Informatie

Is er iemand die nieuwe medicijnen heeft ontdekt door actief mutaties te creëren in het medicijnproducerende organisme?


Onlangs las ik over het ontdekken van medicijnen.

Voor zover ik weet, zijn er momenteel 2 bronnen voor het maken van nieuwe verbindingen door:

  • Screening uit natuurlijke bronnen.

  • Synthetiseren door het toevoegen/verwijderen/vervangen van de functionele groepen van een bekende verbinding met behulp van chemische processen.

Aan de andere kant is moleculaire pharming het proces van het produceren van geneesmiddelen door de voor geneesmiddelen coderende genen te integreren in het bacteriële (meestal E. coli) genoom.

Ik kwam op het idee dat als we mutaties creëren in deze medicijnproducerende kolonies, bijvoorbeeld door UV-licht, we uiteindelijk door toeval een aantal nieuwe verbindingen kunnen verkrijgen zodra de mutaties optreden in het medicijncoderende gebied of verwante genen.

Ik wil in de eerdere onderzoeken zoeken naar degenen die dit idee al hebben bedacht, ik heb het met verschillende trefwoorden geprobeerd en er is geen geluk.

Ik zou willen vragen is dit idee praktisch mogelijk? Hoe groot is de kans op nieuwe verbindingen in vergelijking met het screenen van natuurlijke bronnen en chemische synthese? En als iemand deze studie al heeft gedaan, kunt u mij dan alstublieft enkele referenties geven over deze kwestie?


Ik zou zeggen dat dit mogelijk is, maar niet echt praktisch. Genen muteren door UV-licht is niet zo moeilijk, het is alleen de screening op de (nieuwe) verbindingen die het moeilijk maakt. Je zou waarschijnlijk beter diversiteit kunnen creëren met behulp van gevestigde chemische methoden.

Gewoonlijk wordt UV-mutagenese gedaan voor hele organismen, maar sommige mensen hebben dit waarschijnlijk ook geprobeerd voor afzonderlijke genen (hoewel ze het hele genoom zouden raken). Dit is het makkelijke deel; je zou een enorme hoeveelheid diversiteit kunnen krijgen met heel weinig werk. Hoewel mutaties die enzymatische producten veranderen waarschijnlijk veel zeldzamer zijn dan mutaties die substraatspecificiteit of productchiraliteit veranderen, vinden mensen die mutaties (voorbeeld uit de top van mijn hoofd: p450-hydroxyleringspatronen, hoewel ze waarschijnlijk gerichte mutagenese gebruikten).

Bepalen of een specifiek verbinding wordt geproduceerd door een organisme is ook niet erg hard. Je breekt alle cellen, legt de oplossing op een kolom en controleert met je favoriete analysemethode of je verbinding er wel of niet in zit. Controleren op nieuwe verbindingen is veel moeilijker. Je hebt betere analytische methoden nodig, zoals MS/MS, omdat je geen analytische standaarden hebt en het aangepaste molecuul misschien niet eens detecteerbaar is met de analytische methode die je gebruikte voor het startmolecuul. We zijn heel goed in het opsporen van naalden in hooibergen, maar bepalen of er een naald, een stok of misschien een stuk hooi van een andere soort in de hooiberg zit, is veel moeilijker. Je zou al moeten voorspellen wat voor soort gewijzigde moleculen je verwacht te vinden.

Als je dit allemaal met succes hebt gedaan, heb je een enkel nieuw molecuul geïdentificeerd. Tegenwoordig gebruiken mensen bibliotheken met >100.000 verbindingen om te screenen op hun ziekte-eiwit van belang.

Het idee om enzymen te muteren om nieuwe producten te maken is niet zo vreemd, mensen werken hieraan, publiceren, vinden veel interessante dingen en we leren veel over enzymen. Als een benadering voor het ontdekken van geneesmiddelen is deze benadering gewoon niet high-throughput genoeg.


Inderdaad, detectie van kleine moleculen en secundaire metabolieten is gedaan, en wordt vaak nog steeds gedaan door zowel willekeurige als rationele mutagenese. UV-licht is een optie, maar vaak is het gemakkelijker om iets agressievere methoden te gebruiken, zoals blootstelling aan ethaanmethaansulfaat (EMS).

Streptomyces zo is het modelorganisme voor de productie van secundaire metabolieten door de jaren heen onderworpen aan allerlei mutagenesemethoden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3472513/).

Een benadering van willekeurige mutagenese die tegenwoordig vaak wordt gebruikt, is eerder genetisch dan chemisch en gebruikt de transposons van de mobiele elementen voor willekeurige inserties. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3416362/)

Veel secundaire metabolietenproductie wordt tegenwoordig gedaan via modificatie van niet-ribosomale peptidesynthaseclusters (NRPS). Deze clusters vertonen iets dat de 'colineariteitsregel' wordt genoemd (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074552110000499), waarbij de 'modules' waaruit het eiwitcomplex bestaat, 'pass the parcel' spelen met de groeiende secundaire metaboliet, waarbij elke module vervolgens een nieuwe groep toevoegt - zoals een transportband. Het is daarom mogelijk om voorspellen het molecuul dat een NRPS maakt alleen uit de modules en mutaties die je erin ziet, of ze nu willekeurig of rationeel zijn geproduceerd.

Het is echter vaak zo dat we de talloze secundaire metabolietmoleculen begrijpen die een organisme zo slecht kan produceren, dat eenvoudigweg het screenen van het wildtype-organisme honderdduizenden moleculen oplevert voordat je zelfs maar wijzigingen hoeft te overwegen.


Geschiedenis van hiv/aids

AIDS wordt veroorzaakt door een humaan immunodeficiëntievirus (HIV), dat zijn oorsprong vindt bij niet-menselijke primaten in Centraal- en West-Afrika. Terwijl verschillende subgroepen van het virus op verschillende tijdstippen menselijke besmettelijkheid kregen, vond de wereldwijde pandemie zijn oorsprong in de opkomst van één specifieke stam – hiv-1-subgroep M – in Leopoldstad in Belgisch Congo (nu Kinshasa in de Democratische Republiek Kongo) in de jaren twintig. [1]

Er zijn twee soorten hiv: hiv-1 en hiv-2. HIV-1 is virulenter, gemakkelijk overdraagbaar en is de oorzaak van de overgrote meerderheid van HIV-infecties wereldwijd. [2] De pandemische stam van HIV-1 is nauw verwant aan een virus dat wordt aangetroffen bij chimpansees van de ondersoort Pan troglodytes troglodytes, die leven in de bossen van de Centraal-Afrikaanse landen Kameroen, Equatoriaal-Guinea, Gabon, de Republiek Congo (of Congo-Brazzaville) en de Centraal-Afrikaanse Republiek. HIV-2 is minder overdraagbaar en is grotendeels beperkt tot West-Afrika, samen met zijn naaste verwant, een virus van de roetmangabey (Cercocebus atys atys), een aap uit de Oude Wereld die in het zuiden van Senegal, Guinee-Bissau, Guinee, Sierra Leone, Liberia en het westen van Ivoorkust leeft. [2] [3]


Inhoud

Embryonale stamcellen (ESC's), afgeleid van het blastocyststadium van vroege zoogdierembryo's, onderscheiden zich door hun vermogen om te differentiëren tot elk embryonaal celtype en door hun vermogen om zichzelf te vernieuwen. Het zijn deze eigenschappen die ze waardevol maken op wetenschappelijk en medisch gebied. ESC's hebben een normaal karyotype, behouden een hoge telomerase-activiteit en vertonen een opmerkelijk proliferatief potentieel op lange termijn. [7]

Pluripotent Bewerken

Embryonale stamcellen van de binnenste celmassa zijn pluripotent, wat betekent dat ze kunnen differentiëren om primitief ectoderm te genereren, dat uiteindelijk differentieert tijdens gastrulatie in alle derivaten van de drie primaire kiemlagen: ectoderm, endoderm en mesoderm. Deze kiemlagen genereren elk van de meer dan 220 celtypes in het volwassen menselijk lichaam. Wanneer voorzien van de juiste signalen, vormen ESC's aanvankelijk voorlopercellen die vervolgens differentiëren tot de gewenste celtypen. Pluripotentie onderscheidt embryonale stamcellen van volwassen stamcellen, die multipotent zijn en slechts een beperkt aantal celtypes kunnen produceren.

Zelfvernieuwing en reparatie van structuur

Onder gedefinieerde omstandigheden zijn embryonale stamcellen in staat zichzelf voor onbepaalde tijd te vernieuwen in een ongedifferentieerde toestand. Zelfvernieuwende omstandigheden moeten voorkomen dat de cellen gaan klonteren en een omgeving behouden die een niet-gespecialiseerde staat ondersteunt. [8] Meestal gebeurt dit in het laboratorium met media die serum en leukemieremmende factor bevatten of serumvrije mediasupplementen met twee remmende geneesmiddelen ("2i"), de MEK-remmer PD03259010 en GSK-3-remmer CHIR99021. [9]

Groei Bewerken

ESC's delen zeer vaak vanwege een verkorte G1-fase in hun celcyclus. Door snelle celdeling kunnen de cellen snel groeien in aantal, maar niet in grootte, wat belangrijk is voor vroege embryo-ontwikkeling. In ESC's worden cycline A- en cycline E-eiwitten die betrokken zijn bij de G1/S-overgang altijd op hoge niveaus tot expressie gebracht. [10] Cycline-afhankelijke kinasen zoals CDK2 die de voortgang van de celcyclus bevorderen, zijn overactief, deels als gevolg van neerwaartse regulatie van hun remmers. [11] Retinoblastoma-eiwitten die de transcriptiefactor E2F remmen totdat de cel klaar is om de S-fase in te gaan, worden hypergefosforyleerd en geïnactiveerd in ESC's, wat leidt tot voortdurende expressie van proliferatiegenen. [10] Deze veranderingen resulteren in versnelde cycli van celdeling. Hoewel hoge expressieniveaus van pro-proliferatieve eiwitten en een verkorte G1-fase zijn gekoppeld aan het behoud van pluripotentie, [12] [13] ESC's gekweekt in serumvrije 2i-omstandigheden brengen hypo-gefosforyleerde actieve retinoblastoom-eiwitten tot expressie en hebben een langwerpige G1-fase . [14] Ondanks dit verschil in de celcyclus in vergelijking met ESC's die zijn gekweekt in media die serum bevatten, hebben deze cellen vergelijkbare pluripotente kenmerken. [15] Pluripotentiefactoren Oct4 en Nanoog spelen een rol bij het transcriptioneel reguleren van de ESC-celcyclus. [16] [17]

Gebruik Bewerken

Vanwege hun plasticiteit en potentieel onbeperkte capaciteit voor zelfvernieuwing, zijn embryonale stamceltherapieën voorgesteld voor regeneratieve geneeskunde en weefselvervanging na letsel of ziekte. Pluripotente stamcellen zijn veelbelovend gebleken bij de behandeling van een aantal uiteenlopende aandoeningen, waaronder maar niet beperkt tot: ruggenmergletsel, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, diabetes, neurodegeneratieve aandoeningen (zoals de ziekte van Parkinson), AIDS, enz. [18] Naast hun potentieel in regeneratieve geneeskunde, embryonale stamcellen vormen een mogelijke alternatieve bron van weefsel/organen die dient als een mogelijke oplossing voor het dilemma van het donortekort. Er zijn echter enkele ethische controverses hierover (zie Ethisch debat gedeelte hieronder). Afgezien van deze toepassingen, kunnen ESC's ook worden gebruikt voor onderzoek naar vroege menselijke ontwikkeling, bepaalde genetische ziekten en in vitro toxicologische testen. [7]

Volgens een artikel uit 2002 in PNAS, "Menselijke embryonale stamcellen hebben het potentieel om te differentiëren in verschillende celtypen en kunnen dus nuttig zijn als bron van cellen voor transplantatie of weefselmanipulatie." [19]

Weefseltechniek Bewerken

In tissue engineering is het gebruik van stamcellen recent ontdekt en staat bekend als belangrijk. Om met succes een weefsel te manipuleren, moeten de gebruikte cellen in staat zijn om een ​​specifieke biologische functie uit te voeren, zoals de uitscheiding van cytokinen, signaalmoleculen, interactie met naburige cellen en het produceren van een extracellulaire matrix in de juiste organisatie. Stamcellen demonstreren deze specifieke biologische functies, samen met het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren tot een of meer soorten gespecialiseerde cellen. Embryonale stamcellen zijn een van de huidige bronnen die worden overwogen voor het gebruik van tissue engineering. [20] Het gebruik van menselijke embryonale stamcellen heeft veel nieuwe mogelijkheden voor tissue engineering geopend, maar er zijn veel hindernissen die genomen moeten worden voordat menselijke embryonale stamcellen zelfs maar kunnen worden gebruikt. Er wordt getheoretiseerd dat als embryonale stamcellen kunnen worden veranderd om geen immuunrespons op te wekken wanneer ze in de patiënt worden geïmplanteerd, dit een revolutionaire stap zou zijn in tissue engineering. [21]

Embryonale stamcellen zijn echter niet beperkt tot cel-/weefselengineering.

