Informatie

Bekende MicroRNA - Gensystemen?


Zijn er experimenteel geverifieerde systemen van microRNA's die zich richten op een genenset (bijvoorbeeld bij kanker misschien)?


Ja. Hieronder vindt u een link naar een overzicht van ncRNA (niet-coderende RNA's) en hun rol bij ziekte. Er zijn veel voorbeelden in deze review bij allerlei ziekten, waaronder miR-200, waarvan wordt gedacht dat het een rol speelt bij sommige kankers.

Er zijn ook enkele tabellen in de krant met de miRNA en de ziekte waaraan ze zijn gekoppeld. Ze hebben ook voor elk een referentie, dus je zou meer kunnen lezen over dat specifieke miRNA en zijn functie, inclusief het gen dat het reguleert.

http://www.nature.com/nrg/journal/v12/n12/full/nrg3074.html

Ik weet niet zeker of dat artikel voor het publiek toegankelijk is of niet. Als je er geen toegang toe hebt, kun je altijd het wikipedia-item voor miR-200 bekijken

http://en.wikipedia.org/wiki/Mir-200


PMAMCA: voorspelling van microRNA-ziekte-associatie met behulp van een matrixaanvullingsbenadering

Talrijke experimentele resultaten hebben aangetoond dat microRNA's (miRNA's) een vitale rol spelen in biologische processen, evenals uitbraken van ziekten op moleculair niveau. Ondanks hun belangrijke rol in biologische processen, is de kennis over specifieke functies van miRNA's bij de ontwikkeling van menselijke ziekten zeer beperkt. Tijdens een poging om dit probleem op te lossen, zijn er veel computationele benaderingen voorgesteld die veel aandacht hebben getrokken. De meeste eerdere benaderingen lijden echter aan het algemene probleem dat ze niet van toepassing zijn op nieuwe ziekten zonder bekende associaties met miRNA-ziekte.

Resultaten

Dit artikel stelt een nieuwe methode voor voor het afleiden van ziekte-miRNA-associaties met behulp van een machinale leertechniek genaamd matrixfactorisatie, die veel wordt gebruikt in aanbevelingssystemen. In aanbevelingssystemen is het doel om beoordelingsscores te voorspellen die een gebruiker aan specifieke items kan toewijzen. Door gebruikers te vervangen door miRNA's en items met ziekten, kunnen we miRNA-ziekteassociaties efficiënt voorspellen zonder miRNA's te zaaien. Als gevolg hiervan behaalt ons voorgestelde model, genaamd voorspelling van microRNA-ziekte-associatie met behulp van een matrixaanvullingsbenadering, uitstekende prestaties in vergelijking met eerdere benaderingen met een betrouwbare AUC-waarde van 0,882 door vijfvoudige kruisvalidatie te implementeren.

Conclusies

Voor zover wij weten, past de voorgestelde methode de matrixaanvullingstechniek toe om miRNA-ziekteassociaties af te leiden en het zaad-miRNA-probleem te overwinnen, heeft een negatieve invloed op bestaande computationele modellen.


Niet-coderende RNA's bij hart- en vaatziekten

Pierluigi Lesizza, . Gianfranco Sinagra, in Nucleic Acid Nanotheranostics, 2019

5.3.1.1 miRNA-sponzen

miRNA-sponzen zijn moleculen die zijn ontworpen om meerdere bindingsplaatsen voor miRNA's te bevatten, en fungeren als competitieve remmers van miRNA-mRNA-koppeling. Sponzen kunnen worden gemodificeerd, waardoor het aantal bindingsplaatsen voor miRNA's wordt verhoogd of verlaagd en ze worden gewijzigd om volledig of gedeeltelijk complementair te zijn aan miRNA, inclusief spacers tussen bindingsplaatsen. 188 Al deze modificaties kunnen de sponsactiviteit, bindingsaffiniteit, het risico van sponsafbraak en genetische recombinatie beïnvloeden. miRNA-sponzen kunnen zelfs bindingsplaatsen bevatten voor verschillende doelwit-miRNA's wanneer meerdere miRNA-remming vereist is om een ​​therapeutisch effect te bereiken. 189 Evoluties van miRNA-sponzen zijn 'Tough Decoys', miRNA-gommen en miRNA-maaiers. Tough Decoys bevatten twee miRNA-bindingsplaatsen in een enkelstrengs gebied met korte stengellussen en worden gekenmerkt door een langduriger miRNA-bindingsvermogen dan klassieke miRNA-sponzen. 190 miRNA-wissers bevatten de volledige antisense-sequentie van doelwit-miRNA met een hoge bindingsaffiniteit voor doelwit-miRNA's. 191


Methoden:

MiRNA-doelen en doelinteractienetwerken

Recente studies toonden een hoge betrouwbaarheid aan van miRNA-targets voorspeld door TargetScan [7]. Daarom hebben we de doelen geselecteerd voor alle menselijke miRNA's die worden vermeld in de TargetScan-database. We hebben een set van 677 miRNA's en 18.880 unieke doeleiwitten verkregen. Het resulterende miRNA-eiwitnetwerk bevatte 224.316 interacties. Om miRNA-doelen te voorspellen op basis van PAR-CLIP-gegevens, werden de crosslink-centered regionen (CCR's) van gecombineerde AGO-PAR-CLIP-bibliotheken [13] gebruikt. Target site-voorspelling voor alle CCR's werd gedaan met het programma RNAhybrid [14] met de standaardparameters. Uit de resulterende lijst hebben we alle voorspellingen gefilterd met een p-waarde onder 0,02 en een energiescore onder de 25% kwantiel. Dit resulteerde in een definitieve miRNA-mRNA-lijst van 50.160 voorspelde interacties.

Associatie van eiwitcomplexen met miRNA-targetsets - test op statistische significantie

We gebruikten de Fisher's exact-test voor het toewijzen van de betekenis van de associatie met eiwitcomplexen voor elke miRNA-targetset. De hypergeometrische P-waarde wordt gegeven als de kans waaronder we tenminste . kunnen verwachten N C miRNA richt zich bij toeval in een eiwitcomplex, als we willekeurig selecteren N t (totaal aantal miRNA-doelen) eiwitten uit de totale set eiwitten N bestaande uit alle miRNA-doelen N t en alle eiwitten in complexen N C . P-waarden werden gecorrigeerd voor meerdere testen van 677 miRNA's met behulp van de Holm-Bonferroni-correctiemethode. We hebben de associatie van complexen en miRNA-clusters toegewezen door de vereniging van doelen van alle miRNA's binnen één cluster te gebruiken. Hier hebben we getest op significante overlappingen van deze uniforme sets tussen de componenten van een complex op dezelfde manier als voor enkele miRNA-doelsets.

