (Fig. 3a, b). Sommige hadden complexe structuren, maar veel zijn eenvoudige rechthoeken van de geschatte grootte die wordt verwacht voor een bolvormig eiwit van 169 kDa (8� nm). We merken op dat voorspeld wordt dat meer dan de helft van de sequentie in PSC intrinsiek ongeordend is [46], [47], dus het is interessant dat het eiwit een compacte in plaats van uitgebreide conformatie heeft.

(a) Representatieve EM-beelden van negatief gekleurde PSC. (b) Verdeling van diameters van negatief gekleurde PSC (n =�). (c) Massaverdelingen van STEM-analyse van PSC alleen (n =�). (d) Samenvatting van gemeten massa's van PSC. ( e ) Massaverdelingen van STEM-analyses. Gemeten massa's voor 4N en 4N + PSC zijn respectievelijk 0.97ଐ.01 MDa (n =�) en 1.67ଐ.03 MDa (n =�).

PSC werd geanalyseerd door STEM en we observeerden zes gemiddelde gemeten massa's in veelvouden van 0,17 MDa (PSC-monomeer voorspeld op 0,17 MDa) (Fig. 3c, d). Deze gegevens zijn consistent met het eiwit dat voorkomt in monomere en verschillende multimere vormen. Meer dan 70% van de waargenomen deeltjes hebben massa's die consistent zijn met multimeren, consistent met eerdere demonstraties dat PSC zichzelf kan associëren [48], en met de EM-gegevens. De meeste van deze multimeren zijn dimeren of trimeren. Dit, samen met eerdere gegevens die aangeven dat PSC multimeren vormt bij lage concentraties [48], suggereert dat de actieve DNA-bindende vorm van PSC een multimeer kan zijn.

We analyseerden 4N-arrays alleen en met PSC (met behulp van gradiëntfracties vergelijkbaar met de omkaderde in Fig. la). Alleen fracties die de snelst migrerende PSC-gebonden soorten bevatten, waarvan wordt verwacht dat ze voornamelijk complexen van enkele arrays bevatten, werden geanalyseerd (Figuur 3e). De gemiddelde gemeten massa van 4N-chromatine-templates alleen was 0,97ଐ,01 MDa, wat consistent is met de voorspelde massa van 0,92 MDa. Een enkele piekverdeling van massa's werd waargenomen voor PSC +4N-arrays en de gemiddelde massa van PSC-gebonden chromatine-templates was 1,67ଐ,03 MDa. Gecomprimeerde 4N-templates bevatten dus gemiddeld 4,1 PSC-moleculen (verwachte massa =𠂠.92+4൰.17 =𠂡.6MDa). De rechterschouder op de grafiek van PSC + 4N-arrays in Fig. 3e geeft aan dat de verdeling van het 4N + PSC-monster neigt naar hogere massa's. Deze structuren zouden meer dan één PSC-binding aan elk nucleosoom of binding van sommige nucleosomen door een PSC-multimeer kunnen weerspiegelen. Desalniettemin suggereren onze STEM-resultaten dat een minimale verhouding van 1 PSC tot 1 nucleosoom een ​​verdichte soort produceert. Deze stoichiometrie komt overeen met eerdere schattingen van de verhouding van PSC tot nucleosomen die nodig zijn om hermodellering van een nucleosomale array volledig te remmen [39].Deze stoichiometrie ondersteunt een model voor nucleosoomoverbrugging waarbij elk nucleosoom is gebonden door PSC en deze nucleosoom-gebonden PSC met elkaar interageren (Figuur 3e). De bevinding dat extra PSC's aan arrays kunnen binden, kan array-oligomerisatie verklaren, aangezien deze onbezette PSC's kunnen functioneren als plakkerige uiteinden om extra nucleosomen in trans.

