Informatie

Wat is de betekenis van opsonisatie?


Wikipedia zegt:

Antilichaamopsonisatie is het proces waarbij een pathogeen wordt gemarkeerd voor opname en wordt geëlimineerd door een fagocyt. Opsonisatie omvat de binding van een opsonine, bijvoorbeeld antilichaam, aan een epitoop op een antigeen. Nadat opsonine aan het membraan bindt, worden fagocyten aangetrokken door de ziekteverwekker.

Maar waarom is het nodig dat pathogeen bindt met opsonine? Kunnen fagocyten niet aangetrokken worden tot ziekteverwekkers zonder opsonisatie? Ik wil gewoon weten wat de betekenis van opsonisatie is?


Neutraliserend antilichaam

EEN neutraliserend antilichaam (NAb) is een antilichaam dat een cel verdedigt tegen een pathogeen of infectieus deeltje door elk effect dat het biologisch heeft te neutraliseren. Neutralisatie maakt het deeltje niet langer infectieus of pathogeen. [3] Neutraliserende antilichamen maken deel uit van de humorale respons van het adaptieve immuunsysteem tegen virussen, intracellulaire bacteriën en microbieel toxine. Door specifiek te binden aan oppervlaktestructuren (antigeen) op een infectieus deeltje, voorkomen neutraliserende antilichamen dat het deeltje een interactie aangaat met zijn gastheercellen die het zou kunnen infecteren en vernietigen. Immuniteit door neutraliserende antilichamen is ook bekend als: steriliserende immuniteit, omdat het immuunsysteem het infectieuze deeltje elimineert voordat er een infectie plaatsvindt. [4]


Inhoud

Het molecuul bestaat uit 20 complementcontrole-eiwitmodules (CCP) (ook wel Short Consensus Repeats of sushi-domeinen genoemd) die met elkaar zijn verbonden door korte linkers (van tussen de drie en acht aminozuurresiduen) en gerangschikt in een verlengde kop naar staart mode. Elk van de CCP-modules bestaat uit ongeveer 60 aminozuren met vier cysteïneresiduen disulfide gebonden in een 1-3 2-4 opstelling, en een hydrofobe kern gebouwd rond een bijna onveranderlijk tryptofaanresidu. De CCP-modules zijn genummerd van 1-20 (vanaf het N-uiteinde van het eiwit) CCP's 1-4 en CCP's 19-20 werken samen met C3b, terwijl CCP's 7 en CCP's 19-20 binden aan GAG's en siaalzuur. [11] Tot op heden zijn atomaire structuren bepaald voor CCP's 1-3, [12] CCP 5, [13] CCP 7, [14] CCP's 10-11 en CCP's 11-12, [15] CCP's 12-13, [ 16] CCP 15, CCP 16, [17] CCP's 15-16, [18] CCP's 18-20, [19] en CCP's 19-20. [20] [21] De atomaire structuur voor CCP's 6-8 gebonden aan de GAG ​​bootsen sucrose-octasulfaat na, [22] CCP's 1-4 in complex met C3b [23] en CCP's 19-20 in complex met C3d (dat overeenkomt met de thioster-domein van C3b) [24] [25] zijn ook bepaald. Hoewel een atomaire resolutiestructuur voor intacte factor H nog niet is bepaald, geven lage resolutietechnieken aan dat deze in oplossing kan worden teruggebogen. [26] De tot nu toe beschikbare informatie geeft aan dat CCP-modules 1-4 verantwoordelijk zijn voor de cofactor- en vervalversnellingsactiviteiten van factor H, terwijl zelf-/niet-zelfdiscriminatie voornamelijk plaatsvindt door GAG-binding aan CCP-modules 7 en/of GAG of siaalzuur bindend tot 19-20. [26] [27]

Vanwege de centrale rol die factor H speelt bij de regulatie van complement, zijn er een aantal klinische implicaties die voortvloeien uit afwijkende factor H-activiteit. Overactieve factor H kan resulteren in verminderde complementactiviteit op pathogene cellen, waardoor de gevoeligheid voor microbiële infecties toeneemt. Onderactieve factor H kan leiden tot verhoogde complementactiviteit op gezonde gastheercellen - wat kan leiden tot auto-immuunziekten. Het is daarom niet verrassend dat zeldzame mutaties of veel voorkomende single nucleotide polymorphisms (SNP's) in het complementfactor H-gen (CFH) vaak leiden tot pathologieën. Bovendien worden de complementremmende activiteiten van factor H en andere complementregulatoren vaak gebruikt door pathogenen om de virulentie te verhogen.