Verrijking van biologische processen

Om te testen op significante verrijking van biologische functies op basis van Gene Ontology (GO) [15] en KEGG [16]-routes binnen de reeks doelen in eiwitcomplexen, werd het R-pakket GOstats [17] gebruikt. Een set gerichte componenten van 722 gerichte eiwitcomplexen werd geëxtraheerd en vergeleken met een set eiwitten die uit alle componenten van deze complexen bestond.

Vergelijking van vouwwisselverdelingen

We gebruikten vouwveranderingsmetingen na overexpressie van geselecteerde miRNA's uit recente proteomics-onderzoeken [6, 7]. We selecteerden voor elk van deze miRNA's de eiwitcomplexen die uit ten minste één van zijn doelen bestaan. Een set componenten van deze eiwitcomplexen werd gebouwd. Binnen deze set vergeleken we de vouwveranderingen van componenten die doelen zijn van het specifieke miRNA met de vouwveranderingen van de niet-doelwitcomponenten. Dit werd gedaan door een eenzijdige Kolmogorov-Smirnov-test uit te voeren voor elk van de miRNA's die werden onderzocht in de proteomics-onderzoeken.

Cel cultuur

PANC-1-cellen werden gekocht bij ATCC (Manassas, VA, VS). PANC-1 stabiele klonen voor miR-141 of miR-200c werden verkregen met op sequentie geverifieerde pRetroSuper-miRNA-plasmiden. Cellijnen werden onder standaardomstandigheden gekweekt in DMEM + 10% foetaal runderserum + 2 ug/ml puromycine. Voor tijdelijke knock-down werd PANC-1 getransfecteerd met siRNA gericht op ZEB1 (r(aga uga uga aug cga guc g)d(TT)), CtBP2 (1: r(cuuuggauucagcgucaua)d(TT), 2: r(cuuuguaacugauucugga)d (TT)) of GFP (r(gcu acc ugu ucc aug gcc a)d(TT). Alle transfecties en reporterassays werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [18].

Specifieke test voor miRNA-modulatie

RNA uit gekweekte cellen werd geëxtraheerd met behulp van de mirVana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, VS). mRNA-expressiewaarden werden in drievoud gemeten met behulp van de Roche LightCycler 480 en genormaliseerd naar b-actine-expressie als huishoudelijke controle. Expressiewaarden werden berekend volgens ref. [19].

Immunoblots

werden uitgevoerd met behulp van aangepaste standaardprotocollen. In het kort werden hele celextracten gemaakt van de cellen in Triple Lysis Buffer [50 mM Tris-HCl pH8, 150 mM NaCl, 0,02% (w/v) NaN3, 0,5% (m/v) Nadeoxycholaat, 0,1% SDS, 1% (v/v) NP40]. Extracten (10 g/laan) werden gescheiden op een 10% SDS-polyacrylamidegel, geblot op een PVDF-membraan en geïncubeerd met de aangegeven primaire antilichamen verdund in blokkerende buffer (5% magere droge melk) gedurende de nacht bij 4°C. Na wassen en incuberen met peroxidase-gekoppelde soortspecifieke secundaire antilichamen, werd het signaal ontwikkeld met behulp van SuperSignal West PICO Chemiluminescent Substrate (Perbio Science, Bonn, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant. CtBP2, CDYL, RCOR3, β-actine en ZEB1 werden immuun gedetecteerd met de volgende primaire antilichamen: anti-CtBP2 muis monoklonaal antilichaam (1:8.000, BD Transduction Laboratories™, Franklin Lakes, NJ, VS), anti-CDYL konijn polyklonaal antilichaam (1:500, Abcam, Cambridge, VK), anti-RCOR3 konijn polyklonaal antilichaam (1:1000Abcam, Cambridge, VK) anti-β-actine monoklonaal antilichaam van muis (1:5.000, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Duitsland). de anti-ZEB1 konijn polyklonaal antilichaam (1:20.000) was een geschenk van D.S. Darling, University of Louisville, Louisville, KY, VS.


Resultaten

Evaluatie van MDSC-differentiatie

Celdifferentiatie werd geëvalueerd door morfologie, MHC en desmine-immunolokalisatie, evenals MRF-genexpressie. Runder-MDSC's waren afgeleid van de primaire kweek van spierweefsel en gefuseerde myotubes werden gegenereerd door MDSC's gedurende 1 en 3 dagen in DM te kweken (figuur 1a). In MDSC-P werden de MHC- en desmine-genen niet tot expressie gebracht, maar wel in MDSC-D1 en MDSC-D3 (Fig. 1b, c). De analyse van MRF-genexpressie toonde aan dat de PAX3- en MYF5-genen neerwaarts waren gereguleerd, terwijl MYOG-, MYF6- en MHC-genen opwaarts waren gereguleerd in MDSC-D1 en MDSC-D3 in vergelijking met die in MDSC-P (Fig. 1d). Deze resultaten gaven aan dat de MDSC's zich in het differentiatieproces in MDSC-D1 en MDSC-D3 bevonden, maar niet in MDSC-P, waarin de MDSC's alleen in proliferatie waren.

Morfologie en immunofluorescentiekarakterisering van MDSC's. een Morfologie van MDSC's tijdens differentiatie gedurende 0, 1 en 3 dagen (respectievelijk MDSC-P, MDSC-D1 en MDSC-D3) B Immunofluorescentiedetectie van MHC in MDSC's tijdens differentiatie bij MDSC-P, MDSC-D1 en MDSC-D3 C Immunofluorescentiedetectie van desmine in MDSC's tijdens differentiatie bij MDSC-P, MDSC-D1 en MDSC-D3. NS Expressie van MRF tijdens MDSC-differentiatie. De RT-qPCR-analyse van PAX3-, MYOD-, MYOG-, MYF5- en MYF6-genen in MDSC-D1 en MDSC-D3 in vergelijking met MDSC-P. Foutbalk geeft de standaardfout aan van het gemiddelde van monsters in drievoud. *P < 0,05,**P < 0,01

Celverzameling en high-throughput-sequencing van kleine RNA's

Om kleine RNA's in MDSC's tijdens differentiatie te identificeren, werden totale RNA's van MDSC's in verschillende differentiatiestadia gebruikt om kleine RNA-bibliotheken te construeren. We hebben 5.871.055 schone waarden verkregen uit de MDSC-P-bibliotheek, 5.922.188 uit de MDSC-D1-bibliotheek en 5.935.963 uit de MDSC-D3-bibliotheek na het verwijderen van enkele verontreinigende waarden (tabel 1). Analyse van de lengteverdeling toonde aan dat de meeste meetwaarden varieerden van 21 tot 23 nt. Het percentage van 22 nt-lezingen in totale reads was respectievelijk 72,76, 71,26 en 75,58 % in de MDSC-P-, MDSC-D1- en MDSC-D3-bibliotheek (Fig. 2). De uitlezingen voor de drie bibliotheken (respectievelijk 5.188.810, 5.041.921 en 5.236.492) waren perfect afgestemd op het rundergenoom (tabel 2).