Celvervangingstherapieën Bewerken

Huidig ​​onderzoek richt zich op het differentiëren van ESC's in een verscheidenheid aan celtypen voor uiteindelijk gebruik als celvervangende therapieën (CRT's). Enkele van de celtypen die zijn ontwikkeld of momenteel worden ontwikkeld, zijn onder meer cardiomyocyten (CM), neuronen, hepatocyten, beenmergcellen, eilandcellen en endotheelcellen. [22] De afleiding van dergelijke celtypen uit ESC's is echter niet zonder obstakels, daarom is het huidige onderzoek gericht op het overwinnen van deze barrières. Er zijn bijvoorbeeld studies aan de gang om ESC's te differentiëren in weefselspecifieke CM's en om hun onrijpe eigenschappen die hen onderscheiden van volwassen CM's uit te roeien. [23]

Klinisch potentieel Bewerken

  • Onderzoekers hebben ESC's gedifferentieerd in dopamine-producerende cellen in de hoop dat deze neuronen kunnen worden gebruikt bij de behandeling van de ziekte van Parkinson. [24][25]
  • ESC's zijn gedifferentieerd tot natural killer (NK) cellen en botweefsel. [26]
  • Studies met ESC's zijn aan de gang om een ​​alternatieve behandeling voor diabetes te bieden. Bijvoorbeeld D'Amour et al. waren in staat om ESC's te differentiëren in insulineproducerende cellen [27] en onderzoekers van Harvard University waren in staat om grote hoeveelheden pancreas-bètacellen uit ES te produceren. [28]
  • Een artikel gepubliceerd in de Europees Hartjournaal beschrijft een translationeel proces voor het genereren van menselijke embryonale stamcel-afgeleide cardiale voorlopercellen voor gebruik in klinische onderzoeken bij patiënten met ernstig hartfalen. [29]

Medicijnontdekking Bewerken

Behalve dat ze een belangrijk alternatief worden voor orgaantransplantaties, worden ESC's ook gebruikt op het gebied van toxicologie en als cellulaire schermen om nieuwe chemische entiteiten (NCE's) te ontdekken die kunnen worden ontwikkeld als medicijnen met kleine moleculen. Studies hebben aangetoond dat cardiomyocyten die zijn afgeleid van ESC's gevalideerde in vitro-modellen zijn om geneesmiddelreacties te testen en toxiciteitsprofielen te voorspellen. [22] Van ES afgeleide cardiomyocyten is aangetoond dat ze reageren op farmacologische stimuli en kunnen daarom worden gebruikt om cardiotoxiciteit te beoordelen zoals Torsades de Pointes. [30]

ESC-afgeleide hepatocyten zijn ook bruikbare modellen die kunnen worden gebruikt in de preklinische stadia van de ontdekking van geneesmiddelen. De ontwikkeling van hepatocyten uit ESC's is echter een uitdaging gebleken en dit belemmert het vermogen om het metabolisme van geneesmiddelen te testen. Daarom is het huidige onderzoek gericht op het vaststellen van volledig functionele ESC-afgeleide hepatocyten met stabiele fase I- en II-enzymactiviteit. [31]

Modellen van genetische aandoening

Er zijn verschillende nieuwe onderzoeken gestart om het concept van het modelleren van genetische aandoeningen met embryonale stamcellen aan te pakken. Ofwel door de cellen genetisch te manipuleren, of recenter, door zieke cellijnen af ​​te leiden die zijn geïdentificeerd door prenatale genetische diagnose (PGD), is het modelleren van genetische aandoeningen iets dat is bereikt met stamcellen. Deze benadering kan heel goed waardevol zijn bij het bestuderen van aandoeningen zoals het fragiele-X-syndroom, cystische fibrose en andere genetische aandoeningen die geen betrouwbaar modelsysteem hebben.

Yury Verlinsky, een Russisch-Amerikaanse medisch onderzoeker die gespecialiseerd is in embryo- en cellulaire genetica (genetische cytologie), ontwikkelde testmethoden voor prenatale diagnose om genetische en chromosomale aandoeningen anderhalve maand eerder te bepalen dan standaard vruchtwaterpunctie. De technieken worden nu gebruikt door veel zwangere vrouwen en aanstaande ouders, vooral koppels met een voorgeschiedenis van genetische afwijkingen of waarbij de vrouw ouder is dan 35 jaar (wanneer het risico op genetisch gerelateerde aandoeningen groter is). Door ouders in staat te stellen een embryo zonder genetische aandoeningen te selecteren, kunnen ze bovendien de levens redden van broers en zussen die al soortgelijke aandoeningen en ziekten hadden met behulp van cellen van de ziektevrije nakomelingen. [32]

Reparatie van DNA-schade Bewerken

Gedifferentieerde somatische cellen en ES-cellen gebruiken verschillende strategieën voor het omgaan met DNA-schade. Menselijke voorhuidfibroblasten, één type somatische cel, gebruiken bijvoorbeeld niet-homologe end-joining (NHEJ), een foutgevoelig DNA-reparatieproces, als de primaire route voor het repareren van dubbelstrengs breuken (DSB's) tijdens alle celcyclusstadia. [33] Vanwege zijn foutgevoelige aard heeft NHEJ de neiging om mutaties te produceren in de klonale afstammelingen van een cel.

ES-cellen gebruiken een andere strategie om met DSB's om te gaan. [34] Omdat ES-cellen aanleiding geven tot alle celtypen van een organisme, inclusief de cellen van de kiemlijn, zijn mutaties die in ES-cellen ontstaan ​​als gevolg van gebrekkig DNA-herstel een ernstiger probleem dan in gedifferentieerde somatische cellen. Daarom zijn er robuuste mechanismen nodig in ES-cellen om DNA-schade nauwkeurig te herstellen, en als reparatie mislukt, om die cellen met niet-gerepareerde DNA-schade te verwijderen. Zo gebruiken ES-cellen van muizen voornamelijk high-fidelity homologe recombinatiereparatie (HRR) om DSB's te repareren. [34] Dit type reparatie hangt af van de interactie van de twee zusterchromosomen [ verificatie nodig ] gevormd tijdens de S-fase en samen aanwezig tijdens de G2-fase van de celcyclus. HRR kan DSB's in één zusterchromosoom nauwkeurig repareren door intacte informatie van het andere zusterchromosoom te gebruiken. Cellen in de G1-fase van de celcyclus (d.w.z. na metafase/celdeling maar voorafgaand aan de volgende ronde van replicatie) hebben slechts één kopie van elk chromosoom (d.w.z. zusterchromosomen zijn niet aanwezig). Muis ES-cellen missen een G1-controlepunt en ondergaan geen stopzetting van de celcyclus bij het verwerven van DNA-schade. [35] In plaats daarvan ondergaan ze een geprogrammeerde celdood (apoptose) als reactie op DNA-schade. [36] Apoptose kan worden gebruikt als een faalveilige strategie om cellen met niet-herstelde DNA-schade te verwijderen om mutatie en progressie naar kanker te voorkomen. [37] In overeenstemming met deze strategie hebben ES-stamcellen van muizen een mutatiefrequentie die ongeveer 100 keer lager is dan die van isogene somatische cellen van muizen. [38]

Klinische proef Bewerken

Op 23 januari 2009 ontvingen Fase I klinische onderzoeken voor transplantatie van oligodendrocyten (een celtype van de hersenen en het ruggenmerg) afkomstig van menselijke ES-cellen in personen met een ruggenmergletsel goedkeuring van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA), waarmee het 's werelds eerste menselijke ES-cel menselijke proef. [39] De studie die tot deze wetenschappelijke vooruitgang heeft geleid, werd uitgevoerd door Hans Keirstead en collega's van de Universiteit van Californië, Irvine en ondersteund door Geron Corporation uit Menlo Park, CA, opgericht door Michael D. West, PhD. Een eerder experiment had een verbetering laten zien in het herstel van het bewegingsapparaat bij ratten met ruggenmergletsel na een 7-daagse vertraagde transplantatie van menselijke ES-cellen die in een oligodendrocytische lijn waren geduwd. [40] De klinische fase I-studie was bedoeld om ongeveer acht tot tien mensen met een dwarslaesie in te schrijven die hun verwondingen niet langer dan twee weken voor aanvang van de studie hadden, aangezien de cellen moeten worden geïnjecteerd voordat littekenweefsel kan worden gevormd. De onderzoekers benadrukten dat van de injecties niet werd verwacht dat ze de patiënten volledig zouden genezen en alle mobiliteit zouden herstellen. Op basis van de resultaten van de proeven met knaagdieren speculeerden onderzoekers dat herstel van de myeline-omhulsels en een toename van de mobiliteit zou kunnen optreden. Deze eerste proef was in de eerste plaats bedoeld om de veiligheid van deze procedures te testen en als alles goed zou gaan, hoopte men dat dit zou leiden tot toekomstige studies waarbij mensen met ernstigere handicaps betrokken zouden zijn.[41] De proef werd in augustus 2009 opgeschort vanwege zorgen van de FDA met betrekking tot een klein aantal microscopisch kleine cysten gevonden in verschillende behandelde rattenmodellen, maar de wacht werd op 30 juli 2010 opgeheven. [42]

In oktober 2010 schreven onderzoekers zich in en dienden EST's toe aan de eerste patiënt in het Shepherd Center in Atlanta. [43] De makers van de stamceltherapie, Geron Corporation, schatten dat het enkele maanden zou duren voordat de stamcellen zich zouden vermenigvuldigen en dat de GRNOPC1-therapie zou worden beoordeeld op succes of falen.