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie Bewerken

In 2005 identificeerden verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen een SNP in CFH, wat resulteert in de eiwitverandering p.Y402H, als een risicofactor voor AMD die aanwezig is in ongeveer een derde van de Europeanen. [28] Hoewel de allelfrequentie aanzienlijk varieert tussen verschillende populaties, is Y402H consequent in verband gebracht met het begin en de progressie van AMD. [28] Homozygote individuen hebben een ongeveer zeven keer grotere kans op associatie met AMD, terwijl heterozygoten een twee tot drie keer grotere kans op associatie met de ziekte hebben. [28] Van deze SNP, die zich in CCP-module 7 van factor H bevindt, is aangetoond dat het het vermogen van factor H-eiwit beïnvloedt om zich te lokaliseren naar ontstekingsplaatsen in retinale weefsels (bijv. door polyanionen en pentraxines) en om de activering van complement en immune cellen. [28] Van de SNP is ook aangetoond dat het de functie van factor H-achtig eiwit 1 beïnvloedt, een alternatief gesplitste versie van factor H die alleen uit CCP's 1 tot 7 bestaat, waarvan wordt gedacht dat het een grotere rol speelt bij intraoculaire complementregulatie. [28] Er is echter aangetoond dat de genetische varianten bij CFH met het grootste effect op het individuele risico op LMD invloed hebben op CCP's 1 tot 4, die betrokken zijn bij het dempen van de effecten van de alternatieve route van complement. [28] Een zeldzame functionele coderingsverandering, p.R1210C, in CFH resulteert in een functionele deficiëntie in factor H en leidt tot een aanzienlijk hoger risico op maculaire degeneratie en complement-gemedieerde nieraandoeningen. [28] [29]

Variatie in andere genen van de regulatoren van complementactiveringslocus, zoals complementfactor H-gerelateerde genen, evenals in andere complementeiwitten (bijv. Factor I, C2/factor B en C3) zijn ook in verband gebracht met een groter AMD-risico. [28] De huidige theorie is dat complementdysregulatie een belangrijke oorzaak is van chronische ontsteking bij AMD. [28]

Atypisch hemolytisch uremisch syndroom

Hemolytisch-uremisch syndroom (HUS) is een ziekte die gepaard gaat met microangiopathische hemolytische anemie, trombocytopenie en acuut nierfalen. Het kan ofwel worden verworven (bijv. na infectie met shigatoxigene Escherichia coli), ofwel worden geërfd (ook bekend als atypisch hemolytisch-uremisch syndroom, aHUS). aHUS is sterk gekoppeld aan mutaties in genen van het complementsysteem, met name factor H. [28] In tegenstelling tot AMD en C3 glomerulopathie (een andere complement-gemedieerde nieraandoening) die voornamelijk geassocieerd zijn met variatie in de N-terminus (CCP's 1 tot 4) beïnvloeden predisponerende mutaties in factor H voornamelijk het C-uiteinde van het eiwit (CCP-modules 19 en 20), [28] waarvan is aangetoond dat het verantwoordelijk is voor de hechting aan nierweefsels en de regulatie van complementcomponenten en hun stroomafwaartse effectoren. [28] [30] [31]

Schizofrenie Bewerken

Veranderingen in de immuunrespons zijn betrokken bij de pathogenese van veel neuropsychiatrische aandoeningen, waaronder schizofrenie. Recente onderzoeken wezen uit dat veranderingen in het complementsysteem, waaronder die welke kunnen leiden tot overactivering van de alternatieve complementroute, vatbaar kunnen zijn voor schizofrenie. De CFH SNP rs424535 (2783-526T>A) was bijvoorbeeld positief geassocieerd met schizofrenie. [32]

Ischemische beroerte Bewerken

Er werd gevonden dat rs800292(184G >A) SNP positief geassocieerd was met beroerte en rs800912 minor allel van het CFH-gen kan worden beschouwd als een risicofactor voor ischemische beroerte. [32]

Rekrutering door ziekteverwekkers

Gezien de centrale rol van factor H bij het beschermen van cellen tegen complement, is het niet verwonderlijk dat verschillende belangrijke menselijke pathogenen mechanismen hebben ontwikkeld voor het rekruteren van factor H. Deze rekrutering van factor H door pathogenen zorgt voor een significante weerstand tegen complementaanvallen, en dus verhoogde virulentie. Pathogenen waarvan is aangetoond dat ze factor H rekruteren, zijn onder meer: ​​Aspergillus spp. Borrelia burgdorferi B. duttonii B. recurrentis Candida albicans [33] Francisella tularensis Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Streptococcus Pneumoniae [8] en Streptococcus pyogenes. De Gram-negatieve bacterie B.burgdorferi heeft vijf Factor H-bindende eiwitten: CRASP-1, CRASP-2, CRASP-3, CRASP-4 en CRASP-5. [34] Elk CRASP-eiwit bindt ook aan plasminogeen. [34] Het is mogelijk dat de allelfrequentie van CFH-varianten over de hele wereld de selectieve druk van infectieziekten weerspiegelt. [28]

Van factor H is aangetoond dat het een interactie aangaat met complementcomponent 3, naast andere complementeiwitten en factoren, wat in het bijzonder leidt tot regulering van de alternatieve route van complement. [28] [35] [36]

Biologisch actieve factor H is geproduceerd door Ralf Reski en collega's in de mosbioreactor [37] in een proces dat moleculaire landbouw wordt genoemd. Grote hoeveelheden biologisch actieve menselijke factor H, mogelijk geschikt voor therapeutische doeleinden, werden geproduceerd met behulp van een synthetisch, voor codons geoptimaliseerd gen dat tot expressie werd gebracht in de gistexpressiegastheer, Pichia pastoris. [38]

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie Bewerken

Gemini Therapeutics Inc. is een in Massachusetts gevestigd bedrijf voor precisiegeneeskunde dat zich richt op de ontwikkeling van nieuwe therapieën door middel van een dieper begrip van ziekten. Op basis van de biologische activiteit van menselijke factor H ontwikkelt Gemini een recombinant menselijk factor H-eiwit, GEM103, voor de behandeling van droge LMD. Gemini heeft onlangs de voltooiing aangekondigd van de inschrijving in een fase 2a-onderzoek van GEM103 in droge leeftijdsgerelateerde maculaire degeneratie (AMD) bij patiënten met genetische varianten met een hoog risico. De topline-gegevens worden verwacht in 1H 2021.