Lengteverdelingen van kleine RNA's in de drie RNA-bibliotheken. Witte kolommen vertegenwoordigen lengteverdelingen van kleine RNA's in de MDSC-P-bibliotheek grijze kolommen vertegenwoordigen lengteverdelingen van kleine RNA's in de MDSC-D1-bibliotheek zwarte kolommen vertegenwoordigen lengteverdelingen van kleine RNA's in de MDSC-D3-bibliotheek

Identificatie van geconserveerde runder-miRNA's

Om geconserveerde miRNA's in MDSC's tijdens differentiatie te identificeren, werden de kleine RNA's met een lengte van 18-23 nucleotiden Blastn doorzocht tegen miRBase 21.0 (miRBase-releaseversie V21.0, 3 juli 2014). De miRNA-kandidaten werden vervolgens geclusterd in 439, 394 en 392 categorieën die overeenkomen met 455, 412 en 410 onafhankelijke genomische loci in de drie bibliotheken volgens sequentieovereenkomst (tabel 3), waarvan 322 miRNA's elkaar overlapten in drie bibliotheken (aanvullend bestand 2 ).

De expressie van bekende miRNA's werd aangetoond door log . te genereren2 verhoudingsgrafieken en spreidingsgrafieken (Fig. 3). De expressieprofielen tussen de verschillende bibliotheken worden weergegeven in aanvullend bestand 3. De resultaten toonden aan dat 296 miRNA's 9 up-expressed (Tabel 4), 165 down-expressed en 122 gelijk uitgedrukte miRNA's in MDSC-D1 omvatten in vergelijking met die in MDSC- P304-miRNA's bestonden uit 15 omhoog tot expressie gebrachte (Tabel 4), 145 omlaag tot expressie gebrachte en 144 gelijk tot expressie gebrachte miRNA's in MDSC-D3 vergeleken met die in MDSC-P. 273 miRNA's omvatten 17 omhoog tot expressie gebracht, 55 omlaag tot expressie gebracht en 201 gelijkelijk tot expressie gebrachte miRNA's in MDSC-D3 in vergelijking met die in MDSC-D1. Aanvullend bestand 4: Tabel S1 bevat de 10 meest voorkomende miRNA's in MDSC-P, MDSC-D1 en MDSC-D3. De miRNA met de grootste telling in MDSC-D3 was miR-206, een belangrijke miRNA in de ontwikkeling van skeletspieren, met een gemiddelde genormaliseerde leestelling van >1 miljoen. De alomtegenwoordige let-7-leden, let-7a-5p, let-7f en let-7b, volgden en miR-1 had de vijfde grootste telling. De miRNA-expressiepatronen tijdens MDSC-differentiatie werden geclusterd met behulp van hiërarchische clusteranalyse (aanvullend bestand 5: figuur S1). In vergelijking met de proliferatiestadia (MDSC-P) waren de expressieniveaus van miR-2443, miR-423-5p, miR-181a, miR-10a en miR-206 bijvoorbeeld hoger in MDSC-D1 en het patroon was hetzelfde als die van miR-139, miR-1, miR-95, miR-206 en miR-133a in MDSC-D3.

Differentiële expressie van geconserveerde miRNA's tijdens differentiatie van MDSC's. Vergelijk de bekende miRNA-expressie tussen verschillende differentiatiestadia om het differentieel tot expressie gebrachte miRNA te achterhalen. Elk punt in de figuur vertegenwoordigt een miRNA. De X-as en Y-as tonen het expressieniveau van miRNA's in twee bibliotheken. Groene punten vertegenwoordigen miRNA's met ratio > 2 Blauwe punten vertegenwoordigen miRNA's met ½ < ratio ≤2 Rode punten vertegenwoordigen miRNA's met ratio ≤ 1/2. Verhouding = genormaliseerde expressie in behandeling/genormaliseerde expressie in controle

Nucleotidebiasanalyse op elke positie toonde aan dat het GC-gehalte hoog was op de 2e, 11e en 15e positie met waarden van respectievelijk 94,34, 92,53 en 95,16%, maar niet op de 1e, 6e, 9e, 10e, 13e, 14e, 16e, 22e en 24e posities met waarden van respectievelijk 0,70, 6,69, 4,94, 5,91, 4,69, 3,69, 3,40, 7,17 en 0,18% in de MDSC-P-bibliotheek. Een vergelijkbaar resultaat werd verkregen in de MDSC-D1- en MDSC-D3-bibliotheken. In alle bibliotheken werden nucleotiden A + U voornamelijk verdeeld over de resterende posities, met uitzondering van de 4e, 5e, 8e, 12e, 20e en 23e positie (aanvullend bestand 6: figuur S2). Het fenomeen van nucleotide-bias kan verband houden met de mechanismen van miRNA, zoals binding met doelen voor genregulatie. De 1e, 9e en terminale posities waren verrijkt met U en de 1e en 9e posities waren de limieten van het "zaadgebied" van een miRNA dat verantwoordelijk was voor het richten van mRNA's voor genregulatie [21]. Een vergelijkbaar resultaat werd verkregen in MDSC-P miRNA's op de 1e, 9e en eindposities, maar er was slechts 44,35% U op de eindpositie in MDSC-D1 en 58,21% op de 9e positie in de MDSC-D3-bibliotheek. De waargenomen verschillen tussen onze studie en eerdere studies kunnen te wijten zijn aan verschillende experimentele benaderingen of verschillen in steekproeven [12].

Posities 2-8 van een volwassen miRNA worden het zaadgebied genoemd, dat sterk geconserveerd is. Het doelwit van een miRNA kan verschillen met veranderingen van nucleotiden in deze regio. In onze studie konden miRNA's die mogelijk een basisbewerking hebben, worden gedetecteerd door niet-geannoteerde sRNA-tags uit te lijnen met volwassen miRNA's van miRBase21, waardoor één mismatch op een bepaalde positie mogelijk is. De resultaten toonden aan dat de mismatches voorkwamen in alle drie de bibliotheken met een percentage van respectievelijk 22,65, 22,45 en 23,53%. De mismatches kunnen worden veroorzaakt door post-transcriptionele modificatie en/of RT-PCR en sequentiefouten (aanvullend bestand 7).

In onze studie identificeerde verdere analyse in totaal 439, 394 en 392 geconserveerde miRNA's die behoorden tot 237 miRNA-families in de drie hierboven genoemde bibliotheken. De grootste geïdentificeerde miRNA-familie was miR-2284, die uit 63 leden bestond, en miR-154, let-7 en miR-181/30 bezaten respectievelijk 18, 12 en 6 leden, respectievelijk andere miRNA-families, zoals miR-122 , miR-1249, miR-140 en miR-486 hadden slechts één lid, terwijl miR-1940, miR-2286, miR-3431 en miR-574 tot geen enkele genfamilie behoorden (aanvullend bestand 8).