De zure patch van histon H2A is niet nodig voor PSC-chromatine-interacties

Vervolgens onderzochten we het mechanisme dat PSC gebruikt om te interageren met nucleosomen. Interacties tussen nucleosomen, met name tussen de basisstaarten van histon H4 op één nucleosoom en een cluster van zure resten (de zure patch) van histon H2A op een ander nucleosoom, worden verondersteld een belangrijke rol te spelen bij chromatine-vouwing en array-oligomerisatie [49] x02013[51]. Hoewel eerdere elektronenmicroscopiegegevens aantoonden dat PSC chromatine kan comprimeren met getrypsiniseerde, staartloze histonen [15], is het mogelijk dat andere activiteiten zoals nucleosoomoverbrugging andere vereisten hebben dan chromatineverdichting. Bovendien interageren verschillende nucleosoombindende eiwitten (HMGN2, RCC1, LANA, Sir3 [52]) met de zure patch van histon H2A. Het is mogelijk dat PSC kan interageren met de H2A-zure patch om chromatine te compacteren. PSC is een basiseiwit (pI =𠂩.2), wat suggereert dat het histonstaarten zou kunnen vervangen in nucleosoom-nucleosoom-interacties. Dit mechanisme zou consistent zijn met de stoichiometrie van PSC naar nucleosomen, en onaangetast door verwijdering van de histonstaarten. Om te onderzoeken of nucleosoomoverbrugging en remming van chromatine-remodellering door PSC de zure patch van histon H2A vereist, hebben we recombinant histon H2A bereid met drie belangrijke aminozuren in de zure patch (DEE) gemuteerd naar ongeladen, polaire residuen (STT) (Fig. 4a ) [51]. Xenopus leavis STT-mutant histon H2A (H2A-STT) werd bereid met behulp van standaardprotocollen en geassembleerd tot histon-octameren met H2B, H3 en H4 [53].

(a) Aminozuursequenties voor de wildtype H2A acidic patch (WT) en ongeladen mutant (STT). Zure resten zijn gemarkeerd en gemuteerde resten zijn onderstreept. (b) MgCl2 afhankelijke oligomerisatie van wildtype en H2A-STT-bevattend chromatine. Chromatine werd geïncubeerd met de aangegeven concentraties MgCl2 en gecentrifugeerd in een microfuge. Supernatanten werden geëlektroforeerd op agarosegels en gekleurd met SYBR-goud. Het percentage van de template dat in het supernatant achterbleef werd bepaald door vergelijking met de 0 mM MgCl2 controle. (c) Samenvatting van chromatine-oligomerisatie-assays. ( d ) Restrictie-enzymtoegankelijkheid (REA) -assays op chromatine-templates met 12 nucleosomen. De chromatine-template bevat een unieke restrictieplaats (HhaI) die normaal wordt afgesloten door nucleosomen, maar wordt blootgesteld na Swi/Snf-gemedieerde chromatine-remodellering. De eerste twee banen zijn negatieve en positieve controles (met of zonder Swi/Snf, geen PSC) die aantonen dat de HhaI-site toegankelijker wordt in aanwezigheid van Swi/Snf. ( e ) Samenvatting van REA-assay op chromatine-sjablonen samengesteld met rec-WT- en H2A-STT-histonen. Percentage remming wordt berekend als .

Wildtype recombinante histon-octameren of die geassembleerd met H2A-STT werden geassembleerd tot nucleosomale arrays op DNA die twee sets van vijf 5S-nucleosoompositioneringssequenties bevatten die een uniek gebied flankeren (G5E4, [54]). Om te verifiëren dat de STT-mutatie de chromatinevouwing in onze handen verstoort, zoals gerapporteerd, hebben we de hierboven beschreven precipitatietest gebruikt, maar geïnduceerde array-oligomerisatie met MgCl2 in plaats van PSC. Eerder werk toonde aan dat nucleosomale arrays omkeerbare oligomerisatie ondergaan in aanwezigheid van MgCl2 concentraties boven 1 mM [55], die afhangt van de H2A-H4-interactie [49], [56]. We hebben MgCl . getitreerd2 in nucleosomale arrays geassembleerd met wildtype recombinante histonen (rec-WT), of H2A-STT-octameren, en de arrays gepelleteerd in een eppendorf-centrifuge. Supernatanten werden geanalyseerd op agarosegels en de hoeveelheid DNA werd gekwantificeerd na kleuring met SYBR-goud, elk monster werd vergeleken met de controle, 0 mM MgCl2 supernatant (Fig. 4b). We vinden dat ten minste 80% van de arrays die zijn geassembleerd met rec-WT-octameren worden gepelleteerd in 1 mM MgCl2, terwijl slechts ongeveer 40% van de arrays die zijn geassembleerd met H2A-STT-octameren worden gepelleteerd, zelfs bij 4 of 8 mM MgCl2 (Afb. 4c). Het met H2A-STT-octameren geassembleerde chromatine heeft dus een oligomerisatiedefect, zoals eerder gemeld [51].