Subklassen van IgG

Als u diepgaande informatie wilt hebben over IgG-subklassen, kunt u ook lezen over: subklassen van IgG. Algemene structuur van vier subklassen van IgG-antilichamen (Bron: Kuby Immunology)

Vier subklassen van humaan IgG verschillen in hun structuur omdat ze worden gecodeerd door verschillende kiemlijn-CH-genen. Ze verschillen in de grootte van het scharniergebied en het aantal en de rangschikking van de disulfidebindingen tussen de ketens die hun zware ketens verbinden. Een opmerkelijk kenmerk van humaan IgG3 zijn de 11 disulfidebindingen tussen de ketens.


In vitro Beoordeling van de immunologische betekenis van een humaan monoklonaal antilichaam gericht tegen het influenza A-virus Nucleoproteïne

Influenza A-virussen veroorzaken jaarlijkse epidemieën en soms pandemieën. Antilichamen gericht tegen het geconserveerde virale nucleoproteïne (NP) kunnen een rol spelen bij de immuniteit tegen verschillende subtypes van het influenza A-virus. Hier hebben we de immunologische betekenis beoordeeld van een humaan monoklonaal antilichaam gericht tegen NP in vitro. Dit antilichaam bond aan met virus geïnfecteerde cellen maar vertoonde geen virusneutraliserende activiteit, complementafhankelijke celcytotoxiciteit of opsonisatie van viraal antigeen voor verbeterde antigeenpresentatie aan CD8+ T-cellen door dendritische cellen.

Influenza A-virussen veroorzaken epidemieën, besmetten wereldwijd miljoenen mensen en veroorzaken jaarlijks 250.000 tot 500.000 doden (1). Naast jaarlijkse epidemieën veroorzaken influenza A-virussen af ​​en toe pandemieën. Onlangs is een pandemie veroorzaakt door het influenzavirus A(H1N1)pdm09, dat afkomstig is van varkens. Deze recente pandemie en de aanhoudende circulatie van andere potentieel pandemische influenza A-virussen van de subtypes H5N1, H7N7, H7N9, H3N2v en H9N2 hebben het belang benadrukt van de ontwikkeling van vaccins die immuniteit induceren tegen verschillende subtypes van het influenza A-virus, de zogenaamde heterosubtypische immuniteit. De aanwezigheid van heterosubtypische immuniteit is aangetoond bij mensen en verschillende diermodellen, maar onze kennis van de armen van het immuunsysteem en hun virale doelwitten die bijdragen aan heterosubtypische immuniteit is nog onvolledig (2𠄶). Studies uitgevoerd met diermodellen hebben aangetoond dat virusspecifieke T-cellen bijdragen aan heterosubtypische immuniteit, aangezien ze in staat zijn om geconserveerde epitopen te herkennen die aanwezig zijn in de interne eiwitten van het influenza A-virus (6𠄹). Bovendien dragen antilichamen tegen het extracellulaire domein van het matrix 2-eiwit (M2e) en het stengelgebied van het hemagglutinine bij aan heterosubtypische immuniteit (10�).

De rol van antilichamen tegen het influenza A-virus nucleoproteïne (NP) bij heterosubtypische immuniteit is grotendeels onbekend, hoewel studies bij muizen suggereren dat ze een zekere mate van bescherming kunnen bieden (13, 14). Meer dan 2 decennia geleden werd aangetoond dat NP-specifieke monoklonale antilichamen (MoAbs) in staat waren te binden aan met virus geïnfecteerde cellen, wat suggereert dat viraal NP aanwezig was op het oppervlak van de cel (15). Verder correleerde de bescherming tegen infectie die werd waargenomen bij muizen geassocieerd met NP-specifieke IgG-antilichamen met versnelde virale klaring en omvatte Fc-receptoren en CD8+-cellen (13, 14). Hoewel menselijke proefpersonen met een voorgeschiedenis van influenzavirusinfectie allemaal influenza A-virus NP-specifieke antilichamen ontwikkelen en de vorming van een humaan monoklonaal antilichaam tegen het influenza A-virus NP decennia geleden is beschreven (16, 17), is het momenteel niet bekend of deze antilichamen hebben een immunologische betekenis en bieden enige kruisbeschermende immuniteit bij mensen.