Identificatie van nieuwe runder-miRNA's

De karakteristieke haarspeldstructuur van een miRNA-precursor zou kunnen worden gebruikt om nieuwe miRNA's te voorspellen. De voorspellingssoftware Mireap is ontwikkeld om nieuwe miRNA's te voorspellen door de secundaire structuur, de Dicer-splitsingsplaats en de minimale vrije energie van de niet-geannoteerde kleine RNA-aflezingen die aan een genoom kunnen worden toegewezen, te onderzoeken. Op basis van HiSeq-diepe sequencing werden 53 nieuwe runder-miRNA's geïdentificeerd in runder-MDSC's, wat overeenkwam met 145 genomische loci. Drieënveertig nieuwe miRNA's bevonden zich in de MDSC-P-bibliotheek, 17 waren in de MDSC-D1 en 19 waren in de MDSC-D3-bibliotheek en 26 van de miRNA's overlapten elkaar in drie bibliotheken (aanvullend bestand 9). De leesnummers van HiSeq deep sequencing worden vaak beschouwd als een betrouwbare kwantificering van miRNA-expressie. De leesnummers van miRNA's in de HiSeq deep sequencing-analyse worden weergegeven in aanvullend bestand 10.

De expressie van nieuwe miRNA's in MDSC-P, MDSC-D1 en MDSC-D3 werd aangetoond door log te genereren2 verhoudingsgrafieken en spreidingsgrafieken (aanvullend bestand 11: figuur S3). De resultaten toonden aan dat 42 miRNA's 7 omhoog tot expressie gebrachte, 31 omlaag tot expressie gebrachte en 4 gelijk tot expressie gebrachte miRNA's in MDSC-D1 omvatten in vergelijking met die in MDSC-P 43 miRNA's omvatten 8 omhoog tot expressie gebrachte, 32 omlaag tot expressie gebrachte en 3 gelijk tot expressie gebrachte miRNA's miRNA's in MDSC-D3 vergeleken met die in MDSC-P en 24 miRNA's omvatten 9 omhoog tot expressie gebrachte, 9 omlaag tot expressie gebrachte en 6 gelijk tot expressie gebrachte miRNA's in MDSC-D3 vergeleken met die in MDSC-D1.

QPCR-analyse bevestigde differentiële expressie van geselecteerde miRNA's in MDSC's

Om de RNA-seq-resultaten te bevestigen, werd de expressie van 12 miRNA's gekwantificeerd met stam-lus qPCR [22]. De resultaten toonden aan dat miR-29a, miR-27a en let-7i sterk tot expressie werden gebracht in MDSC-P, terwijl miR-320, miR-1 en miR-206 daarentegen sterk tot expressie werden gebracht in MDSC-D3. Bovendien werden miR-206, miR-1 en miR-320 opwaarts gereguleerd tijdens MDSC-differentiatie. miR-495, miR-133b en miR-487 werden neerwaarts gereguleerd in MDSC-D1 en opgereguleerd in MDSC-D3. De resultaten van de RT-qPCR-analyse waren consistent met die verkregen door RNA-seq-analyse, behalve voor miR-423, dat was opwaarts gereguleerd in MDSC-D3 vergeleken met MDSC-D1 in RT-qPCR, terwijl het was neerwaarts gereguleerd in RNA-seq (Fig. 4). Deze resultaten gaven aan dat de HiSeq diepe sequencing in onze studie van hoge betrouwbaarheid was.

Expressie van miRNA's tijdens MDSC-differentiatie bij runderen gedetecteerd door RT-qPCR. Opmerking: MDSC's tijdens differentiatie op 0, 1 en 3 dagen (respectievelijk MDSC-P, MDSC-D1 en MDSC-D3) Foutbalk geeft de standaardfout aan van het gemiddelde van drievoudige monsters. (* P < 0,05,** P < 0,01, vergeleken met MDSC-P door q-PCR. Δ P < 0,05, P < 0,01, vergeleken met MDSC-P door diepe sequencing)

Doelvoorspelling voor miRNA's

De functie van een miRNA wordt uiteindelijk bepaald door de genen waarop het zich richt en door het effect ervan op de expressie van deze genen. Om de potentiële doelen van miRNA's te identificeren, hebben we een runder-mRNA-database (ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/bosTau7/database/refGene.txt.gz) doorzocht. Tabel 5 geeft een overzicht van de doelgenen die zijn verkregen uit MDSC-P, MDSC-D1 en MDSC-D3, die mogelijk worden gereguleerd door de miRNA's in MDSC-D1, MDSC-D3 en MDSC-P, weergegeven in aanvullend bestand 12. De bindingsenergie van de geconserveerde miRNA's met hun doelen varieerde van -11,2 tot -44,3 kcal/mol en van 10,3 tot -49,4 kcal/mol tussen de nieuwe miRNA's en hun doelen (aanvullend bestand 13). Sommige miRNA's hadden meer dan 1000 voorspelde doelen en sommige andere doelgenen werden vermoedelijk gereguleerd door meer dan twee miRNA's.

GO-verrijkingsanalyse en KEGG-pathway-analyse van doelgenen

Om de biologische functie van miRNA's in MDSC's te begrijpen, werden alle voorspelde doelgenen geclassificeerd volgens functionele KEGG-annotaties, die helpen bij het identificeren van routes die actief werden gereguleerd door miRNA's in MDSC's. De meeste van deze genen waren betrokken bij cellulair metabolisme, routes bij kanker, actine-cytoskeletregulatie en de MAPK-signaleringsroute (tabel 6). De meest aangegeven route was de metabole route, met 1321 genen die 12,44% van het totaal vertegenwoordigen, gevolgd door de routes bij kanker (3,51 %), biosynthese van secundaire metabolieten (3,46 %), regulatie van actine-cytoskelet (3,17 %) en de MAPK-signaleringsroute (3,03 %). Alle voorspelde doelgenen werden ingediend voor Gene Ontology (GO) -analyse met behulp van een online versie van het Blast2GO-programma (www.Blast2GO.com). In totaal werden 10.887 genen goed of beter dan 1 genoemd met behulp van de componentontologie met P-waarde-analyse, 10.228 genen kregen verschillende functies toegewezen en 10.039 genen werden genoemd op biologische processen (aanvullend bestand 4: tabel S2). Om de potentiële functies van de verschillende expressie-miRNA's te bepalen, werden de 45 meest voorkomende miRNA's in de drie bibliotheken geselecteerd voor Gene Ontology-analyse. De belangrijkste GO-categorieën waarop verschillende expressiegenen het doelwit waren, waren het ontwikkelingsproces, celdood, groei, voortplantingsproces en metabolisch proces (Fig. 5). Verdere analyse voor miRNA-doelen is nodig en zal ons helpen inzicht te krijgen in de rollen van deze miRNA's in MDSC-differentiatie.

