Informatie

SS1_2019_Lecture_11 - Biologie


Replicatie ontwerp uitdaging: proeflezen

Wanneer de cel begint met het repliceren van het DNA, doet hij dit als reactie op omgevingssignalen die de cel vertellen dat het tijd is om te delen. Dit is een ontmoedigende taak als je bedenkt dat er ~ 6.500.000.000 basenparen in het menselijk genoom en ~ 4.500.000 basenparen in het genoom van een typische E coli stam en dat Nature heeft bepaald dat de cellen zich binnen respectievelijk 24 uur en 20 minuten moeten vermenigvuldigen. In beide gevallen moeten er veel individuele biochemische reacties plaatsvinden.

Hoewel idealiter replicatie met perfecte getrouwheid zou plaatsvinden, is DNA-replicatie, net als alle andere biochemische processen, onvolmaakt - basen kunnen worden weggelaten, extra basen kunnen worden toegevoegd of basen kunnen worden toegevoegd die niet goed basenpaar vormen. In veel organismen worden veel van de fouten die optreden tijdens DNA-replicatie onmiddellijk gecorrigeerd door DNA-polymerase zelf via een mechanisme dat bekend staat als proeflezen. In proeflezen, de DNA-polymerase "leest" elke nieuw toegevoegde base door de aanwezigheid of afwezigheid van kleine structurele anomalieën te detecteren voordat de volgende base aan de groeiende streng wordt toegevoegd. Daarbij kan een correctie worden aangebracht.

Als de polymerase detecteert dat een nieuw toegevoegde base correct is gepaard met de base in de matrijsstreng, wordt het volgende nucleotide toegevoegd. Als er echter een verkeerd nucleotide aan het groeiende polymeer wordt toegevoegd, zal de verkeerd gevormde dubbele helix ervoor zorgen dat het DNA-polymerase afslaat, en de nieuw gemaakte streng zal worden uitgeworpen van de polymerisatieplaats op de polymerase en zal een exonucleaseplaats binnengaan. Op deze plaats kan DNA-polymerase de laatste paar nucleotiden afsplitsen die aan het polymeer zijn toegevoegd. Nadat de verkeerde nucleotiden zijn verwijderd, worden er weer nieuwe toegevoegd. Deze mogelijkheid tot proeflezen brengt enkele nadelen met zich mee: het gebruik van een foutcorrigerende/nauwkeuriger polymerase vereist tijd (de wisselwerking is snelheid van replicatie) en energie (altijd een belangrijke kostenpost). Hoe langzamer je gaat, hoe nauwkeuriger je kunt zijn. Als u echter te langzaam gaat, kunt u mogelijk niet zo snel repliceren als uw concurrentie, dus het bepalen van de balans is de sleutel.

Fouten die niet worden gecorrigeerd door proeflezen, worden wat bekend staat als mutaties.

Figuur 1. Proeflezen door DNA-polymerase corrigeert fouten tijdens replicatie.

Voorgestelde discussie

Waarom zou DNA-replicatie snel moeten zijn? Overweeg de omgeving waarin het DNA zich bevindt en vergelijk dat met de structuur van DNA terwijl het wordt gerepliceerd.

Voorgestelde discussie

Wat zijn de voor- en nadelen van de proefleescapaciteiten van DNA-polymerase?

Replicatiefouten en DNA-reparatie

Hoewel DNA-replicatie doorgaans een zeer nauwkeurig proces is en het proeflezen van DNA-polymerasen helpt om het foutenpercentage laag te houden, komen er nog steeds fouten voor. Naast replicatiefouten kan er ook milieuschade optreden aan het DNA. Dergelijke ongecorrigeerde replicatiefouten of DNA-schade in de omgeving kunnen ernstige gevolgen hebben. Daarom heeft de natuur verschillende mechanismen ontwikkeld voor het repareren van beschadigd of onjuist gesynthetiseerd DNA.

Mismatch reparatie

Sommige fouten worden niet gecorrigeerd tijdens de replicatie, maar worden gecorrigeerd nadat de replicatie is voltooid; dit type reparatie staat bekend als a mismatch reparatie. Specifieke enzymen herkennen het onjuist toegevoegde nucleotide en snijden het uit en vervangen het door de juiste base. Maar hoe herkennen mismatch-reparatie-enzymen welke van de twee basen de verkeerde is?