In dit artikel hebben we de biologische activiteit van een NP-specifiek humaan monoklonaal antilichaam van het influenza A-virus beoordeeld in vitro. Methoden die werden gebruikt om het menselijke NP-specifieke monoklonale antilichaam (D1-11 MoAb NP) te verkrijgen en te selecteren, zijn eerder beschreven (18). Deze studie was vooraf goedgekeurd door de institutionele beoordelingsraden van de Emory University School of Medicine en de Oklahoma Medical Research Foundation (18). In het kort, bloed werd verzameld van een gezond individu 7 dagen na vaccinatie met een seizoensinfluenzavaccin en enkele IgG+-antilichaam-afscheidende cellen werden gesorteerd. Vervolgens werd een reverse transcriptie-PCR (RT-PCR) uitgevoerd op transcripten van VHDJH en VκJκ genen van deze enkelvoudig gesorteerde cellen, en na amplificatie door specifieke PCR, VHDJH en VκJκ-genen werden gekloneerd in expressievectoren die constant humaan IgG (Cγ1) of Igκ (Cκ) Regio's. Plasmiden van de zware en lichte genen werden gecotransfecteerd in 293T-cellen met behulp van de calciumfosfaatprecipitatiemethode, en antilichamen die werden uitgescheiden in het supernatant werden in wezen gezuiverd zoals eerder beschreven (18, 19). De zuiverheid van de MoAb NP werd getest door SDS-PAGE (gegevens niet getoond) en de eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) eiwittestkit (Thermo Fisher Scientific Pierce Protein Biology Products, Rockford, IL). Vervolgens werd de specificiteit van het antilichaam voor het influenza A-virus NP bevestigd met behulp van een influenza A-virus NP competitieve enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Idexx, Hoofddorp, Nederland) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werd gezuiverd MoAb 10 keer verdund in testbuffer en overgebracht naar putjes van een plaat met 96 putjes die vooraf waren gecoat met influenza A-virus NP. Na 1 uur incubatie, verschillende wasstappen en incubatie met anti-influenzavirus NP, mierikswortelperoxidase en 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, werden platen afgelezen met een Tecan Infinite 200-lezer (Tecan, Giessen , Nederland). Naast de door de fabrikant verschafte controles, werden negatieve controle fretserum en positieve controle humaan serum gebruikt als controles. Een proportioneel verschil in optische dichtheid (OD) tussen monster en negatieve controle van c0.6 werd als positief geïnterpreteerd, zoals aangegeven door de fabrikant.

Om te testen of het monoklonale antilichaam kon binden aan NP aanwezig op het oppervlak van met influenza A-virus geïnfecteerde cellen, A549 adenocarcinoom menselijke alveolaire basale epitheelcellen, Epstein-Barr-virus (EBV)-getransformeerde menselijke B-cellen en Madin-Darby-hond niercellen (MDCK) werden geïnoculeerd met influenza A(H3N2)-virus RESVIR-9 met een multipliciteit van infectie (MOI) van 3. Influenza A(H3N2)-virus RESVIR-9 is een influenzavaccinstam die is verkregen na herschikking tussen influenzavirus A/ Nanchang/933/95 (HA, NA, NP) en influenzavirus A/PR/8/34 (de overige vijf gensegmenten). Na incubatie gedurende 16 tot 18 uur bij 37°C met 5% CO2, werden cellen getrypsiniseerd en vervolgens gedurende 30 minuten geïncubeerd met 10, 20 en 40 &#g/ml MoAb NP of isotypecontrole (BD, Alphen a/d Rijn, Nederland) bij 4&#°C. Na het wassen werden de cellen gekleurd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld MoAb gericht tegen humaan IgG (Dako, Glostrup, Denemarken). Vervolgens werden cellen gefixeerd met Cytofix (BD, Alphen a/d Rijn, Nederland) en vervolgens beoordeeld met flowcytometrie met een FACSCanto II-cytometer. De gegevens werden geanalyseerd met FACSDiva-software (BD, Alphen a/d Rijn, Nederland). Alle experimenten werden in duplo uitgevoerd en niet-geïnfecteerde cellen werden gebruikt als negatieve controles. Zoals getoond in Fig. 1 bond MoAb NP aan met virus geïnfecteerde cellen van alle drie de cellijnen, terwijl er geen binding werd waargenomen aan niet-geïnfecteerde controlecellen. Bovendien werd vrijwel geen binding van de isotype-controle-antilichamen waargenomen (Fig. 1A). Bovendien gaven tijdsverloopexperimenten aan dat NP al binnen 1 uur na inoculatie op het oppervlak van geïnfecteerde cellen kon worden gedetecteerd (gegevens niet getoond), wat de binding van vrij NP in het inoculum suggereert. Deze bevindingen bevestigen de bevindingen die oorspronkelijk werden verkregen door Yewdell et al., die de aanwezigheid van NP op het oppervlak van geïnfecteerde P815-cellen aantoonden met behulp van een MoAb NP van muizenoorsprong (15).

Detectie van influenza A-virus NP op het oppervlak van met influenzavirus geïnfecteerde A549-cellen, B-cellen en MDCK-cellen door MoAb NP. Cellen werden geïnfecteerd met influenzavirus RESVIR-9 (H3N2) met een MOI van 3 (wit) of niet geïnfecteerd (grijs) en na 16 tot 18 uur incubatie vervolgens geïncubeerd met MoAb NP of isotype controle-antilichaam (20 μg/ml ) zoals aangegeven, en de binding van deze antilichamen werd beoordeeld na daaropvolgende incubatie met een FITC-gelabeld MoAb gericht tegen humaan IgG door middel van flowcytometrie (A) of confocale microscopie (B).