In november 2011 kondigde Geron aan dat het de studie stopzette en om financiële redenen stopte met stamcelonderzoek, maar bestaande patiënten zou blijven volgen en probeerde een partner te vinden die hun onderzoek kon voortzetten. [44] In 2013 verwierf BioTime, onder leiding van CEO Dr. Michael D. West, alle stamcelactiva van Geron, met de verklaarde bedoeling om Geron's op embryonale stamcel gebaseerde klinische studie voor onderzoek naar ruggenmergletsel opnieuw op te starten. [45]

BioTime-bedrijf Asterias Biotherapeutics (NYSE MKT: AST) heeft een Strategic Partnership Award van 14,3 miljoen dollar ontvangen van het California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) om 's werelds eerste embryonale, op stamcellen gebaseerde klinische studie bij mensen voor dwarslaesie opnieuw te starten. CIRM, ondersteund door openbare fondsen uit Californië, is de grootste financier van stamcelgerelateerd onderzoek en ontwikkeling ter wereld. [46]

De prijs voorziet in financiering voor Asterias om de klinische ontwikkeling van AST-OPC1 bij proefpersonen met een dwarslaesie te hervatten en om het klinische testen van oplopende doses in de doelpopulatie, bedoeld voor toekomstige cruciale onderzoeken, uit te breiden. [46]

AST-OPC1 is een populatie van cellen afgeleid van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) die oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC's) bevatten. OPC's en hun volwassen derivaten, oligodendrocyten genaamd, bieden essentiële functionele ondersteuning voor zenuwcellen in het ruggenmerg en de hersenen. Asterias presenteerde onlangs de resultaten van klinische fase 1-onderzoekstests van een lage dosis AST-OPC1 bij patiënten met neurologisch volledig thoracaal ruggenmergletsel. De resultaten toonden aan dat AST-OPC1 met succes werd afgeleverd op de plaats van het gewonde ruggenmerg. Patiënten die 2-3 jaar na toediening van AST-OPC1 werden gevolgd, vertoonden geen bewijs van ernstige bijwerkingen die verband hielden met de cellen in gedetailleerde follow-upbeoordelingen, waaronder frequente neurologische onderzoeken en MRI's. Immuunmonitoring van proefpersonen tot één jaar na transplantatie toonde geen bewijs van op antilichamen gebaseerde of cellulaire immuunresponsen op AST-OPC1. Bij vier van de vijf proefpersonen gaven seriële MRI-scans die werden uitgevoerd gedurende de follow-upperiode van 2-3 jaar aan dat er mogelijk verminderde cavitatie van het ruggenmerg is opgetreden en dat AST-OPC1 mogelijk een aantal positieve effecten heeft gehad bij het verminderen van de verslechtering van het ruggenmergweefsel. Er was geen onverwachte neurologische degeneratie of verbetering bij de vijf proefpersonen in het onderzoek, zoals geëvalueerd door het International Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injury (ISNCSCI)-onderzoek. [46]

De Strategic Partnership III-subsidie ​​van CIRM zal financiering verstrekken aan Asterias ter ondersteuning van de volgende klinische proef van AST-OPC1 bij proefpersonen met een dwarslaesie, en voor de productontwikkelingsinspanningen van Asterias om productiemethoden te verfijnen en op te schalen ter ondersteuning van proeven in een later stadium en uiteindelijk commercialisering. De CIRM-financiering is afhankelijk van de FDA-goedkeuring voor de proef, de voltooiing van een definitieve overeenkomst tussen Asterias en CIRM en de voortdurende vooruitgang van Asterias in de richting van het bereiken van bepaalde vooraf gedefinieerde projectmijlpalen. [46]

Bijwerkingen Bewerken

De grootste zorg bij de mogelijke transplantatie van ESC in patiënten als therapieën is hun vermogen om tumoren te vormen, waaronder teratoom. [47] Veiligheidsproblemen brachten de FDA ertoe de eerste klinische ESC-studie stop te zetten, maar er werden geen tumoren waargenomen.

De belangrijkste strategie om de veiligheid van ESC voor mogelijk klinisch gebruik te verbeteren, is om de ESC te differentiëren in specifieke celtypen (bijv. neuronen, spieren, levercellen) die het vermogen om tumoren te veroorzaken verminderd of geëlimineerd hebben. Na differentiatie worden de cellen onderworpen aan sortering door flowcytometrie voor verdere zuivering. Er wordt voorspeld dat ESC inherent veiliger is dan IPS-cellen die zijn gemaakt met genetisch integrerende virale vectoren, omdat ze niet genetisch zijn gemodificeerd met genen zoals c-Myc die verband houden met kanker. Desalniettemin brengen ESC zeer hoge niveaus van de iPS-inducerende genen tot expressie en deze genen, waaronder Myc, zijn essentieel voor ESC-zelfvernieuwing en pluripotentie, [48] en mogelijke strategieën om de veiligheid te verbeteren door c-Myc-expressie te elimineren, zullen de cellen waarschijnlijk niet behouden' " stam". Er is echter vastgesteld dat N-myc en L-myc iPS-cellen induceren in plaats van c-myc met vergelijkbare efficiëntie. [49] Recentere protocollen om pluripotentie te induceren omzeilen deze problemen volledig door gebruik te maken van niet-integrerende RNA-virale vectoren zoals sendai-virus of mRNA-transfectie.

Ethisch debat

Vanwege de aard van embryonaal stamcelonderzoek zijn er veel controversiële meningen over dit onderwerp. Aangezien voor het oogsten van embryonale stamcellen de vernietiging van het embryo nodig is waaruit die cellen zijn verkregen, komt de morele status van het embryo in het geding. Sommige mensen beweren dat de 5 dagen oude massa cellen te jong is om een ​​persoon te worden of dat het embryo, als het wordt gedoneerd door een IVF-kliniek (waar laboratoria gewoonlijk embryo's vandaan halen), anders toch naar het medisch afval zou gaan. Tegenstanders van ESC-onderzoek beweren dat een embryo een mensenleven is, daarom is het vernietigen ervan moord en moet het embryo worden beschermd volgens dezelfde ethische visie als een meer ontwikkeld mens. [50]

  • 1964: Lewis Kleinsmith en G. Barry Pierce Jr. isoleerden een enkel type cel uit een teratocarcinoom, een tumor die nu bekend is uit een kiemcel. [51] Deze cellen werden geïsoleerd uit het gerepliceerde teratocarcinoom en groeiden in celcultuur als een stamcel en staan ​​nu bekend als embryonale carcinoomcellen (EC). [citaat nodig] Hoewel overeenkomsten in morfologie en differentiërend potentieel (pluripotentie) leidden tot het gebruik van EC-cellen als in vitro model voor vroege muisontwikkeling, [52] EC-cellen herbergen genetische mutaties en vaak abnormale karyotypen die zich ophoopten tijdens de ontwikkeling van het teratocarcinoom. Deze genetische afwijkingen benadrukten verder de noodzaak om pluripotente cellen rechtstreeks uit de binnenste celmassa te kunnen kweken.
  • 1981: Embryonale stamcellen (ES-cellen) werden onafhankelijk eerst door twee groepen verkregen uit muizenembryo's. Martin Evans en Matthew Kaufman van de afdeling Genetica van de Universiteit van Cambridge publiceerden voor het eerst in juli en onthulden een nieuwe techniek voor het kweken van muizenembryo's in de baarmoeder om een ​​toename van het aantal cellen mogelijk te maken, waardoor ES-cellen uit deze embryo's kunnen worden afgeleid. . [53]Gail R. Martin, van het Department of Anatomy, University of California, San Francisco, publiceerde haar paper in december en bedacht de term "Embryonic Stem Cell". [54] Ze toonde aan dat embryo's gekweekt konden worden in vitro en dat uit deze embryo's ES-cellen kunnen worden afgeleid.
  • 1989: Mario R. Cappechi, Martin J. Evans en Oliver Smithies publiceren hun onderzoek waarin hun isolatie en genetische modificaties van embryonale stamcellen worden beschreven, waardoor de eerste "knock-out-muizen" ontstaan. [55] Door het creëren van knock-out muizen, verschafte deze publicatie wetenschappers een geheel nieuwe manier om ziekten te bestuderen.
  • 1998: Een team van de Universiteit van Wisconsin, Madison (James A. Thomson, Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall en Jeffrey M. Jones) publiceert een paper getiteld "Embryonale stamcellijnen afgeleid van menselijke blastocysten". De onderzoekers achter deze studie creëerden niet alleen de eerste embryonale stamcellen, maar erkenden ook hun pluripotentie en hun vermogen tot zelfvernieuwing. In de samenvatting van het artikel wordt gewezen op het belang van de ontdekking met betrekking tot de ontwikkelingsbiologie en de ontdekking van geneesmiddelen. [56]
  • 2001: President George W. Bush staat federale financiering toe om onderzoek te ondersteunen naar ongeveer 60 - op dit moment reeds bestaande - lijnen van embryonale stamcellen. Aangezien de beperkte lijnen waarop Bush onderzoek toestond al waren vastgesteld, ondersteunde deze wet embryonaal stamcelonderzoek zonder ethische vragen op te werpen die zouden kunnen rijzen bij het creëren van nieuwe lijnen onder de federale begroting. [57]
  • 2006: Japanse wetenschappers Shinya Yamanaka en Kazutoshi Takashi publiceren een paper waarin de inductie van pluripotente stamcellen uit culturen van volwassen muizenfibroblasten wordt beschreven. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) zijn een enorme ontdekking, omdat ze schijnbaar identiek zijn aan embryonale stamcellen en kunnen worden gebruikt zonder dezelfde morele controverse te veroorzaken. [58]
  • Januari 2009: De Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) geeft goedkeuring voor de fase I-studie van Geron Corporation voor hun behandeling op basis van menselijke embryonale stamcellen voor ruggenmergletsels. De aankondiging werd met opwinding ontvangen van de wetenschappelijke gemeenschap, maar ook met behoedzaamheid van tegenstanders van stamcellen. De behandelingscellen waren echter afgeleid van de cellijnen die waren goedgekeurd onder het ESC-beleid van George W. Bush. [59]
  • Maart 2009: Executive Order 13505 wordt ondertekend door president Barack Obama, waarmee de beperkingen worden opgeheven die door de vorige presidentiële regering waren ingesteld op federale financiering voor menselijke stamcellen. Dit zou de National Institutes of Health (NIH) in staat stellen financiering te verstrekken voor hESC-onderzoek. Het document stelt ook dat de NIH binnen 120 dagen na ondertekening van het bevel herziene federale financieringsrichtlijnen moet verstrekken. [60]

Afleiding van de mens

Bij in-vitrofertilisatie ontstaan ​​meerdere embryo's. Het overschot aan embryo's wordt niet klinisch gebruikt of is ongeschikt voor implantatie in de patiënt en mag daarom met toestemming door de donor worden gedoneerd. Menselijke embryonale stamcellen kunnen worden afgeleid van deze gedoneerde embryo's of ze kunnen daarnaast ook worden geëxtraheerd uit gekloonde embryo's met behulp van een cel van een patiënt en een gedoneerd ei. [61] De binnenste celmassa (cellen van belang), uit het blastocyststadium van het embryo, wordt gescheiden van het trophectoderm, de cellen die zouden differentiëren tot extra-embryonale weefsels. Immunochirurgie, het proces waarbij antilichamen aan het trophectoderm worden gebonden en door een andere oplossing worden verwijderd, en mechanische dissectie worden uitgevoerd om scheiding te bereiken. De resulterende binnenste celmassacellen worden uitgeplaat op cellen die ondersteuning zullen leveren. De binnenste celmassacellen hechten zich vast en breiden zich verder uit om een ​​menselijke embryonale cellijn te vormen, die ongedifferentieerd is. Deze cellen worden dagelijks gevoed en worden elke vier tot zeven dagen enzymatisch of mechanisch gescheiden. Om differentiatie te laten plaatsvinden, wordt de menselijke embryonale stamcellijn verwijderd van de ondersteunende cellen om embryoïde lichamen te vormen, wordt ze samen gekweekt met een serum dat de nodige signalen bevat, of wordt ze geënt in een driedimensionaal stellage om te resulteren. [62]

