Informatie

Eiwitten die geen biofilm kunnen vormen?


Ik probeer een machine learning-trainingsset te bouwen voor bacteriële eiwitsequenties die biofilm vormen, en dat kan niet. Ik heb de positieve reeksen verzameld van de GO-ontologiewebsite, maar voor negatieve reeksen weet ik niet zeker welke reeksen ik in mijn trainingsset moet opnemen.

Kan iemand mij wijzen op bronnen voor eiwitsequenties waarvan bekend is dat ze geen biofilms kunnen vormen?


Intracellulaire eiwitten kunnen geen biofilms vormen. Bovendien bevatten veel (maar niet alle) extracellulaire eiwitten een N-terminale splitsbare signaalsequentie.


Lori (1992) Determinanten van extracellulaire eiwitsecretie in Gram-negatieve bacteriën. J Bacteriol 174: 3423-3428. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1592799

Schneewind & Missiakas (2012) Eiwitafscheiding en oppervlakteweergave in Gram-positieve bacteriën. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 367:1123-1139. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22411983


Bacteriofagen en biofilms

Biofilms zijn een extreem veel voorkomende aanpassing, waardoor bacteriën vijandige omgevingen kunnen koloniseren. Ze vormen unieke problemen voor antibiotica en biociden, zowel vanwege de aard van de extracellulaire matrix als vanwege de aanwezigheid in de biofilm van metabolisch inactieve persistente cellen. Dergelijke chemicaliën kunnen zeer effectief zijn tegen planktonische bacteriële cellen, terwijl ze in wezen ineffectief zijn tegen biofilms. Daarentegen lijken bacteriofagen een groter vermogen te hebben om deze veel voorkomende vorm van bacteriegroei aan te pakken. Het grote aantal bacteriën dat aanwezig is in biofilms vergemakkelijken de werking van bacteriofagen door een snelle en efficiënte infectie van de gastheer en de daaruit voortvloeiende amplificatie van de bacteriofaag mogelijk te maken. Bacteriofagen hebben ook een aantal eigenschappen die biofilms vatbaar maken voor hun werking. Het is bekend dat ze enzymen produceren (of kunnen induceren) die de extracellulaire matrix afbreken. Ze zijn ook in staat om persisterende cellen te infecteren, daarin slapend te blijven, maar opnieuw te activeren wanneer ze metabolisch actief worden. Sommige gekweekte biofilms lijken ook beter in staat om de replicatie van bacteriofagen te ondersteunen dan vergelijkbare planktonische systemen. Het is misschien niet verrassend dat bacteriofagen, als natuurlijke vijanden van bacteriën, het vermogen hebben om zich op deze veel voorkomende vorm van bacterieel leven te richten.


Abstract

De micro-organismen in biofilms leven in een zelfgeproduceerde matrix van gehydrateerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) die hun directe omgeving vormen. EPS zijn voornamelijk polysachariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden. Ze zorgen voor de mechanische stabiliteit van biofilms, bemiddelen hun hechting aan oppervlakken en vormen een samenhangend, driedimensionaal polymeernetwerk dat biofilmcellen met elkaar verbindt en tijdelijk immobiliseert. Bovendien fungeert de biofilmmatrix als een extern spijsverteringssysteem door extracellulaire enzymen dicht bij de cellen te houden, waardoor ze opgeloste, colloïdale en vaste biopolymeren kunnen metaboliseren. Hier beschrijven we de functies, eigenschappen en bestanddelen van de EPS-matrix die biofilms tot de meest succesvolle vormen van leven op aarde maken.


KWANTITATIEVE KARAKTERISERINGSMETHODEN

Een van de meest elementaire en meest verworven soorten bacteriële metingen, of het nu in plankton- of biofilmculturen is, is de bepaling van hoeveel aanwezig is. Er zijn verschillende directe en indirecte methoden gebruikt om cellen in biofilms te kwantificeren. Directe telmethoden maken telling mogelijk van cellen die kunnen worden gekweekt, waaronder plaattellingen, microscopische celtellingen, Coulter-celtelling, flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie. Indirecte meetmethoden omvatten de bepaling van de droge massa, totale organische koolstof, microtiterplaat-assays, ATP-bioluminescentie, totaal eiwit en kwartskristalmicrobalans. Opgemerkt moet worden dat veel methoden, zowel direct als indirect, homogenisatie van de biofilm inhouden om cellen in een vloeibaar medium te dispergeren voorafgaand aan analyse via een in de handel verkrijgbare homogenisator en vortexmenging [16�].

Directe kwantificatiemethoden

Directe methoden voor kwantificering van biofilms zijn methoden die afhankelijk zijn van directe observatie voor kwantificering van de gewenste parameter (aantal cellen, totaal biofilmvolume, enz.). Beeldvorming en geautomatiseerde celtelling zijn de meest gebruikelijke methoden voor het kwantificeren van biofilms. Bovendien maakt het gebruik van vlekken of fluorescerende markers, om cellen van belang nauwkeuriger te identificeren en te onderscheiden van cultuurresten, een eenvoudigere en grotere nauwkeurigheid van het tellen van cellen en gegevensinterpretatie mogelijk. Beeldvormingsmethoden, waaronder licht- en confocale microscopie, bieden handmatige platforms om cellen te tellen en het totale biofilmvolume te bepalen. Instrumenten die flow bevatten, zoals geautomatiseerde celtellers en flowcytometers, bieden gemechaniseerde methoden. Deze verschillende directe methoden zullen in volgende paragrafen worden beschreven.

Bepaling van het aantal levensvatbare cellen door het aantal platen (kolonievormende eenheden/ml of CFU's)

Levensvatbare celtelling, ook wel CFU/ml-assay of aerobe plaattelling genoemd, is een standaard kwantificatiemethode die wordt gebruikt om het aantal levensvatbare cellen te bepalen [19�]. Het basisconcept van deze test is om de individuele cellen op een agarplaat te scheiden en kolonies van cellen te laten groeien, waardoor het leven van dode cellen wordt onderscheiden en de levende cellen worden gekwantificeerd zonder de hulp van kleurstoffen of instrumentatie. De procedure begint met een vloeibare planktoncultuur of een volwassen biofilm die wordt gesuspendeerd en gehomogeniseerd in vloeibaar medium via schrapen, vortexen of soniceren. De plateringsmethode omvat de aseptische verwijdering van aliquots van de gesuspendeerde biofilm, gevolgd door seriële verdunning en plateren op voedingsstofhoudende agar. Nadat de incubatie is voltooid (meestal 24 uur), worden de kolonies op de platen geteld en wordt het aantal cellen per milliliter (cfu/ml) in de oorspronkelijke kweek berekend met behulp van de gemiddelde kolonietellingen, het volume van de uitgeplaate kweek en de verdunningsfactor van de gesuspendeerde biofilm naar de plaat. Als de hoeveelheid biofilm klein is, zoals kan worden verzameld uit een kweekplaat met 96 putjes, kan het aantal cellen onvoldoende zijn om met deze methode een significant verschil in kolonienummer te bepalen. Om het aantal cellen voor het tellen van kolonies te vergroten, kan de biofilm van elk monster in een bepaald volume steriel vloeibaar medium worden gesuspendeerd en onder schudden bij een geschikte temperatuur worden gekweekt (bijv. 37 ° C bij 180 rpm). Het is belangrijk om de incubatietijd te noteren en deze uniform te houden om elke cultuur met dezelfde hoeveelheid uit te breiden. Het is raadzaam om een ​​experimentcontrole te hebben die geen behandeling heeft gekregen wanneer een kweekuitbreiding wordt uitgevoerd, aangezien de uiteindelijke telling relatief zal zijn en baat kan hebben bij normalisatie van de uiteindelijke telling. Bij het werken met een gemengde cultuur is het goed om op te merken dat bacteriën zich met verschillende snelheden vermenigvuldigen. Daarom is de kweekuitbreiding mogelijk niet geschikt omdat het de verhouding van cellen uit de oorspronkelijke biofilm zal verstoren. Bovendien moet de aandacht voor de kolonievormende incubatietijd mogelijk worden verlengd om plaats te bieden aan langzame kolonievormende bacteriën [20]. Telling is een bijzonder nuttige kwantificeringsmethode in zuivere culturen, aangezien de optische dichtheid (OD) kan worden gemeten voorafgaand aan het plateren om een ​​kalibratiecurve te verkrijgen die wordt gebruikt om het celaantal en de absorptie te correleren. Daardoor kan in toekomstige experimenten de absorptie van een monster met een onbekend aantal cellen worden gemeten om de celconcentratie te bepalen [22,23].

De CFU-techniek vereist doorgaans geen zeer gespecialiseerde of geavanceerde apparatuur en kan in de meeste laboratoriumsituaties worden uitgevoerd door getrainde personen. Het verkrijgen van consistente resultaten vereist enige oefening met plating en mediavoorbereiding. Een belangrijke overweging bij het kiezen van deze methode is dat alleen levende cellen die een kolonie kunnen vormen, worden geteld. Het is echter mogelijk dat deze techniek niet in alle situaties de voorkeur heeft, omdat het tijdrovend en arbeidsintensief is en soms dagen nodig heeft om voldoende herhalingen uit te voeren om reproduceerbare resultaten te verkrijgen [24]. Bovendien, aangezien de biofilm moet worden gesuspendeerd, kunnen er fouten optreden als gevolg van bacteriële klontering en als antimicrobiële behandeling werd gebruikt, kan overdracht optreden. Deze techniek is ook kwetsbaar voor telfouten en gebruikersbias, vooral wanneer het opgegeven aantal kolonies hoog is en/of de telling handmatig wordt gedaan, maar deze fout kan worden verzacht door het gebruik van handmatige kolonietellers (zoals ImageJ).

Op flow gebaseerde celtelling

Een meer geautomatiseerde manier om cellen te tellen is een paar methoden waarbij cellen in vloeibare cultuur door nauwe openingen stromen en worden gemeten terwijl ze passeren. Coulter-telling en flowcytometrie vereisen beide dat de biofilm wordt gehomogeniseerd en in vloeibare culturen wordt gesuspendeerd. Hoewel Coulter-tellers minder duur zijn, levert flowcytometrie mogelijk meer informatie over cellen op tijdens de meting.

De Coulter-methode houdt in dat geladen deeltjes in een elektrolytoplossing door een opening worden geleid die deel uitmaakt van een elektrisch circuit [25,26]. De aanwezigheid van het deeltje verandert de impedantie van het circuit en wordt geregistreerd als een verandering in spanning. De verandering in spanning is gecorreleerd aan de deeltjesgrootte, waardoor de techniek individuele bacteriële cellen kan onderscheiden. De spanningspulsen worden dan over een tijdsperiode geteld en gecorreleerd met het aantal cellen. Deze methode vereist een Coulter Counter-instrument, dat meestal duizenden dollars kost. Deze techniek is heel eenvoudig, maar kan helaas geen onderscheid maken tussen levende en dode cellen.

Een andere stroomtelmethode maakt gebruik van een stroomcytometer [16,27]. Bij deze techniek stromen cellen door een nauwe opening, waardoor ze door een enkel bestand gaan. Een laser wordt gebruikt om de cellen te detecteren terwijl ze passeren via verstrooiing, absorptie of intrinsieke en extrinsieke fluorescentiemetingen. De grote voordelen van flowcytometrie zijn de snelheid, eenvoud en nauwkeurigheid van metingen. Veel aanvullende informatie over de cellen, inclusief de celafmetingen en oppervlakte-eigenschappen, metabolische activiteit en de differentiatietoestand van de cellen, kan gelijktijdig worden verzameld met behulp van deze methode met extra celkleuring of endogene fluorescerende tags (zoals GFP) [28] . Het belangrijkste nadeel van deze methode zijn de aanzienlijke initiële kosten van het instrument, die in veel laboratoria niet vaak worden aangetroffen en doorgaans tussen $ 50.000 en $ 02013100.000 kosten. Het is ook belangrijk op te merken dat niet alle flowcytometers het volume registreren, maar gericht zijn op het aantal gebeurtenissen, daarom kunnen niet alle instrumenten een celgetal per volume-eenheid opleveren.

Licht- en fluorescentiemicroscopie

Celtelling en biofilm 3D-karakterisering kan worden bereikt met behulp van verschillende microscopiemethoden, variërend van eenvoudige lichtmicroscopie van gesuspendeerde biofilms tot volume- en morfologiemetingen van aangehechte biofilms met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM). In deze subsectie zullen we verschillende methoden beschrijven voor het kwantificeren van biofilm, van celtelling tot totaal biofilmvolume, met behulp van microscopie. Verder hebben we een korte handleiding met veelvoorkomende hulpmiddelen voor het introduceren van fluorescentie in monsters voor analyse.

Samengestelde licht- en fluorescentiemicroscopen

Structuren, zo klein als bacteriële cellen, kunnen worden gevisualiseerd door een samengestelde lichtmicroscoop. Resolutie van typische bacteriële cellen, die 2𠄸 μm lang zijn, vereist een totale vergroting van 200x of meer. Contrastverbeteringsmethoden zoals fasecontrast of differentieel interferentiecontrast (DIC) kunnen de totale kwaliteit van de afbeeldingen verbeteren en cellen beter zichtbaar maken. De kosten van samengestelde lichtmicroscopen variëren van honderden tot tienduizenden dollars. Fluorescentiemicroscopie breidt de optische mogelijkheden van lichtmicroscopie uit tot intrinsieke of toegevoegde fluorescentielichtemissie, wat de informatie die met deze methode kan worden verzameld aanzienlijk vergroot [29]. Fluorescerende microscopen zijn uitgerust met een lamp met hoge intensiteit om fluorescerende moleculen te exciteren, en fluorescerende filters waarmee specifieke banden van excitatie- en emissielicht respectievelijk het monster en de waarnemer kunnen bereiken. De kosten van conventionele fluorescentiemicroscopen lopen in de tientallen tot honderdduizenden dollars, afhankelijk van de verfijning van het model en extra functies, zoals bevestigde camera en fluorescentiefilters, boven het beschikbare basismodel. De kosten van fluorescerende vlekken en verbruiksartikelen liggen in het bereik van tientallen tot honderden dollars.

Celtelling met behulp van microscopie kan worden gedaan in zeer onrijpe biofilms op hun plaats of op gehomogeniseerde / gesuspendeerde biofilms met een kamertelglaasje. Dit kan worden gedaan met ongekleurde cellen of gekleurde cellen, en met lichtmicroscopie of fluorescentiemicroscopie. Afbeeldingen van Pseudomonas aeruginosa biofilms gekleurd met kristalviolet op verschillende incubatietijden worden getoond in figuur 1. Met onrijpe biofilms (Figuur 1A), kunnen individuele cellen worden onderscheiden en geteld. Dit kan tijdrovend zijn, veel afbeeldingen vereisen voor reproduceerbaarheid en onderhevig zijn aan gebruikersbias, zoals vermeld bij het tellen van kolonies. Bovendien wordt in volwassen biofilms (Figuur 1D) een driedimensionale structuur gevormd die het tellen via beeldvorming nog ingewikkelder en moeilijker maakt.

Lichtmicroscopie van biofilms. Microscopie beelden van Pseudomonas aeruginosa (PA01) biofilmgroei in de tijd. Lichtmicroscopiebeelden tonen de morfologie van PA01-biofilmgroei in een weefselkweekplaat met volledige FAB-media gekleurd met kristalviolet op 1 (A), 3 (B), 6 (C) en 24 (D) uur na het zaaien in een statische cultuur . Hoewel lichtmicroscopie de visualisatie van biofilm in alle groeistadia mogelijk maakt, heeft het beperkingen aan het telvermogen, aangezien de 3D-structuur van de film zich in latere stadia begint te vormen, zoals kan worden waargenomen in deze afbeeldingen. Niet-gepubliceerde afbeeldingen door Christina Wilson aan de Doane University 2016.