Bovendien werd de cellulaire lokalisatie van NP in virus-geïnfecteerde A549-cellen geanalyseerd door confocale microscopie met behulp van een Zeiss LSM700-microscoop in combinatie met Zeiss LSM Zen 2010-software (Carl Zeiss, Sliedrecht, Nederland). Dezelfde procedure als beschreven voor flowcytometrie werd gebruikt, behalve dat cellen ook werden geïncubeerd met PKH-26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) om celmembranen zichtbaar te maken. Ook met behulp van deze methode werd binding van MoAb NP aan extracellulair NP waargenomen op met virus geïnfecteerde cellen, terwijl vrijwel geen binding werd waargenomen met de isotypecontrole (Fig. 1B). Van belang was dat binding van MoAb NP aan NP niet gelijkmatig over het hele celoppervlak was verdeeld, maar een fragmentarisch patroon vertoonde, dat in overeenstemming is met het patroon van NP-kleuring van geïnfecteerde muizencellen met een monoklonaal muisantilichaam specifiek voor NP (15). Permeabilisatie van de geïnfecteerde cellen voorafgaand aan incubatie met het NP-specifieke antilichaam resulteerde in de typische nucleaire en cytoplasmatische kleuring van NP, en ook op deze cellen werd binding van MoAb NP op het oppervlak van cellen waargenomen (gegevens niet getoond).

Om de reactiviteit van MoAb NP te beoordelen, werden A549-cellen geïnoculeerd met influenza A-virussen A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), A/Swine/Netherlands/25/1980 (H1N1), A/Netherlands/246/2008 (H1N1), A/Nederland/602/2009 (H1N1pdm09), A/HongKong/2/1968 (H3N2), en A/Nederland/348/2007 (H3N2) en influenza B-virussen B/Nederland/151/2001 (Victoria afstamming) en B/Netherlands/080/2002 (Yamagata-afstamming) met een MOI van 3 en vervolgens getest met flowcytometrie zoals hierboven beschreven. FITC-gelabelde MoAbs gericht tegen de NP van ofwel het influenza A- of het influenza B-virus (Imagen-immunofluorescentietest Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) werden gebruikt als positieve controles.

Binding van het MoAb NP werd waargenomen aan cellen die waren geïnfecteerd met een van de influenza A-virussen, maar niet aan die geïnfecteerd met influenza B-virussen. Dit bevestigt de brede reactiviteit van dit antilichaam tegen influenza A-virussen. Er werden echter verschillen waargenomen in de mate van binding, wat te wijten zou kunnen zijn aan verschillen in de biologie van infectie of aan verschillen in de affiniteit van het antilichaam voor de respectieve NP's (Fig. 2) (20, 21).

Detectie van influenzavirus NP op het oppervlak van A549-cellen die zijn geïnfecteerd met verschillende influenza A- en B-virussen. Cellen werden geïnfecteerd met verschillende influenzavirussen met een MOI van 3 en gedurende 16 tot 18 uur geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met MoAb NP (wit) of isotype controle-antilichaam (grijs 20 &#cg/ml), en de binding van deze antilichamen werd beoordeeld na daaropvolgende incubatie met een FITC-gelabeld MoAb gericht tegen humaan IgG door middel van flowcytometrie.

Hoewel het MoAb NP zeer kruisreactief is en kan binden aan met virus geïnfecteerde cellen, blijft de rol van dit NP-specifieke MoAb bij de immuniteit tegen influenza ongrijpbaar. Daarom presteerden we in vitro experimenten om mogelijke rollen van de MoAb NP in immuniteit tegen influenza A-virus te beoordelen.

Eerst werd het virusneutraliserende vermogen van de MoAb NP getest met behulp van de infectiereductietest met influenza A-virussen RESVIR-9 (H3N2) en A/PR/8/34 (H1N1) zoals eerder beschreven (22). Met behulp van deze test, die gevoeliger is dan de conventionele virusneutralisatietest (22), werd geen vermindering van infectie waargenomen met 2,5, 5,0, 10,0 en 20,0 μg/ml MoAb NP in tegenstelling tot fretsera na infectie opgewekt tegen de homologe stammen die als positieve controles werden gebruikt. Deze bevindingen geven aan dat dit NP-specifieke MoAb niet in staat is om infectie van cellen te voorkomen, wat eerdere resultaten bevestigt die zijn verkregen met murine monoklonale antilichamen die specifiek zijn voor NP (Fig. 3A) (15).

Immunologische activiteit van humaan NP-specifiek MoAb in vitro. (A) De virusneutraliserende activiteit van MoAb NP tegen influenzavirus A/PR/8/34 (H1N1, zwarte balken) of RESVIR-9 (H3N2, grijze balken) werd getest met behulp van een infectiviteitsreductietest zoals eerder beschreven (22) in verschillende concentraties zoals aangegeven. Er werd geen virusneutraliserende activiteit waargenomen, in tegenstelling tot het gebruik van homologe positieve controle post-infectie fretsera (FS). (B) MoAb NP medieerde geen complementafhankelijke cytotoxiciteit van A549-cellen (grijze balken), in tegenstelling tot een IgG-antilichaampreparaat verkregen uit humaan serum met HI-activiteit tegen het gebruikte virus (RESVIR-9 [H3N2]) (witte balken) . Aangezien equivalente volumes werden gebruikt voor het humane (Hu) IgG en het MoAb NP, is de concentratie van MoAb NP (μg/ml) aangegeven of de veelvoud van het volume van humaan IgG dat hemagglutinatie van 4 hemagglutinine-eenheden kon voorkomen zoals gemeten in de HI-assay (HI-eenheden [U]/ml) wordt aangegeven op de x as. (C en D) Activering van virusspecifieke CD8+ T-cellen (CD8+ T-celkloon specifiek voor het HLA-B*3501-beperkte epitoop NP418� [LPFEKSTVM]) door DC geïncubeerd met verschillende concentraties gesplitst virion-antigeenpreparaat zoals gemeten door intracellulair IFN-γ in de afwezigheid (grijze balken) of aanwezigheid (witte balken) van MoAb NP met DC verkregen van twee verschillende bloeddonoren. Aangegeven zijn gemiddelde waarden ± standaarddeviaties. De aanwezigheid van MoAb NP had geen effect op de activering van de NP418�-specifieke CD8+ T-cellen.