Afleiding van andere dieren

Embryonale stamcellen zijn afgeleid van de binnenste celmassa van het vroege embryo, die worden geoogst van het donormoederdier. Martin Evans en Matthew Kaufman rapporteerden een techniek die de implantatie van embryo's vertraagt, waardoor de binnenste celmassa kan toenemen. Dit proces omvat het verwijderen van de eierstokken van de donormoeder en het doseren van haar met progesteron, het veranderen van de hormoonomgeving, waardoor de embryo's vrij in de baarmoeder blijven. Na 4-6 dagen van deze intra-uteriene kweek worden de embryo's geoogst en gekweekt in vitro cultuur totdat de binnenste celmassa "eiercilinderachtige structuren" vormt, die worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen en worden uitgeplaat op fibroblasten die zijn behandeld met mitomycine-c (om fibroblastmitose te voorkomen). Klonale cellijnen worden gemaakt door een enkele cel op te groeien. Evans en Kaufman toonden aan dat de cellen die uit deze culturen zijn gegroeid teratomen en embryoïde lichamen kunnen vormen en differentiëren in vitro, die allemaal aangeven dat de cellen pluripotent zijn. [53]

Gail Martin heeft haar ES-cellen op een andere manier afgeleid en gekweekt. Ze verwijderde de embryo's van de donormoeder ongeveer 76 uur na de copulatie en kweekte ze een nacht in een medium met serum. De volgende dag verwijderde ze de binnenste celmassa van de late blastocyst met behulp van microchirurgie. De geëxtraheerde binnenste celmassa werd gekweekt op fibroblasten behandeld met mitomycine-c in een medium dat serum bevat en geconditioneerd door ES-cellen. Na ongeveer een week groeiden kolonies cellen uit. Deze cellen groeiden in kweek en vertoonden pluripotente kenmerken, zoals aangetoond door het vermogen om teratomen te vormen, te differentiëren in vitro, en vormen embryoïde lichamen. Martin noemde deze cellen ES-cellen. [54]

Het is nu bekend dat de voedingscellen de leukemieremmende factor (LIF) leveren en dat serum botmorfogenetische eiwitten (BMP's) levert die nodig zijn om te voorkomen dat ES-cellen differentiëren. [63] [64] Deze factoren zijn uiterst belangrijk voor de efficiëntie van het afleiden van ES-cellen. Verder is aangetoond dat verschillende muizenstammen verschillende efficiënties hebben voor het isoleren van ES-cellen. [65] Huidige toepassingen voor ES-cellen van muizen omvatten het genereren van transgene muizen, waaronder knock-outmuizen. Voor menselijke behandeling is er behoefte aan patiëntspecifieke pluripotente cellen. Het genereren van menselijke ES-cellen is moeilijker en wordt geconfronteerd met ethische problemen. Dus, naast het onderzoek naar menselijke ES-cellen, zijn veel groepen gericht op het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen). [66]

Mogelijke methoden voor het afleiden van nieuwe cellijn

Op 23 augustus 2006 verscheen de online editie van Natuur wetenschappelijke tijdschrift publiceerde een brief van Dr. Robert Lanza (medisch directeur van Advanced Cell Technology in Worcester, MA) waarin stond dat zijn team een ​​manier had gevonden om embryonale stamcellen te extraheren zonder het eigenlijke embryo te vernietigen. [67] Deze technische prestatie zou wetenschappers mogelijk in staat stellen om te werken met nieuwe lijnen van embryonale stamcellen die zijn verkregen met overheidsgeld in de VS, waar de federale financiering destijds beperkt was tot onderzoek met embryonale stamcellijnen die vóór augustus 2001 waren verkregen. In maart , 2009 werd de beperking opgeheven. [68]

Menselijke embryonale stamcellen zijn ook afgeleid door somatische celkernoverdracht (SCNT). [69] [70] Deze benadering wordt soms ook wel "therapeutisch klonen" genoemd omdat SCNT vergelijkbaar is met andere soorten klonen doordat kernen worden overgebracht van een somatische cel naar een ontkernde zygote. In dit geval werd SCNT echter gebruikt om embryonale stamcellijnen in een laboratorium te produceren, niet levende organismen via een zwangerschap. Het "therapeutische" deel van de naam is opgenomen vanwege de hoop dat door SCNT geproduceerde embryonale stamcellen klinisch bruikbaar zouden kunnen zijn.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen

De iPSC-technologie werd ontwikkeld door het laboratorium van Shinya Yamanaka in Kyoto, Japan, dat in 2006 aantoonde dat de introductie van vier specifieke genen die coderen voor transcriptiefactoren volwassen cellen kunnen omzetten in pluripotente stamcellen. [71] Hij ontving de Nobelprijs van 2012 samen met Sir John Gurdon "voor de ontdekking dat rijpe cellen kunnen worden geherprogrammeerd om pluripotent te worden." [72]

In 2007 werd aangetoond dat pluripotente stamcellen die sterk lijken op embryonale stamcellen kunnen worden gegenereerd door de levering van drie genen (4 okt, Sox2, en Klf4) naar gedifferentieerde cellen. [73] De levering van deze genen "herprogrammeert" gedifferentieerde cellen tot pluripotente stamcellen, waardoor pluripotente stamcellen kunnen worden gegenereerd zonder het embryo. Omdat ethische bezwaren met betrekking tot embryonale stamcellen doorgaans te maken hebben met hun afstamming van beëindigde embryo's, wordt aangenomen dat herprogrammering naar deze "geïnduceerde pluripotente stamcellen" (iPS-cellen) minder controversieel is. Zowel menselijke als muizencellen kunnen met deze methode worden geherprogrammeerd, waarbij zowel menselijke pluripotente stamcellen als pluripotente muizenstamcellen zonder embryo worden gegenereerd. [74]

Dit kan het genereren van patiëntspecifieke ES-cellijnen mogelijk maken die mogelijk kunnen worden gebruikt voor celvervangingstherapieën. Bovendien zal dit de generatie van ES-cellijnen van patiënten met een verscheidenheid aan genetische ziekten mogelijk maken en zal het onschatbare modellen opleveren om die ziekten te bestuderen.

Als eerste indicatie dat de technologie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) in snel tempo kan leiden tot nieuwe behandelingen, werd deze echter gebruikt door een onderzoeksteam onder leiding van Rudolf Jaenisch van het Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts, om genezen muizen van sikkelcelanemie, zoals gerapporteerd door Wetenschap online editie van het tijdschrift op 6 december 2007. [75] [76]

Op 16 januari 2008 kondigde een in Californië gevestigd bedrijf, Stemagen, aan dat ze de eerste volwassen gekloonde menselijke embryo's hadden gemaakt van afzonderlijke huidcellen van volwassenen. Deze embryo's kunnen worden geoogst voor embryonale stamcellen die overeenkomen met de patiënt. [77]

Besmetting door in celkweek gebruikte reagentia

De online editie van Natuurgeneeskunde publiceerde een studie op 24 januari 2005, waarin werd gesteld dat de menselijke embryonale stamcellen die beschikbaar zijn voor federaal gefinancierd onderzoek, besmet zijn met niet-menselijke moleculen uit het kweekmedium dat wordt gebruikt om de cellen te laten groeien. [78] Het is een veelgebruikte techniek om muiscellen en andere dierlijke cellen te gebruiken om de pluripotentie van actief delende stamcellen te behouden. Het probleem werd ontdekt toen niet-menselijk siaalzuur in het groeimedium het potentiële gebruik van de embryonale stamcellen bij mensen in gevaar bracht, volgens wetenschappers van de Universiteit van Californië, San Diego. [79]

Echter, een studie gepubliceerd in de online editie van Medisch tijdschrift Lancet op 8 maart 2005 gedetailleerde informatie over een nieuwe stamcellijn die werd verkregen uit menselijke embryo's onder volledig cel- en serumvrije omstandigheden. Na meer dan 6 maanden van ongedifferentieerde proliferatie, toonden deze cellen het potentieel om derivaten te vormen van alle drie de embryonale kiemlagen zowel in vitro en in teratomen. Deze eigenschappen werden ook met succes behouden (meer dan 30 passages) met de gevestigde stamcellijnen. [80]


Kenmerken van lysosomen

Op basis van onze huidige kennis bestaan ​​er drie hoofdtypen autofagie. Ze vereisen allemaal de aanwezigheid van een organel dat bekend staat als een lysosoom en de enzymen die het bevat. Een organel is een gespecialiseerde structuur in een cel die een specifieke taak of gerelateerde taken uitvoert. Enzymen verhogen de snelheid van chemische reacties, waardoor ze nuttig kunnen zijn voor levende wezens.

Er kunnen honderden lysosomen in een cel zijn. Ze spelen een centrale rol bij autofagie omdat de celcomponenten die worden verwijderd, worden afgebroken in de lysosomen (of in een hybride structuur gemaakt van een lysosoom en een ander organel).

Elk lysosoom is een bolvormige vacuole omgeven door een enkel membraan.Het bevat hydrolytische enzymen, die moleculen afbreken in een zure omgeving. Waterstofionen worden naar een lysosoom verplaatst om de zure pH te produceren. Een lysosoom is herbruikbaar. Het wordt vernietigd wanneer de inhoud uiteenvalt.

De video hierboven bevat een beschrijving van autofagie in gistcellen. Het proces in gisten is niet identiek aan dat in dierlijke of menselijke cellen.


Abstract

Optische biosensoren die oppervlakte-plasmonresonantie, golfgeleiders en resonante spiegels benutten, zijn de afgelopen tien jaar op grote schaal gebruikt om biomoleculaire interacties te analyseren. Met deze sensoren kunnen de affiniteit en kinetiek van een breed scala aan moleculaire interacties in realtime worden bepaald, zonder dat een moleculaire tag of label nodig is. Vooruitgang in instrumentatie en experimenteel ontwerp hebben geleid tot de toenemende toepassing van optische biosensoren op veel gebieden van het ontdekken van geneesmiddelen, waaronder doelidentificatie, ligandvissen, testontwikkeling, leadselectie, vroege ADME en productiekwaliteitscontrole. Dit artikel bespreekt belangrijke vorderingen in optische-biosensorinstrumentatie en toepassingen, en belicht ook enkele opwindende ontwikkelingen, zoals sterk gemultiplexte optische-biosensorarrays.


Resultaten

De Heat Map (S1-tabel) rapporteert de gegevens van meer dan 290 testen die zijn uitgevoerd op de Malaria Box-verbindingen. Een momentopname wordt getoond in Fig 1. De resultaten zijn kleurgecodeerd, waarbij de verbindingen met de hoogste activiteit rood zijn gecodeerd en die met relatieve inactiviteit groen . In het midden van het vak in S1-tabel wordt de numerieke waarde voor de verbinding gegeven. Het kan onmiddellijk worden gezien dat sommige verbindingen activiteiten hebben in verschillende biologische tests bij meerdere soorten en deze hebben de neiging om ook activiteit te hebben tegen zoogdiercellen, terwijl andere verbindingen een vrij beperkt werkingsspectrum hebben en minder toxisch zijn voor zoogdiercellen.