Zodra een biofilm voorbij het vroege stadium groeit en een derde dimensie aanneemt, vereist handmatig tellen met een lichtmicroscoop homogenisatie en suspensie voor het tellen met een Petroff-Hausser kamertelglaasje. Dit zijn gespecialiseerde glazen microscoopglaasjes met een nauwkeurig gedefinieerd monstervolume en een geëtst tweedimensionaal raster op de bodem waarmee de celdichtheid (cellen/mL) van een zwevende biofilm kan worden bepaald [30�]. Na homogenisatie/suspensie worden de cellen vervolgens gevisualiseerd en handmatig geteld in elke rastersectie. De gemiddelde telling van verschillende roosters kan worden gebruikt om het aantal cellen in de oorspronkelijke suspensie te berekenen met het bekende vloeistofvolume over het rooster. Een mogelijke complicatie bij deze techniek is het potentieel voor beweeglijke cellen om tijdens de meting in verschillende rastersecties over te steken. Dit is echter gemakkelijk te verhelpen door een afbeelding van het raster te nemen en op de afbeelding te rekenen. Deze techniek kan worden beperkt door niet-representatieve monsters en het aangeboren onvermogen om levende cellen van dood te onderscheiden. Het gebruik van verschillende metabolische of selectief permeabele vlekken kan de zichtbaarheid van de cellen echter vergroten en levende van dode cellen onderscheiden om het tellen nauwkeuriger te maken. Deze techniek is eenvoudig, gemakkelijk te implementeren en goedkoop omdat er alleen een lichtmicroscoop voor nodig is, een standaardinstrument van celcultuurlaboratoria en een Petroff-Hausser-objectglaasje dat ongeveer $ 800 kost.

Bovendien kan analyse van het totale biofilmvolume en de morfologie, zodra een volwassen film is gevormd, belangrijke informatie opleveren over de constructie en morfologie van de biofilm zonder de fysieke structuur van de film te verstoren. Microscopie kan worden gebruikt om de totale oppervlaktedekking en het volume van een biofilm te bepalen of te schatten, inclusief de extracellulaire polymere matrix. De totale oppervlaktedekking van de biofilm kan bijvoorbeeld worden bepaald in (Figuur 1D). Bovendien kan, door de brandpuntshoogte van de microscoop te kalibreren, de diepte van de biofilmlaag worden gevonden door de hoogte van de bovenkant van de biofilm en de hoogte van het oppervlak waarop de biofilm is bevestigd te bepalen [33,34]. Een ander voorbeeld van het gebruik van fluorescentiemicroscopie om de totale biofilm te meten, wordt getoond in figuur 2, waarin het beeld van PA14 dat een Arabidopsis thaliana wortel wordt gebruikt om (Figuur 2A) de dikte van de biofilmlaag op de wortel te bepalen.

Fluorescerende microscopie van biofilms. Fluorescerende beelden van biofilms. (A) Samengevoegde fase en fluorescerend beeld van Arabidopsis thaliana wortels gekoloniseerd met EGFP dat PA14 tot expressie brengt. Overlays van fluorescentie (groen) en fasecontrast (grijs) beelden van A. thaliana wortels geïnfecteerd met PA14 worden getoond. Niet-gepubliceerde afbeelding door Cat Foster aan de Doane University 2014. (B) Confocale microscopie-afbeelding van Pseudomonas aeruginosa (PA14) biofilm. PA14 groei in vitro twee en zes uur na inoculatie onder stroomomstandigheden. Levensvatbare cellen zijn groen (EGFP) en dode cellen zijn rood (gekleurd met propidiumjodide). Confocaal zorgt voor de monitor van x- en y-vlak (middenpaneel) en z-as (onder- en rechterpaneel) om biofilmgroei te karakteriseren. Niet-gepubliceerde afbeelding door Barbara Clement van het Helmholtz Institute for Infectious Disease Research, Susanne Häussler Lab 2014.

Confocale scanning lasermicroscopie

Confocale laser scanning microscopie (CLSM) is een gespecialiseerde vorm van microscopie die hoge resolutie, scherpe beelden van biofilms in drie dimensies produceert [35�] . 3D-beeldvorming wordt mogelijk gemaakt omdat de confocale optica zich kan concentreren op een zeer klein volume in het monster terwijl licht van andere locaties wordt uitgesloten. Het focusgebied wordt over het monster gescand om 2-D 'slices' met hoge resolutie op verschillende hoogten te produceren die worden geassembleerd om een ​​definitief 3D-beeld te produceren (Figuur 2A). Bovendien kan confocale microscopie gebruik maken van enkele of meerdere excitatielasers om meerdere fluorescerende markers achtereenvolgens of gelijktijdig te bekijken [37]. De kosten van confocale microscopen variëren sterk, afhankelijk van de systeemconfiguratie, maar beginnen doorgaans bij honderdduizenden dollars bij het opstarten. Deze instrumenten vereisen ook ervaren en hoogopgeleide gebruikers voor nauwkeurige metingen en analyses. Bovendien kunnen de kosten die gepaard gaan met de aankoop van fluorescerende kleurstoffen en confocale compatibele media en containers in de honderden dollars lopen.

Fluorescerende kleurstoffen en eiwitten

Hoewel intrinsieke biomoleculen, zoals NADH en NAD(P)H of chlorofyl, die fluorescerende eigenschappen hebben, kunnen worden gebruikt in fluorescentiemicroscopie, worden fluorescerende kleurstoffen en eiwitten heel vaak gebruikt om fluorescentie in een te analyseren monster te introduceren. Fluorescerende kleurstoffen zijn vaak fluorescerende moleculen, bekend als fluoroforen, of biomoleculen die zijn verbonden met fluoroforen, die licht absorberen en uitzenden terwijl ze in de biologische structuur zijn opgenomen. Het uitgestraalde licht wordt gedetecteerd voor het genereren van afbeeldingen om biofilmkenmerken te analyseren, zoals ruimtelijke cellulaire levensvatbaarheid, vorm en functie gedurende de groei-/behandelingsperiode.Een andere optie voor het verkrijgen van celfluorescentie is om het organisme genetisch te modificeren om een ​​fluorescerend eiwit tot expressie te brengen. Hoewel deze opties de voorbereidingstijd verhogen, hetzij op methodeniveau (productie van een fluorescerende cel) of op monsterniveau (biofilmkleuring), is de aanvullende informatie vaak nuttig voor een beter begrip van cellulaire groei en leven in de biofilm [14,39]. Hier introduceren we enkele veelvoorkomende klassen van fluorescerende kleurstoffen en eiwitten die worden gebruikt voor de analyse van biofilms.

Er zijn veel in de handel verkrijgbare fluorescerende vlekken die nuttig zijn voor elke toepassing, waaronder fluorescerende microscopie, confocale microscopie en flowcytometrie. Deze omvatten aangeboren fluorescerende moleculen, fluoroforen verbonden met biomoleculen of moleculen met een fluorescerend derivaat. De vlekken zijn verkrijgbaar in verschillende emissiekleuren (rood, groen, oranje en violet) waarmee meerdere kleurstoffen op een enkel monster kunnen worden geanalyseerd. Lokalisatie van de vlekken in/op de cel hangt af van de chemische structuur of eigenschappen van het molecuul waaraan de fluorofoor is gehecht. Tabel 1 bevat een samenvatting van veelgebruikte kleurstoffen met informatie over cellulaire lokalisatie, of de kleurstof levensvatbaarheid aangeeft en referenties voor experimentplanning. DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dilactaat) is bijvoorbeeld een kleurstof die zeer selectief is voor nucleïnezuren die zich in de buurt van het DNA zullen lokaliseren, terwijl lipofiele kleurstoffen, zoals FM 4�, in het celmembraan achterblijven. Veel kleurstoffen geven informatie over de levensvatbaarheid, afhankelijk van de doorlaatbaarheid van het celmembraan, zoals SYTO 9 en propidiumjodide (PI), die beide fluoresceren in de aanwezigheid van nucleïnezuren, maar PI is niet doorlaatbaar voor celmembranen en zal geen vlekken maken op levende cellen, terwijl SYTO 9 vrij binnenkomt. levende cellen. Een ander mechanisme voor het labelen van levende cellen is dat van calceïnevlekken die celmembraandoorlatend en niet-fluorescerend zijn totdat ze worden omgezet in het fluorescerende derivaat via acetoxymethylesterhydrolyse door intracellulaire esterasen van de levende cellen [40]. Dit mechanisme heeft voordelen, aangezien de hydrolyse-afhankelijke fluorescentie ervoor zorgt dat calceïne in de extracellulaire vloeistof van de biofilm kan blijven bestaan ​​zonder interferentie te veroorzaken in het beeld-/kwantificatieproces, waardoor extra wasstappen overbodig zijn en de nauwkeurigheid wordt verbeterd.

Tafel 1

Overzichtstabel van veelvoorkomende fluorescerende vlekken die worden gebruikt voor biofilmkleuring.

NaamMobiele locatieMembraanpermeabiliteitLevensvatbaarheid (Levend/Dood/Beide)Verwijzing
DAPI (4′,6-Diamidino-2-fenylindol dilactaat)NucleïnezurenJaBeide[ 14 ]
FM-kleurstoffenCelmembraan lipidenJaBeide[ 170 ]
SYPRO Ruby Biofilm Matrix StainMatrix-eiwittenNeeBeide[ 171 ]
PropidiumjodideNucleïnezurenNeeDood[ 27 , 171 , 172 ]
SYTONucleïnezurenJaLive[ 27 , 116 , 172 ]
CalceinIntracellulaire ruimteJaLive[ 140 , 172 ]

Een andere manier om celfluorescentie te induceren is om vreemd DNA genetisch te manipuleren in de bacteriën, wat resulteert in de productie van fluorescerende genproducten. Dit wordt meestal uitgevoerd door introductie van een plasmide, een klein deel van vreemd DNA, hoewel opname van vreemd DNA in het bacteriële genoom nuttig kan zijn voor het volgen van genexpressie [41]. Groen fluorescerend eiwit (GFP) en variaties van GFP zoals verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP), wanneer geproduceerd door de cel, zorgt ervoor dat de cel groen fluoresceert, emissie tussen 400 en 600 nm, wanneer geëxciteerd door UV-licht, tussen 350 en 450 nm in gezonde cellulaire omstandigheden [41,42] . De resulterende emissie kan worden gebruikt om cellen te tellen en realtime biofilmaccumulatie te volgen [39]. Biofilms die GFP uitdrukken, kunnen alleen voor groen worden beoordeeld of in combinatie met andere fluorescerende vlekken zoals PI, zoals weergegeven in figuur 2A. In deze beelden, genomen twee uur en zes uur na inoculatie van de stroomcel, is de Pseudomonas aeruginosa (PA) biofilm bevat EGFP, daarom lijken levende cellen groen, terwijl PI uit de kweekmedia zich ophoopt in dode cellen die rood lijken. Genetische modificatie kan veel voordelen hebben in vergelijking met kleuring, waaronder relatieve stabiliteit tegen fotobleken en het vermogen om het plasmide door te geven aan dochterculturen, waardoor de modificatie in veel culturen behouden blijft, terwijl vlekken bij elk experiment opnieuw moeten worden geïntroduceerd. Gezien de kosten van vectoren en arbeid die gepaard gaan met het klonen van de cellen, heeft het creëren van het organisme echter meestal de voorkeur als fluorescentie-analyse vaak wordt gebruikt. Er zijn veel voordelen aan GFP omdat het een handige fluorescerende reporter is voor biofilmstudies en het lijkt de celgroei en -functie niet te verstoren. Er is nu een verscheidenheid aan gekleurde fluorescerende eiwitten beschikbaar, zoals Cyan Fluorescent Protein (CFP) en Yellow Fluorescent Protein (YFP), waarmee afzonderlijke labeling van cellen in co-cultuur of meervoudige labeling in een enkele cel mogelijk is [42,43]. Biofilms met GFP kunnen worden gevisualiseerd in vitro zoals in een stroomcel (Figuur 2A) of ter plaatse zoals de PA aan Arabidopsis thaliana wortels (Figuur 2B). Een mogelijk nadeel van veel, maar niet alle fluorescerende kleurstoffen en eiwitten, is het potentieel voor interferentie in de cellulaire processen, resulterend in toxiciteit of veranderingen in de cel die de mogelijke soorten karakterisering kunnen beperken. Klantenservice van leveranciers en eerdere literatuur kunnen nuttig advies geven om te begrijpen of de kleurstof geschikt is voor de gewenste gegevensverzameling en zorgen voor ongehinderde groei na gebruik.

Voordelen en nadelen van microscopie

Over het algemeen heeft microscopie het voordeel dat het fascinerende beelden produceert die direct kunnen worden gebruikt in publicaties of gekwantificeerd met behulp van beeldverwerkingssoftware. Afbeeldingen verbeteren vaak de leesbaarheid van publicaties en stellen de lezer in staat om de waarnemingen van de microscopist te interpreteren. Een groot voordeel van microscopie is het vermogen om biofilms kwantitatief te analyseren zonder de noodzaak van oogsten en resuspensie, waardoor de natuurlijke structuren behouden blijven [35,36,44]. Het gebruik van kleurstoffen en fluorescentie maakt het mogelijk om meer informatie te verkrijgen over de ruimtelijke en temporele cellulaire levensvatbaarheid en functie zonder vernietiging van de biofilm, hoewel introductie van fluorescentie ook de voorbereidingstijd verhoogt, hetzij op methodeniveau (het produceren van een fluorescerende cel) of op monsterniveau ( biofilmkleuring) [14,39] . Helaas is beeldselectie onderhevig aan vooroordelen, hoewel er maatregelen kunnen worden genomen om dit feit te verminderen. Willekeurige selectie van afbeeldingen of consistente selecties van afbeeldingslocatie tussen meerdere monsters zijn twee veelgebruikte technieken. Om statistische significantie uit analyse te verkrijgen, is bovendien een grote bibliotheek met afbeeldingen nodig, wat tijdrovend kan zijn. In het geval van fluorescerende beelden, moet er bij de planning van het experiment voor worden gezorgd dat de cellen consistent worden afgebeeld. Men moet het uitdoven van de fluorofoor of het bleken door foto's vermijden, die het gevolg zijn van blootstelling aan chemicaliën en licht, waardoor de fluorescentie van de fluorofoor wordt verminderd of geëlimineerd, wat kan leiden tot niet-representatieve resultaten. Als gegevensverzameling kwantificering van fluorescerende intensiteit omvat, moet er ook voor worden gezorgd dat alle instellingen uniform zijn in de bibliotheek met afbeeldingen. Het verzamelen en analyseren van afbeeldingen met software voor beeldanalyse, zoals open source ImageJ, is een veelgebruikte kwalitatieve en kwantitatieve karakteriseringsmethode [45,46].

Indirecte kwantificatiemethoden

Biofilmgroei kan vaak indirect worden bepaald met behulp van een proxy-marker die de hoeveelheid biofilm afleidt. Voorbeelden van deze markers omvatten droge massa, totaal eiwitgehalte, DNA, RNA, polysachariden of metabolieten. Indirecte kwantificeringsmethoden houden allemaal de basisveronderstelling in dat de te kwantificeren stof of eigenschap correleert met het aantal cellen, of dat de hoeveelheid eiwit/DNA/massa van cel tot cel consistent is. Deze aanname is gevalideerd voor biofilms, waardoor deze methoden buitengewoon nuttig zijn [47]. Het is de beste praktijk om indirecte methoden te verifiëren met directe methoden, aangezien ze slechts een proxy-kwantificering zijn op basis van de metabole functie en de productie van biomoleculen, die afhankelijk kunnen zijn van het organisme, de kweekomstandigheden en de leeftijd.

Droge massa

Droge massa, meestal uitgedrukt als massa per oppervlakte-eenheid, of biofilmdichtheid is een veelgebruikte marker die kan leiden tot snelle groeikwantificering. Om de droge massa te vinden, wordt de biofilm met groeisubstraat in een oven geplaatst op een constante temperatuur totdat het water is verwijderd en een constant gewicht is bereikt [48,49]. Als alternatief, als het substraat warmtegevoelig is, kan de biofilm van het oppervlak worden geschraapt, in fysiologische zoutoplossing worden gesuspendeerd, worden neergeslagen met koude ethanol en het neerslag wordt verzameld voor analyse [17]. De droogtemperatuur is afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker en de hittetolerantie van het substraat. Terwijl sommige onderzoekers bijvoorbeeld 60 ° C hebben gebruikt, hebben anderen 100 ° x02013105 ° C gebruikt, beide temperaturen met hun respectievelijke droogtijd zorgen voor volledige droging van het monster, maar werden gekozen op basis van de voorkeur van de onderzoeker op basis van specifieke aspecten van het betreffende experiment [ 47,48] . Het belangrijkste doel is om een ​​constante temperatuur en bijbehorende tijd te gebruiken om een ​​volledig droog monster te verkrijgen met minimale verstoring van de biofilm of het substraat. Na droging wordt het monster gewogen, de biomassa van het substraat geschraapt en het substraat gewogen. Droge biomassa is het verschil in gewicht tussen biomassa op het substraat en het substraat zonder biomassa. De droge biomassa wordt genormaliseerd naar het groeigebied van de natte biofilm voor de berekening van biomassa per oppervlakte-eenheid film of naar het natte biofilmvolume voor biofilmdichtheid [48,49].