Ten tweede hebben we getest of het MoAb tegen NP complementafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (CDCC) kon mediëren, zoals eerder beschreven voor antilichamen tegen het matrix 2-eiwit en het geconserveerde gebied van het stengeleiwit van het hemagglutinine (10, 23). Hiertoe werden A549-cellen geïnfecteerd met influenza A-virus RESVIR-9 (H3N2) met een MOI van 3 en werden 30.000 cellen per putje van een V-bodemplaat met 96 putjes gedurende 3 uur bij 37°C in een vochtige atmosfeer geïncubeerd. van 5% CO2. Er werd een interval van 3 uur gebruikt omdat in pilootexperimenten was aangetoond dat de herkenning van NP op het oppervlak van cellen een plateau bereikte binnen 3 uur na inoculatie en deze relatief korte duur van infectie resulteerde in het hoogste aantal levende cellen met NP op het oppervlak. Vervolgens werden de cellen gedurende 30 minuten geïncubeerd met 0, 20 of 40 &#g/ml MoAb NP in fenolroodvrij RPMI-medium met 5% foetaal kalfsserum, 100 IE/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 2 mM glutamine en 20 μM β-mercapto-ethanol. Als positieve controle gebruikten we gezuiverd IgG van een menselijke donor waarin de aanwezigheid van antilichamen tegen het hemagglutinine van het RESVIR-9-virus werd aangetoond met behulp van de hemagglutinatieremming (HI) -test (HI-titer van 40). Vervolgens werd 1:20 verdund, Low-Tox cavia-complement (Cedarlane, Burlington, Ontario, Canada) toegevoegd en na incubatie gedurende 2 uur werd complementafhankelijke lysis van cellen bepaald met behulp van de Cytotox 96 niet-radioactieve cytotoxiciteitstest (Promega , Leiden, Nederland) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Alle experimenten werden uitgevoerd in vijfvoud en niet-geïnfecteerde cellen werden gebruikt als negatieve controles. Antilichaam-specifieke lysis werd berekend door het percentage specifieke lysis, gemeten voor niet-geïnfecteerde cellen, af te trekken van het percentage specifieke lysis van geïnfecteerde cellen. Percentage specifieke lysis werd berekend met behulp van de volgende formule: (% lysis door antilichaam en complement −% lysis door complement alleen)/(% maximale lysis −% lysis door complement). Ook in deze test werd geen activiteit van het MoAb NP waargenomen ondanks het gebruik van hoge antilichaamconcentraties van MoAb NP, in tegenstelling tot equivalente volumes van het positieve controle IgG (Fig. 3B). Deze bevindingen suggereren dat dit antilichaam tegen het NP geen CDCC medieert, in tegenstelling tot antilichamen tegen het hemagglutinine of het matrix 2-eiwit (10, 23). De verschillen worden hoogstwaarschijnlijk verklaard door het feit dat het hemagglutinine- en matrix 2-eiwit verankerd zijn in het celmembraan, terwijl dit niet is aangetoond en hoogstwaarschijnlijk niet het geval is voor het nucleoproteïne. Van belang, Yewdell en collega's observeerden lage niveaus van CDCC met behulp van een muizen-MoAb gericht tegen de NP, wat in tegenstelling is tot onze waarnemingen (15). Dit kan te maken hebben met verschillen tussen de gebruikte assays of de gebruikte MoAb NP.

