Informatie

Dynamiek van celnanodeeltjes in bloed


Ik probeer de dynamiek van een bepaalde cel in omloop wiskundig te modelleren en zijn binding aan een ander nanodeeltje dat intraveneus wordt geïnjecteerd. De concentratie van deze cel is erg laag (ongeveer 5 cellen per ml bloed). Ik wil zien hoeveel nanodeeltjes er nodig zijn om aan zoveel mogelijk van deze zeldzame cellen te binden.

Dus eerst probeer ik de celdynamiek in de bloedstroom te modelleren. Ik weet niet zeker hoe ik moet beginnen. Ik wilde de celbeweging door het hele cardiovasculaire systeem modelleren, maar ik zou het moeten vereenvoudigen. Ik denk erover om de bloedstroom door enkele van de belangrijkste orgaansystemen te modelleren en de absorptie door de haarvaten te schatten. Ik denk aan zoiets als het fysiologisch gebaseerde farmacokinetische model (PBPK). Er zouden echter enkele parameters zijn waarvan ik niet zou weten die ik nodig zou hebben voor het model (tenminste dat is wat ik denk, ik ben nieuw in farmacokinetiek) Ook voor de feitelijke vloeistofdynamica weet ik niet zeker hoe modelleer dit, omdat het bloed niet alleen een vloeistof is, en veel andere cellen heeft, dus ik weet niet of er nog andere effecten zijn.

Dus mijn vraag is, in welke richting moet ik gaan om de dynamiek van deze cel in omloop te modelleren? Ik wil de circulatie in het hele cardiovasculaire systeem modelleren, omdat ik ook de andere dynamiek van nanodeeltjes moet modelleren, en hoe waarschijnlijk het is om sommige receptoren op de cel te vinden en eraan te binden. Is er een voorbeeld van een soortgelijk model dat is gemaakt?


Om de PBPK-route te volgen:

Ik zou aanraden om de organismeparameters en structuur van het hele lichaam platformmodel van Shah en Betts te gebruiken.

  • Shah, DK & Betts, AM J Pharmacokinet Pharmacodyn (2012) 39: 67. doi: 10.1007/s10928-011-9232-2

Ze hebben een plasmaruimtevolume, plasmastroom, bloedcelruimtevolume en bloedcelstroom toegewezen voor elk orgaan en het totale lichaam. De basismodelstructuur voor circulatie is compleet als u de vergelijkingen voor de bloedcelruimte in dit artikel als basis gebruikt (Vgl 2 en Vgl 5).

Zodra de modelstructuur is voltooid, is stap 2 het modelleren van alle processen die de cel in elk compartiment kunnen beïnvloeden. Als de cel zich aan een nanodeeltje hecht, zou een compartimentvergelijking dan kunnen zijn:

d[cel]/dt = (stroom in - stroom uit)/volume + Kon x [nano] x [cel] - Koff x [cel-nano-complex]

Om de interactie van de cel met het nanodeeltje te modelleren, moet je beide binnen dezelfde structuur modelleren. Een overzicht van PBPK-modellering voor nanodeeltjes is hier te vinden:

  • Fysiologisch gebaseerde farmacokinetische modellering van nanodeeltjes Mingguang Li, Khuloud T. Al-Jamal, Kostas Kostarelos en Joshua Reineke ACS Nano 2010 4 (11), 6303-6317 doi: 10.1021/nn1018818

Een farmacokinetisch (top-down, klassiek) model voor nanodeeltjes in de bloedsomloop kan ook inzicht geven in het modelleren van de processen die nanodeeltjes beïnvloeden in vivo. Dit model houdt rekening met vloeistofdynamica, poriegrootte en specifieke eigenschappen van nanodeeltjes.

  • Kirtane, A.R., Siegel, R.A. en Panyam, J. (2015), een farmacokinetisch model voor het kwantificeren van het effect van vasculaire permeabiliteit op de keuze van geneesmiddeldrager: een raamwerk voor gepersonaliseerde nanogeneeskunde. J. Farm. Wetenschap, 104: 1174-1186. doi:10.1002/jps.24302

Modellering van het transport van nanodeeltjes onder de bloedstroom met behulp van een op agenten gebaseerde benadering

Door bloed gemedieerde toediening van nanodeeltjes is een nieuw en groeiend veld in de ontwikkeling van therapieën en diagnostiek. Eigenschappen van nanodeeltjes zoals grootte, vorm en oppervlaktechemie kunnen worden gecontroleerd om hun prestaties in biologische systemen te verbeteren. Dit maakt modulatie van interacties met het immuunsysteem, het bloedklaringsprofiel en de interactie met doelcellen mogelijk, waardoor een effectieve levering van vracht in cellen of weefsels wordt bevorderd. Hun vermogen om weefsels vanuit het bloed aan te vallen en binnen te gaan, is sterk afhankelijk van hun gedrag onder de bloedstroom. Hier hebben we een op agenten gebaseerd model van het gedrag van nanodeeltjes onder de bloedstroom in haarvaten geproduceerd. We tonen aan dat rode bloedcellen zeer belangrijk zijn voor een effectieve distributie van nanodeeltjes in haarvaten. Bovendien gebruiken we dit model om aan te tonen hoe de grootte van nanodeeltjes selectief tumorweefsel kan richten op normaal weefsel. We tonen aan dat de polydispersiteit van populaties van nanodeeltjes een belangrijke overweging is bij het bereiken van optimale specificiteit en het vermijden van off-target effecten. In de toekomst zou dit model kunnen worden gebruikt voor het informeren van nieuw ontwerp van nanodeeltjes en om algemene en specifieke opname-eigenschappen onder de bloedstroom te voorspellen.


Nanodeeltjes kunnen ontstekingen beperken door het immuunsysteem af te leiden

Een verrassende bevinding suggereert dat een injectie met nanodeeltjes kan helpen het immuunsysteem te bestrijden wanneer het in de war raakt, hebben onderzoekers van de Universiteit van Michigan aangetoond. De nanodeeltjes leiden immuuncellen die ontstekingen veroorzaken weg van de plaats van de verwonding.

Ontsteking is een tweesnijdend zwaard. Als het werkt, helpt het het lichaam te genezen en bestrijdt het infecties. Maar soms reageert het immuunsysteem overdreven. Een acuut longletsel, bijvoorbeeld opgelopen door het inademen van rook, kan leiden tot een op hol geslagen vloeistofproductie die in wezen een persoon verdrinkt.

Nu suggereren experimenten bij muizen dat eenvoudige plastic nanodeeltjes, afgeleverd door IV, een type immuuncel - een neutrofiel genaamd - te druk kunnen houden om ontstekingen te veroorzaken. Andere ziekten waarbij neutrofielen overmatige ontsteking veroorzaken, zijn onder meer sepsis en de verharding van de slagaders of atherosclerose.

"Neutrofielen zijn de eerste verdedigingslinie. Ze zijn het meest actief en het meest geoptimaliseerd om een ​​ontstekingsreactie op te wekken", zegt Omolola Eniola-Adefeso, een professor in chemische technologie en biomedische technologie aan de UM, die het onderzoek leidde. "Ze zijn de underdogs van witte bloedcellen, en we zien dat we misschien meer aandacht aan hen moeten besteden."

Ze begon er niet aan om het immuunsysteem om te buigen met nanodeeltjes. In plaats daarvan heeft haar werk de dynamiek in bloedvaten onderzocht die het vermogen van nanodeeltjes om medicijnen aan de bloedvatwand en daarbuiten te leveren, helpen of schaden. In experimenten lieten haar studenten bloed door kunstmatige bloedvaten lopen - kanalen geëtst in een chip en bekleed met dezelfde soort cellen die de bloedvatwanden bekleden.

Eerst zagen ze alleen dat de neutrofielen hun plastic deeltjes verbannen, die waren ontworpen om zich aan de bloedvatwand te hechten. Dit was een probleem, want als de deeltjes niet konden binden, konden ze geen medicijnen afgeven aan ziek weefsel. Maar nadat ze de videobeelden van de microscoop vele malen hadden bekeken, realiseerden ze zich dat de neutrofielen ook verdwenen waren - ze waren ook niet gebonden aan de bloedvatwand.

"Het 'oh mijn God' van afschuw over ons deeltje veranderde in een opwinding over deze deeltjes die iets deden met cellen die nog niet eerder waren onderzocht," zei Eniola-Adefeso. "Deze coole interacties tussen cellen en deeltjes stonden een van beide in de weg om te doen wat ze wilden doen."

Haar team ontwierp een experiment waarbij een deel van de bloedvatwand in de microfluïdische chips werd beschadigd en bevestigde dat de neutrofielen hun aandacht verlegden van het veroorzaken van ontstekingen op de plaats van de verwonding naar het wegvoeren van de vreemde deeltjes.

Vervolgens verbond Eniola-Adefeso zich met Michael Holinstat, een professor in farmacologie aan Michigan Medicine, die technologie heeft die in de bloedvaten van levende muizen kan kijken. Bij muizen met acuut longletsel ontdekten ze dat het injecteren van nanodeeltjes door IV het aantal neutrofielen dat zich op de plaats van de verwonding verzamelt, met de helft of meer kon verminderen.

In feite was de neutrofielconcentratie vergelijkbaar met de concentratie die werd gevonden in het bloed van niet-verwonde muizen. In plaats daarvan brachten de neutrofielen de deeltjes naar de lever, waar ze uit de circulatie konden worden verwijderd. Eniola-Adefeso is van plan het onderzoek in deze richting voort te zetten, om uit te zoeken of een injectie van nanodeeltjes een levensvatbare behandeling is voor aandoeningen met overmatige ontsteking.

Haar groep zal ook doorgaan met het oplossen van problemen met nanodeeltjes als vehikels voor gerichte medicijnafgifte. Een manier om de neutrofielen weg te houden, is door de deeltjes te bekleden met zogenaamde niet-vervuilende materialen - materialen die resistent zijn tegen het opnemen van eiwitten uit het bloed.

Omdat de chemicaliën die het team gebruikt om de nanodeeltjes aan de bloedvatwanden te hechten dezelfde zijn als die welke door de neutrofielen zelf worden gebruikt, zal een coating die niet-vervuilende materialen combineert met de targetingchemicaliën de meeste witte bloedcellen van de geur afstoten.

"Tot op heden hebben we veel niet-vervuilende materialen geprobeerd, maar uiteindelijk vervuilen ze omdat de natuur erg geavanceerd is," zei ze.

Als alternatief hebben andere onderzoeksgroepen geprobeerd de membranen te nemen van cellen die van nature naar het beoogde weefsel reizen - bijvoorbeeld de neutrofielen die zich aan de bloedvatwand hechten - en nanodeeltjes erin te plaatsen. Zoals de alien in de menselijke huid uit de film 'Men in Black'.


Resultaten en discussie

Optische vangst van nanodeeltjes in levende zebravissen

De optische transparantie van de dunne zebravislarven (aanvullende film 1 aanvullende figuur 1) is uniek onder in vivo gewervelde modellen en een van de belangrijkste redenen voor zijn immense populariteit als modelsysteem. Met dit in gedachten hebben we getest of de zebravis ook 'optisch doorzichtig' was voor de infrarode laserstraal van de optische pincet en of deze benadering kon worden gebruikt om verschillende structuren in de levende larve te manipuleren.

Een recent opkomende toepassing van de zebravis als modelsysteem is op het gebied van nanogeneeskunde 12 . Hiervoor kunnen nanodeeltjes geladen met medicijnen en op hun oppervlak gedecoreerd met (potentieel) targetingfactoren worden geïnjecteerd, waardoor hun biodistributie en bloedcirculatie kunnen worden gevolgd met behulp van live-beeldvorming. Om te bepalen of dergelijke geïnjecteerde deeltjes in de complexe omgeving van de vissen kunnen worden gevangen, hebben we latexdeeltjes in 2-dagen oude vislarven geïnjecteerd (volgens een recent ontwikkeld protocol 12 , zie ook Methoden, Aanvullende Film 2 en Aanvullende Fig. 2 ). De deeltjes verspreidden zich gemakkelijk door de bloedsomloop en na verloop van tijd hechtte een toenemend deel van de nanodeeltjes zich ofwel aan de endotheelbekleding van de bloedvaten of werden opgenomen door macrofagen.

Na het monteren van de vis in de optische pincetmicroscoop (aanvullende figuur 3), gebruikten we transmissiemicroscopie om interessante deeltjes te selecteren die zich hadden gehecht aan het endotheel langs de staartader (figuur 1a). Vervolgens werd de OT ingeschakeld en konden we voorzichtig enkele deeltjes van het endotheel verwijderen (Fig. 1a bij 3, 5 s, zie ook Aanvullende Film 3). Vervolgens konden de deeltjes worden verplaatst en ook tegen de richting van de snelle bloedstroom in worden bewogen (200 m s 1 in de ader en ∼ 700 m s 1 in de slagader 14 ), wat wijst op sterke insluiting. In het getoonde voorbeeld (Fig. 1a) raakt een erytrocyt op tijdstip 5.4 s de optische val, waardoor het deeltje uit de val wordt losgemaakt. Intrigerend genoeg werd het losgeraakte deeltje vervolgens veerachtig teruggetrokken naar het oorspronkelijke adhesiepunt. Dit gaf aan dat het deeltje was verbonden via een nanobuis (zoals eerder beschreven 15 ), die een trekkracht op het deeltje uitoefende, die de ketting na terugtrekking opnieuw in het endotheel opnam. Deze manipulaties zouden kunnen worden uitgevoerd met een trapping-laservermogen van 500 mW, ongeveer 10% van de maximaal beschikbare kracht (overeenkomend met ongeveer 75 mW in het monster). Dit toont aan dat statisch hechtende deeltjes kunnen worden gevangen in de zebravis, waardoor het mogelijk wordt om details van interactie te onderzoeken die niet mogelijk zijn met andere methoden.

(een) Een deeltje (groene pijlpunt) gehecht aan het endotheel van de staartader (aangegeven met blauwe stippellijnen) wordt van het endotheel weggetrokken in de snelle bloedstroom (paarse pijl) met behulp van een optisch pincet (zwart dradenkruis). Op tijdstip 5,5 s wordt een erytrocyt in de val getrokken. Dit vervangt het deeltje in de val dat vervolgens wordt teruggetrokken naar het oorspronkelijke adhesiepunt van het endotheel, vermoedelijk door een verbindende nanobuis. Experiment minstens 80 keer herhaald. (B) Vier afzonderlijke deeltjes (genummerd) worden uit de bloedstroom gevist en naar een beschut gebied aan het uiteinde van de staart verplaatst. Paarse pijlen geven de stroomrichting aan. Experiment werd minstens 10 keer herhaald. Schaalbalk, 5 m.

Nadat we hadden vastgesteld dat een reeds vastgehecht deeltje kon worden ingevangen, onderzochten we vervolgens of het mogelijk was om deeltjes op te vangen die met hoge snelheid in de bloedbaan werden geïnjecteerd en met de stroom meebewogen 14 . Om dit te doen, hebben we gebruik gemaakt van de beschikbare time-sharing multiplexing-optie van het optische pincetsysteem door de vanglaser met hoge snelheid over verschillende posities te scannen, meerdere vallen kunnen worden gemaakt die kunnen worden gebruikt om een ​​groot aantal objecten parallel te vangen 16 . Zo verdeelden we verschillende ‘visvallen’ door de bloedbaan. In Fig. 1b (aanvullende film 4) waren met behulp van twee vallen al twee deeltjes (gemarkeerd met '1' en '2') naar de staart verplaatst naar een gebied met een lagere stroomsnelheid buiten de hoofdbloedstroom (paarse pijlen). Vervolgens werd een ander deeltje (‘3’) gevangen (19,7 s) en samen met de twee andere deeltjes bewogen, terwijl een ander deeltje (‘4’) in de stroom op t=20 s. Om de positioneringscontrole te demonstreren die het gemultiplexte pincet mogelijk maakt: in vivo, werden de deeltjes eerst in een rechte lijn (32 s) gepositioneerd en vervolgens opnieuw gepositioneerd in een vierkante vorm (39,1 s). Het vangen van meerdere deeltjes in de bloedstroom en de daaropvolgende reorganisatie van hun relatieve posities demonstreert de robuustheid van het vangen en de veelzijdigheid van experimenten die bijvoorbeeld mogelijk zijn door gelijktijdig contact tot stand te brengen tussen verschillende deeltjes en specifieke cellen (aanvullende film 5 aanvullend Afb. 4).

Het vangen was mogelijk door de hele vis en tot een diepte van 100 m verwijderd van het onderste dekglas (inclusief zebravis en medium, aanvullende figuur 3) en we hebben bijvoorbeeld cellen en deeltjes in het kloppende hart gevangen. We ontdekten echter dat de meest eenvoudige vangst kon worden gedaan in de staartader en slagader in het (dunnere) staartgebied van de vis, op een diepte van ongeveer 50 m, waar de arteriële bloedstroom van retrograde transport naar de staart naar anterograde gaat. transport naar de kop van de vis. De experimenten tonen aan dat de hechtende eigenschappen van deeltjes in de levende vis kunnen worden getest met behulp van micromanipulatie, zelfs in het snelstromende bloed in de staartslagader. We hebben met succes polystyreendeeltjes van 200 nm tot 1 m diameter gevangen en verplaatst, maar de meeste experimenten uitgevoerd met deeltjes met een diameter van 840 nm (zie de sectie Methoden, fluorescentie-emissiepiek bij ∼ 700 nm) of 1 μm (niet-fluorescerend) vanwege hun heldere zichtbaarheid en hogere vangstijfheid 17 . Het vertragen van de bloedstroom met behulp van het verdovingsmiddel tricaïne 18 vergemakkelijkt optische vangst en maakt het ook mogelijk kleinere deeltjes tot 200 nm te verplaatsen, hoewel dit moeilijker was vanwege de lagere invangstijfheid en het feit dat kleinere deeltjes moeilijk te onderscheiden waren met heldere veld transmissie microscopie. Met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie konden de deeltjes echter worden geïdentificeerd. De grotere deeltjes zouden zonder duidelijke verhittingsschade gedurende langere tijd in het vaatstelsel kunnen worden opgesloten met laservermogens van 100 mW tot 3 W (ongeveer 15 mW tot ∼ 450 mW in het monster). Een paar verspreide donkere gebieden (mogelijk pigmenten die zich hadden ontwikkeld ondanks het gebruik van fenylthioureum (PTU), zie Methoden) hadden echter een sterke wisselwerking met de OT, en toen de OT tijdelijk over deze gebieden werd bewogen, raakten ze zichtbaar beschadigd, vermoedelijk door verhitting. Door deze gebieden te vermijden, werd echter geen waarneembare schade waargenomen in de loop van de experimenten.