GO-analyse op basis van miRNA-gerichte genen. De GO's die het doelwit waren van overvloedige miRNA's werden getoond. De horizontale as is de GO-categorie en de verticale as is het aantal genen


Deel 2: Tailing in de regulering van microRNA en verder

00:00:15.02 Hallo. Ik ben Narry Kim van het RNA Research Center
00:00:18.11 bij IBS.
00:00:20.16 Ik werk ook aan de Seoul National University.
00:00:24.18 In het laatste deel van mijn presentatie,
00:00:26.23 Ik heb met je gesproken over:
00:00:29.27 hoe microRNA's worden gegenereerd en gereguleerd.
00:00:32.16 In deze talk zal ik het met je hebben over:
00:00:36.26 een type RNA-modificatie genaamd tailing,
00:00:40.15 die microRNA-biogenese regelt
00:00:43.24 en andere soorten RNA's, inclusief boodschapper-RNA's.
00:00:49.26 Dus meer dan 100 soorten RNA-modificaties
00:00:54.20 zijn tot nu toe beschreven.
00:00:56.11 RNA-modificatie kan op de basis of de riboseresten zijn.
00:01:03.10 Bovendien, de nucleotiden
00:01:06.19 kan worden toegevoegd aan of verwijderd uit RNA.
00:01:09.14 Mijn lab was bijzonder geïnteresseerd
00:01:13.04 in het 3'-deel van het RNA, dat we staarten noemen.
00:01:17.29 In deze presentatie,
00:01:20.18 Ik ga je wat gegevens van het lab laten zien
00:01:27.07 waaruit blijkt dat, soms,
00:01:29.23 een staart kan het lot van het RNA veranderen.
00:01:33.12 Dus deze regel van de studie
00:01:38.20 begon toen we de microRNA-route bestudeerden.
00:01:42.00 Zoals ik je in het eerste deel van het gesprek heb uitgelegd,
00:01:46.06 miRNA-biogenese omvat:
00:01:49.02 Pol II, Drosha, Exportin 5, Dicer en Argonaute.
00:01:53.28 En volwassen miRNA's worden gedacht.
00:01:58.02 werden beschouwd als een enkele soort.
00:02:03.07 Maar in feite, als je kijkt naar de diepe sequencing-gegevens.
00:02:07.25 hier, aan de linkerkant,
00:02:11.01 de cijfers geven de relatieve abundantie van de miRNA-soorten aan.
00:02:16.01 afgezien van de meest voorkomende referentiereeks,
00:02:19.19 kunt u ook aanvullende isovormen vinden.
00:02:23.07 Het meest opvallend is dat sommige isovormen
00:02:28.29 niet-template A-reeksen of U-reeksen
00:02:33.07 aan het einde van het miRNA.
00:02:35.29 Bij dieren, zoals en wij
00:02:39.27 zijn de meest voorkomende ongetemperde nucleotiden
00:02:44.04 aan het 3'-uiteinde van het RNA.
00:02:46.14 In planten is U de meest prominente,
00:02:50.10 zoals oorspronkelijk beschreven door het laboratorium van Xuemei Chen.
00:02:55.06 Dus, waar komen deze ongetemperde nucleotiden vandaan?
00:03:00.23 Het bleek dat er uridylatie plaatsvindt,
00:03:04.26 meestal, voorafgaand aan Dicer-verwerking op pre-miRNA,
00:03:09.15 terwijl adenylatie optreedt
00:03:14.20 na Dicer-verwerking, op RNA van 22 nucleotiden.
00:03:20.14 Dus deze reacties worden uitgevoerd
00:03:25.07 door een groep niet-canonieke poly(A)-polymerasen,
00:03:28.23 ook bekend als terminale uridylyltransferasen.
00:03:33.02 Van de 7 niet-canonieke poly(A)-polymerasen, of TUTases,
00:03:39.09 TUT4 en TUT7,
00:03:43.25 die vergelijkbare domeinorganisaties hebben,
00:03:47.21 hebben redundante functies in de uridylering van pre-let7.
00:03:55.05 Hoe zit het met adenylatie?
00:03:57.04 Er werd aangetoond dat TUTase2 of GLD2
00:04:01.22 of Piekerige in vliegen,
00:04:04.19 zijn verantwoordelijk voor adenylering.
00:04:07.21 Maar voordat ik begin met het uitleggen van de regelgeving
00:04:11.05 door te volgen,
00:04:13.13 Ik wil duidelijk maken dat de staartfrequenties
00:04:16.08 zijn over het algemeen vrij laag in de meeste celtypen
00:04:18.27 voor de meeste miRNA's.
00:04:21.24 Dus ik wil dat je een indruk hebt
00:04:25.08 dat tailing altijd belangrijk is voor alle miRNA's.
00:04:30.22 Echter, de staartfrequentie
00:04:34.27 varieert afhankelijk van miRNA-soorten en celtypen.
00:04:38.13 En tailing kan een moleculaire basis bieden
00:04:43.03 voor de regulatie van sommige miRNA's
00:04:46.02 in specifieke ontwikkelingsstadia.
00:04:49.18 Dus, om je een paar voorbeelden te geven
00:04:53.24 van tailing-gemedieerde regelgeving.
00:04:56.15 de eerste is uridylatie van pre-let-7.
00:05:00.28 Er zijn in feite minstens twee manieren om pre-let-7 te uridyleren.
00:05:05.12 De eerste is monouridylatie
00:05:09.21 -- dit wordt bemiddeld door TUT7 en TUT4,
00:05:13.25 en monouridylatie bevordert de verwerking van Dicer,
00:05:18.28 dus, in deze context TUtases
00:05:24.09 bevordert de biogenese van let-7,
00:05:27.12 die dienst doet als biogenesefactor.
00:05:29.14 Maar dit is het geval van gedifferentieerde somatische cellen,
00:05:34.03 maar in embryonale cellen en kanker,
00:05:36.28 wordt een RNA-bindend eiwit genaamd Lin28 tot expressie gebracht,
00:05:44.21 en het bindt aan pre-let-7
00:05:47.08 en interageert met TUTases
00:05:50.18 om oligouridylatie te induceren.
00:05:53.09 Dus, nu, de lange U-staart
00:05:56.15 remt de verwerking van Dicer,
00:05:59.09 en bevordert verder het verval van het RNA.
00:06:03.19 Dus, in deze situatie,
00:06:09.07 TUtases, dezelfde enzymen,
00:06:11.11 kunnen dienen als negatieve regulatoren.
00:06:13.21 Er is dus een functionele dualiteit in uridylatie,
00:06:17.22 afhankelijk van de lengte van de geuridyleerde staarten
00:06:22.05 en de context van RNA en celtypes.
00:06:28.29 Door dit te doen, Lin28 en TUtases