Het nadeel van droge-massametingen is dat ze de celmassa niet differentiëren van verschillende filmcomponenten zoals de extracellulaire matrix. Het gebruik van deze methode is ook afhankelijk van het groeisubstraat aangezien het hittebestendig moet zijn bij de droogtemperatuur of gemakkelijk te scheiden is van de biofilm en wordt dus niet meegenomen in de biomassaberekening. Een ander nadeel van deze methode is dat het monster na droging niet voor andere karakteriseringsmethoden kan worden gebruikt. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn het relatieve gemak en de kosteneffectiviteit, aangezien er relatief weinig laboratoriumapparatuur voor nodig is, zoals een droogoven en een weegschaal, die standaard laboratoriumapparatuur zijn.

Totaal organische koolstof

Totaal organische koolstof (TOC) is een indirecte meting van de hoeveelheid koolstof in een monster geassocieerd met organische verbindingen of koolstofverbindingen afgeleid van levende wezens (eiwitten, lipiden, ureum, enz.). Dit in tegenstelling tot elementaire koolstof (EC), zoals grafiet of steenkool, en anorganische koolstof (IC), bestaande uit eenvoudige verbindingen, waaronder eenvoudige koolstofoxiden (CO en CO2), carbonaten, carbiden en cyaniden. De drie koolstofbronnen zijn te onderscheiden door verschillen in condities die nodig zijn voor afbraak tot CO2 van de verschillende koolstofverbindingen [50,51] . TOC-metingen worden vaak gebruikt om de waterkwaliteit in de omgeving te bepalen en voor het testen van de reinheid van instrumenten in de farmaceutische industrie, evenals voor het kwantificeren van de accumulatie van biofilm [52�].

De TOC-kwantificering van biofilms wordt meestal uitgevoerd als een proces in twee stappen waarin totale koolstof (TC) en IC worden gemeten en gebruikt om TOC te bepalen [55,56]. De biofilm wordt afgebroken en het IC wordt omgezet in CO2, typisch via verwarmde verzuring en gedetecteerd door infraroodspectroscopie. Vervolgens wordt alle koolstof in het monster omgezet in CO2, meestal via verhitte oxidatie, en de TC wordt gemeten. De TOC wordt dan afgeleid door het verschil tussen deze twee waarden (TOC = TC – IC) [55] . De exacte methode van monstervoorbereiding en kwantificering wordt bepaald met behulp van instrumenten zoals de Oceanic International Carbon Analyzer, Analytik Jena Multi N/C 2100S, of een UIC ingebouwd model CM5012 CO2 kleurmeter. De uiteindelijke berekening voor TOC is echter universeel en niet instrumentafhankelijk [54�] . Daarom zijn de belangrijkste kosten en nadelen van deze methode de kosten van een gespecialiseerd TOC-instrument, dat ongeveer $ 20K kost. Een ander nadeel is het gebrek aan specificiteit in kwantificering, aangezien TOC het koolstofgehalte van de gehele biofilm meet, inclusief de bacteriën en de extracellulaire polymere stoffen (EPS). Er bestaan ​​schattingsprotocollen voor het onderscheiden van koolstof van cellen en koolstof van EPS, waardoor dit nadeel wordt verholpen [55].

Hoewel TOC een marker biedt om de hoeveelheid aanwezige biofilm te kwantificeren, moet deze waarde worden gecorreleerd met behulp van een directe analysemethode (CFU's, celgetal, enz.) om een ​​methodeonafhankelijke waarde te genereren. Ook is aangetoond dat de hoeveelheid koolstof in een bepaald volume cellen afhankelijk is van de gezondheidsstatus van de bacteriën [53]. Er moeten dus aanvullende correlaties worden gemaakt onder elke reeks omstandigheden en er moet elke keer dat het experiment wordt uitgevoerd een nieuw standaardisatieprotocol of controle worden uitgevoerd.

Kristalviolet test

Gramkleuring is een van de meest gebruikte en goed geoptimaliseerde methoden in de microbiologie voor identificatie en visualisatie van bacteriën [57]. De primaire component en veelgebruikte kleurstof voor gramkleuring is kristalviolet, een basische trianilinekleurstof die celmembraan doorlaatbaar is in grampositieve en negatieve cellen [58]. Traditioneel wordt in het gramkleuringsproces een beitsmiddel, typisch een jodium-jodidemengsel, toegevoegd dat het kristalviolet in het celcytoplasma complexeert. Dit complex is membraan-ondoordringbaar in gram-positieve cellen, vanwege de grotere celmembraandikte die het complex binnenhoudt, maar breekt door het dunne membraan van gram-negatieve cellen. Dit laat gram-positieve cellen paars van kleur na een ontkleuring met een ethanoloplossing waardoor differentiatie tussen gram-positieve en negatieve bacteriën via microscopie [58] mogelijk is. Als differentiatie tussen gramtypes echter niet het doel is, kan het beitsmiddel worden weggelaten, zullen zowel grampositieve als negatieve cellen het kristalviolet opnemen en zal de kleurstof vrijelijk uit de cel passeren tijdens de ontkleuringsstap, waardoor de kwantificering van kristalviolet via spectroscopie. Deze kwantificering is uiterst nuttig gebleken als celschatting voor biofilmgroei [23,59�] .

Het schema in figuur 3 verklaart een fundamentele biofilm accumulatie-assay uitgevoerd in een multi-welled plaat. De groeimedia en planktonische cellen worden van de plaat verwijderd en gewassen met gedeïoniseerd (DI) water, waardoor alleen de aangehechte biofilm achterblijft (Figuur 3A). Een 1% oplossing van kristalviolet in DI-water wordt toegevoegd en de biofilm wordt gedurende een bepaalde periode, typisch 5 tot 30 minuten, bij kamertemperatuur met de kleurstof geïncubeerd. Na incubatie wordt de kleurstofoplossing verwijderd en de biofilm meerdere keren gewassen met DI-water om vrije kleurstof te verwijderen (Figuur 3B). De ontkleuringsoplossing kan vervolgens worden toegevoegd tot een volume dat groter is dan of gelijk is aan het oorspronkelijke volume van het kweekmedium, en gedurende 10� minuten met de biofilm worden geïncubeerd. De ontkleuringsoplossing bestaat doorgaans uit een 90�% ethanoloplossing, maar andere ontkleuringsoplossingen zoals pure ethanol of ethanol met aceton of azijnzuur kunnen ook worden gebruikt, aangezien het doel is om de CV op te lossen [23,61,62]. Ten slotte wordt de met CV geïnfuseerde ontkleuringsoplossing overgebracht naar een schone plaat met 96 putjes met geschikte blanco's ontkleuringsoplossing die moet worden beoordeeld op absorptie bij 530-2013600 nm, afhankelijk van de beschikbaarheid van filters van het instrument, met een UV-Vis-plaat met meerdere putjes spectrometer [23,60,61] .

Schematische kristalviolette test op biofilms in een microtiterplaat. Schematische voorstelling van kristalviolet assay op PA01 biofilm in een microtiterplaat 5 uur na inoculatie. Biofilmformulering is moeilijk te onderscheiden met het blote oog (A) CV is echter een niet-specifieke kleurstof die colokaliseert met bacteriën waardoor het zichtbaar wordt (B). Een bijzonder dicht gebied van de biofilm zal worden gevormd aan de buitenrand van elk putje waar de plaat, media en lucht elkaar kruisen. Dit is te zien aan een dunne donkerpaarse ring (zijaanzicht). Het kristalviolet dat door de bacteriën wordt geabsorbeerd, is evenredig met het aantal cellen in de biofilm. Daarom kan, wanneer verwijderd uit de biofilm door ethanol en overgebracht naar een schone 96 wells plaat (C), worden gekwantificeerd door een UV-Vis-plaatlezer (D). Niet-gepubliceerde gegevens verkregen door Christina Wilson aan de Doane University 2016.

Hoewel de kristalviolette microtiterplaat-assay uit verschillende stappen bestaat, is het relatief eenvoudig uit te voeren, reproduceerbaar en stelt het onderzoekers in staat om snel meerdere monsters tegelijk te analyseren. Het is relatief goedkoop omdat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is, en de kleurstof is goedkoop met een houdbaarheid van jaren indien beschermd tegen verontreiniging. Bovendien kan de kristalviolettest worden aangepast voor biofilms die in verschillende reactoren worden gekweekt. Figuur 4 toont een schema voor het meten van optische dichtheid (OD) over-tijd-tijdgegevens voor de groei van a Pseudomonas aeruginosa (PA) biofilm in een Center for Disease Control (CDC) reactor aan het begin van de fase van exponentiële groei (“log”). Het belangrijkste nadeel van deze test is de niet-specifieke aard omdat er geen onderscheid wordt gemaakt tussen levende en dode cellen. Een ander nadeel van deze test zijn de vele variabelen (incubatietijden, incubatietemperaturen, ontkleurende vlek, enz.) die partijvariabiliteit in de testresultaten kunnen introduceren [62]. De goedkeuring van een gestandaardiseerd protocol dat beschikbaar is in de literatuur en het gebruik van een controle voor normalisatie kan de variabiliteit van de methode echter elimineren.

Schmatic kristalviolet test van biofilms in een CDC-reactor. Crystal Violet (CV) Assay van PA01-biofilm in een CDC-reactor. (A) Schematische voorstelling van de test die op elk tijdstip wordt herhaald voor de ontwikkeling van de groeicurve. Eerst wordt de biofilm op coupons gekweekt in de CDC-reactor. Na verwijdering wordt de biofilm behandeld met CV dat zich aan het bacterieoppervlak hecht totdat het wordt gewassen met ethanol. De absorptie (optische dichtheid) van de ethanolwassing wordt gemeten bij 600 nm als een surrogaat voor biofilmgroei. Niet-gepubliceerde afbeeldingen verkregen door Christina Wilson en Helena Valquier-Flynn aan de Doane University 2016. (B) optische dichtheid (OD)-tijdgegevens voor de groei van een biofilmcelcultuur van PA01 op een glasoppervlak. De cellen bevinden zich in de fase van exponentiële groei (“log”). De onzekerheid in de OD-metingen is kleiner dan of gelijk aan de cirkelgrootte. De ononderbroken lijn past bij een exponentiële functie. De inzet toont dezelfde gegevens en past met behulp van een semi-log-plot die laat zien hoe de exponentiële groeicurve lineair wordt wanneer de log van optische dichtheid wordt uitgezet tegen de tijd. De biofilm van Pseudomonas aeruginosa (PA) werd gekweekt in 0,25% glucose (GL) en minimale media (MM). Niet-gepubliceerde gegevens verkregen door Chris Wentworth en Jeniffer Caballero aan de Doane University 2015.

Tetrazoliumzout

Tetrazoliumzouten zijn een van de meest gebruikte hulpmiddelen in de biologie voor het monitoren van het metabolisme in vitro [63] . Een verscheidenheid aan zouten, samengevat in Tabel 2, die met succes zijn gebruikt voor biofilmevaluatie, zijn ontwikkeld die kwantificering en visualisatie van cellulaire levensvatbaarheid en metabolisme via UV-Vis en fluorescentiespectroscopie mogelijk maken.Hoewel de exacte reductiemechanismen nog steeds onder de loep worden genomen en variëren tussen organisme en zouttype, kan het algemene concept op de volgende manier worden veralgemeend.

Tafel 2

Overzichtstabel van veelgebruikte tetrazoliumzouten voor onderzoek naar biofilms in vitro met wateroplosbaarheid en detectiegolflengte.

NaamOplosbaarheid in waterDetectiegolflengte (nm)
MTT
2-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-3,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromide
OnoplosbaarBuikspieren: 550�
CTC
5-Cyaan-2,3-di-(p-tolyl)tetrazoliumchloride
OnoplosbaarVb: 540
Em:630
INT
2-(4-joodfenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-fenyl-2H-tetrazoliumchloride
OnoplosbaarAbs: 470
TTC
2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride
OplosbaarAbs: 480
XTT(2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfofenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)OplosbaarBuikspieren: 490

Het tetrazoliumzout naar keuze wordt verdund in een fysiologisch relevante oplossing, zoals media of zoutoplossing, en de biofilm wordt gedurende 1𠄳 uur bij kweektemperatuur of kamertemperatuur geïncubeerd. Gedurende deze tijd wordt het kleurloze zout gereduceerd door cellulaire cofactoren en enzymen uit het cellulaire metabolisme, indicatief voor en evenredig aan de levensvatbaarheid van de cellen, tot het overeenkomstige formazanmolecuul dat detecteerbaar is door visuele of fluorescerende spectrometers of microscopen [63,64]. De reductie kan resulteren in in water oplosbare of in water onoplosbare formazan die de eindopwerkings- en analytische stappen dicteert. In water oplosbare formazans lossen op in de behandelingsbuffer en kunnen daarom onmiddellijk worden gedetecteerd via spectrometrische analyse [21,31,65�]. Deze worden vaak gebruikt voor realtime evaluatie van cellulaire levensvatbaarheid en metabolisme. In water onoplosbaar formazan kristalliseert en wordt tijdens het reductieproces gevangen in het celmembraan. Daarom kunnen de kristallen worden geëvalueerd via flowcytometrie en microscopie, per cel, in de cel of opgelost in een oplosmiddel, zoals DMSO of alcohol met 0,1 N HCl, voor algehele kwantificering [68�]. Figuur 5 toont visualisatie van een PA01-biofilm gekweekt in een Drip Flow Reactor gekleurd met onoplosbare formazan CTC met behulp van fluorescentiemicroscopie. Het formazan-kristal heeft fluorescerende eigenschappen waardoor het zichtbaar is met een fluorescerende microscoop, zoals weergegeven in figuren 5B en 5C.

Afbeeldingen van biofilm gekleurd met tetrazoliumzout. Representatieve beelden van biofilmgroei gevisualiseerd met onoplosbaar formazan afgeleid van tetrazoliumzout, CTC. Groei van biofilm op glasplaatje (A) is zichtbaar voor het blote oog biofilmvorming na 48 uur groei in de druppelstroom biofilmreactor en kleuring met CTC (rood) en DAPI (geel). De biofilm kan verder worden waargenomen met fluorescentiemicroscopie om de biofilmvorm kwalitatief te karakteriseren en het dekkingsgebied op een glasplaatje (B) te kwantificeren bij lage vergroting en kwantificering van de levensvatbaarheid met CTC-afgeleide fluorescerende formazan die alleen levende cellen kleurt (C) en DAPI die alle cellen kleurt (D ) bij hoge vergroting. Schaalbalk C en D=200 μm. Niet-gepubliceerde afbeeldingen verkregen door Jasmin Sandoval aan de Doane University 2016.

ATP-bioluminescentie

ATP-bioluminescentietesten zijn een gevestigde microbiële test in voedsel- en biomedische gemeenschappen voor de aanwezigheid van microbiële besmetting op oppervlakken [71,72]. Adenosinetrifosfaat (ATP) is een nucleosidetrifosfaat dat fungeert als de primaire energiebron in alle organismen en daardoor een belangrijke marker voor levensvatbaarheid. Bioluminescentie verwijst naar het proces waarbij organismen chemische energie omzetten in licht. De meest voorkomende ATP-bioluminescentietest maakt gebruik van het enzym luciferase, dat verantwoordelijk is voor de lichtproductie in vuurvliegjes. Bij lage ATP-concentraties is luciferase een reactie die licht produceert met een lineaire correlatie met de hoeveelheid ATP die in oplossing aanwezig is [73]. Daarom kan de hoeveelheid licht worden gebruikt om de levensvatbaarheid van biofilm en biomassa af te leiden [71,73]. De basisreactie verloopt in twee stappen, de eerste is het complexeren van luciferase, luciferine en ATP om een ​​luciferyladenylaatcomplex te creëren. De tweede stap is de oxidatie van luciferyladenylaat met zuurstof tot oxyluciferine, wat resulteert in de emissie van een foton dat wordt gedetecteerd op ongeveer 550 tot 570 nm [71,74] .