In E colina replicatie krijgt de stikstofbase adenine een methylgroep; dit betekent dat direct na replicatie de ouderlijke DNA-streng methylgroepen zal hebben, terwijl de nieuw gesynthetiseerde streng deze niet heeft. Mismatch-reparatie-enzymen zijn dus in staat om het DNA te scannen en de verkeerd opgenomen basen uit de nieuw gesynthetiseerde, niet-gemethyleerde streng te verwijderen door de gemethyleerde streng te gebruiken als de "juiste" sjabloon waaruit een nieuw nucleotide kan worden opgenomen. Bij eukaryoten wordt het mechanisme niet zo goed begrepen, maar er wordt aangenomen dat het de herkenning van niet-verzegelde inkepingen in de nieuwe streng omvat, evenals een korte termijn, voortdurende associatie van enkele van de replicatie-eiwitten met de nieuwe dochterstreng nadat replicatie heeft plaatsgevonden. voltooid.

Figuur 2. Bij mismatch-reparatie wordt de onjuist toegevoegde base gedetecteerd na replicatie. De mismatch-reparatie-eiwitten detecteren deze base en verwijderen deze uit de nieuw gesynthetiseerde streng door nuclease-actie. Het gat is nu gevuld met het correct gepaarde honk.

Nucleotide excisie reparatie

Nucleotide excisie reparatie enzymen vervangen onjuiste basen door een snede te maken aan zowel de 3'- als de 5'-uiteinden van de onjuiste base. Het gehele DNA-segment wordt verwijderd en vervangen door correct gepaarde nucleotiden door de werking van een DNA-polymerase. Zodra de basen zijn opgevuld, wordt de resterende opening afgesloten met een fosfodiesterbinding die wordt gekatalyseerd door het enzym DNA-ligase. Dit reparatiemechanisme wordt vaak gebruikt wanneer blootstelling aan UV de vorming van pyrimidinedimeren veroorzaakt.

Figuur 3. Nucleotide-excisie herstelt thymine-dimeren. Bij blootstelling aan UV kunnen naast elkaar liggende thymines thyminedimeren vormen. In normale cellen worden ze uitgesneden en vervangen.

Gevolgen van fouten bij replicatie, transcriptie en vertaling

Iets belangrijks om over na te denken:

Cellen hebben een verscheidenheid aan manieren ontwikkeld om ervoor te zorgen dat DNA-fouten zowel worden gedetecteerd als gecorrigeerd. We hebben er al een aantal besproken. Maar waarom zijn er zoveel verschillende mechanismen ontstaan? Van proeflezen door de verschillende DNA-afhankelijke DNA-polymerasen tot de complexe reparatiesystemen. Dergelijke mechanismen zijn niet geëvolueerd voor fouten in transcriptie of vertaling. Als je bekend bent met de processen van transcriptie en/of vertaling, bedenk dan wat de gevolgen zijn van een fout in de transcriptie. Zou zo'n fout gevolgen hebben voor het nageslacht? Zou het dodelijk zijn voor de cel? Hoe zit het met fouten in de vertaling? Stel dezelfde vragen over het vertaalproces. Wat zou er gebeuren als het verkeerde aminozuur tijdens translatie per ongeluk in het groeiende polypeptide wordt gestopt? Hoe contrasteren deze met DNA-replicatie? Maak je geen zorgen als je niet bekend bent met transcriptie of vertaling. We zullen die snel leren en terugkomen op deze vraag.

De stroom van genetische informatie

In bacteriën, archaea en eukaryoten is de primaire rol van DNA het opslaan van erfelijke informatie die codeert voor de instructieset die nodig is voor het creëren van het organisme in kwestie. Hoewel we veel beter zijn geworden in het snel lezen van de chemische samenstelling (de sequentie van nucleotiden in een genoom en enkele van de chemische modificaties die erop zijn aangebracht), weten we nog steeds niet hoe we op betrouwbare wijze alle informatie in en alle van de mechanismen waarmee het wordt gelezen en uiteindelijk uitgedrukt.