We hebben eerst getest of H2A-STT interfereert met het vermogen van PSC om nucleosoomremodellering te remmen. Chromatine-remodellering werd gevolgd door restrictie-enzymtoegang (REA) tot nucleosomaal DNA. DNA geassembleerd tot nucleosomen is over het algemeen ontoegankelijk [57] maar kan worden blootgesteld door chromatine-remodellering [58] de mate van restrictie-enzymdigestie is een kwantitatieve maatstaf voor chromatine-remodellering. PSC remt de hermodellering van chromatine door de ATP-afhankelijke hermodelleringsfactor hSwi/Snf [39] zodat de door hSwi/Snf geïnduceerde restrictie-enzymdigestie wordt verminderd. PSC remt de toegankelijkheid van restrictie-enzymen niet substantieel in afwezigheid van hSwi/Snf [39], wat aangeeft dat remming van chromatine-remodellering specifiek is. PSC-activiteit op chromatine-templates die zijn geassembleerd met recombinante histonen is niet eerder gerapporteerd, dus we vergeleken eerst de remming van chromatine-remodellering op sjablonen die zijn geassembleerd met histon-octameren die zijn gezuiverd uit HeLa-cellen of rec-WT-octameren. We vinden dat PSC de hermodellering van beide nucleosomale arrays even goed remt (Fig. 4d, e), wat aangeeft dat eventuele histon-modificaties die aanwezig zijn op HeLa-gezuiverde octameren niet vereist zijn voor PSC-gemedieerde remming van chromatine-remodellering. We hebben getest of PSC hermodellering van arrays geassembleerd met H2A-STT-octameren kan remmen en ontdekten dat het hun hermodellering even efficiënt remt als die van arrays geassembleerd met wildtype octameren (Fig. 4d, e). Dus noch de zure patch van H2A noch covalente modificaties die aanwezig zijn op cellulaire histonen zijn vereist voor remming van nucleosoomremodellering door PSC.

We hebben getest of nucleosoomoverbrugging, waarbij nucleosomen worden geclusterd, de zure patch van histon H2A vereist (Fig. 5). Nucleosoomoverbrugging wordt bepaald op gechromatineerde plasmiden die zijn geïncubeerd met buffer (controle) of PSC (Fig. 5a). Nadat PSC aan het chromatine is gebonden, wordt het linker-DNA dat de nucleosomen verbindt, verwijderd door digestie met microkokkennuclease (MNase). Met MNase gedigereerde reacties (of controle mock-digested reacties) worden gesedimenteerd door sucrosegradiënten die overbrugde van vrije mononucleosomen kunnen scheiden, of PSC-gebonden van ongebonden intacte plasmiden in controlereacties. De nucleosoomoverbruggingstest werd uitgevoerd op plasmidechromatine-templates met rec-WT- of H2A-STT-histonen. Analyse van gradiëntfracties van reacties die schijndigestie waren, geeft aan dat incubatie van beide matrijs met PSC ervoor zorgt dat chromatine snel neerslaat nabij de bodem van de gradiënt. Mononucleosomen gegenereerd door MNase-digestie van beide PSC-gebonden sjablonen sedimenteren ook nabij de bodem van de gradiënt. PSC is dus in staat om nucleosomen van zowel H2A-STT- als rec-WT-sjablonen te overbruggen met vergelijkbare efficiëntie (Fig. 5b𠄽). We concluderen dat noch de zure patch noch histon-modificaties nodig zijn voor PSC om nucleosomen te overbruggen.