Het protocol voor de kwantificering van bioluminescentie is relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd op gesuspendeerde of aangehechte cellen. Eerst wordt het kweekmedium verwijderd en wordt de biofilm gewassen met water of buffer om extracellulair ATP te verwijderen. Ten tweede wordt de biofilm gesuspendeerd en worden cellen gelyseerd om intracellulair ATP vrij te maken waardoor het beschikbaar wordt voor het luciferine-luciferase. In de derde stap wordt het vrijgekomen intracellulaire ATP toegevoegd, of vice versa, aan het reactiereagens bestaande uit luciferine, luciferase, magnesiumionen, buffer voor pH-handhaving, enz. in een voor de luminometer geschikte cuvette of plaat met meerdere putjes. De halfwaardetijd van het luminescentiecomplex is ongeveer 30 minuten. Daarom moet het uitgestraalde licht zo snel mogelijk worden gedetecteerd na de toevoeging van biologisch monster/reagens [23]. De beste praktijk is om het uitgestraalde licht elke 10� seconden te kwantificeren gedurende een beperkt tijdsbestek, zodat de meetwaarden kunnen worden gemiddeld voor een totale ATP-schatting. Dit gemiddelde wordt vergeleken met een ATP-standaard die door hetzelfde protocol is gekwantificeerd onder dezelfde omstandigheden waarin de hoeveelheid ATP die in stap 3 is toegevoegd, bekend is. De beschreven procedure is de stapsgewijze volgorde van de test. Er kunnen echter in de handel verkrijgbare kits worden gekocht die een geoptimaliseerde verhouding van lysisdetergens, luciferase, luciferine, buffer en ionen bevatten, die worden verkocht als gevriesdroogd poeder, waarvoor alleen gedeïoniseerd water hoeft te worden toegevoegd, waardoor het protocol wordt teruggebracht tot de toevoeging van één reagens aan het biologische monster , incubatie en kwantificering van uitgestraald licht via een luminometer [75,76].

Deze test is zeer betrouwbaar, kan snel worden uitgevoerd en vereist alleen een luminometer voor analyse. Basis luminometers, die een enkele cuvet per keer lezen, kosten ongeveer $ 1000, terwijl geavanceerdere instrumenten die in staat zijn om platen met 96 putjes te lezen en/of automatische reagenstoevoeging hebben, $ 10K of meer kunnen kosten. De test is zeer nauwkeurig bij lage ATP-niveaus. Veel variabelen zoals slechte ATP-extractie, schommelingen in temperatuur en pH, onvoldoende verhouding van luciferine tot luciferase kunnen echter leiden tot gegevensvariantie. Daarom wordt het meestal aanbevolen om een ​​kit en geen zelfgemaakte reagens te gebruiken voor de test [74,77]. Commerciële assays kosten enkele honderden dollars en omvatten reagens en standaarden, die kunnen worden gebruikt om 200�-assays uit te voeren. Naast de relatief hoge kosten van de testen en instrumentatie, heeft deze methode de duidelijke beperking dat het instrument regelmatig moet worden gekalibreerd om de nauwkeurigheid te bevestigen [23].

Als alternatief hebben sommige onderzoekers ernaar gestreefd om een ​​niet-destructieve bioluminescentietest te maken voor biofilmobservatie in de tijd, screening met hoge doorvoer of targeting van specifieke bacteriën in een diverse biofilm [78,79]. Deze methode vereist de productie van recombinante bacteriën, door de introductie van een plasmide dat vergelijkbaar is met het plasmide dat eerder is besproken voor GFP-modificatie, voor de endogene productie van luciferase en luminescentie gekwantificeerd via een luminometer [78�]. Als ATP-bioluminescentie-assays vaak worden gebruikt voor experimenten met hoge doorvoer, kunnen de kosten en moeite van het maken van een recombinante bacterie gerechtvaardigd zijn. Anders is de eerder beschreven commercieel beschikbare test voldoende voor algemeen gebruik.

Totale eiwitbepaling

Een algemeen aanvaard surrogaat voor totale biofilmgroei is het totale eiwitgehalte. Ervan uitgaande dat het eiwitgehalte ongeveer gelijk is tussen cellen, is gevonden dat het eiwitgehalte correleert met het aantal cellen in biofilms in biofilms van wetland-microkosmos [54]. Variabiliteit van eiwitproductie tussen soorten, leeftijd en kweekomstandigheden kan echter resulteren in een afwijking van de directe correlatie met het aantal cellen, waardoor dit een methode is om te gebruiken in combinatie met strikte experimentcontroles en geverifieerd met meer directe kwantificatiemethoden [82,83]. Om dit te beoordelen worden de biofilms van hun substraat verwijderd en gehomogeniseerd in een vloeibare suspensie. De cellen worden gelyseerd op een manier die consistent is met de te gebruiken eiwitbepalingsmethode. Sommige protocollen vereisen bijvoorbeeld incubatie in aanwezigheid van een sterke base bij 55 ° C of een oplossing met detergens en eiwitprecipitatie met trichloorazijnzuur (TCA). Deze lysisbuffer moet proteasevrij worden gemaakt omdat de aanwezigheid van proteasen, enzymen die eiwitten afbreken, de kwaliteit van het monster zou verminderen. Na lysis kan het eiwitgehalte vervolgens worden gemeten door kleurverandering als gevolg van de kleurstof-eiwitinteractie via een UV-Vis-spectrometer. De verandering in absorptie van de gekleurde soort bij een bepaalde golflengte, afhankelijk van het kleurstof-eiwit-interactieproduct, is volgens de wet van Beers-Lambert evenredig met de eiwitconcentratie.

Er zijn veel gevestigde methoden voor de bepaling van het totale eiwitgehalte. Een van de meest gebruikte zijn de methoden van Bradford, Lowry en bicinchoninezuur (BCA). De Bradford-methode is eenvoudig en bestaat uit de toevoeging van een bekend volume eiwitmonster aan een zuur Bradford-reagens dat Coomassie Brilliant Blue G-250-kleurstof bevat [84]. Het gelyseerde monster of standaardeiwit wordt aan het Bradford-reagens toegevoegd en gedurende een korte periode, d.w.z. 10'201330 minuten, bij kamertemperatuur of 37'C geïncubeerd (om de vereiste reactietijd te verkorten). Tijdens deze incubatie bindt het eiwit zich aan de kleurstof, wat resulteert in een spectrale verschuiving van bruin (absorptie bij ongeveer 465 nm) naar blauw (optimale absorptie bij ongeveer 595 nm) [85,86]. De eiwitbinding is afhankelijk van de aanwezigheid van positief geladen aminozuren in de eiwitstructuur die een interactie aangaan met de netto negatief geladen kleurstof via Van der Waals, ionische en hydrofobe interacties [87]. Daarom wordt de verandering in absorptie bij 595 nm gemeten en omgezet in concentratie van totaal eiwit via een BSA-standaardcurve. Een tweede veelgebruikte methode is de Lowry-assay. De originele Lowry-eiwittest, of de modernere modificatie ervan, is gebaseerd op oxidatie-reductiechemie in twee stappen [88�]. Eerst reageert het eiwitmonster met kopersulfaat en tartraat met een incubatietijd van tien minuten bij kamertemperatuur om een ​​tetradentaat kopercomplex te vormen van vier peptidebindingen en één koperatoom. In de tweede stap wordt een Folin-fenolreagens toegevoegd en wordt de lichtblauwe kleur van het tetradentaat-kopercomplex versterkt door de overdracht van elektronen naar een fosfomolybdeen/fosfowolfraamzuurcomplex in het Folin-fenolreagens tijdens incubatie bij kamertemperatuur van 30 minuten of groter, en de uiteindelijke kleur absorbeert optimaal bij ongeveer 750 nm. Het exacte mechanisme is onderzocht, maar is tot op heden niet volledig opgehelderd. De eiwitsuspensiebuffer is een kritische overweging omdat de Lowry-test gevoelig is voor detergentia, kaliumionen, de meeste oppervlakteactieve stoffen, chelaatvormers (dwz ethyleendiaminetetra-azijnzuur, EDTA), sommige suikers die routinematig in kweekmedia aanwezig zijn en reductiemiddelen interfereren met de test en kunnen resulteren in foutieve kleurveranderingen [84] . De derde veelgebruikte methode voor het kwantificeren van eiwitten is de BCA-assay. Het chemische mechanisme van de BCA-eiwittest lijkt sterk op de Lowry-test waarbij gebruik wordt gemaakt van de reductie van koperionen door eiwitten, wat resulteert in een spectrale verschuiving. Het Folin-reagens van de Lowry-methode wordt echter vervangen door bicinchoninezuur (BCA), dat in één stap kan worden uitgevoerd in plaats van in twee [54,92]. Het eiwitmonster en de BCA-kitreagentia, een carbonaatbuffer die BCA-reagens en een kopersulfaatoplossing bevat, worden 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en de absorptie wordt optimaal geanalyseerd bij 562 nm. Het belangrijkste voordeel van de BCA-eiwittest is de compatibiliteit met de meeste oppervlakteactieve stoffen, waardoor het geschikt is voor gebruik met de meeste gebruikelijke cellysisreagentia, hoewel het nog steeds kwetsbaar is voor chelaatvormers. De BCA-assay wordt veel gebruikt en de methode is eenvoudig omdat in de literatuur algemeen wordt vermeld dat deze wordt uitgevoerd door de instructies van de fabrikant, die gewoonlijk de combinatie van reagentia A en B en de toevoeging van het monster dat is verdund met lysis omvat buffer om de monsterconcentraties binnen de standaardcurve [93,94] te brengen. Naast deze traditionele methoden is een verscheidenheid aan andere colorimetrische en fluorescerende eiwitassays beschreven, waaronder speciale assays voor histidinetags, antilichamen, enz. en vele zijn in de handel verkrijgbaar als assaykits [95�].

Eiwitkwantificering is een snelle, algemeen beschikbare test die een relatieve beoordeling van biofilmgroei mogelijk maakt. Assaykits kosten gewoonlijk $ 100�, afhankelijk van de kitgrootte. Deze omvatten doorgaans testreagentia voor 100-20131000 monsters, in het bereik van 1'20132000 ul eiwit per ml monster, afhankelijk van de gevoeligheid van de gekozen assay, en flesjes met de BSA-standaard. Bij het testen van zeer kleine hoeveelheden eiwit is het raadzaam om een ​​standaard, typisch BSA, uit te voeren met elke plaat of testset vanwege niet-systematische variatie in pipetteren (dwz slechte/onervaren techniek), variaties in kamertemperatuur of incubatietijd, enz. Hoewel verschillende kits gevoelig zijn voor talrijke interfererende middelen, is het mogelijk om lysisbuffers te plannen en kits te kiezen om interferentie te voorkomen. In het geval dat interferentie onvermijdelijk is, kunnen kleine gevallen worden verklaard door een achtergrondblanco uit te voeren van alleen de opschortingsbuffer. Anders kunnen monsters worden behandeld via gelfiltratie, dialyse of eiwitprecipitatie om storende stoffen te verwijderen [54,90,95]. Het grootste bezwaar tegen deze test is het onvermogen om onderscheid te maken tussen cellulair en extracellulair eiwit, wat fouten kan veroorzaken bij biofilmvergelijkingen tussen soorten en behandelingen die het EPS-eiwit verlagen zonder de cellen te schaden. Dit kan worden vermeden via methoden van cellulaire extractie waarbij het extracellulaire eiwit uit de cellen wordt verwijderd, of het gebruik van eiwitkwantificering parallel met een cellevensvatbaarheidstest kan raadzaam zijn.

Kwartskristal microbalans

Kwartskristalmicrobalansen (QCM's) maken de niet-destructieve meting van biofilmaccumulatie als functie van de tijd mogelijk [98]. Het instrument bestaat uit een kleine schijf van Astatine (AT)-geslepen eenkristalkwarts (Figuur 6D), een piëzo-elektrisch materiaal dat wordt aangedreven op de resonantiefrequentie van de schijf door een toegepast oscillerend potentiaalverschil. De schijf kan worden gecoat, bijvoorbeeld met goud (Au) of siliciumoxide (Si02), en dient als het groeisubstraat. Deze schijf bevindt zich in het stroomkanaal van de bioreactor zodat de biofilm op het schijfoppervlak wordt gevormd. De resonantiefrequentie is een functie van de massa van het systeem, dus microgramveranderingen in massa zijn evenredig met de verschuiving in resonantiefrequentie, waardoor de ophoping van biofilm tijdens de vorming kan worden gemeten [99]. Tam et al. illustreert effectief gebruik van QCM-technologie om het effect van omgevingscondities en genetische manipulaties op de groeisnelheid van Streptococcus mutans biofilms [100] aan te tonen. In deze studie wordt een directe correlatie tussen de natte massa van de film en de QCM-frequentieverschuiving getoond, wat een kwantitatieve maat voor de massa van het QCM-apparaat geeft.

Kwartskristal microbalans biofilm reactor. De openQCM© testkamer met aangehechte instroom- en uitstroomslangen voor media. Foto's van de (A) bovenkant, (B) vooraanzicht en (C) in de stroomkamer inclusief het kwartskristal en houder van de openQCM© testkamer. De kamer bevat de benodigde elektronica in de basis. (D) Een cartoon van de stroomcelconfiguratie waar biofilm zich op het kristal zou afzetten voor kwantificering van de biofilm [100].

Aanvullende informatie over de visco-elastische eigenschappen kan worden verkregen wanneer de aangelegde potentiaal is uitgeschakeld, zodat exponentieel verval van de oscillatie kan worden gevolgd. Dit type meting wordt kwartskristalmicrobalans met dissipatiebewaking (QCM-D) genoemd. De bij deze techniek gemeten dissipatiefactor is gevoelig voor de oppervlaktemassadichtheid van de film en de mechanische koppeling van de film aan het kristaloppervlak en het omringende medium [101]. QCM-D maakt dynamische metingen in een vloeibare omgeving mogelijk en is een niet-destructieve techniek. Zo kan de afhankelijkheid van biofilmkwaliteit en vormingskinetiek van omgevingscondities, zoals pH of additieve concentraties, in overweging worden genomen [102�]. QCM-D vereist modellen om de gegevens te interpreteren en geeft schattingen voor filmdikte, schuifspanning en viscositeit van biofilms [101,107�]. Deze parameters zijn van bijzonder belang voor pogingen om biofilms mechanisch te verwijderen. QCM-D blijft een onderbenutte techniek voor de karakterisering van biofilms die voornamelijk wordt gebruikt door natuurkundigen en ingenieurs, maar microbiologen hebben deze optie niet uitgebreid onderzocht als een interdisciplinaire methode.

Het grote voordeel van deze techniek is de real-time monitoring van massaaccumulatie tot op ng/cm2 nauwkeurigheid zonder het monster op te offeren, wat heeft bijgedragen tot een beter begrip van de aanhechting van biofilms en het mogelijk maakt om onderzoek te doen met meerdere analytische technieken, zoals testen voor het kwantificeren van levensvatbaarheid en gen/eiwit-expressie, op een enkel monster. Een groot nadeel van deze methode zijn de kosten van gespecialiseerde apparatuur, elektronica, software en verbruiksartikelen, die kunnen variëren van een eenvoudig apparaat met één kanaal, zoals dat beschikbaar is via openQCM©, voor $ 600 tot volledig geautomatiseerde apparaten met hoge doorvoer van Q -Zin voor duizenden dollars. Afbeelding 6 toont een voorbeeld van het openQCM©-apparaat met het QCM-kristal in een kleine stroomkamer. De elektronica is gebaseerd op het micro-Arduino-microcontrollerbord. Alle hardware en software zijn open source, dus ze kunnen eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker. Een ander nadeel van dit systeem is dat de resonantiefrequentie zeer gevoelig is voor veranderingen in temperatuur en druk, waardoor het belangrijk is om fluctuaties van die variabelen te behouden of ermee rekening te houden tijdens het verzamelen van gegevens.