Er zijn echter enkele kernprincipes en mechanismen die verband houden met het lezen en uitdrukken van de genetische code waarvan de basisstappen worden begrepen en die deel moeten uitmaken van de conceptuele toolkit voor alle biologen. Twee van deze processen zijn transcriptie en translatie, respectievelijk het verwerken van delen van de genetische code die in DNA is geschreven in moleculen van het verwante polymeer-RNA en het lezen en coderen van de RNA-code in eiwitten.

In BIS2A richten we ons grotendeels op het ontwikkelen van inzicht in de

Verwerken

van transcriptie (herinner je dat een energieverhaal gewoon een rubriek is voor het beschrijven van een proces) en zijn rol in de expressie van genetische informatie. We motiveren onze bespreking van transcriptie door ons te concentreren op functionele problemen (door delen van onze probleemoplossende/ontwerpuitdagingsrubriek in te voeren) die moeten worden opgelost in het proces dat moet plaatsvinden. Vervolgens beschrijven we hoe het proces door de natuur wordt gebruikt om een ​​verscheidenheid aan functionele RNA-moleculen te creëren (die verschillende structurele, katalytische of regulerende rollen kunnen hebben), waaronder zogenaamde boodschapper-RNA-moleculen (mRNA) die de informatie bevatten die nodig is om eiwitten te synthetiseren. . Evenzo richten we ons op uitdagingen en vragen die verband houden met het translatieproces, het proces waarbij de ribosomen eiwitten synthetiseren.

De basisstroom van genetische informatie in biologische systemen wordt vaak afgebeeld in een schema dat bekend staat als "het centrale dogma" (zie onderstaande afbeelding). Dit schema stelt dat informatie die is gecodeerd in DNA via transcriptie in RNA stroomt en uiteindelijk via translatie naar eiwitten. Processen zoals reverse transcriptie (het maken van DNA uit en RNA-template) en replicatie vertegenwoordigen ook mechanismen voor het verspreiden van informatie in verschillende vormen. Dit schema zegt echter niet per se iets over hoe informatie wordt gecodeerd of over de mechanismen waarmee regulerende signalen bewegen tussen de verschillende lagen van molecuultypes die in het model worden weergegeven. Daarom, hoewel het onderstaande schema een bijna verplicht onderdeel is van het lexicon van elke bioloog, misschien een overblijfsel uit de oude traditie, moeten studenten zich er ook van bewust zijn dat mechanismen van informatiestroom complexer zijn (we zullen er gaandeweg meer over leren, en dat "het centrale dogma" slechts enkele kernwegen vertegenwoordigt).

Figuur 1. De stroom van genetische informatie.
Naamsvermelding: Marc T. Facciotti (origineel werk)

Genotype naar fenotype

Een belangrijk concept in de volgende paragrafen is de relatie tussen genetische informatie, de genotype, en het resultaat van het uitdrukken ervan, de fenotype. Deze twee termen en de mechanismen die de twee met elkaar verbinden, zullen de komende weken herhaaldelijk worden besproken - begin vaardig te worden in het gebruik van dit vocabulaire.

Figuur 2. De informatie die in het DNA is opgeslagen, bevindt zich in de volgorde van de afzonderlijke nucleotiden wanneer ze van de 5'- naar de 3'-richting worden gelezen. Omzetting van de informatie van DNA in RNA (een proces dat transcriptie wordt genoemd) produceert de tweede vorm die informatie in de cel aanneemt. Het mRNA wordt gebruikt als template voor het creëren van de aminozuursequentie van eiwitten (in translatie). Hier worden twee verschillende sets informatie weergegeven. De DNA-sequentie is iets anders, wat resulteert in twee verschillende geproduceerde mRNA's, gevolgd door twee verschillende eiwitten en uiteindelijk twee verschillende vachtkleuren voor de muizen.

Genotype verwijst naar de informatie die is opgeslagen in het DNA van het organisme, de volgorde van de nucleotiden en de compilatie van zijn genen. fenotype verwijst naar elk fysiek kenmerk dat u kunt meten, zoals lengte, gewicht, hoeveelheid geproduceerd ATP, vermogen om lactose te metaboliseren, reactie op omgevingsstimuli, enz. Verschillen in genotype, zelfs kleine, kunnen leiden tot verschillende fenotypes die onderhevig zijn aan natuurlijke selectie. Bovenstaande figuur geeft dit idee weer. Merk ook op dat, terwijl klassieke discussies over de relaties tussen genotype en fenotype worden besproken in de context van meercellige organismen, deze nomenclatuur en de onderliggende concepten van toepassing zijn op alle organismen, zelfs eencellige organismen zoals bacteriën en archaea.