Opvangen van cellen in levende zebravissen

Traditioneel worden voor experimenten met optische pincetten bolvormige deeltjes met een hoge brekingsindex gebruikt omdat ze met een hoge stijfheid kunnen worden ingesloten en ze bijzonder geschikt zijn voor valkalibratie voor kwantitatieve experimenten. Voor andere toepassingen is ruimtelijke micromanipulatie echter het cruciale kenmerk, aangezien objecten zoals cellen, deeltjes of andere objecten op nano-micronschaal op goed gedefinieerde tijdstippen en posities met elkaar in contact kunnen worden gebracht, wat de mogelijkheid opent voor analyse dynamiek niet toegankelijk via passieve observatie.

Omdat we ontdekten dat deeltjes gemakkelijk en robuust door de hele zebravis kunnen worden gevangen, vroegen we vervolgens of cellen ook in de vis konden worden gemicromanipuleerd. Bij afwezigheid van deeltjes en met behulp van hogere laservermogens (ongeveer 2 W systeeminstelling, ∼ 250 mW in het monster), activeerden we de optische val in het midden van de staartader, wat bijna onmiddellijk resulteerde in de immobilisatie van een erytrocyt in de val. Deze cellen konden stabiel in positie worden gehouden tegen de volledige stroom van de bloedstroom in (Fig. 2a Aanvullende Film 6) en zouden zelfs in de richting tegen de bloedstroom kunnen worden bewogen. We ontdekten dat de kern van de zebraviserytrocyten 19 het sterkst vastzat. In Fig. 2a is een membraan in een 'zak'-achtige vorm te zien achter de stabiel opgesloten kern, deze vervorming wordt veroorzaakt door de sleepkracht die het bloed uitoefent en lijkt op de bubbels die zich vormen als gevolg van lokale verwarming van cellen 20 . Dit experiment toont aan dat in de zebravis optische vangst van erytrocyten sterk is en robuuster lijkt dan die in muizenoor 8, waar het vangen geleidelijk moest gebeuren terwijl cruciaal gebruik werd gemaakt van de wand van het bloedvat. Een mogelijke verklaring hiervoor kan zijn dat erytrocyten bij muizen een kern missen.

(een) Een erytrocyt wordt opgesloten en verplaatst in de bloedstroom. Schaalbalk, 10 m. Experiment minstens 10 keer herhaald. (B) Een in het bloed aanwezige fluorescerende macrofaag (gele, groene omtrek in t=0 s) werd gemicromanipuleerd en in 3D in een bloedvat bewogen. De witte omtrek geeft een andere, niet-mobiele macrofaag aan. De rode stippen zijn geïnjecteerde deeltjes. Schaalbalk, 5 m. Experiment minstens 5 keer herhaald. (C) Een geïnjecteerd deeltje (rode kleur) dat geassocieerd was met een macrofaag werd getest op adhesie. Eerst werd het deeltje wegbewogen (t=0–21,7 s) waarna de OT kort werd uitgeschakeld. Dit resulteerde niet in het wegvloeien van het deeltje met het bloed, wat suggereert dat een nanobuisje (niet zichtbaar) het deeltje aan het vastbinden was, waarna het deeltje voorzichtig in contact werd gebracht en weer weg werd bewogen (52,3–101,6 s), wat aangeeft dat er geen sterke binding was. vastgesteld. Uiteindelijk werd het deeltje met een hogere duwkracht verder de macrofaag in bewogen waarna het deeltje niet meer los kon komen (t= 107,6-136,1 s). Schaalbalk, 10 m. Experiment werd minstens 5 keer herhaald.

Vervolgens hebben we getest of er ook andere celtypes in de zebravislarve gevangen konden worden. Het is echter niet altijd triviaal om verschillende celtypen te identificeren op basis van uitsluitend het gebruik van transmissiebeeldvorming in de drukke en dynamische omgeving van een levend organisme. We hebben daarom gebruik gemaakt van een functie die we hebben geïmplementeerd op het hier gebruikte optische pincet-beeldvormingssysteem (aangepast Nanotracker JPK Instruments AS, Berlijn, zie Methoden), namelijk de mogelijkheid om parallelle trapping en confocale en transmissiebeeldvorming te doen (zie ook ref. 21). Met behulp van een transgene zebravislijn met fluorescerende macrofagen (Tg(mpeg1:mcherry)) 22 gingen we dus het vangvermogen van deze cellen testen. In deze vislijn zijn relatief veel macrofagen aanwezig in het weefsel en deze cellen kunnen niet worden gemanipuleerd met behulp van OT. Verschillende macrofagen waren echter ook vrij aanwezig in het lumen van bloedvaten. In Fig. 2b (zie ook aanvullende film 7) werd een gebied met twee macrofagen in de staartader geselecteerd, deze macrofagen konden worden geïdentificeerd met behulp van fluorescentiebeeldvorming, een die onbeweeglijk was (witte contour) en een andere die kon worden verplaatst met behulp van de OT. Eerst werd de macrofaag verplaatst ten opzichte van de vis (met behulp van op akoesto-optische afbuiging gebaseerde herpositionering t=0-18 s en 39-81 s), terwijl at t=20 s werd het hele podium, inclusief de vis en de niet-mobiele macrofaag, verplaatst (horizontaal en axiaal), terwijl de val in een stabiele positie werd gehouden. De gecombineerde trapping en confocale beeldvorming in de zebravis toont aan dat specifieke celtypen kunnen worden geïdentificeerd en gevangen met behulp van dit veelzijdige systeem. Er is een overvloed aan transgene zebravislijnen 10 beschikbaar en daardoor kunnen verschillende celtypes en fysiologische vragen worden beantwoord. Als een ander voorbeeld werd in aanvullende film 8 (en aanvullende figuur 5) een deeltje (rode kleur, emissie 640 nm) bewogen in zebravissen met (groene) fluorescerende endotheelcellen (Tg(fli1:EGFP) 23 .

Vervolgens vroegen we of deeltjes die geassocieerd waren met een macrofaag specifiek met het pincet konden worden verplaatst, we vroegen ons af of ze zich aan het macrofaagoppervlak hechtten of door de cel waren geïnternaliseerd. Hiervoor gebruikten we opnieuw tricaïne om de bloedstroom te vertragen. In Fig. 2c (aanvullende film 9) werd een fluorescerende macrofaag geïdentificeerd in de staartader van de zebravislarve met behulp van confocale beeldvorming. Vervolgens werd een deeltje (rode kleur, aangegeven met een groene pijl) gevangen met het pincet en verwijderd, waardoor het loskwam van de macrofaag (t= 0-21.7 s), wat aangeeft dat het zich niet in de macrofaag bevond. Het kortstondig uitschakelen van de OT resulteerde niet in het wegstromen van het deeltje met het bloed zoals andere deeltjes (de rode stippen) kunnen worden waargenomen terwijl ze langs de stationaire macrofaag en stationaire rode nanodeeltjes bewegen. Dit suggereert dat het deeltje via een nanobuisje aan de macrofaag vast bleef zitten (niet zichtbaar omdat het zich in een ander vlak bevindt dan het confocale beeldvormingsvlak of omdat het erg dun en niet erg helder was). Vervolgens werd het deeltje weer naar de macrofaag verplaatst, maar er kon geen interactie worden waargenomen (52,3-101,6 s). Ten slotte werd het deeltje met een hogere duwkracht tegen de macrofaag bewogen, waarna het stevig hechtte en het deeltje niet meer los kon maken (zelfs bij 5 W, het hoogste vermogen dat beschikbaar is op ons systeem). Macrofagen spelen een centrale rol bij het opruimen van grotere objecten 24 , en het is van cruciaal belang om deze interactie voor op nanodeeltjes gebaseerde nanogeneeskunde en afgifte van medicijnen te begrijpen. Het zebravis-optische pincetsysteem maakt het mogelijk om de dynamiek van de interacties te bestuderen, contact te maken met een specifiek gebied van de cel, en kan ook worden gebruikt om de rol te onderzoeken van de contactkrachten waarmee deeltjes interageren wanneer ze tegen een macrofaag op een gecontroleerde manier.

Meerdere vallen voor in vivo vorming van nanobuisjes

Om de adhesie van deeltjes aan endotheelcellen in meer detail te bestuderen in vivo, werd een complexer systeem getest waarbij meerdere cellen betrokken waren. Bij een zebravis waarbij de bloedstroom werd afgeremd (met behulp van tricaïne), lokaliseerden we eerst een deeltje dat zich aan het endotheel hechtte. Vervolgens hebben we verschillende optische vallen toegepast om het operatiegebied van alle cellen te wissen: vier erytrocyten die dicht bij het gehechte deeltje aanwezig waren, werden verwijderd (Fig. 3a Aanvullende Film 10). Eerst werd cel '1' wegbewogen (gedroeg zich als een biljartbal die de andere cellen naar voren duwde) en na het wegschuiven werd het op een afstand gehouden, waardoor een 'hek' kon worden gemonteerd samen met verschillende andere vallen die in aangrenzende posities. Vervolgens werd cel '2' verplaatst en achter cel '1' geplaatst. Het 'hek' gevormd door verschillende optische vallen verhinderde dat de cellen vloeiden en terug diffundeerden in het operatiegebied. Bovendien ondervonden cellen die onscherp waren een verstrooiingskracht die hen wegblies van het gebied van het hek. Bij t=36,4 s het eerder geïdentificeerde deeltje werd vervolgens verwijderd van het endotheel. Dit deeltje kwam echter niet volledig los, omdat een dun membraanuitsteeksel uit de endotheelcel werd getrokken. Dergelijke membraankettingen of nanobuisjes zijn tot in detail bestudeerd in vitro omdat ze informatie kunnen onthullen over bijvoorbeeld membraan-cytoskelet-interacties, continuïteit van het membraan en zijn biofysische eigenschappen 25,26,27 . Onze experimenten met OT in de levende zebravislarve laten voor het eerst zien dat nanobuisjes kunnen worden gevormd in een meercellig organisme in vivo met behulp van actieve micromanipulatie en dat deze nanobuisjes zouden kunnen functioneren als een flexibele adhesie, waarbij aangehechte objecten kunnen worden verwijderd terwijl ze vastgebonden blijven.

(een) In een kleiner bloedvat worden verschillende erytrocyten geklaard (0-36,4 s) en afgeschermd, waarna een vastgehecht deeltje van het endotheel werd verwijderd en een aanbindende nanobuis werd gevormd (36,4-42,2 s). Schaalbalk, 5 m. (B) Kwantificering van de adhesiewaarschijnlijkheid van naakte en PEG-gecoate deeltjes, geclassificeerd als: afneembaar (wit), sterk hechtend (vast) en vastgebonden (lijnen). Experiment werd minstens 60 keer herhaald.

Kwantificering van hechting en 'stealth'-eigenschappen

Begrijpen hoe nanodeeltjes zich hechten aan verschillende celtypen en hoe de dynamiek van adhesie wordt gereguleerd, is cruciaal voor op nanodeeltjes gebaseerde medicijnafgifte. We wilden daarom de hechting van deeltjes aan de endotheelcellen die de bloedvaten bekleden systematisch testen. Om dit te doen hebben we geëxperimenteerd met twee soorten deeltjes: 'naakte'- en polyethyleenglycol (PEG)-gecoate polystyreendeeltjes (diameter 1 m). De PEG zou een bekleding moeten verschaffen die de niet-specifieke affiniteit van de deeltjes voor cellen zoals macrofagen verlaagt. PEG is op grote schaal gebruikt om 'stealth'-eigenschappen te geven aan nanodeeltjes die zijn ontworpen voor bijvoorbeeld kankertherapie, waardoor een langere circulatietijd in de bloedbaan wordt vergemakkelijkt. In een ander project gebruikten we PEG-gecoate deeltjes in ZF en controleerden we effectief hun biodistributie en karakteriseerden we hun targeting en 'stealth'-eigenschappen naar kankercellen 11 . Geïnjecteerde deeltjes van 1 m die aan het endotheel hechten, werden gedetecteerd en er werd geprobeerd ze weg te trekken met een vast laservermogen van 500 mW. Voor de naakte polystyreendeeltjes vonden we dat de meerderheid van de deeltjes sterk aan het endotheel hechtte (Fig. 3b) en het was niet mogelijk om ze weg te bewegen met het gebruikte laservermogen (vaak ook niet bij hogere vermogens omdat ze sterk gehecht waren) . Van de 30 deeltjes die in de larven werden getest, konden er 29 niet worden verplaatst en slechts 1 kon worden weggetrokken, maar bleef niettemin verbonden via een ketting en werd teruggetrokken nadat de val was uitgeschakeld (Fig. 3b, linker balk). Vervolgens testten we geïnjecteerde deeltjes met een PEG-coating. Deze deeltjes bleken ook aan het endotheel te hechten en we bepaalden de binding van deze gePEGyleerde deeltjes (Fig. 3b, rechts). Van de 30 met PEG beklede deeltjes die aan het endotheel geïmmobiliseerd werden gevonden, konden er 26 worden losgemaakt, terwijl vier een ketting vormden. Geen van deze deeltjes was zo sterk gehecht dat het onmogelijk was om ze van het endotheel weg te bewegen. Dit toont aan dat PEG de bindingsaffiniteit van de polystyreendeeltjes voor endotheelcellen verlaagt in vivo, hoewel ze nog steeds tot op zekere hoogte aan het endotheel hechtten.

Het feit dat de PEG-gecoate deeltjes vaker tethers vormen, geeft aan dat de deeltjes wel hechten, maar met een aanzienlijk lagere sterkte dan niet-gecoate deeltjes. De aanvankelijke kracht die nodig is voor de vorming van een ketting hangt sterk af van de grootte van de adhesiezone en frequentere vorming van de ketting impliceert dat het gebied van adhesie aan endotheelcellen kleiner is in het geval van gePEGyleerde deeltjes. Naakte deeltjes hechten waarschijnlijk door grotere gebieden, wat resulteert in een hogere drempelkracht voor de vorming van nanobuisjes 15,28 dan het pincet kan bieden.

Vervolgens hebben we onderzocht of heparine 29 de binding van nanodeeltjes aan de endotheliale voering zou beïnvloeden, aangezien eiwitten en geneesmiddelen met heparinebindingsplaatsen die het endotheel binden, kunnen worden losgemaakt in de aanwezigheid van heparine. We evalueerden dit eerst door de circulatie van fluorescerende deeltjes in ZF geïnjecteerd met mengsels (3 nl) van deeltjes (niet-gecoat polystyreen) samen met of zonder heparine (concentraties 40 en 100 mg ml 1) te vergelijken. Confocale fluorescentiebeeldvorming onthulde geen verschil in adhesie-eigenschappen in aanwezigheid of afwezigheid van heparine, zelfs niet bij de hoogste geneesmiddelconcentratie. Vervolgens hebben we een optische pincet gebruikt om te evalueren of de adhesie-eigenschappen van deeltjes op een 'subtieler niveau' waren veranderd in de aanwezigheid van heparine. Net als bij de PEG-gecoate deeltjes (Fig. 3b) gebruikten we de OT om aan nanodeeltjes te trekken die aan het endotheel waren gehecht (500 mW laservermogen). Deze experimenten tonen aan dat er geen significant verschil was in de adhesie-eigenschappen in aanwezigheid of afwezigheid van heparine (aanvullende figuur 6).

Optische vangst en manipulatie van geïnjecteerde bacteriën

Nadat we het vangen van geïnjecteerde deeltjes en natuurlijk voorkomende zebraviscellen in de levende zebravislarve hadden aangetoond, hebben we getest of deze aanpak ook kan worden toegepast om geïnjecteerde bacteriën te bestuderen. Bacteriën behoorden tot de eerste biologische deeltjes die optisch werden gevangen in vitro in waterige oplossingen 2 , maar voor zover we weten zijn er geen meldingen van het invangen van bacteriën in levende gewervelde dieren. Staafvormige bacteriën zijn moeilijker te vangen dan bolvormige (polystyreen) deeltjes en ze zijn kleiner dan macrofagen en erytrocyten. Als proof of principle van optische manipulatie van bacteriën in zebravissen, hebben we de visbacterie geïnjecteerd M. marine, dat vissentuberculose veroorzaakt en dat op grote schaal en effectief is gebruikt als model voor menselijke tuberculose bij de zebravislarve 12,30 .

Voor dit experiment selecteerden we een regio waar de bloedstroom erg traag was (opnieuw met behulp van tricaïne), en met behulp van fluorescentie- of transmissiebeeldvorming konden we de aanwezigheid detecteren van (rood fluorescerende) bacteriën die waren geïnjecteerd (Fig. 4). Vervolgens werd een bacterie gevangen en tegen het endotheel bewogen met behulp van de OT (aanvullende film 11). Voordat de val werd geactiveerd, zag men de bacterie op een Brownse manier door het bloedvat bewegen, roteren en diffunderen. Het kan in een momentopname worden afgebeeld terwijl het in het beeldvormingsvlak is georiënteerd (Fig. 4a, zie ook Aanvullende Film 11). Het activeren van het optische pincet (Fig. 4b) resulteerde in een oriëntatie van de bacterie in een richting loodrecht op het beeldvlak (in de richting van de pincetstraal). Deze heroriëntatie wordt verwacht voor langwerpige objecten. Vervolgens werd de bacterie tegen het endotheel geduwd (figuur 4c). Intrigerend genoeg kon in figuur 4d een cel (vermoedelijk een macrofaag 31) worden waargenomen die naar het contactpunt kruipt. Nadat de bacterie herhaaldelijk tegen het endotheel was bewogen, werd gezien dat de immuuncel zijn beweging stopte en uiteindelijk leek te 'beslissen' om over de endotheelbarrière te bewegen (Fig. 4g-i). Van macrofagen is bekend dat ze bacteriën verzamelen 31 , en het controleren van de positie en timing van bacteriën en interacties met verschillende cellen maakt het mogelijk om dit fenomeen op een gecontroleerde manier te bestuderen. De OT kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te bepalen hoe lang een bacterie in contact moet blijven om aan een cel te hechten of een reactie op te roepen, of dat meerdere bacteriën de rekrutering van macrofagen zullen verhogen of de fagocytose-dynamiek zullen beïnvloeden.

(een) Een diffunderende bacterie (paarse pijl) is (BNS) opgesloten, tegen het endotheel geduwd en van het endotheel verwijderd (rode lijn in een). Dit lijkt een immuuncel te activeren (groene pijlpunten), die naar het contactpunt beweegt (CF). Herhaald contact met het endotheel lijkt weer de aandacht te trekken van de kruipende cel, die (Gl) komt uiteindelijk in de ader terecht. De totale duur van het experiment is ∼ 2 min. Schaalbalk, 10 m. Experiment werd minstens 4 keer herhaald.