Getoond worden geselecteerde gegevens uit de HeatMap (S1-tabel) voor de 400 Malaria Box-verbindingen. Elke kolom vertegenwoordigt een test (gegroepeerd op categorie), verbindingen worden weergegeven in rijen. De rood-groene gradiënt staat voor hogere tot lagere activiteit. Gunstige PK-activiteiten worden groen gescoord. Pf: Plasmodium falciparum, Pb: Plasmodium berghei, PK: farmacokinetiek, sol.: oplosbaarheid, hERG: remming van humaan ether-a-go-go-kanaal, DDI: interacties tussen geneesmiddelen (voorspeld).

De gegevens die in S1-tabel worden getoond, worden geleverd door 55 groepen die 291 tests hebben uitgevoerd om de Malaria Box te screenen. Het overgrote deel van de gegevens wordt voor het eerst in dit artikel gepresenteerd. Merk in de S1-tabel met aanvullende gegevens op dat kolommen met gegevens die voor het eerst in dit artikel worden gepresenteerd, die 236 assays vertegenwoordigen, roze zijn gekleurd op de bovenste rij gepubliceerd / in persgegevenskolommen, 55, zijn grijs, met citaten. Door de gecombineerde dataset te presenteren, krijgt u inzicht in de hitrates in deze verschillende tests, terwijl de bredere wetenschappelijke gemeenschap snel toegang heeft tot de gegevens.

De Heat Map (S1-tabel) presenteert de Malaria Box-chemicaliën gegroepeerd op chemische verwantschap. Van de 400 verbindingen zijn er meer dan 100 nauw verwante gepaarde moleculen, dus directe structuur-activiteitsrelaties (SAR) kunnen vaak worden gezien uit hits met deze paren. De Heat Map identificeerde duidelijke correlaties in chemie en biologie tussen verbindingen (zowel Mechanism-of-Action als fenotypische activiteit). Sommige biologische testen zijn relatief vergelijkbaar, er waren bijvoorbeeld een groot aantal verschillende P. falciparum gametocytenassays (S1-tabel, kolommen AV-CB), die ook clusteren, hoewel niet perfect. Als zodanig helpen de geaggregeerde screeninggegevens om vooroordelen tussen laboratoria te overwinnen en uitstekende activiteiten te identificeren. Verbindingen die actief waren in meerdere gametocytentests vertegenwoordigen bijvoorbeeld meer solide positieven dan een verbinding die actief was in slechts één screeningstest. De gametocyttesten werden echter vaak uitgevoerd met verschillende technieken en screeningconcentraties (zie S1-methoden en resultaten voor details) en de ene test kan de voorkeur hebben boven een andere om verbindingen met gametocytactiviteit te selecteren. Het is dus waardevoller om de geaggregeerde gegevens samen met de afzonderlijke protocollen te presenteren dan alleen elke afzonderlijke gegevensset opeenvolgend te bekijken.

Malaria Box veiligheid en farmacokinetische gegevens

Vroege veiligheidsgegevens werden verkregen door alle verbindingen te testen tegen 73 menselijke cellijnen bij 10 M of hoger, en ontwikkelende zebravisembryo's werden blootgesteld bij 5 μM, wat verdere aanwijzingen opleverde over mogelijke veiligheidsproblemen. Een veelvoorkomend veiligheidsrisico voor cardiotoxiciteit is QTc-verlenging en alle verbindingen werden gescreend op hERG-remming [6], wat een indicatie is voor dit risico (S1-tabel kolom GI). De werkzaamheid en veiligheid van antimalariamiddelen kunnen worden gewijzigd in endemische regio's als ze worden toegediend aan patiënten die ook worden behandeld voor hiv (humaan immunodeficiëntievirus) of tbc (tuberculose), als gevolg van geneesmiddelinteracties in de lever. Om dergelijke interacties te markeren, hebben we twee recente doorbraakmodellen gebruikt: een bio-engineered menselijke lever op microschaal in een high-throughput assay-formaat dat nauwkeurig menselijke interacties tussen geneesmiddelen vastlegt die niet detecteerbaar zijn in dieren of cellijnen [7] en een op maat gemaakte, robotachtige high -doorvoer Op Luminex gebaseerde methode voor het profileren van de expressie van 83 humane levergeneesmiddelmetaboliserende enzymen [8]. Door deze hulpmiddelen te combineren, hebben we de Malaria Box-verbindingen geprofileerd voor inductie of remming van geneesmiddelmetaboliserende routes (S1-tabel, kolommen GL-HA) en daarbij verbindingen gerangschikt voor potentieel voor geneesmiddelinteracties met bestaande HIV- en TB-regimes, om de selectie van verbindingen met de laagste veiligheidsrisico's. We scoorden ook de Malaria Box-verbindingen voor acute hepatoxiciteit door de morfologie en dagelijkse albumine- en ureumsecretie uit hepatocyten te volgen (S1-tabel, kolommen FQ-FS).

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) vertegenwoordigen de grootste doelwitklasse voor menselijke geneesmiddelen [9] ze beïnvloeden de neurologische en cardiovasculaire fysiologie en zijn opgenomen in routinematige veiligheidsfarmacologiepanels [10]. Daarom, in vitro affiniteitsbepalingen op 23 geselecteerde menselijke off-target GPCR's werden uitgevoerd op een subset (10%) van MMV-verbindingen (S1-tabel, kolommen HC-HZ). Een van de ernstigste GPCR-gerelateerde bijwerkingen is hartvalvulopathie gekoppeld aan 5-HT2B activering [11, 12]. Daarom zijn sommige van de MMV-verbindingen met significante bindingsaffiniteit voor de 5-HT2B receptor werden ook getest op de overeenkomstige functionele test om een ​​mogelijk agonistisch effect te bepalen. Bovendien werden voorspellingen van de glutathionreactiviteit en het epoxidatiepotentieel van de verbinding berekend voor elk van de Malaria Box-verbindingen (S1-tabel, kolommen IB-IC). Deze gecombineerde veiligheidsresultaten waarschuwen ons voor verbindingen met problemen die hopelijk kunnen worden opgelost in volgende medicinale chemieprogramma's.

Vóór in vivo farmacologische evaluatie Het is belangrijk om te weten dat een effectieve plasmaconcentratie kan worden bereikt. Deze blootstelling werd gemeten bij knaagdieren voor alle verbindingen, vanaf een enkele hoge orale dosis (140 μmol/kg). Ongeveer een derde van de verbindingen genereerde een hoge plasma Cmax (>1 μg/ml) en/of hoge totale blootstelling (S1-tabel, kolommen GD-GE). Dit is een hoger dan verwacht percentage verbindingen met meetbare orale biologische beschikbaarheid dan wanneer verbindingen willekeurig werden geselecteerd, en weerspiegelt waarschijnlijk het grote aantal medicijnachtige leads dat is geselecteerd voor de Malaria Box. De combinatie van in vitro potentie en biologische beschikbaarheid bieden een ruwe schatting van de dosering, die de daaropvolgende besluitvorming rond de selectie van ontwikkelingsleads informeert.

De gecombineerde analyse van al deze veiligheids- en farmacokinetische gegevens maakt het mogelijk de meest veelbelovende verbindingen te selecteren om door te gaan naar medicinale chemie, en welke parameters moeten worden gecontroleerd en verbeterd tijdens een medisch-chemieprogramma.

Nieuwe inzichten in malaria

De activiteit van Malaria Box-verbindingen tegen het aseksuele, erythrocytische stadium van P. falciparum werd bevestigd door vijf laboratoria op zeven verschillende P. falciparum stammen. Er waren soms 5-10-voudige verschillen in de effectieve concentratie die een groeivermindering van 50% veroorzaakten (EC50) in elke test, en deze kunnen het gevolg zijn van variaties in de uitlezingen voor de screeningstesten (LDH-afgifte, opname van MitoTracker of Sybr Green-kleurstof, opname van hypoxanthine, DAPI-beeldvormingstest), variaties in de eiwitconcentratie in het testmedium (die de concentratie van de vrije verbinding), de tijd waarop de verbinding is geïncubeerd, of andere verschillen. Meestal waren de resultaten echter consistent en stamonafhankelijk. We hebben gedocumenteerd op welke subfase van de aseksuele levenscyclus de verbindingen inwerkten (S1-tabel, kolommen AA-AE). Deze informatie is belangrijk bij het identificeren van verbindingen die de bestaande resistentie tegen artemisinine en andere antimalariamiddelen kunnen overwinnen. Er wordt bijvoorbeeld gezocht naar verbindingen die zich richten op intra-erythrocytaire parasieten in het vroege ringstadium en een snel dodende dynamiek hebben, omdat ze, net als artemisinines, parasieten snel doden en de mortaliteit van patiënten kunnen verminderen. Tabel 1 toont verbindingen die ook gericht zijn op leverstadia van de levenscyclus van de parasiet.

Selectiviteitsindex, SI, is toxiciteitsniveau/activiteitsniveau p, sondeachtig d, geneesmiddelachtig.

Gericht op ziekte-relevante malariastadia

P. berghei remming van het leverstadium (LS), met behulp van door parasieten gecodeerde luciferase-activiteit als een uitlezing van infectie in HepG2-cellen, werd onafhankelijk bepaald door twee groepen bij zeer verschillende screeningconcentraties (Hanson: 5 M, Winzeler: 50 M). Drieënveertig verbindingen, ruwweg 10% van de verbindingsbibliotheek, remden infectie met ten minste 50% bij 5 M en 90% bij 50 M (aangeduid als LS double actives). HepG2-celtoxiciteit (50% of meer reductie in HepG2-abundantie op basis van directe of indirecte uitlezingen) werd waargenomen met 63% van de Malaria Box-verbindingen bij 50 M, terwijl slechts 10% toxisch was bij de 5 μM-concentratie. Na uitsluiting van degenen die significante toxiciteit vertoonden in HepG2-cellen bij zowel 5 als 50 M, werden Malaria Box-verbindingen gestratificeerd op basis van mogelijke annotatie van het werkingsmechanisme (S1-tabel, kolom M). Vijf potentiële werkingsmechanismen vielen op als verrijkt met dubbele actieve stoffen van LS: (l) cysteïne-proteaseremmers (cruzaïne, rhodesaïne): 1,8% van alle Malaria Box-verbindingen (7/400) en 4,7% (2/43) van de dubbele actieve stoffen van LS (ii) mogelijke ademhalingsafhankelijke doelen (Δ IC50 in lage zuurstof vs. normale zuurstof): 0,8% (3/400) van alle Malaria Box-verbindingen en 4,7% (2/43) (iii) gericht op gistademhaling: 3,5% van alle Malaria Box-verbindingen (14/400) en 9,3% van de dubbele actieve stoffen van LS (4/43) (NS) vermoed of bekend PfDHODH-remmers (dihydroorotaatdehydrogenase): 2,5% van alle Malaria Box-verbindingen (10/400) en 9,3% van LS dubbel actief (4/43) en (v) vermoedelijke of bekende cytochroom bc1-remmers: 4,3% van alle Malaria Box-verbindingen (17/200) en 16,3% van de dubbele actieve stoffen van LS (7/43). Verbindingen met activiteit tegen PfATP4, nu het meest voorkomende intra-erythrocytische aseksuele doelwit dat wordt gezien in fenotypische screenings, werd niet gevonden bij de dubbele actieve stoffen van LS.