Let op: mogelijke discussie

Kan iets dat je "met het oog" niet kunt zien als een fenotype worden beschouwd?

Let op: mogelijke discussie

Kunnen eencellige organismen meerdere gelijktijdige fenotypes hebben? Zo ja, kunt u een voorbeeld geven? Zo niet, waarom?

Genen

Wat is een gen? EEN gen is een DNA-segment in het genoom van een organisme dat codeert voor een functioneel RNA (zoals rRNA, tRNA, enz.) of eiwitproduct (enzymen, tubuline, enz.). Een generiek gen bevat elementen die coderen voor regulerende regio's en een regio die codeert voor een getranscribeerde eenheid.

Genen kunnen verwerven mutaties-gedefinieerd als veranderingen in de samenstelling en/of sequentie van de nucleotiden - in de coderende of regulerende regio's. Deze mutaties kunnen tot verschillende mogelijke uitkomsten leiden: (1) er gebeurt niets meetbaars; (2) het gen wordt niet langer tot expressie gebracht; of (3) de expressie of het gedrag van het (de) genproduct(en) zijn verschillend. In een populatie van organismen die hetzelfde gen delen, staan ​​verschillende varianten van het gen bekend als: allelen. Verschillende allelen kunnen leiden tot verschillen in fenotypes van individuen en bijdragen aan de diversiteit in de biologie die onder selectieve druk staat.

Begin met het leren van deze woordenschattermen en bijbehorende concepten. Je bent er dan een beetje mee bekend als we er in de volgende colleges dieper op in gaan.

Figuur 3. Een gen bestaat uit een coderend gebied voor een RNA- of eiwitproduct vergezeld van zijn regulerende gebieden. Het coderende gebied wordt getranscribeerd in RNA dat vervolgens wordt vertaald in eiwit.

Transcriptie: van DNA naar RNA

Sectie samenvatting

Bacteriën, archaea en eukaryoten moeten allemaal genen uit hun genomen transcriberen. Hoewel de cellulaire locatie verschillend kan zijn (eukaryoten voeren transcriptie uit in de kern; bacteriën en archaea voeren transcriptie uit in het cytoplasma), zijn de mechanismen waarmee organismen van elk van deze clades dit proces uitvoeren fundamenteel hetzelfde en kunnen worden gekarakteriseerd door drie stadia : initiatie, verlenging en beëindiging.

Een kort overzicht van transcriptie

Transcriptie is het proces waarbij een RNA-kopie van een DNA-segment wordt gemaakt. Aangezien dit een Verwerken, willen we de Energy Story-rubriek toepassen om een ​​functioneel begrip van transcriptie te ontwikkelen. Hoe ziet het systeem van moleculen eruit voor de start van de transcriptie? Hoe ziet het er aan het einde uit? Welke transformaties van materie en overdrachten van energie vinden plaats tijdens de transcriptie en wat katalyseert het proces zo mogelijk? We willen ook nadenken over het proces vanuit een Design Challenge-standpunt. Als het de biologische taak is om een ​​kopie van DNA te maken in de chemische taal van RNA, welke uitdagingen kunnen we redelijkerwijs veronderstellen of anticiperen, gezien onze kennis over andere nucleotide-polymeerprocessen, die moeten worden overwonnen? Is er bewijs dat de natuur deze problemen op verschillende manieren heeft opgelost? Wat lijken de criteria voor succes van transcriptie te zijn? Je snapt het idee.

Opsomming van enkele van de basisvereisten voor transcriptie

Laten we eerst eens kijken naar de taken die voor ons liggen door een deel van onze fundamentele kennis te gebruiken en ons voor te stellen wat er tijdens de transcriptie zou moeten gebeuren als het doel is om een ​​RNA-kopie te maken van een stuk van een streng van een dubbelstrengs DNA-molecuul. We zullen zien dat het gebruik van enige basislogica ons in staat stelt om veel van de belangrijke vragen en dingen af ​​te leiden die we moeten weten om het proces goed te beschrijven.