We hebben ook de effecten getest van ontstekingsremmende medicijnen op de migratie van immuuncellen naar door bacteriën binnengedrongen gebieden. Onze voorlopige experimenten met vislijnen met fluorescerende neutrofielen of fluorescerende macrofagen bevestigden dat de ontstekingsremmende geneesmiddelen diclofenac en indomethacine 32 de rekrutering van neutrofielen (en in mindere mate macrofagen, niet-gepubliceerde resultaten) naar plaatsen waar bacteriën waren geïnjecteerd, remden 12 . Deze experimenten hebben echter een systematische follow-up nodig om hun significantie te verifiëren.

Gezamenlijk demonstreren de experimenten die we hebben beschreven voor de eerste keer actieve micromanipulatie van een volledige schaal van nano- tot micron-sized structuren in een levende gewervelde met behulp van de transparante zebravislarve. De gemanipuleerde structuren varieerden van geïnjecteerde nanodeeltjes en bacteriën tot natuurlijk voorkomende zebraviscellen als erytrocyten en macrofagen.

We voorzien veel toepassingen van deze benadering, zoals (maar niet beperkt tot), de karakterisering van interactie-eigenschappen van nanodeeltjes met specifieke cellen voor toepassingen in de nanogeneeskunde. In het bijzonder zouden de eigenschappen van nanodeeltjes kunnen worden bestudeerd, bijvoorbeeld door ze te functionaliseren met liganden voor targeting op specifieke cellen of met jassen zoals PEG om interacties met andere cellen te voorkomen. Als alternatief kunnen optisch gemanipuleerde nanodeeltjes die een specifieke verbinding afgeven, in de nabijheid van de van belang zijnde organismale structuur worden gebracht voor het testen van lokale cellulaire reacties op chemicaliën (zoals al elegant is aangetoond met cellen in vitro 33), zoals voor studies van vasculaire functie en endotheliale integriteit.

Gecontroleerd onderzoek naar rekrutering en activering van immuuncellen, door micromanipulatie van bacteriën, andere micro-organismen of met antigeen gecoate deeltjes naar specifieke gebieden in het organisme, zal het mogelijk maken om adhesie aan en activering/rekrutering van immuuncellen te onderzoeken, bijvoorbeeld in de aanwezigheid van anti- inflammatoire geneesmiddelen, vooral in combinatie met beeldvorming. Ten slotte hebben kwantitatieve optische pincetten een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van cellulaire biomechanische eigenschappen en hun regulerende rol in functie. Dit is echter grotendeels gedaan in vitro met cellen in kweek, en het hier gepresenteerde werk biedt vele mogelijkheden om dergelijke experimenten uit te voeren in een levende gewervelde.


4. Toepassingen van nanodeeltjes in de biologie

4.1 Nanodeeltjes als sensoren

NP-platforms zoals gouden NP's zijn op grote schaal gebruikt als sensoren vanwege hun oppervlaktechemie. Een methode om de unieke oppervlaktechemie van gouden NP's te gebruiken voor signaaltransductieversterking is de bio-barcodemethode die is ontwikkeld door de Mirkin-groep. Deze methode is toegepast voor eiwit 50 en DNA 51 doeldetectie. Voor detectie van doelwit-DNA kan PCR-achtige gevoeligheid worden bereikt. Deze techniek is beschreven voor de detectie van cytokinen bij een concentratie van 30 aM (attomolair) 52 en voor de detectie van een oplosbare pathogene biomarker voor de ziekte van Alzheimer bij een concentratie rond 100 aM. 53 Meer recentelijk gebruikte de groep deze methode om prostaatspecifiek antigeen (PSA) te detecteren, een veel onderzochte kankerbiomarker die de aanwezigheid van prostaatkanker kan aangeven wanneer deze bij verhoogde niveaus tot expressie wordt gebracht. 54 In de bio-barcode-assaybenadering worden DNA-gefunctionaliseerde gouden NP's (30 nm) geconjugeerd aan PSA-specifieke antilichamen om PSA gouden NP-probes te genereren (Fig. 2). 55,56 De DNA-strengen zijn de bio-barcodes. Een magnetisch microdeeltje (MMP) gefunctionaliseerd met monoklonale antilichamen tegen PSA wordt gemengd met het PSA-doelwiteiwit. Na een wasstap worden de PSA-gouden NP-probes toegevoegd aan de MMP-gebonden PSA. Na verdere scheiding door toepassing van magnetisch veld en wasstappen, worden de PSA-specifieke DNA-barcodes vrijgegeven in oplossing en geanalyseerd met behulp van de scanometrische test, die gebruikmaakt van gouden NP-gekatalyseerde zilververbetering. Deze test bereikte een gevoeligheid van 330 fg mL −1 van PSA.

Figuur 2 De bio-barcode methode. (A) Ontwikkeling van de NP-sonde. (B) detectiemethode met behulp van prostaatspecifieke antigeen-geconjugeerde gouden NP-sondes. Overgenomen van ref. 56.

De DNA-biobarcodemethode combineert het vermogen om een ​​groot aantal DNA-strengen op gouden NP-oppervlakken te conjugeren en de detectie van deze DNA-strengen met behulp van technieken zoals PCR-amplificatie of scanometrische tests. Een andere benadering voor detectie die optische eigenschappen van het NP-oppervlak gebruikt, is ontwikkeld door de Rotello-groep. 57 Ze ontdekten dat anionische fluorescerende polymeren omkeerbaar kunnen binden en dissociëren van gefunctionaliseerde kationische gouden NP's door niet-covalente chemische interacties. Wanneer het fluorescerende polymeer aan de NP wordt gebonden, wordt de fluorescentie ervan gedoofd. Wanneer het wordt losgekoppeld van de NP, wordt de fluorescentie hersteld. Dit fenomeen is de basis van een “chemical nose” systeem. 58 In dit systeem wordt het doeleiwit gedetecteerd op basis van zijn verschillende fluorescentiereacties bij binding aan verschillende soorten oppervlakte-gemodificeerde gouden NP's. Een fluorescentieresponspatroon wordt gegenereerd en vervolgens geanalyseerd door middel van statistische methoden. Dit proces kan verschillende moleculaire doelen van elkaar detecteren, kwantificeren en onderscheiden. Dit proces is oorspronkelijk ontwikkeld voor de detectie en detectie van eiwitten58, maar is ook aangepast voor de detectie en detectie van bacteriën,59 voor de detectie van fysisch-chemische verschillen tussen gezonde, kankerachtige en metastatische menselijke borstcellen, en voor de differentiatie van isogene gezonde en getransformeerde cellen (Fig. 3). 60,61 "Chemische neus"-detectie biedt ook het voordeel dat er geen antilichamen worden gebruikt voor detectie, aangezien de identiteit van de doelanalyt niet bekend hoeft te zijn om de analyt te detecteren.

Afb. 3 Interacties tussen NP-GFP-complexen en celoppervlakken genereren verschillende fluorescentiepatronen. Overgenomen van ref. 61.

Gouden NP's kunnen ook oppervlakteversterkte Raman-verstrooiing (SERS) verbeteren voor detectie en identificatie van biomoleculen aan het NP-oppervlak.De SERS-techniek is vaak gebruikt om specifieke analyten te detecteren door hun unieke trillingsspectra. De smalle breedte van SERS-spectra maakt detectie van meerdere analyten binnen complexe mengsels mogelijk, inclusief detectie tot op het niveau van één molecuul. 33 Zo zijn SERS-technieken gebruikt voor ultragevoelige detectie van biomoleculen zoals glucose, 62 hemoglobine, 63 bacteriën, 64 en virussen. 65 Met behulp van deze benadering toonde een groep aan dat gouden NP's gecodeerd met Raman-reporters en geconjugeerd met single-chain variant fragment (ScFv) -antilichamen zich kunnen richten op kankerbiomarkers zoals epidermale groeifactorreceptoren (EGFR) in vitro en in vivo (Fig. 4) . 66,67 Onlangs hebben onderzoekers ook een SERS-systeem gedemonstreerd op basis van een zelf-geassembleerde dunne-film NP-array in de vloeistof-vloeistof interfase voor meerfasige sporenanalytdetectie. 68 De groep was in staat om enkelfasige analyten te detecteren, evenals meerdere analyten opgelost in water en organische fasen.

Afb. 4 Surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectra en de gecorreleerde oppervlakteplasmonbeeldvorming van enkele kankercellen getagd met ScFv-geconjugeerde gouden NP's. Overgenomen van ref. 67.

Er zijn ook nanosensoren ontwikkeld die gebruikmaken van de magnetische eigenschappen van magnetische NP's zoals SPION's. Er is veel belangstelling voor magnetische NP's omdat ze sterke magnetische eigenschappen hebben en de meeste biologische monsters een verwaarloosbare magnetische gevoeligheid vertonen. 69 SPION's zijn gebruikt als magnetische tags voor veel verschillende soorten sensoren, waaronder gigantische magnetoresistieve (GMR) biosensoren, die zijn gebaseerd op de binding van magnetische deeltjes aan een sensoroppervlak. 70 De magnetische velden van de deeltjes kunnen de magnetische velden van de sensor veranderen, waardoor de elektrische weerstand van de sensor verandert. Onlangs hebben Wang en collega's van de Stanford University het gebruik van deze techniek aangetoond voor een eiwitdetectietest waarbij een reeks GMR-sensoren wordt gebruikt om bindingsgebeurtenissen van eiwitten aan arrays van oppervlaktegebonden antilichamen te detecteren met behulp van SPION's als magnetische tags . 71 In deze test bevindt het doelantigeen zich tussen twee antilichamen, één gebonden aan de sensor en de andere gelabeld met een SPION. De aan- of afwezigheid van de gemagnetiseerde NP wordt gedetecteerd door de onderliggende sensor. De groep toonde aan dat de test matrixongevoelig is voor verschillende biologische vloeistoffen, maar nog steeds in staat is om eiwitten te detecteren tot in attomolaire concentraties en over een uitgebreid bereik van concentraties. Met behulp van een vergelijkbare strategie hebben ze ook de detectie van kanker-geassocieerde eiwitten in 50% serum bij subpicomolaire concentraties aangetoond met behulp van MACS-deeltjes (gecommercialiseerde SPION's voor celscheiding). 72 Onlangs hebben ze met streptavidine gefunctionaliseerde antiferromagnetische NP's gebruikt om DNA met hoge gevoeligheid (10 pM) te detecteren. 73

De superparamagnetische eigenschap van IONP's is ook de basis van magnetische relaxatieschakeling. De Weissleder-groep heeft magnetische relaxatieschakelaars bestudeerd die bestaan ​​​​uit 3-5 nm SPION's gecoat met 10 nm dik dextran en gestabiliseerd door verknoping. 74 Gerichte SPION's worden ontwikkeld door ze te functionaliseren met aminogroepen voor de aanhechting van een reeks sulfhydryl-dragende moleculen. 75 De nanoschakelaars kunnen omkeerbare assemblage ondergaan (clustering en declustering) in aanwezigheid van een molecuul dat wordt herkend door de liganden die op het NP zijn geïmmobiliseerd, wat resulteert in een verandering in de transversale magnetische relativiteit (1/T 2) van omringende waterprotonen. De veranderingen in relaxatiesnelheden als gevolg van NP-assemblage kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid aan biologische doelen te detecteren, waaronder DNA en eiwitten op het lage femtomol-niveau (0,5-10 fmol). 76 Onlangs heeft de Weissleder-groep een draagbaar, op chips gebaseerd diagnostisch magnetische resonantie (DMR) -systeem ontwikkeld voor snelle en kwantitatieve detectie van biologische doelen. 77 De DMR gebruikt ook IONP's als sensoren om moleculaire interacties te versterken die worden veroorzaakt door assemblages van SPION's. Ze demonstreerden proof of concept door met hoge gevoeligheid de aanwezigheid van eiwitten parallel te detecteren en door bacteriën te detecteren. Vergeleken met de NMR-relaxometer op de tafel had het DMR-systeem een ​​massadetectielimiet die met twee ordes van grootte was verbeterd (detectielimiet van 15 fmol).

Magnetische NP-relaxatiesensoren zijn ook gebruikt in testen waarbij de basis van de test de relaxatie van de magnetische momenten binnen magnetische NP's is. 78 Brownse relaxatie is het dominante mechanisme voor deze NP-biosensoren. Bij deze methode vormen NP's aggregaten bij herkenning van doelanalyten, wat leidt tot een grotere hydrodynamische grootte en dus langzamere Brownse relaxatiereacties dan individuele NP's. Met behulp van dit principe ontdekte een groep onlangs een bacterieel antilichaam met een gevoeligheid van 0,3 nM met een AC-susceptometer. 79

De Weissleder-groep heeft ook met antilichaam gecoate NP's in een microfluïdisch apparaat gebruikt om bacteriën te detecteren. 82 Ze rapporteerden ook dat core-shell NP's met Fe-metaalkernen een verhoogde gevoeligheid hebben in vergelijking met IONP's voor de detectie van bacteriële cellen. Onlangs heeft de groep ook een test ontwikkeld op basis van een magnetische barcoderingsstrategie die geen antilichamen nodig had en mutaties in één gen kon detecteren. 83 In deze benadering worden met PCR geamplificeerde mycobacteriële genen sequentiespecifiek gevangen op polymere kralen die zijn gemodificeerd met complementair DNA, gelabeld door SPION's en gedetecteerd door NMR. Het platform kon binnen 2,5 uur M. tuberculosis detecteren en resistentiestammen uit sputummonsters identificeren. De onderzoekers ontwikkelden ook een soortgelijk systeem dat rRNA gebruikt als een doelwitmarker voor NP-labeling. 84 De benadering maakte gebruik van een universele en specifieke nucleïnezuurprobe die 16S-rRNA detecteert, dat overvloedig aanwezig is in en gemeenschappelijk is voor veel bacteriesoorten. Het apparaat was gevoelig genoeg om slechts 1-2 E. coli-bacteriën in 10 ml bloed te detecteren en de bacteriële belasting nauwkeurig te schatten.

Veel groepen hebben ook gefunctionaliseerde NP's met kleine moleculen gebruikt om bacteriën te labelen. Eén groep ontwikkelde een magnetisch op glyco-NP gebaseerd systeem dat E. coli-stammen in 5 minuten kon detecteren en tot 88% verwijdering uit het monster mogelijk maakte door gebruik te maken van de bacteriële interactie met koolhydraten op celoppervlakken van zoogdieren (Fig. 5). 85,86 Een andere groep rapporteerde het gebruik van vancomycine-gemodificeerde SPION's in een magnetische vangsttest voor verschillende Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën. 87 Ze toonden ook aan dat naarmate de grootte en liganddekking op de NP toenemen, de tijd die nodig is voor efficiënte labeling aan de bacteriën met de NP's afneemt.

Optische biosensing van bacteriën is ook gebruikt met behulp van zowel metalen NP's als QD's. De biobarcode-assaybenadering 50 verschaft amplificatie en de mogelijkheid om gelijktijdig veel verschillende doelen in één monster te detecteren. Met behulp van deze methode werd dubbelstrengs genomisch DNA van Bacillus subtilis gedetecteerd bij een concentratie van 2,5 fM. 88 Evenzo werd Salmonella enteritidis gedetecteerd bij 0,2 fM. 89 QD's zijn ook gebruikt als sensoren voor pathogenen. Edgar et al. rapporteerde een techniek die in vivo biotinylatie van gemanipuleerde gastheerspecifieke bacteriofaag en hechting van de faag aan met streptavidine gecoate QD's combineerde. 90 De methode biedt specifieke detectie van E. coli tussen verschillende bacteriestammen en kan slechts 10 bacteriën per ml van de experimentele monsters detecteren.

NP-immunomagnetische technieken zijn enkele van de meest gebruikte methoden voor de identificatie en opname van CTC's. Deze technieken omvatten het gebruik van magnetische NP's om CTC's te targeten en te isoleren met behulp van een op ligand-receptor gebaseerd mechanisme. Momenteel is het CellSearch-apparaat, dat een immunomagnetische techniek gebruikt, de enige door de FDA goedgekeurde test voor CTC-beoordeling. 92,93 CellSearch is gebaseerd op een positieve epitheliale celadhesiemolecuul (EpCAM) selectie van de CTC's en maakt gebruik van ijzer-NP's gecoat met een polymeerlaag die biotine-analogen draagt ​​en geconjugeerd met anti-EpCAM, voor het in vitro vangen van CTC's. Dit systeem kan ook worden gebruikt voor het labelen en identificeren van leukocyten met behulp van een anti-CD45-APC-antilichaam als het NP-targeting-ligand. Onlangs heeft een groep ook aangetoond dat IONP's gefunctionaliseerd met anti-HER2 of anti-HER2 / neu kunnen worden gebruikt om 73,6% van HER2 / neu tot overexpressie brengende kankercellen te scheiden die in 1 ml bloed waren verrijkt. 94 De receptor-ligand-interacties resulteerden in de preferentiële vangst van de kankercellen. In een ander preklinisch onderzoek werd een in vivo CTC-detectiebenadering bereikt met behulp van gePEGyleerde magnetische NP's. 95 Onderzoekers waren dubbel gericht op CTC's in vivo met magnetische NP's geconjugeerd met plasminogeenactivator (uPA) en folaatgerichte nanobuisjes voor daaropvolgende detectie met behulp van fotoakoestische flowcytometrie.

De opname van polymeren, die gerichte detectie en oppervlakte-capture mogelijk kunnen maken, in andere organische en anorganische NP-platforms kan mogelijk leiden tot nieuwe NP-sensoren voor CTC-detectie. 96 Onlangs gebruikte een groep gerichte, met polymeer gecoate gouden NP's en de SERS-techniek om CTC's direct te meten in de aanwezigheid van witte bloedcellen (Fig. 6). 97,98 EGF-peptiden werden geconjugeerd aan de met polymeer beklede gouden NP's die waren gecodeerd met QSY-reporters. De NP's identificeerden met succes CTC's in het perifere bloed van 19 patiënten met plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek, met een gevoeligheidsbereik van 1 tot 720 CTC's per ml volbloed.

Afb. 6 Surface-enhanced Raman scattering (SERS) detectie van circulerende tumorcellen. (A) Schematische voorstelling van EGF-peptide-geconjugeerde NP's. (B) SERS-spectra van verschillende aantallen kankercellen die in het monster van witte bloedcellen zijn geprikt. (C) SERS-spectra van een bloedmonster geïncubeerd met gerichte en niet-gerichte NP's. Overgenomen van ref. 98.