00:06:35.07 kan zorgen voor een moleculaire schakelaar in de ontwikkeling
00:06:37.22 en pathologische overgangen,
00:06:40.05 zoals bij kanker.
00:06:41.28 Het tweede voorbeeld is:
00:06:46.21 adenylering van volwassen miRNA's.
00:06:48.27 In deze Northern blotting van Drosophila-eieren en embryo's,
00:06:55.03 kun je enkele heterogene miRNA-populaties vinden,
00:06:59.26 wat adenylatie van volwassen miRNA's aangeeft.
00:07:04.00 Deze geadenyleerde isovormen
00:07:07.15 verdwijnen wanneer het embryo zich verplaatst naar
00:07:11.07 zijn ontwikkelingsstadium.
00:07:14.00 Later bleek dat hetzelfde patroon wordt waargenomen bij andere diersoorten,
00:07:23.03 zoals in zee-egels en muis,
00:07:27.14 wat suggereert dat dit een geconserveerd mechanisme is.
00:07:31.05 Later ontdekten we dat een enzym genaamd Wispy,
00:07:35.11 een niet-canonieke poly (A) polymerase,
00:07:38.22 wordt specifiek uitgedrukt in eieren
00:07:41.06 en induceert miRNA-adenylatie.
00:07:44.20 Dit is een mutant van het Wispy-gen
00:07:47.06 en hier hopen miRNA's zich op als een ongewijzigde vorm.
00:07:55.18 Dus we vonden die miRNA's
00:07:58.14 worden dynamisch gecontroleerd tijdens late oögenese
00:08:02.01 en vroege embryogenese.
00:08:04.23 Maternale miRNA's worden gedeponeerd
00:08:07.18 en dan worden ze snel afgebroken tijdens de ontwikkeling,
00:08:12.04 terwijl de zygotische miRNA's
00:08:16.03 worden geïnduceerd uit het zygotische genoom
00:08:18.11 om de bevolking te vervangen.
00:08:21.11 Het mechanisme dat aan deze verordening ten grondslag ligt
00:08:24.12 wordt gereguleerd door Wispy,
00:08:27.20 die miRNA adenyleert om snel verval te induceren.
00:08:34.08 Dus, piekerige gemedieerde adenylatie
00:08:37.07 kan bijdragen aan de klaring van maternale miRNA's
00:08:41.06 tijdens deze interessante, dynamische ontwikkelingsovergangsperiode.
00:08:48.05 Dus ik heb je tot nu toe uitgelegd,
00:08:50.24 in dierlijke systemen,
00:08:53.07 er is zowel uridylatie als adenylatie
00:08:56.11 die het lot van een bepaalde groep miRNA's bepalen
00:09:00.15 in specifieke celtypen
00:09:02.25 en ontwikkelingsvoorwaarden.
00:09:05.08 Dus, doorgaan naar andere paden.
00:09:15.13 Van mRNA's is ook bekend dat ze staarten hebben, canonieke poly(A)-staarten,
00:09:19.01 maar we waren benieuwd of die er is
00:09:27.09 alle andere soorten niet-canonieke staarten op mRNA's.
00:09:29.27 We waren ook benieuwd of we het konden onderzoeken
00:09:34.11 de functie van deze staarten
00:09:37.24 door poly(A) staartlengte te meten op de genomische schaal
00:09:40.28 en met hoge resolutie.
00:09:43.16 De andere methoden, zoals Northern blotting en microarray,
00:09:47.29 zijn ontwikkeld,
00:09:50.10 maar de resolutie en de schaal waren niet goed genoeg
00:09:53.29 om effectief naar het transcriptoom te kijken.
00:10:00.01 Dus ontwikkelden we een techniek genaamd TAIL-seq,
00:10:05.14 dat is om het 3'-terminoom te sequencen.
00:10:08.03 Om je even het protocol uit te leggen,
00:10:11.27 totale RNA's waren verrijkt met mRNA
00:10:17,00 door fractionering op grootte en uitputting van ribosomaal RNA.
00:10:22.16 Dit was geligeerd aan de 3'-adapter
00:10:25.09 die biotineresten bevat
00:10:28.26 zodat, na gedeeltelijke vertering,
00:10:31.06 we kunnen het 3'-meeste fragment naar beneden halen
00:10:34.21 door streptavidine-parels te gebruiken.
00:10:38.23 Het fragment werd vervolgens geligeerd
00:10:42.12 naar een 5'-adapter en verder versterkt door RT-PCR,
00:10:49.03 en we hebben gepaarde sequencing uitgevoerd
00:10:52.05 om 51 nucleotiden te krijgen van Read 1
00:10:58.23 en 251 nucleotiden van Read 2.
00:11:02.00 Read 1 wordt gebruikt om het RNA in kaart te brengen,
00:11:06.18 om de identiteit van het transcript te krijgen,
00:11:09.29 en Read 2 wordt gebruikt om te bepalen:
00:11:13.25 de staartsequenties.
00:11:16.13 Met deze methode konden we precies bepalen:
00:11:22.21 de allerlaatste sequenties van de RNA's,
00:11:25.19 maar een uitdaging die we hadden was,
00:11:29.01 vanwege de homopolymere aard van poly(A)-staarten,
00:11:32.23 als je diep in de staart gaat,
00:11:36.07 de sequencing-kwaliteit wordt echt slecht,
00:11:40.25 dus het was erg moeilijk om de sequenties goed te krijgen.
00:11:44.23 Om het probleem op te lossen,
00:11:47.00 we verzamelden de fluorescerende signalen
00:11:50.01 rechtstreeks van de sequentiereactie
00:11:52.27 en keek naar de beelden van de sequencer,
00:11:56.17 merkte op dat er een overgang is
00:12:00.07 tussen poly(A) sequenties
00:12:03.20 en niet-poly(A) sequenties.
00:12:05.25 En we kunnen de informatie omzetten
00:12:08.22 om het relatieve T-signaal te berekenen,
00:12:11.18 en het gaf ons de mogelijkheid
00:12:17.06 om de status van de reeks te bepalen
00:12:21.03 om te coderen voor de poly(A) staartlengte.
00:12:25.04 Dus we konden nauwkeurig meten,
00:12:29.17 de poly(A)-staartlengte van mRNA's.
00:12:33.24 Dus dit was best handig,
00:12:35.23 en ik zal u enkele voorbeelden van TAIL-seq-lezingen laten zien.
00:12:39.17 Dit zijn de willekeurige waarden die overeenkomen met het p53-mRNA.
00:12:45.07 Zoals ik al zei, dit is een sequencing aan het einde,
00:12:49.08 dus van Read 1, dat in blauw wordt weergegeven,
00:12:52.25 worden gebruikt om de identiteit van het transcript te achterhalen,
00:12:58.19 en dan wordt Read 2 gebruikt om