Stel dat we een nanomachine/nanobot willen ontwerpen die transcriptie zou uitvoeren. We kunnen wat Design Challenge-denken gebruiken om problemen en deelproblemen te identificeren die door onze kleine robot moeten worden opgelost.

• Waar moet de machine beginnen? Waar moet de machine langs de miljoenen tot miljarden basenparen heen?
• Waar moet de machine stoppen?
• Als we start- en stopsites hebben, hebben we manieren nodig om die informatie te coderen zodat onze machine(s) deze informatie kunnen lezen - hoe wordt dat bereikt?
• Hoeveel RNA-kopieën van het DNA moeten we maken?
• Hoe snel moeten de RNA-kopieën gemaakt worden?
• Hoe nauwkeurig moeten de kopieën worden gemaakt?
• Hoeveel energie kost het proces en waar komt de energie vandaan?

Dit zijn natuurlijk slechts enkele van de kernvragen. Men kan dieper graven als ze dat willen. Deze zijn echter al goed genoeg om een ​​goed beeld te krijgen van dit proces. Merk ook op dat veel van deze vragen opmerkelijk veel lijken op de vragen waarvan we concludeerden dat ze nodig zouden kunnen zijn om te begrijpen over DNA-replicatie.

De bouwstenen van transcriptie

De bouwstenen van RNA

Bedenk uit onze discussie over de structuur van nucleotiden dat de bouwstenen van RNA erg lijken op die in DNA. In RNA bestaan ​​de bouwstenen uit nucleotidetrifosfaten die zijn samengesteld uit een ribosesuiker, een stikstofbase en drie fosfaatgroepen. De belangrijkste verschillen tussen de bouwstenen van DNA en die van RNA zijn dat RNA-moleculen zijn samengesteld uit nucleotiden met ribosesuikers (in tegenstelling tot deoxyribosesuikers) en uridine gebruiken, een uracil-bevattende nucleotide (in tegenstelling tot thymidine in DNA). Merk hieronder op dat uracil en thymine structureel erg op elkaar lijken - het uracil mist gewoon een methyl (CH3) functionele groep vergeleken met thymine.

Figuur 1. De chemische basiscomponenten van nucleotiden.
Naamsvermelding: Marc T. Facciotti (origineel werk)

Transcriptie initiatie

Promotors

Eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het maken van een RNA-kopie van een bepaald stukje DNA (transcriptie) moeten eerst het begin van het te kopiëren element kunnen herkennen. EEN promotor is een DNA-sequentie waarop verschillende eiwitten, gezamenlijk bekend als de transcriptiemachinerie, binden en transcriptie initiëren. In de meeste gevallen bevinden promotoren zich stroomopwaarts (5' van het coderende gebied) van de genen die ze reguleren. De specifieke sequentie van een promotor is erg belangrijk omdat het bepaalt of het corresponderende coderende deel van het gen altijd, een deel van de tijd of niet vaak wordt getranscribeerd. Hoewel promotors tussen soorten variëren, worden soms enkele elementen met een vergelijkbare sequentie geconserveerd. Op de -10 en -35 regio's stroomopwaarts van de initiatieplaats zijn er twee promotor overeenstemming sequenties of regio's die vergelijkbaar zijn over veel promotors en over verschillende soorten. Sommige promotors zullen een sequentie hebben die erg lijkt op de consensussequentie (de sequentie die de meest voorkomende sequentie-elementen bevat), en andere zullen er heel anders uitzien. Deze sequentievariaties beïnvloeden de sterkte waaraan de transcriptiemachinerie kan binden aan de promotor om transcriptie te initiëren. Dit helpt bij het controleren van het aantal transcripties dat wordt gemaakt en hoe vaak ze worden gemaakt.

Figuur 2. (a) Een algemeen diagram van een gen. Het gen omvat de promotorsequentie, een niet-vertaald gebied (UTR) en de coderende sequentie. (b) Een lijst van verschillende sterke E. coli-promotersequenties. De -35-box en -10-box zijn sterk geconserveerde sequenties in de hele sterke promotorlijst. Zwakkere promotors zullen meer basenpaarverschillen hebben in vergelijking met deze sequenties.
Bron: http://www.discoveryandinnovation.co...lecture12.html

Let op: mogelijke discussie

Welke soorten interacties worden veranderd tussen de transcriptiemachinerie en het DNA wanneer de nucleotidesequentie van de promotor verandert? Waarom zouden sommige sequenties een "sterke" promotor creëren en waarom creëren andere een "zwakke" promotor?