Er is grote behoefte aan antimalariamiddelen die dodelijk zijn slaperig, leverstadium P. vivax (hypnozoïeten), maar er is een gebrek aan testen die deze activiteit meten. Slechts negen verbindingen (tabel 1) vertonen gelijktijdige activiteit tegen gametocyten, lever- en aseksuele stadia, terwijl er geen bewijs is van toxiciteit bij zebravissen en brede cytotoxiciteit voor zoogdiercellen. Dit zouden verbindingen zijn om prioriteit voor te geven in vitro en in vivo screening tegen P. vivax hypnozoïeten en zouden baat hebben bij aanvullende MoA-onderzoeken.

Gametocytocidale medicijnen zouden de overdracht van de mens op de mug blokkeren en de levenscyclus van de parasiet doorbreken. De gegevens in tabel 1 omvatten reeksen met activiteiten op zowel gametocyt- als leverstadia, en sommige gegevens daagt op intrigerende wijze bestaande veronderstellingen uit. MMV007116 in deze categorie is bijvoorbeeld een mitochondriale (bc1) -remmer (S1-tabel, kolom M, regel 168) en heeft activiteit in een aantal gametocytocide-assays, maar andere bc1-remmers zijn over het algemeen niet gametocytocide, wat wijst op een andere MoA voor deze verbinding. We zien ook 4-aminoquinolinen als remmers van sommige gametocytentests, hoewel bekend is dat de oorspronkelijke 4-aminoquinolineverbinding chloroquine niet gametocytocide is voor P. falciparum. Nogmaals, dit kan een andere MoA impliceren voor sommige 4-aminoquinolineverbindingen of misschien meerdere werkingsmechanismen voor bepaalde verbindingen. Deze bevindingen benadrukken opnieuw de kracht van het bekijken van testgegevens in een bredere context bij het ontdekken van geneesmiddelen met open source.

Screening op het werkingsmechanisme

Gegevens van honderdnegentien MoA-assays voor verbindingen uit de Malaria Box zijn opgenomen, waarbij potentiële doelen voor 135 ervan zijn geïdentificeerd (S1-tabel en S1-methoden en resultaten). De MoA-assaygegevens worden weergegeven in kolom M van de S1-tabel en meer informatie over de schermen en hun resultaten wordt gegeven in S1-methoden en -resultaten. Deze schermen omvatten biochemische onderzoeken op enzymremming, eiwit-eiwitinteracties, gedrag door veranderde gist- of malaria-organismen en een verscheidenheid aan andere schermen. Sommige associaties zijn sterk en zijn opgevolgd met aanvullende experimenten (e.G. MMV008138 en zijn doelwit Pf-IspD [13-15]), maar de meeste doelassociaties zijn nog voorlopig. Sommige vermelde MoA-activiteiten komen inderdaad alleen voor bij hogere concentraties dan activiteit in celgebaseerde screenings en daarom is het onwaarschijnlijk dat ze de activiteit van die verbinding tegen een pathogeen of tumorcel verklaren. Bovendien zijn er veel MoA's afgeleid voor malaria, maar deze zijn minder waarschijnlijk van toepassing op de diverse groepen organismen die worden gescreend met de Malaria Box-verbindingen.

Oppervlakteplasmonresonantie (SPR) werd gebruikt om negen verbindingen te identificeren die vier sets eiwit-eiwitinteracties (PPI) remmen, zonder overlap tussen sets (S1-methoden en resultaten), wat suggereert dat moleculen werden geïdentificeerd die specifiek op deze eiwit-eiwitinterfaces zijn gericht. Verbindingen die remmen P. falciparum (autofagie-gerelateerde eiwitten) Atg8-Atg3 PPI waren MMV007907, MMV001246 en MMV665909 (S1-tabel, kolom M). Ze hadden een uitgesproken effect op alle stadia van de ontwikkeling van gametocyten, wat het idee ondersteunt van: PfAtg8-Atg3 is betrokken bij hermodellering en vesiculaire handel in de ontwikkeling van gametocyten. Zes verbindingen geremd in vitro vertaling naar P. falciparum lyseert met meer dan 60% bij een concentratie van 1 M (S1-tabel, kolom L [16]). Een van deze eiwittranslatieremmende verbindingen, MMV007907, is interessant omdat het activiteit had tegen zowel lever- als gametocytstadia, evenals een breed scala aan andere pathogenen, en een lage toxiciteit voor menselijke cellijnen heeft. Zesentwintig verbindingen remden ofwel de mitochondriale elektronentransportketen (bc1, 11 verbindingen) of DHODH (15 verbindingen). Omdat zowel de bc1- als de DHODH-route samenkomen op de biosynthese van pyrimidine, is het interessant dat bijna alle bc1-remmers anti-leverstadium en anti-mannelijke gametocytactiviteit hadden, terwijl de anti-mannelijke gametocyteigenschap over het algemeen ontbrak in de meeste DHODH-remmers [17-19] ].

PfATP4 is een P. falciparum plasmamembraaneiwit met genetische varianten die resistentie verlenen tegen verschillende nieuwe klinische en preklinische antimalariamiddelen [20-24]. PfEr is voorgesteld dat ATP4 functioneert als een Na+:H+-pomp, die Na+ uit de malariaparasiet laat stromen (en H+ importeert in) [21]. Parasieten die zijn blootgesteld aan 28 MMV Malaria Box-verbindingen hebben ion-homeostase-veranderingen laten zien die vergelijkbaar zijn met die waargenomen met waarschijnlijke PfATP4-remmers (aangegeven in kolom K, S1-tabel) [25], en worden dus geacht PfATP4-remmers. Analyse van de resultaten van de 281 assays met deze verbindingen, hier gerapporteerd, maakt gedetailleerde conclusies mogelijk over de mogelijke effecten van ATP4-remming in Plasmodium evenals andere organismen. Uit de hier samengevatte Malaria Box-gegevens blijkt dat de 28 PfATP4-geassocieerde hits waren meestal inactief tegen de verscheidenheid aan niet-Apicomplexan protozoa, wormen, insecten, gisten en bacteriën die werden getest. Een uitzondering was: Trypanosoma cruzi, dat door bijna 40% van de PfATP4-remmers (11/28), vergeleken met een algemeen hitpercentage van 20%. Opgemerkt moet worden dat de niet-Plasmodium Apicomplexan-parasieten waartegen de meeste verbindingen werden getest–Cryptosporidium parvum, Toxoplasma gondii, Theileria equi en drie soorten Babesia– waren over het algemeen niet bijzonder gevoelig voor de PfATP4-geassocieerde hits. Er is, voor zover wij weten, geen enkel bewijs dat de andere Apicomplexan-parasieten waartegen de Malaria Box werd getest, worden blootgesteld aan een hoge Na + -omgeving in hun gastheercellen, en dit kan de lagere gevoeligheid voor remming van een Na + -efflux verklaren mechanisme. Daarentegen infectie van een erytrocyt door Plasmodium wordt gevolgd door een toename van de Na+-concentratie in het erytrocytencytosol als gevolg van de inductie van breed-specificiteit (Na+-permeabele) ‘New Permeability Pathways’ in het erytrocytenmembraan van de gastheer [26-28]. Dit suggereert dat verstoring van Na + efflux door remming van PfATP4 is uniek, zeer schadelijk voor intra-erythrocytische malariaparasieten.

Er is eerder bewijs dat PfATP4-geassocieerde verbindingen zijn actief tegen gametocytstadia van P. falciparum [5, 22-24, 29-32]. Vijfentwintig van de 28 PfATP4-geassocieerde hits (89%) veroorzaakten enige remming van de vorming van mannelijke gameten bij 1 M (l.e. had positieve % remmingswaarden S1 Tabel). Opgemerkt moet echter worden dat ongeveer de helft van de PfATP4-geassocieerde hits hebben IC50 waarden voor het doden van aseksuele parasieten die vergelijkbaar zijn met of hoger zijn dan de 1 M-concentratie die wordt gebruikt in de gameetvormingstest. Slechts 65% van de PfDe geteste ATP4-non-hits hadden positieve waarden voor remming van de vorming van mannelijke gameten bij 1 M. Het is bekend dat een verhoging van de extracellulaire pH de exflagellation van mannelijke P. falciparum gameten, waardoor de mogelijkheid wordt vergroot dat een verhoging van de intracellulaire pH in mannelijke gametocyten of gameten, als gevolg van PfATP4-remming, voortijdige exflagellation veroorzaakt, wat leidt tot de dood van parasieten. Het is dus mogelijk dat een verhoging van de intracellulaire pH in mannelijke gametocyten of gameten als gevolg van: PfATP4-remming veroorzaakt voortijdige exflagellation die leidt tot hun dood.

Malariaboxverbindingen werden ook gescreend tegen aseksuele stadia met behulp van metabolomische en chemogenomische profilering (figuur 2). Met behulp van metabolomische profilering om de metabole reacties op de 80 verbindingen in plaat A te onderzoeken, zes van de zeven verbindingen waarvan wordt aangenomen dat ze zich richten op PfATP4 [25] vertoonde een duidelijke metabole respons die wordt gekenmerkt door een accumulatie van dNTP's en een afname van hemoglobine-afgeleide peptiden (Fig 2A, S2-tabel).Eenentwintig verbindingen geclusterd met atovaquon, een remmer van het bc1-complex van de elektronentransportketen, met een atovaquon-achtige signatuur die wordt gekenmerkt door de ontregeling van de pyrimidinesynthese. Van deze 21 atovaquon-achtige verbindingen werden er 17 ook door andere groepen geïdentificeerd als gericht op de elektronentransportketen of pyrimidinesynthese. Voor chemogenomische profilering, een verzameling van 35 P. falciparum enkele invoeging piggyBac [33] mutanten werden geprofileerd met 53 MMV-verbindingen en drie artemisinine (ART) verbindingen [Artesunate (AS), Artelinezuur (AL) en Artemether (AM)] voor veranderingen in IC50 ten opzichte van de wildtype ouder NF54 (Fig 2B, S3-tabel, S4-tabel). Vijf Malaria Box-verbindingen (MMV006087, MMV006427, MMV020492, MMV665876 en MMV396797) werden geïdentificeerd met vergelijkbare chemogenomische profielen voor geneesmiddelen als de ART-gevoeligheidscluster (Fig 2B). Deze verbindingen kunnen snelle moordenaars zijn, zoals artemisinine, en moeten verder worden onderzocht voor bevestiging, en of ze artemisinine-resistentie voor ringstadiumdoding kunnen overwinnen.