Andere technieken voor identificatie en scheiding van cellen omvatten het gebruik van biomimetische nanotechnologie, die gebruikmaakt van natuurlijk voorkomende processen. De Hong-groep heeft biomimetische benaderingen onderzocht om microfluïdische apparaten te ontwikkelen voor de identificatie en scheiding van cellen. Deze apparaten maken gebruik van het natuurlijke proces van celrollen, dat het resultaat is van adhesieve interacties tussen selectinemoleculen die tot expressie worden gebracht op de endotheliale venulen en glycoproteïnereceptoren op de kankercellen. 99 Onlangs werd het celrolproces met behulp van E-selectine toegepast op CTC-detectie voor verbeterde oppervlaktegevoeligheid en specificiteit. 100 Zevende generatie (G7) poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimeren werden ook gebruikt om celinvangoppervlakken te manipuleren voor gelijktijdige binding van meerdere liganden aan meerdere receptoren (multivalente binding). De biomimetische combinaties van dendrimeer-gemedieerd multivalent effect en celrollen verbeterden de oppervlakte-opname van CTC's aanzienlijk.

4.2 Nanodeeltjes als beeldvormende middelen

Anorganische NP's zoals QD's behoren tot de meest veelbelovende fluorescerende labels voor cellulaire beeldvorming. QD's kunnen licht van specifieke golflengten uitstralen en ook worden afgestemd om uit te zenden in het NIR-gebied van het spectrum, waarin de autofluorescentie van weefsel wordt verminderd en de penetratie van excitatielicht toeneemt. 110 Monofunctionele QD's zijn gebruikt om individuele eiwitten in cellen 111 en receptoren die betrokken zijn bij celbeweging tijdens ontwikkeling en metastase te volgen. 112 QD's zijn gebruikt voor beeldvorming van specifieke tumorbiomarkers, zoals het gebruik van arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) peptide-geconjugeerde NIR QD's voor de targeting van integrine αvβ3. 113 Gerichte QD's zijn ook bestudeerd vanwege hun vermogen tot multiplex-beeldvorming, waarbij gelijktijdige beeldvorming van veel moleculaire doelen wordt gebruikt met behulp van verschillende QD's die verschillende emissiegolflengten gebruiken. Onlangs zijn QD's toegepast voor multiplex moleculaire beeldvorming van lymfeklieren, 114 embryonale stamcellen, 115 evenals tumorcellen en vasculatuur. 116,117

Gouden NP's zijn onderzocht als een niet-invasieve modaliteit voor in vivo kankerbeeldvorming met behulp van kleine organische moleculen als nabij-infrarood (NIR) SERS-reporters. Onlangs werden met antilichaam geconjugeerde gouden NP's gebruikt in combinatie met een gevoelige en stabiele cyaninereporter die werd ontwikkeld en gescreend uit een combinatorische bibliotheek van SERS-reporters voor de detectie van HER2-positieve tumoren in xenotransplantaatmodellen. 118 Andere recente in vivo beeldvormingsinspanningen waren gericht op het gebruik van verschillende gerichte SERS-gouden NP's voor gemultiplexte beeldvorming in muismodellen. 119,120

Magnetische NP's zijn een van de meer goed bestudeerde NP-platforms voor gerichte moleculaire beeldvorming. Magnetische NP-beeldvormingssystemen hebben potentieel aangetoond voor realtime visualisatie van biologische gebeurtenissen, zoals celmigratie / mensenhandel, 121-123 enzymactiviteiten, 124 en andere biologische interacties op moleculair en cellulair niveau. 25 Magnetische NP's hebben ook veelbelovend gebruik laten zien als contrastmiddelen bij magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), een biomedische techniek die is gebaseerd op nucleaire magnetische resonantie van verschillende interagerende kernen. SPION's, gevormd uit ijzeroxidekristallen bedekt met dextran of carboxydextran, zijn veelgebruikte MRI-contrastmiddelen voor beeldvorming van kanker. Bij injectie bij patiënten is aangetoond dat SPION's 24 uur na injectie in de tumoren blijven, vergeleken met 1 uur voor op gadolinium gebaseerde MR-middelen. 125 Dit verschil is te wijten aan een gemakkelijkere opname van de NP door de tumor en een lagere diffusie van de NP uit de tumor.

Veel studies hebben het gebruik van SPION's onderzocht voor de gerichte detectie van tumoren en hun metastasen. 126-129 SPION's zijn ook gericht op kankercellen zonder gebruik te maken van gerichte liganden. In één onderzoek werd aangetoond dat een recombinant humaan zware-keten-ferritine-eiwitomhulsel dat IONP's bevat gericht was op tumorcellen die transferrinereceptor 1 tot overexpressie brengen. 130 De ijzeroxidekern katalyseerde ook de oxidatie van peroxidasesubstraten in de aanwezigheid van waterstofperoxide om een ​​kleurreactie te produceren dat wordt gebruikt om tumorweefsels zichtbaar te maken. In een andere studie verzamelden onderzoekers SPION's en richten ze zich op peptiden op een gemodificeerde virale scaffold om het aantal SPION's dat tumorcellen bereikt te vergroten. 129 Glutaminezuurresiduen werden geïntroduceerd in de eiwitmantel van M13, een virus dat bacteriën infecteert. De negatief geladen residuen bevorderden de elektrostatische assemblage van NP's langs de filamenteuze structuur van de M13-coating. De virale mantel bleek ook een peptide te vertonen dat zich richt op SPARC-glycoproteïne, dat tot overexpressie wordt gebracht in verschillende kankers. In vergelijking met traditionele benaderingen waarbij NP's direct worden gefunctionaliseerd met gerichte liganden, kan deze benadering het contrast versterken bij het uitvoeren van MR-beeldvorming.

Nieuwe NP's met geavanceerde magnetische eigenschappen zijn ook nagestreefd voor het visualiseren van biologische gebeurtenissen. Een dergelijke klasse is met metaal gedoteerde ferriet-NP's met een samenstelling van MFe2O4, waarbij M +2 kation van Mn, Fe, Co of Ni is, om specifieke magnetische eigenschappen af ​​te stemmen. 127 MnFe2O4 NP's bleken in vitro niet-toxisch te zijn en hebben de hoogste magnetische gevoeligheid, wat suggereert dat ze betere MRI-sondes kunnen maken. Wanneer deze NP's werden geconjugeerd met antilichamen, vertoonden ze een verhoogde MRI-gevoeligheid voor de detectie van kankermarkers. Andere NP-platforms zijn gecombineerd met SPION's, waaronder dendrimeren (magnetodendrimeren) 123 en liposomen (magnetoliposomen). 131 Deze SPION's zijn gebruikt voor toepassingen zoals het monitoren van de migratie van cellen of het in vivo visualiseren van beenmerg. 132

4.3 Nanodeeltjes als transportmiddel

NP's bieden een mogelijke oplossing voor de uitdagingen bij de levering van siRNA. Kationische lipide of polymere NP's zijn gebruikt om anionische nucleïnezuren in cellen te transporteren vanwege hun vermogen om een ​​gecondenseerd complex te vormen met nucleïnezuren. 136 Dit stabiliseert en beschermt ze tegen enzymatische afbraak. Kationische materialen kunnen NP's ook helpen ontsnappen aan sekwestratie in endosomen/lysosomen. Groepen zoals de stikstoffen in het kationische polymeer polyethyleenimine (PEI), die worden geprotoneerd in de pH-omgeving van de endosomen/lysosomen, kunnen endosomale ontsnapping vergemakkelijken door de Cl te verhogen influx als reactie op protonering bij zure pH. Het resultaat is een toename van de osmotische druk en zwelling, wat leidt tot het barsten van de organellen en de afgifte van de siRNA-NP's. Dit fenomeen wordt het “protonensponseffect” genoemd. Een recent onderzoek toonde echter aan dat de afgifte van siRNA in een kationisch lipide NP-systeem aanzienlijk was verminderd, aangezien ongeveer 70% van het geïnternaliseerde siRNA werd gerecycled naar de extracellulaire media als gevolg van het verlaten van de lipide NP's uit late endosomen/lysosomen. 137 De afgifte van siRNA kan dus worden verbeterd door nieuwe NP-voertuigen te ontwerpen die kunnen ontsnappen aan de recyclingpaden. Actieve targetingmethoden voor niet-endocytische opname van NP-afgifte van nucleïnezuren zijn ook onderzocht met behulp van fusogene peptiden en celpenetrerende peptiden. 138 Om siRNA-NP-interacties met biologische systemen beter te begrijpen, zijn siRNA-sondes gebruikt om intracellulair verkeer 139 te bestuderen, evenals assemblage en demontage van siRNA-NP's. 140

Onlangs zijn NP's gebruikt om siRNA af te leveren om genen in immuuncellen tot zwijgen te brengen, omdat deze cellen een cruciale rol kunnen spelen bij homeostase en ziekte. 141 In één onderzoek werden NP's gebruikt om selectief Cyclin D1 (CyD1), een celcyclusregulerend molecuul, in leukocyten in vivo tot zwijgen te brengen om de exacte rol van het molecuul bij darmontsteking te bepalen. 141 NP's werden geladen met CyD1-siRNA en gefunctionaliseerd met antilichamen tegen7 integrine. De studie onthulde dat deze gerichte NP's CyD1 in leukocyten tot zwijgen brachten en experimenteel geïnduceerde colitis bij muizen omkeerden door de proliferatie van leukocyten en T-helpercel 1-cytokine-expressie te onderdrukken. Een ander recent rapport beschreef ook het gebruik van lipide NP's voor de in vivo levering van siRNA om ziektegenen in immuuncellen tot zwijgen te brengen. 142 De studie toonde siRNA-gemedieerde silencing aan in myeloïde celtypen van niet-menselijke primaten en stelde de haalbaarheid vast van het richten op meerdere gendoelen in myeloïde cellen van knaagdieren. Het therapeutisch potentieel werd gevalideerd met behulp van siRNA gericht op tumornecrosefactor-α (TNFα). Een andere studie gebruikte NP's om de immunologische mechanismen te onderzoeken die niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) veroorzaken. 142 De onderzoekers ontdekten dat TNFa geproduceerd door Kupffer-cellen de ontwikkeling van NASH kan veroorzaken door de verhoogde productie van chemokinen IP-10 en MCP-1. Bovendien verminderde TNFa-silencing in myeloïde cellen de chemokineproductie en verhinderde het de ontwikkeling van NASH, wat het potentieel van TNFa als een nieuw therapeutisch doelwit in NASH suggereert.

NP's zijn ook gebruikt als vehikels om siRNA in plantencellen af ​​te leveren om cellulaire routes op het niveau van een enkele cel te bestuderen. 143 De ene groep gebruikte amine-geconjugeerde polymere NP's als vehikels om siRNA te leveren dat gericht was op specifieke genen in de cellulosebiosyntheseroute. Ze ontdekten dat NtCesA-1, een factor die betrokken is bij celwandsynthese in hele planten, ook een essentiële rol speelt bij celwandregeneratie in geïsoleerde protoplasten.

Het vermogen om NP's gemakkelijk te wijzigen en te functionaliseren heeft geresulteerd in recente interesse in het gebruik van deze vehikels om middelen af ​​te leveren aan subcellulaire organellen. Gerichte NP's kunnen binden aan doelen die op het celoppervlak zijn gelokaliseerd en de cel binnenkomen via endocytose. Als het doelwit zich echter intracellulair bevindt, kunnen NP's en hun lading het beoogde doelwit mogelijk niet bereiken vanwege intracellulaire sekwestratie van het NP of vanwege het ontbreken van subcellulaire targetingmogelijkheden.Met name NP's die oligonucleotiden dragen, moeten aan het endosoom ontsnappen en vervolgens worden gericht om effectief te zijn. Hulpmiddelen voor effectieve subcellulaire targeting zijn in opkomst voor gerichte levering aan de kern, 146 cytosol, 147 mitochondriën, 148 endosomen, 149 en lysosomen. 150 In het algemeen worden twee benaderingen onderzocht voor het ontwerp van NP's voor subcellulaire targeting: (1) passieve targeting van NP's op een bepaald organel door NP-kenmerken zoals grootte, vorm en samenstelling te variëren 151 en (2) actieve targeting van NP's naar het van belang zijnde organel door NP-oppervlakken te functionaliseren met gerichte liganden die naar het organel zijn gericht. Deze benaderingen zijn met wisselend succes toegepast.

Hindernissen voor succesvolle subcellulaire targeting omvatten biologische barrières die specifiek zijn voor het doelorganel. NP's die op de kern zijn gericht, moeten bijvoorbeeld het celmembraan binnendringen, endosomaal-lysosomale routes ontsnappen, een manier hebben om te interageren met het nucleaire poriecomplex en klein genoeg zijn om het kernmembraan te passeren. 146 Targeting-liganden zoals het nucleaire lokalisatiesignaal (NLS) zijn gebruikt om de nucleaire levering door het actieve transportmechanisme te verbeteren. 152 In één onderzoek beschadigde de lokalisatie van NLS-geconjugeerde gouden NP's in de kern van een kankercel het DNA. 152 In een ander onderzoek daarentegen waren NLS-geconjugeerde gouden NP's niet in staat om de kern van cellen van buiten het plasmamembraan te targeten omdat ze de cellen niet konden binnendringen of vastzaten in de endosomen. In plaats daarvan bereikten NP's geconjugeerd met zowel NLS als receptor-gemedieerde endocytose (RME) peptiden de kern. 153

Voor NP's die gericht zijn op de mitochondriën, omvatten biologische barrières intracellulair transport naar de mitochondriën en buitenste en binnenste mitochondriale membranen en toxiciteit. 154 Tot nu toe hebben de meeste studies voornamelijk metaaloxide of liposomale NP's ontwikkeld voor levering aan de mitochondriën. Levering aan de mitochondriën is ook gebaseerd op elektrostatische interacties tussen de NP en het organel. De mitochondriën hebben een negatief membraanpotentiaal in vergelijking met andere celmembranen, wat kan leiden tot de ophoping van lipofiele kationen. 155 Dit concept werd gebruikt bij de fabricage van op stearyltrifenylfosfonium (STPP) gerichte liposomen met antikankermiddelen ceramide 156 en scarleol 157 om de mitochondriën aan te pakken. STPP werd gekozen omdat het zowel kationische als lipofiele eigenschappen vertoont. Een andere groep gebruikte een polymeer NP-systeem om mitochondria-werkende therapieën op hun bestemming af te leveren. 158 De NP's werden gesynthetiseerd met een lipofiel trifenylfosfonium (TPP) -kation, waarvan bekend is dat het de mitochondriale matrixruimte binnendringt. Door in vitro screening van een bibliotheek van NP's met variërende lading en grootte, identificeerde de groep een geoptimaliseerde gerichte NP die de werkzaamheid verbeterde en de toxiciteit voor kanker, de ziekte van Alzheimer en obesitas verminderde in vergelijking met niet-gerichte NP's of de therapieën met kleine moleculen. 158

4.4 Effecten van biologie op NP's

Onlangs is aangetoond dat de opname van NP's door cellen in vitro kan worden beïnvloed door de celcyclusfase. 104 Uit de studie bleek dat NP's die door cellen zijn geïnternaliseerd, niet uit cellen worden geëxporteerd, maar worden gesplitst tussen dochtercellen wanneer de cel zich deelt. De resultaten kunnen implicaties hebben voor de klaring of accumulatie van NP's in vivo. Een andere recente studie toonde aan dat de globale immuunstatus, zoals de balans van Th1-Th2-cytokinen en M1-M2-macrofagen, ook het NP-klaringsproces kan beïnvloeden. 105 De onderzoekers toonden aan dat muizenstammen die gevoelig zijn voor Th1-immuunreacties NP's langzamer opruimen dan Th2-gevoelige muizen. Macrofagen geïsoleerd uit de Th1-stammen namen in vitro ook minder deeltjes op dan macrofagen uit Th2-stammen. De resultaten werden bevestigd in van menselijke monocyten afgeleide macrofagen, wat suggereert dat globale immuunregulatie de NP-klaring bij mensen kan beïnvloeden.

Vanwege hun kleine omvang en het EPR-effect zijn NP's vaak passief of actief gericht op kankertumoren. 106 Toch kan de klaring en distributie van NP's ook sterk afhangen van het tumorvasculatuur. Jain en collega's hebben gesuggereerd dat lekkende en slecht georganiseerde bloedvaten van kankertumoren kunnen resulteren in een toename van de interstitiële vloeistofdruk in tumoren, waardoor de bloedtoevoer naar hen wordt verminderd en dus de afgifte van middelen aan de tumoren wordt belemmerd. 107 Ze toonden aan dat het repareren van de abnormale bloedvaten in borsttumoren, door het blokkeren van vasculaire endotheliale groeifactor receptor-2, de afgifte van kleinere NP's (12 nm) verbetert, terwijl de afgifte van grotere NP's (125 nm) wordt belemmerd. De rol van andere eiwitten zoals TGF-β bij het normaliseren van tumorvasculatuur voor NP-afgifte in tumoren is ook onderzocht. 108 TGF-β-blokkade bleek de tumorgroei en metastase bij muizen significant te verminderen. Het verhoogde ook de rekrutering en opname van perivasculaire cellen in tumorbloedvaten, verhoogde de fractie van geperfundeerde bloedvaten en verminderde het collageen I-gehalte van de interstitiële tumormatrix. De onderzoekers ontdekten dat als gevolg van de normalisatie van het bloedvat en de interstitiële matrix, TGF-β-blokkade de intratumorale opname van NP-therapeutica verbeterde, wat leidde tot een betere controle van de tumorgroei.