Bacteriële versus eukaryote promotors

In bacteriële cellen is de -10-consensussequentie, het -10-gebied genoemd, AT-rijk, vaak TATAAT. De -35 sequentie, TTGACA, wordt herkend en gebonden door het eiwit σ. Zodra deze eiwit-DNA-interactie is gemaakt, binden de subeenheden van het kern-RNA-polymerase aan de plaats. Vanwege de relatief lagere stabiliteit van AT-associaties, vergemakkelijkt het AT-rijke -10-gebied het afwikkelen van de DNA-matrijs en worden verschillende fosfodiesterbindingen gemaakt.

Eukaryote promoters zijn veel groter en complexer dan prokaryotische promoters, maar beide hebben een AT-rijk gebied - bij eukaryoten wordt dit meestal een TATA-box genoemd. In het muisthymidinekinasegen bevindt de TATA-box zich bijvoorbeeld op ongeveer -30. Voor dit gen is de exacte TATA-boxsequentie TATAAAA, zoals afgelezen in de 5'-naar 3'-richting op de niet-matrijsstreng. Deze volgorde is niet identiek aan de E coli -10 regio, maar beide delen de kwaliteit van een AT-rijk element.

In plaats van een enkele bacteriële polymerase coderen de genomen van de meeste eukaryoten voor drie verschillende RNA-polymerasen, die elk bestaan ​​uit tien of meer eiwitsubeenheden. Elke eukaryote polymerase vereist ook een aparte reeks eiwitten die bekend staan ​​als: transcriptiefactoren om het te werven voor een promotor. Bovendien helpt een leger van andere transcriptiefactoren, eiwitten die bekend staan ​​als enhancers en geluiddempers om de synthese van RNA van elke promotor te reguleren. Enhancers en geluiddempers beïnvloeden de efficiëntie van transcriptie, maar zijn niet nodig voor de initiatie van transcriptie of de processie ervan. Basale transcriptiefactoren zijn cruciaal bij de vorming van a pre-initiatie complex op de DNA-matrijs die vervolgens RNA-polymerase rekruteert voor transcriptie-initiatie.

Initiatie van transcriptie begint met de binding van RNA-polymerase aan de promotor. Transcriptie vereist dat de dubbele DNA-helix zich gedeeltelijk afwikkelt, zodat één streng kan worden gebruikt als sjabloon voor RNA-synthese. Het gebied van afwikkelen heet a transcriptie bubbel.

figuur 3. Tijdens elongatie volgt RNA-polymerase de DNA-matrijs, synthetiseert mRNA in de 5'- naar 3'-richting en wikkelt het af en spoelt het DNA vervolgens terug terwijl het wordt gelezen.

Verlenging

Transcriptie gaat altijd van de sjabloon streng, een van de twee strengen van het dubbelstrengs DNA. Het RNA-product is complementair aan de template-streng en is bijna identiek aan de niet-template-streng, de coderende streng, met de uitzondering dat RNA een uracil (U) bevat in plaats van de thymine (T) die in DNA wordt gevonden. Tijdens elongatie, een enzym genaamd RNA-polymerase gaat langs de DNA-matrijs en voegt nucleotiden toe door basenparing met de DNA-matrijs op een manier die vergelijkbaar is met DNA-replicatie, met het verschil dat een gesynthetiseerde RNA-streng niet gebonden blijft aan de DNA-matrijs. Naarmate de verlenging vordert, wordt het DNA continu vóór het kernenzym afgewikkeld en erachter teruggespoeld. Merk op dat de richting van synthese identiek is aan die van synthese in DNA - 5' naar 3'.

Figuur 4. Tijdens verlenging volgt RNA-polymerase langs de DNA-matrijs, waarbij mRNA wordt gesynthetiseerd in de 5'- naar 3'-richting, het afwikkelen en vervolgens terugspoelen van het DNA terwijl het wordt gelezen.