(a) Schematisch diagram van nucleosoomoverbruggingstest. (b) Representatieve controlereacties voor nucleosoomoverbrugging (mock MNase verteerd) waaruit blijkt dat PSC zowel rec-WT- als H2A-STT-chromatine bindt. Pijlen wijzen naar de belangrijkste plasmidevormen (gekerfd en supercoiled). De reeks kleine isovormen die hier wordt waargenomen, is atypisch, maar de isovormen gedragen zich op dezelfde manier. ( c ) Representatieve MNase verteerde nucleosoomoverbruggingsreacties die aantonen dat PSC zowel rec-WT- als H2A-STT-nucleosomen overbrugt. ( d ) Samenvatting van nucleosoomoverbruggingstests op chromatine-templates geassembleerd met recombinant wildtype (rec-WT) en H2A-zure patch-mutante histonen (H2A-STT). Waarden van fracties 5𠄷 (onderste fracties) van sucrosegradiënten werden opgeteld en uitgezet.

PSC kan kale DNA-segmenten overbruggen

PSC bindt stevig aan zowel nucleosomen als kaal DNA, wat suggereert dat de interactie met chromatine ten minste gedeeltelijk wordt gemedieerd door binding van linker-DNA. Omdat onze gegevens aangeven dat standaard chromatine-vouwmechanismen niet vereist zijn voor overbrugging door PSC (Fig. 5b𠄽), vroegen we ons af of nucleosomen nodig waren voor overbrugging. Als overbrugging PSC-DNA-binding en PSC-PSC-interacties weerspiegelt, is het mogelijk niet afhankelijk van nucleosomen. Om te vragen of PSC segmenten van bloot DNA bij elkaar kan brengen, werd PSC geïncubeerd met ofwel niet-gebiotinyleerd DNA of een mengsel van gebiotinyleerde en niet-gebiotinyleerde DNA's van verschillende groottes (Figuur 6a). Gebonden DNA's werden geïsoleerd door sucrosegradiëntsedimentatie (Figuur 6b). Gradiëntfracties werden geïncubeerd met met streptavidine beklede kralen om het gebiotinyleerde DNA te vangen (Figuur 6c, d). Wanneer zowel de gebiotinyleerde als niet-gebiotinyleerde DNA's werden opgenomen in PSC, werden beide efficiënt gevangen door de streptavidine-parels. Bij afwezigheid van het gebiotinyleerde DNA wordt weinig van het niet-gebiotinyleerde DNA gevangen door de met streptavidine beklede korrels, hoewel het nog steeds aan PSC is gebonden. PSC brengt dus de gebiotinyleerde en niet-gebiotinyleerde DNA-fragmenten samen, wat aangeeft dat PSC zowel DNA-segmenten als nucleosomen kan overbruggen, en consistent met DNA-binding die een belangrijke rol speelt in hoe PSC interageert met chromatine.

(a) Schematisch diagram van DNA-overbruggingstest. (b) Representatieve analyse van overbrugging van naakt DNA door PSC. Bovenste panelen tonen sucrosegradiëntfracties die werden samengevoegd voor streptavidine pull-down. Onderste panelen tonen streptavidine pull-down resultaten. Het percentage gebonden verwijst naar hoeveel van het niet-gebiotinyleerde fragment in de pellet aanwezig is als een fractie van het totaal (pellet + supernatant). Sterretjes geven de positie van het gebiotinyleerde fragment aan. Merk op dat in pelletfracties het gebiotinyleerde fragment onvolledig wordt teruggewonnen door Proteinase K-behandeling van met streptavidine gecoate korrels, en langzaam migreert, waarschijnlijk als gevolg van gebonden streptavidine. (c) Samenvatting van pull-down-experimenten met streptavidine. Grafieken tonen het gemiddelde percentage van het niet-gebiotinyleerde fragment geassocieerd met streptavidineparels.