Alternatieve kwantitatieve karakteriseringsmethoden

Literatuurverslagen laten zien dat biofilms ook kunnen worden geanalyseerd met behulp van DNA-, RNA- en polysaccharide-kwantificering [91,110�]. Hoewel deze vaak worden gebruikt als directe technieken met de veronderstelling dat elke cel vergelijkbare hoeveelheden DNA, RNA en polysacchariden per cel zal hebben, is het raadzaam om deze kwantificeringen samen te brengen met meer directe methoden, zoals CFU of celtelling als de EPS-matrix bevat DNA-, RNA- en polysacharidecomponenten van eerder gelyseerde cellen, waardoor deze technieken dezelfde klacht krijgen als totaal eiwit met het onvermogen om cellulaire van EPS-componenten te onderscheiden [12]. Verder is opgemerkt dat bepaalde hoeveelheden RNA- en polysaccharide-expressie veranderen door organisme of groeiomgevingen [118,119]. Daarom wordt literatuurvoorrang voor kwantificering van deze verbindingen in een bepaald organisme sterk aanbevolen.

Fluorescentiespectroscopie is een onderzochte maar niet vaak gebruikte methode voor indirecte kwantificering. Deze methode gaat ervan uit dat elke cel bij excitatie een vergelijkbare fluorescentie-emissie-intensiteit uitstraalt, waardoor intensiteit wordt gebruikt als een surrogaatkwantificatiewaarde voor het celaantal en kan worden uitgevoerd op gesuspendeerde biofilm [120]. Deze methode kan profiteren van autofluorescentie van metabole moleculen (NAD/NADH, FAD, tryptofaan, enz.), en cellen kunnen worden getransfecteerd om fluorescerende eiwitten te produceren zoals eerder besproken met GFP, of cellen kunnen worden geverfd met een fluorescerende kleurstof [69,120 & #x02013122] . De aanwezigheid van metabole moleculen en de fluorescentie-intensiteit van eiwitten worden beïnvloed door extra- en intracellulaire omstandigheden. Daarom moeten experimenten worden uitgevoerd met een negatieve controle, een monster met dezelfde kweekomstandigheden zonder behandelingsmiddel [122]. Hoewel het geen kwantificatiemethode is, kan 2D-fluorescentiespectroscopie worden gebruikt als een niet-destructieve, in de tijd oplosbare methode om informatie te verkrijgen over de fysiologische toestand van de biofilm [122]. Deze methode vereist een aantal gespecialiseerde apparatuur, maar kan in combinatie met andere technologie informatie verschaffen over fysieke interacties tussen de biofilm en het omringende medium. Wolf et al. gebruikte deze techniek in combinatie met kunstmatige neurale netwerken om biofilmvorming te bestuderen ter plaatse en analyseer biofilmgroei met betrekking tot procesparameters [123].

Radioactief labelen is ook gebruikt voor de kwantificering van biofilms door een isotoop te hechten aan een biologisch molecuul, zoals thymidine of glucose, en observatie via microscopie, scintillatie-/gammastraalteller [124�]. Gespecialiseerde apparatuur en training zijn vereist vanwege de mogelijk schadelijke effecten van overmatige blootstelling aan straling.


Ontdekking opent deur naar aanvallende biofilms die chronische infecties veroorzaken

Een slimme nieuwe beeldvormingstechniek ontdekt aan de University of California, Berkeley, onthult een mogelijk aanvalsplan voor veel bacteriële ziekten, zoals cholera, longinfecties bij patiënten met cystische fibrose en zelfs chronische sinusitis, die biofilms vormen die hen resistent maken tegen antibiotica.

Tot nu toe konden wetenschappers alleen groeiende clusters van bacteriële cellen in een biofilm zien. Maar dankzij nieuwe beeldvormingstechnieken konden onderzoekers van UC Berkeley inzoomen op deze clusters en vastleggen hoe de bacteriën hun onneembare 'kastelen' bouwen, die belangrijke doelen vormen voor medicijnen om de biofilms af te breken. (Video geproduceerd door Veysel Berk, UC Berkeley)

Door een nieuwe fluorescerende labelstrategie te bedenken en superresolutie-lichtmicroscopie toe te passen, konden de onderzoekers de structuur onderzoeken van plakkerige plaques, bacteriële biofilms genaamd, die deze infecties zo hardnekkig maken. Ze identificeerden ook genetische doelen voor potentiële medicijnen die de bacteriële gemeenschap zouden kunnen opbreken en de insecten zouden kunnen blootstellen aan de dodelijke kracht van antibiotica.

"Uiteindelijk willen we deze insecten dakloos maken", zegt hoofdonderzoeker Veysel Berk, een postdoctoraal fellow bij de afdeling Natuurkunde en het California Institute for Quantitative Biosciences (QB3) aan UC Berkeley.

Berk en zijn co-auteurs, waaronder Nobelprijswinnaar en voormalig UC Berkeley-professor Steven Chu, rapporteren hun bevindingen in het nummer van 13 juli van het tijdschrift Wetenschap.

"In hun natuurlijke habitat leeft 99,9 procent van alle bacteriën als een gemeenschap en hechten ze zich aan oppervlakken als biofilms volgens de National Institutes of Health, 80 procent van alle infecties bij mensen is gerelateerd aan biofilms," zei Berk.

De onderzoekers konden nieuwe technieken gebruiken waarmee ze konden inzoomen op een straatniveau van deze biofilms, waar ze leerden "hoe ze uit een enkele cel groeien en samenkomen om kamers en hele gebouwen te vormen", zei Berk. "Nu kunnen we een logische aanpak bedenken om te ontdekken hoe we hun gebouw kunnen slopen, of voorkomen dat ze het gebouw zelf vormen."

Door superresolutiemicroscopie te combineren met de techniek die Berk heeft ontwikkeld, waarmee continu groeiende en delende cellen in cultuur kunnen worden gelabeld, kunnen biologen op veel gebieden stop-motionvideo opnemen van "hoe bacteriën hun kastelen bouwen", zei hij.

"Dit werk heeft geleid tot nieuwe inzichten in de ontwikkeling van deze complexe structuren en zal ongetwijfeld de weg vrijmaken voor nieuwe benaderingen voor de bestrijding van infectieziekten en ook voor bacteriologische toepassingen in milieu- en industriële omgevingen", zegt Chu, een voormalig UC Berkeley-hoogleraar natuurkunde. en van moleculaire en celbiologie en voormalig directeur van het Lawrence Berkeley National Laboratory.

Bacteriën zijn geen eenlingen

De populaire opvatting van bacteriën is dat het vrijlevende organismen zijn die gemakkelijk in toom kunnen worden gehouden door antibiotica, zei Berk. Maar wetenschappers realiseren zich nu dat bacteriën het grootste deel van hun leven in kolonies of biofilms doorbrengen, zelfs in het menselijk lichaam. Hoewel afzonderlijke bacteriën vatbaar kunnen zijn voor antibiotica, kunnen de films 1000 keer resistenter zijn en kunnen de meeste alleen operatief worden verwijderd.

3D-reconstructie van de bacteriële biofilm gemaakt door cholerabacteriën. Bacteriële cellen (blauw) hechten zich aan oppervlakken met een lijmachtig eiwit (groen) en hechten zich aan elkaar met een ander eiwit (grijs). De bacterieclusters bedekken zich vervolgens met een beschermend omhulsel (rood) gemaakt van eiwitten en suikermoleculen. (afbeelding Scheepsberk)

Implantaten, zoals pacemakers, stents en kunstmatige gewrichten, worden af ​​en toe geïnfecteerd door bacteriën die biofilms vormen. Deze biofilmlocaties scheiden periodiek bacteriën af - avonturiers, noemt Berk ze - die acute infecties en koorts kunnen veroorzaken. Terwijl antibiotica deze vrijzwemmende bacteriën kunnen uitschakelen en de infectie tijdelijk kunnen kalmeren, blijft de biofilm onaangetast. De enige permanente oplossing is verwijdering van het met biofilm gecoate apparaat en vervanging door een nieuw gesteriliseerd implantaat.

Een permanente bacteriële biofilm in de sinussen kan een immuunrespons veroorzaken die leidt tot chronische sinusinfecties, met symptomen zoals koorts en verkoudheidsachtige symptomen. Tot nu toe is de meest effectieve behandeling het operatief verwijderen van het aangetaste weefsel.

Bacteriën vormen ook permanente, meestal levenslange, biofilms in de met slijm gevulde longen van patiënten met cystische fibrose en zijn verantwoordelijk voor de chronische longinfecties die tot vroegtijdig overlijden leiden. Hoewel een langdurige behandeling met antibiotica helpt, kan het de infectie niet volledig uitroeien.

Het bestuderen van een biofilm gevormd door cholerabacteriën (Vibrio cholerae), bouwde Berk zijn eigen superresolutiemicroscoop in de kelder van UC Berkeley's Stanley Hall op basis van een ontwerp uit 2007 van coauteur Xiaowei Zhuang, Chu's voormalige postdoctorale student die nu professor is aan de Harvard University. Om deze cellen daadwerkelijk te zien terwijl ze zich splitsten om 'kastelen' te vormen, bedacht Berk een nieuwe techniek, continue immunokleuring genaamd, waarmee hij vier afzonderlijke doelmoleculen kon volgen door middel van vier afzonderlijke fluorescerende kleurstoffen.

Hij ontdekte dat een enkele bacterie gedurende een periode van ongeveer zes uur een lijm had aangebracht om zich aan een oppervlak te hechten, en vervolgens in dochtercellen werd verdeeld, waarbij ze ervoor zorgden dat elke dochter aan zichzelf hechtte voordat ze in tweeën splitste. De dochters gingen door met delen totdat ze een cluster vormden - zoals een bakstenen en mortelgebouw - op welk punt de bacteriën een eiwit afscheidden dat het cluster omhulde als de schil van een gebouw.

De clusters worden gescheiden door microkanalen die voedingsstoffen kunnen binnenlaten en weggooien, zei Berk.

“Als we een medicijn kunnen vinden om het lijmeiwit kwijt te raken, kunnen we het gebouw als geheel verhuizen. Of als we het cementeiwit kunnen verwijderen, kunnen we alles oplossen en het gebouw laten instorten, waardoor we toegang krijgen tot antibiotica, "zei Berk. "Dit kunnen in de toekomst doelwitten zijn voor plaatsspecifieke, antibiotische geneesmiddelen."

Superresolutiemicroscopie: schilderen met licht

Berk is een bioloog opgeleid in natuurkunde en optica met expertise in het in beeld brengen van de structuren van eiwitten: hij maakte een paar jaar geleden deel uit van een team dat de atomaire structuren van het ribosoom bepaalde, de cellulaire machine die de genetische boodschap vertaalt in een afgewerkt eiwit .

Hij vermoedde dat krachtige nieuwe superresolutie-lichtmicroscopie de onbekende structuur van biofilms zou kunnen onthullen. Superresolutiemicroscopie verkrijgt een 10 keer betere resolutie dan standaard lichtmicroscopie - 20 in plaats van 200 nanometer - door slechts een deel van het beeld tegelijk te markeren met behulp van fotoverwisselbare sondes en duizenden afbeeldingen samen te voegen tot een enkele momentopname. Het proces lijkt veel op schilderen met licht: een zaklamp op een donkere scène schijnen terwijl de sluiter van de camera open blijft. Elke momentopname kan enkele minuten duren om te compileren, maar voor langzame celgroei is dat snel genoeg om een ​​stop-actiefilm te maken.

Het probleem was hoe de cellen te labelen met fluorescerende kleurstoffen om hun groei en deling continu te volgen. Normaal gesproken hechten biologen primaire antilichamen aan cellen en overspoelen ze de cellen met fluorescerende kleurstof die is bevestigd aan een secundair antilichaam dat zich aan de primaire hecht. Vervolgens spoelen ze de overtollige kleurstof weg, schijnen licht op de geverfde cellen en fotograferen de fluorescentie.

Berk vermoedde dat een kritisch uitgebalanceerde concentratie van fluorescerende vlekken - laag genoeg om achtergrondverkleuring te voorkomen, maar hoog genoeg om efficiënte kleuring te hebben - net zo goed zou werken en de noodzaak zou elimineren om overtollige kleurstof weg te spoelen uit angst dat het een achtergrondglans zou veroorzaken.

"De klassieke benadering is eerst kleuren, dan ontkleuren en dan slechts een enkele momentopname maken," zei Berk. "We hebben een manier gevonden om kleuring te doen en alle fluorescerende sondes in de oplossing te houden terwijl we de beeldvorming doen, zodat we alles continu kunnen controleren, van een enkele cel tot een volwassen biofilm. In plaats van één momentopname nemen we een hele film op.”

"Het was een heel eenvoudig, cool idee, maar iedereen vond het gek", zei hij. "Ja, het was gek, maar het werkte."


Inleiding en kenmerken van biofilmvorming

Biofilms zijn een collectief van een of meer soorten micro-organismen die op veel verschillende oppervlakken kunnen groeien. Micro-organismen die biofilms vormen, zijn onder meer bacteriën, schimmels en algen. De biofilmmatrix is ​​een belangrijk onderdeel van de biofilm die de microbiële cellen, exopolysacchariden en water bevat. Gewoonlijk zijn de microbiële cellen in een biofilm ingebed in de extracellulaire polymere stoffen (EPS) die ze zelf produceren, ook wel Slime genoemd.

EPS bevat extracellulair DNA, eiwitten en polysachariden die slijm vormen. Daarom worden biofilms ook wel de verzameling micro-organismen genoemd, omringd door het slijm dat ze afscheiden.
Microbiële cellen in de biofilm zijn anders dan de planktoncellen die enkelvoudige cellen zijn en op een vloeibaar medium kunnen drijven. Wanneer een enkele cel verandert in biofilm, is er een verschuiving in het fenotypische gedrag als gevolg van de verandering van expressie in de genetica.
Door de biofilms kan het micro-organisme zich hechten aan elk oppervlak, levend of niet-levend. De adaptieve en genetische veranderingen van de micro-organismen in de biofilm maken ze resistent tegen alle bekende antimicrobiële middelen.
De meeste milieubiofilms bevatten meerdere spp. Het is betrokken geweest bij verschillende microbiële infecties, sommige zelfs tot dodelijke infecties, variërend van UWI tot de infecties van het implantaat zoals katheters, prothesen, enz.
Een biofilm kan ook worden beschouwd als een hydrogel, een complex polymeer dat vele malen zijn drooggewicht in water bevat. Biofilms zijn niet alleen bacteriële slijmlagen, maar biologische systemen waarin de bacteriën zichzelf organiseren in een gecoördineerde functionele gemeenschap. Biofilms kunnen hechten aan een oppervlak zoals een tand, steen of oppervlak, en kunnen een enkele soort of een diverse groep micro-organismen bevatten. De biofilmbacteriën kunnen voedingsstoffen delen en worden beschermd tegen schadelijke factoren in de omgeving, zoals uitdroging, antibiotica en het immuunsysteem van een gastheerlichaam. Een biofilm begint zich meestal te vormen wanneer een vrijzwemmende bacterie zich hecht aan een oppervlak,

Biofilms KENMERKEN

Biofilms zijn dynamisch en reageren op hun omgeving, dat wil zeggen dat ze zich kunnen aanpassen aan veranderingen in hun omgeving.
Een fenomeen dat bekend staat als onthechting lijkt veel voor te komen bij alle biofilms. Bacteriële cellen kunnen afzonderlijk of in groepjes loskomen van hun biofilmkolonie.
Wanneer individuele micro-organismen loskomen van een biofilm, zijn deze geïsoleerde micro-organismen relatief eenvoudig te doden met chemicaliën die hiervoor zijn ontworpen.
Wanneer micro-organismen zich in klonten losmaken van hun biofilmkolonie, de klonten zijn stukjes van de biofilm die op dit moment niet aan een oppervlak vastzitten in dit geval, ze behouden de beschermende eigenschappen van de oorspronkelijke biofilm en zijn dus veel moeilijker te doden.
Onder de juiste omstandigheden kunnen biofilms in de loop van de tijd op verschillende manieren over oppervlakken migreren.
Biofilms vangen voedingsstoffen op voor microbiële groei en helpen het losraken van cellen op oppervlakken in het stromende systeem te voorkomen.
Het bevat verschillende poreuze lagen en de cellen in elke laag kunnen worden onderzocht met behulp van confocale scanninglasermicroscopie.
Meestal gekweekt op een vast substraat dat is ondergedompeld in of blootgesteld aan een vloeibaar medium.
Onder bepaalde omstandigheden vormen ze een monospeciescultuur.
In staat om antibioticaresistente genen met elkaar uit te wisselen, waardoor antibiotica-afbrekende enzymen worden geproduceerd die het effect van de binnenkomende antibiotica volledig teniet kunnen doen.