00:13:02.29 learn about the sequences of the tail.
00:13:06.12 From this dataset,
00:13:09.01 we could determine precisely
00:13:13.08 the poly(A) tail length of the mRNA.
00:13:15.19 In addition, we could of course look at
00:13:20.14 the 3' end of the RNA
00:13:23.16 to find some interesting terminal modifications,
00:13:26.00 such as uridylation and even guanylation.
00:13:31.07 So, TAIL-seq is very useful
00:13:34.23 in studying the regulation of poly(A) tails.
00:13:38.09 Shown here is an example
00:13:42.15 -- it's the TAIL-seq data from total cell lysate
00:13:45.19 and PABP immunoprecipitate.
00:13:48.15 PABPC1 is a poly(A) binding protein.
00:13:52.03 On the x axis you have poly(A) tail length
00:13:56.06 and on the y axis you can see the fraction of reads.
00:14:00.20 This is a duplicated experiment
00:14:03.18 and you can see that input -- or total cell lysate --
00:14:08.26 gives a very reproducible result.
00:14:12.19 And from this distribution
00:14:18.05 you can learn that the median poly(A) length
00:14:22.26 is typically between 60-100 nucleotides
00:14:26.10 in mammalian messenger RNAs,
00:14:28.27 which is shorter than previously anticipated.
00:14:33.23 You can also learn that PABP, as you would expect,
00:14:42.26 binds preferentially to long poly(A) tails.
00:14:46.05 PABP is known to span 25 nucleotides,
00:14:50.23 so, on average, a poly(A) tail
00:14:54.11 can accommodate only 2-4 PABP molecules.
00:14:58.06 You can also use this technique
00:15:05.04 to study the 3' end modification of mRNA.
00:15:08.16 For instance, you can study uridylation of mRNA.
00:15:12.19 We were actually quite surprised to see
00:15:16.04 such widespread distribution of uridylation
00:15:20.02 on mammalian mRNAs.
00:15:21.27 This suggests that,
00:15:25.14 perhaps, uridylation is an integral part of the mRNA life cycle,
00:15:30.21 and even though mRNA uridylation
00:15:33.28 was observed in some individual mRNAs
00:15:36.16 from fungi and plants before,
00:15:41.04 this study collectively indicates that
00:15:47.10 this process may be preserved in eukaryotes.
00:15:51.17 To find out the function of uridylation,
00:15:56.05 we searched for the enzymes that are responsible for uridylation
00:16:01.01 and found that TUTases 4 and 7 mediate mRNA uridylation.
00:16:07.25 If you knock down TUTase 4 and 7 in HeLa cells
00:16:14.27 and carry out a TAIL-seq experiment,
00:16:19.14 uridylation frequency is reduced substantially,
00:16:22.29 particular the oligo-U tails.
00:16:27.12 So, what's the functional consequence of these enzymes?
00:16:34.06 To find out, we knocked down TUTase 4 and 7
00:16:38.26 and treated the cells with actinomycin D
00:16:44.01 and carried out an RNA-seq experiment
00:16:48.03 to measure the stability of mRNAs.
00:16:49.27 And we found that,
00:16:53.13 compared to control,
00:16:56.04 in TUT4 and 7 depleted cells,
00:16:59.09 the half-lives of mRNAs were globally increased,
00:17:02.17 indicating that TUTase 4 and 7 facilitate mRNA decay.
00:17:13.04 So, our study told us that
00:17:16.21 oligo-U tails serve as a decay mark for mRNAs,
00:17:21.13 as well as for pre-miRNAs.
00:17:24.08 To explain to you how messenger RNAs
00:17:27.28 are degraded in mammalian cells,
00:17:31.19 the active mRNA has a long poly(A) tail
00:17:36.04 that is bound to poly(A) binding protein,
00:17:39.12 but after the adenylation
00:17:43.20 the poly(A) tail gets shortened.
00:17:46.18 When it is below about 25 nucleotides,
00:17:49.20 PABP cannot bind to this mRNA any longer,
00:17:54.14 and this leads to the recruitment of decay factors.
00:18:03.00 It is known that this can happen in 5'-to-3' orientation
00:18:07.07 and 3'-to-5' orientation.
00:18:11.03 Our study shows that this can be facilitated
00:18:16.07 when TUTase 4 and 7
00:18:20.00 recognizes that adenylated mRNA
00:18:23.06 and uridylates the tail,
00:18:25.15 which recruits the decay factors more rapidly.
00:18:33.12 So, that was the role of uridylation
00:18:38.14 in the context of the mRNA pathway.
00:18:42.10 So, to wrap up this talk,
00:18:44.27 we have found that
00:18:49.20 tailing can provide important layers of gene regulation.
00:18:54.01 And tails can actually come in more than one flavor
00:18:59.14 -- not only canonical poly(A) tails,
00:19:02.13 but also noncanonical A tails, or U tails, or G tails.
00:19:09.18 And we have shown that noncanonical A tails
00:19:15.07 can destabilize maternal microRNAs.
00:19:18.10 And U tails can be used in various ways.
00:19:23.08 Oligo-U tail, in particular,
00:19:25.25 serves as a general decay mark
00:19:28.29 for both microRNA pathways and mRNA pathways.
00:19:33.23 With that, I would like to thank
00:19:36.29 all previous and present members of my lab,
00:19:40.22 but I would like to especially point out
00:19:45.25 Inha Heo, Chirlmin Joo, and Minju Ha
00:19:48.00 for the microRNA uridylation study
00:19:50.25 and Mihye Lee and Yeon Choi
00:19:53.24 for the microRNA adenylation study.
00:19:56.17 And mRNA tailing was studied
00:20:00.15 mainly by Hyeshik Chang, Jaechul Lim, and Minju Ha.
00:20:03.21 I also appreciate the help from our collaborators,
00:20:07.02 especially Dinshaw Partel's lab
00:20:11.04 and the funding from Institute for Basic Science.
00:20:16.01 Thank you very much for your attention.