PSC clustert nucleosomen maar bindt ook DNA op dun geassembleerde plasmiden

De waarneming dat PSC naakt DNA kan overbruggen, zou erop kunnen wijzen dat het alleen via DNA-binding met chromatine interageert. Om te begrijpen hoe PSC interageert met nucleosomen en DNA wanneer beide aanwezig zijn, hebben we plasmide-templates van 3 kb gemaakt met een klein aantal (1 of 2) geassembleerde nucleosomen en gevraagd hoe PSC met hen interageert door EM (Fig. S1a). Sjablonen bevatten twee 601 nucleosoompositioneringssequenties, die bij voorkeur worden ingenomen bij lage verhoudingen van histonen tot DNA (vergelijkbaar met [59]). PSC werd in lage verhoudingen aan plasmiden gebonden. Sjablonen werden gefixeerd met glutaaraldehyde, roterend geschaduwd met platina en gevisualiseerd door EM. Titraties van PSC-binding aan chromatine door elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) geven aan dat dun geassembleerde arrays gemakkelijk langzaam migrerende multi-template-aggregaten vormen (Fig. S1b). EM werd uitgevoerd met PSC-verhoudingen die slechts een kleine verschuiving in plasmidemobiliteit door EMSA veroorzaken (Fig. S1b).

PSC vormde een diverse reeks structuren met dun geassembleerde sjablonen (Fig. 7b, c). We hebben deze structuren in twee groepen ingedeeld, Klasse 1 en Klasse 2, op basis van visuele inspectie van hoeveel vrij DNA zichtbaar is en hoe groot de deeltjes op de sjabloon zijn. Klasse 1-structuren vertegenwoordigen waarschijnlijk sjablonen met minder PSC-moleculen gebonden, terwijl klasse 2 volledig gecomprimeerde structuren omvat. De eenvoudigste Klasse 1-structuren bevatten één deeltje dat groter is dan de grootte van een nucleosoom en zou een of meer PSC-gebonden nucleosomen kunnen vertegenwoordigen, en een grote lus van DNA (zoals molecuul 14 in Fig. 7b). In sommige gevallen wordt waargenomen dat kleine deeltjes samenklonteren, wat eenvoudige overbruggingsgebeurtenissen kan vertegenwoordigen (zoals molecuul 3 in figuur 7b). Belangrijk is dat het tellen van het aantal individuele deeltjes per matrijs voor Klasse 1-moleculen aangeeft dat veel van deze sjablonen 3 deeltjes bevatten. Sjablonen alleen bevatten 0, 1 of 2 deeltjes (nucleosomen). Aldus moeten ten minste enkele van de waargenomen deeltjes PSC vertegenwoordigen, gebonden aan DNA zonder een nucleosoom. Daarentegen bevatten de meeste klasse 2-moleculen een of twee deeltjes, en de meeste van deze deeltjes zijn groter dan nucleosomen en groter dan de deeltjes op klasse 1-moleculen (Fig. 7e, Tabel 1). De grote deeltjes die worden waargenomen in Klasse 2-moleculen bevatten dus waarschijnlijk PSC gebonden aan zowel nucleosomen als DNA in een gecompacteerd complex. Met name de meest compacte structuren (zoals moleculen 4, 5, 7� in Fig. 7b) hebben heel weinig vrij DNA. Samen geven deze gegevens aan dat PSC waarschijnlijk bij voorkeur bindt aan nucleosomen, zoals waargenomen in klasse 1-moleculen. PSC kan ook grote DNA-gebieden comprimeren, zelfs op sjablonen met slechts één of twee nucleosomen, zoals waargenomen in klasse 2-moleculen. Omdat de deeltjes op Klasse 2-templates groter zijn dan die op Klasse 1-moleculen (Fig. 7e, Tabel 1), kunnen de klassen een progressie vertegenwoordigen die wordt aangedreven door binding van toenemende aantallen PSC-moleculen.