4.5 Nanodeeltjes om biologische processen te bestuderen

NP-platforms kunnen ook de lokale verstoring van eiwitactiviteiten in cellen op subcellulaire schaal mogelijk maken. In het bijzonder kunnen magnetische NP's worden gecoat met een biocompatibele oppervlaktelaag die kan worden gefunctionaliseerd met liganden die zich richten op specifieke celoppervlakreceptoren, die vervolgens op afstand kunnen worden geactiveerd door aangelegde magnetische velden. In een recente studie gebruikten onderzoekers deze benadering om te bestuderen hoe NP-gemedieerde activering van specifieke signaalroutes kan leiden tot veranderingen in cellulaire reacties. 161 De magnetische NP's zijn bevestigd met actieve signaaleiwitten en kunnen door magnetische krachten naar verschillende locaties in de cel worden verplaatst. Zodra deze eiwit-geconjugeerde NP's in de cellen zijn ingebracht, binden ze partnereiwitten aan hun oppervlak en stimuleren lokaal signaaltransductieroutes. Deze strategie werd toegepast op leden van de Rho-GTPasen, een reeks moleculaire schakelaars waarvan bekend is dat ze de celmorfologie reguleren. NP-gemedieerd Rac1-signaal bleek actine-polymerisatie te induceren in uitstekende delen van cellen, terwijl er geen NP-geïnduceerde actine-polymerisatie werd waargenomen in de andere delen van de cel, wat suggereert dat Rac1 associeert met een andere partner om actine te polymeriseren in de regio's met hoge membraanactiviteit. De onderzoekers toonden aan dat de NP-gemedieerde activering van signaalroutes ook zou kunnen leiden tot een lokale wijziging van de cellulaire morfologie en hermodellering van het actine-cytoskelet. De strategieën die in deze studie worden gebruikt, kunnen dus worden gebruikt om het begrip te vergroten van hoe andere biomoleculen ruimtelijk worden gemoduleerd en geïntegreerd op cellulair niveau.

Het gebruik van magnetische NP's voor het controleren van celsignaleringsroutes werd aangetoond in een ander onderzoek door Cheon en collega's. 162 De groep toonde aan dat gefunctionaliseerde magnetische NP's apoptose-celsignalering kunnen inschakelen wanneer een magnetisch veld wordt aangelegd. De ontwikkelde magnetische schakelaar bestond uit met zink gedoteerde IONP's geconjugeerd met een gericht antilichaam voor doodreceptor 4 (DR4) van DLD-1-darmkankercellen. Wanneer een magnetisch veld werd toegepast om DR4-geconjugeerde IONP's gebonden aan celoppervlakreceptoren te aggregeren, werd een apoptose-signaleringsroute bevorderd. Deze magnetische controle van apoptose werd in vivo aangetoond met de zebravis als modelorganisme. IONP's kunnen ook worden gebruikt om cellen te activeren en de eiwitproductie op afstand te reguleren. 163.164 Stanley en collega's gebruikten anti-His-geconjugeerde IONP's om te binden aan een TRPV1-kanaal met gemodificeerd epitoop-gelabeld. Het temperatuurgevoelige TRPV1-kanaal werd geactiveerd met lokale verwarming van gebonden anti-His-IONP's, resulterend in activering van een Ca 2+ -gevoelige promotor die de synthese en afgifte van bioengineered insuline stimuleerde. Dit resultaat, samen met een verlaagde bloedglucose, werd in vivo bevestigd met muizen die het bioengineered insulinegen tot expressie brachten. De onderzoekers toonden verder aan dat cellen kunnen worden gemanipuleerd om genetisch gecodeerde ferritine-NP's te synthetiseren en op induceerbare wijze insuline af te geven. Het gebruik van IONP's in niet-invasieve technieken voor celmanipulatie biedt mogelijk een nuttig hulpmiddel voor fundamenteel biologieonderzoek.

Andere anorganische NP-platforms hebben ook potentieel getoond als hulpmiddelen om cellulaire activiteiten te reguleren met ruimtelijke en temporele controle. Onlangs werden infrarood-absorberende gouden NP's gebruikt als optische schakelaars van geninterferentie en op afstand bestuurd met behulp van licht. 165 De techniek omvatte het functionaliseren van de NP's met dubbelstrengs oligonucleotiden en op specifieke tijdstippen en intracellulaire locaties werd NIR-verlichting gebruikt om de gouden NP's fotothermisch te verwarmen, waardoor de dubbelstrengs oligonucleotiden denatureren bij hun smelttemperatuur en de antisense-oligonucleotiden vrijkwamen van de vervoerders.

Op macroscopische schaal kan de ruimtelijke organisatie van cellen in celkweek belangrijk zijn in fundamenteel biologieonderzoek. Omdat cellulaire activiteiten in conventionele 2D-celcultuur verschillen van die in vivo, zijn veel inspanningen gericht geweest op het ontwikkelen van 3D-celcultuur voor een meer fysiologisch relevante micro-omgeving. Onlangs rapporteerden Pasqualini en collega's een innovatieve benadering van 3D-weefselkweek op basis van de magnetische levitatie van cellen met een hydrogel bestaande uit gouden NP's, IONP's en M13-afgeleide faagdeeltjes die op integrine gerichte liganden vertonen. 163 Door het magnetische veld ruimtelijk te beheersen, waren de auteurs in staat om de geometrie van de celmassa te beheersen en geconcentreerde clustering van verschillende celtypen in co-cultuur te produceren. Ze ontdekten ook dat magnetisch zwevende menselijke glioblastomacellen vergelijkbare eiwitexpressieprofielen vertoonden als die waargenomen in menselijke tumorxenotransplantaten. De resultaten geven aan dat magnetische levitatie van cellen een bruikbare methode kan zijn voor het recapituleren van in vivo eiwitexpressie zonder het gebruik van een specifiek medium, geconstrueerde steigers of matrices.


Nanodeeltjes vermomd als rode bloedcellen om kankerbestrijdende medicijnen af ​​te leveren

Onderzoekers van de Universiteit van Californië, San Diego, hebben een nieuwe methode ontwikkeld om nanodeeltjes te vermommen als rode bloedcellen, waardoor ze het immuunsysteem van het lichaam kunnen ontwijken en kankerbestrijdende medicijnen rechtstreeks in een tumor kunnen afleveren. Hun onderzoek wordt volgende week gepubliceerd in de online Early Edition van de Proceedings van de National Academy of Sciences.

De methode omvat het verzamelen van het membraan van een rode bloedcel en het wikkelen ervan als een krachtige camouflerende mantel rond een biologisch afbreekbaar polymeer nanodeeltje gevuld met een cocktail van kleine molecuul medicijnen. Nanodeeltjes zijn kleiner dan 100 nanometer, ongeveer even groot als een virus.

"Dit is het eerste werk dat het natuurlijke celmembraan combineert met een synthetisch nanodeeltje voor toepassingen voor medicijnafgifte." zei Liangfang Zhang, hoogleraar nanotechniek aan de UC San Diego Jacobs School of Engineering en Moores UCSD Cancer Center. "Dit nanodeeltjesplatform zal weinig risico op immuunrespons hebben."

Onderzoekers werken al jaren aan het ontwikkelen van medicijnafgiftesystemen die het natuurlijke gedrag van het lichaam nabootsen voor een effectievere medicijnafgifte. Dat betekent het creëren van voertuigen zoals nanodeeltjes die gedurende langere tijd in het lichaam kunnen leven en circuleren zonder aangevallen te worden door het immuunsysteem. Rode bloedcellen leven tot 180 dagen in het lichaam en zijn als zodanig "het transportmiddel van de natuur met lange circulatie", zei Zhang's student Che-Ming Hu, een UCSD Ph.D. kandidaat in bio-engineering, en eerste auteur op het papier.

Stealth-nanodeeltjes worden al met succes gebruikt bij de klinische behandeling van kanker om chemotherapiemedicijnen te leveren. Ze zijn gecoat in een synthetisch materiaal zoals polyethyleenglycol dat een beschermingslaag creëert om het immuunsysteem te onderdrukken, zodat het nanodeeltje de tijd heeft om zijn nuttige lading af te leveren. Zhang zei dat de huidige stealth-voertuigen voor het afleveren van nanodeeltjes uren in het lichaam kunnen circuleren in vergelijking met de minuten die een nanodeeltje zou kunnen overleven zonder deze speciale coating.

Maar in de studie van Zhang circuleerden nanodeeltjes gecoat in de membranen van rode bloedcellen bijna twee dagen in de lichamen van laboratoriummuizen. De studie werd gefinancierd door een subsidie ​​van het National Institute of Health.

Een verschuiving naar gepersonaliseerde geneeskunde

Het gebruik van de eigen rode bloedcellen van het lichaam markeert een belangrijke verschuiving in focus en een belangrijke doorbraak op het gebied van onderzoek naar gepersonaliseerde medicijnafgifte. Proberen om de belangrijkste eigenschappen van een rode bloedcel in een synthetische coating na te bootsen, vereist een diepgaand biologisch begrip van hoe alle eiwitten en lipiden op het oppervlak van een cel functioneren, zodat je weet dat je de juiste eigenschappen nabootst. In plaats daarvan neemt het team van Zhang gewoon het hele oppervlaktemembraan van een echte rode bloedcel.

"We hebben dit probleem vanuit een technisch oogpunt benaderd en al deze fundamentele biologie omzeild", zei Zhang. "Als de rode bloedcel zo'n eigenschap heeft en we weten dat het iets met het membraan te maken heeft - hoewel we niet helemaal begrijpen wat er precies aan de hand is op eiwitniveau - nemen we gewoon het hele membraan. leg de mantel op het nanodeeltje, en het nanodeeltje ziet eruit als een rode bloedcel."

Het gebruik van nanodeeltjes om medicijnen toe te dienen, vermindert ook de uren die nodig zijn om chemotherapie-medicijnoplossingen langzaam door een intraveneuze lijn te laten druppelen tot slechts een paar minuten voor een enkele injectie van medicijnen met nanodeeltjes. Dit verbetert de ervaring van de patiënt en de naleving van het therapeutische plan aanzienlijk. De doorbraak zou kunnen leiden tot een meer gepersonaliseerde medicijnafgifte waarbij een klein monster van het eigen bloed van een patiënt genoeg van het essentiële membraan kan produceren om het nanodeeltje te verhullen, waardoor het risico op een immuunrespons tot bijna niets wordt verminderd.

Zhang zei dat een van de volgende stappen is om een ​​aanpak te ontwikkelen voor grootschalige productie van deze biomimetische nanodeeltjes voor klinisch gebruik, wat zal worden gedaan met financiering van de National Science Foundation. Onderzoekers zullen ook een targetingmolecuul aan het membraan toevoegen waarmee het deeltje kankercellen kan zoeken en eraan kan binden, en de technologie van het team voor het laden van medicijnen in de nanodeeltjeskern integreren, zodat meerdere medicijnen tegelijkertijd kunnen worden afgeleverd.

Zhang zei dat het belangrijk is om meerdere medicijnen in een enkel nanodeeltje te kunnen afleveren, omdat kankercellen een resistentie kunnen ontwikkelen tegen medicijnen die afzonderlijk worden afgeleverd. Door ze te combineren en het nanodeeltje het vermogen te geven om kankercellen te targeten, kan de hele cocktail als een bom uit de kankercel vallen.


Toegangsopties

Koop enkel artikel

Directe toegang tot het volledige artikel PDF.

De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.

Abonneren op tijdschrift

Onmiddellijke online toegang tot alle nummers vanaf 2019. Het abonnement wordt jaarlijks automatisch verlengd.

De belastingberekening wordt definitief tijdens het afrekenen.


Cel- en nanodeeltjestransport in tumormicrovasculatuur: de rol van grootte, vorm en oppervlaktefunctionaliteit van nanodeeltjes

Door middel van nanogeneeskunde ontstaan ​​baanbrekende methoden om medicijnmoleculen rechtstreeks naar zieke gebieden te brengen. Een van de meest veelbelovende hiervan is de gerichte levering van geneesmiddelen en beeldvormende middelen via op geneesmiddelen gebaseerde platforms. Dergelijke medicijnafgiftesystemen kunnen nu worden gesynthetiseerd uit een breed scala aan verschillende materialen, gemaakt in een aantal verschillende vormen en gecoat met een reeks verschillende organische moleculen, waaronder liganden. Indien geoptimaliseerd, kunnen deze systemen de doeltreffendheid en specificiteit van de levering verbeteren in vergelijking met die van niet-gerichte systemen. Opkomende geïntegreerde multischaal experimenten, modellen en simulaties hebben de deur geopend voor eindeloze medische toepassingen. De huidige knelpunten bij het ontwerp van de geneesmiddeldragende deeltjes zijn het gebrek aan kennis over de verspreiding van deze deeltjes in de microvasculatuur en hun daaropvolgende internalisatie door zieke cellen (Bao et al. 2014 J.R. Soc. Koppel11, 20140301 (doi:10.1098/rsif.2014.0301)). We beschrijven multischaalmodelleringstechnieken die bestuderen hoe medicijndragers zich verspreiden in de microvasculatuur. De ondergedompelde moleculaire eindige-elementenmethode wordt gebruikt om volbloed te simuleren, inclusief bloedplasma, rode bloedcellen en nanodeeltjes. Met een nieuwe methode voor dissipatieve deeltjesdynamica kunnen de beginstadia van receptorgestuurde endocytose van nanodeeltjes in detail worden begrepen. Met behulp van deze multischaalmodelleringsmethode verduidelijken we hoe de grootte, vorm en oppervlaktefunctionaliteit van nanodeeltjes hun dispersie in de microvasculatuur en daaropvolgende internalisatie door gerichte cellen zullen beïnvloeden.

1. Inleiding

Een aantal biofysische barrières kan voorkomen dat circulerende middelen zich op een bevredigend niveau ophopen op tumorlocaties. De afgifte-efficiëntie van zowel medicijnmoleculen als beeldvormende middelen kan dus erg laag zijn. De biofysische barrières omvatten de sekwestratie in de reticulo-endotheliale systeem (RES) organen [1,2], cellulaire opname door immuuncellen [3,4], afbraak door eiwitabsorptie (opsonisatie) in de bloedstroom [5], lage permeabiliteit van de bloedvaten en ongunstige interstitiële vloeistofdruk in solide tumoren [6-10]. Daarom kunnen de vrij toegediende geneesmiddelmoleculen niet efficiënt op de tumorplaats worden afgeleverd. Slechts minder dan 0,1% van de geïnjecteerde medicijnmoleculen kan bijvoorbeeld worden gevonden in 1 g tumorweefsel, wat wijst op de inefficiënte afgifte van deze vrije moleculen. Wanneer deze moleculen echter worden ingekapseld in liposomen, kan hun piekaccumulatie met één of twee ordes van grootte worden verbeterd. Het opent dus een nieuwe weg voor de op nanodeeltjes (NP) gebaseerde medicijndragers om de medicijnmoleculen of beeldvormende middelen efficiënt af te leveren op de zieke plaatsen.

Bij kankerbehandeling en beeldvorming is de standaardstrategie voor het maximaliseren van NP-accumulatie op de tumorlocaties afhankelijk van het verbeterde permeatie- en retentieeffect (EPR) [11-14]. Op de tumorlocaties hebben de vaatwanden de neiging om discontinu te zijn met fenestraties. De grootte van deze fenestraties is ongeveer 100-200 nm voor muizen, afhankelijk van het tumortype, stadium en locatie [11]. Daarom kunnen voldoende kleine NP's (kleiner dan de grootte van fenestraties) tumorvaten passief verlaten en in het tumorweefsel diffunderen. De accumulatie van deze NP's bereikt gewoonlijk een piek 12-24 uur na injectie. Vervolgens moeten deze NP's sterisch gestabiliseerd en opsonisatiebestendig zijn in de bloedstroom, om lange circulatietijden (uren tot dagen) mogelijk te maken. Grote RES-organen, zoals de lever en de milt, worden echter ook gekenmerkt door een gefenestreerd endotheel en gebruiken hetzelfde mechanisme om de vreemde circulerende objecten, d.w.z. medicijnmoleculen en NP's, af te sluiten. Het is dus niet verrassend dat de meeste van de systemisch geïnjecteerde medicijnmoleculen en NP's zich ophopen in de RES-organen.Daarnaast moeten we benadrukken dat de op EPR gebaseerde toedieningsstrategie uitsluitend en uitsluitend beperkt is tot kankertherapie en verbeelding, en geen algemene methode biedt voor de toediening van geneesmiddelen, zoals besproken door Nie [15]. Daarom is het ontwerpprincipe voor medicijndragers uitgebreid door niet alleen rekening te houden met het EPR-effect (passieve targeting), maar ook met de lokale omgeving (actieve targeting), zoals pH-waarde [16,17], voor gerichte medicijnafgifte.

Tot op heden zijn er verschillende klassen van NP's die veelbelovende eigenschappen vertonen als therapeutische dragers, zoals vaste lipide NP's, liposomen, kwantumdots, dendrimeren en polymeermicellen. Door de medicijnmoleculen in deze NP's te laden, kunnen hun biodistributie, farmacokinetiek en toxiciteit dramatisch worden verbeterd in vergelijking met hun vrij toegediende tegenhangers [19-21]. Desalniettemin is de accumulatie van deze NP's in de zieke plaatsen nog steeds ongewenst laag en kan deze worden verbeterd. Om dit probleem op te lossen, zijn er veel strategieën ontwikkeld voor het ontwerpen van efficiënte op NP gebaseerde medicijndragers [22-24]. Vasculaire targeting is bijvoorbeeld voorgesteld als een algemene strategie om de concentratie van NP's en de bijbehorende medicijnmoleculen in het zieke weefsel te verhogen. In dit geval zijn geïnjecteerde NP's versierd met targeting-eenheden (liganden) die specifiek de tot overexpressie gebrachte specifieke receptoren op de abnormale vaatwanden herkennen en er stevig aan binden [25-27].

De fysiochemische eigenschappen van NP's, zoals grootte, vorm, oppervlaktefunctionaliteit en stijfheid (4S-parameters), kunnen hun biologische klaring beïnvloeden [18,23,24,28,29]. Daarom kunnen NP's op verschillende manieren worden aangepast om hun circulatietijd te verlengen [13,14]. In de afgelopen decennia is het ontwerp van NP's voor biomedische toepassingen gevorderd door hun biologische reacties te bestuderen. De evolutie van de NP-dragers heeft de vooruitgang gevolgd in het begrip van hoe 4S-parameters hun werkzaamheid beïnvloeden. Zoals te zien is in figuur 1, zijn er drie generaties NP's ontwikkeld voor biomedische toepassingen [18,23]. In de eerste generatie NP's zijn ze gefunctionaliseerd met basische oppervlaktechemie (ladingen/liganden) en worden ze beoordeeld op hun biocompatibiliteit en toxiciteit. Deze NP's zijn echter onstabiel en worden tijdens de bloedsomloop meestal geïnternaliseerd door de immuuncellen (macrofagen). Om deze problemen te overwinnen, worden in de tweede generatie de oppervlakken van NP's geënt met polymeerketens, waardoor hun oplosbaarheid in water wordt verbeterd en aggregatie en opsonisatie worden vermeden. Vergeleken met de eerste generatie vertoont de tweede generatie NP's verbeterde stabiliteit en targeting in biologische systemen. Het actief richten van deze NP's op de tumorcellen of andere zieke cellen is echter nog steeds teleurstellend. Zo verschuiven de NP's van de derde generatie het ontwerpparadigma van stabiele materialen naar 'intelligente' en milieuvriendelijke materialen met verbeterde targetingmogelijkheden. Lokale veranderingen in de omgeving (d.w.z. pH-waarde) zorgen ervoor dat de eigenschappen van deze NP's op een voorgeschreven manier veranderen. Hier moeten we benadrukken dat hoewel het ontwerp van NP's verschuift van de eerste generatie naar de derde generatie, de eerste en tweede generatie NP's nog steeds veel toepassingen hebben op verschillende gebieden, maar hun gedrag nog steeds slecht wordt begrepen. Bovendien zal een uitgebreid begrip van de eerste en tweede generatie NP's ons helpen om de derde generatie NP's efficiënt te ontwerpen, wat in deze studie zal worden nagestreefd.