Er is gesuggereerd dat het beschermende effect van NP-specifieke antilichamen waargenomen bij muizen kan worden toegeschreven aan de vorming van immuuncomplexen die worden verwerkt door antigeenpresenterende cellen, wat vervolgens resulteert in versnelde en verbeterde virusspecifieke CD8+ T-celreacties. Er werd inderdaad geen bescherming waargenomen in de afwezigheid van geheugen-T-cellen (14, 24). Daarom wilden we het effect van MoAb NP op opsonisatie van viraal antigeen onderzoeken, mogelijk resulterend in verbeterde opname, verwerking en antigeenpresentatie aan virusspecifieke CD8+ T-cellen door professionele antigeenpresenterende cellen. Om dit mogelijke werkingsmechanisme te testen, werd een gesplitst virionpreparaat van het influenza A-virus RESVIR-9 geproduceerd door geconcentreerde en gezuiverde virusvoorraden te behandelen met decanoyl-N-methylglucamide (Mega-10 Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Nederland) gedurende 30 min. Na dialyse tegen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 24 uur, werd de eiwitconcentratie bepaald met behulp van de BCA-eiwittestkit (Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products, Rockford, IL), en volledige inactivatie van het virus werd bevestigd zoals eerder beschreven ( 25). Een hoeveelheid van 0-, 0,5- of 1-&#g van het gesplitste virionpreparaat werd gedurende 1 uur bij 37&#C geïncubeerd met of zonder 1&#cg MoAb NP en vervolgens toegevoegd aan 100.000 humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (DC ) van HLA-B*3501+-donoren, die werden bereid zoals eerder beschreven met monocyten afkomstig van twee verschillende gezonde bloeddonoren (26). Na incubatie van DC met antigeen en met of zonder MoAb NP gedurende 16 tot 18 uur bij 37°C, 30.000 cellen van een CD8+ T-celkloon specifiek voor het HLA-B*3501-beperkte epitoop NP418-426 (LPFEKSTVM) (27) toegevoegd. Na incubatie gedurende 6 uur in aanwezigheid van Golgistop (BD, Alphen a/d Rijn, Nederland), werd de productie van gamma-interferon (IFN-γ) door cellen van de CD8+ T-celkloon beoordeeld door middel van flowcytometrie met behulp van een FACSCanto II-cytometer. De gegevens werden geanalyseerd door FACSDiva-software in wezen zoals eerder beschreven, en de specifieke productie van IFN-γ werd berekend door het percentage IFN-γ + T-cellen van mediumcontroles af te trekken van de DC die was geïncubeerd met het gesplitste virionpreparaat (28 ). Stimulatie van de NP-specifieke CD8+ T-cellen met dendritische cellen die waren geïncubeerd met het gesplitste virionpreparaat, induceerde de productie van IFN-γ. Pre-incubatie van het gesplitste virion-antigeenpreparaat met MoAb NP verhoogde echter niet het percentage IFN-γ-producerende T-cellen (Fig. 3C en ​ en D). NS ). Deze bevindingen suggereren dat dit MoAb NP de opname, verwerking en antigeenpresentatie aan virusspecifieke CD8+ T-cellen door DC niet verbetert. in vitro. Bovendien werd geen verhoogde opregulatie van co-stimulerende moleculen CD80, CD83 en CD86 waargenomen na incubatie van DC met gesplitst virion en MoAb NP vergeleken met die met DC geïncubeerd met alleen het gesplitste virion-preparaat (gegevens niet getoond). MoAb NP zou echter de endocytose en presentatie via het major histocompatibility complex (MHC) klasse II-molecuul aan CD4+ T-cellen kunnen verbeteren. Gezamenlijk hebben we aangetoond dat MoAb NP bond aan viraal nucleoproteïne op het oppervlak van met virus geïnfecteerde cellen, maar we waren niet in staat om biologische activiteit van immunologische betekenis aan te tonen voor dit menselijke antilichaam gericht tegen het NP in verschillende in vitro test systemen.

De exacte bron en transportroute van NP, resulterend in het fragmentarische uiterlijk op het oppervlak van met virus geïnfecteerde cellen, zijn nog onbekend. In pilootstudies met een NP-specifiek muis monoklonaal antilichaam, hebben we waargenomen dat NP al binnen 1 uur na inoculatie op het oppervlak van geïnfecteerde cellen detecteerbaar was. Bovendien konden we deze verschijning niet voorkomen door de eiwittransportremmer brefeldin A te gebruiken, wat suggereert dat het geen actief proces is, wat al eerder werd gesuggereerd (15). Mogelijk wordt op het celoppervlak gedetecteerde NP verkregen na afgifte door andere met virus geïnfecteerde cellen of opgehoopt uit het virale inoculum.

Natuurlijk, de in vitro hier gebruikte testsystemen geven de situatie niet weer in vivo. Bovendien kan het biologische effect van NP-specifieke antilichamen afhankelijk zijn van de epitopen die worden herkend, en er moeten meer antilichamen tegen de NP worden getest om dit probleem aan te pakken. Verder was het constante gebied van de zware keten van het MoAb van de huidige studie van de IgG1-subklasse, die mogelijk niet hetzelfde is als dat van het oorspronkelijke antilichaam. IgG1, de meest voorkomende subklasse, is echter in staat complement te activeren en te binden aan Fc-receptoren op verschillende cellen van het immuunsysteem (29, 30). Het kan echter niet worden uitgesloten dat andere subklassen een andere biologische activiteit kunnen vertonen, en daarom. meer subklassen moeten worden getest. Antilichamen tegen het nucleoproteïne van het influenza A-virus kunnen dus nog steeds een rol spelen bij heterosubtypische immuniteit, bijvoorbeeld door samen te werken met T-cellen om met virus geïnfecteerde cellen in de longen te elimineren (14). Meer onderzoek is nodig om het potentieel van NP-specifieke antilichamen om heterosubtypische immuniteit bij mensen te verschaffen aan te pakken, om hun relatieve bijdrage aan dit type immuniteit op te helderen en om de beschermingsmechanismen op te helderen.


Aanvulling

Onze redacteuren zullen beoordelen wat je hebt ingediend en bepalen of het artikel moet worden herzien.

Aanvulling, in de immunologie, een complex systeem van meer dan 30 eiwitten die samenwerken om infectieuze micro-organismen te helpen elimineren. Specifically, the complement system causes the lysis (bursting) of foreign and infected cells, the phagocytosis (ingestion) of foreign particles and cell debris, and the inflammation of surrounding tissue.

The interacting proteins of the complement system, which are produced mainly by the liver, circulate in the blood and extracellular fluid, primarily in an inactivated state. Not until the system receives an appropriate signal are they activated. The signal sets off a chemical chain reaction in which one activated complement protein triggers the activation of the next complement protein in the sequence.

Complement activation occurs by two routes, called the classical pathway and the alternative pathway, or properdin system. A different type of signal activates each pathway. The classical pathway is triggered by groups of antibodies bound to the surfaces of a microorganism, while the alternative pathway is spurred into action by molecules embedded in the surface membranes of invading microorganisms and does not require the presence of antibodies. Both pathways converge to activate the pivotal protein of the complement system, called C3.