Tafel 1

−PSC+PSC klasse 1+ PSC klasse 2−PSC+ PSC klasse 1+ PSC klasse 2
Diameter (nm, +/-02212SD)285+/�233+/�164+/�282+/�251+/�164+/�
t-toets (P-waarde) 8.6e-82.3e� 9.3e-55.4e-41
deeltjesdiameter (nm, +/− SD20+/𢄤45+/�58+/�19+/𢄤36+/�64+/�
t-toets (P-waarde) 3.9e�1.7e� 1.5e�3.9e�
# deeltjes (+/− SD)1.2+/𢄠.71.8+/𢄠.91.6+/𢄠.91.3+/𢄠.81.8+/𢄠.91.5+/𢄠.7
t-toets (P-waarde) 3.1e𠄶2.5e𠄳 8.9e-53.3e-2
N10076431036267

Tabel geeft gemiddelde +/-2212 standaarddeviatie voor drie metingen van twee experimenten. Elke sjabloon maakt gebruik van een plasmide dat twee 601 nucleosoompositioneringssequenties bevat die is samengesteld in lage verhoudingen van histonen tot DNA (0,2 histon:DNA in massa). De eerste set sjabloon heeft � bp tussen de 601 nucleosomen en de tweede heeft 385 bp. Diameter is de maximale diameter van elke sjabloon (de diameter van de kleinste cirkel die de sjabloon volledig zou omvatten) [15]. De maximale diameter van elk deeltje op elke sjabloon werd gemeten, wat aanleiding gaf tot de meting van de 'deeltjesdiameter'. Voor –PSC-monsters moeten deeltjes nucleosomen zijn, terwijl ze in +PSC-monsters nucleosomen kunnen zijn, PSC gebonden aan naakt DNA of PSC-gebonden nucleosomen. Merk op dat de grootste diameter van het schijfvormige nucleosoom 11 nm is. Monsters werden in de schaduw gezet tot een dikte van 3,75 nm, dus de gemeten diameter komt overeen met de verwachting (11+2൳.75 =�.5 nm voorspelde grootte). Het aantal deeltjes geeft elk afzonderlijk deeltje op een sjabloon aan, ongeacht de grootte.

(a) Representatieve EM-beelden van plasmiden met twee 601 nucleosoompositioneringssequenties geassembleerd met een lage verhouding van histonen tot DNA. Merk op dat volledig geassembleerde plasmiden 17 nucleosomen zouden bevatten en dat 601 sequenties worden gescheiden door 385 basenparen. Plasmiden werden geassembleerd in aanwezigheid van E coli Topoisomeren I zodat plasmiden ontspannen zijn. Pijlen wijzen naar nucleosomen. Merk op dat matrijs 2 het enige waargenomen voorbeeld was van meer dan 2 nucleosomen op het plasmide (3), van de 103 moleculen die werden geanalyseerd (Tabel 1). (b) dun geassembleerde plasmiden met PSC. Klasse 1-moleculen (zie tekst) zijn meer uitgebreid en hebben waarschijnlijk minder kopieën van PSC-gebonden dan Klasse 2-moleculen (c), die zeer compact zijn. Pijlen wijzen naar deeltjes (waarschijnlijk PSC-gebonden nucleosomen) die bij elkaar zijn gekomen en de overbrugde configuratie kunnen vertegenwoordigen. Merk op dat in sommige gevallen meer dan één template kan worden geclusterd (zoals molecuul 3). Sterretjes geven deeltjes aan die mogelijk ongebonden nucleosomen zijn (op basis van hun grootte), hoewel ze ook gebonden PSC kunnen zijn. (c) dun geassembleerde plasmiden met PSC met klasse 2-configuraties. Merk op dat de moleculen een reeks vertegenwoordigen tussen de meest uitgebreide klasse 1-moleculen en de meest compacte klasse 2-moleculen. (d) Samenvatting van het aantal deeltjes per sjabloon. De bevinding dat Klasse 1-moleculen vaak meer dan 2 deeltjes hebben, geeft aan dat PSC op sommige sjablonen moet binden aan naakt DNA (evenals nucleosomen). Zie tabel 1 voor een samenvatting van metingen van dit en een soortgelijk experiment.