Figuur 5. De toevoeging van nucleotiden tijdens het transcriptieproces lijkt sterk op de toevoeging van nucleotiden bij DNA-replicatie. Het RNA wordt gepolymeriseerd van 5' naar 3' en bij elke toevoeging van een nucleotide wordt een fosfoanhidride-binding gehydrolyseerd door het enzym, wat resulteert in een langer polymeer en de afgifte van twee anorganische fosfaten.
Bron: http://utminers.utep.edu/rwebb/html/...longation.html

Let op: mogelijke discussie

Vergelijk en contrasteer het energieverhaal voor de toevoeging van een nucleotide in DNA-replicatie met de toevoeging van een nucleotide in transcriptie.

Bacteriële versus eukaryote verlenging

Bij bacteriën begint de verlenging met het vrijkomen van de σ subeenheid van het polymerase. de dissociatie van σ laat het kernenzym toe om langs de DNA-matrijs te gaan, waarbij mRNA wordt gesynthetiseerd in de 5'- naar 3'-richting met een snelheid van ongeveer 40 nucleotiden per seconde. De basenparing tussen DNA en RNA is niet stabiel genoeg om de stabiliteit van de mRNA-synthesecomponenten te handhaven. In plaats daarvan werkt de RNA-polymerase als een stabiele linker tussen de DNA-matrijs en de ontluikende RNA-strengen om ervoor te zorgen dat de verlenging niet voortijdig wordt onderbroken.

In eukaryoten wordt, na de vorming van het pre-initiatiecomplex, het polymerase vrijgemaakt van de andere transcriptiefactoren en laat men de verlenging verlopen zoals bij prokaryoten waarbij het polymerase pre-mRNA synthetiseert in de 5'- naar 3'-richting. Zoals eerder besproken, transcribeert RNA-polymerase II het grootste deel van eukaryote genen, dus deze sectie zal zich concentreren op hoe deze polymerase verlenging en beëindiging tot stand brengt.

Beëindiging

In bacteriën

Zodra een gen is getranscribeerd, moet het bacteriële polymerase worden geïnstrueerd om te dissociëren van de DNA-template en het nieuw gemaakte mRNA vrij te maken. Afhankelijk van het gen dat wordt getranscribeerd, zijn er twee soorten terminatiesignalen. De ene is gebaseerd op eiwitten en de andere op RNA. Rho-afhankelijke beëindiging wordt gecontroleerd door het rho-eiwit, dat achter het polymerase aan de groeiende mRNA-keten volgt. Tegen het einde van het gen komt het polymerase een reeks G-nucleotiden tegen op de DNA-matrijs en stopt het. Hierdoor botst het rho-eiwit met het polymerase. De interactie met rho maakt het mRNA vrij uit de transcriptiebel.

Rho-onafhankelijke beëindiging wordt gecontroleerd door specifieke sequenties in de DNA-matrijsstreng. Naarmate het polymerase het einde nadert van het gen dat wordt getranscribeerd, komt het een gebied tegen dat rijk is aan CG-nucleotiden. Het mRNA vouwt zichzelf terug en de complementaire CG-nucleotiden binden aan elkaar. Het resultaat is een stabiele haarspeld dat zorgt ervoor dat het polymerase stopt zodra het een gebied begint te transcriberen dat rijk is aan AT-nucleotiden. Het complementaire UA-gebied van het mRNA-transcript vormt slechts een zwakke interactie met het matrijs-DNA. Dit, in combinatie met het vastgelopen polymerase, veroorzaakt genoeg instabiliteit voor het kernenzym om te breken en het nieuwe mRNA-transcript vrij te maken.

In eukaryoten

De beëindiging van transcriptie is verschillend voor de verschillende polymerasen. In tegenstelling tot prokaryoten vindt verlenging door RNA-polymerase II in eukaryoten plaats 1000-2000 nucleotiden voorbij het einde van het gen dat wordt getranscribeerd. Deze pre-mRNA-staart wordt vervolgens verwijderd door splitsing tijdens mRNA-verwerking. Aan de andere kant vereisen RNA-polymerasen I en III terminatiesignalen. Genen die zijn getranscribeerd door RNA-polymerase I bevatten een specifieke sequentie van 18 nucleotiden die wordt herkend door een terminatie-eiwit. Het proces van terminatie in RNA-polymerase III omvat een mRNA-haarspeld vergelijkbaar met rho-onafhankelijke terminatie van transcriptie in prokaryoten.