VORMING VAN BIOFILMS

Biofilmvorming begint met de aanhechting. Er zijn voornamelijk 5 stappen voor de vorming van biofilm als volgt:

Stap 1: Eerste bijlage

Vrij zwevend micro-organisme hecht zich aan een vast substraat, blootgesteld in een vochtige omgeving door een zwakke Vander Waals-kracht die omkeerbaar is. De aanhechting vindt ook plaats vanwege het hydrofobe effect. Verhoogde hydrofobiciteit vermindert de afstoting tussen de bacterie en de extracellulaire matrix.

Stap 2: Onomkeerbare bevestiging

Na de bevestiging met zwakke Vander Waals kracht. als de bacterie niet wordt verwijderd, zal deze zich volledig verankeren met behulp van celadhesiestructuren zoals pilla. Dit zou een onomkeerbare gehechtheid zijn.

Stap 3: Uitbreiding

Na onomkeerbare hechting breidt de bacteriële/microbiële kolonie uit, hetzij door celdeling, hetzij door celdeling te combineren met de rekrutering van de andere microbiële cellen. Beweeglijke cellen kunnen zich gemakkelijk herkennen en hechten aan de matrix, terwijl de niet-beweeglijke cellen deze functie niet gemakkelijk kunnen uitvoeren. Dergelijke cellen die zich niet succesvol aan het substraat kunnen hechten, hechten zich aan aanvankelijk gekoloniseerde cellen.

Stap 4: Rijping

Zodra de microbiële cellen zich hebben geaggregeerd en gekoloniseerd om een ​​biofilm te vormen, communiceren ze met elkaar met behulp van een Quorum-detectieproduct (N-acylhomoserinelacton). Hierdoor kunnen ze verschillende biochemische functies uitvoeren en extracellulaire polymere substantie (EPS) vrijgeven. Het werkt als een slijm voor de bescherming van biofilm en vergemakkelijkt de communicatie.

Stap 5: Dispersie

De laatste fase van biofilmvorming. Hier in de biofilm verandert alleen de grootte en vorm. Verspreiding helpt bij het koloniseren van nieuwe oppervlakken, remming van biofilm. EPS-afbrekende enzymen zoals dispersie-B en deoxyribonuclease degraderen de EPS en verhogen zo de "NO".
Stikstofmonoxide (NO) veroorzaakt de verspreiding van biofilms gevormd door verschillende bacteriën. Het heeft het potentieel voor de behandeling van patiënten met chronische infectie als gevolg van biofilms, kansen op biofilmvernietiging. EPS-afbrekende enzymen kunnen worden gebruikt als anti-biofilmmiddelen en remmen de groeiende kolonies.

BIOFILMS DIE INFECTIEZIEKTEN VEROORZAKEN

Naarmate het onderzoek in de loop der jaren vorderde, zijn biofilms - bacterieel en schimmel - betrokken bij verschillende gezondheidsproblemen. In een oproep voor subsidieaanvragen uit 2002 merkten de National Institutes of Health (NIH) op dat biofilms verantwoordelijk zijn voor meer dan 80 procent van de microbiële infecties in het lichaam.

Biofilms kunnen groeien op geïmplanteerde medische apparaten zoals prothetische hartkleppen, gewrichtsprothesen, katheters en pacemakers. Dit leidt op zijn beurt tot infecties. Het fenomeen werd voor het eerst opgemerkt in de jaren tachtig toen bacteriële biofilms werden gevonden op intraveneuze katheters en pacemakers. Van bacteriële biofilms is ook bekend dat ze infectieuze endocarditis en longontsteking veroorzaken bij mensen met cystische fibrose, volgens het artikel uit 2004 in Nature Reviews Microbiology, naast andere infecties.

Schimmelbiofilms kunnen ook infecties veroorzaken door te groeien op geïmplanteerde apparaten. Gistsoorten zoals de leden van het geslacht Candida groeien op borstimplantaten, pacemakers en prothetische hartkleppen. Candida-soorten groeien ook op menselijke lichaamsweefsels, wat leidt tot ziekten zoals vaginitis (ontsteking van de vagina) en orofaryngeale candidiasis (een schimmelinfectie die zich in de mond of keel ontwikkelt).

De vorming van tandplakbacteriën die tijdens het eerste levensjaar in de mond worden aangetroffen, is aerotolerante anaëroben zoals streptokokken en lactobacillen. Bacteriële kolonisatie van tandoppervlakken begint met de aanhechting van enkele bacteriële cellen. Zelfs op een pas gereinigd tandoppervlak vormt een zuur glycoproteïne uit het speeksel een dunne organische film van enkele micrometers dik. Deze film biedt een aanhechtingsplaats voor bacteriële microkolonies. Uitgebreide groei van deze organismen resulteert in een dikke bacteriële laag die tandplak wordt genoemd. Als plaque filamenteuze anaëroben blijft vormen, zoals Fusobacterium spp, beginnen ze te groeien. Filamenteuze bacteriën ingebed in de matrix gevormd door de streptokokken strekken zich loodrecht op het tandoppervlak uit, waardoor een dikkere bacterielaag ontstaat. Geassocieerd met de filamentbacteriën zijn spirocheten zoals grampositieve staafjes van de Borrelia-soort en gramnegatieve kokken. In plaque filamenteuze obligaat anaërobe organismen kan Actinomyces overheersen. Zo wordt tandplak bestaande uit een relatief dikke laag bacteriële verschillende soorten beschouwd als biofilm met gemengde culturen.
Tandplak is een biofilm of massa bacteriën die groeit op oppervlakken in de mond. Het is aanvankelijk een kleverige kleurloze afzetting, maar wanneer het tandsteen vormt, is het vaak bruin of lichtgeel. Het wordt vaak gevonden tussen de tanden, aan de voorkant van de tanden, achter de tanden, op kauwvlakken, langs de tandvleesrand of onder de cervicale marges van de tandvleesrand. Tandplak is ook bekend als microbiële plaque, orale biofilm, dentale biofilm, tandplakbiofilm of bacteriële plaquebiofilm. Bacteriële plaque is een van de belangrijkste oorzaken van tandbederf en tandvleesaandoeningen.

Progressie en opbouw van tandplak kan leiden tot tandbederf - de plaatselijke vernietiging van de weefsels van de tand door zuur geproduceerd door de bacteriële afbraak van fermenteerbare suiker - en parodontale problemen zoals gingivitis en parodontitis. Daarom is het belangrijk om de massa bacteriën en verwijder deze. Het onder controle houden en verwijderen van tandplak kan worden bereikt met correct dagelijks of tweemaal daags tandenpoetsen en het gebruik van interdentale hulpmiddelen zoals tandzijde en interdentale ragers.
Mondhygiëne is belangrijk omdat biofilms in het gebit zuur kunnen worden en demineralisatie van de tanden kunnen veroorzaken (ook wel cariës genoemd) of verharden tot tandsteen (ook bekend als tandsteen).Tandsteen kan niet worden verwijderd door middel van tandenpoetsen of met interdentale hulpmiddelen, maar alleen door professionele reiniging.

2) Infectieuze bacteriële endocarditis

Endocarditis treedt op wanneer bacteriën de bloedbaan binnendringen en zich hechten aan een beschadigd deel van de binnenbekleding van het hart of abnormale hartkleppen. Niet alle bacteriën die in de bloedbaan terechtkomen, kunnen endocarditis veroorzaken. Alleen die bacteriën die aan het oppervlak van het hart en abnormale kleppen kunnen kleven, hebben de neiging om endocarditis te veroorzaken.

Komt meestal voor bij mensen met een reeds bestaande hartaandoening. De ziekteverwekker die endocarditis veroorzaakt: Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus.

De hartkleppen worden niet rechtstreeks van bloed voorzien. Daarom kan het immuunsysteem van het lichaam, zoals de infectiebestrijdende witte bloedcellen, de kleppen niet rechtstreeks via de bloedbaan bereiken. Als bacteriën op de kleppen beginnen te groeien (dit komt het vaakst voor bij mensen met reeds zieke hartkleppen), is het moeilijk om de infectie te bestrijden, hetzij door het immuunsysteem van het lichaam of door medicijnen die voor levering afhankelijk zijn van het bloedsysteem.

3) Katheter-geassocieerde UTI

De overheersende vorm van leven voor de meeste micro-organismen in elk gehydrateerd biologisch systeem is een coöperatieve gemeenschap die een "biofilm" wordt genoemd. Een biofilm op een inwonende urinekatheter bestaat uit hechtende micro-organismen, hun extracellulaire producten en gastheercomponenten die op de katheter zijn afgezet. De levenswijze van de biofilm geeft een overlevingsvoordeel aan de micro-organismen die ermee verbonden zijn, en dus resulteert biofilm op urinekatheters in aanhoudende infecties die resistent zijn tegen antimicrobiële therapie.

Omdat chronische katheterisatie bijna onvermijdelijk tot bacteriurie leidt, wordt routinematige behandeling van asymptomatische bacteriurie bij personen die gekatheteriseerd zijn niet aanbevolen. Wanneer symptomen van een urineweginfectie zich ontwikkelen bij een persoon die gekatheteriseerd is, verbetert het vervangen van de katheter voordat urine wordt verzameld de nauwkeurigheid van de resultaten van de urinekweek. Het vervangen van de katheter kan ook de respons op antibiotische therapie verbeteren door de biofilm te verwijderen die waarschijnlijk de infecterende organismen bevat en die kan dienen als een nidus voor herinfectie.

BIOFILMVORMING OP IMPLANTATEN

Tandimplantaat

Tandheelkundige implantaten worden gebruikt om de tanden te vervangen bij edentate en gedeeltelijk edentate patiënten. Tandimplantaten ondersteunen enkele of meerdere tandrestauraties. Materialen die momenteel worden gebruikt voor tandheelkundige implantaten zijn metalen, keramiek, polymeer en glasachtige koolstof. Een bacteriële tandplak is de kolonisatie van bacteriële cellen rond het tandoppervlak, de kroon of het implantaat. Geschat wordt dat er jaarlijks een miljoen tandheelkundige implantaten worden geplaatst, met een gerapporteerd succespercentage van 90-95%, ondanks bacteriële infectie. Er wordt echter gerapporteerd dat de prevalentie van implantaatmucositis groter is dan 60%. De verschillende onderdelen van het tandimplantaat omvatten een implantaatpost, abutment en kroon.

De implantaten zijn geclassificeerd als:

(i) endostale (wortelvorm of plaatvorm) implantaat, dat direct in het kaakbot wordt ingebracht,

(ii) subperiostale implantaat, geplaatst op en rond het bot,

(iii) transosteaal implantaat, ingebracht door de kin en ondersteund door een plaat, en iv) tijdelijk implantaat, gebruikt voor een tijdelijk doel.

Orthopedische implantaten

Orthopedische implantaten kunnen grofweg worden geclassificeerd als schouder-, elleboog-, heup-, knie- en wervelkolomimplantaten. Enkele van de materialen die veel worden gebruikt, zijn roestvrij staal, titaniumlegeringen, tantaal, titanium, kobalt-chroomlegeringen en polyethyleen. De meeste bacteriën die uit orthopedische implantaten worden geïsoleerd, zijn niet vatbaar voor gewone antibiotica, zelfs niet in de zittende vorm.
Orthopedische implantaatgerelateerde infecties zijn van groot belang vanwege hun significante morbiditeit. Vrij zwevende soorten binden zich aan het inheemse of prothetische gewricht en transformeren in kleine kolonievarianten. Dit resulteert in een aanvullende modificatie die resulteert in een volwassen, antimicrobieel resistente biofilm.

Staphylococcus aureus en methicilline-resistente Staphylococcus aureus zijn de belangrijkste bacteriën die worden geassocieerd met de meeste orthopedische implantaatgerelateerde infecties, terwijl in prothetische gewrichten een laaggradige infectie, die enkele maanden tot een jaar na implantatie begint, wordt veroorzaakt door coagulase-negatieve Stafylokokken en Propionibacterium acnes. De kans op infectie is groter bij kniegewrichten dan bij heup- of schouderprothese gevolgd door breukplaten. De hechting van Mycobacterium tuberculosis aan roestvrij staal en titanium is slecht, waardoor ze een betere vervanging zijn in het geval van spinale tuberculose.

Hartimplantaten

Prothetische kleppen, ventriculaire ondersteunde apparaten en coronaire stents zijn enkele van de meest voorkomende hartimplantaten. De omgeving van de meeste van deze implantaten is bloed. Coagulase-negatieve Staphylococcus aureus is een primaire veroorzaker in het geval van hartkleppen en ventrikelondersteunde apparaten. Staphylococcus-aureus, Streptococcus sp., Gramnegatieve Bacilli, Enterococci, Pseudomonas-aeruginosa zijn andere kolonisatoren die in deze implantaten worden gevonden. CoNS, een normale huidflora, hecht zich ook aan de medische hulpmiddelen en de aangrenzende weefsels,

voornamelijk aan fibronectine. Staphylococcus aureus, een nasofaryngeale en nosocomiale pathogeen, produceert meerdere toxines die de weefsels afbreken en de immuunrespons van de gastheer stimuleren.

Niet-implantaat-geassocieerde biofilms

Niet alle infecties zijn te wijten aan de aanwezigheid van een implantaat. De vorming van een natieve biofilm is te wijten aan de aanwezigheid van levensvatbare bacteriën in het bloed en de duur van de groei (fysiologische bacteriëmieperiode). Hoewel implantaat-geassocieerde biofilms goed gedocumenteerd zijn, zijn de niet-implantaat-geassocieerde biofilms die leiden tot infectie niet goed bestudeerd.
Patiënten met cystische fibrose, waarbij longsecties zijn gemeld met een dichte kolonie Pseudomonas aeruginosa met een goed gedefinieerde EPS-alginaat, is een voorbeeld van een niet-implantaat-geassocieerde biofilm. De exacte rol van alginaat in de biofilmarchitectuur en antimicrobiële resistentie is niet goed vastgesteld.
Otitis media is een andere infectie die waarschijnlijk wordt veroorzaakt door biofilms. Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae en Moraxella catarrhalis zijn verantwoordelijk voor de infectie van het middenoor.
Parodontitis is een andere niet-implantaat-geassocieerde infectie, die ontstaat door de aanwezigheid van een orale biofilm, die vooral Gram-negatieve bacteriën bevat. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve ziekteverwekker, aggregeert samen met primaire tandkolonisatoren en produceert protease, dat interfereert met de cytokine-signaleringsroute van de gastheer. Salmonella enterica, Shigella sp. en Yersinia sp. zijn de infectieuze agentia van artritis.