Figuur 1. Evolutie van het ontwerp van nanodeeltjes met hun eigenschappen en biologische uitdagingen. MPS, EPR en PEG duiden respectievelijk mononucleair fagocytsysteem, verbeterde permeatie en retentie en polyethyleenglycol aan. Zie de hoofdtekst voor meer discussies. Aangepast van [18]. (Online versie in kleur.)

Wanneer de op NP gebaseerde medicijndragers in de bloedstroom worden geïnjecteerd, zullen ze tijdens hun levensreis verschillende belangrijke stappen doorlopen om op de zieke plaats te worden afgeleverd [28]: (i) microcirculatie met rode bloedcellen (RBC's), witte bloedcellen (WBC's), bloedplaatjes en vele andere in de bloedstroom, (ii) stevige absorptie door de vaatwand rond de tumorplaats, (iii) diffundering naar de tumorplaats, en (iv) herkenning en opname door de tumorcellen. Vanwege de complexiteit van het medicijnafgifteproces is het meestal moeilijk om het gedrag van NP's stap voor stap in dit proces te traceren en hun gedrag te begrijpen. Integendeel, met de vooruitgang in computationele modellering kan het gedrag van NP's in de bloedstroom en hun interacties met ziektecellen nauwkeuriger worden gekwantificeerd [18,28,30-32]. Daarom kunnen de gedetailleerde fysieke mechanismen die ten grondslag liggen aan de NP-gemedieerde medicijnafgifte worden begrepen door deze simulaties, die nuttig zullen zijn bij het begeleiden van het ontwerp van NP's met een hoge werkzaamheid.

Dit blad is als volgt ingedeeld. Sectie 2 vat de huidige kennis van NP-gemedieerde medicijnafgifte samen door te focussen op het transport van NP's in de bloedstroom en hun daaropvolgende internalisatie door zieke cellen. De effecten van NP-grootte en -vorm zullen verder worden onderzocht door middel van simulaties met ondergedompelde moleculaire eindige-elementenmethode (IMFEM) in §3. Sectie 4 zal laten zien hoe de vorm en oppervlaktefunctionalisering van de NP's hun internalisatiegedrag zullen beïnvloeden. Ten slotte besluit §5 de huidige studie en bespreekt de toekomstige onderzoeksrichtingen met de vorderingen in multischaalmodellering.

2. Staat van kennis

2.1. Vasculaire dynamica van nanodeeltjes

2.1.1. Marginatiegedrag van nanodeeltjes

Bloed is een dichte suspensie van vervormbare cellen in plasma, waarbij RBC's ongeveer 35-45% per volume uitmaken, terwijl WBC's en bloedplaatjes minder dan 1% innemen. De volumefractie van rode bloedcellen wordt hematocriet genoemd. In grote bloedvaten kan bloed vanwege de hoge afschuifsnelheden eenvoudig worden gemodelleerd als een Newtonse vloeistof. In de microcirculatie en nabij de vaatwanden worden de transport-, rol- en adhesiedynamiek van NP's echter beïnvloed door de aanwezigheid van RBC's. In het bijzonder is goed gedocumenteerd dat snel bewegende RBC's de neiging hebben om circulerende WBC's en NP's lateraal te duwen, waardoor hun dynamiek en wandafzetting wordt beïnvloed [26,33]. Daarom verdient het potentiële belang van niet-Newtoniaanse effecten in de microcirculatie en in de nabijheid van de vaatwanden zorgvuldig onderzoek.

In experimenten bleken verschillende componenten in de bloedstroom, waaronder de RBC's, WBC's, bloedplaatjes en NP's, te segregeren onder normale fysiologische omstandigheden [34,35]. De RBC's hebben de neiging weg te migreren van de vaatwand en zich in het midden van het vat te concentreren. Zo wordt nabij de vaatwand een ‘celvrije laag’ gevormd, die ongeveer 1 µm dik is [36]. De WBC's, bloedplaatjes en sommige van de NP's migreren echter liever naar deze 'celvrije laag'. Dit gedrag wordt ‘marge’ genoemd. Bij NP-gemedieerde medicijnafgifte kunnen de medicijnmoleculen efficiënter aan de tumor worden afgeleverd door het marginatiegedrag van NP's, wat de interactie van NP's met de vaatwand verhoogt. Hierdoor kunnen de NP's de biofysische en biologische afwijkingen, zoals de aanwezigheid van fenestraties of de expressie van specifieke receptoren, op het oppervlak van endotheelcellen beter 'voelen'. Daarna kan de NP stevig aan de vaatwand hechten onder stroom, als de hydrodynamische krachten worden gecompenseerd door de interfaciale adhesieve interacties tussen de NP en de vaatwand. De adhesieve interactie kan specifiek zijn, d.w.z. vorming van ligand-receptorbindingen, en niet-specifiek, d.w.z. van der Waals, elektrostatische en sterische interacties. Marginatie en de daaropvolgende adhesie van NP's aan het endotheel stellen de NP's in staat om over de endotheelwand te transmigreren en een ziek weefselgebied binnen te gaan, waardoor uiteindelijk de medicijnmoleculen worden afgeleverd. Daarom moet een efficiënte medicijndrager, ongeacht het targetingmechanisme (specifiek of niet-specifiek), in staat moeten zijn om naar de 'celvrije laag' op de tumorplaats te migreren, waardoor de interactie met de vaatwand van de tumor wordt gemaximaliseerd.

2.1.2. 4S-parametereffecten op marginatie-neiging

De neiging tot marge hangt af van de 4S-parameters van NP's. De effecten van deze parameters op NP-marginatie zijn samengevat in tabel 1. De grootte van de NP is een belangrijke parameter bij het ontwerpen van geneesmiddeldragers. De NP's kleiner dan 10 nm worden uit de bloedstroom verwijderd via de nier of via extravasatie van een tumor [49]. De NP's groter dan 200 nm lopen echter het risico door de lever of milt te worden uitgefilterd of door het beenmerg te worden vernietigd. Charoenpho et al. [40] bestudeerde het NP-grootte-effect door bollen te gebruiken met een diameter van 0,5 tot 10 µm in het bloed. De marginatie-neiging blijkt toe te nemen met de boldiameter. Onlangs heeft Lee et al. [38] onderzocht het NP-grootte-effect door middel van gecombineerd in vivo en in silico studies, met behulp van sferische polystyreen NP's met een diameter van 10-1000 nm. De simulatie- en experimentele resultaten bevestigen dat grotere NP's (groter dan 500 nm) kunnen migreren naar de 'celvrije laag', terwijl kleinere NP's (minder dan 200 nm) meestal gevangen zitten tussen RBC's in het kerngebied. Tot op heden is er echter geen consensus over een optimale NP-grootte voor marginatie [31,34,37,38,40].

Tabel 1. Samenvatting van de effecten van 4S-parameters op NP-marginatie.

De marge en adhesie van verschillend gevormde NP's zijn theoretisch en experimenteel (in vitro) studeerde. Sferische, quasi-hemisferische en schijfvormige NP's zijn vergeleken [34,35]. Dunne schijfvormige NP's blijken grotere laterale driftsnelheden (migratiesnelheid) te vertonen dan andere NP's, onder invloed van hydrodynamische krachten [34,35]. Deze resultaten geven aan dat dunne schijfvormige NP's waarschijnlijker interageren met de vaatwand. Een deel van de theoretische, in vitro en in vivo experimentele resultaten hebben aangetoond dat dunne schijfvormige deeltjes steviger aan de zijwanden kunnen hechten onder afschuifstroming in vergelijking met sferische en slanke cilindrische deeltjes [26.50.51]. Er wordt waargenomen dat de dunne schijfvormige NP's een groter adhesieoppervlak en een kleinere dwarsdoorsnede bieden, wat leidt tot lagere hydrodynamische krachten en grotere adhesieve interactie. Evenzo, Gentile et al. [35] ontdekte dat schijfvormige en halfronde NP's meer migreerden in vergelijking met hun bolvormige tegenhangers. Bovendien vertonen gouden nanostaafjes een veel grotere neiging tot marginatie dan gouden nanobolletjes, zoals onthuld door Toy et al. [37]. Het bewijs toont duidelijk aan dat NP-vorm hun vasculaire dynamiek dramatisch kan beïnvloeden.

Het effect van NP-stijfheid is onderzocht door de marge van WBC's. Freund bestudeerde het mengsel van RBC's en WBC's in flow [45]. Wanneer de stijfheid van RBC's met een factor 10 werd vergroot, was de waargenomen verandering in marginatie-neiging voor WBC's verwaarloosbaar. De auteur concludeerde dus dat de vervormbaarheid van RBC's geen invloed heeft op het marginatiegedrag van WBC's. Kumar & Graham [46] modelleerden een verdunde suspensie van elastische capsules onder eenvoudige afschuifstroming. In tegenstelling tot de resultaten gerapporteerd door Freund [45], vonden ze dat stijve deeltjes (zoals WBC's) de neiging hebben om te marginaliseren, terwijl de zachte ("floppy") deeltjes (zoals RBC's) zich ophopen nabij het midden van het kanaal [46]. Later bestudeerden ze een systeem dat beide soorten deeltjes bevat en ontdekten dat de stijve en zachte deeltjes het gedrag van respectievelijk WBC's en RBC's in de bloedstroom [47] nabootsten. De marge van stijve deeltjes wordt toegeschreven aan de heterogene botsingen tussen deze deeltjes [48]. Onlangs is de vervormbaarheid (stijfheid) van deeltjes en het effect ervan op het transport in de bloedsomloop opgemerkt door de groep van DeSimone [52]. Ze gebruikten de PRINT-benadering, die vergelijkbaar is met de hydrogel-sjabloonstrategie, om aan te tonen dat vervormbare microdeeltjes (5 µm) met een concave vorm langer kunnen circuleren dan hun stijve tegenhangers [52].

Door middel van Monte Carlo-simulaties hebben Wang & Dormidontova [53,54] de binding bestudeerd tussen een bolvormig NP dat is vastgemaakt met liganden en een vlak celoppervlak met mobiele receptoren. De kerngrootte van de NP, entdichtheid, kabellengte en het percentage functionalisering door liganden blijken een belangrijke rol te spelen bij de bindingsaffiniteit van NP's voor het celoppervlak. Radhakrishnan en collega's [55,56] hebben een Monte Carlo-methode ontwikkeld om de bindingsvrije energie tussen gefunctionaliseerde NP's en endotheelceloppervlakken te berekenen. De verkregen resultaten tonen aan dat er een kritische antilichaamdichtheid bestaat, waaronder de bindingsaffiniteit dramatisch daalt. Al deze resultaten demonstreren de belangrijke rol die wordt gespeeld door de oppervlakte-eigenschappen van NP's, d.w.z. geënte ketens en hun lengte, entdichtheid en liganddichtheid. Daarnaast blijkt ook de vorm en grootte van NP's theoretisch een grote invloed te hebben op de kleefkracht [26,50]. Het bestuderen van de bindingsaffiniteit tussen NP's en vaatwand onder de gecombineerde invloed van de 4S-parameters en de afschuifstroom is dus essentieel om de mechanismen die de werkzaamheid van de medicijnafgifte regelen volledig te begrijpen [57].

Hoewel er uitgebreide experimentele onderzoeken zijn uitgevoerd om het effect van 4S-parameters van NP's op de werkzaamheid van hun medicijnafgifte te begrijpen, zijn er veel tegenstrijdige resultaten gerapporteerd voor verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld speelgoed et al. [37] mat de marge van sferische NP's met diameters variërend van 60 tot 130 nm in een bloedloze oplossing. Ze ontdekten dat de kleinere NP's veel sneller diffunderen dan grotere NP's vanwege de Brownse beweging [21]. Echter, door een gecombineerde in vivo en in silico studie, Lee et al. [38] ontdekte dat NP's van 1 m nabij de wand dispersie vertoonden, terwijl NP's van 200 nm willekeurig in het bloedvat werden verdeeld wanneer RBC's aanwezig waren. De kleinere NP's lijken vast te komen te zitten in de ruimtes tussen RBC's, waardoor hun diffusie naar de vaatwand wordt vertraagd en suggereert dat kleinere NP's niet altijd beter zijn. De verschillende resultaten die door deze onderzoeken worden gerapporteerd, worden veroorzaakt door verschillende hematocrietwaarden. Om bovenstaande controverse op te lossen en een uniform beeld te geven van het ontwerpen van efficiënte NP's, moeten we een meerschalige computationele methode creëren voor het bestuderen van het vasculaire transport en depositie van NP's met verschillende 4S-eigenschappen, onder dezelfde relevante fysiologische omstandigheden zoals vaatdiameter, afschuiving snelheid en hematocriet.

2.2. Internalisatie van nanodeeltjes

Nadat de NP het oppervlak van tumorcellen nadert, moet het worden geïnternaliseerd om de aangehechte geneesmiddelmoleculen in het binnenste van de cel af te leveren. Dit proces, de zogenaamde 'endocytose', omvat verschillende belangrijke stappen: (i) NP's zijn specifiek gebonden aan het celmembraan, (ii) NP's worden door het membraan omwikkeld en er wordt een membraangebonden NP-complex gevormd, (iii) een endosoom in een vroeg stadium wordt gevormd door het afknijpen van het ontluikende membraan, en (iv) endosomale afgifte van de NP tijdens het late stadium van het endosoom. Merk op dat endocytose ook een belangrijk proces is voor cellen om kleine moleculen, zoals eiwitten en andere macromoleculen, te internaliseren.

De grootte en vorm van NP's zijn geïdentificeerd als twee belangrijke parameters om hun internalisatiegedrag te beheersen [58-60]. Aoyama en collega's onderzochten het grootte-effect van endocytose in het subvirale gebied, door gebruik te maken van de lipofiele CdSe-quantumdot gecoat met trioctylfosfineoxide [59]. Door de NP's met verschillende diameters te vergelijken, namelijk 5, 15 en 50 nm, vonden ze een dramatisch grootte-effect, aangezien Chan en collega's later het NP-grootte-effect systematisch hebben bestudeerd door Au NP's te gebruiken met verschillende diameters van 10 tot 100 nm [ 60]. De opnamehalfwaardetijd van Au NP's met diameters van 14, 50 en 74 nm is respectievelijk 2,1, 1,90 en 2,24 uur. Nogmaals, ze vinden dat Au NP's met een diameter van 50 nm het meest efficiënt kunnen worden opgenomen door de zieke cellen. Dus zowel de kinetiek als de verzadigingsconcentraties van NP's kunnen sterk worden beïnvloed door hun fysieke afmetingen. Ze onderzochten ook het potentiële NP-vormeffect door de bolvormige en staafachtige NP's te gebruiken. De NP-opname blijkt afhankelijk te zijn van de vorm en de opname van staafachtige NP's is minder efficiënt dan hun bolvormige tegenhangers [60]. Zo kunnen 500 en 375% meer 74 en 14 nm sferische NP's door cellen worden geïnternaliseerd dan respectievelijk 74 × 14 nm staafachtige NP's. Verdere studies onthullen dat de lokale kromming van niet-sferische NP's de endocytische kinetiek regelt wanneer de NP's het celoppervlak naderen [61,62].

Om de NP-grootte- en vormeffecten te begrijpen, zijn de afgelopen jaren zowel theoretische als computationele studies uitgevoerd [63-68]. Het baanbrekende werk van Gao et al. [63] wijst erop dat de endocytose van NP's afhankelijk is van concurrentie tussen het buigen van het membraan en diffusie van vrije receptoren naar de koppelingsplaats wanneer de NP het celoppervlak nadert. Daarom kunnen zowel kleine als grote NP's niet efficiënt worden opgenomen vanwege de energiebarrière van respectievelijk membraanbuiging en beperking van vrije receptoren. Hun theoretische model voorspelt de optimale grootte van NP van ongeveer 25-50 nm [63], wat goed overeenkomt met eerdere experimentele waarnemingen. Vanwege het complexe kinetische proces dat betrokken is bij de endocytose van niet-sferische NP's, kan de theoretische studie echter alleen worden gebruikt om het NP-vormeffect kwalitatief te verklaren. Meer informatie is onthuld door grootschalige moleculaire simulaties (bijv. [67,69-71]). Deze simulatieresultaten laten zien dat de sferische NP's de meest efficiënte dragers zijn die door zieke cellen worden geaccepteerd. De membraanbuigenergie is de belangrijkste reden waarom de niet-sferische NP's minder efficiënt zijn om in de zieke cel te worden afgeleverd. De kinetiek van endocytose speelt een belangrijke rol bij het ontwerp van geneesmiddeldragers. De werkzaamheid van medicijndragers hangt bijvoorbeeld niet alleen af ​​van hoeveel, maar ook van hoe snel ze de zieke cel kunnen binnendringen. Zoals aangetoond in de huidige studie, kunnen zowel de oppervlakte-eigenschap als de vorm van NP de endocytische kinetiek dramatisch beïnvloeden, waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerp van geneesmiddeldragers.

In de afgelopen jaren is de stijfheid van NP's ook erkend als een belangrijke parameter om hun endocytische kinetiek te beheersen. Theoretische [74], computationele [75] en experimentele [76,77] studies hebben aangetoond dat de stijve NP's gemakkelijker kunnen worden geïnternaliseerd door cellen, in vergelijking met hun zachte tegenhangers. Het theoretische model ontwikkeld door Yi et al. [74] heeft uitstekend uitgelegd hoe de stijfheid van NP's hun internalisatie kan beheersen. Wanneer een zachte NP bijvoorbeeld het celmembraan nadert, kan het zich onder een grote natte hoek op het celoppervlak verspreiden. Vervolgens introduceert de sterk uitgespreide NP een grote lokale kromming aan het verspreidingsfront. Op deze manier komt de endocytose van een zachte NP een zeer grote membraanbuigende energiebarrière tegen die lijkt op de gespreide vorm.Uiteindelijk kan de membraanwikkeling van de zachte NP worden voorkomen door de grote energiebarrière (tabel 2).