In archaea

Beëindiging van transcriptie in de archaea is veel minder bestudeerd dan in de andere twee domeinen van het leven en wordt nog steeds niet goed begrepen. Hoewel de functionele details waarschijnlijk lijken op mechanismen die we in andere levensdomeinen hebben gezien, vallen de details buiten het bestek van deze cursus.

Mobiele locatie

In bacteriën en archaea

Bij bacteriën en archaea vindt transcriptie plaats in het cytoplasma, waar het DNA zich bevindt. Omdat de locatie van het DNA, en dus het transcriptieproces, niet fysiek gescheiden is van de rest van de cel, begint de translatie vaak voordat de transcriptie is voltooid. Dit betekent dat mRNA in bacteriën en archaea wordt gebruikt als sjabloon voor een eiwit voordat het gehele mRNA wordt geproduceerd. Het ontbreken van ruimtelijke segregatie betekent ook dat er voor deze processen zeer weinig temporele segregatie is. Figuur 6 toont de processen van transcriptie en translatie die gelijktijdig plaatsvinden.

Figuur 6. De toevoeging van nucleotiden tijdens het transcriptieproces lijkt sterk op de toevoeging van nucleotiden bij DNA-replicatie.
Bron: Marc T. Facciotti (eigen werk)

Bij eukaryoten....

Bij eukaryoten is het transcriptieproces fysiek gescheiden van de rest van de cel, afgezonderd in de kern. Dit resulteert in twee dingen: het mRNA is voltooid voordat de vertaling kan beginnen, en er is tijd om het mRNA te "aanpassen" of te "bewerken" voordat de vertaling begint. De fysieke scheiding van deze processen geeft eukaryoten de kans om het mRNA zodanig te veranderen dat de levensduur van het mRNA wordt verlengd of zelfs het eiwitproduct dat uit het mRNA wordt geproduceerd, verandert.

MRNA-verwerking

5' G-cap en 3' poly-A-staart

Wanneer een eukaryoot gen wordt getranscribeerd, wordt het primaire transcript op verschillende manieren in de kern verwerkt. Eukaryote mRNA's worden aan het 3'-uiteinde gemodificeerd door de toevoeging van een poly-A-staart. Deze reeks A-residuen wordt toegevoegd door een enzym dat geen genomisch DNA als sjabloon gebruikt. Bovendien hebben de mRNA's een chemische modificatie van het 5'-uiteinde, een 5'-cap genoemd. Gegevens suggereren dat deze modificaties zowel helpen om de levensduur van het mRNA te verlengen (de voortijdige afbraak ervan in het cytoplasma te voorkomen) als om het mRNA te helpen translatie te initiëren.

Figuur 7. pre-mRNA's worden in een reeks stappen verwerkt. Introns worden verwijderd, een 5'-cap en poly-A-staart worden toegevoegd.
Bron: http://www.discoveryandinnovation.co...lecture12.html

Alternatieve splicing

Splicing vindt plaats op de meeste eukaryote mRNA's waarin introns worden verwijderd uit de mRNA-sequentie en exons aan elkaar worden geligeerd. Dit kan een veel korter mRNA creëren dan aanvankelijk werd getranscribeerd. Door splicing kunnen cellen mixen en matchen welke exons in het uiteindelijke mRNA-product worden opgenomen. Zoals in onderstaande figuur te zien is, kan dit ertoe leiden dat meerdere eiwitten door één gen worden gecodeerd.

Figuur 8. De informatie die in het DNA is opgeslagen is eindig. In sommige gevallen kunnen organismen deze informatie mixen en matchen om verschillende eindproducten te creëren. Bij eukaryoten maakt alternatieve splicing de creatie van verschillende mRNA-producten mogelijk, die op hun beurt worden gebruikt bij translatie om verschillende eiwitsequenties te creëren. Dit leidt uiteindelijk tot de productie van verschillende eiwitvormen, en dus verschillende eiwitfuncties.
Bron: http://www.discoveryandinnovation.co...lecture12.html