BESTAND TEGEN ANTIMICROBILE MIDDELEN

De groeiwijze van de biofilm verleent de geassocieerde organismen een meetbare afname van de antimicrobiële gevoeligheid. Bijvoorbeeld Ceri et al. ontdekte dat biofilm-geassocieerde Escherichia coli >500 keer de MIC van ampicilline nodig had om een ​​3-log reductie te verkrijgen. Willems et al. ontdekte dat Staphylococcus aureus-biofilms >10 keer de MBC van vancomycine nodig hadden om een ​​reductie van 3 log te verkrijgen. Het effect op de gevoeligheid kan intrinsiek zijn (d.w.z. inherent aan de biofilmmodus van groei) of verworven (d.w.z. veroorzaakt door de verwerving van resistentieplasmiden).
Er zijn ten minste 3 redenen voor de intrinsieke antimicrobiële resistentie van biofilms: Ten eerste moeten antimicrobiële middelen door de EPS-matrix diffunderen om contact te maken met de organismen in de biofilm en deze te inactiveren. EPS's vertragen de diffusie door een chemische reactie met de antimicrobiële moleculen of door hun transportsnelheid te beperken. Hoyle et al. toonde aan dat de EPS's van Pseudomonas aeruginosa in staat waren te binden aan tobramycine gedispergeerde cellen waren 15 keer gevoeliger voor dit middel dan cellen in intacte biofilms. Ten tweede hebben biofilm-geassocieerde organismen verminderde groeisnelheden, waardoor de snelheid waarmee antimicrobiële middelen in de cel worden opgenomen, wordt geminimaliseerd en daardoor de inactiveringskinetiek wordt beïnvloed. Er werd gevonden dat een toename van de groeisnelheid de gevoeligheid van Staphylococcus epidermidis biofilms verhoogde. Ten derde kan de omgeving die de cellen in een biofilm onmiddellijk omgeeft, voorwaarden scheppen die het organisme verder beschermen. Tresse et al. ontdekte dat in agar ingesloten E. coli een verminderde gevoeligheid voor aminoglycoside-antibiotica vertoonde als gevolg van verminderde opname van het antibioticum door de zuurstofarme cellen.
Wat betreft verworven resistentie blijkt uit onderzoek dat plasmiden in biofilms onder verschillende omstandigheden uitgewisseld kunnen worden. Plasmiden zijn extrachromosomale cirkels van DNA die kunnen coderen voor resistentie tegen verschillende antimicrobiële middelen, waaronder β-lactams, erytromycine, aminoglycosiden, tetracycline, glycopeptiden, trimethoprim en sulfonamiden

CONTROLE OF BEHANDELING VAN BIOFILM

1) Quorumdetectie

Het is het vermogen om celpopulatiedichtheid te detecteren en erop te reageren door genregulatie. Zo stelt quorum sensing (QS) bacteriën in staat om de expressie van specifieke genen te beperken tot de hoge celdichtheden waarbij de resulterende fenotypes het meest gunstig zijn. Veel soorten bacteriën gebruiken quorum sensing om genexpressie te coördineren op basis van de dichtheid van hun lokale populatie. Evenzo gebruiken sommige sociale insecten quorumdetectie om te bepalen waar ze moeten nestelen.
Naast zijn functie in biologische systemen, heeft quorumdetectie verschillende nuttige toepassingen voor computers en robotica. In het algemeen kan quorumdetectie fungeren als een besluitvormingsproces in elk gedecentraliseerd systeem waarin de componenten: (a) een manier hebben om het aantal andere componenten waarmee ze interageren te beoordelen en (b) een standaardreactie zodra een drempelwaarde van het aantal componenten wordt gedetecteerd.

2) Gebruik van zware metalen bij de behandeling van biofilm

Soms zijn biofilms nuttig. Bioremediatie is in het algemeen het gebruik van levende organismen of hun producten - bijvoorbeeld enzymen - om schadelijke verbindingen te behandelen of af te breken. biofilms worden gebruikt bij de behandeling van afvalwater, zware metalen verontreinigingen zoals chromaat, explosieven zoals TNT en radioactieve stoffen zoals uranium. “Microben kunnen ze afbreken of hun mobiliteit of hun toxische toestand veranderen en ze daardoor minder schadelijk maken voor het milieu en de mens”.
Nitrificatie met behulp van biofilms is een vorm van afvalwaterzuivering. Tijdens nitrificatie wordt ammoniak door oxidatie omgezet in nitrieten en nitraten. Dit kan door autotrofe bacteriën, die als biofilms op plastic oppervlakken groeien.
Micro-organismen breken TNT af door reductie. De meeste micro-organismen verminderen de drie nitrogroepen, terwijl sommige de aromatische ring aantasten.


Wat hebben Alzheimer en bacteriële biofilms gemeen?

Bacteriën doen niet veel uit zichzelf. Een enkele bacterie is een vrij zwak ding. Het is kwetsbaar voor aanvallen van het immuunsysteem, als er concurrerende bacteriën omheen zijn, zal het waarschijnlijk verhongeren en als er roofdieren zijn, zal het snel worden opgeslokt. Het is dan ook niet verwonderlijk dat evolutie bacteriën een pad heeft gegeven om sterke gemeenschappen te vormen waar ze veel minder worden blootgesteld aan schade uit hun omgeving. Eén type bacteriegemeenschap is de biofilm waar bacteriën in grote groepen samenklonteren en een kleverig, beschermend slijm produceren om ze te bedekken en hen te helpen bij elkaar te blijven en zich aan oppervlakken te hechten. Wanneer ze in deze gemeenschappen leven, veranderen bacteriën hun gedrag. Veel van de cellen in een biofilm stoppen met delen of delen heel langzaam. Dit wordt een enorm probleem bij het behandelen van biofilms met antibiotica die zich richten op actief groeiende cellen. Na een antibioticakuur zullen veel bacteriën uit een biofilm overleven en opnieuw beginnen te groeien, wat leidt tot ernstige en terugkerende infecties.

Biofilms zijn dan ook een enorm probleem in ziekenhuizen. Ten eerste zijn ze erg plakkerig, dus als ze zich vormen, zijn ze moeilijk te verwijderen. Vervolgens zorgen ze ervoor dat leden van de gemeenschap resistent worden en de behandelingsopties beperken tot toxische of laatste redmiddel-antibiotica. Veel recente onderzoeken hebben ook aangetoond dat biofilms verschillende soorten bacteriën herbergen. Het is alsof de ene soort zich afweert tegen antibiotica en het immuunsysteem, waarna andere bacteriën binnenkomen om te schuilen. Dit kan leiden tot gevaarlijke allianties tussen pathogene bacteriën die elkaar helpen te overleven en schade aanrichten bij nietsvermoedende patiënten.

Een grote uitdaging in zowel ziekenhuizen als in het onderzoekslab is dat we niet weten wanneer een biofilm is ontstaan. We kunnen meten of er bacteriën aanwezig zijn, maar we weten niet of ze zich in het beschermende slijm hebben ingebed. Dit heeft implicaties voor de behandeling en ontwikkeling van nieuwe therapieën, omdat medische professionals niet zeker weten wanneer ze met normale antibiotica moeten worden behandeld of dat een andere benadering nodig is. Helaas zijn veel van de methoden en kleurstoffen die we tegenwoordig gebruiken om naar biofilms te kijken erg giftig voor zowel mensen als bacteriën, wat betekent dat we ze niet kunnen gebruiken om patiënten te behandelen of de levende biofilm te bestuderen.

Een recente studie van npj Biofilms and Microbiomes beschrijft een nieuwe manier om biofilm te detecteren. Een team onder leiding van professor Agneta Richter-Dahlfors van het Karolinska Institutet in Stockholm produceerde een nieuwe klasse van fluorescerende "slimme" moleculen die zich specifiek binden aan de Salmonella-biofilm. Het werk kwam voort uit een samenwerking met organische chemici in Linköping, onder leiding van professor Peter Nilsson. Agneta vertelt hoe de samenwerking tot stand is gekomen.

“Bij het organiseren van een PhD-cursus in nanogeneeskunde, hoorde ik de toespraak van professor Peter Nilsson over zijn nanosondes, uiterst gevoelige optische sensoren voor verkeerd gevouwen eiwitten en amyloïden die verband houden met de ziekte van Alzheimer. Het viel me op dat wanneer bacteriën biofilms vormen, ze curli produceren, een amyloïde eiwit. Dit leidde tot een spannende, nieuwe studie van nanosondes als sensoren voor Salmonella-biofilms.”

Van de ziekte van Alzheimer tot bacteriële biofilm! Het lijkt vergezocht, maar als je kijkt naar de structuren van de amyloïde plaques die worden gevonden bij Alzheimerpatiënten en de amyloïde vezels die worden gevormd in de Salmonella-biofilm, dan is er veel overeenkomst. Het onderzoeksteam ontdekte al snel dat ze Salmonella konden detecteren, in de veronderstelling dat de sonde zich zou binden aan curli in de biofilm. Een van de grootste verrassingen van het werk kwam echter bij het testen van deze hypothese, het team ontdekte dat de sonde aan curli bond, maar ze vonden ook iets anders.

“We realiseerden ons dat de sonde zich ook aan de koolhydraatcellulose, een ander belangrijk bestanddeel in de Salmonella-biofilm, bond op een manier die totaal anders is dan bij curli. Mijn promovendus Ferdinand Choong werd erg enthousiast toen hij dit resultaat zag, wat betekende dat we één nanosonde konden gebruiken om tegelijkertijd twee verschillende componenten van de Salmonella-biofilm optisch te detecteren”, zegt Agneta Richter-Dahlfors.

Dus de sonde kan binden aan cellulose en curli, dat betekent dat het niet-specifiek is, toch? Nou, niet precies, en daarom worden ze ook wel 'slimme moleculen' genoemd. Om dit uit te leggen, moeten we naar de chemie gaan. De sondes zijn korte, goed gedefinieerde fluorescerende polymeren die licht uitzenden op basis van de conformatie van de polymeerruggengraat. Als de ruggengraat een beetje buigt, verandert het spectrum van het uitgestraalde licht, zodat hetzelfde molecuul er totaal anders uitziet. Het onderzoeksteam realiseerde zich al snel dat wanneer de sonde aan curli bond, hij één conformatie had en wanneer hij aan cellulose bond, hij een andere had. Deze verschillende conformaties waren zichtbaar in de lichtspectra die door de sonde werden uitgezonden. Dus hoewel het "slimme molecuul" bindt aan zowel cellulose als curli, is het signaal van elk anders en is het mogelijk om ze van elkaar te onderscheiden.

Het project liep echter niet altijd van een leien dakje. "Onze grootste uitdaging was het vertalen van amyloïdonderzoek om bacteriële infecties te bestuderen." Agneta stelt. “Biofilm extracellulair slijm bevat een complex mengsel van chemisch verschillende componenten van zowel eiwitten als polysachariden. Het scheiden van dit mengsel was niet triviaal, dus het kostte ons tijd om de resultaten te interpreteren en er zeker van te zijn dat ze correct waren.”

Het team werkt nu aan het maken van nieuwe 'slimme moleculen' om verschillende verbindingen te detecteren die door bacteriën worden geproduceerd tijdens infectie. Ze werken er ook aan om deze sondes te integreren in systemen voor vroege detectie die zowel in ziekenhuizen als in voedselveiligheid kunnen worden gebruikt. Een spannende eigenschap van de sondes is dat ze ook elektriciteit kunnen geleiden. Dit betekent dat onderzoekers in de toekomst de specificiteit van de optische sondes kunnen gebruiken om een ​​elektronische uitlezing van de biofilmsamenstelling te geven en deze in te bouwen in apparaten die al in de ziekenhuizen worden gevonden.


Sleutelbegrippen

  • extremofiel: een organisme dat leeft onder extreme omstandigheden van temperatuur, zoutgehalte, enz. Commercieel belangrijk als bron van enzymen die onder vergelijkbare omstandigheden werken
  • halofiel: een organisme dat leeft en gedijt in een omgeving met een hoog zoutgehalte, waarvoor vaak een vorm van extremofiel nodig is
  • alkalifiel: elk organisme dat leeft en gedijt in een alkalische omgeving, zoals een sodameer een vorm van extremofiel

3 Gemeenschap: biofilms en gemeenschappelijk gedrag

3.1 Zijn biofilms meercellige organismen?

Het idee dat bacteriën vaak in de natuur voorkomen als biofilms in plaats van als individuele, vrij zwevende cellen, werd algemeen aanvaard door de ideeën en intuïtie van Dr. J. William Costerton [1]. Na de opwinding die voortkwam uit zijn baanbrekende revolutie van al lang bestaand wetenschappelijk dogma, begonnen andere revolutionaire hypothesen over de aard van bacterieel gedrag naar voren te komen. Een dergelijke hypothese is dat biofilms moeten worden beschouwd als meercellige organismen en dat biofilmbacteriën coöperatief, onzelfzuchtig gedrag vertonen [26]. Het gedrag van bacteriën in biofilms heeft zelfs geleid tot scepsis over de darwinistische evolutietheorieën [27]. Hypothetische uitdagingen voor algemeen aanvaarde theorieën zijn vermakelijk, maar zonder wetenschappelijk bewijs om ze te ondersteunen, blijven ze puur filosofisch, en er is nog geen poging gedaan om de uitdaging van onze huidige ideeën over evolutie wetenschappelijk te valideren. Recentelijk worden echter wiskundige modellering van biofilmsystemen en wetenschappelijke experimenten ontworpen om te testen of coöperatief, altruïstisch gedrag bij bacteriën verenigbaar is met de reguliere evolutietheorie [28].

Er zijn inderdaad overeenkomsten tussen biofilmbacteriën en meercellige organismen. Bacteriën (inclusief planktonische bacteriën) kunnen bijvoorbeeld hun omgeving waarnemen, en dit stelt hen in staat hun metabolische processen aan te passen om het gebruik van beschikbare substraten te maximaliseren en zichzelf te beschermen tegen schadelijke omstandigheden. Wanneer bacteriën in een biofilm groeien, resulteren deze veranderingen in genexpressie in fenotypische heterogeniteit binnen de biofilm die kan worden geïnterpreteerd als specialisatie of taakverdeling vergelijkbaar met cellulaire differentiatie die wordt gezien in meercellige organismen. Bovendien scheiden bacteriën stoffen uit die auto-inducerende signalen worden genoemd, die de genexpressie beïnvloeden en een middel kunnen zijn waarmee cellen met elkaar communiceren. Er is zelfs een groeiend aantal bewijzen dat bacteriën altruïstisch gedrag vertonen en een proces kunnen ondergaan dat vergelijkbaar is met geprogrammeerde celdood, wat opnieuw wijst op multicellulariteit [29].Er zijn echter fundamentele verschillen tussen bacteriën en meercellige organismen. Hoewel bacteriële cellen bijvoorbeeld kunnen reageren en zich kunnen aanpassen aan hun omgeving, differentiëren ze niet permanent. Men kan bijvoorbeeld colonepitheelcellen isoleren van een mens en deze laten groeien in weefselkweekmedium, en ook al worden de cellen plotseling geconfronteerd met radicale veranderingen in hun omgeving, ze blijven groeien als colonepitheelcellen en kunnen zelfs een gepolariseerde vorm vormen. monolaag vergelijkbaar met colonepitheel. Wetenschappers hebben veel moeite gedaan om methoden te ontwikkelen om gedifferentieerde cellen te 'ongedifferentieerd', maar het proces van cellulaire differentiatie, zelfs in eenvoudige meercellige organismen, kan niet gemakkelijk op natuurlijke wijze worden teruggedraaid. Dit komt omdat hun genetische regulatiepatronen permanent zijn veranderd. Als je echter bacteriële cellen uit een biofilm verwijdert en hun omgevingscondities radicaal verandert, zullen ze zich snel aanpassen aan hun nieuwe omgevingsomgeving en fenotypische veranderingen vertonen. Afhankelijk van de omstandigheden waarin ze worden gekweekt, zullen ze zelfs teruggaan naar de planktonische groeiwijze. Bacteriële cellen differentiëren niet, maar reageren op hun omgeving door hun genexpressie aan te passen aan hun eigen overlevingsbehoeften. Om deze reden is het nauwkeuriger om naar biofilms te verwijzen als interactieve gemeenschappen in plaats van ze te vergelijken met meercellige organismen. Desalniettemin is de levensstijl van de gemeenschap waarschijnlijk een belangrijke motivatie voor biofilmvorming en biedt het haar leden een aantal voordelen. Naast het voordeel van weerstand tegen veranderingen in de omgeving, dat wordt besproken in de verdedigingssectie, kan de biofilm profiteren van een aantal eigenschappen van een gemeenschappelijk bestaan, waaronder verdeling van de metabole belasting, genoverdracht en onbaatzuchtig gedrag.

3.1.1 Verdeling van de metabole belasting

Diffusiebeperkingen veroorzaakt door de biofilmstructuur resulteren in lokale variaties in de beschikbaarheid van voedingsstoffen, pH en zuurstofspanning. Daarom zijn de bacteriën in biofilms onvermijdelijk heterogeen met betrekking tot genexpressie. Veel biofilms zijn opgebouwd uit verschillende bacteriesoorten en sommige bevatten zelfs mengsels van bacteriën en schimmels. De leden van deze gemengde biofilms hebben verschillende vereisten en voeren verschillende metabolische functies uit, waardoor commensalisme een wijdverbreid fenomeen is in biofilms [26]. Terwijl vroege kolonisatoren van de mondholte bijvoorbeeld aëroob of facultatief anaëroob zijn, biedt beperkte zuurstofdiffusie door de biofilm een ​​omgevingsniche die latere kolonisatie door obligate anaëroben mogelijk maakt [7]. Een studie waarin de activiteit van de promotor werd gevolgd als een functie van de expressie van een fluorofoor, gaf aan dat heterogeniteit in de genexpressieprofielen van de individuele cellen zelfs bestaat binnen biofilms van één soort [30]. Het is waarschijnlijk dat deze heterogeniteit zich vertaalt in gespecialiseerde functies van cellen binnen een biofilm [30]. Vruchtlichaamvorming door Myxobacteriën wordt vaak genoemd als voorbeeld van celspecialisatie in bacteriën en het is een aantrekkelijk idee dat dit fenomeen ook bij andere bacteriën voorkomt [26]. Hoewel het niet definitief is bewezen, kan de heterogeniteit binnen biofilms inderdaad leiden tot een soort "arbeidsverdeling" en zeker de metabole efficiëntie van de bevolking als geheel verhogen.