The activation of C3 fragments the protein into two pieces—a smaller piece, called C3a, which promotes an inflammatory reaction, and a larger piece, called C3b, which binds to the surface of a microbial cell. C3b helps bring about the elimination of the microbial invader in two ways:

Complement was identified in the late 19th century as one of two soluble proteins in human blood serum responsible for killing bacteria, the other substance being antibody. The original complement protein was called alexin, but its name was eventually changed to indicate how the protein “complemented” the action of antibody in carrying out bacterial lysis. The classical pathway was characterized in the early part of the 20th century, prior to the discovery of the alternative pathway, which was described in the 1940s but not fully appreciated until the 1970s. Because antibodies are not needed to activate the alternative pathway—but are required to set off the classical cascade—the alternative pathway serves as a first defense against infection and is part of the nonspecific, innate immune response, which occurs before a specific, acquired immune response can be mounted. The alternative pathway appears to be the more primitive of the two systems, and the nomenclature, therefore, indicates the sequence of discovery of the two pathways and not their evolutionary history.


Understanding the Importance of Human IgG

Human IgG is a component of the immune system that protects the body from infection. It is the most abundantly found antibody isotype within the circulatory system of the human body. All antibody isotypes contain two heavy chains and two light chains that are arranged in a Y-shape. The IgG isotpye is found in blood, extracellular fluid, and colostrum among a wide variety of body fluids, and protects the fetus in utero because it is a small monomer capable of crossing the placenta.

It functions through multiple mechanisms: opsonization (coating pathogens for phagocytic uptake), activation of the complement signaling cascade, and toxin neutralization through binding. Human IgG antibody has been used to characterize novel classification algorithms for analyzing immunosignature data on complex microarrays in a highly reproducible manner (1). Using human IgG antibody, researchers were able to show that a Niave Bayes algorithm was more simple, robust, fast, and accurate than other widely used methods.

Novus Biologicals offers a wide selection of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM and IgY products in the form of primary antibodies, secondary antibodies, isotype controls, kits and more.


What is Cell Mediated Immunity

Cell mediated immunity is the immunity mediated by antigen-specific T cells. T cells are produced in the bone marrow and are matured in the thymus. After they enter the bloodstream, T cells occur can be found in the blood as well as in lymphoid tissue. The antigens should be presented on the surface of the antigen-presenting cells (APCs) along with the major histocompatibility complexes (MHC). Once T cells encounter an antigen, they proliferate and differentiate into armed effector cells. The cytotoxic T cells destroy the infected cells by inducing apoptosis. T helper cells stimulate plasma B cells to produce antibodies.

Figure 2: Cell Mediated Immunity

The IgG and IgM are the main two types of antibodies produced by T helper cells in response to plasma B cells. The memory T cells are differentiated T cells, but their action requires the activation by the specific antigen. The major characteristic feature of the cell mediated immunity is that it destroys intracellular pathogens. The cell mediated immunity is shown in Figuur 2.


Opsonization

If the complement system in the sea urchin functions through multiple lectin and alternative pathways in the absence of the lytic functions of the terminal pathway, the major activity of this system is expected to be opsonization.

This work discovered a new form of Type I polysaccharide and produced evidence that complement played a catalytic-like part in the opsonization of bacteria by specific antibody.

Besides that, through cytokine-mediated interactions with B lymphocytes, the CD4 + T cells contribute to the generation of high-affinity IgG antibodies, which are able to perform bacterial opsonization and complement activation.

Besides that, through cytokine-mediated interactions with B lymphocytes, the CD4 + T cells contribute to the generation of high-affinity IgG antibodies, which are able to perform bacterial opsonization and complement activation.

The second mechanism is an opsonization process, involving the formation of immune complexes with ADAMTS13, which are subsequently cleared by phagocytes

We also theorize that physical and biological processes such as particle shape, size, coating and opsonization that affect MP clearance of debris and microbes can be harnessed to facilitate uptake of nanoparticles (NP) and tissue delivery.

Indeed, it is well known that opsonization of particles and microbes facilitates rapid uptake into monocytes and MDM.

To achieve the latter goal, we used a simple means, antibody opsonization, to facilitate uptake of particles into MP the process by which the host facilitates foreign particles for ingestion and destruction.

De opsonization of foreign particles could facilitate the phagocytic process due to the interaction with Fc receptors highly expressed on the surface of monocytes

Moghimi SM, Szebeni J (2003) Stealth liposomes and long circulating nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein-binding properties.


Immune tolerance

&ldquoWhy don&rsquot tens to hundreds of millions of B cells recognize and attack self-tissues?&rdquo

Antibodies recognize all types of antigens, except self-antigens. This feature is called &ldquoimmune tolerance.&rdquo B cells that react to self-antigens are generated, but are eliminated within the bone marrow. Even if some autoreactive B cells evade the elimination process and reach the periphery, those B cells that produce antibodies to self-antigens (autoantibodies) are inactivated by another mechanism including regulation by Tregs..

When these mechanisms are disrupted, &ldquoautoimmune disease&rdquo develops, characterized by immune cell-mediated self-tissue attack. Possible causes of autoimmune disease include viral infection, high fever, pregnancy, and the recently proposed abnormalities in the intestinal microbiome. However, the details of the mechanism remain unknown.