Tabel 2. Samenvatting van de effecten van 4S-parameters op NP-internalisatie.

Moleculair-specifieke NP's zijn ontwikkeld met als doel de tumorspecifieke accumulatie te verbeteren. Het oppervlak van deze NP's is bedekt met ligandmoleculen die in staat zijn receptoren te herkennen en te binden die op de doelcellen tot expressie worden gebracht [72]. Ondanks hun buitengewone in vitro efficiëntie, heeft deze aanpak beperkt succes opgeleverd in vivo. Mogelijke redenen zijn onder meer veranderingen in ligandbindingsaffiniteit, ligandimmunogeniteit en beperkingen op de ligandpresentatie, met name op kleine NP's met een beperkt oppervlak. Als gevolg hiervan blijft tumortargeting met moleculair-specifieke NP's controversieel, zoals benadrukt door Nie en collega's [15,73]. Daarom is het ontwerpen van de oppervlaktefunctionaliteit van de NP's nog steeds een uitdaging, die in detail verder moet worden onderzocht.

3. Vasculair transport van nanodeeltjes voorspeld door ondergedompelde moleculaire eindige-elementenmethode

3.1. Model en methodologie

De IMFEM [78–83] is een computationeel raamwerk om gelijktijdig om te gaan met de relevante fysieke interacties in biologische omgevingen [80,84,85], inclusief vloeistof-structuurinteractie (FSI) [82,86,87], cel-celinteractie [81,88,89], thermische fluctuatie [78,79,90], elektrokinetiek [83,91,92], zelfassemblagegedrag [79,93-95] en andere mesoschaal- en moleculaire effecten [96]. In dit werk zal de IMFEM worden gebruikt om zowel de bloedstroom als de microcirculatie van NP's te simuleren. In dit geval worden de vervormbare RBC's ondergedompeld in een Newtoniaanse vloeistof, die het bloedplasma vertegenwoordigt. De microcirculatie van NPs in het bloed zal geanalyseerd worden in functie van de 4S parameters, en de lokale vasculaire condities, d.w.z. vaatdiameter en stroomsnelheid. Vervolgens zullen de cel-cel-, cel-NP- en NP-NP-interacties expliciet worden verantwoord zoals hieronder beschreven en worden ze gekoppeld aan een Euleriaans vloeistofdomein binnen IMFEM. De NP's worden behandeld als Lagrangiaanse vaste stoffen in het Euleriaanse vloeistofdomein, zoals beschreven in figuur 2. De FSI-krachten worden berekend op de oppervlakken van RBC's en NP's, en vervolgens verdeeld over het omringende vloeistofdomein via een Dirac-deltafunctie of reproductiekerneldeeltjesmethode (RKPM) [97,98]. De onderliggende heersende vergelijking voor de Euleriaanse vloeistof is de Navier-Stokes-vergelijking, die direct kan worden opgelost door een vloeistofoplosser. De beweging van RBC's en NP's wordt bepaald door de hydrodynamische krachten en thermische fluctuaties, evenals hun interacties.

Figuur 2. Wiskundig raamwerk voor ondergedompelde moleculaire eindige-elementenmethode, die is gebaseerd op een Navier-Stokes-vergelijkingsoplosser. De structurele vergelijking wordt behandeld als een interactiekracht tussen vloeistof en structuur die in het vloeistofdomein wordt verdeeld door de functie van de reproductiekerneldeeltjesmethode. (Online versie in kleur.)

De initiële vorm van de RBC is een biconcave schijf waarvan het dwarsdoorsnedeprofiel wordt gedefinieerd door een wiskundige uitdrukking [81]. De vervorming van RBC's wordt bepaald door een hyperelastische, Mooney-Rivlin, rekenergiefunctie. De materiaaleigenschappen van het RBC-membraan zijn gekalibreerd op basis van de experimentele resultaten van de uniaxiale spanning van een enkele RBC [99], zoals weergegeven in figuur 3. De RBC-RBC-interactie wordt beschreven door een Morse-type potentiaal, die theoretisch is aangeboden door Neu et al. [100.101]. Om overlap tussen RBC's en NP's in de simulaties te voorkomen, gebruiken we een Lennard-Jones-potentieel voor RBC-NP- en NP-NP-interacties [31,38]. Om de meerfasige aard van de plasma-cel-NP-mengsels correct vast te leggen, zijn hun interacties ook gekoppeld aan de Navier-Stokes-vergelijking voor het vloeistofdomein. De interactiekrachten worden berekend voor elk element op de oppervlakken van RBC's of NP's door een grensafstand te gebruiken om te bepalen welke elementen van nabijgelegen cellen zich binnen het invloedsdomein bevinden. De interactiekrachten zijn geïntegreerd over het oppervlak binnen het getroffen domein. De berekende krachten op de oppervlakken van RBC's en NP's worden via de RKPM [97,98] over het omringende vloeistofdomein verdeeld. Deze FSI's zijn ook opgenomen in de bewegingsvergelijkingen voor het vloeistofdomein. Na het oplossen van de heersende vergelijkingen, worden de snelheden van het vloeistofdomein geïnterpoleerd op de oppervlakken van RBC's en NP's, wat zorgt voor de antislip randvoorwaarde op de oppervlakken van RBC's of NP's. Hier moeten we benadrukken dat hoewel het vloeistofdomein is gemodelleerd als een Newtoniaanse vloeistof, het niet-Newtoniaanse gedrag in de microcirculatie voortkomt uit het meerfasenmengsel van RBC's en NP's, en correct wordt vastgelegd door onze IMFEM-simulaties.

Figuur 3. Validatie van de ondergedompelde eindige-elementenmethode op een enkele rode bloedcel (RBC): (een) vervormingsgedrag van de RBC onder uniaxiale spanning, (B) vervorming van RBC langs de trek- en transversale richtingen wanneer het onder uniaxiale spanning staat en (C) tankloopgedrag van RBC onder afschuifstroming (maximale afschuifsnelheid is 100 µm s –1). De experimentele aannames en resultaten in (een) en (B) zijn gereproduceerd met toestemming van [99]. Het tankloopgedrag van RBC onder de schuifstroom is waargenomen in experimenten door [102]. (Online versie in kleur.)

De IMFEM-simulatie van de bloedstroom is gevalideerd en geverifieerd door vergelijking met de volgende experimenten: (i) RBC-vervorming langs de trek- en transversale richtingen wanneer deze onder uniaxiale spanning staat [99], (ii) tankloopgedrag van RBC onder een afschuifstroom [102,103], (iii) afvoer hematocriet uit het vat [104], (iv) afvoer hematocriet uit het vat [104], en (v) celvrije laagdikte bij verschillende hematocrieten [105,106], zoals besproken in onze recente studie [38]. Voor al deze gevallen blijken de experimentele resultaten goed in overeenstemming te zijn met onze simulaties, wat de nauwkeurigheid en validiteit van de voorgestelde aanpak ondersteunt. Nadat het model en de methoden zijn gevalideerd, wordt de radiale dispersiecoëfficiënt NSR van NP's die hun ophoping in de buurt van de wand in bloedvaten reguleren, kan worden bepaald door middel van de IMFEM-simulaties. Voor een bepaald aantal NP's, N, de spreidingscoëfficiënt NSR is gedefinieerd als

3.2. Effecten van de grootte en vorm van nanodeeltjes op het microcirculatiegedrag

Om het NP-grootte-effect op het microcirculatiegedrag te begrijpen, worden 100 starre, sferische NP's met gelijke diameter (variërend tussen simulaties van 20 tot 1000 nm) willekeurig verdeeld binnen het capillair in de initiële configuraties, zoals beschreven in figuur 4. Onder de normale fysiologische omstandigheden, vinden we dat de vervorming van RBC's het lokale omringende stroomveld wijzigt. In het bijzonder worden de vervormde rode bloedcellen weggeduwd van de vaatwand en hebben ze de neiging zich op te hopen in het midden van het bloedvat, wat leidt tot de vorming van een 'celvrije laag'. Het gewijzigde lokale stromingsveld rond RBC's verandert het microcirculatiegedrag van de NP's drastisch (zie figuur 4). Wanneer de diameter van NP's groter is dan 500 nm, worden de NP's weggeduwd van het centrum van het bloedvat, vanwege het tuimelen van RBC's. De grote NP's migreren dus naar de 'celvrije laag' en hebben de neiging zich op te hopen nabij de vaatwand. Dergelijk marginatiegedrag van grote NP's bootst WBC's en bloedplaatjes na tijdens circulaties. Wanneer de diameters van de NP's kleiner zijn dan 500 nm, kunnen ze tijdens de circulatie binnen de ruimte tussen RBC's blijven. Interessant is dat de NP's die in het midden van het bloedvat zijn verdeeld, niet kunnen ontsnappen, omdat hun bewegingen worden geblokkeerd door de RBC's. De radiale dispersiecoëfficiënten NSR van verschillende grootte NP's worden ook berekend tijdens de simulaties. NSR van NP's met een diameter van 1000 nm blijken zes keer groter te zijn dan die van NP's van 100 nm, wat wijst op de belangrijke rol die de grootte van NP's speelt.

Figuur 4. (een) Initiële configuratie van vervormbare rode bloedcellen (RBC's) en bolvormige stijve deeltjes gedispergeerd in een capillair van 20 × 60 µm. Aan het inlaatgedeelte wordt een parabolisch snelheidsprofiel toegekend met een maximale snelheid van 100 µs −1 . (B) Rond de deeltjes, in de buurt van RBC's, wordt een complex stromingsveld gevormd. Aangepast van [38]. (Online versie in kleur.)

Ook de concentratie van de rode bloedcellen blijkt hierbij een belangrijke rol te spelen. Zo zijn de banen van 100 en 1000 nm NP's in een capillair met verschillende hematocrietwaarden, namelijk 0, 15 en 30%, weergegeven in figuren 5 en 6. Het is duidelijk dat bij afwezigheid van rode bloedcellen (0% hematocriet), de NP's volgen de stroomlijnen zonder noemenswaardige laterale drift, ongeacht de NP-grootte. Voor het geval met 15 en 30% hematocriet blijken laterale bewegingen voor NP's echter af te wijken van het kerngebied en naar de middellijn te bewegen. De grootste en snellere fluctuaties langs de radiale richting van het vat werden waargenomen voor de kleine NP's (100 nm in diameter), bij de lagere hematocriet (15%). Met een lagere RBC-volumefractie is de scheidingsafstand tussen aangrenzende cellen inderdaad groter en kunnen NP's gemakkelijker door de circulerende cellen bewegen, wat leidt tot een meer hectische NP-dynamiek. Over het algemeen tonen deze resultaten verder aan dat grotere NP's van submicrometer en micrometer efficiënter kunnen worden uitgesloten door de vaatkern, lateraal geduwd door de snel bewegende RBC's, terwijl de kleinste NP's veel minder zouden profiteren van dit uitsluitingsmechanisme en zouden langer opgesloten blijven in de bloedvatkern.

Figuur 5. Trajecten voor bolvormige deeltjes met een diameter van 100 nm in een capillair met verschillende hematocrietwaarden: (een) 0%, (B) 15% en (C) 30%.

Figuur 6. Trajecten voor bolvormige deeltjes met een diameter van 1000 nm in een capillair met verschillende hematocrietwaarden: (een) 0%, (B) 15% en (C) 30%.

Om de effectieve verspreiding van NP's tijdens microcirculatie te kwantificeren, introduceren we verder de effectieve radiale dispersiecoëfficiënt, gedefinieerd als NSR/NSB, waar NSB is de diffusiecoëfficiënt van NP's veroorzaakt door de Brownse beweging. Volgens de klassieke Stokes-Einstein-relatie hebben we:

waar kB en t zijn respectievelijk de Boltzmann-constante en temperatuur, NS is de diameter van deeltjes en η is de viscositeit van de vloeistof. Vervolgens kunnen de effectieve radiale dispersiecoëfficiënten voor NP's met diameters van 100 en 1000 nm worden verkregen en worden weergegeven in figuur 7een met hematocrietwaarden van 15%. De effectieve dispersieverhouding: NSR/NSB is groter voor NP's in de vaatkern en kleiner voor NP's in de 'celvrije laag'. In vergelijking met de 1000 nm NP's is de effectieve dispersieverhouding altijd kleiner voor de 100 nm NP's, wat aangeeft dat de grotere NP's efficiënter zijn. Bovendien is de bijdrage van RBC's aan de verspreiding van kleinere NP's relatief klein. Ten slotte kan het NP-vormeffect met dezelfde methode worden onderzocht. Zoals weergegeven in figuur 7B, kunnen de verschillend gevormde NP's, zoals bol, capsule en ellipsoïde, worden bestudeerd en hun laterale driftsnelheden worden berekend. De ellipsoïde-vormige NP blijkt efficiënter weg te drijven van het kerngebied van het vat. Verdere studies zullen worden voortgezet om het NP-vormeffect in detail te begrijpen.

Figuur 7. (een) Effectieve radiale dispersiecoëfficiënten voor deeltjes met een diameter van 100 en 1000 nm met 15% hematocriet. (B) Driftsnelheid van de verschillend gevormde deeltjes in een capillair met 30% hematocriet. (Online versie in kleur.)

4. Moleculaire simulatie over internalisatie van nanodeeltjes

4.1. Model en methodologie

Om het internalisatiegedrag van de NP's te bestuderen, gebruiken we de dissipatieve deeltjesdynamica (DPD) -methode [107,108], die nauwkeurig rekening kan houden met de hydrodynamische interacties door de watermoleculen expliciet te beschouwen. In de DPD-methode vertegenwoordigt een enkele kraal een groep atomen of moleculen. DPD kan dus grotere temporele en ruimtelijke schalen benaderen in vergelijking met klassieke moleculaire simulaties. Bovendien kunnen de interacties tussen verschillende moleculaire soorten nauwkeurig worden gereproduceerd door de conservatieve kracht in de DPD-simulaties [71,109]. Als gevolg hiervan is de DPD-methode zeer geschikt om de endocytose van NP's te bestuderen als verschillende betrokken moleculen.

Zoals weergegeven in figuur 8, wordt het lipidemolecuul weergegeven door de H3(T5)2 model. Elk lipidemolecuul bestaat uit een lipidekop met twee staarten, gevormd door respectievelijk drie hydrofiele (H) en vijf hydrofobe (T) kralen. Vervolgens worden de aangrenzende kralen met elkaar verbonden door een eenvoudige harmonische veer. Om de lineariteit van de lipidekoppen en -staarten te garanderen, wordt een harmonisch buigpotentieel toegepast op de aangrenzende drie kralen. Om de hydrofiele/hydrofobe eigenschap van de kop- en staartkralen weer te geven, zijn de afstotelijke interactieparameters voor hetzelfde type kralen hetzelfde, terwijl deze is vergroot voor verschillende kralen. Vervolgens kunnen de lipidemoleculen zichzelf assembleren tot een stabiele lipidedubbellaag in de wateromgeving. Voor de gedetailleerde opzet van de DPD-simulatie worden de lezers verwezen naar onze eerdere studies [71,109]. Voor het model van NP's beschouwen we dat de NP wordt gevormd door een stijve kern met een polymeer met een oppervlaktecoating [110]. Een typisch modelsysteem zijn de gePEGyleerde Au NP's, waarbij de kern en de schaal respectievelijk Au NP en PEG-polymeer vertegenwoordigen. In de DPD-simulatie wordt de relatieve positie van de kernkralen voor de NP bepaald door een stijve kern te beschouwen. De gebonden polymeerketens zijn vrij flexibel en hydrofiel, waardoor de clustering van NP's in de oplossing wordt voorkomen. Elk paar kralen op een vastgebonden polymeerketen is verbonden via een harmonische binding met aangrenzende drie kralen die worden beperkt door een harmonisch buigpotentieel, waardoor de aanhoudende lengte van de polymeerketens realistisch is. De potentialen van de binding en hoek worden gekalibreerd door middel van de statistische verdelingen van de binding en hoek van het PEG-polymeer ondergedompeld in het water, die worden verkregen door de volledig atomaire simulaties [109]. Op deze manier kan de conformatie van de aangebonden PEG-polymeren nauwkeurig worden weergegeven in onze DPD-simulaties. Alle mogelijke parameters voor de geënte PEG-polymeren en hun interacties met lipidemoleculen worden gerapporteerd in onze recente studies [71,109]. De representatieve DPD-modellen voor gePEGyleerde NP's worden getoond in figuur 8. Met deze modellen bij de hand kan de internalisatie van gePEGyleerde NP's worden bestudeerd door onze DPD-simulaties.

Figuur 8. (een) H3(T5)2 model voor het lipidemolecuul en de bijbehorende lipidedubbellaag in de simulatiebox. De hydrofiele koppen en hydroponische staarten van lipidemoleculen zijn respectievelijk gekleurd door blauwe kralen en zilveren lijnen. Voor de duidelijkheid zijn de oplosmiddel (water)moleculen onzichtbaar gemaakt. (B) Modellen voor gePEGyleerde NP's met geënte PEG-ketenlengte N = 18, overeenkomend met een molecuulgewicht van 815 Da. De kerndiameter van de NP is ongeveer 8 nm, geel gekleurd. De geënte PEG-ketens en richtende eenheden die aan hun vrije uiteinden zijn gebonden, zijn respectievelijk gekleurd door cyaan en blauw. Voor de duidelijkheid zijn de oplosmiddelmoleculen onzichtbaar gemaakt. (Online versie in kleur.)

Hier gaan we ervan uit dat de NP's de tumorcellen al in simulaties hebben bereikt. Daarom kan de endocytose van deze NP's door de cel direct wijzen op de werkzaamheid van deze geneesmiddeldragers bij de behandeling van de ziekte. Om de receptor-gemedieerde endocytose in onze simulaties na te bootsen, wordt aangenomen dat het celmembraan rijk-receptor ingebedde regimes bevat, wat de typische situatie is voor tumorcellen. Vervolgens worden de vrije uiteinden van gekoppelde PEG-ketens covalent gebonden met specifieke liganden, die deze receptoren kunnen herkennen en eraan kunnen binden. Op deze manier zou ons simulatiemodel de receptor-gemedieerde endocytose-route [71,109] goed kunnen reproduceren.