PSC kan vrije histonen binden

De EM-gegevens suggereren dat PSC een voorkeur heeft voor bindende nucleosomen boven kaal DNA, en dus dat PSC kenmerk(en) van andere nucleosomen dan DNA herkent. Om te testen of PSC kan interageren met de histon-eiwitten in het nucleosoom en het DNA, hebben we PSC-bindingsassays uitgevoerd met histon-octameren of histon-subcomplexen. We vinden dat histon-octameren PSC binden met behulp van pull-down-assays (Fig. 8a). We wilden testen of PSC zowel H2A/H2B-dimeren als H3/H4-tetrameren bindt, maar deze testen werden gehinderd door een hoge niet-specifieke binding van de histon-subcomplexen aan kralen. Door Flag-PSC op kralen te immobiliseren, dimeren of tetrameren toe te voegen, te wassen en vervolgens Flag-PSC en gebonden histonen te elueren (protocol van [60]), konden we een laag maar reproduceerbaar niveau van specifieke binding aan zowel H2A/H2B waarnemen. en H3/H4 (Fig. 8b). PSC-binding werd ook waargenomen met glutaaraldehyd-gemedieerde verknoping (niet getoond). We concluderen dat PSC kan binden aan vrije histonen, hoewel aanvullende methoden nodig zijn om deze interactie kwantitatief te beoordelen. Het vermogen van PSC om te interageren met histonen kan bijdragen aan zijn nucleosoombindingsactiviteit.

(a) Representatieve test van PSC-binding aan histon-octameren. PSC werd gemengd met histon-octameren die één gebiotinyleerde en één fluorescerende kopie van ofwel H3 (H3-gelabelde octameren) of H2B (H2B-gelabelde octameren) bevatten (zie Methoden voor een gedetailleerde beschrijving). Mengsels werden geïncubeerd met met streptavidine beklede parels en de hoeveelheid gevangen PSC werd bepaald door middel van Western-blotting. Fluorescentie (Cy5) werd gebruikt om octameeropname te volgen. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen in twee aanvullende testen. (b) Representatieve test van PSC-binding aan H2A/H2B-dimeren of H3/H4-tetrameren. Dimeren en tetrameren werden met fluorofoor gelabeld op de aangegeven (sterretje) subeenheid. Hoge niveaus van achtergrondbinding aan kralen werden waargenomen voor zowel dimeren als tetrameren, zoals getoond, maar in elk van de drie testen werden meer H2A/H2B en H3/H4 geëlueerd uit Flag-korrels die PSC geïmmobiliseerd hebben dan controleparels zonder geïmmobiliseerd eiwit. PSC in de elutie wordt gedetecteerd door Western-blotting.


Chromatinevezel versus chromosoom

Chromosomen zijn draadachtige structuren waarin DNA-moleculen zijn verpakt. Het zijn de opslagplaatsen van de genetische informatie van een organisme. Het aantal chromosomen en hun vormen verschillen tussen de levende organismen. Een menselijke cel bevat 46 chromosomen, die in 23 homologe paren zijn. Prokaryoten hebben minder chromosomen die niet worden omsloten door een kernmembraan.Chromosoom heeft vier chromatiden en een centromeergebied. Chromosomen zijn niet zichtbaar in normale cellen. Ze worden zichtbaar tijdens de celdeling onder de microscoop. Chromosomaal DNA bestaat als chromatinevezels. Chromatinevezels zijn de complexen van DNA en histon-eiwitten. De basiseenheid van het chromatine is nucleosoom en nucleosomen zijn samengesteld uit een DNA-segment dat rond acht histon-eiwitten is gewikkeld. Nucleosomen wikkelen zich in lussen en vormen dicht opeengepakte chromatinevezels. Chromatinevezels spoelen strak en vormen chromatiden en chromatiden vormen chromosomen. Dit is hoe DNA is verpakt in een kleine ruimte van de kern in een cel. Dit is het verschil tussen chromatine en chromosoom.

Verwijzing:

1.Natuurnieuws, Nature Publishing Group. Beschikbaar Hier
2. De redactie van Encyclopædia Britannica. "Chromosoom." Encyclopædia Britannica, Encyclopædia Britannica, inc., 15 januari 2018. Beschikbaar Hier


Bekijk de video: Garis Komando u0026 Garis Koordinasi Dalam Struktur Organisasi (Januari- 2022).