  • Part 1: Biogenesis and Regulation of microRNA

Developmental conservation of microRNA gene localization at the nuclear periphery

microRNAs are of vital importance for the regulation of the adaptive and innate immune responses, modulating gene expression at the post transcriptional level. Although there is cumulative information regarding the steady state mature microRNA levels and their respective targets, little is known about the effect of the three-dimensional chromatin architecture on the transcriptional regulation of microRNA gene loci. Here, we sought to investigate the effect of subnuclear localization on the transcriptional activation of eight murine microRNA loci in the immune system. Our results show that microRNA genes display a preferential monoallelic gene expression profile accompanied with perinuclear localization irrespectively of their transcription status or differentiation state. The expression profile and perinuclear localization are developmentally conserved while microRNA gene loci localization outside constitutive lamin associated domains is cross-species conserved. Our findings provide support for an active nuclear periphery and its role in chromatin organization of the non-coding genome.

Belangenconflict verklaring

De auteurs hebben verklaard dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Figuren

Fig 1. Allelic expression profile analysis of…

Fig 1. Allelic expression profile analysis of microRNA gene loci reveals their preferential monoallelic expression…

Fig 2. microRNA gene loci are localized…

Fig 2. microRNA gene loci are localized in the cell nuclear periphery.

Fig 3. The perinuclear localization of microRNA…

Fig 3. The perinuclear localization of microRNA gene loci is independent of their transcriptional activity.

Fig 4. Perinuclear localization of microRNA gene…

Fig 4. Perinuclear localization of microRNA gene loci in Bach1 -/- thymocytes and BMDMs.

Fig 5. The perinuclear localization of microRNA…

Fig 5. The perinuclear localization of microRNA gene loci is developmentally conserved.


Abstract

A class of small, non-coding transcripts called microRNAs (miRNAs) that provide a crucial and pervasive layer of post-transcriptional gene regulation has recently emerged and become the focus of intense research. miRNAs are abundant in the nervous system, where they have key roles in development and are likely to be important mediators of plasticity. A highly conserved pathway of miRNA biogenesis is closely linked to the transport and translatability of mRNAs in neurons. Although there are nearly 500 known human miRNA sequences, each of only ∼ 21 nucleotides, which bind to multiple mRNA targets, the accurate prediction of miRNA targets seems to lie just beyond our grasp. Nevertheless, the identification of such targets promises to provide new insights into many facets of neuronal function.


Future perspectives

Gene expression, a quantitative and complex trait, has been extensively studied during the past few years, especially using the human cell line models and the HapMap genotypic data (53). Genetic variants like SNPs and CNVs have been found to contribute substantially to gene expression variation (57-63). Defining the roles of miRNAs in gene expression regulation, however, still have many important hurdles to cross. Before we could comprehensively understand the role of miRNAs in inflammatory lung disease, some basic research studies on their role in gene regulation (e.g., building a systematic and more reliable catalogue of miRNA gene targets) will prove to be critical and benefit the research community. For example, due to cost and efficiency, current miRNA target identification still relies largely on computational algorithms (e.g., miRanda used by the miRBase (71, 74), TargetScan (114, 115), PicTar (116)) that aim to take advantage of the biochemical/thermodynamic properties of the sequences of miRNAs and their gene targets. Although successful to some extent, the prediction results of these computational methods are generally uncorrelated and their predictions are often not supported by each other or by experimental evidence (117) such as those in TarBase (118) (a manually curated database of experimentally supported miRNA targets). Understandably, an approach that aims to integrate these different computational algorithms and/or genome-wide miRNA/mRNA expression data such as ExprTarget (http://www.scandb.org/apps/microrna/) (105), therefore, could have the potential to generate a more reliable and comprehensive catalogue of the gene targets regulated by miRNAs, thus benefiting the studies on their role in other biological processes and physiological pathways. For instance, it is expected that pathway analysis on a more reliable and comprehensive list of gene targets of differentially expressed miRNAs between patient samples and normal controls could help construct a more precise model for the mechanisms of ALI susceptibility.

Since significant gene expression variation have been observed between human populations (60-63), studying the role of miRNAs in regulating population differences in gene expression would provide novel insights in health disparities such as the higher mortality rate in ALI (as well as sepsis) in African Americans and Hispanics in the United States (13). Although socioeconomic status could significantly affect health disparities, notably, genes related to immune response to bacterial infection (e.g., genes in inflammatory pathways such as CCR7, chemokine receptor 7 and CXCR3, chemokine receptor 3) were found to be enriched among the differentially expressed genes between the cell lines derived from individuals of African and European ancestry (60, 119). Previous studies attempted to illustrate the contribution of SNPs and CNVs to population-level gene expression variation (60-63), similarly, it would be interesting to investigate the contribution of miRNAs to differential gene expression between populations as well, thus helping explain the observed racial difference in diseases including ALI. In addition, expression variation in some genes has also been observed between males and females using the cell line models (120, 121). Although genetics does not appear to affect gender-specific gene expression as males and females have the same autosomal genetic background, the contribution of miRNAs to gender-specific gene expression has not yet been studied. Therefore, it would be important to illustrate the role of miRNAs in defining gender-specific gene expression for the purpose of understanding the gender differences in inflammatory lung disease (e.g., gender differences in ARDS mortality rate (13)).

Because of the early stage of research, the current studies on the relationships between miRNAs and ALI/ARDS and VILI have been largely relied on animal models. No doubt, results derived from animal models can guide further investigations on patient samples and future translational research, the interpretation of these results, however, needs to be cautious as not all results from animal models are relevant to humans. Therefore, expanding the current studies to human cell lines, tissues and ultimately human subjects would provide direct evidence to the role of miRNAs in the development of inflammatory lung disease.

Since miRNA expression is believed to be a dynamic process in cells, future experimental techniques that may monitor the longitudinal changes of miRNAs in vitro of in vivo and their interactions with changing cellular environment could provide unprecedented picture of the critical role of miRNAs in gene regulation and disease development. Finally, to construct a most comprehensive model for complex diseases such as ALI presents the challenges for integrating all kinds of data on the phenotypes or traits (e.g., gene expression, SNPs, CNVs, DNA methylation). MiRNAs will be critical components in our complete understanding of the mechanism and genetic networks of inflammatory lung disease. Though with some promising evidence so far, before they can be applied in the daily management of ALI, the potential of miRNAs to be novel therapeutic targets as well as biomarkers for ALI should also be continuously investigated.


MicroRNA: A Master Regulator of Cellular Processes for Bioengineering Systems

microRNAs (miRNAs) are small RNAs 18 to 24 nucleotides in length that serve the pivotal function of regulating gene expression. Instead of being translated into proteins, the mature single-stranded miRNA binds to messenger RNAs (mRNAs) to interfere with the translational process. It is estimated that whereas only 1% of the genomic transcripts in mammalian cells encode miRNA, nearly one-third of the encoded genes are regulated by miRNA. Various bioinformatics databases, tools, and algorithms have been developed to predict the sequences of miRNAs and their target genes. In combination with the in silico approaches in systems biology, experimental studies on miRNA provide a new bioengineering approach for understanding the mechanism of fine-tuning gene regulation. This review aims to provide state-of-the-art information on this important mechanism of gene regulation for researchers working in biomedical engineering and related fields. Particular emphases are placed on summarizing the current tools and strategies for miRNA study from a bioengineering perspective and the possible applications of miRNAs (such as antagomirs and miRNA sponges) in biomedical engineering research.