Een populaire opvatting is dat een dergelijke taakverdeling gecoördineerd wordt gereguleerd binnen biofilms door middel van intercellulaire communicatie. Auto-inducerende signalen zijn kleine moleculen, in het algemeen homoserinelactonen in gramnegatieven en peptiden in grampositieven, die constitutief worden afgegeven door bacteriën en die, indien aanwezig in een kritische concentratie, de expressie van bepaalde genen zullen induceren. Auto-inducerende signalen worden vaak quorum-sensing-signalen genoemd, omdat wanneer een bacteriële populatie een voldoende hoge dichtheid bereikt, de lokale concentraties drempelniveaus bereiken en genexpressie veranderen. Het is echter niet overtuigend aangetoond dat bacteriën daadwerkelijk reageren op de accumulatie van een quorum, en er is gesuggereerd dat de meer biologisch significante rol van de auto-inducerende signalen is om informatie door te geven aan de bacteriële cel over lokale diffusiesnelheden [31]. In haar provocerende recensie suggereert Dr. Rosemary Redfield dat de expressie van uitgescheiden eiwitten wordt geïnduceerd in aanwezigheid van verhoogde niveaus van auto-inducerende signalen, niet omdat de bacteriën zijn geëvolueerd om samen te werken, maar omdat de voordelen van uitgescheiden eiwitten worden gerealiseerd door een individuele bacteriële cel wanneer lokale omstandigheden diffusie en vermenging beperken [31]. Een voorbeeld dat wordt gebruikt is de uitscheiding van een protease dat nodig is om exogene eiwitten af ​​te breken zodat de bacteriën aminozuren kunnen assimileren. Onder omstandigheden van verminderde diffusie of vermenging, zouden uitgescheiden proteasen en de daardoor afgebroken eiwitten in de buurt van de cel blijven en hiervan profiteren. Het is daarom logisch dat bacteriën de expressie van uitgescheiden eiwitten zouden beperken onder omstandigheden van hoge menging en diffusie. Er zijn ook voorbeelden van autoinducer-effecten die niet direct in dit model passen. Het diffusiedetectiemodel suggereert dat een bacteriële cel reageert op zijn eigen uitgescheiden signalen, maar herkenning van en reactie op signalen die worden uitgescheiden door heterologe soorten is goed gedocumenteerd [32]. Het is waarschijnlijk dat zowel diffusie-detectie als quorum-sensing aspecten zijn van auto-inducerende signalen, maar een nauwkeuriger antwoord met rollen voor beide fenomenen wacht op verder onderzoek.

Hoewel de primaire functie van auto-inducerende signalen onduidelijk blijft, is hun rol in de ontwikkeling van biofilm zelfs nog onduidelijker. Zoals aangegeven in tabel 1, vond één onderzoek een rol voor het LuxS-systeem in S. mutans maar twee aanvullende onderzoeken gaven aan dat LuxS niet nodig was voor biofilmvorming [12, 33, 34]. Evenzo verwarrende resultaten werden verkregen toen verschillende onderzoekers de rol van de lasRlasI quorum-sensing systeem in P. aeruginosa[ 35]. Verder is er bewijs dat de accessoire genregulator (Agr), die betrokken is bij quorum-sensing in de stafylokokken, daadwerkelijk de vorming van biofilm remt [36]. Een recentere studie suggereert dat het Agr-effect afhankelijk is van de vloeisterkte over de biofilm en dat Agr onder statische omstandigheden de vorming van biofilms vermindert, bij lage tot matige stroming geen invloed heeft op de vorming van biofilms en onder zeer sterke stroming de biofilmvorming verhoogt [30]. Deze resultaten kunnen de diffusiegevoelige theorie ondersteunen als men bedenkt dat onder snelle stroom de auto-inducerende signalen snel uit de biofilm kunnen diffunderen.

Over het algemeen vertegenwoordigt een biofilm zowel een quorum als beperkingen op diffusie, dus ongeacht of men de diffusiegevoelige of de quorumgevoelige hypothese accepteert, lijkt het, althans oppervlakkig, dat auto-inducerende signalen de ontwikkeling ervan beïnvloeden. In delen van het menselijk lichaam, vooral op plaatsen zoals hartkleppen en tanden, worden biofilms echter onderworpen aan sterke schuifkrachten die de auto-inducerende signaalniveaus laag kunnen houden. Een recent rapport geeft aan dat in de menselijke long het acyl-homoserine lacton quorum-waarnemende signaal van P. aeruginosa wordt geïnactiveerd door een niet-geïdentificeerde gastheercel-geassocieerde factor [37]. Wijst dit op de overbodigheid van quorum-sensing en betekent dit dat? P. aeruginosa een biofilm in de long kan vestigen ondanks immuungemedieerde remming van quorum-sensing, of suggereert de bevinding dat het immuunsysteem dit signaal target op het belang ervan bij biofilmvorming? Het antwoord is onduidelijk en de rol van quorum-sensing bij biofilmvorming blijft ongrijpbaar.

3.1.2 Genoverdracht

Nucleïnezuur is de basis voor evolutie en bijgevolg is het enige echte doel om zijn eigen specifieke code te repliceren en te bestendigen. Een reproductief fitnessvoordeel zal het genetische materiaal van een individu in stand houden. Dezelfde regels zijn van toepassing op verplichte infectieuze agentia zoals virussen en plasmiden, en aangezien deze agentia hun eigen genetisch materiaal niet kunnen repliceren, zouden ze ophouden te bestaan ​​zonder een middel om zich van het ene organisme naar het andere te verspreiden. Bacteriofaag en plasmiden hebben daarom beide mechanismen ontwikkeld om hun instandhouding binnen een bacterie en hun verspreiding naar andere bacteriën te bevorderen. Bacteriofagen vertragen bijvoorbeeld hun replicatieve machinerie en integreren in het bacteriële chromosoom, zodat hun genoom wordt gerepliceerd terwijl de cel zich deelt. Plasmide-replicatie is een duur proces voor een bacteriële cel en plasmiden gaan snel verloren, tenzij ze nodig of nuttig zijn. Plasmiden hebben daarom een ​​nogal ingewikkelde overlevingsmethode ontwikkeld. Ze dragen toxine-antitoxine-genparen die hun onderhoud noodzakelijk maken voor bacteriële overleving [38]. Het door plasmide gecodeerde toxine is een stabiel eiwit en het antitoxine is een labiel eiwit. Wanneer een bacteriële cel zich deelt, erft de dochtercel zowel toxine als antitoxine. Als de cel er niet in slaagt het plasmide te repliceren terwijl het zich deelt of als de dochtercel het plasmide niet erft, neemt de toevoer van labiele antitoxine snel af, terwijl het toxine blijft hangen en de plasmide-vrije dochtercel vernietigt.

Deze sluwe onderhoudsmethoden zorgen voor verticale overdracht van fagen en plasmiden, maar om succesvol te zijn, moet een faag of infectieus plasmide ook horizontale overdracht gebruiken. Een biofilm is de ideale omgeving voor horizontale uitwisseling van genetisch materiaal [39]. De nabijheid bevordert een snelle verspreiding van fagen evenals conjugatie en opname van plasmide-DNA door competente bacteriën. Plasmiden en fagen hebben bijgevolg methoden ontwikkeld om de overgang naar de biofilm-groeiwijze in hun gastheer te induceren, zodat ze zich naar niet-geïnfecteerde bacteriën kunnen verspreiden en soms zelfs de soortbarrière kunnen passeren [40]. Dr. Jean-Marc Ghigo ontdekte dat de pili gecodeerd in een aantal conjugatieve plasmiden zich niet-specifiek hechten aan vaste oppervlakken en aan andere bacteriën, wat leidt tot een dramatische toename van de vorming van biofilms van E coli en andere Gram-negatieve bacteriën [41]. Door de overgang naar de biofilm-groeimodus te induceren, vergroot het plasmide waarschijnlijk zijn kansen op horizontale transmissie. Daarnaast worden een aantal faaggenen, waaronder faagmanteleiwitgenen, geactiveerd in P. aeruginosa biofilms, wat het idee ondersteunt dat een effectieve strategie voor horizontale faagtransmissie is om opnieuw de infectieuze cyclus in te gaan tijdens de biofilm-groeimodus [19]. In feite moeten we misschien bedenken dat biofilmvorming niet alleen de bacteriële fitheid ten goede komt, maar ook het proliferatieve potentieel van bacteriofaag en plasmiden.

Horizontale genoverdracht binnen biofilms kan de bacteriën ook direct ten goede komen door de uitwisseling van determinanten van antibioticaresistentie. In S. gordonii, is de expressie van competentiefactoren geïmpliceerd als zowel een oorzaak als een gevolg van biofilmvorming die een rol ondersteunt voor de uitwisseling van genetisch materiaal in biofilms [39, 42]. Of de primaire functie van competentiefactoren is om extern DNA te assimileren als een middel om hun genetische diversiteit te vergroten of gewoon om het als voedingsbron te gebruiken, is controversieel, maar het eindresultaat is dat de biofilm een ​​ideale omgeving is voor de uitwisseling van genetisch materiaal . De motivatie van bacteriën zelf, evenals plasmiden en bacteriofagen om genetisch materiaal uit te wisselen, kunnen allemaal een belangrijke rol spelen in het proces van biofilmontwikkeling.

3.1.3 Onbaatzuchtig gedrag

Over het algemeen genieten bacteriën een aantal voordelen vanwege hun gemeenschapswijze van groei, maar zijn bacteriën echt coöperatief en in staat om onzelfzuchtig of zelfs altruïstisch gedrag te vertonen? Experimenteel bewijs van wiskundige modellering ondersteunt inderdaad het concept dat bacteriën altruïstisch gedrag kunnen vertonen [28]. Hoewel dit in eerste instantie de regels van survival of the fittest lijkt te tarten, geven de modellen aan dat onzelfzuchtig gedrag bij biofilmbewoners de algehele groeiopbrengst kan verhogen. Daarom zijn altruïstische bacteriën, ondanks een opoffering in groeisnelheid, onder bepaalde omstandigheden eigenlijk meer geschikt. De resultaten van deze onderzoeken suggereren ook dat altruïsme efficiënter is wanneer de bacteriën in kleine, klonale clusters voorkomen, wat misschien de microkolonievorming die kenmerkend is voor biofilms verklaart. Fitness hoeft geen agressie met zich mee te brengen, gunstige symbiotische relaties kunnen de opbrengst verhogen, en Darwins theorieën over evolutie door middel van competitie en fitness kunnen toepasselijk worden toegepast op onzelfzuchtig gedrag.

Er is steeds meer bewijs dat een proces dat lijkt op apoptose daadwerkelijk kan plaatsvinden in bacteriën. Homologen van pro-apoptotische genen zoals caspases zijn wijdverbreid onder bacteriën [43]. Bovendien zijn er verschillende voorbeelden gevonden van toxine-antitoxinecassettes, vergelijkbaar met die welke zorgen voor het behoud van plasmiden, gevonden in de chromosomen van gram-negatieve en gram-positieve bacteriën, en er is gesuggereerd dat geprogrammeerde celdood kan optreden binnen de biofilmgemeenschap [ 38]. Een rationalisatie voor altruïstisch gedrag bij bacteriën is dat het de metabolische belasting vermindert en de beschikbaarheid van voedingsstoffen voor de overlevenden verhoogt. Dit soort onzelfzuchtig gedrag zou kunnen worden verklaard in een klonale populatie van bacteriën waar de dood van sommigen nog steeds resulteert in bestendiging van de genetische code. Dit type fenomeen wordt gerationaliseerd door het kin-selectiemodel [43]. Bacteriële biofilms zijn echter zelden klonaal en overlevende bacteriën zouden de opofferende bacteriën snel overtreffen. Een meer plausibele hypothese met betrekking tot de chromosomale toxine-antitoxinecassettes is onlangs voorgesteld door Dr. Kim Lewis. Hij suggereert dat de cassettes, in een fractie van de bacteriële populatie, geen dood veroorzaken, maar een rustige, persistente toestand die overleving mogelijk maakt in het geval van een plotselinge ongunstige verandering van het milieu [3]. Over het algemeen is het idee dat bacteriële cellen geprogrammeerde celdood kunnen ondergaan, hoewel aantrekkelijk, niet onmiddellijk logisch met betrekking tot de wetten van evolutie, maar alleen verdere experimenten zullen deze vraag oplossen.


Biofilm

Onze redacteuren zullen beoordelen wat je hebt ingediend en bepalen of het artikel moet worden herzien.

Biofilm, aggregaat van bacteriën bijeengehouden door een slijmachtige matrix van koolhydraten die zich aan een oppervlak hecht. Biofilms kunnen zich vormen op het oppervlak van vloeistoffen, vaste stoffen en levende weefsels, zoals die van dieren en planten. Organismen in biofilms vertonen vaak wezenlijk andere eigenschappen dan hetzelfde organisme in de individuele of vrijlevende (plankton) toestand. Gemeenschappen ontstaan ​​wanneer individuele organismen, die van dezelfde of verschillende soorten kunnen zijn, zich hechten aan en zich ophopen op een oppervlak. Dit proces wordt adsorptie genoemd. Na een periode van groei en voortplanting produceren de organismen een extracellulaire matrix die bestaat uit koolhydraten, polysachariden genaamd. Deze matrix dient om de bacteriën bij elkaar te houden en onomkeerbaar aan het oppervlak te binden.

Bacteriën die zich hebben geaggregeerd tot biofilms, kunnen informatie communiceren over populatiegrootte en metabolische toestand. Dit type communicatie wordt quorum sensing genoemd en werkt door de productie van kleine moleculen die auto-inducers of feromonen worden genoemd. De concentratie van quorumgevoelige moleculen - meestal peptiden of geacyleerde homoserinelactonen (AHL's speciale signaalchemicaliën) - is gerelateerd aan het aantal bacteriën van dezelfde of verschillende soorten in de biofilm en helpt bij het coördineren van het gedrag van de biofilm.

Biofilms zijn voordelig voor bacteriën omdat ze een voedingsrijke omgeving bieden die de groei bevordert en omdat ze resistentie tegen antibiotica verlenen. Biofilms kunnen ernstige infecties veroorzaken bij gehospitaliseerde patiënten. De vorming van biofilms wordt in deze gevallen meestal geassocieerd met de introductie in het lichaam van vreemde substraten, zoals kunstmatige implantaten en urinekatheters. Biofilms vormen zich ook op de dunne films van tandplak die op tanden worden gevonden, waar ze suikers en zetmeel in zuren fermenteren, waardoor het tandglazuur wordt vernietigd. In het milieu spelen biofilms een belangrijke rol bij de afbraak van organisch afval door afval uit water te filteren en door verontreinigingen in de bodem te verwijderen of te neutraliseren. Als gevolg hiervan worden biofilms gebruikt om water in waterzuiveringsinstallaties te zuiveren en verontreinigde delen van het milieu te ontgiften.

Dit artikel is voor het laatst herzien en bijgewerkt door Robert Lewis, assistent-redacteur.


Voorkeuren

Afdeling Toegepaste Wetenschappen, Indian Institute of Information Technology Allahabad, Allahabad, 211012, India

Debjani Banerjee, P. M. Shivapriya, Pavan Kumar Gautam, Krishna Misra, Amaresh Kumar Sahoo & Sintu Kumar Samanta

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

U kunt deze auteur ook zoeken in PubMed Google Scholar

Corresponderende auteur


Bekijk de video: Caulobacter biofilm 3D (Januari- 2022).