4.2. Effecten van oppervlaktefunctionaliteit en vorm van nanodeeltjes op internalisatiegedrag

De endocytische kinetiek van de gePEGyleerde NP's met sferische kern wordt gegeven in figuur 9. De diameter van de kern is ongeveer 8 nm en het molecuulgewicht van de gebonden keten is ongeveer 838 Da, wat binnen het experimenteel relevante bereik valt. Vanwege de verschillende entdichtheid van PEG kunnen we kwantitatief verschillend gedrag van deze gePEGyleerde NP's waarnemen. Wanneer de entdichtheid bijvoorbeeld laag is, b.v. 0,2 ketens nm −2, de gePEGyleerde NP kan in het begin op het oppervlak van het celmembraan worden geabsorbeerd. Na een lange simulatietijd (meer dan 2000 ns) bevindt het gePEGyleerde NP zich echter nog steeds op het oppervlak van het membraan en kan het niet in het binnenste van de cel worden afgeleverd. Wanneer de entdichtheid is verhoogd tot 1,6 ketens nm −2, zal de gePEGyleerde NP in het begin door het celmembraan worden gewikkeld, wat het zogenaamde 'membraanbuigende' stadium is. Dit wordt gevolgd door de fase 'membraan-extruderen', omdat het bovenste blad van het membraan zal extruderen om rond het oppervlak van de NP te wikkelen. Uiteindelijk zal het NP volledig worden omhuld door het membraan en een NP-membraancomplex vormen. Op deze manier kan het gePEGyleerde NP in de zieke cel worden afgeleverd voor gerichte medicijnafgifte.

Figuur 9. Representatieve DPD-simulatiesnapshots voor het internalisatieproces van PEGylated NP met entdichtheden van (een) 0.2 en (B) 1,6 ketens nm −2 . De kerndiameter is ongeveer 8 nm. De lengte van de geënte PEG-keten is: N = 18. Hetzelfde kleurenschema als in figuur 8 wordt gebruikt. (Online versie in kleur.)

Gezien dit verschillende gedrag van gePEGyleerde NP's, kunnen we ons afvragen waarom de verschillende entdichtheden van PEG-polymeer een belangrijke rol spelen. In onze recente studies [28,71,109] is onthuld dat drie belangrijke veranderingen in vrije energie betrokken zijn tijdens endocytose: (i) specifieke ligand-receptor-interacties, (ii) membraanbuigenergie en (iii) niet-specifieke entropieverandering van vastgebonden kettingen. In deze bijdragen aan vrije energie zorgt de specifieke ligand-receptor-interactie ervoor dat het gePEGyleerde NP wordt ingepakt door de lipidedubbellaag en uiteindelijk in de cel wordt afgeleverd. De verandering in buigenergie en het entropieverlies van gekoppelde ketens creëren echter energiebarrières, waardoor de internalisatie van NP's wordt voorkomen. In dit geval, als de drijvende kracht die wordt geleverd door de ligand-receptor-interactie niet sterk genoeg is om de energiebarrière te overwinnen die wordt gecreëerd door de membraanbuiging en entropieverlies van gebonden ketens, kan de NP niet worden geïnternaliseerd. Volgens het bovenstaande argument hebben we een theoretische methode ontwikkeld (mean-field-benadering) om het entropieverlies van de tethered chains te schatten [71,109]. De gratis wissel per keten tijdens dit proces blijkt ongeveer 1 . te zijnkBt, waar kB en t zijn respectievelijk de Boltzmann-constante en temperatuur. Wanneer de entdichtheid laag is, d.w.z. 0,2 ketens nm −2, is het overeenkomstige entropieverlies ook klein.De ligand-receptor-interactie is echter ook zwak, omdat de liganden zijn geconjugeerd aan de vrije uiteinden van gebonden ketens. De gePEGyleerde NP's kunnen dus niet worden geïnternaliseerd. Integendeel, de gePEGyleerde NP's met een grote entdichtheid kunnen snel door de cel worden geaccepteerd, omdat de specifieke ligand-receptor-interactie sterk genoeg is om de energiebarrières te overwinnen. Deze waarnemingen benadrukken de belangrijke rol die wordt gespeeld door de oppervlaktefunctionalisering van NP's tijdens endocytose.

De simulatieresultaten zijn ook vergeleken met experimentele onderzoeken naar de J774A.1-opname van gePEGyleerde Au NP's in serumvrije media, uitgevoerd door Walkey et al. [111], zoals weergegeven in figuur 10. Wanneer de entdichtheid van PEG-polymeer hoog is, is de interactie tussen het gePEGyleerde NP en het celmembraan erg sterk, vanwege de directe interacties tussen de distale methoxygroep aan de vrije uiteinden van het PEG ketens en de membraanoppervlakte-eiwitten of lipiden [111]. Wanneer de entdichtheid echter laag is, wordt de interactie tussen gePEGyleerde NP's en celmembraan erg zwak. Dus de gePEGyleerde NP's met hoge transplantatiedichtheden zouden gemakkelijk door de cel kunnen worden geaccepteerd, terwijl lage transplantatiedichtheid dat niet kan. Al deze verschijnselen zijn bevestigd door moleculaire simulaties en experimentele resultaten (zie figuur 10). Desalniettemin zouden de gePEGyleerde NP's de cel kunnen binnendringen via andere routes, zoals door clathrine gemedieerde endocytose, wat buiten het bestek van deze studie valt [106].

Figuur 10. Effect van entdichtheid op de cellulaire opname-efficiëntie, die evenredig is met de internalisatiesnelheid van gePEGyleerde NP's. (een) Experimentele resultaten door Walkey et al. [111] voor J774A.1-opname van gePEGyleerde Au NP's worden getoond ter vergelijking met onze DPD-resultaten. (B) Representatieve transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van de intracellulaire distributie van gePEGyleerde Au NP's met entdichtheid van 0,96 ketens nm −2 en kerndiameter van 15 nm (B1: schaalbalk, 1000 nm. B2-B4: schaalbalk, 100 nm). Afbeeldingen B1-B4 zijn gereproduceerd met toestemming van [111]. (Online versie in kleur.)

De NP-vorm is ook een belangrijke ontwerpparameter voor internalisatie. Zoals aangetoond in figuur 11, vertonen de verschillend gevormde NP's verschillende endocytische kinetiek, hoewel ze dezelfde ligand-receptor-interactie hebben met een gelijke hoeveelheid geënte PEG-polymeren. De bolvormige, staafachtige, kubische en schijfachtige NP's worden vergeleken met dezelfde oppervlakten voor hun kernen. Onder een vaste entdichtheid, 0,6 ketens nm −2, kan de bolvormige NP het meest efficiënt worden geaccepteerd door de cel, gevolgd door kubische en staafachtige NP's, terwijl de schijfachtige NP alleen op het oppervlak van het celmembraan kan worden gevonden. De gerelateerde membraanbuigenergieën blijken ongeveer 8 . te zijnπκ, [8,12)πκ, 12πκ en 27.33πκ voor respectievelijk bolvormige, kubische, staaf- en schijfachtige NP's [71]. κ is de membraanbuigmodulus, in de orde van 10-20 kBt [71]. Daarom bepalen de verschillende membraanbuigenergieën voor deze NP's hun efficiëntie tijdens endocytose.

Figuur 11. Representatieve DPD-simulatiesnapshots voor het internalisatieproces van gePEGyleerde NP's met verschillende gevormde kernen: bol, staaf, kubus en schijf. Al deze kernen hebben een gelijk oppervlak. De lengte van de geënte PEG-keten is: N = 30. Hetzelfde kleurenschema als in figuur 8 wordt gebruikt. Aangepast van [71]. (Online versie in kleur.)

We moeten benadrukken dat het effect van NP-vorm altijd dubbelzinnig wordt geëvalueerd in de experimenten vanwege het samenspel tussen de NP-vorm en zijn oppervlakte-eigenschappen. De verschillend gevormde NP's hebben bijvoorbeeld verschillende oppervlakte-tot-volumeverhoudingen, wat het onderscheiden van het grootte-effect van het oppervlakte-effect moeilijk maakt, vooral wanneer slechts een paar verschillende vormen worden overwogen. Bovendien hebben verschillend gevormde NP's verschillende aantallen liganden per geënte keten vanwege hun verschillende oppervlaktekrommingen [112]. Om het vormeffect van NP's te verduidelijken, kunnen we eerst de grootte (diameter) van bolvormige NP's bepalen en vervolgens de staaf- of schijf-NP's bestuderen onder gelijke oppervlakte-tot-volumeverhouding en ligand-tot-geënte-ketenverhouding. Dergelijke nauwkeurig gedefinieerde omstandigheden zullen ons in staat stellen om het vormeffect van NP's tijdens endocytose ondubbelzinnig te onderzoeken, wat alleen mogelijk is door computersimulaties.

5. Slotopmerkingen en perspectief

In dit werk hebben we aangetoond dat het transport van NP's in de microvasculatuur van de tumor sterk kan worden beïnvloed door hun 4S-parameters, zoals grootte, vorm, oppervlaktefunctionaliteit en stijfheid. De microcirculatie van NP's en hun daaropvolgende internalisatie door ziektecellen kan worden begrepen door respectievelijk IMFEM- en DPD-simulaties. De belangrijke rollen die de 4S-parameters spelen, kunnen worden opgehelderd door middel van deze simulaties. Door de IMFEM te combineren met DPD-simulaties, kan de levensreis van de op NP gebaseerde medicijndragers dus worden voorspeld via onze multischaalmodelleringsaanpak.

Door deze multischaalsimulaties kunnen fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan de NP-gemedieerde medicijnafgifte worden opgehelderd. Deze gedetailleerde fysieke inzichten kunnen nuttige richtlijnen bieden bij het ontwerp van NP's. Grotere NP's blijken bijvoorbeeld in staat te zijn om naar de 'celvrije laag' te migreren via IMFEM-simulaties, terwijl kleinere NP's efficiënter door de zieke cellen kunnen worden opgenomen door theoretische analyse en computersimulaties. Op basis van deze observaties is een meertraps bezorgplatform ontworpen door Ferrari en collega's [113]. Bij het ontwerp van dit platform worden biologisch afbreekbare en biocompatibele mesoporeuze siliciumdeeltjes gebruikt om kwantumdots of koolstofnanobuisjes van nanoformaat te dragen. Tijdens het microcirculatieproces kunnen deze mesoporeuze siliciumdeeltjes gemakkelijker worden geaccumuleerd op de tumorlocaties vanwege de EPR- en marginatie-effecten. Vervolgens kunnen de gedragen NP's geleidelijk worden vrijgegeven en in de tumorcellen diffunderen. Via receptor-gemedieerde endocytose en andere routes, zullen deze NP's worden geïnternaliseerd door tumorcellen. In vergelijking met het traditionele ontwerp van NP's, heeft dit meertrapsplatform rekening gehouden met verschillende fysieke mechanismen tijdens het NP-gemedieerde medicijnafgifteproces. Merk op dat het traditionele ontwerp van NP's afhankelijk is van de langzame en inefficiënte 'Edisoniaanse' benaderingen. Een dergelijk proces is zeer tijdrovend en kosteninefficiënt. Volgens de multischaalmodelleringsbenadering kan het ontwerp van NP's gemakkelijker worden bereikt door deze computersimulaties. In de nabije toekomst hopen we dat op simulatie gebaseerde ontwerpparadigma's als leidraad kunnen dienen voor het experimentele ontwerp van NP's van de volgende generatie, met verbeterde actieve targeting, lage toxiciteit en beperkte bijwerkingen.


Invoering

De pathologische complicaties van atherosclerose, namelijk hartaanvallen en beroertes, blijven de belangrijkste oorzaak van wereldwijde sterfte [1]. Omdat atherosclerose in wezen een ziekte is die gepaard gaat met ontsteking van het endotheel, de monolaag van cellen die de binnenkant van bloedvaten vormt, is een bijzonder veelbelovend idee het gebruik van nanodeeltjes als vrachtvoertuigen voor gerichte afgifte van ontstekingsremmende middelen aan arteriële endotheelcellen. Recente studies hebben aangetoond dat de internalisering van nanodeeltjes in endotheelcellen afhangt van een aantal factoren, waaronder de grootte van nanodeeltjes en de functionalisering van het oppervlak [2-4]. Het ophelderen van de basis voor deze waarnemingen is van primair belang.

Een cruciaal onderdeel in de ontwikkeling van een effectief op nanodeeltjes gebaseerd endovasculair medicijnafgiftesysteem is de interactie tussen deeltjes en het endotheelceloppervlak. Om ontstoken endotheelcellen specifiek te richten op een atherosclerotische laesie, kunnen nanodeeltjes worden gecoat met antilichamen tegen endotheelceladhesiemoleculen, zoals selectines, VCAM-1, PECAM-1 of ICAM-1 [5]. Van deze verschillende receptoren is intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) een bijzonder relevant doelwit, omdat het expressieniveau ervan in vasculaire endotheelcellen aanzienlijk wordt verhoogd door pathologische stimuli zoals oxidanten, cytokinen en abnormale mechanische schuifspanningen in vloeistoffen [ 3]. In het bijzonder is een 20 tot 100-voudige toename in ICAM-1-expressie in geactiveerde cellen ten opzichte van rustende cellen gerapporteerd [6]. ICAM-1-gemedieerde internalisatie van nanodeeltjes in endotheelcellen is het onderwerp geweest van een aantal recente experimentele onderzoeken [3, 6-10]. Nanodeeltjes gecoat met anti-ICAM-1-antilichamen activeren een specifieke endocytose-route genaamd CAM-gemedieerde endocytose [7]. In tegenstelling tot endocytose die wordt gemedieerd door andere membraanreceptoren, vereist CAM-gemedieerde endocytose multivalente binding: een enkel anti-ICAM-1-antilichaam wordt niet geïnternaliseerd door een endotheelcel, terwijl een deeltje dat meerdere antilichamen draagt, kan worden geïnternaliseerd. CAM-gemedieerde endocytose is actine-afhankelijk, maar er zijn andere eiwitmachines bij betrokken dan clathrine-gemedieerde endocytose, caveoli, macropynocytose of fagocytose [3, 7].

In dit artikel ontwikkelen we een wiskundig model om receptor-gemedieerde internalisatie van nanodeeltjes te beschrijven, specifiek rekening houdend met het geval van ICAM-1-gemedieerde endocytose. Verschillende theoretische modellen van internalisatie van nanodeeltjes zijn eerder voorgesteld. Een eerste groep theoretische modellen beschrijft receptor-gemedieerde internalisatie van sferische en niet-sferische deeltjes beperkt door diffusie van receptoren in het celmembraan [11–13]. Deze modellen gaan ervan uit dat de dichtheid van de deeltjesligand veel groter is dan de receptordichtheid van het celmembraan, waardoor receptordiffusie naar de deeltjesomhullende zone een beperkend fysiek mechanisme wordt. Deze aanname lijkt niet van toepassing op ICAM-1-gemedieerde endocytose van nanodeeltjes in ontstoken endotheelcellen, waar receptor- en liganddichtheden beide in de orde van 1000 moleculen/μm 2 [14], en diffusie van receptoren wordt dus verwaarloosbaar. Een andere groep theoretische modellen maakt gebruik van energetische benaderingen om membraanverpakking van een nanodeeltje te beschrijven (zie de recente recensie van Bahrami et al. [15]). Deze modellen hebben de rol van de vorm en oriëntatie van nanodeeltjes [16, 17], de vervormbaarheid van nanodeeltjes [18] en interacties tussen meerdere nanodeeltjes [19, 20] onderzocht, maar ze laten vaak de cytoplasmatische stijfheid van de cel en de dynamiek van bindingsvorming buiten beschouwing, zoals evenals de kinetiek van het wikkelproces. Recente ontwikkelingen in het modelleren van het omwikkelen van een nanodeeltje door een membraan hebben stochastische thermische fluctuaties ingebouwd om de kinetiek van het omwikkelen [21] of conformationele veranderingen van membraaneiwitten te bestuderen, die worden beschreven door simulaties van deeltjesdynamica [22].

Hier ontwikkelen we een nieuw theoretisch model om de kinetiek van internalisatie van nanodeeltjes te bestuderen onder de volgende premissen: (i) we beschouwen het geval waarin receptor- en liganddichtheid vergelijkbaar zijn, dus we negeren receptordiffusie (ii) we omvatten zowel membraanbuiging als visco-elastische vervorming van het cytoskelet (iii) we verklaren de dynamiek van bindingsvorming onder kracht. In tegenstelling tot de meeste van de voorgaande theoretische modellen, die gebaseerd zijn op energieformuleringen, ontwikkelen we ons model in termen van krachtenbalansen. Onze formulering is geïnspireerd op die voorgesteld door Dembo et al. om de kinetiek van het losraken van een membraan van een oppervlak te bestuderen [23]. Ons model stelt ons in staat te begrijpen hoe receptor-gemedieerde internalisatie wordt beïnvloed door deeltjesgrootte, bindingskenmerken, celmechanische eigenschappen en externe krachten die op het nanodeeltje worden uitgeoefend.


Conclusies

De potentiële toxiciteit van NP's is het belangrijkste probleem van hun gebruik in de geneeskunde. Daarom moeten niet alleen positieve resultaten van het gebruik van NP's, maar ook de mogelijke onvoorspelbare negatieve gevolgen van hun actie op het menselijk lichaam onder de loep worden genomen. De toxiciteit van NP's houdt verband met hun distributie in de bloedbaan en lymfestroom en hun vermogen om in bijna alle cellen, weefsels en organen te penetreren en interactie aan te gaan met verschillende macromoleculen en hun structuur te veranderen, waardoor ze interfereren met intracellulaire processen en het functioneren van hele organen . De NP-toxiciteit is sterk afhankelijk van hun fysische en chemische eigenschappen, zoals de vorm, grootte, elektrische lading en chemische samenstelling van de kern en de schil. Veel soorten NP's worden niet herkend door de beschermende systemen van cellen en het lichaam, wat de snelheid van hun afbraak vermindert en kan leiden tot aanzienlijke accumulatie van NP's in organen en weefsels, zelfs tot zeer giftige en dodelijke concentraties. Er zijn echter al een aantal benaderingen beschikbaar voor het ontwerpen van NP's met een verminderde toxiciteit in vergelijking met de traditionele NP's. Geavanceerde methoden voor het bestuderen van de NP-toxiciteit maken het mogelijk om verschillende routes en mechanismen van toxiciteit op moleculair niveau te analyseren en om betrouwbaar het mogelijke negatieve effect op lichaamsniveau te voorspellen.

Het is dus duidelijk dat het ontwerpen van NP's die weinig of geen negatieve effecten hebben, onmogelijk is tenzij alle kwalitatieve en kwantitatieve fysische en chemische eigenschappen van NP's systematisch in overweging worden genomen en een relevant experimenteel model voor het schatten van hun invloed op biologische systemen beschikbaar is.


Bekijk de video: Cairan Instraseluler CIS dan Cairan Ekstraseluler CES (Januari- 2022).