(A) Metabolische profilering: warmtekaart met metabole vingerafdrukken van 80 Malaria Box-verbindingen en atovaquon-controle. Parasietextracten werden geanalyseerd met LC-MS en veranderingen in metabolietpools werden berekend voor met geneesmiddel behandelde parasieten in vergelijking met onbehandelde controles. Hiërarchische clustering werd uitgevoerd op 2 log-fold veranderingen in metabolieten (gegevens in S2-tabel), geschaald van -3 tot +3. Zes van de zeven verbindingen (aangegeven in rood) gerapporteerd als doelwit PfATP4 [25] vertoonde een duidelijke metabole respons die wordt gekenmerkt door de accumulatie van dNTP's en een afname van hemoglobine-afgeleide peptiden. Een groot cluster van verbindingen (aangegeven in blauw) geclusterd met de atovaquon-controle (aangegeven in oranje), en vertonen een atovaquon-achtige signatuur die wordt gekenmerkt door ontregeling van de biosynthese van pyrimidine, en vertoonden een duidelijke metabole respons die wordt gekenmerkt door de accumulatie van dNTP's en een afname in hemoglobine-afgeleide peptiden. (B) Chemogenomische profilering: een verzameling van 35 P. falciparum enkele invoeging piggyBac mutanten werden geprofileerd met 53 MMV-verbindingen en 3 artemisinine (ART) -verbindingen [Artesunate (AS), Artelinezuur (AL) en Artemether (AM)] voor veranderingen in IC50 ten opzichte van de wildtype ouder NF54 (gegevens in S3-tabel, genen opgevraagd in S4-tabel). Kloon PB58 droeg een piggyBac insertie in het promotorgebied van het K13-gen en heeft een verhoogde gevoeligheid voor ART-verbindingen zoals PB54 en PB55 [33]. Drug-drug relaties gebaseerd op overeenkomsten in IC50 afwijkingen van verbindingen gegenereerd met piggyBac mutanten creëerden chemogenomische profielen die werden gebruikt om relaties tussen geneesmiddelen te definiëren. De significantie van overeenkomst in MoA tussen Malaria Box-verbindingen en ART werd geëvalueerd door Pearson's correlatieberekeningen van paarsgewijze vergelijkingen. De X-as toont de chemogenomische profielcorrelatie tussen een Malaria Box-verbinding en AS, de Y-as met AM de kleurgradiënt geeft de gemiddelde correlatie aan met alle geteste ART-derivaten. Vijf Malaria Box-verbindingen (MMV006087, MMV006427, MMV020492, MMV665876, MMV396797) werden geïdentificeerd met vergelijkbare chemogenomische profielen voor geneesmiddelen als de ART-gevoeligheidscluster.

Screening op gist om MoAs . voor te stellen

Vier groepen voerden schermen uit op S. cerevisiae stammen die zijn ontworpen om de MoA van testverbindingen te helpen ophelderen. Eén screening stelde vast dat 35 Malaria Box-verbindingen actief waren op een meervoudige ABC-transporter-deficiënte stam (ook bekend als de 'monsterstam') S. cerevisiae [34]. Aangezien gisten in het algemeen resistent zijn tegen remming van verbindingen als gevolg van transporters, kan deze monsterstam nu worden geanalyseerd op MoA van remming door deze 35 verbindingen. Een tweede studie mat selectieve groeiremming van S. cerevisiae verschillende koolstofbronnen gebruiken. De groei werd gemeten in drie verschillende groeimedia: rijke of minimale media met dextrose als koolstofbron, of minimale media met ethanol en glycerol als koolstofbronnen. Verbindingen die de groei op een mediaspecifieke manier beïnvloeden, kunnen remmers van belangrijke metabole routes vertegenwoordigen. Een derde groep gebruikte een giststam die de Pf fosfoethanolamine-methyltransferase (PfPMT) om te screenen op fosfocholine (PC) syntheseremmers. Dit scherm is gebaseerd op het onvermogen van deze giststam om PC te synthetiseren in afwezigheid van exogene choline, en is dus afhankelijk van de malaria PfPMT om te overleven. Het screenen van de Malaria Box-verbindingen en een verscheidenheid aan controles, waaronder wild-type PMT en met choline aangevulde media, leidde tot de identificatie van MMV007384, MMV007041 MMV396736, MMV396723, MMV000304, MMV000570, MMV000704, MMV666071, MMV000445, MMV667491 en MMV666080. PfPMT-remmers. Eindelijk een vierde groep gescreend S. cerevisiae gekweekt op ethanolbevattende media die ademhaling vereisen of glucose-fermentatieve media die geen ademhaling vereisen, en identificeerde 12 verbindingen die superieure remming gaven op ethanolmedia, wat suggereert dat deze verbindingen een ademhalingsdoelwit remmen. Zeven hiervan waren niet geassocieerd met andere doelwitten, de andere waren potentiële remmers van DHODH (3, 49), bc1 en IspD.

Activiteit tegen andere protozoa dan Plasmodium

De Malaria Box werd gescreend tegen 16 extra protozoa, die allemaal van medisch of veterinair belang zijn. Verbindingen met activiteit tegen drie of meer protozoa waren meestal toxisch voor de zebravis- of niet-kankercellijnen van zoogdieren, wat de noodzaak onderstreept om de concentraties die in tests worden gebruikt, te beperken om zinloze positieven te voorkomen. Tabel 2 geeft een overzicht van verbindingen met activiteit tegen protozoa die niet-toxisch waren voor zebravissen en de meeste zoogdiercellen. In de Cryptosporidium parvum assay waren er talrijke actieve verbindingen, maar geen enkele was volledig verstoken van toxiciteit voor cellijnen van zebravissen en zoogdieren. MMV665917 had een >20-voudige selectiviteitsindex (SI) voor C. parvum boven zoogdiercellen. Trypanosoma cruzi actieven waren niet overlappend tussen groepen, en worden apart vermeld, maar t. brucei actieven overlapten uitgebreid met andere schermen en worden samen gepresenteerd. Er waren zeven niet-toxische treffers die actief waren tegen extracellulaire amastigoten van Leishmania infantum, maar er waren geen niet-toxische verbindingen actief op de intracellulaire groei van macrofagen L. infantum. Er waren vijf niet-toxische Malaria Box-verbindingen actief tegen: t. gondii (MMV666095, MMV007363, MMV007791, MMV007881 en MMV006704). Veel van de verbindingen die actief waren op Neospora caninum veroorzaakten geen toxiciteitsvlaggen op het bijbehorende gastheercelfibroblastscherm, maar veel waren giftig bij 10 M of lager voor zoogdiercellen en zebravissen. De resterende niet-toxische N. hondsdolheid actieven die nader onderzocht moeten worden zijn: MMV019670, MMV000911 en MMV006309. De meeste verbindingen die actief zijn tegen Entamoeba histolytica, Naegleria fowleri, of exflagellation van Chromera velia waren giftig. Een uitzondering was MMV665979, een uitstekende hit voor Naegleria fowleri, met beperkte toxiciteit elders in de dataset. Met betrekking tot screening Babesia en Theileria, tien nieuwe anti-Babesia en anti-Theileria hits met nanomolaire IC50s werden geïdentificeerd: MMV666093, MMV396794, MMV006706, MMV665941, MMV085203, MMV396693, MMV006787, MMV073843, MMV007092 en MMV665875. De meest interessante hits waren MMV396693, MMV073843, MMV666093, MMV665875 en MMV006706 met gemiddelde SI's groter dan 230 en IC50s variërend van 43 tot 750 nM voor zowel runderen Babesia en paarden Babesia en Theileria parasieten. Bovendien vertoonden 64, 45 en 49 Malaria Box-verbindingen IC50s lager dan die van diminazeenacetaat (het meest gebruikte antibabesial geneesmiddel) tegen de in vitro groei van B. bovis, B. grotemina en t. equi, respectievelijk.

Selectiviteitsindex, SI, is toxiciteitsniveau/activiteitsniveau p, sondeachtig d, geneesmiddelachtig.

In vitro screening van Open Access Malaria Box verbindingen tegen Babesia bovis, B. grotemina, Theileria equi en B. caballi heeft geleid tot de ontdekking van 10 nieuwe krachtige anti-babesial hits die submicromolaire potentie vertonen tegen zowel runderen Babesia en paarden Babesia en Theileria. In vitro follow-up van de vele treffers die in deze studie zijn geïdentificeerd voor: B. bovis, B. grotemina, B. caballi, en t. equi parasieten, onthulde IC50s lager dan die verkregen met de eerder beschreven drug-leads luteoline, pyronaridine, nimbolide, gedunin en enoxacine [35]. De tien krachtige hits voor runderen Babesia en paarden Babesia en Theileria geïdentificeerd in deze studie vertoonde IC50s lager dan die verkregen met de op apicoplast gerichte antibacteriële middelen (ciprofloxacine, thiostrepton en rifampicine), miltefosine, fusidinezuur of allicine [36-39].

Activiteit op wormen, mycobacteriën en bacteriën

Veel Malaria Box-verbindingen waren actief op wormen bij 10 μM, maar de meeste waren ook giftig voor zoogdiercellen of zebravissen. De overige niet-toxische verbindingen waren werkzaam tegen: Brugia maleisië (lymfatische filariasis) en Ancylostoma ceylanicum (mijnworm Tabel 1). Maar er werden geen niet-toxische verbindingen gevonden met consistente activiteit tegen Schistosoma mansoni, Strongyloides stercoralis, Trichuris muris, Haemonchus contortus, of Onchocerca linnenalis. Er blijft de mogelijkheid bestaan ​​dat sommige van de toxische treffers tegen deze soorten kunnen worden aangepakt door medicinale chemie.

Met betrekking tot activiteit tegen mycobacteriën en bacteriën, hoewel elk scherm actieve stoffen afleverde, werd de meerderheid opnieuw weggegooid vanwege een toxiciteitssignaal tegen zebravis- en/of zoogdiercellen. De uitzonderingen waren niet-toxische Malaria Box-verbindingen die actief waren tegen: Wolbachia (Tafel 1). Wolbachia bacteriën worden aangevallen als anti-filariamiddelen om nematoden die rivierblindheid en elefantiasis veroorzaken te beroven van essentiële voedingsstoffen die door deze bacterie worden geleverd [40].

Activiteit op kankercellen

Het Amerikaanse National Cancer Institute heeft 59 menselijke tumorcellijnen ('NCI60') gescreend tegen de Malaria Box-verbindingen bij 10 M (S1-tabel en S1-methoden en resultaten). Van de 133 verbindingen die verder werden geëvalueerd op dosis-respons, en de tien daarvan werden vervolgens getest in bevestigende testen (S1-tekst), werd MMV007384 geselecteerd op potentie en gerichte activiteit tegen darmkankercellen, en is gevorderd tot een in vivo proof-of-concept-experiment.


Aanwijzingen ontdekt over hoe het belangrijkste medicijn tegen tuberculose zijn doelwit aanvalt

Onderzoekers van de Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health zeggen dat ze een nieuwe aanwijzing hebben gevonden om te begrijpen hoe de belangrijkste medicatie voor tuberculose (tbc) slapende tbc-bacteriën aanvalt om de behandeling te verkorten.

Het antibioticum Pyrazinamide (PZA) wordt al sinds de jaren vijftig gebruikt voor de behandeling van tbc, maar de mechanismen ervan zijn het minst bekend van alle tbc-medicijnen. De PZA-bevindingen kunnen onderzoekers helpen bij het identificeren van nieuwe en effectievere geneesmiddelen, niet alleen voor TB - waarvoor zes maanden of langer behandeling nodig kan zijn - maar ook voor andere aanhoudende bacteriële infecties. Een rapport over het onderzoek is online gepubliceerd op 13 augustus in het tijdschrift Opkomende microben en infecties.

"PZA is waarschijnlijk het meest unieke antibioticum dat we hebben, want in plaats van alleen achter tbc-cellen aan te gaan die actief repliceren, zoekt het naar en vernietigt het slapende tbc-cellen die niet door andere antibiotica kunnen worden gecontroleerd", zegt onderzoeksleider Ying Zhang, MD, PhD, een professor in de afdeling Moleculaire Microbiologie en Immunologie van de Bloomberg School. "Het is net als wanneer je aan het wieden bent. De meeste huidige medicijnen hakken gewoon de bladeren eraf, maar de wortels zijn er nog. PZA grijpt naar de wortels. Door te leren hoe het werkt, kunnen we mogelijk sneller en permanenter van tbc afkomen zonder terugval ."

De nieuwe studie, uitgevoerd in samenwerking met de Fudan University in Shanghai, vond dat PZA de energieproductie van Mycobacterium tuberculosis, het doden van de bacteriën. Het doet dit door de PanD te verstoren, die onder andere cruciaal is voor de synthese van co-enzym A, een molecuul in het centrum van het energiemetabolisme. Wanneer PanD correct werkt in een tbc-cel, kan de cel overleven en blijven bestaan ​​ondanks een lange behandelingskuur. Alleen PZA's unieke vermogen om dit proces te stoppen, stelt het in staat om de slapende bacteriën te verwijderen.

De onderzoekers, die de afgelopen jaren een ander PZA-doelwit, Rspa, ontdekten, zeggen dat PanD-mutaties alleen worden gevonden in een subset van tbc-bacteriën die resistent zijn tegen PZA. Het laboratoriumwerk dat voor de nieuwe studie is gedaan, levert bewijs dat PanD een nieuw en duidelijk doelwit is voor PZA, zegt Zhang.

PanD, zegt Zhang, is een veelbelovende bevinding omdat het enzym alleen aanwezig is in bacteriën zoals die gevonden worden in TB en niet in de cellen van mensen die de ziekte oplopen. Het is altijd veiliger om een ​​doelwit aan te vallen dat alleen in het gevaarlijke organisme voorkomt en niet in zijn gastheer, zegt hij.

In 2012 ontwikkelden naar schatting 8,6 miljoen mensen wereldwijd tbc en stierven er 1,3 miljoen aan de ziekte. Terwijl het aantal nieuwe diagnoses daalt, groeit het aantal resistente gevallen. Wanneer een patiënt wordt gediagnosticeerd met de longziekte, is de behandelingskuur zes maanden antibiotica. Onderzoekers over de hele wereld proberen medicijnen te ontwikkelen die sneller kunnen werken en zonder de toxische bijwerkingen die alle medicijnen in gebruik hebben.

PZA is de eerstelijnsbehandeling voor tbc. Het wordt gegeven aan patiënten met zowel geneesmiddelgevoelige als geneesmiddelresistente vormen van de ziekte. Alle nieuwe medicijnen in ontwikkeling worden gebruikt in combinatie met PZA.

Nu hij de rol begrijpt die PZA speelt op PanD en cellen die lang na de behandeling aanhouden, zegt Zhang dat hij van plan is te zoeken naar verbindingen die zich op dezelfde manier richten op PanD. De bevindingen kunnen implicaties hebben, zegt hij, voor het ontwikkelen van medicijnen die zich richten op persistente organismen in andere bacteriële infecties waarvan bekend is dat slapende cellen opnieuw verschijnen, zoals de ziekte van Lyme, urineweginfecties en zelfs kanker.


ASU staat voor het derde jaar op rij in de top 10 van de Amerikaanse octrooiranglijst

Volgens een jaarlijkse ranglijst van de beste universiteiten door de National Academy of Inventors en de Intellectual Property Owners Association, staat ASU voor het derde achtereenvolgende jaar in de top 10 voor Amerikaanse patenten die zijn verleend aan Amerikaanse universiteiten - en 11e wereldwijd.

"Deze patenten vertegenwoordigen het harde werk van ASU's elite onderzoeksfaculteit, hun toewijding om de grootste problemen van de samenleving aan te pakken en op te lossen en het succes dat ze in die missie hebben", zegt Sally C. Morton, executive vice president van ASU's Knowledge Enterprise. “ASU zet zich - in de kern - in om de wereld ten goede te veranderen. Deze erkenning laat zien hoe we deze inspanningen voortzetten.”

In 2020 kreeg ASU 140 Amerikaanse patenten, een stijging van 137 het jaar ervoor, een totaal dat aansluit bij de Universiteit van Florida en ASU slechts één plek achter Harvard plaatst. Andere Amerikaanse universiteiten in de top 10 zijn MIT, Stanford en Caltech. Tsinghua University in Peking was de enige niet-Amerikaanse universiteit die ASU overtrof op de wereldwijde lijst.

De commercialisering van innovaties die door ASU-onderzoekers zijn gemaakt, wordt geleid door het team van Skysong Innovations, ASU's exclusieve organisatie voor technologieoverdracht en intellectueel eigendom. Het team van business-, technologie- en juridische experts van Skysong Innovations werkt samen met ASU-faculteit, postdocs en personeel om het intellectuele eigendom dat ze creëren te beschermen en op de markt te brengen.

"ASU is absoluut uniek in haar toewijding aan het promoten van beurzen en onderzoek dat direct gericht is op de echte uitdagingen die de samenleving moet overwinnen", zegt Augie Cheng, CEO van Skysong Innovations. "We hebben een model waarmee ondernemende faculteiten een breed scala aan potentiële toepassingen kunnen nastreven, en dat prioriteit geeft aan langetermijnimpact."

Naast patenten bleven ASU-onderzoekers die met Skysong Innovations werkten, in het fiscale jaar 2020 andere nieuwe maatstaven zetten, door 306 uitvindingen bekend te maken en 19 nieuwe startups te lanceren. ASU-startups hebben in het fiscale jaar 2020 ook meer dan $ 120 miljoen aan externe financiering opgehaald. Op nationaal niveau ondersteunden Skysong Innovations en ASU-startups meer dan 2.000 banen en droegen ze $ 222 miljoen bij aan de economie, met het grootste deel van die impact in Arizona.

Hieronder staan ​​twee voorbeelden van door ASU gepatenteerde technologieën die in het 2020-rapport worden genoemd.

Neurologische aandoeningen opsporen - zo vroeg mogelijk

Aural Analytics, een door een onderneming gesteund ASU-spin-outbedrijf, heeft applicaties gebouwd die spraak gebruiken om subtiele veranderingen in de gezondheid van de hersenen te detecteren. Het bedrijf is mede opgericht door Julie Liss, associate dean en professor in het College of Health Solutions, en Visar Berisha, een associate professor met een gezamenlijke aanstelling in het College of Health Solutions en de School of Electrical, Computer and Energy Engineering.

Veel neurologische aandoeningen leiden tot veranderingen in spraakpatronen. Door die symptomen te analyseren, kunnen clinici beter lokaliseren waar de stoornis in het zenuwstelsel optreedt. Deze veranderingen zijn echter vaak te subtiel om te worden gedetecteerd zonder geavanceerde algoritmen.

In oktober 2020 heeft Skysong Innovations voor ASU een patent verkregen dat exclusief in licentie is gegeven aan Aural Analytics en dat het gebruik van de spraak van een patiënt dekt voor het diagnosticeren en volgen van neurologische aandoeningen, waaronder de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Huntington, multiple sclerose (MS), traumatisch hersenletsel (TBI), beroerte en andere aandoeningen waarbij motorische spraakveranderingen kunnen optreden.

Aural Analytics heeft een tiental medewerkers in Arizona en heeft meer dan $ 4 miljoen aan startkapitaal opgehaald.

Water uit de lucht halen in tijden en locaties van droogte

Cody Friesen is een serial entrepreneur, ASU-alumnus en Fulton Engineering Professor of Innovation. Zijn spin-out van ASU, SOURCE Global, heeft Hydropanels ontwikkeld en geproduceerd die drinkwater maken uit zonlicht en lucht.

In november 2020 werden Friesen en medewerkers benoemd tot uitvinders van een ASU-patent dat exclusief in licentie is gegeven aan SOURCE voor een methode om efficiënt waterdamp uit atmosferische lucht te extraheren. Het was een druk 2020 voor het bedrijf, dat in zijn laatste investeringsronde $ 50 miljoen ophaalde en ook werd genoemd op de lijst van Fast Company met de meest innovatieve sociaal-goede bedrijven.

Het bedrijf, met hoofdkantoor in Scottsdale, Arizona, is actief in 48 landen en op zes continenten.

Het rapport Top 100 Worldwide Universities Granted U.S. Utility Patents in 2020 gebruikt gegevens van het U.S. Patent and Trademark Office om patenten te vinden die universiteiten als de eerste rechtverkrijgende vermelden. In een tijd van intense publieke discussie over de bescherming van intellectueel eigendom, is het rapport bedoeld om het belang van octrooien in universitair onderzoek en innovatie te demonstreren.

"De instellingen die in het rapport van dit jaar zijn opgenomen, leiden wereldwijd innovatie door hun aanmoediging van academische ontdekkingen en uitvindingen", zei Paul R. Sanberg, president van de National Academy of Inventors, bij de aankondiging van het nieuwe rapport.

Geschreven door Derek Sarley/Skysong


Biotechnologie en de wet

Ook op het gebied van het recht heeft de biotechnologie belangrijke bijdragen geleverd. Het meest opvallende is dat wetenschappers buitengewoon gevoelige methoden hebben ontwikkeld voor het identificeren van DNA. Inderdaad, met de uitvinding van de polymerase kettingreactie in 1988, kan genoeg DNA worden geëxtraheerd uit een druppel bloed, een klein stukje huid, een enkel haar of een klein spermamonster om de persoon te identificeren van wie het afkomstig is. Dergelijke "genetische vingerafdrukken" werden ontwikkeld in 1984 en voor het eerst gebruikt in een proef in 1985.

Misschien wel de meest bekende zaak met op DNA gebaseerd bewijs was de O.J. Simpson-moordzaak in 1995. In de jaren negentig werd genetisch bewijs in de rechtszaal echter gemeengoed en werd het geaccepteerd door zowel advocaten, rechters als jury's. In feite zijn verschillende onschuldige mensen vrijgelaten uit de gevangenis als gevolg van het heronderzoek van bewijsmateriaal met behulp van DNA-vingerafdrukken.


Voorbij het laboratorium

Naast haar biologische basiswerk in het laboratorium, waagde Shapiro zich ook aan translationeel onderzoek. Shapiro erkende een toename van infectieziekten over de hele wereld en de behoefte aan nieuwe antibiotica en antischimmelmiddelen, en werkte in 1999 samen met Penn State-chemicus Stephen Benkovic om een ​​nieuwe klasse antimicrobiële verbindingen te creëren met behulp van boor - in plaats van koolstof - op de actieve plaats van moleculen, ondanks het advies van farmaceutische chemici dat het idee nooit zou werken. De twee richtten Anacor Pharmaceuticals op, nu eigendom van Pfizer. Een van hun verbindingen is nu een door de Food and Drug Administration goedgekeurd antischimmelmiddel en een ander is een niet-toxische plaatselijke behandeling voor eczeem bij kinderen en volwassenen.

Shapiro zat onlangs in een bioscoop en zag een commercial voor het middel tegen eczeem. "Het was zo'n ongelooflijk en surrealistisch gevoel om te zien hoe ons boorbevattende medicijn op het grote scherm werd aangeprezen", zegt ze. "'Als mijn moeder hier maar was om dit te zien', dacht ik."

Shapiro was wetenschappelijk adviseur van president Bill Clinton, en ook van voormalig minister van Binnenlandse Veiligheid Tom Ridge en voormalig minister van Buitenlandse Zaken Condoleezza Rice over dreigingen van bioterrorisme tijdens het presidentschap van George W. Bush. In 2012 ontving ze de National Medal of Science van de toenmalige president Barack Obama. De National Science Foundation maakte een video, waarop haar vier kleinkinderen te zien waren. Haar advies aan hen en anderen: "Volg je passie en je zult een rijk en waardevol leven hebben."

Shapiro volgt haar eigen advies op en vindt nog steeds tijd om te schilderen, vooral wanneer ze reist. Haar werken zijn getoond in meerdere tentoonstellingen en haar portret van moleculair bioloog Joe Sambrook zal binnenkort deel uitmaken van de permanente collectie van het Cold Spring Harbor Lab.


Bekijk de video: Het veilig slikken van medicijnen (November 2021).